ES2336222T3 - Una composicion que tiene actividades inmunorreguladoras que comprende lactobacillus pensosus. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende bacterias de ácido láctico que pertenecen a Lactobacillus pentosus y que tienen una actividad de asimilación débil o ninguna actividad de asimilación para glicerol y donde las bacterias de ácido láctico son una cepa S-PT84 de Lactobacillus pentosus (Nº de Acceso de Depósito FERM BP-10028, Nº de Recibo de Depósito FERM ABP-10028).
Description
Una composición que tiene actividades
inmunorreguladoras que comprende Lactobacillus pentosus.
La presente invención se refiere a una
composición que comprende Lactobacillus pentosus que tiene
actividades inmunorreguladoras.
Se conoce que las bacterias de ácido láctico
muestran diversas bioactividades beneficiosas tales como una
actividad reguladora del intestino y actividad inmunoestimuladora.
Muchas de las bacterias de ácido láctico con tales bioactividades
beneficiosas se separan del tracto intestinal o de productos lácteos
fermentados obtenidos de fuentes animales. También se conoce que
algunas bacterias de ácido láctico de fuentes vegetales muestran
actividades inmunoestimuladoras.
Un ejemplo de bacterias de ácido láctico que
tienen actividades inmunoestimuladoras se encuentra, por ejemplo,
en el Documento de Patente 1, que describe la cepa
L-137 de Lactobacillus plantarum. Otros
ejemplos incluyen la cepa Labre de Lactobacillus brevis
separada de "Suguki," que es un tipo particular de encurtidos
tradicionales producidos en Kyoto y la cepa DA74N de
Lactobacillus pentosus separada de "Shibazuke", otro
tipo de encurtidos de Kyoto (véase los Documentos No de Patente 1,
2).
- \quad
- [Documento de Patente 1]
- \quad
- Publicación de Patente Japonesa Abierta A Inspección Pública Nº 167972/1998 (Tokukaihei 10-167972; publicada el 23 de junio de 1998).
- \quad
- [Documento No de Patente 1]
- \quad
- Screening of immune-enhancing Probiotics: Study of immune-enhancing effects of Lactobacilli strains by in vitro stimulation human peripheral blood mononuclear cells, Atsuko KISHI, Aoi KOKUBO, Kaoru AKATANI, Eriko OUGITANA, Setsuya FUJITA, Tsunataro KISHIDA, Pasken Journal 15. 21-26, 2002.
- \quad
- [Documento No de Patente 2]
- \quad
- The 6th Intestinal Bacteria Conference (Chonai Saikin Gakkai). May 30-31, 2002. Abstract, Kaoru AKATANI, Atsuko KISH1, Eriko OUGITANA, Aoi KOKUBO, Setsuya FUJITA, Tsunataro KISHIDA.
\vskip1.000000\baselineskip
Una amplia diversidad de bacterias se puede
separar de los encurtidos tradicionales de Kyoto y se cree que los
encurtidos incluyen otras cepas bacterianas, además de la cepa
Labre, con las actividades inmunoestimuladoras u otras
bioactividades beneficiosas. Entre diferentes cepas bacterianas
separadas de los encurtidos, Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus pentosus se separan más frecuentemente. Sin
embargo, los efectos de bacterias separadas de los encurtidos no se
han investigado activamente. Además, ya que las bacterias de ácido
láctico separadas de los encurtidos están contenidas de forma
original en los alimentos, se considera que son altamente seguras
incluso si se ingieren por organismos vivos. Por lo tanto, con las
bacterias de ácido láctico beneficiosas separadas de los
encurtidos, se puede realizar una composición útil que comprende
tales bacterias de ácido láctico.
La presente invención se realizó en vista del
anterior problema y un objeto de la invención es proporcionar
alimentos, bebidas, medicamentos o similares que sean seguros y
contengan bacterias de ácido láctico, separadas de encurtidos
tradicionales de Kyoto, que tengan bioactividades beneficiosas.
Los inventores de la presente invención han
trabajo de forma diligente para resolver los anteriores problemas.
Al conseguir la invención, los inventores investigaron las
actividades inmunorreguladoras de 16 tipos de bacterias de ácido
láctico separadas de encurtidos y realizaron un estudio detallado de
las actividades inmunorreguladoras de las bacterias
Lactobacillus pentosus entre las bacterias separadas. Se
observó como resultado que se mostraban actividades
inmunorreguladoras tales como actividad inmunoestimuladora y una
actividad anti-alérgica cuando las bacterias
Lactobacillus pentosus se ingirieron por animales con el agua
de bebida o cuando se administró una suspensión de las bacterias
Lactobacillus pentosus a los animales.
Específicamente, una composición de acuerdo con
la presente invención comprende bacterias de ácido láctico que
pertenecen a Lactobacillus pentosus y que tienen una débil
actividad de asimilación o ninguna actividad de asimilación para
glicerol. Preferiblemente, las bacterias de ácido láctico tienen
actividades inmunorreguladoras y son una cepa que produce
polisacárido extracelular.
La bacteria de ácido láctico es una cepa
S-PT84 de Lactobacillus pentosus (Nº de
Acceso de Depósito FERM BP-10028, Nº de Recibo de
Depósito FERM ABP-10028). La cepa
S-PT84 de Lactobacillus pentosus se separó de
"Shibazuke" por los inventores y se observó que poseía fuertes
actividades inmunorreguladoras. La cepa S-PT84 de
Lactobacillus pentosus también se denomina una cepa DS84C.
