ES2336343T3 - Biosensor de creatinina estable para tres enzimas. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un biosensor de tres enzimas de uso múltiple para la determinación amperométrica de creatinina en líquidos biológicos, comprendiendo dicho biosensor una pluralidad de enzimas inmovilizadas, comprendiendo dicho método la aplicación a dicho biosensor de una composición enzima-polímero que comprende dicha pluralidad de enzimas inmovilizadas, siendo inmovilizadas dichas enzimas por medio de enlaces covalente, comprendiendo dicho método una etapa inicial de modificación química de dichas enzimas enlazando una o más cadenas de polietilen glicol (PEG) por monómero de enzima, donde dicha pluralidad de enzimas inmovilizadas comprende al menos dos de creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa y sarcosina oxidasa.
Description
Biosensor de creatinina estable para tres
enzimas.
La presente invención se relaciona en general
con el campo de la medicina diagnóstica y, más específicamente, con
métodos para producir un biosensor de uso múltiple para la
determinación amperométrica de creatinina que incluye un
biopolímero de enzimas inmovilizadas.
La determinación de los niveles de creatinina
influidos biológicos es una necesidad clínica importante creciente.
Los biosensores amperométricos se han desarrollado con base en un
sistema de tres enzimas que convierten la creatinina en peróxido de
hidrógeno medible amperométricamente. Debido a la complejidad del
sistema de tres enzimas, el desarrollo de estos biosensores ha sido
lento.
La incorporación de enzimas en redes de
polímeros a través de uniones multipunto es una estrategia rápida y
efectiva para potenciar la estabilidad de las enzimas, a la vez que
retienen la actividad. Esta estrategia involucra la producción de
bioplásticos en una etapa individual, empleando ligómeros capaces de
reaccionar químicamente con funcionalidades específicas sobre la
superficie de la enzima.
La utilidad de las enzimas en biosensores está
limitada por su estabilidad. Los analizadores clínicos de sangres
requieren enzimas que se usen una y otra vez mientras están en
contacto con la sangre entera. Muchos analizadores de sangre operan
a 37ºC lo cual limita adicionalmente la estabilidad de la enzima.
Una variedad de procedimientos de inmovilización está descrita en
la literatura para uso con biosensores. Aunque la mayor parte de los
procedimientos descritos sugieren ser útiles para los biosensores,
frecuentemente no están probados bajo condiciones que serían
aplicables en condiciones de la vida real, tales como temperatura
ambiente o a 37ºC mientras está en contacto con el fluido. La
inmovilización de la enzima es especialmente crítica para el uso
continuo de biosensores donde la pérdida de enzima puede ser una
preocupación.
La inmovilización de la enzima en un
"biopolímero" mediante uniones covalentes multipunto
proporciona un método directo y conveniente para la preparación de
enzimas inmovilizadas para los biosensores. No solamente la
inmovilización covalente con puntos múltiples previene la pérdida
de enzima, sino que también incrementa la estabilidad de la enzima
al calor, pH, solventes orgánicos, peróxidos y la degradación
proteolítica y microbiana.
Así, hay necesidad para el desarrollo de
biosensores de uso múltiple que tengan incorporadas como componente
enzimas estables que retengan su actividad. La presente invención
satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.
La invención proporciona métodos para preparar
un biosensor de tres enzimas de uso múltiple estable para la
determinación amperométrica de creatinina en líquidos biológicos que
tiene un tiempo de vida útil significativamente más allá de los
biosensores amperómetricos disponibles actualmente. El biosensor
preparado por lo métodos de la invención abarca una pluralidad de
enzimas inmovilizadas que son aplicadas al biosensor como una
composición enzima-polímero. Las enzimas, que
pueden incluir creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa
y sarcosina oxidasa, se inmovilizan en la composición
enzima-polímero simultáneamente a medida que son
aplicadas al biosensor de manera simultánea. Antes de ser
inmovilizadas las enzimas son modificadas químicamente enlazando una
o más cadenas de polietilen glicol (PEG) por monómero de enzima. El
componente polimérico puede ser suministrado mediante una membrana
de poliuretano. La invención también provee un método para preparar
un biosensor que limita la difusión de los iones plata que emanan
del electrodo de referencia, previniendo por lo tanto el contacto
entre los iones plata y las enzimas. También se proveen métodos
relacionados para preparar una composición
enzima-polímero para incorporación en un biosensor
de tres enzimas de uso múltiple para la determinación amperométrica
de creatinina en líquidos biológicos. La invención también
proporciona biosensores para uso múltiple y composiciones
enzima-polímeros preparados por los métodos
divulgados.
La Figura 1 muestra la retención de actividad de
MSOX PEGilada modificada utilizando PEG-NCO a pH 7.5
(círculos cerrado) y pH 8.5 (cuadrados cerrados).
La Figura 2 muestra la retención de actividad de
MSOX después de la PEGilación en la presencia de inhibidores (10: 1
(sólido) y 10: 1 (blanco) relación isocianato a amina). La
concentración de inhibidor fue 50 mM.
La Figura 3 muestra la estabilidad de la
sarcosina oxidasa como una función del número de PEGs unidos a 37ºC.
La enzima nativa (cuadrados abiertos); un PEG unido (cuadrados
cerrados); dos PEGs unidos (círculos cerrados).
La Figura 4 muestra la actividad relativa de la
MSOX que contiene poliuretanos como una función del contenido de
enzimas.
La Figura 5 muestra la posibilidad de reutilizar
los hidrogeles de poliuretano que contienen MSOX.
La Figura 6 muestra la pérdida de sarcosina
oxidasa a partir de los geles de poliuretano. 1 mg de MSOX/g
polímero (triángulos cerrados); 2 mg de MSOX/g polímero (cuadrados
abiertos).
La Figura 7 muestra la estabilidad de MSOX que
contienen hidrogeles de poliuretano almacenados en regulador a
37ºC. Las ratas fueron normalizadas con respecto a la rata de
consumo de oxígeno después del primer día. Enzima nativa (círculos
cerrados); enzima inmovilizada (círculos abiertos).
La Figura 8 muestra la inhibición irreversible
inducida por iones de la actividad de la sarcosina oxidasa. Tiempo
de incubación: 5 min (círculos cerrados); 1 hora (cuadrados
abiertos); 3 horas (triángulos cerrados; 5 horas (círculos
abiertos); 21 horas (cuadrados cerrados).
La Figura 9 muestra la estabilidad de creatina
amidinohidrolasa como una función de número de PEGs unidos a 37ºC.
Enzima nativa (diamantes cerrados). Un PEG unido (triángulos
cerrados); tres PEGs unidos (círculos cerrados); cinco PEGs unidos
(cuadrados cerrados).
La figura 10 muestra la estabilidad de los
hidrogeles de poliuretano que contienen creatina amidinohidrolasa
almacenados en un regulador a 37ºC. Las ratas fueron normalizadas
con respecto a la rata de consumo de oxígeno después del primer
día. Enzima nativa (círculos abiertos); enzima inmovilizada: 10
unidades/g polímero (triángulos cerrados); 50 unidades/g de
polímero (cuadrados cerrados); 100 unidades/g de polímero (círculos
cerrados).
La Figura 11 muestra la desactivación inducida
por plata de la creatina amidinohidrolasa en solución. Tiempo de
incubación: 5 min (círculos cerrados); 15 min (cuadrados
cerrados).
La Figura 12 muestra la protección de la
creatina amidinohidrolasa de la inactivación inducida por plata.
La Figura 13 muestra las fluctuaciones
residuales en creatinasa. Panel (A) Comparación de la predicción
(mediante GNM; mostrado en azul) y lo experimental
(rayos-X cristalográficos; rojo) de factores B.
Panel (B) diagrama de cinta con codificación de color del monómero
mostrando las regiones más flexibles (picos en panel a) en rojo, y
las menos flexibles (mínimas) en azul. El diagrama de cinta de panel
(C) ilustra las posiciones relativas de los monómeros A y B con
respecto al ligando.
La Figura 14 muestra la distribución de las
movilidades en el modo global dominante del dímero de creatinasa.
Los residuos catalíticos Phe62, Arg64, His231, Tyr257, Glu261,
Arg334 y Glu357 son mostrados mediante los círculos azules abierto
y Cys60, Cys249 y Cys297 son mostrados mediante cuadrados naranja,
en ambos monómeros (separados por la línea punteada). Las flechas
rojas indican los residuos catalíticos que coordinan el CMS en la
estructura cristalina examinada.
La Figura 15 en el Panel (A) muestra el diagrama
de cintas codificadas por color que ilustra la movilidad de los
residuos de creatinasa en movimientos globales. Los colores
azul-verde-amarillos-naranja-rojo
son utilizados en el orden de movilidad creciente. El análogo de la
creatina, CMS, se muestra en una representación llenando espacios.
Las flechas amarillas indican las tres cisteínas (mostradas en bolas
y barras) sobre el monómero B, y la flecha blanca el CYs60 sobre el
monómero A. Los átomos en CMS y las cisteínas están coloreados según
la convención CPK. El Panel (B) muestra la dinámica cerca del sitio
activo. El análogo de la creatina, CMS, y los residuos catalíticos
claves se muestran en bolas y barras. Las cadenas laterales de los
residuos catalíticos y su esqueleto asociado (tintas) están
coloreados de acuerdo con sus movilidades globales (lo mismo que el
panel a, mostrado desde una perspectiva diferente en búsqueda de
claridad), Los enlaces de hidrógeno se muestran en líneas
punteadas. La localización de la ruptura del enlace peptídico
durante la transferencia catalítica de electrones se muestra
mediante la flecha blanca. La movilidad moderada de Glu261 y Glu357,
la cual forma puentes de hidrógeno con el átomo de nitrógeno en el
grupo guanidina de la CMS puede facilitar la ruptura del enlace
peptídico. Phe62 y Arg64 se unen al bolsillo catalítico de la otra
cadena.
