ES2336229T3 - Utilizacion de formoterol en el tratamiento profilactico y/o terapeutico de la perdida muscular y/o el sindrome caquectico que estan asociados con los estados catabolicos de determinadas enfermedades, tales como el cancer, el sida, las infecciones, la diabetes y otras. - Google Patents
Utilizacion de formoterol en el tratamiento profilactico y/o terapeutico de la perdida muscular y/o el sindrome caquectico que estan asociados con los estados catabolicos de determinadas enfermedades, tales como el cancer, el sida, las infecciones, la diabetes y otras. Download PDFInfo
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Abstract
El formoterol, utilizado hasta ahora para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma, exhibe una potente eficiencia anti-caquectica con relativamente bajos efectos secundarios adversos y toxicidad. Asi, la invencion se refiere al use del formoterol o sussales o solvatos farmaceuticamente aceptables, particularmente fumarato o fumarato dihidrato, para Ia preparacion de un medicamento para el tratamiento profilactico y/o terapeutico del desgastemuscular y/o un sIndrome caquectico, ambos asociados a un estadocatabolico en un mamifero, en particular un humano. Algunos estados catabolicos que se pueden tratar con formoterol son cancer, elsindrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infecciones,diabetes, estados de inmobilizacion o distrofias musculares.
Description
Utilización de formoterol en el tratamiento
profiláctico y/o terapéutico de la pérdida muscular y/o el síndrome
caquéctico que están asociados con los estados catabólicos de
determinadas enfermedades, tales como el cáncer, el sida, las
infecciones, las diabetes y otras.
La presente invención se refiere al campo de la
medicina humana, y específicamente a una nueva utilización de un
compuesto destinado al tratamiento de enfermedades o estados
particulares en el ser humano.
Quizá la manifestación más común de la
enfermedad maligna avanzada es el desarrollo de caquexia de cáncer.
En efecto, la caquexia se produce en la mayoría de pacientes de
cáncer, y es responsable de la muerte de 22% de ellos. Además de en
el cáncer, la caquexia se produce asociada a otras enfermedades o
estados, tales como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA), traumatismo o sepsis. Entre las anormalidades asociadas a
la caquexia se incluyen anorexia, pérdida de peso, pérdida y atrofia
musculares, anemia y alteraciones del metabolismo de los
carbohidratos, de los lípidos y de las proteínas (ver Argilés J.M.
et al., "The metabolic basis of cancer cachexia", Med.
Res. Rev. 17:477-98, 1997). El grado de caquexia
está inversamente correlacionado con el tiempo de supervivencia del
paciente y siempre implica un prognóstico pobre. Una de las
características más relevantes de la caquexia es la astenia (es
decir, la falta de fuerza muscular), que refleja la importante
pérdida de masa muscular que tiene lugar en el paciente caquéctico
de cáncer. La astenia también se caracteriza por una debilidad
general, así como por fatiga física y mental. Además, la reducción
de la masa corporal magra es una de las tendencias principales de
la caquexia e implica no sólo el músculo esquelético sino que
también afecta a las proteínas cardiacas, resultando en importantes
alteraciones del comportamiento cardiaco.
Se han propuesto varias estrategias para tratar
la caquexia, aunque sólo algunas han alcanzado un nivel clínico con
resultados positivos. Sin embargo, la mayoría de ellas han mostrado
problemas derivados de su utilización. Entre los fármacos
anticaquécticos más ampliamente utilizados se encuentran varios
derivados de la progesterona (por ejemplo el acetato de megestrol y
la medroxiprogesterona), que pueden mejorar el apetito y la ganancia
de peso, aunque el incremento observado de la masa corporal se debe
principalmente a una masa grasa y retención de agua incrementados,
sin efectos significativos sobre el índice de Kamofsky (una medida
del nivel de actividad para los pacientes de cáncer). El
canabinoide dronabinol puede mejorar la caquexia en pacientes tanto
de cáncer como de SIDA, aunque muchos de ellos experimentan efectos
secundarios, tales como euforia, mareo, somnolencia y confusión. Se
ha utilizado la insulina como intensificador del apetito (con el fin
de mejorar la anorexia), pero se ha demostrado que está asociada a
un incremento del peso tumoral. Los corticoesteroides (por ejemplo
la dexametasona o la prednisolona), en el caso de que se utilicen en
tratamientos prolongados, aparentemente conducen a un estado de
debilidad, delirio, osteoporosis e inmunosupresión, y aparentemente
no presentan ningún efecto significativo sobre la reducción de la
mortalidad. El clembuterol es otro compuesto que ha demostrado
algún efecto anticaquéctico, pero su toxicidad en el ser humano y en
animales (especialmente sus efectos negativos sobre el corazón) no
ha permitido la realización de ensayos clínicos (ver Carbó N. et
al., "Comparative effects of beta2-adrenergic
agonists on muscle waste associated with tumor growth", Cancer
Lett. 115:113-8, 1997; Hoffman R.J. et al.,
"Clembuterol ingestion causing prolonged tachycardia, hypokalemia,
and hypophosphatemia with confirmation by quantitative levels",
J. Toxicol. Clin. Toxicol. 39:339-44, 2001). La
utilización de anticuerpos y receptores solubles de citoquinas es
un enfoque prometedor para tratar la caquexia, aunque estos
tratamientos son excesivamente caros debido a que requieren un
número muy grande moléculas para bloquear por completo la acción de
las citoquinas. La utilización de esteroides anabólicos (por ejemplo
la nandrolona y la oximetolona) presenta importantes efectos
secundarios adversos, tales como la masculinización, la retención
de fluidos y la toxicidad hepática. El sulfato de hidrazina ha sido
utilizado como fármaco anticaquéctico, pero presenta algunos
problemas derivados de su toxicidad (ver Argilés J.M. et al.,
"Cancer cachexia: a therapeutic approach", Med. Res. Rev.
21:83-101, 2001).
De esta manera, resulta altamente deseable
proporcionar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la
caquexia y la pérdida de masa muscular. En particular, resulta
deseable disponer de nuevos agentes terapéuticos con una eficiencia
anticaquéctica elevada y consecuencias no tóxicas.
En el contexto de la presente invención se ha
descubierto que el formoterol, utilizado hasta ahora para el
tratamiento del broncoespasmo asociado al asma, muestra una potente
eficiencia anticaquéctica con efectos secundarios adversos
relativamente reducidos y baja toxicidad.