La cepa S-PT84 de Lactobacillus pentosus
(Lactobacillus pentosus SAM 2336) se deposita con el Nº de
Acceso de Depósito FERM BP-10028, Nº de Recibo de
Depósito FERM ABP-10028 en el International Patent
Organism Depositary en el National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology (AIST). Por lo tanto, una composición de
acuerdo con la presente invención comprende la cepa
S-PT84 de Lactobacillus pentosus.
Una composición de acuerdo con la presente
invención comprende las bacterias de ácido láctico y tiene
actividades inmunorreguladoras. Además, una composición de acuerdo
con la presente invención comprende las bacterias de ácido láctico
y tiene actividades anti-alérgicas. Además, una
composición de acuerdo con la presente invención puede comprender
bacterias de ácido láctico como células viables. La composición es
útil para alimentos, bebidas y medicamentos que tienen actividades
inmunorreguladoras y/o actividades
anti-alérgicas.
Para una comprensión más completa de la
naturaleza y las ventajas de la invención, se debe hacer referencia
a la descripción detallada consiguiente tomada junto con los dibujos
adjuntos.
La Figura 1 es un gráfico que representa el
resultado de un ensayo de inducción de IL-12 de
macrófagos realizado mediante estimulación in vitro usando
16 tipos de bacterias de ácido láctico.
La Figura 2 es un gráfico que representa los
cambios en la concentración de IL-12 en suero en
respuesta a administración intraperitoneal de
S-PT84.
La Figura 3 es un gráfico que representa los
resultados de medición de la concentración de IL-12
en suero de ratón en respuesta a la administración intraperitoneal
de 16 tipos de bacterias de ácido láctico.
La Figura 4(a) a la Figura 4(c)
son diagramas de citometría de flujo que representan la producción
de citocinas por esplenocitos provocada por la estimulación con
S-PT84, en las que la Figura 4(a) es el
resultado del uso de un medio de cultivo de esplenocitos no
estimulados, la Figura 4(b) es el resultado del uso de un
medio de cultivo de esplenocitos estimulados por células
S-PT84 inactivadas por calor y la Figura 4(c)
es el resultado un medio de cultivo de esplenocitos estimulados con
concanavalina A.
La Figura 5(a) a la Figura 5(c)
son diagramas de citometría de flujo que representan los efectos de
la estimulación con S-PT84 sobre células CD4+, CD8+
y CD69+, donde la Figura 5(a) es el resultado mediante el uso
de esplenocitos no estimulados, la Figura 5(b) es el
resultado usando células S-PT84 inactivadas por
calor de esplenocitos estimulados y la Figura 5(c) es el
resultado mediante el uso de esplenocitos estimulados con
concanavalina A.
La Figura 6 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la actividad de NK de linfocitos
hepáticos en respuesta a la administración intraperitoneal de
S-PT84.
La Figura 7(a) y la Figura 7(b)
son diagramas de citometría de flujo que representan los efectos de
la administración intraperitoneal de S-PT84 sobre
células CD4+, CD8+ y CD69+ de linfocitos hepáticos, donde la Figura
7(a) es el resultado para el control y la Figura 7(b)
es el resultado con administración de S-PT84.
La Figura 8 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la concentración de
IL-12 en suero en ratones a los que se administró
por vía oral S-PT84.
La Figura 9 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la actividad de NK esplénica de ratones
a los que se administró por vía oral S-PT84.
La Figura 10 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la proporción de Th1/Th2 en esplenocitos
de ratones a los que se administró por vía oral
S-PT84.
La Figura 11 es un gráfico que representa los
cambios en el peso de ratones a los que se administró por vía oral
S-PT84, en respuesta a administración de
ciclofosfamida.
La Figura 12 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la concentración de
IL-12 en suero en ratones a los que se administró
por vía oral S-PT84, en respuesta a administración
de ciclofosfamida.
La Figura 13 es un gráfico que representa los
cambios en la concentración de IgE específica de OVA en ratones a
los que se administró por vía oral S-PT84.
La Figura 14 es un gráfico que representa el
resultado de la medición de la concentración de IgE total 3 semanas
después de la administración de OVA en ratones a los que se
administró por vía oral S-PT84.
La Figura 15 es un gráfico que representa los
efectos supresores de reducción de actividad de NK en ratones a los
que se administró por vía oral S-PT84 y que se
pusieron bajo estrés.
La Figura 16 es un gráfico que representa los
resultados de la medición de la concentración de
IL-12 en suero en respuesta a la administración
intraperitoneal de 4 tipos de bacterias de ácido láctico (DB22C,
DS51C, DS2C y DS84C(S-PT84)) como células
inactivadas por calor o células viables.
A continuación se describirá una realización de
la presente invención. Se tiene que señalar que la invención no se
limita de ningún modo por la siguiente descripción. La presente
invención se refiere a una composición que comprende bacterias de
ácido láctico que pertenecen a Lactobacillus pentosus, y que
tienen una débil actividad de asimilación o ninguna actividad de
asimilación para glicerol y donde las bacterias de ácido láctico son
una cepa S-PT84 de Lactobacillus pentosus
(Nº de Acceso de Depósito FERM BP-10028, Nº de
Recibo de Depósito FERM ABP-10028).