La Figura 16 en el Panel (A) muestra las
fluctuaciones en los modos de alta frecuencia. Los picos (marcados
por los tipos y números de residuos) revelan los centros de
localización de la energía sujetos a las vibraciones de más alta
frecuencia. Cys60, Cys249 y Cys297 se muestra mediante círculos
rojos. El pico más alto en Cys297 indica que este residuo
contribuye significativamente a la flexión/estabilidad. El Panel (B)
muestra los mismos resultados dispuestos en forma de mapa sobre la
estructura cristalina de la creatinasa. Las trazas de carbón
\alpha del monómero B se muestra en negro, y la del monómero A en
gris. Las cadenas laterales de los residuos de picos en el panel
(a) se presentan en bolas y barras, coloreado de rojo (picos más
altos) o amarillo (picos moderados). La CMS es coloreada mediante
las convenciones CPK. Notamos que S 173, C249 y L266 en el monómero
A forman contactos cercanos en el espacio, indicativos de un núcleo
flexionado.
La Figura 17 muestra la retención de la
actividad de creatinina amidohidrolasa PEGilada como una función del
número promedio de cadenas PEG enlazadas covalentemente.
La Figura 18 muestra la estabilidad de la
creatinina amidohidrolasa como una función del número PEGs unidos a
37ºC. Enzima nativa (círculos cerrados); un PEG unido (cuadrados
cerrados); dos PEGs unidos (triángulos cerrados); tres PEGs unidos
(círculos abiertos); cuatro PEG (triángulos abiertos); cinco PEGs
unidos (cuadrados abiertos).
La Figura 19 muestra la actividad relativa de
poliuretanos que contienen creatinina amidohidrolasa como una
función del contenido de enzima.
La Figura 20 muestra la posibilidad de
reutilización de los geles de poliuretano que contienen creatinina
amidohidrolasa.
La Figura 21 muestra la estabilidad de
hidrogeles de poliuretano que contienen creatinina amidohidrolasa
almacenadas en regulador a 37ºC. Las ratas fueron normalizadas con
respecto a la rata de consumo de oxígeno después del primer día.
Enzima nativa (círculos cerrados); enzima inmovilizada (círculos
abiertos).
La Figura 22 muestra la desactivación inducida
por iones plata de la creatinina amidohidrolasa en solución. Tiempo
de incubación: 5 min (círculos abiertos); 1 hora (cuadrados
cerrados).
La Figura 23 muestra la estabilidad de membranas
de poliuretano que contienen 3 enzimas almacenada en regulador de
fosfato 50 mM (pH 7.5) a 37ºC con (cuadrados cerrados) y sin
(círculos cerrados) sensores planos.
La figura 24 muestra la retención de la
actividad de electrodos de 3 enzimas almacenados en regulador a
37ºC. Los electrodos fueron preparados con (cuadrados abiertos) y
sin (círculos cerrados) membranas de recubrimiento de acetato de
celulosa.
La invención proporciona métodos para preparar
un biosensor de tres enzimas de uso múltiple estable para la
determinación amperométrica de creatinina en líquidos biológicos que
tiene un tiempo de vida útil que se extiende significativamente más
allá de los biosensores amperométricos actualmente disponibles.
Como se divulga aquí, la enzimas creatinina
amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa y sarcosina oxidasa
pueden ser modificadas de manera efectiva e incorporadas en
composiciones enzima-polímero. La inmovilización de
las enzimas en composiciones enzima-polímero de
acuerdo con los métodos de la invención mejora significativamente
la estabilidad de la enzima e incrementa la vida útil. Las
composiciones enzima-polímero y los biosensores
preparados de acuerdo con los métodos de la invención tienen una
estabilidad enzimática considerable que permiten el uso múltiple
del biosensor extendiéndose por más de 4 días, más de 6 días, más de
8 días, más de 10 días, más de 12 días, más de 15 días, más de 20
días, más de 25 días, más de 30 días.
El biosensor preparado por los métodos de la
invención abarca una pluralidad de enzimas inmovilizadas que se
aplican al biosensor a manera de una composición
enzima-polímero. Las enzimas, las cuales pueden
incluir creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa y
sarcosina oxidasa, pueden ser inmovilizadas en la composición
enzima-polímero simultáneamente así como ser
aplicadas al biosensor simultáneamente. En otras realizaciones, las
enzimas pueden ser inmovilizadas y añadidas en forma de paso a paso
o cualquier combinación deseada por el usuario.
Una etapa crítica en el desarrollo de los
biosensores es la inmovilización efectiva de la enzima. La invención
se basa, en parte, en el descubrimiento de que es posible
inmovilizar exitosamente las tres enzimas utilizadas en los
biosensores amperométricos de creatinina, creatinina amidohidrolasa,
creatina amidinohidrolasa y sarcosina oxidasa, en membranas
utilizando prepolímeros de poliuretano a la vez que retienen
suficiente actividad enzimática. Tal como se ejemplifica aquí, las
tres enzimas pueden ser modificadas covalentemente e incorporadas en
hidrogeles de poliuretano donde exhiben una estabilidad mejorada
cuando se compara con las enzimas nativas en solución a 37ºC. El
biosensor preparado de acuerdo con los métodos de la invención puede
ser utilizado a una temperatura deseada por el usuario y
dependiendo de la aplicación particular, por ejemplo, a temperatura
ambiente así como a 37ºC.
En una realización preferida, la invención
proporciona un método para preparar un biosensor de tres enzimas
para uso múltiple para la determinación amperométrica de creatinina
en líquidos biológicos, conteniendo el biosensor una pluralidad de
enzimas inmovilizadas, comprendiendo el método la aplicación al
biosensor de una composición enzima-polímero que
comprende la pluralidad de enzimas inmovilizadas.
El sistema de tres enzimas convierte la
creatinina a peróxido de hidrógeno H_{2}O_{2} medible
amperométricamente.
Se contempla que todas las tres enzimas que son
componentes de ese sistema son inmovilizadas en la composición
enzima-polímero. Sin embargo, las realizaciones en
las cuales solamente una o dos de las tres enzimas son
inmovilizadas en la composición enzima-polímero
también representan realizaciones útiles de la invención. Así, al
menos una o al menos dos o todas las tres enzimas creatinina
amidohidrolasa, creatina himidinohidrolasa y sarcosina oxidasa
pueden ser inmovilizadas en la composición
enzima-polímero que se aplica a un biosensor de la
invención. Las enzimas pueden ser inmovilizadas en la composición
enzima-polímero simultáneamente en una etapa
sencilla. Consecuentemente, las enzimas pueden ser aplicadas al
biosensor simultáneamente como parte de una lámina o membrana de
polímero, por ejemplo, una membrana de poliuretano.
Los métodos de la invención para preparar un
biosensor de tres enzimas de uso múltiple estable para la
determinación amperométrica de creatinina en líquidos biológicos
incluye adicionalmente la etapa inicial de modificar químicamente
las enzimas mediante el enlace de una o más cadenas de polietilen
glicol (PEG) por monómero de enzima. La conjugación de los
monómeros de la enzima con modificadores poliméricos solubles en
agua, especialmente, la conjugación con polietilen glicol (PEG),
frecuentemente llama "PEGilación" se contempla como una etapa
inicial. La bioconjugación de los monómeros de la enzima con
modificadores poliméricos solubles en agua incrementa su tamaño
molecular y su impedimento estérico y mejora las vidas útiles de las
enzimas.
Un biosensor de acuerdo con la invención tiene
por lo menos un electrodo de trabajo, al menos uno de referencia y
al menos uno de recuento y tiene aplicada a su superficie una, dos o
las tres enzimas, las cuales han sido inmovilizadas como se divulga
mediante el método de la invención. Tal como se divulga aquí, las
enzimas pueden hacer parte del biosensor siendo incorporadas en una
composición enzima-polímero, por ejemplo como una
membrana de poliuretano, que se aplica al sensor.
Si es deseado por el usuario, el sensor puede
tener, por ejemplo, dos electrodos de trabajo, conteniendo cada uno
al menos una, al menos dos o las tres enzimas inmovilizadas. Por
ejemplo, un electrodo puede contener dos de las tres enzimas,
mientras que un segundo electrodo de trabajo puede contener las
tres. Cualquier combinación o permutación de enzimas y electrodos
puede ser seleccionada por el usuario con base en la realización
deseada en la invención que se vaya a llevar a cabo. En una
realización adicional, el biosensor está hecho de dos sistemas de
tres electrodos, comprendiendo el primer sistema de electrodos las
enzimas creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa y
sarcosina oxidasa y sirve para la determinación de la suma de
creatinina y creatina y comprendiendo el segundo sistema de
electrodos las enzimas creatina amidinohidrolasa y sarcosina oxidasa
y sirviendo para la determinación de creatina, mediante lo cual el
resultado del segundo sistema de electrodos es deducido del
resultado del primero para la determinación de la creatinina. Si se
desea, el biosensor comprende un sistema de electrodo adicional que
sirve para la eliminación de interferencias electroquímicas.
Las enzimas pueden ser susceptibles a la
inhibición por la plata, la cual puede causar la inactivación aun
cuando esté presente en cantidades micro molares. La susceptibilidad
de los iones plata puede ser importante cuando se utilizan las
enzimas en biosensores amperométricos de creatinina con electrodos
que contienen plata. Como se describe más abajo, un polímero con
las tres enzimas aplicado a los cuerpos de los electrodos de plata
puede causar la desactivación por parte de los iones de plata. Por
ejemplo, la creatina amidinohidrolasa es altamente susceptible a la
inhibición por plata. La adición de moléculas que contienen tiol que
consumen la plata puede ser efectiva en la prevención de la pérdida
de la actividad enzimática debida a la plata. Con base en los
análisis de GNM de la dinámica molecular de la creatina
amidinohidrolasa, dos de los residuos de cisteína, Cys60 y Cys297
en ambas cadenas fueron identificados como importantes en el control
de la dinámica funcional de la enzima y juegan un papel en la
desestabilización de la enzima y llevan a la inactivación. De
manera significativa, la Cys297 está rodeada por residuos cargados
negativamente que atraen la plata cargada positivamente cerca a
este residuo. El uso de la creatina amidinohidrolasa en un biosensor
requiere por lo tanto la protección frente a los iones plata, la
cual puede ser lograda utilizando un simulador de la enzima que
tenga una susceptibilidad disminuida a la plata, añadiendo
consumidores de o, en realizaciones preferidas, cubriendo el
electrodo con un material que prevenga el contacto entre los iones
plata y la enzima.