El formoterol es un compuesto racémico que
presenta la fórmula química adjunta (mostrando la estereoquímica
relativa de uno de los dos enantiómeros) y es un agonista selectivo
para el adrenoceptor \beta_{2} altamente potente que combina
las ventajas clínicas de un rápido inicio y una duración prolongada
de su acción. Este compuesto se utiliza en el ser humano para el
tratamiento del broncoespamo asociado al asma. El formoterol in
vitro es un potente relajante del músculo liso de las vías
respiratorias de eficacia elevada y muy elevada afinidad y
selectividad para el adrenoceptor \beta_{2}. Además de la
relajación del músculo liso de las vías respiratorias, el
formoterol inhibe un abanico de procesos inflamatorios agudos en
modelos animales, incluyendo la activación e infiltración de
eosinófilos en las vías respiratorias, la fuga microvascular y la
liberación de mediador inducida por antígeno en los pulmones en el
ser humano. Además, el formoterol relaja el músculo liso bronquial
y también proporciona importantes beneficios clínicos en pacientes
sintomáticos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). El
formoterol, como otros agonistas adrenoceptores \beta_{2} de
acción prolongada, atenúa la reacción asmática tardía inducida por
alérgeno y, bajo determinadas condiciones, presenta más efecto que
otros agonistas adrenoceptores \beta_{2}, tales como el
salbutamol y el salmeterol (ver Linden A. et al.,
"Salmeterol, formoterol y salbutamol in the isolated guinea pig
trachea: differences in maximum relaxant effect and potency but not
in functional antagonism", Thorax 48:547-53,
1993).
La presente invención se refiere a la
utilización del formoterol o de una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo, o de un solvato farmacéuticamente aceptable de cualquiera
de las mismas, para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la reducción de la masa
muscular y/o del síndrome caquéctico, encontrándose ambos asociados
a un estado catabólico en un mamífero, en particular en el ser
humano. La expresión "estado catabólico" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a una situación fisiopatológica en
la que se encuentran activadas las rutas catabólicas. Son ejemplos
de rutas catabólicas la glucogenolisis hepática, la lipolisis en el
tejido adiposo, la proteolisis en el músculo esquelético y la
termogénesis. De esta manera, la invención puede utilizarse para el
tratamiento de un paciente que sufre de pérdida de masa muscular
y/o de síndrome caquéctico, asociados ambos a un estado catabólico
en un mamífero, en particular en el ser humano, que comprende la
administración de una dosis terapéutica aceptable de formoterol o
de sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo,
conjuntamente con excipientes farmacéuticamente aceptables. En una
forma de realización particular, el fumarato de formoterol, sin
modificación o en forma de dihidrato, se utiliza para dichas
indicaciones terapéuticas.
El formoterol ejerce una acción protectora
selectiva potente sobre el corazón y el músculo esquelético mediante
el antagonismo de la degradación incrementada de las proteínas que
caracteriza la caquexia de cáncer. De esta manera, a la inversa de
lo que se observa con otros agonistas \beta_{2} que presentan
numerosos efectos secundarios y considerable toxicidad en el ser
humano, el formoterol es un agente terapéutico conveniente en
estados patológicos en los que el hipercatabolismo de las proteínas
musculares es una característica crítica, tal como la caquexia de
cáncer u otras enfermedades con reducción de la masa muscular.
En las formas de realización particulares de la
invención, el formoterol o las sales y/o solvatos farmacéuticamente
aceptables del mismo pueden utilizarse para el tratamiento de la
pérdida de masa muscular o del síndrome caquéctico asociado a:
cáncer, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), sepsis,
diabetes, estados de inmovilización, quemaduras severas, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica, envejecimiento, patologías
cardiovasculares, patologías hepáticas, artritis reumatoide,
trastornos de la alimentación, acidosis, enfermedades
neuromusculares, enfermedad de Alzheimer, hiperadrenocortisolismo,
hipertiroidismo, síndrome de Cushing, atrofias y distrofias
musculares, colitis ulcerosa, síndrome de fatiga crónica,
insuficiencia renal, cirrosis hepática, enfermedad de Crohn y un
estado de reducción de la masa muscular debido a ingravidez.
El tratamiento con formoterol presenta un claro
efecto protector del músculo esquelético y del corazón en términos
de peso de tejido húmedo. Además, el formoterol proporciona una
acción trófica significativa sobre los músculos también en no
portadores de tumores, particularmente en los gastrocnemios,
tibiales, EDL (extensor digital largo) y en el músculo cardíaco,
mientras que el sóleo no resulta afectado significativamente.
Respecto a los tejidos adiposos, el tratamiento de formoterol
induce un incremento del peso de tejido adiposo marrón. Además, el
tratamiento de formoterol no altera ni el peso de los tumores
sólidos ni la cantidad de alimento ingerido.
Dependiendo de las circunstancias, un experto en
la materia podrá seleccionar una vía de administración apropiada
para el formoterol o las sales y/o solvatos farmacéuticamente
aceptables del mismo, tal como la vía oral, nasal, parenteral,
subcutánea, tópica, etc. El experto en la materia también podrá
seleccionar un sistema de administración adecuado para la vía de
administración seleccionada.
Las formas de realización particulares y los
dibujos siguientes se proporcionan a título ilustrativo, y no
limitativo de la presente invención.
La figura 1 representa la transferencia northern
de músculos gastrocnemios procedentes de ratas de control (C),
ratas tratadas con formoterol (C+F), ratas portadoras de tumor
(hepatoma ascítico Yoshida AH-130) (TB) y ratas
portadoras de tumor tratadas con formoterol (TB+F). La expresión de
ARNm de ubiquitina (UB), de subunidad C8 del proteasoma (C8), de
m-calpaína (m-cal) y de catepsina B
(catB) en músculos gastrocnemios se detectó tras la hibridación con
sondas de ADNc. Se utilizó una sonda de ARNr 18S (18S) para la
cuantificación total y la corrección de carga. Se sometieron
autorradiografías a densitometría de barrido.
La figura 2 representa la apoptosis en músculos
tibiales procedentes de ratas de control (C), de ratas tratadas con
formoterol (C+F), de ratas portadoras de tumor (hepatoma ascítico
Yoshida AH-130) (TB) y de ratas portadoras de tumor
tratadas con formoterol (TB+F). Los resultados son medias \pm SEM
para cinco animales en cada grupo. Figuras 2A y 2B: se evaluó la
fragmentación del ADN a partir del seguimiento del escalonado de los
fragmentos en un gel de agarosa. Se cuantificó el porcentaje de
fragmentación del ADN mediante densitometría de barrido. Se
utilizaron hígados de ratones tratados con anticuerpo
anti-Fas (C+) como control positivo. Figura 2C: se
determinó la actividad de caspasa-3 mediante un
ensayo colorimétrico; los resultados se expresan en nmoles/hora.