Las bacterias de ácido láctico contenidas en una
composición de acuerdo con la presente invención pertenecen a
Lactobacillus pentosus y tienen una débil actividad de
asimilación o ninguna actividad de asimilación para glicerol. Una
composición que comprende tales bacterias de ácido láctico es
altamente valiosa como una composición capaz de mostrar
bioactividades beneficiosas de las bacterias de ácido láctico. Entre
tales composiciones, se prefiere una composición que tenga
actividades inmunorreguladoras. Como se usa en este documento, la
expresión "actividad inmunorreguladora" se refiere a la
función de activar una función inmune constante o disminuida
(actividad inmunoestimuladora) o la función de suprimir un exceso de
función inmune hasta un nivel apropiado (actividad
inmunosupresora). Además de o en lugar de estas actividades, la
expresión también se usa para referirse a la función de conseguir
un equilibrio óptimo entre la inmunidad celular y la inmunidad
humoral. Los ejemplos no limitantes de actividades
inmunorreguladoras incluyen: facilitación o supresión de la
producción de citocinas; activación de linfocitos; mejora de la
actividad de
NK (asesinos naturales); mejora del equilibrio Th1/Th2; supresión de la reducción inmune; y actividad anti-alérgica.
NK (asesinos naturales); mejora del equilibrio Th1/Th2; supresión de la reducción inmune; y actividad anti-alérgica.
Además, es preferible que las bacterias de ácido
láctico contenidas en una composición de acuerdo con la presente
invención sean una cepa productora de polisacáridos (EPS)
extracelular. La propiedad o estructura química de EPS varía en
gran medida de género a género, de especie a especie y de cepa a
cepa. La EPS produce polisacáridos capsulares, que se acumulan
sobre la superficie de las bacterias y se puede reconocer de forma
sencilla por tinción con tinta china. La cepa productora de EPS es
más hidrófila que cepas que no producen EPS. Esto es ventajoso en
aplicaciones alimentarias.
Las bacterias de ácido láctico contenidas en una
composición de acuerdo con la presente invención son la cepa
S-PT84 de Lactobacillus pentosus. Esta cepa
bacteriana se deposita con el Nº de Acceso de Depósito FERM
BP-10028, Nº de Recibo de Depósito FERM
ABP-10028 en el International Patent Organism
Depositary en el National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology (AIST). La cepa S-PT84 de
Lactobacillus pentosus (denominada en lo sucesivo en este
documento simplemente "S-PT84") se describirá a
continuación.
Basándose en los criterios señalados más
adelante, los inventores de la presente invención separaron y
seleccionaron 16 tipos de bacterias de ácido láctico de
"Shibazuke" (4 tipos de Lactobacillus plantarum y 12
tipos de Lactobacillus pentosus). Específicamente, 16 tipos
de bacterias de ácido láctico se seleccionaron entre las bacterias
de ácido láctico vegetales si (1) eran bacilos (género
Lactobacillus), (2) se separó más de una cepa con las mismas
características, (3) proliferaron de forma deseable en un medio de
cultivo y (4) eran diferentes de "Shibazuke".
Los 16 tipos de bacterias de ácido láctico se
compararon con respecto a la actividad inducible de interleucina 12
(simplemente "IL-12" en lo sucesivo en este
documento). El resultado mostró que la cepa S-PT84
de Lactobacillus pentosus produjo la mayor concentración de
IL-12 en suero cuando se administró por vía
intraperitoneal a ratones.
Los estudios detallados de las actividades
inmunorreguladoras de S-PT84 condujeron a los
siguientes hallazgos.
- (1)
- Cuando se procesó in vitro en los esplenocitos preparados de ratones, el S-PT84 indujo la producción de IFN-\gamma (interferón \gamma) y TNF-\alpha (factor de necrosis tumoral \alpha) de la citocina de tipo Th1 y, por lo tanto, aumentó el número de células CD4+CD69+ y células CD8+CD60+. Es decir, el S-PT84 funcionó activando las células T auxiliares o las células T asesinas.
- (2)
- Cuando se administró por vía intraperitoneal a ratones, el S-PT84 aumentó la actividad de NK de los linfocitos hepáticos. Además, el S-PT84 aumentó el número de células CD8+ y de células CD8+CD69+ y, por lo tanto, aumentó la inmunidad celular.
- (3)
- Cuando se administró por vía oral a ratones, el S-PT84 aumentó la concentración de IL-12 en suero, aumentó el número de células CD4+, CD8+ y CD3+ en el bazo y, por lo tanto, aumentó la actividad de NK de los esplenocitos. Como resultado, el equilibrio de Th1/Th2 en los esplenocitos se convirtió en dominante de Th1.
- (4)
- Cuando se administró por vía oral a ratones, el S-PT84 suprimió una pérdida de peso provocada por la administración de ciclofosfamida y suprimió la reducción de la respuesta inmune.
\newpage
- (5)
- Cuando se administró por vía oral a ratones, el S-PT84 suprimió la IgE específica de ovoalbumina (OVA) y la IgE total, incluso cuando se sensibilizó con OVA.
- (6)
- Cuando se administró por vía oral a ratones, el S-PT84 suprimió la reducción inducida por estrés de la actividad de NK.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estos hallazgos, se confirmó que
S-PT84 era una cepa con actividades
inmunorreguladoras.
La siguiente Tabla 1 muestra las características
bacterianas del S-PT84.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Generalmente se conoce que el Lactobacillus
pentosus tiene una fuerte actividad de asimilación para
glicerol. Sin embargo, el S-PT84 tenía una
actividad de asimilación débil para glicerol, como se muestra en la
Tabla 1. Por tanto, se observó que el S-PT84 era
diferente de cualquier otro Lactobacillus pentosus
conocido.
Después de extraer el ADN de
S-PT84, se secuenció un total de aproximadamente 500
pb en toda la región del gen 16SrRNA usando el kit de ADNr 16S
Microseq Full Gene (Applied Biosystems). La secuencia del gen
16SrRNA (SEC ID Nº: 1) era homóloga en el 100% a la secuencia del
gen 16SrRNA de JCM^{T} de Lactobacillus pentosus (D79211).
A partir de esto, el S-PT84 se identificó como
Lactobacillus pentosus.