A la vista de lo anterior se contempla que, en
realizaciones donde el electrodo de referencia es un electrodo
Ag/AgCl (plata/cloruro), el electrodo de referencia puede ser
recubierto con un material que limite la difusión de los iones
plata que emanan de dicho electrodo de referencia, previniendo así
el contacto entre los iones plata y las enzimas. Se contempla que
el uso de una membrana de recubrimiento de acetato de celulosa para
separar el electrodo de la composición
enzima-polímero, por ejemplo, la membrana de
poliuretano, puede disminuir la fuga de iones plata de los
electrodos y puede mejorar la vida útil del sensor. Adicionalmente,
mejoras en el diseño del sensor para prevenir la fuga de iones
plata y reducir el contacto de la enzima con el sensor pueden ser
utilizadas para incrementar la vida útil de los biosensores de
creatinina e incrementar su utilidad en los análisis clínicos de
sangre entera. En general, un electrodo en un biosensor de acuerdo
con la invención puede consistir de carbono, metal, óxidos de metal
o una mezcla de carbono y metal y óxidos de metal. Adicionalmente,
se contempla que los electrodos son aplicados sobre un sustrato no
conductor.
En una realización preferida, el biosensor está
hecho de hasta dos sistemas de tres electrodos, comprendiendo el
primer sistema de electrodo las enzimas creatininasa, creatinasa y
sarcosina oxidasa y sirviendo para la determinación de la suma de
creatinina y creatina y comprendiendo el segundo sistema de
electrodos las enzimas creatinasa y sarcosina oxidasa y sirviendo
para la determinación de creatina, por lo cual el resultado del
segundo sistema de electrodos se deduce del resultado del primero
para la determinación de creatinina. Si se desea, el biosensor
puede contener un electrón adicional para la eliminación de
interferencias electroquímicas.
Los métodos de la invención abarcan la
modificación química e inmovilización de la sarcosina oxidasa en una
composición enzima-polímero, también denominada
biopolímero, por ejemplo en un polímero de poliuretano. Mientras
que el método de la invención se ejemplifica con poliuretano, la
persona experimentada apreciará que cualquier polímero que permita
la incorporación de las enzimas en la red polimérica de una forma
tal que potencie la estabilidad de las enzimas, a la vez que
retiene la actividad, se contempla como útil para poner en práctica
los métodos de la invención, por ejemplo, poliuretano, polímeros de
cianato, cloruro de polivinilo, poliéster, policarbonato,
copolímero de acetato de vinilo, nylon, poli
(1,4-butilentereftalato), propionato de celulosa,
copolímero etileno/ácido acrílico, polibutadieno, polietileno,
polipropileno, poliimida, película acrílica, poliestireno y
fluoruro de polivinilo.
En una realización preferida, los métodos aquí
provistos abarcan la producción de una composición
enzima-polímero que se lleva a cabo en una etapa
individual, empleando oligómeros capaces de reaccionar químicamente
con las funcionalidades específicas sobre la superficie de la
enzima. Las enzimas son enlazadas al polímero de una manera que
proporciona retención de proteína, por ejemplo, por medio de
entrecruzamiento, enlaces covalentes o inclusión en matriz, de
manera que las ventajas de la inmovilización puedan ser
maximizadas.
La invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de la relación particular
estructura-función-ambiente
requerida para mantener la sarcosina oxidasa en un ambiente de
sensor polimérico. La sarcosina oxidasa (EC 1.5.3. 1) cataliza la
desmetilización oxidativa de la sarcosina (N.metilglicina) y forma
cantidades equimolares de formaldehído, glicina y peróxido de
hidrógeno. La sarcosina oxidasa de la Arthrobacter sp. Es un
monómero con un peso molecular de 43 kDa (Nishiya e Imanaka, J Ferm
Bioeng 75:139-244 (1993)). Las sarcosina oxidasas
monoméricas (MSOX) son proteínas flavina que contienen moles de
dinucleótido flavina adenina (FAD) que está enlazado de manera
covalente a la enzima mediante un residuo cisteína (Trickey et
al., Structure 7:331-345 (1999)). En ciertas
realizaciones la enzima sarcosina oxidasa se pone en contacto
inhibidor como por ejemplo, ácido
pirrol-2-carboxílico o ácido
(metiltio) acético, en una cantidad efectiva para prevenir la
inactivación durante la etapa de modificación química. Como se
describe aquí, la sarcosina oxidasa fue inactivada cuando se
modificó mediante una molécula individual de PEG-NCO
y se descubrió que dos inhibidores irreversibles ácido (metiltio)
acético y ácido
pirrol-2-carboxílico, fueron
efectivos en la prevención de la inactivación de la enzima durante
la modificación permitiendo que la enzima fuera exitosa e
irreversiblemente inmovilizada durante la pulverización mediante el
entrecruzamiento químico en polímeros de poliuretano que conforman
un hidrogel, reteniendo la actividad y estabilidad suficientes para
utilizarse aproximadamente durante 30 días en una solución regulada
a 37ºC.
La creatina amidinohidrolasa (creatinasa, EC
3.5.3.3) es un homodímero con pesos moleculares de subunidades de
aproximadamente 45 kDa. Los dos sitios activos de la proteína están
en la interfaz de los monómeros que están siendo compartidos por
cada monómero y únicamente el dímero es activo. Mientras que la
enzima tiene una baja estabilidad funcional, aditivos tales como
agentes reductores, proteínas y polioles han demostrado incrementar
la estabilidad de la enzima (Schumann et al., Biol Chem
374:427-434 (1993a)). La estabilidad intrínseca
baja de la creatinasa ha impulsado el uso de la ingeniería de
proteínas para mejorar la estabilidad (Shumann, et al.,
Protein Science 2:1612-1620 (1993b)). Tal como se
divulga aquí, la creatina amidinohidrolasa puede ser modificada de
manera efectiva mediante PEG-NCO e incorporada en
forma covalente en materiales de poliuretano a través de la
modificación de los prepolímeros de diisocianato. La creatina
amidinohidrolasa fue exitosa e irreversiblemente inmovilizada
mediante entrecruzamiento químico en polímeros de poliuretano y
retuvo actividad significativa y estabilidad suficiente para ser
usado durante 30 días en una solución regulada a 37ºC.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero
no limitar la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo describe la inmovilización de
sarcosina oxidasa en polímeros de poliuretano utilizando
PEG-NCO
\vskip1.000000\baselineskip
La sarcosina oxidasa (de Arthrobacter sp.,
SAO-341) fue comprada de Toyobo Co., Ltd. La
peroxidasa de rábano fue comprada de Sigma-Aldrich
(San Louis, MO). Todas las enzimas fueron utilizadas sin
purificación adicional. El PEG-NCO (peso molecular
5000) y PEGSPA (peso molecular 5000) fueron obtenidos de Shearwater
Polymers Inc. (Huntsville, AL). El prepolímero Hypol 2060G fue
comprado de Hampshire Chemical (Lexington, MA): Todos los demás
reactivos fueron comprados de Sigma-Aldrich
Chemicals (San Louis, MO) y eran de la más alta pureza
disponible.
\vskip1.000000\baselineskip
La sarcosina oxidasa fue disuelta en un
regulador acuoso (regulador de fosfato 50 mM, pH 7.5 o regulador de
borato 50 nM, pH 8.5) a una concentración de 1 mg/mL. Se añadió el
PEG-NCO o el PEG-SPA en exceso a la
enzima en una relación molar de 1:100 para asegurar una
modificación enzimática completa. En algunos experimentos los
inhibidores de sarcosina oxidasa (ácido metiltioacético 50 mM o
ácido pirrol-2-caboxílico 50 mM)
fueron añadidos para ayudar a prevenir la inactivación de la
enzima. La mezcla de reacción fue mezclada durante 30 min seguida
por diálisis (corte de peso molecular 12000) contra regulador de
fosfato 50 mM (Drevon et al., Biomacromolecules
2:764-771 (2001)).
\vskip1.000000\baselineskip
El prepolímero Hypol 2060G (0.4 g), un
prepolímero basado en tolueno diisocianato fue añadido a una
solución regulada (3.6 g de regulador de fosfato 50 mM, inhibidor
50 mM, pH 7.5 que contenía sarcosina oxidasa (de 0 a 200 unidades
de enzima por gramo de prepolímero). La solución acuosa de polímero
fue mezclada vigorosamente durante 30 segundos en una cápsula de
pesaje hasta el inicio de la gelificación. La polimerización fue muy
rápida y la gelificación usualmente tuvo lugar antes de un
minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo análisis
MALDI-MS utilizando un Persective Biosystems Voyager
Elite MALDI-TOF- El voltaje de aceleración fue
establecido en 20 kV en un modo lineal. Se mezcló 1 \muL de
solución de enzima PEGilada (0.1 mg/mL) con 1 \muL de solución
matriz (0.5 mL de agua, 0.5 mL de acetonitrilo, 1 \muL de ácido
trifluoracético, y 10 mg de ácido sinapínico) y luego se sembró
sobre la placa objetivo. Se registraron los espectros después de la
evaporación de la mezcla de solventes y se calibró externamente con
citocromo C equino (12,361.96 Da (media)), aldolasa de músculos de
conejo (39,212.28 Da (media)) y albúmina de suero bovino (66,430.09
Da (media)).
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de peróxido de hidrógeno fue
medida utilizando el sistema
4-aminoantipireno-peroxidasa
(Nishiya and Imanaka, Appl. Environ. Microbiol.