Significancia estadística de los resultados (de pruebas t de
Student): figura 2A: no tratados frente a F:
\dagger\daggerp<0,01; figura 2C: C frente a TB: *p<0,05,
no tratado frente a F: \dagger\dagger\daggerp<0,001.
La figura 3 representa la transferencia northern
de músculos gastrocnemios procedentes de ratones de control (C), de
ratones tratados con formoterol (C+F), de ratones portadores de
tumor (carcinoma pulmonar de Lewis) (TB) y de ratones portadores de
tumor tratados con formoterol (TB+F). El procedimiento seguido y las
abreviaturas son análogas a las de la figura 1.
En los diferentes experimentos se utilizaron
ratas Wistar macho (Interfauna, Barcelona, España) que pesaban
aproximadamente 110 gramos y ratones C57BI/6 (Criffa, Barcelona,
España) de aproximadamente 12 semanas de edad. Los animales se
mantuvieron a 22 \pm 2ºC bajo un ciclo regular de
luz-oscuridad (luz encendida entre 08:00 y 20:00) y
disponían de libre acceso a comida y agua. La dieta (B.K. Universal
G.J./S.L., Sant Vicenç dels Horts, Barcelona, España) consistía en
45,5% a 48,5% de carbohidratos (3,5% de glucosa absorbible, 42% a
45% de almidón), 18,5% de proteínas y 3,1% de grasas (el residuo era
material no digerible). Se midió diariamente la cantidad de
alimento ingerido. Todas las manipulaciones de los animales se
realizaron según las directrices de la Comunidad Europea para la
utilización de animales de laboratorio. Todos los compuestos
bioquímicos eran de grado reactivo y se obtuvieron de Roche S.A.
(Barcelona, España) o de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Los compuestos químicos radioactivos se obtuvieron de Amersham Int.
(Amersham, Bucks., Reino Unido) y el fumarato de formoterol
micronizado, de Industriale Chimica s.r.l. (Saronno, Italia).
Hepatoma ascítico Yoshida
AH-130: es un tumor de rata que crece
exponencialmente durante 4 a 5 días y entra en una etapa
estacionaria alcanzado el día 7 tras el trasplante. Las ratas se
dividieron en dos grupos: controles y huéspedes de tumor. Las
últimas recibieron una inoculación intraperitoneal de 10^{8}
células de hepatoma ascítico Yoshida AH-130
obtenidas de tumores exponenciales. Ambos grupos se dividieron
adicionalmente en tratadas y no tratadas, recibiendo las primeras
la administración de una dosis intraperitoneal (i.p.) diaria de
formoterol (2 mg/kg de peso corporal (pc), disuelta en solución
fisiológica) y las últimas un volumen correspondiente de solvente.
El día 7 después del trasplante de tumores, se pesaron los animales
y se anestesiaron con una inyección i.p. de mezcla de
quetamina/xilazina (3:1) (Imalgene® y Rompun®, respectivamente). Se
recolectó el tumor de la cavidad peritoneal y se evaluó su volumen
y celularidad. Se recogió sangre de la aorta abdominal en tubos
heparinizados y se centrifugaron (3.500 xg, 10 minutos, 4ºC) para
obtener el plasma. Se extirparon rápidamente los tejidos, se
pesaron y se congelaron en nitrógeno líquido.
En el tratamiento de combinación de formoterol y
pentoxifilina, los grupos experimentales fueron los siguientes:
ratas de control y ratas portadoras de tumor, dos, cuatro y siete
días después de la inoculación de los tumores. Ambos grupos se
dividieron adicionalmente en tratadas y no tratadas, recibiendo las
primeras la administración de una dosis subcutánea (s.c.) diaria de
formoterol (3 mg/kg de peso corporal (pc) y de pentoxifilina (10
mg/kg de peso corporal (pc), disuelta en solución fisiológica), y
las últimas con el volumen correspondiente de solvente. Los días
dos, cuatro y siete después de la inoculación de los tumores, se
sacrificaron los animales.
En el tratamiento con dosis diferentes de
formoterol, los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas
portadoras de tumor sin tratamiento y ratas portadoras de tumor
tratadas subcutáneamente con diferentes dosis de formoterol (0,3,
1, 3 y 10 mg/kg de peso corporal). El día siete después de la
inoculación de los tumores, se sacrificaron los animales.
En el tratamiento con dosis bajas de formoterol,
los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas de control y
ratas portadoras de tumor, dos, cuatro y siete días después de la
inoculación de los tumores. Ambos grupos se dividieron
adicionalmente en tratadas y no tratadas, recibiendo las primeras la
administración de una dosis subcutánea (s.c.) diaria de formoterol
(0,3 mg/kg de peso corporal (pc), disueltos en solución fisiológica)
y las últimas el volumen correspondiente de solvente. Los días dos,
cuatro y siete después de la inoculación de los tumores, se
sacrificaron los animales.
En el tratamiento de la lesión muscular, los
grupos experimentales fueron los siguientes: ratas de control,
ratas con lesiones musculares provocadas por una inyección aguda de
bupivacaína (al 0,5%), ratas con lesiones musculares provocadas por
una inyección aguda de bupivacaína (al 0,5%) y que habían sido
tratadas con formoterol durante los últimos siete días, ratas con
lesiones musculares provocadas por una inyección aguda de
bupivacaína (al 0,5%) y que habían sido tratadas con formoterol
durante los catorce días. El tratamiento de formoterol fue una
dosis subcutánea diaria de formoterol de 0,3 mg/kg de peso corporal
disueltos en solución fisiológica.
En todos los experimentos, se extirpó el tumor
de la cavidad peritoneal y se evaluó su volumen y celularidad. Se
recogió sangre de la aorta abdominal en tubos heparinizados y se
centrifugó (3.500 g, 10 minutos, 4ºC) para obtener el plasma. Los
tejidos se extirparon rápidamente, se pesaron y se congelaron en
nitrógeno líquido.
Carcinoma pulmonar de Lewis: es un
sistema modelo adecuado para estudiar los mecanismos implicados en
el establecimiento de la caquexia. Este tumor ha sido descrito como
un epidermoide anaplásico de tendencia hemorrágica marcada, que
regular, espontánea y consistentemente produce múltiples metástasis
pulmonares. Su crecimiento causa en el huésped una rápida y
progresiva pérdida de peso corporal y una reducción de la masa de
tejido, particularmente del músculo esquelético. Los ratones se
dividieron en dos grupos: controles y huéspedes tumorales. Los
huéspedes tumorales recibieron una inoculación de 5x10^{5}
células de carcinoma pulmonar de Lewis obtenidas de tumores
exponenciales, proporcionada intramuscularmente (muslo izquierdo).