El S-PT84 es más hidrófilo que
bacterias que no producen EPS y esencialmente no tiene adherencia a
una superficie plástica. Además, el S-PT84
esencialmente no tiene actividad de aglomeración para levaduras.
Una composición de acuerdo con la presente
invención comprende bacterias de ácido láctico que pertenecen a
Lactobacillus pentosus y que tienen una actividad de
asimilación débil o ninguna actividad de asimilación para glicerol.
Una composición de acuerdo con la presente invención tiene
preferiblemente actividades inmunorreguladoras o actividades
anti-alérgicas. Sería más ventajoso si la
composición mostrara tanto actividades inmunorreguladoras como
actividades anti-alérgicas.
Una composición de acuerdo con la presente
invención se puede usar ventajosamente en forma de alimentos,
bebidas o medicamentos que tienen actividades inmunorreguladoras
y/o actividades anti-alérgicas. En otras palabras,
la composición se puede usar de forma adecuada como una composición
farmacéutica que tiene actividades inmunorreguladoras y/o
actividades anti-alérgicas.
Las bacterias de ácido láctico pueden estar
contenidas en una composición directamente (de forma viable o
muerta) o en forma de una inclusión o células procesadas, por
ejemplo. Se pueden obtener células viables de una inclusión de
bacterias de ácido láctico tal como un caldo de bacterias de ácido
láctico. Se pueden obtener células muertas sometiendo células
viables a calor, radiación de UV o un tratamiento con formalina, por
ejemplo. Las células viables o las células muertas pueden molerse o
triturarse hasta células procesadas.
Es decir, una composición de acuerdo con la
presente invención incluye al menos uno de: bacterias de ácido
láctico; una inclusión de bacterias de ácido láctico; y células
procesadas de bacterias de ácido láctico. Los ejemplos de bacterias
de ácido láctico incluyen células viables, células húmedas y células
secadas. La inclusión de bacterias de ácido láctico puede ser una
suspensión de bacterias de ácido láctico, un medio de cultivo de
bacterias de ácido láctico (incluyendo bacterias de ácido láctico,
sobrenadante y el propio medio), un caldo de bacterias de ácido
láctico (obtenido eliminando un componente sólido del medio de
cultivo) o leche fermentada de bacterias de ácido láctico (bebida
de bacterias de ácido láctico, leche agria, yogurt, etc.). Las
células procesadas de bacterias de ácido láctico, por ejemplo,
pueden ser células molidas, células trituradas, células licuadas
(extracto, etc.), células concentradas, células en pasta, células
secadas (células secadas por pulverización, células secadas por
congelación, células secadas al vacío, células secadas en tambor) o
células diluidas. El S-PT84 contenido en una
composición de acuerdo con la presente invención se separa del
"Shibazuke" fermentado y, como tal, una composición que
comprende el producto de frutas, bebidas o cereales fermentados con
S-PT84 también es adecuada como una realización de
una composición de acuerdo con la presente invención. Se debe
señalar que una composición que comprende S-PT84 es
segura debido a que S-PT84 se separa del alimento,
como se ha descrito anteriormente.
Es preferible que una composición de acuerdo con
la presente invención se use como alimento, bebidas, medicamentos o
similares. Más específicamente, la composición se usa
preferiblemente como una composición farmacéutica que tiene
actividades inmunorreguladoras. Cuando se usa como alimento o
bebida, es preferible que la composición se proporcione como
alimento sano que tiene actividades inmunorreguladoras. Además, la
composición se puede combinar con edulcorantes, acidificantes,
vitaminas o diversos otros componentes para proporcionar productos
selectivos para el usuario. Por ejemplo, la composición se puede
proporcionar en forma de un comprimido, una cápsula, una bebida
sanitaria, un producto lácteo tal como yogurt o una bebida de
bacterias de ácido láctico, un potenciador del sabor, alimentos
procesados, postre o pastelería.
Los ejemplos de medicamentos incluyen un
inmunoestimulante y un fármaco anti-alérgico. La
composición se puede preparar en un medicamento como un componente
activo en combinación con auxiliares convencionales usados de forma
común en el campo de la preparación de fármaco. Los ejemplos de
tales auxiliares incluyen: un excipiente, un aglutinante, un
disgregante, un lubricante, una fragancia, un agente solubilizante,
un agente de suspensión y un agente de recubrimiento. La forma de
dosificación no está particularmente limitada. Por ejemplo, el
medicamento puede estar en forma de un comprimido, una cápsula, un
gránulo, un polvo, un jarabe, un supositorio o una inyección.
Tampoco está particularmente limitada la vía de administración del
medicamento. Por ejemplo, están disponibles la administración oral,
administración rectal y administración transintestinal.
\newpage
Se separaron cuatro tipos de Lactobacillus
plantarum y doce tipos de Lactobacillus pentosus de
"Shibazuke," un tipo de encurtido tradicional de Kyoto. Estas
cepas bacterianas se compararon con respecto a la actividad
inducible de interleucina 12 (IL-12), para
seleccionar cepas con buena actividad inmunoestimuladora de tipo
Th1. Para cada cepa usada, la Tabla 2 enumera nombres de cepa y
especie y la presencia o ausencia de EPS. A partir del resultado de
la comparación para actividad inducible por IL-12,
se observó que la actividad de la cepa DS84C
(S-PT84) era particularmente fuerte. Como tal, se
realizaron experimentos posteriores solamente para
S-PT84.