62:2405-2410 (1996)). Típicamente, se incubó una
solución enzimática (0.05 mL) con una mezcla (1.0 mL total) de
sarcosina 95 mM, 4-aminoantipireno 0.47 mM, fenol 2.
mM, tritón X- 100 0.045%, fosfato de sodio 50 mM (pH 8.0) y 5
unidades/mL de peroxidasa de rábano a 37ºC durante 10 minutos. La
reacción fue terminada mediante la adición de 2.0 mL de solución de
SDS 0.25% y se midió la absorbancia a 500 nm. Una unidad fue
definida como la cantidad enzima que catalizaba la oxidación de
1).mol de sustrato por minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
La rata inicial de consumo de oxígeno fue medida
también a 37ºC con un electrodo de oxígeno Clark de Yellow Spring
Instruments (Yellow Springs, OH). La reacción fue iniciada añadiendo
una solución enzimática (1 \muL) o un polímero que contenía
enzima (10-100 mg de corte en pequeñas piezas) a 5.0
mL de sustrato (sarcosina 50 mM en regulador de fosfato mM, pH
7.5). Antes de la medición, la solución de prueba se dejó equilibrar
a 37ºC con aire. El consumo de oxígeno fue medido para 5 a 10
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La sarcosina oxidasa fue adicionada a un medio
regulado (fosfato de sodio 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5). La
concentración de enzima nativa utilizada fue 0.06 mg/ml. La
actividad de la sarcosina oxidasa fue seguida con el tiempo a
temperatura ambiente (22ºC), y a 4ºC y 37ºC utilizando el ensayo de
punto final descrito más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
La termoinactivación de la
PEG-sarcosina oxidasa fue monitorizada a 37ºC en
reguladora (fosfato de sodio 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5) tal como se
describió para la enzima nativa. La concentración de la enzima en
todas las muestras fue ajustada a 0.05 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de enzima-polímero
fueron cortadas en pequeñas piezas y añadidas al regulador (fosfato
50 mM, pH 7.5) y se incubaron a 37ºC. Las muestras fueron retiradas
con el tiempo y probadas en cuanto a su actividad enzimática
utilizando el electrodo de oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el efecto de los iones plata
sobre la sarcosina oxidasa, 0.07 mg/mL de sarcosina oxidasa fueron
incubados en Tris-HCl 20 mM (pH 7.5), con nitrato de
plata (0 a 1 mM) a temperatura ambiente. Las muestras fueron
retiradas periódicamente y probadas utilizando la prueba de punto
final para la actividad de la sarcosina oxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la inmovilización de la enzima en los
polímeros de poliuretano involucra la modificación química de le
enzima mediante reacciones que involucran el isocianato con residuos
nucleofílicos sobre la superficie de la enzima es conveniente
modelar el proceso de la modificación química utilizando polímero
solubles. La modificación utilizando esta técnica nos permite
simular el efecto de la inmovilización covalente sobre la actividad
enzimática a la vez que aún se trabaja con una enzima soluble. Una
vez que la enzima es incorporada en un polímero, los efectos de la
transferencia de masa pueden complicar el análisis.
La sarcosina oxidasa monomérica fue modificada
utilizando PEG-NCO (5,000 de peso molecular) a pH
7.5 (regulador de fosfato 50 mM) y pH 8.5 (regulador de borato 50
mM) utilizando diferentes proporciones (NCO/enzima). La cantidad de
enzima nativa remanente fue cuantificada utilizando análisis
MALDI-TOF y se representó en una gráfica contra la
retención de la actividad de la sarcosina oxidasa después de la
modificación (Figura 1). Cuando la enzima fue modificada a pH 7.5,
el porcentaje de actividad retenida fue proporcional al porcentaje
de enzima no modificada. Esto indica que un residuo crítico desde la
perspectiva del mecanismo de la enzima (o grupo de residuo) domina
la reacción con el isocianato. Sin embargo, la modificación a pH 8.5
llevó a una retención incrementada de la actividad probablemente
debida a la nucleofilicidad incrementada de la
\alpha-aminas de la lisina (promedio pKa = 9.3 -
9.5) con pH incrementado.
Puesto que una modificación individual por parte
del isocianato parecía desactivar la sarcosina oxidasa, se
requerirá un método para proteger la enzima durante la
inmovilización en polímeros de poliuretano. Si la modificación en o
cerca de un residuo de un sitio activo, puede añadirse un inhibidor
a la solución para ayudar a incrementar la retención de actividad
bloqueando el aseguramiento del sitio activo. Aunque este método de
protección es discutido frecuentemente, la literatura contiene
pocos ejemplos apreciables de donde las estrategias de protección
del inhibidor trabajar efectivamente. Un número de inhibidores ha
sido identificado para la sarcosina oxidasa (Wagner et al.,
Biochem 39:8813-8824 (2000)). El ácido
pirrol-2-carboxílico (Ki=1.27 mM) y
el ácido (metiltio) acético Ki=2.60 mM) fueron seleccionados puesto
que tenían bajos valores de Ki y no contenían grupos funcionales
que fuesen altamente reactivos con el isocianato. El sustrato
nativo, sarcosina (Km = 0.6), no fue utilizado como agente
protector ya que el producto de oxidación catalítica, peróxido de
hidrógeno, puede inactivar la enzima y también puede oxidar el
excreto PEG. La modificación de la sarcosina oxidasa a pH 7.5 con
cualquiera de los inhibidores mostró una retención de la actividad
considerablemente mejorada en comparación con la modificación sin
inhibidor (Figura 2). El análisis por MALDI-TOF
confirmó que la mayor parte de la enzima se modificó con PEG y que
la presencia del inhibidor tenía un efecto mínimo sobre el proceso
de modificación mismo.
La estabilidad de las sarcosina oxidasas nativa
y modificada con PEG fue medida a 37ºC en regulador de fosfato 50
mM (Figura 3). La enzima con un promedio de una cadena de PEG unida
por molécula de enzima tenía una estabilidad similar a la enzima
nativa (vida media de 7 días). La enzima con un promedio de tres
cadenas PEG unidas por moléculas de enzima tenía una vida media
mejorada (17 días).
\vskip1.000000\baselineskip
Los isocianatos son capaces de reaccionar con
los grupos amino, sulfhidrilo, carboxilo, hidroxilofenólico
imidazol y fosfato en las proteínas (Means and Feeney, Chemical
modification of proteins, San
Francisco:Holden-Day, Inc, (1971)); sin embargo,
solamente la reacción con los grupos amino resulta de la formación
de un producto estable. Las reacciones con los grupos sulfhidrilo,
imidazol, tirosilo y carboxilo produce aductos relativamente
inestables que pueden descomponerse por dilución o cambios en el pH
(REF).
La inactivación por cianato e isocianato ha sido
reportada para un cierto número de enzimas: pepsina (Rimon and
Perlmann, J Biol Chem 243:3566-3572 (1968), papaína
(Sluyterman, Biochim Biophys Acta 139:439-449
(1967)), tripsina y quimotripsina (Shaw et al., J Biol Chem
239:PC671-673 (1964); Brown and Wold, Biochemistry
12:835-40 (1973)), y glutatión reductasa (Jochheim
and Bailie, Biochem Pharmacol 47:1197-1206 (1994)).
La actividad proteolítica de la pepsina fue inhibida cuando los
residuos de tirosina fueron carbamilados con cianato de potasio;
sin embargo el tratamiento con hidroxilamina fue efectivo para
invertir la inactivación descarbamilando los residuos (Rimon y
Perlman, supra, 1968). La papaína también es inactivada por
el cianato. En efecto, el sitio activo tiol de la papaína es
aproximadamente 3000 veces más reactivo con cianato que el grupo
tiol de la cisteína libre (Sluyterman, supra, 1967). La
inactivación es reversible por dilución debido a un debilitamiento
del grupo sulfhidrilo carbamilado. La quimotripsina también mostró
ser inactivada por el cianato (Shaw et al., supra,
1964). La modificación del sitio activo de serina es la causa de la
inactivación y se han reportado efectos similares para la tripsina
y la subtilisina (Shaw et al., supra, 1964).
Con el fin de determinar si la sarcosina oxidasa
modificada con isocianato fue modificada en un residuo que daba un
aducto inestable (un residuo sulfhidrilo o tirosilo modificado por
ejemplo), la enzima fue tratado con un cierto número de maneras
para intentar reactivar la inactividad de la enzima. Ni la dilución,
ni la diálisis durante la noche a pH 7.5 fueron exitosas en la
reactivación de la enzima. El tratamiento con hidroxilamina es un
método utilizado frecuentemente para remover conjugados enlazados
débilmente de las enzimas (Smyth, J. Biol. Chem.
242:1592-1:598 (1967)). El tratamiento de sarcosina
oxidasa modificada con isocianato con hidroxilamina (500 mM, pH 7)
por hasta 24 horas no fue efectivo para revivir la enzima. Así, el
PEG-isocianato había reaccionado con una amina de
la superficie de la proteína y por lo tanto había inactivado la
enzima.
Con el fin de determinar si la inactivación fue
específica para el isocianato, o si otros PEGs modificadores de la
amina tendrían un efecto similar, la sarcosina oxidasa fue
modificada utilizando PEG-SPA. El
PEG-SPA es un PEG modificado con NHS que forma
uniones amida estables con las aminas (Hermanson, Bioconjugate
Techniques, San Diego: Academic Press, 1996). De forma interesante,
una modificación baja (promedio de 1 a 3 PEG por enzima) de
sarcosina oxidasa con el PEG-SPA causó una pérdida
de menos de 5% de actividad. En modificaciones más altas (> 5
PEG cadenas unidas) fue evidente una pérdida más significativa de la
actividad enzimática la cual podría prevenirse utilizando los
inhibidores ácido pirrol carboxílico y (metiltio) acético. Esto
indica que la reactividad del PEG-SPA con los
residuos sobre la superficie de la sarcosina oxidasa que la
reactividad de PEG-NCO con sarcosina oxidasa.