El desarrollo de un nódulo en el flanco de la inyección de tamaño
creciente hasta 20% del peso del animal se consideró indicativo de
la efectividad de la inoculación. Ambos grupos se dividieron
adicionalmente en tratadas y no tratadas, recibiendo las primeras
la administración, durante los últimos 9 días antes del sacrificio,
de una dosis i.p diaria de formoterol (2 mg/kg p.c., disueltos en
solución fisiológica) y las últimas, un volumen correspondiente de
solvente. El día 15 después del trasplante tumoral, los animales se
pesaron y se anestesiaron con una mezcla de quetamina/xilazina
(i.p.) (Imalgene® y Rompun®, respectivamente). Se extirpó el tumor
de la pata trasera y se determinó su masa. Se extirparon
rápidamente muestras de los tejidos, se pesaron y se congelaron en
nitrógeno líquido.
Se extrajo el ARN total de músculo EDL
utilizando el método de isotiocianato de guanidinio
ácido/fenol/clorofor-
mo. Se desnaturalizaron muestras de ARN (20 \mug), se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,2% que contenían formaldehído al 6,3% y se transfirieron a membranas Hybond N (Amersham). Se fijó el ARN a la membrana con Genelinker. El ARN en los geles y en los filtros se visualizó con bromuro de etidio y se fotografió mediante transiluminación U.V. para garantizar la integridad del ARN, para comprobar la carga de cantidades equivalentes de ARN y para confirmar que se había producido correctamente la transferencia. El ARN se transfirió en solución salina citrato estándar 20x (SSC, NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, pH 7,0). La hibridación se realizó a 65ºC durante la noche en el tampón de hibridación (Na_{2}HPO_{4} 0,25 M/SDS al 7%/EDTA 1 mM/BSA al 1%/dextrán sulfato al 10%) y se añadieron sondas marcadas desnaturalizadas (10^{6} a 10^{7} cpm/ml). Las sondas marcadas radioactivamente se prepararon mediante el método del cebador aleatorio (Amersham). La sonda ubiquitina utilizada fue un clon de ADNc que contenía 12 pares de la segunda secuencia codificante de ubiquitina más una tercera y una cuarta secuencias codificantes de ubiquitina y 120 pares de bases de la región 3' no traducida del gen UBI de la poliubiquitina de pollo. También se hibridaron las membranas con sondas de ADNc codificantes de C8, C9, enzima conjugante E2, m-calpaína de rata y catepsina B de rata. Los filtros se expusieron a película Hyperfilm-MP (Amersham) a -80ºC durante 1 a 4 días y las películas se cuantificaron mediante densitometría de barrido. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante pruebas t de Student.
mo. Se desnaturalizaron muestras de ARN (20 \mug), se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,2% que contenían formaldehído al 6,3% y se transfirieron a membranas Hybond N (Amersham). Se fijó el ARN a la membrana con Genelinker. El ARN en los geles y en los filtros se visualizó con bromuro de etidio y se fotografió mediante transiluminación U.V. para garantizar la integridad del ARN, para comprobar la carga de cantidades equivalentes de ARN y para confirmar que se había producido correctamente la transferencia. El ARN se transfirió en solución salina citrato estándar 20x (SSC, NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, pH 7,0). La hibridación se realizó a 65ºC durante la noche en el tampón de hibridación (Na_{2}HPO_{4} 0,25 M/SDS al 7%/EDTA 1 mM/BSA al 1%/dextrán sulfato al 10%) y se añadieron sondas marcadas desnaturalizadas (10^{6} a 10^{7} cpm/ml). Las sondas marcadas radioactivamente se prepararon mediante el método del cebador aleatorio (Amersham). La sonda ubiquitina utilizada fue un clon de ADNc que contenía 12 pares de la segunda secuencia codificante de ubiquitina más una tercera y una cuarta secuencias codificantes de ubiquitina y 120 pares de bases de la región 3' no traducida del gen UBI de la poliubiquitina de pollo. También se hibridaron las membranas con sondas de ADNc codificantes de C8, C9, enzima conjugante E2, m-calpaína de rata y catepsina B de rata. Los filtros se expusieron a película Hyperfilm-MP (Amersham) a -80ºC durante 1 a 4 días y las películas se cuantificaron mediante densitometría de barrido. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante pruebas t de Student.
Se determinó la actividad similar a
quimotripsina del proteasoma muscular a partir de la evaluación de
los cortes en el sustrato fluorogénico específico
succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-metilcoumarina
(LLVY). Se homogeneizó el músculo gastrocnemio en
Tris-HCl 20 mM, pH 7,2, que contenía EDTA 0,1 mM,
2-mercaptoetanol 1 mM, ATP 5 mM, glicerol al 20% y
Triton X-100 al 0,04% (v/v). A continuación, se
centrifugaron los homogenados musculares (13.000 g, 15 minutos,
4ºC). Se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de
proteínas utilizando el ensayo BCA (Pierce Chemical Co.). A
continuación, se incubaron alícuotas de 40 \mug de proteína
durante 60 minutos a 37ºC en presencia de LLVY 40 \muM. El tampón
de incubación para la evaluación de la actividad del proteasoma era
HEPES 50 mM, pH 8,0, que contenía EGTA 5 mM. Se leyó la
fluorescencia con un espectrofluorómetro (longitudes de onda de
excitación y de emisión: 380 y 460 nm, respectivamente;
espectrofluorofotómetro RF-5001 PC, Shimadzu). La
actividad, expresada como nkatales/mg de proteína referidos al
reservorio total de proteínas, se calculó mediante la utilización
de la amidocoumarina libre como estándar de trabajo. El resultado
final es la diferencia entre los nkatales obtenidos en presencia y
en ausencia de lactacistina 25 \muM, un inhibidor específico del
proteasoma.
Se llevó a cabo un ensayo de fragmentación del
ADN en músculo tibial tal como se ha descrito anteriormente (ver
Van Royen M. et al., "DNA fragmentation occurs in skeletal
muscle during tumor growth: a link with cancer cachexia?",
Biochem. Biophys. Res. Commun. 270:533-7, 2000). Se
determinó la actividad de caspasa-3 en músculo
tibial utilizando el kit de ensayo colorimétrico de
caspasa-3 BD Apoalert^{TM} (BD Biosciences
Clontech, USA).
Se aislaron extractos de proteínas nucleares
procedentes de músculo tibial tal como se ha informado anteriormente
(ver Blough E. et al., "Extraction of nuclear proteins
from striated muscle tissue", Biotechniques
26:202-4, 1999) y la concentración de proteínas se
determinó utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, USA).