En primer lugar se administró por vía
intraperitoneal tioglicolato al 4,05% a ratones BALB/c (7 semanas de
edad, macho). Después de 4 días, los macrófagos intraperitoneales
se recogieron con PBS y se ajustaron hasta 2 x 10^{6} células/ml
usando medio RPMI que contenía FBS al 10%. El cultivo se inoculó en
una placa de 24 pocillos (0,5 ml/pocillo). Después se añadieron
células inactivadas por calor (10 \mug/ml) de cada cepa a cada
pocillo y, después de 24 horas de incubación, se midió la
concentración de IL-12 del sobrenadante. Ya que la
forma activa de IL-12 es P70 que combina dos
subunidades p35 y p40, se midió la concentración de
IL-12 (p70). Para la medición de
IL-12, se usó el kit de ELISA de
IL-12 de ratón OptEIA (BD Pharmingen).
Los resultados se muestran en la Figura 1. Como
es evidente a partir de la Figura 1, la actividad inducible de
IL-12 varió en gran medida incluso entre las cepas
de la misma especie o la misma cepa parental. Entre estas cepas, la
actividad era particularmente elevada en DW69N,
S-PT84 (DS84C) y DS25C. [Inducción de
IL-12 por estimulación in vivo].
Se administró una suspensión (disolvente;
solución salina) de células inactivadas por calor (500 \mug/0,2
ml/ratón) de cada cepa por vía intraperitoneal a ratones BALB/c (7
semanas de edad, macho). Después 6 horas, se realizó la dislocación
cervical y se recogió sangre del corazón. Para los ratones de
control se administró la misma cantidad de solución salina. La
sangre se recogió 6 horas después de la administración debido a que
un análisis preliminar usando S-PT84 había puesto de
manifiesto que la concentración máxima de IL-12 en
suero tiene lugar 6 horas después de la administración de células
muertas (Figura 2). Después de que se hubiera recogido la sangre,
se recogió el suero por centrifugación. Se midió la concentración de
IL-12 en el suero con el kit de ELISA de
IL-12 de ratón OptEIA (BD Pharmingen).
Los resultados se muestran en la Figura 3. Como
es evidente a partir de la Figura 3, la concentración de
IL-12 en suero era significativamente alta para
muestras a las que se administró S-PT84 (DS84C),
DS51C y DS25C, en comparación con el control. Ya que el
S-PT84 (DS84C) tenía la mayor concentración, se usó
solamente esta cepa en experimentos posteriores.
Se eliminaron los bazos de ratones BALB/c (7
semanas de edad, macho) y se prepararon los esplenocitos de acuerdo
con el método normal. Los esplenocitos se cultivaron durante 24
horas en un medio que contenía (1 (\mug/ml) de células
S-PT84 inactivadas por calor. Como un control, los
esplenocitos se cultivaron en solitario en un medio (control). Como
otro control, los esplenocitos también se cultivaron en un medio con
adición de concanavalina A (2,5 \mug/ml) (Con A). Para determinar
el tipo de citocina producida por el estímulo de las células muertas
de S-PT84, se midió la concentración de citocina en
el sobrenadante de cada medio usando el kit CBA (BD Pharmingen). Se
recogieron los esplenocitos y se marcaron con el anticuerpo
anti-CD4 marcado con fluorescencia (marcador
CY-CHCROME^{TM}, BD bioscience), anticuerpo
anti-CD8 (marcador FITC, Immunotech) y anticuerpo
anti-CD69 (marcador PE, BD bioscience) y se
midieron las respectivas proporciones de células positivas a CD4-,
CD8- y CD69- por citometría de flujo (Beckman Coulter).
La Figura 4 ilustra el resultado de la
producción de citocinas. La Figura 4(a) es el resultado para
el control en el que el medio se usó en solitario, la Figura
4(b) es el resultado para S-PT84 en el que se
añadieron las células muertas de S-PT84 al medio y
la Figura 4(c) es el resultado para Con A en el que se añadió
concanavalina A al medio: como es evidente a partir de la Figura 4,
el estímulo de S-PT84 produjo
IFN-\gamma (interferón \gamma) y
TNF-\alpha (factor de necrosis tumoral \alpha),
que no se observaron en el control. Estas citocinas eran citocinas
de tipo Th1. Por lo tanto, se pensaba que el S-PT84
indujo específicamente citocinas de tipo Th1. No se produjeron
citocinas de tipo Th2 tales como IL-4 o
IL-5 en absoluto. Con la estimulación con
concanavalina A, se produjo otro tipo de citocina de tipo Th1,
IL-2 (inter-
leucina 2).
leucina 2).
La Figura 5 muestra cómo las células CD4+, CD8+
y CD69+ estaban afectadas. La Figura 5(a) es el resultado
para el control en el que se usó en solitario el medio. La Figura
5(b) es el resultado para S-PT84 en el que
se añadieron las células muertas de S-PT84 (1
\mug/ml) al medio. La Figura 5(c) es el resultado para Con
A en el que se añadió concanavalina A al medio. En la Figura 5, las
direcciones de las flechas indican números crecientes de células
positivas para cada antígeno de superficie. Como es evidente a
partir de la Figura 5, las células T auxiliares y las células T
asesinas se activaron por el S-PT84.
Se administró una suspensión (disolvente;
solución salina) de células S-PT84 inactivadas por
calor (500 \mug/0,2 ml/ratón) por vía intraperitoneal a ratones
C57BL/6 (7 semanas de edad, macho). Después de 24 horas, se retiró
el hígado y se prepararon linfocitos hepáticos por centrifugación.