Puesto que la modificación de la sarcosina
oxidada a pH 7.5 causó un mayor inactivación que a pH 8.5, parece
probable que la modificación de la amina terminal puede ser
responsable por la pérdida de la actividad puesto que la amina
terminal debería ser más reactiva (la amina terminal tiene un pKa
más bajo que la \alpha-amina de la lisina). En
efecto, la modificación de la sarcosina oxidasa por el
PEG-NCO no produjo una desviación notable en el
espectro de absorción visible de la sarcosina oxidasa indicando que
la modificación no ocurrió en el sitio activo. El espectro de
absorción de la FAD enlazada a la enzima de la Corinebacterium
sarcosina oxidasa ha sido reportada por cambiar (desviación hacia
el rojo del pico de absorción de 455 a 462 nm) por modificación de
un residuo de histidina con dietilpirocarbonato (DEP), probablemente
en la vecindad de la unidad estructural flavina, (Hayashi et
al., J. Biochem. 94:551-558 (1983)). La
sarcosina oxidasa modificada con DEP es completamente inactiva; sin
embargo, la actividad puede ser recuperada mediante tratamiento con
hidroxilamina. Aunque el espectro de absorción de la Artrobacter
sarcosina oxidasa no se desvía por modificación con
PEG-NCO, esto no es evidencia absoluta de que la
modificación no ocurra en el sitio activo.
Con el fin de elucidar el efecto de la
modificación sobre la actividad de la sarcosina oxidasa, se llevaron
a cabo estudios computacionales para predecir los residuos más
importantes para la actividad/estabilidad de la enzima y los
residuos más reactivos para la modificación.
La reactividad de la acetilación sobre los
residuos de lisina en ARNAasa A como una función de la accesibilidad
del solvente (SA) de una residuo y el valor pKa de las lisinas ha
sido descrito previamente (Glocker et al., Bioconjugate
Chem. 5:583-590 (1994)). Se han mostrado resultados
similares para la desoxi-hemoglobina (Scaloni et
al., FEBS Letters 452:190-194 (1999)) y
peroxidasa de rábano (O' Brien et al., Biotechnol Bioeng
76:277-284 (2001)). Específicamente, la reactividad
se incrementa al incrementarse el SA. Sin embrago, aún con un SA
bajo, la reactividad se incrementa dramáticamente cuando el pKa de
un residuo de lisina dado es especialmente bajo (lo que significa
un muy buen nucleófilo). Por lo tanto, los residuos de lisina
localizados en la superficie de la enzima (con pKa\sim2.5)
tendrán una reactividad que es proporcional al SA; sin embargo, los
residuos localizados en una ambiente que pueda tener un efecto
significativo sobre el pKa, como el sitio activo de la lisina de la
ribonucleasa A bovina, tendrá un pKa significativamente diferente y
una reactividad alterada.
Los pKa's predichos para los residuos de lisina
en la sarcosina oxidasa (MSOX libre de FDA) se muestran en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las filas en negrilla muestran los residuos
localizados en o dentro de seis Angstroms del sitio reactivo de la
enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
El SA fue calculado a partir del visor SWISS PDB
y los pKa estimados fueron obtenidos a partir del algoritmo UHBD.
Con base en estos resultados, la lisina 351 es la lisina más
reactiva puesto que el pKa de esta lisina es 9.18. La lisina 268 en
sitio activo tiene el segundo pKa más bajo de 9.68. La lisina del
tercer sitio activo (lisina 322) tiene un pKa significativamente
incrementado (13.67) y no se sospecha que sea modificada
fácilmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de encontrar las condiciones óptimas
para la modificación de sarcosina oxidasa para preservar la
retención de la actividad de la enzima durante la modificación con
isocianato, la enzima fue inmovilizada en hidrogeles de
poliuretano. Los polímeros que contenían enzima que fueron
preparados con concentraciones de enzima de 0 a 200 U/g de polímero
tenían una actividad específica que era directamente proporcional a
la concentración de la enzima (Figura 4). Puesto que la rata de
reacción es proporcional a la concentración de la enzima, esto
asegura que las ratas medidas bajo estas condiciones no son
controladas en cuanto a su difusión y representan solamente la rata
de la reacción catalizada por la enzima (Yamane, Bioeng.
19:749-756 (1977)). Los polímeros con enzima
preparados sin inhibidor no retuvieron actividad verificando que los
efectos vistos con los modificadores solubles se trasladaban
directamente al biopolímero de poliuretano. Las retenciones de
actividad de los polímeros preparados con inhibidor fueron
aproximadamente 10% de las encontradas usando un método
protegido.
Los polímeros inmovilizados fueron probados en
cuanto a su reutilización ensayando repetidamente una muestra de
gel individual durante ocho ciclos sin pérdida de actividad aparente
(Figura 5). Como se ve con otras químicas de poliuretano, la enzima
es bien inmovilizada dentro del gel y no se observa pérdida de
enzima (Lejeune and Russell, Biotechnol Bioeng
51:450-457 (1996); Lejeune et al., Biotechnol
Bioeng 544:105-114 (1997); Drevon et al.,
Biotechnol Bioeng 79:785-794 (2002)). Los polímeros
también fueron preparados y almacenados en una reguladora a 4ºC
bajo agitación suave. Las muestras fueron retiradas de la fase
líquida para medir la actividad enzimática que pueda haberse
perdido. No se midió actividad en la fase líquida durante un período
de casi 50 días (Figura 6). Puesto que la enzima es inmovilizada de
manera irreversible en el material de poliuretano, esta técnica de
inmovilización será ideal para su uso en biosensores clínicos
reutilizables.
La termoinactivación de la enzima en el polímero
fue determinada incubando muestras de
enzima-polímero en un regulador a 37ºC y retirando
las muestras para probar periódicamente (Figura 7). La vida media de
la sarcosina oxidasa nativa a 37ºC es 7 días muestras que la
sarcosina oxidasa inmovilizada retuvo más del 50% de su actividad
después de incubación a 37ºC en solución reguladora durante más de
50 días. Obviamente, la inmovilización protegida por inhibidor de
la sarcosina oxidasa en polímeros de poliuretano es efectiva para
estabilizar la enzima. La alta estabilidad enzimática,
especialmente a temperaturas elevadas, será esencial para una
aplicación exitosa en analizadores clínicos de sangre de uso
continuo.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la enzima será aplicada a electrodos
amperométricos que contienen electrodos de referencia plata/AgCl,
el efecto de los iones plata sobre la actividad de la enzima fue
explorado. La inhibición de las enzimas por los iones plata a
partir de los electrodos de referencia había sido notada antes
(Schaffar, Anal Bioanal Chem 372:254-260 (2002);
Patente de los Estados Unidos No. 4,547,280) y debería establecerse
adecuadamente puesto que los iones plata pueden enlazarse muy
apretadamente a una enzima y llevar a su desactivación.
Con el fin de probar la sarcosina oxidasa en
cuanto a la inhibición por los iones plata, se añadió nitrato de
plata 1 nM a 1 mM a una solución de enzima y se incubó durante
varios periodos de tiempo. La enzima fue retirada entonces de la
solución y probada en cuando a la actividad residual de la sarcosina
oxidasa en ausencia de plata (Figura 8). Obviamente, la plata es un
inhibidor irreversible efectivo de la sarcosina oxidasa. La
inhibición de la enzima parece ser lenta requiriendo largos períodos
de incubación para ver un efecto a bajas concentraciones de plata.
Aunque la inhibición puede no ser instantánea, puesto que estos
sensores pueden ser usados durante un período de un par de semanas,
la inhibición por plata puede acortar la vida media del sensor y
pueden emplearse estrategias para disminuir el impacto de los iones
plata sobre los sensores basados en biocatalizadores tal como se
describió más arriba para disminuir o prevenir la inactivación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
II
Este ejemplo describe la inmovilización y
estabilización de la creatina amidinohidrolasa modificada con
polietilen glicol (PEG activado con isocianato).
\vskip1.000000\baselineskip
La creatina amidinohidrolasa (de Actinobacilus
sp., CRH-211) y la sarcosina oxidasa de Artrobacter
sp., SAO-341) fueron compradas de Toyobo Co., LTD.
Todas las enzimas fueron utilizadas sin purificación adicional. El
PEG-NCO (peso molecular 5000) fue obtenido de
Shearwater Polymers Inc. (Huntsville, AL) El prepolímero Hypol 2060G
fue obtenido de Hampshire Chemical (Lexington, MA): Todos los demás
reactivos fueron comprados de Sigma-Aldrich
Chemicals (San Louis, MO) y eran de la pureza más alta
disponible.
\vskip1.000000\baselineskip
El PEG-NCO fue añadido a
temperatura ambiente a una solución regulada (fosfato 50 mM, pH 7.5)
que contenía 3 mg/mL de creatina amidinohidrolasa. La relación de
PEG-NCO/enzima fue ajustada de 0/1 a 100/1. La
reacción fue mezclada durante 30 minutos seguida por diálisis
durante la noche con la solución reguladora de fosfato 50 mM a 4ºC
(Drevon et al., Biomacromolecules 2:764- 771 (2001)). La
actividad de la enzima después de la modificación fue determinada
utilizando una prueba de punto final (descrita más abajo).