Los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de consenso de
NF-\kappaB (factor nuclear kappa B),
AP-1 (proteína activadora 1) y C/EBP (proteína
intensificadora de unión a CCAAT) se marcaron en los extremos
utilizando [\alpha^{32}P]dCTP y enzima Klenow. Los
oligoucleótidos de doble cadena marcados en los extremos (30.000
cpm) se incubaron durante 10 minutos en hielo con 150 \mug de
extracto de proteínas nucleares. Las reacciones se llevaron a cabo
en un volumen final de 20 \mul que contenía glicerol al 12%, Hepes
12 mM (pH 7,9), Tris-HCl 4 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM
(pH 8), ditiotreitol (DTT) 1 mM, KCl 25 mM, MgCl_{2}
5 mM, 40 \mug/ml de polidI-dC (ácido
desoxinosínico-desoxicitidílico) e inhibidores de
proteasa (PMSF, aprotinina y leupeptina). Al final de la
incubación, las muestras mezcladas se sometieron a electroforesis a
4ºC a 325 V durante 60 a 80 minutos en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante al 7% en 0,5x
Tris-borato-EDTA. Tras la
electroforesis, el gel se secó durante 120 minutos en un secador de
gel BioRad y se expuso durante la noche a película sensible a los
rayos X (Hyperfilm-MP, Amersham Biosciences) a -80ºC
con pantallas intensificadoras. Se confirmó la especificidad de las
bandas NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP
mediante reacciones con oligonucleótidos mutantes marcados en los
extremos.
La determinación de la expresión génica de
Pax-7 y de miogenina se llevó a cabo mediante PCR en
tiempo real en músculo tibial tal como se ha informado
anteriormente (ver Edstrom E. et al., "Sarcopenia is not
due to lack of regenerative drive in senescent skeletal muscle",
Aging Cell 4:65-77, 2005).
El número de células tumorales en huéspedes
portadores del modelo Yoshida AH-130 no resultó
significativamente afectado por el formoterol, así como tampoco la
cantidad de alimento ingerido (observado en portadores tumorales).
La hipofagia durante el crecimiento tumoral persistió sin cambios en
los animales tratados (ver la Tabla 1).
El patrón de los músculos esquelético y cardiaco
era bastante diferente. De esta manera, tal como se muestra en la
Tabla 1, la implantación del hepatoma ascítico Yoshida
AH-130 resultó en una reducción del peso muscular
(13% para el gastrocnemio, 16% para el tibial, 11% para el sóleo,
19% para EDL y 11% para el corazón). El tratamiento de formoterol
resultó en un incremento en la mayoría de tipos musculares,
incluyendo el gastrocnemio (28%), tibial (25%), EDL (32%) y
cardíaco (21%) en el grupo de control. En los animales portadores de
tumor, el formoterol indujo un incremento del peso en el
gastrocnemio (9%), tibial (11%), EDL (16%) y corazón (11%),
evitando de esta manera la reducción de la masa muscular. El
tratamiento con formoterol presentó, por lo tanto, un efecto
protector, en términos de peso de tejido húmedo, para los músculos
esqueléticos y para el corazón. Además, el formoterol también
proporcionó una acción trófica significativa sobre los músculos en
no portadores de tumor, particularmente en los músculos
gastrocnemio, tibial, EDL y cardíaco, mientras que el sóleo no
resultó significativamente afectado. Respecto a los tejidos
adiposos, el crecimiento tumoral causó grandes reducciones de la
masa de tejido adiposo blanco (46%). Se observó una situación
similar para el tejido adiposo marrón (53%). En el modelo de tumor
en la rata, el tratamiento de formoterol se asoció a una tendencia
hacia una reducción de la masa de tejido adiposo blanco en animales
tanto de control como portadores tumorales, aunque los resultados
no alcanzaron la significancia estadística, mientras que indujo un
incremento del peso del tejido adiposo marrón (ver la Tabla 1).
La Tabla 1 muestra la cantidad de alimento
ingerido, los pesos de tejido y el crecimiento tumoral en ratas
portadoras de hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La
cantidad de alimento ingerido se expresa en gramos y se refiere a
la ingestión durante el periodo del experimento antes del sacrificio
(7 días después de la inoculación del tumor). Los pesos de tejido
se expresan en mg/100 g de peso corporal inicial. La carcasa (cuerpo
sin órganos ni tumor) se expresa como g/100 g de peso corporal
inicial. El contenido de células tumorales se expresa en millones
de células. Los resultados son medias \pm SEM para el número de
animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con
formoterol; TB = portadores tumorales. Significancia estadística de
los resultados (de pruebas t de Student): C frente a TB:
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. No tratadas frente a F:
\daggerp<0,05, \dagger\daggerp<0,01,
\dagger\dagger\daggerp<0,001.
La degradación acelerada de las proteínas
musculares en huéspedes tanto de AH-130 como de
carcinoma pulmonar de Lewis se produce básicamente debido a la
activación del sistema proteolítico dependiente de
ATP-ubiquitina. De esta manera, se investigaron los
efectos del formoterol sobre la expresión génica de diferentes
sistemas proteolíticos presentes en el músculo esquelético. Se
estudio la expresión génica en el músculo gastrocnemio de dos
especies de ARNm de poliubiquitina (2,4 kb y 1,2 kb), de la
subunidad C8 del proteasoma (ambos implicados en la ruta
proteolítica dependiente de ATP-ubiquitina), de la
m-calpaína (sistema dependiente del calcio) y de la
catepsina B (sistema lisosómico). Tal como se muestra en la Tabla 2,
los animales portadores tumorales mostraron una expresión
incrementada de los genes poliubiquitina comparado con los animales
de control correspondientes: más de 2 veces (2,4 kb) y de 6 veces
(1,2 kb) (ver la figura 1). Al recibir los animales
portadores tumorales el formoterol, dicha activación resultó
suprimida (Tabla 2). Resulta interesante que se encontraron
resultados similares para las subunidades C8 y C9 del proteasoma y
para el enzima conjugante E2, la expresión del cual se incrementó
significativamente como resultado del crecimiento tumoral y el
tratamiento de formoterol suprimió esta activación de la expresión
génica (ver la Tabla 2 y la figura 1). Respecto a otros sistemas
proteolíticos, la carga tumoral también resultó en un incremento de
la expresión del sistema m-calpaína dependiente del
calcio (de 3 veces) pero el tratamiento de formoterol no eliminó
está activación en este modelo tumoral sometido a ensayo (ver la
Tabla 2 y la figura 1). Finalmente, el tratamiento de formoterol
redujo la expresión de catepsina B lisosómica en las ratas
portadoras tumorales (ver la Tabla 2).
La Tabla 2 muestra la expresión génica (ARNm) de
diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemios de
ratas que portan hepatoma ascítico Yoshida AH-130.