Como un control se administró solamente la solución salina por vía
intraperitoneal. Se midió la actividad de NK de los linfocitos
hepáticos por un método PINK. El método PINK es un método para
calcular la actividad citotóxica de los linfocitos de ratón de
acuerdo con el siguiente procedimiento. En primer lugar, un
Yac-1 de célula diana se marca con perclorato de
3,3'-dioctadeciloxacarbocianina (Dio), que es un
colorante fluorescente hidrófobo para marcar una membrana. Después,
el núcleo de la célula muerta se somete a tinción doble con yoduro
de propidio (PI), que es un colorante fluorescente que se une a
ácido nucleico impermeable a membrana. Las células
Yac-1 se detectaron con citometría de flujo, usando
la tinción simple con Dio para células no lesionadas y la tinción
doble para células lesionadas. Además, las demás células hepáticas
se marcaron con el anticuerpo anti-CD4 marcado con
fluorescencia (marcador CY-CHCROME^{TM}, BD
bioscience), anticuerpo anti-CD8 (marcador FITC,
Immunotech) y anticuerpo anti-CD69 (marcador PE, BD
bioscience) y se midieron las respectivas proporciones de células
positivas a CD4, CD8 y CD69 con citometría de flujo (Beckman
Coulter).
La Figura 6 muestra el resultado de la medición
de la actividad de NK. En la Figura 6, la actividad de NK (%)
indica citotoxicidad celular de los linfocitos hepáticos de ratón
contra Yac-1 y la proporción E:T indica el valor
del número de linfocitos hepáticos que han reaccionado frente al
número de células Yac-1. Como es evidente a partir
de la Figura 6, la actividad de NK de los linfocitos hepáticos
preparados a partir de ratones a los que se administró por vía
intraperitoneal S-PT84 era claramente superior a la
del control.
La Figura 7 muestra los resultados para células
CD4+, CD8+ y CD69+, donde la Figura 7(a) es el resultado para
el control y la Figura 7(b) es el resultado con la
administración de S-PT84. Además, en la Figura 7,
las direcciones de las flechas indican números crecientes de
células positivas para cada antígeno de superficie. Como es evidente
a partir de la Figura 7, el número de células CD8+, así como
células CD8+CD69+, aumentó claramente. Por lo tanto, se observó que
la administración de S-PT84 aumenta el número de las
células T asesinas en el hígado, así como el número de células T
asesinas activas.
Se dejó que seis ratones BALB/c (7 semanas de
edad, macho) bebieran agua que contenía S-PT84
(células muertas) durante una semana (equivalente de 2 mg/día).
Como un grupo de control se usaron seis ratones sin
S-PT84. Después de una semana se recogió sangre del
corazón y se eliminó el bazo. El suero se recogió de la sangre por
centrifugación y se midió la concentración de IL-12
en el suero usando el kit de ELISA de IL-12 de ratón
OptEIA (BD Biosciences). Del bazo se prepararon esplenocitos por el
método normal y se recontó el número de las células CD4+, CD8+ y
CD3+ en los linfocitos esplénicos (se realiza la medición con la
citometría de flujo, usando anticuerpos marcados de las respectivas
células). Además, se midió la actividad de NK por el método PINK.
También se realizó una medición de la proporción de Th1/Th2 (se dejó
que 2,5 \mug/ml de concanavalina A actuara sobre 5 x 10^{6}
esplenocitos de ratón durante 24 horas y se midieron las
concentraciones de IL-4 e
IFN-\gamma resultantes en el sobrenadante). La
proporción de Th1/Th2 se obtuvo dividiendo la concentración de
IFN-\gamma por la concentración de
IL-4.
La Figura 8 muestra el resultado de la medición
de la concentración de IL-12 en suero. Como es
evidente a partir de la Figura 8, la concentración de
IL-12 en suero en los ratones a los que se
administró por vía oral S-PT84 era
significativamente mayor que la del grupo de control (Cont).
La siguiente Tabla 3 representa el resultado de
la medición de células CD4+, CD8+ y CD3+. Como es evidente a partir
de la Figura 3, el subconjunto de linfocitos T esplénicos tenía una
tendencia a aumentar.
La Figura 9 muestra el resultado de la medición
de la actividad de NK. En la Figura 9, la actividad de NK (%)
indica la citotoxicidad de los esplenocitos de ratón frente a
Yac-1 y la proporción E:T indica el valor del
número de esplenocitos que han reaccionado frente al número de
células Yac-1. Como es evidente a partir de la
Figura 9, la actividad de NK de los esplenocitos preparados a partir
de los ratones a los que se administró por vía oral
S-PT84 era significativamente superior a la del
grupo de control (Cont).
La Figura 10 muestra el resultado de la medición
de la proporción de Th1/Th2. Como es evidente a partir de la Figura
10, los esplenocitos preparados a partir de ratones a los que se
administró por vía oral S-PT84 tenían una
proporción considerablemente grande de citocina Th1 en comparación
con el grupo de control (Cont).
Como se ha descrito anteriormente, la citocina
de tipo Th1 se indujo en ratones a los que se administró por vía
oral S-PT84. Como resultado, el equilibrio de
Th1/Th2 cambió a dominante en Th1 y la actividad de NK aumentó como
resultado. Esto probó la actividad de ajuste del equilibrio de
Th1/Th2 y la actividad inmunoestimuladora del
S-PT84.
Veinte ratones BALB/c (7 semanas de edad, macho)
se dividieron en dos grupos de peso promedio prácticamente igual, a
fin de proporcionar un grupo al que se administró
S-PT84 y un grupo al que no se administró
S-PT84 (grupo de control). Se dejó que el grupo al
que se administró S-PT84 bebiera agua que contenía
S-PT84 (células muertas) durante 22 días
(equivalente de 2 mg/día). Después 8 días desde el inicio de la
administración se administraron 200 mg/kg de ciclofosfamida (CY)
(fármaco quimioterapéutico antitumoral, agente alquilante) por vía
intraperitoneal a todos los individuos. Se midió el peso de cada
individuo el 1^{er}, 2º, 3^{er}, 5º, 8º, 12º y 15º día desde la
administración de CY.