\vskip1.000000\baselineskip
El prepolímero Hypol 2060G (0.4 g), un
prepolímero basado en tolueno diisocianato, fue añadido a una
solución regulada (3. 6 g de regulador de fosfato 50 mM, pH 7.5)
que contenía creatina amidinohidrolasa (0 a 100 unidades de enzima
por gramo de prepolímero). La solución polimérica acuosa fue
mezclada durante 30 segundos en una cápsula de pesaje hasta el
inicio de la gelificación.. La polimerización fue muy rápida y la
gelación se terminó usualmente al cabo de un minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis de MALDI-MS fueron
llevados a cabo utilizando un sistema Perspective Biosystems Voyager
Elite MALDI-TOF. El voltaje de aceleración fue
establecido en 20 kV en un modo lineal. 1 \muL de solución de
enzima PEGilada (0.1 mg/mL) fue mezclado con 1 \muL de solución
matriz (0.5 mL de agua, 0.5 mL de acetonitrilo, 1 \muL de ácido
trifluoracético y 10 mg de ácido sinapínico). Los espectros fueron
registrados después de la evaporación de la mezcla de solventes y
fueron calibrados externamente utilizando citocromo C equino
(12,361.96 Da), aldolasa de músculo de conejo (39,212.28 Da) y
albúmina de suero bovino (66 430.09 Da).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la creatina amidinohidrolasa fue
monitorizada utilizando un ensayo colorimétrico que mide la
formación de urea a partir de la hidrólisis de la creatina (Tsuchida
and Yoda, Clin. Chem. 29:51-55 (1983)). Una
solución de enzima (0.1 mL) fue incubada con una mezcla 0.90 mL) de
creatina 100 mM en solución reguladora de fosfato de sodio (50 mM,
pH 7.5) a 37ºC durante 10 minutos. La reacción fue detenida
añadiendo 2.0 mL de una solución que contenía el reactivo de
Ehrlich's (2.0 g de p-dimetil aminobenzaldehído en
100 mL de dimetil sulfóxido de más 15 mL de HCl concentrado). La
solución fue incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente y
se midió la absorbancia a 435 nm. Una unidad se definió como la
cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de una \mumol de
sustrato por minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
La rata inicial de consumo de oxígeno fue medida
a 37ºC con un electrodo de oxígeno Clark de Yellow Springs
Instruments (Yellow Springs, OH).La reacción fue iniciada añadiendo
una solución enzimática (1 \muL) o un polímero que contenía
enzima (10-100 mg cortado en pequeñas piezas) a 5.0
mL de substrato (creatina 100 mM en solución reguladora de fosfato
50 mM, pH 7.5 con al menos 6 U/mL de sarcosina oxidasa). Antes de la
medición la solución de prueba se dejó equilibrar a 3.7ºC con aire.
El consumo de oxígeno fue medido de 5 a 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La termoinactivación de la creatina
amidinohidrolasa nativa y PEG fue monitorizada a 37ºC en solución
reguladora (50 Mm de fosfato de sodio, EDTA 2 mM, pH 7.5). La
concentración de la enzima en todas las muestras fue 0.08 a 0.
Mg/ml. Las muestras fueron retiradas periódicamente y probadas en
cuanto a su actividad utilizando la prueba de punto final.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de polímero enzima fueron cortadas
en pequeñas piezas y añadidas a una solución reguladora (fosfato 50
mM, pH 7.5) e incubadas a 37ºC. Las muestras fueron retiradas
periódicamente y probadas en cuanto a su actividad enzimática
utilizando el electrodo de oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
La creatina amidinohidrolasa (1.0 mg/mL) fue
incubada en Tris-HCl 20 mM (pH 7.5) con nitrato de
plata (0 a 1 mM) a temperatura ambiente. Las muestras fueron
retiradas periódicamente probadas utilizando el ensayo de punto
final. Con el fin de probar si la creatina actuaba como un inhibidor
competitivo para la inhibición por plata, el ensayo de punto final
fue llevado a cabo como se describe más arriba con nitrato de plata
añadido a la solución de creatina (AgN03 0 a 100 \muM en solución
reguladora Tris 20 mM). Después de 10 minutos de incubación, se
añadió la solución detención (solución de p-dimetil
benzaldehído). Los experimentos de control mostraron que el nitrato
de plata no tenía efecto sobre el desarrollo de color.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó creatina amidinohidrolasa (1.0 mg/ml)
en solución con EDT A 50 mM, EGT A 50 mM, mercaptoetanol 50 mM, DTT
50 mM o cisteína 50 mM con Tris 20 mM, pH 7.5. Se añadió nitrato de
plata para darle una concentración final de 0 a 100 \muM. Después
de la adición de nitrato de plata, las soluciones se dejaron incubar
durante 50 minutos y la actividad residual fue determinada
utilizando el ensayo de punto final.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros UV fueron determinados tal como lo
describen Shen et al., J. Inorg. Biochem,
95:124-130 (2003). Rápidamente, la creatina
amidinohidrolasa (1 mg/mL) fue disuelta en Tris 20 mM (pH 7.5) con
concentraciones variables de nitrato de plata
(0-100 \muM). En cubetas de cuarzo, se midieron
los espectros de absorción UV de las soluciones de enzima de 230 a
300 nm. Los espectros diferenciales fueron obtenidos sustrayendo el
espectro de la enzima nativa (sin plata) de los espectros de enzima
con plata.
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura cristalina de la Actinobacilus
creatinasa tal como la describen Padmanabhan et al., Acta
Crystallogr., Sect. D 58(8): 1322-1328
(2002) (código PDB: 1KP0) fue utilizado para el modelo de red
Gaussiana (GNM) (Bahar et al., Folding Design
2:173-181 (1997)), para el análisis de la dinámica
colectiva. La estructura de la unión CMS (análogo de creatina) A.
Bacillus creatinasa fue modelada computacionalmente combinando la
molécula de CMS en la estructura de P.putida creatinasa (código
PDB: 1CHM) con la estructura de A. Bacillus creatinasa, seguido por
minimización de la energía estándar utilizando el paquete MOE
(Molecular Operating Environment, world wide web at
chemcomp.com/Corporate_Infonnation/MOE_Bioinfonnatics.html).
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al efecto de la modificación
química sobre la actividad y estabilidad de la creatina
amidinohidrolasa, la PEGilación simula con exactitud las primeras
etapas en las estrategias de inmovilización con base en poliuretano.
Por lo tanto, la enzima fue PEGilada. La creatina amidinohidrolasa
puede ser modificada con PEG's reactivos hasta un alto grado sin
pérdida significativa de la actividad de la enzima. La modificación
de cada monómero de la enzima con un promedio de 5 cadenas de PEG
lleva a la pérdida de solamente el 30% de actividad.
Aunque la mayor parte de la actividad de la
enzima fue retenida después de la modificación, se observó un
significativo decrecimiento en la estabilidad de la enzima cuando la
enzima modificada fue almacenada en una solución reguladora a 37ºC
(Figura 9). La enzima nativa pierde menos de 40% de actividad en
solución reguladora a 37ºC a lo largo de 40 días; sin embargo, la
enzima modificada mostró un decrecimiento sustancial en su
estabilidad en solución. Puesto que la creatina amidinohidrolasa es
un homodímero con una estabilidad intrínseca baja (Schumann et
al., Biol. Chem. 374:427-434 (1993)) es posible
que la modificación química modifique la proteína de manera tal que
es desplegada con mayor facilidad. Aunque la PEGilación
frecuentemente predice el impacto de la inmovilización en
poliuretano sobre la actividad, la estabilización de las proteínas
por inmovilización puede ser significativamente diferente que el
impacto de la PEGilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los biopolímeros fueron preparados con
concentraciones de 0 a 100 unidades/g de polímero. La actividad
específica de las enzima-polímeros fue directamente
proporcional a la concentración de la enzima (Figura 10). Esto
implica que las ratas medidas bajo estas condiciones no son
controladas en cuanto a la difusión y reflejan solamente la rata de
reacción enzimática (Yamane, Biotechnol. Bioeng.
19:749-756 (1977)). La retención de la actividad
promedio de la creatina amidinohidrolasa en los polímeros de
poliuretano fue 28%.
Los polímeros inmovilizados fueron probados en
cuanto a su posibilidad de ser reusados probando repetidamente una
muestra de gel individual durante ocho ciclos sin pérdida de
actividad aparente (Tabla 1). Como se ve con otras químicas de
poliuretano, la enzima es bien inmovilizada dentro del gel y no se
observa pérdida de enzima (Lejeune and Russell, Biotechnol Bioeng
51:450-457 (1996); Lejeune et al., Biotechnol
Bioeng 54:105-114 (1997); Drevon et al.,
Biotechnol Bioeng 79:785-794 (2002)).
La estabilidad en almacenamiento de la enzima en
el polímero fue determinada incubando las muestras
enzima-polímero en solución reguladora a 37ºC y
retirando las muestras periódicamente para ser probadas (Figura 10).
De forma interesante, la enzima polimerizada reproduciblemente
incrementó la actividad observada durante la primera semana de
almacenamiento. Este incremento en la actividad puede deberse a un
cambio en las propiedades del polímero; sin embargo, este tipo de
efecto no fue observado con otras enzimas en estos polímeros.
Después de la primera semana, la actividad de la enzima comenzó a
decrecer y la rata de pérdida en la actividad observada de la
enzima dependía de la concentración de la enzima en el polímero. Los
polímeros con más enzima mostraron una menor desactivación. No
obstante, se retuvo una actividad significativa en todos los
polímeros hasta por 80 días lo cual es más que suficiente para su
uso en un biosensor de diagnóstico. Obviamente, la reducción de
estabilidad causada por la PEGilación no fue observada en la enzima
inmovilizada. Dado que solamente por inmovilización la enzima es
"asegurada" en una conformación fija estos datos soportan una
expectativa intuitiva de las mejoras en la estabilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de ser utilizada en un sensor en
funcionamiento, la enzima inmovilizada en poliuretano puede ser
aplicada a electrodos amperométricos que contengas Ag/AgCl. Dada la
conocida propensión de los iones plata a interactuar con las
proteínas (Schaffar, Anal Bioanal Chem 372:254- 260 (2002); Patente
de los Estados Unidos No. 4,547,280), el efecto de los iones plata
sobre la actividad de las enzimas ha sido explorado. La inactivación
inducida por plata se hace más preocupante si un sensor va a ser
utilizado en una serie con otros sensores durante un largo período
de tiempo puesto que la enzima tendrá tiempo significativo para
extraer plata de la solución.