Se detectó tras la hibridación con sondas de ADNc. Se llevó a cabo
una corrección de carga mediante la preparación de filtros con la
sonda de subunidad ribosómica 18S de rata. Las autorradiografías se
sometieron a densitometría de barrido. Los símbolos son los
utilizados en la Tabla 1.
Considerando el incremento de actividad del
proteasoma anteriormente descrita en músculo esquelético de ratones
portadores tumorales (ver Whitehouse A.S. et al.,
"Mechanism of attenuation of skeletal muscle protein catabolism
in cancer cachexia by eicosapentaenoic acid", Cancer Res.
61:3604-9, 2001), se decidió someter a ensayo si el
formoterol también era capaz de revertir su actividad en el músculo
esquelético de ratas portadoras tumorales. Se midió la actividad
catalítica más dominante (actividad similar a quimotripsina) en
músculo gastrocnemio de ratas que portaban el tumor Yoshida
AH-130. Los resultados obtenidos muestran una
reducción de la actividad del proteasoma en ratas tanto no
portadoras (64%) como portadoras tumorales (47%) tratadas con
formoterol (ver la Tabla 3).
La Tabla 3 muestra la actividad del proteasoma
en homogenados de músculo esquelético procedente de ratas portadoras
tumorales. Las actividades, expresadas en nkatales/mg de proteína
referida al reservorio total de proteínas, se calcularon mediante
la utilización de amidocoumarina libre como el estándar de trabajo.
El resultado final es la diferencia entre los nkatales obtenidos en
presencia y en ausencia de lactacistina 25 \muM, un inhibidor
específico del proteasoma. Los símbolos son los utilizados en la
Tabla 1.
Otro aspecto que se evaluó fue la apoptosis
muscular durante el cáncer. Los resultados presentados en la figura
2 muestran que el crecimiento tumoral se asocia a una tasa
incrementada de apoptosis, determinada como fragmentación del ADN
(68%) (ver las figuras 2A y 2B) y como activación de la
caspasa-3 (59%) (ver la figura 2C). El tratamiento
de formoterol eliminó por completo la tasa incrementada de apoptosis
muscular (ver las figuras 2A, 2B y 2C).
Los resultados representados en la Tabla 4
muestran que ninguno de los factores transcripcionales estudiados
(NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP) se
encontraba implicado en el desarrollo de la pérdida de masa muscular
durante el crecimiento tumoral.
La Tabla 4 muestra actividad ligante de ADN de
NF-\kappab, AP-1 y C/EBP en los
músculos tibiales de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida
AH-130. Se determinó la unión del ADN de
NF-\kappab, AP-1 y C/EBP en
extractos nucleares procedentes de músculo tibial. Se sometieron
autorradiografías a densitometría de barrido. Los símbolos son los
utilizados en la Tabla 1.
La expresión génica tanto de UCP2 como de UCP3
se incrementó en el músculo esquelético como consecuencia del
crecimiento tumoral. En efecto, en el músculo gastrocnemio, se elevó
el contenido de ARNm de UCP2 en un factor de 3, mientras que el de
UCP3 se incremento en un factor de 5. Al recibir las ratas
portadoras de tumor el formoterol, esta activación se redujo
significativamente en el caso de la expresión de UCP2 y se observó
una tendencia considerable en el caso de la expresión de UCP3 (ver
la Tabla 5).
La Tabla 5 muestra la expresión génica (ARNm) de
las proteínas desacoplantes (UCP2 y UCP3) en músculos gastrocnemios
procedentes de ratas portadoras de hepatoma ascítico Yoshida
AH-130. Se detectó después de la hibridación con
sondas de ADNc. Se llevó a cabo una corrección de carga mediante la
preparación de filtros con la sonda subunidad ribosómica 18S de
rata. Las autorradiografías se sometieron a densitometría de
barrido. Los símbolos son los utilizados en la Tabla 1.
La disección y el aislamiento de los músculo EDL
se llevó a cabo bajo anestesia con una mezcla de quetamina/xilazina.
Los músculos aislados se fijaron a un clip de acero inoxidable para
mantener el músculo bajo una ligera tensión (de manera que fuese
comparable a la longitud en reposo) durante la incubación. Los
músculos pueden así mantener concentraciones de ATP y fosfocreatina
normales durante un periodo de incubación de 3 horas. Los músculos
se incubaron en un baño de agua bajo
agitación-termostatizado a 35ºC durante 3 horas en 2
ml de solución salina fisiológica de
Krebs-Henseleit, pH 7,4, que contenía glucosa 5 mM y
HEPES 20 mM. Tras la adición de los músculos a los viales, se
inició la incubación a una tasa de agitación de 45 ciclos/minuto.
Los viales se gasificaron con O_{2}/CO_{2} 19:1 durante la
totalidad del periodo de incubación. Los músculos se preincubaron
durante 60 minutos:30 minutos en tampón de
Krebs-Henseleit y durante 30 minutos en medio
suplementado que contenía formoterol 10^{-4} M, clembuterol
10^{-4} M o nada, y después se incubaron durante 120 minutos en
medio suplementado fresco.
Se calculó la degradación de las proteínas
totales en los músculos aislados como la tasa de tirosina liberada
en las últimas dos horas de incubación hacia el medio en presencia
de cicloheximida 0,5 mM con el fin de bloquear la reincorporación
de la tirosina en las proteínas del tejido. La tirosina se midió
fluorimétricamente. El análisis de los datos se llevó a cabo
mediante pruebas t de Student. Tal como puede observarse en la Tabla
6, el formoterol redujo la tasa de degradación de las proteínas
(medida como la liberación de tirosina hacia el medio de
incubación) en 20%, confirmando de esta manera que la acción de la
molécula se basa en una reducción de la tasa proteolítica.
La Tabla 6 representa las tasas proteolíticas en
músculos EDL aislados de ratas de control. Se midieron en presencia
de cicloheximida (0,5 mM) y se expresan en nmoles/gramos en 2 horas
y son medias \pm SEM para el número de animales indicado entre
paréntesis. Significancia estadística de los resultados (de pruebas
t de Student): agonista \beta_{2} añadido frente a ninguna
adición; ***p<0,001.
Además, la tasa proteolítica también se redujo
significativamente (12%) en ratas que habían sido previamente
tratadas durante seis días consecutivos con el agonista
\beta_{2} (ver la Tabla 7).
La Tabla 7 muestra las tasas proteolíticas en
músculos EDL aislados de ratas que recibieron formoterol (2 mg/kg
peso corporal) durante seis días consecutivos previamente al
sacrificio. Las tasas se midieron en presencia de cicloheximida
(0,5 mM) y se expresan en nmoles/g en 2 horas. Significancia
estadística de los resultados (de pruebas t de Student): ratas
tratadas frente a ratas de control, *p<0,05.