La Figura 11 muestra cambios en el peso corporal
promedio en ambos grupos. Como es evidente a partir de la Figura
11, se suprimió una pérdida de peso corporal provocada por la
administración de CY en el grupo al que se administró
S-PT84 en comparación con el grupo de control
(Control).
Se dividieron ratones BALB/c (7 semanas de edad,
macho) en 5 grupos: un grupo no tratado (5 ratones); un grupo al
que no se administró S-PT84 y al que no se
administró CY (10 ratones); un grupo al que no se administró
S-PT84 y al que se administró CY (10 ratones); un
grupo al que administró S-PT84 y al que no se
administró CY (10 ratones); y un grupo al que se administró
S-PT84 y al que se administró CY (11 ratones). Se
dejó que los dos grupos a los que administró S-PT84
bebieran agua que contenía S-PT84 (células muertas)
durante 12 días (equivalente de 2 mg/día). Después de 7 días desde
el inicio de la administración se administraron 200 mg/kg de
ciclofosfamida (CY) (fármaco quimioterapéutico antitumoral, agente
alquilante) por vía intraperitoneal a los grupos a los que se
administró CY. Después de 5 días desde la administración de CY, se
administró por vía intraperitoneal una suspensión (disolvente;
solución salina) de células inactivadas por calor de
S-PT84 (500 \mug/0,2 ml/ratón) a los ratones de
todos los grupos excepto el grupo no tratado. Seis horas después de
la administración de células muertas de S-PT84, se
recogió sangre del corazón de todos los individuos, incluyendo los
del grupo no tratado. De la sangre recogida se recogió el suero por
centrifugación
y se midió la concentración de IL-12 en el suero con el kit de ELISA de IL-12 de ratón OptEIA (BD Pharmingen).
y se midió la concentración de IL-12 en el suero con el kit de ELISA de IL-12 de ratón OptEIA (BD Pharmingen).
Los resultados se muestran en la Figura 12. Como
es evidente a partir de la Figura 12, la administración de CY en el
grupo al que no se administró S-PT84 redujo la
concentración de IL-12 en el suero en una cantidad
considerable. Por otro lado, en el grupo al que se administró
S-PT84, la reducción de la concentración de
IL-12 en el suero provocada por la administración de
CY estaba suprimida significativamente y la concentración de
IL-12 en el suero era prácticamente igual a la del
grupo de control.
A partir de estos resultados, se probó que el
S-PT84 tiene la capacidad de suprimir una pérdida de
peso y una reducción inmune provocada por CY. En otras palabras, se
confirmó la actividad inmunoestimuladora del
S-PT84.
Se dividieron treinta y seis ratones BALB/c (7
semanas de edad, macho) en cuatro grupos: un grupo no tratado (5
ratones); un grupo de control (10 ratones); un grupo de
S-PT84 (11 ratones); y un grupo al que se administró
dexametasona (10 ratones). Se dejó que el grupo de
S-PT84 bebiera agua que contenía
S-PT84 (células muertas) durante 7 semanas
(equivalente de 2 mg/día). Al grupo al que se administró Dex se
administro de forma forzosa 0,5 mg/kg de S-PT84
durante 7 semanas por administración oral. Se dejó que el grupo no
tratado y el grupo de control bebieran agua del grifo durante 7
semanas. Obsérvese que la Dex es un fármaco esteroideo con
actividades anti-alérgicas y
anti-inflamatorias y se usó como un fármaco de
control positivo. Una semana y dos semanas después de la captación
de S-PT84 o la administración de Dex, se administró
por vía intraperitoneal una mezcla que contenía 20 \mug de
ovoalbumina (OVA) y 2 mg de gel de hidróxido de aluminio a los
ratones de todos los grupos excepto el grupo no tratado. Desde la
segunda administración (0 semanas) a la 5^{a} semana se recogió
sangre cada semana durante un total de 6 veces de todos los
individuos y se midió una concentración de IgE específica de OVA.
La medición de la concentración de IgE específica de OVA en el suero
se realizó de acuerdo con el método ELISA usando un kit de ELISA de
IgE de ratón OptEIA modificado (BD Pharmingen) en el que se aplicó
como recubrimiento OVA en lugar del anticuerpo de captura. Usando la
muestra de sangre de la tercera semana se midió la IgE total. La
medición de IgE total se realizó de acuerdo con el método ELISA
usando el kit de ELISA de IgE de ratón OptEIA.
La Figura 13 muestra los cambios en la
concentración de IgE específica de OVA en la 3^{a} semana desde el
inicio del experimento. La Figura 14 muestra el resultado de la
medición de la concentración de IgE total. Como es evidente a
partir de la Figura 13, el grupo de S-PT84 suprimió
significativamente el aumento de la concentración de IgE específica
de OVA en comparación con el grupo de control (control). En el grupo
de Dex, el resultado no era significativamente diferente del grupo
de control, aunque se observó cierto efecto supresor. Además, como
es evidente a partir de la Figura 14, el grupo de
S-PT84 y el grupo de Dex suprimieron
significativamente el aumento de la concentración de IgE total en
comparación con el grupo de control (control).
Fue evidente a partir de estos resultados que el
S-PT84 tenía una actividad
anti-alérgica.