Con el fin de probar la creatina
amidinohidrolasa en cuanto a la inhibición por iones plata, la
enzima fue probada con nitrato de plata 5-100
\muM y probada en cuanto a la actividad residual de creatina
amidinohidrolasa. La plata es un inhibidor muy efectivo de la
creatina amidinohidrolasa inhibiendo completamente la actividad de
la enzima. Adicionalmente las bajas concentraciones de plata
inactivan efectivamente la enzima. Además, la concentración de
plata está en el mismo orden que la concentración de enzima.
Con el fin de determinar si la plata estaba
actuando como un inhibidor competitivo se añadieron diferentes
concentraciones de plata y creatina 90 mM a la solución reguladora.
La enzima (\sim7 \muM) fue añadida directamente a esta solución
y después de 10 minutos se determinó la concentración de urea en el
sistema (Figura 11). La presencia de creatina no hizo más lenta la
inhibición de la enzima. La plata probablemente se enlaza en una
localización diferente al sitio activo; de otro lado, su actividad
inhibidora sería reducida por la presencia de altas concentraciones
del sustrato. También es importante anotar que la inactivación no
fue reversible. La dilución de la enzima inhibida no regeneró su
actividad; adicionalmente, la diálisis durante la noche con EDT A o
DTT no reactivó la enzima. Esto indica que la plata se enlaza muy
estrechamente a la enzima y probablemente no se disocie.
Puesto que la enzima es inhibida efectivamente
por los iones plata a concentraciones que podrían ser liberadas
desde los electrodos en un biosensor clínico, es interesante
desarrollar métodos para prevenir o al menos disminuir la
inhibición de la enzima por plata: la plata puede ser consumida
efectivamente por un cierto número de moléculas. El uso de
soluciones 50 mM de EDT A, EGTA, DTT mercaptoetanol, cisteína,
imidazol y polietilenimina (PEI) fue empleado para secuestrar la
plata. La inhibición por los iones plata fue prevenida efectivamente
mediante pre-incubación con compuestos que
contenían tiol (cisteína, mercaptoetanol, DTT) y se previno de
alguna manera por PEI (Figura 12). Por lo tanto, los compuestos que
contienen tiol pueden ser efectivos en el consumo de los iones
plata que se pierden del electrodo y pueden ser útiles en prevenir
la desactivación de la enzima.
La espectroscopía UV/V fue utilizada para
determinar si ocurrían cambios estructurales mayores por el
enlazamiento de la plata a la enzima (Figura 13). Un incremento de
la absorbancia alrededor de 247 nm es evidente cuando se
incrementan las concentraciones de plata. Este pico observado
probablemente es debido a la formación de bandas de transición de
carga de ligando a metal (LMCT). Las bandas LMCT son debidas a las
transiciones de carga que ocurren cuando los ligandos en la
creatina amidinohidrolasa se enlazan al centro metálico de AG (I)
(Shen et al., J Inorg Biochem 95:124-130
(2003)). Se utilizó la espectroscopia Raman para mostrar que los
iones plata forman enlaces covalente con los átomos de azufre en la
albúmina de suero humana (HSA) (Shen et al., supra,
2003). Puesto que la Ag (I) es un ácido de Lewis suave debería tener
una alta afinidad por el átomo de azufre donador suave (ref) y por
lo tanto se podrían esperar fuertes interacciones entre los residuos
de cisteína de la creatina amidinohidrolasa y la plata.
La modificación de los grupos sulfhidrilo sobre
la creatina amidinohidrolasa produce la pérdida completa de
actividad (Coll et al., J Mol Biol
214:597-610 (1990) and Yoshimoto et al., J
Biochem 79:1381-1383 (1976). Esto es interesante
puesto que los residuos Cys están todos lejos del sitio activo y no
tienen un papel conocido en la catálisis (Coll et al.,
supra, 1990; Hoeffken et al., J Mol Biol
204:417-433 (1988)). La alquilación de la Cys298
inactiva la enzima aun cuando este residuo esté lejos del sitio
activo y la pérdida de actividad puede ser atribuida a la
prevención posible de los movimientos de dominio por alquilación
asegurando así la enzima en una conformación dada.
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Para investigar adicionalmente como los residuos
Cys, y su interacción con los iones plata, pueden contribuir a la
función y estabilidad de la creatina amidinohidrolasa, se examinó la
dinámica de la proteína con el modelo de red Gaussiana (GNM (Bahar
et al., supra, 1997). El GNM es un modelo de red
elástica que ha demostrado predecir la dinámica colectiva de las
proteínas, en una concordancia cercana con los factores de
temperatura (B-) a partir de los experimentos cristalográficos con
rayos X (Bahar, Folding Design 2:173-181 (1997);
Kundu et al. Biophys. J. 83: 723-732
(2002)), así como los costos de energía libre del intercambio H/D
(Bahar et al., Biochemistry 37:1067-1075
(1998b)). La modalidad permite la descomposición de los movimientos
conformacionales en una serie de modos ortogonales, clasificados
por sus frecuencias asociadas. Los modos con la frecuencia más
lenta (el modo más lento) también son denominados como movimientos
"globales", que usualmente revelan los movimientos funcionales
que enganchan la molécula completa (Kitao and Go, Curr. Op. Struc.
Biol. 9(2): 164-169 (1999); Ming et
al., Procl. Nat. Acad. Sci. USA 99:8620-8625
(2002);Haliloglu and Bahar, Proteins: Structure, Function and
Genetics 37:654-667 (1999); Bahar and Jernigan, J.
Mol. Biol. 281:871-884 (1998); Bahar et al.,
Phys. Rev. Lett. 80:2733-2736 (1998); Bahar et
al., J. Mol. Biol. 285:102301037 (1999); Tama and Sanejouand,
Protein Engineering 14:1-6 (2001)). Los modos más
rápidos, por otro lado, indican los movimientos "locales" y
señalan a residuos individuales involucrados en el
plegado/estabilización temprana como proceso (Bahar et al.
Phys. Rev. Lett. 80:2733-2736 (1998); Rader and
Bahar, Polymer 45(2):659-668 (2004). La
utilidad principal del GNM es su aplicabilidad eficiente a la
dinámica de estructuras grandes (tales como creatina
amidinohidrolasa, un dímero de N = 804 residuos) que están más allá
del rango de las simulaciones de la dinámica molecular.
Como una primera prueba, los mínimos cuadrados
de las fluctuaciones de los residuos de creatina amidinohidrolasas
predichos por el GNM fueron comparados con los factores
experimentales B (Padmanabhan et al., supra, 2002)
(Figura 13(A)). Los resultados se presentan solamente para un
monómero puesto que ambos monómeros muestran un comportamiento de
fluctuación casi idéntico. La estructura del monómero está compuesta
de dos lóbulos, lóbulo-N y lóbulo-C
y los terminales N- y C- compuestos de 160 y 240 residuos,
respectivamente. El extremo N-terminal muestra las
fluctuaciones más altas. La concordancia cercana entre los valores
teóricos y experimentales da soporte a un examen adicional de los
movimientos colectivos con el GNM. El panel b despliega el diagrama
de cinta de la enzima, codificada en colores de rojo a azul, en el
orden de fluctuaciones de mínimos cuadrados decrecientes. El panel
C muestra la localización de los dos monómeros y el análogo sustrato
(CMS).
A continuación, se utilizaron modelos globales
de movimientos para inferir información sobre la dinámica funcional.
La Figura 14 muestra las movilidades de los residuos en el modo
global más representativo de la enzima, el cual efectivamente
presenta la demarcación entre los dos lóbulos. La ordenada aumenta
con los desplazamientos al cuadrado de los residuos individuales.
Los picos indican que las regiones más móviles, y las mínimas se
refieren a regiones de fijación global (o anclado), alrededor de las
cuales los movimientos concertados de las subestructuras grandes
(dominios, subunidades, etc) tienen lugar. Los residuos involucrados
en la actividad catalítica de la enzima (mostrados por los círculos
azules abiertos) exhiben fluctuaciones mínimas. Este tipo de
restricción mecánica cerca del sitio catalítico es consistente con
la sintonización fina y la cooperación de la actividad enzimática
(Barlett and Thornton, J. Mol. Biol. 324:105-121
(2002)). De manera notable, el análogo de sustrato (CMS) no está
enlazado simétricamente con respecto a los dos monómeros en la
estructura PDB, pero interactúa más cercanamente con una de las
cadenas (monómero B) y el subconjunto de residuos catalíticos
(mostrado por flechas en la Figura 14), aunque ambas cadenas exhiben
la misma dinámica global, y así están igualmente dispuestas a
enlazarse al sustrato.
El panel (B) en la Figura 15 presenta los mismos
resultados en el diagrama de cinta codificado por color del
monómero B. Utilizando la misma convención que la Figura 14, las
regiones móviles están coloreadas de rojo, y las regiones más
severamente constreñidas están coloreadas de azul. Las regiones de
movilidad intermedia están coloreadas de
naranja-amarillo-verde-cian,
en el orden de movilidad decreciente. El lóbulo terminal exhibe los
movimientos de amplitud más grande. Cys60 y Cys297 están localizadas
ambas en regiones altamente constreñidas de fijación/anclado sobre
los respectivos lóbulos C y N (Figura 15(A)). En particular
los residuos Cys297 en una región central altamente estable cerca
de la interfaz entre los dos lóbulos, juega un papel doble en el
control de los movimientos del dominio y del subdominio (evidenciado
por los mínimos observados en este residuo en los modos
dominantes). El dominio N-terminal sirve como una
tapa que se mueve concentradamente que permite que el bolsillo
catalítico en el dominio C-terminal de la otra
cadena sea expuesto al solvente y reclute el interior del sustrato.
La Cys60 que pertenece a la cadena A se coordina cercanamente con el
sustrato, y también es distinguida por constreñirse severamente y
por una dinámica cooperativa alta (mínimos en el panel A).