Además de los efectos sobre la tasa de
degradación de las proteínas en músculos de rata incubados, tanto el
formoterol como el clembuterol influyeron sobre la tasa de síntesis
de proteínas, que se incrementó en 20% en ambos casos, para el
formoterol y el clembuterol (ver la Tabla 8). Se evaluó la tasa de
síntesis de proteínas totales en músculos aislados tal como se ha
descrito anteriormente (ver García-Martínez C. et
al., "Interleukin-6 does not activate protein
breakdown in rat skeletal muscle", Cancer Lett.
76:1-4, 1994). Estos resultados concuerdan con
observaciones similares realizadas en estudios anteriores con
agonistas \beta_{2} en músculos de rata incubados (ver Rehfeldt
C. et al., "The effect of the
beta-adrenergic agonist clembuterol on the growth
of skeletal muscles of rats", Arch. Tieremahr
45:333-44, 1994).
La Tabla 8 representa la tasa de síntesis de
proteínas en músculos EDL aislados procedentes de ratas de control.
Las tasas sintéticas se expresan en nmoles de
[^{14}C]fenilalanina incorporada por gramo y 30 minutos.
Significancia estadística de los resultados (de pruebas t de
Student): adición de agonista \beta_{2} frente ninguna adición,
*p<0,05.
Se demostró que la combinación de formoterol (3
mg/kg de peso corporal) y pentoxifilina, un inhibidor de la
síntesis del factor alfa de necrosis tumoral
(TNF-\alpha) (ver Combaret L. et al.,
"Manipulation of the ubiquitin-proteasome pathway
in cachexia: pentoxifylline suppresses the activation of 20S and 26S
proteasomes in muscles from tumor-bearing rats",
Mol. Biol. Rep. 26:95-101, 1999) (10 mg/kg de peso
corporal), provocaba un efecto positivo sobre la ganancia de masa
muscular debido a la caquexia (Tabla 9). Este efecto se apreció en
los diferentes días del crecimiento tumoral (días 2, 4 y 7 tras la
inoculación del tumor).
La Tabla 9 (A, B y C) representa la cantidad de
alimento ingerido, los pesos de tejido y el crecimiento tumoral en
ratas portadoras de hepatoma ascítico Yoshida
AH-130. La cantidad de alimento ingerido se expresa
en gramos y se refiere a la ingestión durante el periodo
experimental antes del sacrificio (días 2, 4 y 7 después de la
inoculación del tumor; Tablas 9A, 9B y 9C, respectivamente). Los
pesos de tejido se expresan en mg/100 g de peso corporal
inicial. La carcasa (cuerpo sin órganos ni tumor) se expresa en
g/100 g de peso corporal inicial. El contenido de células tumorales
se expresa en millones de células. Los resultados son medias \pm
SEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C =
control; F = tratado con formoterol; P = tratado con pentoxifilina;
TB = portador tumoral. Significancia estadística de los resultados
(de pruebas t de Student): C frente a TB: *p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001; no tratado frente a F: \daggerp<0,05,
\dagger\daggerp<0,01,
\dagger\dagger\daggerp<0,001.
\vskip1.000000\baselineskip
(dos días después de la inoculación
del
tumor)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(cuatro días después de la
inoculación del
tumor)
\newpage
(siete días después de la
inoculación del
tumor)
El tratamiento con diferentes dosis de
formoterol (0,3, 1, 3 y 10 mg/kg de peso corporal) fue similar, por
lo que el formoterol a dosis muy bajas resulta efectivo contra la
caquexia (Tabla 10).
La Tabla 10 muestra la cantidad de alimento
ingerido, los pesos de tejido y el crecimiento tumoral en ratas
portadoras de hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La
cantidad de alimento ingerido se expresa en gramos y se refiere a
la ingestión diaria media. Todas las demás variables se expresan tal
como en la Tabla 9. F = tratadas con formoterol; TB = portador
tumoral. Significancia estadística de los resultados (de pruebas t
de Student): no tratado frente a F: \daggerp<0,05;
\dagger\daggerp<0,01,
\dagger\dagger\daggerp<0,001.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con los últimos resultados, se
decidió estudiar el efecto del formoterol a dosis bajas (0,3 mg/kg
de peso corporal) sobre la caquexia de cáncer en diferentes días del
crecimiento tumoral (días 2, 4 y 7 tras la inoculación del tumor) y
se confirmó que este agonista selectivo para el adrenoceptor
\beta_{2} también resulta efectivo a dosis bajas (Tablas 11A, B
y C).
\newpage
La Tabla 11 (A, B y C) muestra la cantidad de
alimento ingerido, los pesos de tejido y el crecimiento tumoral en
ratas portadoras de hepatoma ascítico Yoshida
AH-130. Todas las demás variables se expresan tal
como en la Tabla 9.
(dos días después de la inoculación
del
tumor)
(cuatro días después de la
inoculación del
tumor)
(siete días después de la
inoculación del
tumor)
La regeneración muscular es un proceso que
implica la activación de células satélite, que son células
musculares precursoras situadas contiguamente a las fibras de
músculo esquelético. Se dañó el músculo mediante la inyección de
bupivacaína intramuscular (al 0,5%). Este compuesto, tras el daño
muscular estimula la regeneración del músculo. Además, se analizó
el efecto de dos tratamientos de formoterol (0,3 mg/kg de peso
corporal): 7 ó 14 días de tratamiento. La Tabla 12 representa el
efecto anabólico de los tratamientos de formoterol sobre el músculo
tibial dañado previamente con bupivacaína.
La Tabla 12 representa el peso de músculos
tibiales inyectados previamente con bupivacaína y tratados después
con formoterol durante 7 ó 14 días. Los pesos de músculo se expresan
en mg/100 g de peso corporal inicial. Los resultados son medias
\pm SEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C =
control; F = tratado con formoterol; B = tratado con bupivacaína;
d7 = 7 días de tratamiento; d14 = 14 días de tratamiento.
Significancia estadística de los resultados (de pruebas t de
Student): C frente a tratados: *p<0,05, **p<0,01, bupivacaína
frente a formoterol: \daggerp<0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento de formoterol indujo una mayor
recuperación del peso muscular en comparación con la recuperación
debida al inductor de daño y la posterior estimulación de la
regeneración muscular (bupivacaína). Por este motivo, se estudió la
expresión génica de algunos marcadores de regeneración muscular: los
genes se expresan durante la activación de células satélite tales
como Pax-7 (marcador de activación temprana) y la
miogenina (marcador de activación final). Se detallan los
resultados en la Tabla 13.