Nueve ratones C57BL/6 (6 semanas de edad, macho)
se dividieron en tres grupos de un peso promedio prácticamente
igual, a fin de proporcionar un grupo de control (3 ratones), un
grupo estresado (3 ratones) y un grupo al que se administró
S-PT84 y estresado (3 ratones). Se dejó que el grupo
al que se administró S-PT84 bebiera agua que
contenía S-PT84 (células muertas) durante 7 días
(equivalente de 2 mg/día). El octavo día de la administración, un
total de 6 ratones en el grupo estresado y el grupo al que se
administró S-PT84 y estresado se sumergieron en
agua, se pusieron en un tubo de polietileno de 50 ml cuya punta
tenía una ventilación de aire y se restringieron durante 24 horas.
El grupo de control se dejó sin bebida y agua. De cada animal se
retiró el bazo y se prepararon linfocitos esplénicos para la
medición de la actividad de NK.
La Figura 15 muestra el resultado de la medición
de la actividad de NK. El grupo estresado mostró una caída
significativa en la actividad de NK en comparación con el grupo de
control. El grupo al que se administró S-PT84 y
estresado mantuvo una actividad de NK comparable con la del grupo de
control, es decir, el nivel de actividad de NK era
significativamente superior que el del grupo estresado. Esto probó
que el S-PT84 tenía la actividad de suprimir la
inmunorreducción inducida por estrés.
Se compararon las actividades
inmunoestimuladoras entre células muertas y células viables de las
bacterias de ácido láctico. Para la comparación, se usaron las
bacterias de ácido láctico que aumentaron la concentración de
IL-12 en suero de ratón en respuesta a la
administración intraperitoneal como se muestra en la Figura 3.
Se prepararon suspensiones de 4 tipos de
bacterias de ácido láctico (DB22C, DS51C, DS2C y DS84C
(S-PT84)), en forma tanto de células inactivadas
por calor como células viables (que pesaban cada una 500 \mug
(2,5x10^{8}/0,2 ml/ratón)). Las suspensiones se administraron por
vía intraperitoneal a ratones BALB/c (7 semanas de edad, macho).
Después de 6 horas, se realizó la dislocación cervical y se recogió
sangre del corazón. Como un control, se usó un ratón al que se
administró la misma cantidad de solución salina en lugar de las
bacterias de ácido láctico.
Después de que se hubiera recogido la sangre, se
recogió el suero por centrifugación. La concentración de
IL-12 en el suero se midió con el OptEIA (BD
Pharmingen). Los resultados se muestran en la Figura 16.
Como en el caso de la Figura 3, la cantidad de
IL-12 en suero era mayor para las muestras a las que
se administró DS84C (S-PT84). Como es evidente a
partir de la Figura 16, la cantidad de IL-12 era
mayor en las muestras a las que se administraron las células
viables de DS84C (S-PT84) que en las muestras a las
que se administraron las células muertas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de producción
1
Se produjo un medicamento que contenía
S-PT84 (comprimido) de acuerdo con los siguientes
procedimientos.
Una mezcla que contenía 66,7 g de un polvo
pulverizado secado de S-PT84, 232,0 g de lactosa y
1,3 g estearato de magnesio se troqueló con una máquina de
formación de comprimidos de un solo troquel a fin de producir
comprimidos que tuvieran un diámetro de 10 mm y un peso de 300
mg.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de producción
2
Se añadió leche fermentada por
S-PT84 con un componente de leche de sólido del 21%
a leche disponible en el mercado y se dejó la mezcla reposara
durante 3 días a fin de preparar yogurt. El yogurt resultante tenía
un sabor deseable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de producción
3
Mediante el uso de S-PT84 se
preparó una bebida de bacterias de ácido láctico con las
composiciones mostradas en la Tabla 4. La bebida de bacterias de
ácido láctico resultante tenía un sabor deseable.
Habiéndose descrito la invención de este modo,
será obvio que la misma se puede variar de muchas maneras. No se
tiene que considerar que tales variaciones son un alejamiento del
espíritu y alcance de la invención y todas estas modificaciones
como serían obvias para el especialista en la técnica tienen por
objeto incluirse en el alcance de las siguientes
reivindicaciones.
Una composición de acuerdo con la presente
invención, si se dedica a alimento o bebida, o se administra como
medicamentos, permite activar la función inmune y, por lo tanto,
suprime la reducción de las funciones inmunes. Además, al ajustar
el equilibrio de la función inmune, se pueden suprimir los efectos
adversos del exceso de función inmune del cuerpo.
Se puede implementar una composición de acuerdo
con la presente invención como bebida sanitaria o medicamentos con
actividades inmunorreguladoras. Por lo tanto, la invención es útil
para industrias alimentarias e industrias farmacéuticas.
<110> Suntory Limited
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Una composición que tiene
actividades inmunorreguladoras que comprende Lactobacillus
pentosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M3438EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/JP2005/006585
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
29-03-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2004-159461
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-05-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus pentosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (7)
1. Una composición que comprende bacterias de
ácido láctico que pertenecen a Lactobacillus pentosus y que
tienen una actividad de asimilación débil o ninguna actividad de
asimilación para glicerol y donde las bacterias de ácido láctico
son una cepa S-PT84 de Lactobacillus pentosus
(Nº de Acceso de Depósito FERM BP-10028, Nº de
Recibo de Depósito FERM ABP-10028).
2. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que las bacterias de ácido láctico tienen
actividades inmunorreguladoras y/o actividades
anti-alérgicas.
3. La composición de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que las bacterias de ácido láctico son una
cepa productora de polisacárido extracelular.
4. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la composición tiene actividades
inmunorreguladoras.
5. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la composición tiene actividades
anti-alérgicas.
6. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la composición contiene bacterias de ácido
láctico como células viables.
7. La composición de acuerdo con la
reivindicación 4, donde la composición es alimento, una bebida o un
medicamento.
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