La Tabla 13 muestra la expresión génica de dos
marcadores de activación de células satélite: Pax-7
y miogenina. Los resultados son medias \pm SEM para el número de
animales que se indica entre paréntesis. C = control; F = tratado
con formoterol; B = tratado con bupivacaína; d7 = 7 días de
tratamiento; d14 = 14 días de tratamiento. Significancia
estadística de los resultados (de pruebas t de Student): C frente a
tratado: *p<0,05, **p<0,01. Bupivacaína frente a formoterol:
\daggerp<0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento de formoterol no alteró ni el
peso del tumor sólido procedente de huéspedes portadores del modelo
de carcinoma pulmonar de Lewis, ni la cantidad de alimento ingerido
(controles y portadores tumorales). La hipofagia producida durante
el crecimiento de los tumores persistió sin cambios en los animales
tratados (Tabla 14).
En el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis, la
carga tumoral indujo una reducción más grande de los pesos
musculares (13% para los gastrocnemios, 21% para los tibiales y 18%
para los sóleos) (Tabla 14). El tratamiento de formoterol
incrementó los pesos musculares de los gastrocnemios (19%), tibiales
(13%) y sóleos (28%) significativamente en los animales no
portadores de tumor. Resulta interesante que el tratamiento con
formoterol presentó un efecto protector significativo de los pesos
de músculo esquelético: gastrocnemios (11%), tibiales (11%) y sóleo
(56%), y del músculo cardiaco (24%) en animales portadores
tumorales. Respecto a los tejidos adiposos, el crecimiento tumoral
provocó grandes reducciones de la masa de tejido adiposo blanco en
el modelo de carcinoma pulmonar de Lewis (76%). Se observó una
situación similar para el tejido adiposo marrón (39%). En el modelo
de carcinoma pulmonar de Lewis, el formoterol no alteró la masa de
tejido adiposo blanco ni en los animales de control ni en los
portadores tumorales, aunque indujo un incremento de la masa de
tejido adiposo marrón tanto en los controles como en los portadores
tumorales (Tabla 14).
La Tabla 14 muestra la cantidad de alimento
ingerido, los pesos de tejido y el crecimiento tumoral de ratones
portadores de carcinoma pulmonar de Lewis. La cantidad de alimento
ingerido se expresa en gramos y se refiere a la ingestión durante
el periodo experimental previo al sacrificio, que tuvo lugar 15 días
después de la inoculación del tumor. Los pesos de tejido se
expresan en mg/100 de peso corporal inicial. La carcasa (cuerpo sin
órganos ni tumores) se expresa en gramos/100 gramos de peso corporal
inicial. El peso tumoral se expresa en gramos. Los símbolos son los
utilizados en la Tabla 1.
Tal como se muestra en la Tabla 15, los ratones
portadores tumorales mostraron una expresión incrementada de los
genes de poliubiquitina comparado con los animales de control
correspondientes: más de 2 veces (2,4 kb) y 3 veces (1,2 kb)
(figura 3). Al recibir los ratones portadores tumorales el
formoterol, se suprimió dicha activación (Tabla 15). Resulta
interesante que se encontraron resultados similares para las
subunidades C8 y C9 del proteasoma, la expresiones de las cuales se
incrementó significativamente como resultado del crecimiento
tumoral, suprimiendo el tratamiento de formoterol esta activación de
la expresión génica (Tabla 15 y figura 3). Respecto a otros
sistemas proteolíticos, la carga tumoral también resultó en un
incremento de la expresión del sistema m-calpaína
dependiente del calcio (2 veces), pero el tratamiento de formoterol
no eliminó esta activación en el modelo de carcinoma pulmonar de
Lewis (Tabla 15 y figura 3). Finalmente, el ligero incremento del
contenido de ARNm de catepsina B lisosómica observado en los ratones
portadores de carcinoma pulmonar de Lewis fue revertido por el
tratamiento de formoterol (Tabla 15 y figura 3).
La Tabla 15 muestra la expresión génica (ARNm)
de los diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemios
procedentes de ratones portadores de carcinoma pulmonar de Lewis. Se
realizaron las mediciones tras la hibridación con sondas de ADNc.
Se llevó a cabo una corrección de carga a partir de filtros con la
sonda de subunidad ribosómica 18S de rata. Las autorradiografías se
sometieron a densitometría de barrido. Los símbolos son los
utilizados en la Tabla 1.
Se incrementó la expresión génica tanto de UCP2
como de UCP3 en el músculo gastrocnemio como consecuencia del
crecimiento de los tumores pulmonares de Lewis. En el músculo
gastrocnemio, el contenido de ARNm de UCP2 se encontraba elevado en
un factor de 3, mientras que el de UCP3 se había incrementado en un
factor de 2 (sin alcanzar la significancia). Al recibir los ratones
portadores tumorales el formoterol, esta activación resultó
eliminada en la expresión de ambos genes (Tabla 16).
La Tabla 16 muestra la expresión génica (ARNm)
de las proteínas desacoplantes (UCP2 y UCP3) en músculos
gastrocnemios procedentes de ratones portadores de carcinoma
pulmonar de Lewis. Se realizaron las mediciones tras la hibridación
con sondas de ADNc. Se llevó a cabo una corrección de carga a partir
de filtros con la sonda de subunidad ribosómica 18S de rata. Las
autorradiografías se sometieron a densitometría de barrido. Los
símbolos son los utilizados en la Tabla 1.
Claims (16)
1. Utilización de formoterol o de una sal
farmacéuticamente aceptable, o de un solvato farmacéuticamente
aceptable de cualquiera, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la pérdida
muscular y/o del síndrome caquéctico, encontrándose asociados
cualquiera o ambos a un estado catabólico en un mamífero.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es la enfermedad de Crohn, el cáncer o el
SIDA.
3. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es la sepsis, la diabetes o un estado de
inmovilización.
4. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es una quemadura severa o se debe a la
ingravidez o al envejecimiento.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, una patología cardiovascular o una patología hepática.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es la artritis reumatoide, un trastorno de
alimentación o la acidosis.
7. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es una enfermedad neuromuscular, la
enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Cushing.
8. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es el hipertiroidismo, el
hiperadrenocortisolismo o una atrofia y/o distrofia muscular.
9. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el estado catabólico es la colitis ulcerosa, el síndrome de
fatiga crónica, la insuficiencia renal o la cirrosis hepática.
10. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la utilización es de fumarato
de formoterol o de dihidrato de fumarato de formoterol.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el mamífero es un ser
humano.
12. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento está destinado
a la administración por vía oral.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el medicamento está destinado a
la administración por vía nasal.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el medicamento está destinado a
la administración por vía parenteral.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el medicamento está destinado a
la administración por la vía subcutánea.
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el medicamento está destinado a
la administración por la vía tópica.
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