La Figura 16 proporciona una vista más cercana
de un bolsillo de enlace catalítico. Los átomos de oxígeno 0 1 de
la Glu357 y 0 2 de la Glu26 1 sobre el monómero B forman puentes de
hidrógeno con un átomo de nitrógeno en el grupo guanidina del CMS
(Figura 16), lo que puede facilitar la ruptura del enlace peptídico
entre el grupo guanidina y la molécula resultante de sarcosina.
Probablemente, los residuos Cys60, Phe62 y Arg64 sobre el monómero
A están espacialmente cercanos al monómero B His231, el residuo más
crítico que dicta a la química catalítica de la creatina (Coll
et al., J. Mol. Biol. 214:597-610 (1990);
Padmanabhan et al., supra, 2002). La His231 forma
tres puentes de hidrógeno con el sustrato (mostrados por líneas
punteadas) pero no con ningún otro aminoácido. El átomo sulfuro
(Sy) cobre la Cys60 podría formar una interacción similar a puente
de hidrógeno con nitrógeno N\delta1 sobre la His231, lo que
podría asistir a la cadena lateral His231 para estabilizar en una
conformación catalíticamente
potente.
potente.
Los núcleos de plegado fueron inferidos a partir
de los modos de frecuencia alta predichos por el GNM. Entre estos
tres residuos de cisteína, la Cys297 se distingue por un pico en la
Figura 16. La Cys297 se conoce como uno de los residuos más
críticos que están involucrados en el proceso de plegado temprano en
la creatina amidinohidrolasa. También se observó un pico cerca de
Cys249. La Cys249 está localizada en el núcleo de plegado compuesto
de tres láminas \beta (\beta9, (\beta11 y \beta12) y parte
de dos hélices \alpha (\alpha7 y \alpha8) en un plegado del
llamado pan pita del lóbulo terminal C aunque tiene solamente un
significado menor en la estructura en el proceso de plegado.
Adicionalmente desde el análisis electrostático, se encontró que la
Cys297 está rodeada por parches cargados negativamente. Estos
parches se sospecha que reclutan preferencialmente iones plata para
la Cys297, lo que se encontró estructural y funcionalmente crítico,
más que otras cisteínas. Una modalidad intuitiva para reducir la
sensibilidad de la plata de la creatina amidinohidrolasa podría ser
mutar los residuos responsables de los parches negativos alrededor
de Cys297. También una mutación individual de Cys60 a Ser o Thr
preservaría el carácter funcional de la Cys60 mientras que abate el
ataque potencial de los iones plata.
Significativamente, la plata se enlaza
fuertemente con la creatina amidinohidrolasa e inhibe completamente
la función enzimática aún en concentraciones bajas. Tal como se ha
informado en otros artículos en esta serie, las tres enzimas
necesarias para el biosensor de creatinina son inhibidas en algún
grado por la plata; así, se requieren métodos para prevenir o hacer
más lenta la inactivación de la enzima por parte de la plata.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
III
Este ejemplo describe la modificación e
inmovilización química de la enzima creatinina amidohidrolasa en
prepolímeros de poliuretano.
\vskip1.000000\baselineskip
La creatinina amidohidrolasa (del microorganismo
CNH-311), creatina amidinohidrolasa (de
Actinobacilus sp., CRH-211) y sarcosina oxidasa (de
Arthrobacter sp., SAO-341) fueron comparadas en
Toyobo Co., LTD. Todas las enzimas fueron usadas sin purificación
adicional. El PEG-SPA (peso molecular 5000) fue
obtenido de Shearwater Plymers Inc. (Huntsville, AL). El
prepolímero Hypol 20600 fue comprado en Hampshire Chemical
(Lexington, MA). Todos los demás reactivos fueron comprados de
Sigma-Aldrich Chemicals (San Louis, MO) y estaban en
la pureza más alta disponible.
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El PEG-SPA fue añadido a
temperatura ambiente en una solución regulada (fosfato 50 mM, pH
7.5) que contenía 3 mg/mL de creatina amidinohidrolasa. La relación
PEG..SPA a la enzima fue ajustada de 0/1 a 100/1. La mezcla de
reacción fue mezclada durante 30 minutos seguida por diálisis
durante la noche (12000 MWCO) contra solución reguladora de fosfato
50 mM a 4ºC (Drevon et al., Biomacromolecules
2:764-77 (2001)). La actividad de la enzima después
de la modificación fue determinada utilizando el ensayo de punto
final.
\vskip1.000000\baselineskip
El prepolímero Hypol 2060G (0.4 g), un
prepolímero basado en tolueno diisocianato, fue añadido a una
solución regulada (3.6 de solución reguladora de fosfato 50 mM, pH
7.5) que contenía creatinina amidohidrolasa (0 a 150 unidades de
enzima por gramo de prepolímero). La solución polimérica acuosa fue
mezcla vigorosamente durante 30 segundos, utilizando una espátula
en una cápsula de pesaje hasta que apareció la gelificación. La
polimerización fue muy rápida y la gelificación se terminó
usualmente al cabo de un minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis MALDI-MS fueron
llevados a cabo utilizando un sistema Perspective Biosystems Voyager
Elite MALDI-TOF. El voltaje de aceleración fue
definido a 20 kV en un modo lineal. Se mezcló 1 \muL de solución
de enzima PEGilada (0.1 mg/mL) con 1 \muL de solución matriz (0.
mL, 0.5 mL de acetonitrilo, 1 \muL de ácido trfluoracético y 10
mg de ácido sinaínico). Los espectros fueron registrados después de
la evaporación de la mezcla de solventes y se calibraron
externamente utilizando citocromo c equino (12 361.96 Da
(promedio)), aldolasa de músculo de conejo (39,212.28 Da
(promedio)) y albúmina de suero bovino (66,430.09 Da
(promedio)).
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de la actividad de la creatinina
amidohidrolasa se basa en la reacción de Jaffé (Tsuchida and Yoda,
Clin. Chem. 29:51-55 (1983)). Una solución de la
enzima (0.1 mL) fue incubada con una mezcla (0.90 mL) de creatina
100 mM en solución de fosfato de sodio mM (pH 7.5) a 37ºC durante 10
minutos. Después de 10 minutos, la mezcla creatina/enzima (0.1 mL)
fue añadida a hidróxido de sodio 0.5 M (1.9 mL) y ácido pícrico al
1% (1.0 mL). Esta solución fue incubada durante 20 minutos a
temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 520 nm. Una unidad
se definió como la cantidad de enzima que catalizaba la formación de
1 \mumol de creatinina por
minuto.
minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
La rata inicial de consumo de oxígeno fue medido
a 37ºC con un electrodo de oxígeno Clark de Yellow Springs
Instruments (Yellow Springs, OH). La reacción fue iniciada añadiendo
una solución de enzima (1 \muL) o un polímero que contenía la
enzima (10-100 mg cortado en pequeñas piezas) a 5.0
mL de sustrato (creatinina en 1.0 mM en solución reguladora de
fosfato 50 mM, pH 7.5 con al menos 18 U/mL de sarcosina oxidasa y 10
U/mL de creatina amidinohidrolasa). Antes de la medición, la
solución de ensayo se dejó equilibrar a 37ºC con aire. El consumo
de oxígeno fue medido durante 5 a 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La termoinactivación de la creatina
amidinohidrolasa nativa y con PEG fue monitorizada a 37ºC en
solución reguladora (fosfato de sodio 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5). La
concentración de la enzima en todas las muestras fue de 0.01 a 0.02
mg/ml. Las muestras fueron retiradas periódicamente y probadas en
cuanto a su actividad utilizando el ensayo de punto final.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de enzima-polímero
fueron cortadas en pequeñas piezas y añadidas al regulador (fosfato
50 mM, pH 7.5) e incubadas a 37ºC. Las muestras fueron retiradas
con el tiempo y probadas en cuanto a su actividad enzimática
utilizando el electrodo de oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el efecto de iones plata sobre
la creatinina amidohidrolasa, 57 \mug/mL de enzima liofilizada
fueron incubados en Tris-HCl 20 mM (pH 7.5) con
nitrato de plata (0 a mM) a temperatura ambiente. Las muestras
fueron retiradas periódicamente y probadas utilizando el ensayo de
punto final.
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades relativas de las membranas de
poliuretano que contenían las tres enzimas fueron probadas
almacenando membranas (20 mg hidratadas) en 1 mL de solución
reguladora de fosfato 50 mM (pH 5) con (dos sensores planos) y sin
sensores planos en viales de Wheaton de 5 mL. Las membranas fueron
retiradas y probadas utilizando el monitor de oxígeno con
creatinina 1 mM. La rata de consumo de oxígeno fue medida y las
membranas fueron reemplazadas para ser reensayadas el día
siguiente. Las membranas de poliuretano con las tres enzimas fueron
preparadas utilizando 1000 unidades/g de prepolímero de sarcosina
oxidasa y creatina amidinohidrolasa y 2500 unidades/g de
prepolímero de creatinina amidinohidrolasa en solución reguladora de
fosfato de 50 mM (pH 7.8) con ácido
pirrol-2-carboxílico 50 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los biosensores de creatinina fueron preparados
fusionando una membrana de poliuretano que contenía la enzima sobre
un chip del sensor amperométrico para dar un espesor de polímero
húmedo de aproximadamente 25 micrómetros. Los chips del sensor
fueron colocados en un cuerpo de sensor y probados utilizando una
disposición de flujo de detención. El peróxido de hidrógeno
producido a partir de la degradación enzimática de la creatinina fue
medido amperométricamente utilizando un voltamógrafo Bas
CV-37. Las lecturas de línea base fueron medidas
utilizando solución reguladora de fosfato 50 mM (pH 7.5) La
respuesta a la creatinina 1 mM fue determinada inyectando
aproximadamente 1 ml de solución de creatinina a través del cuerpo
sensor. Se midió el incremento en la respuesta amperométrica
después de 2 minutos. Cuando los sensores no estaban siendo
probados, fueron almacenados a 37ºC en solución reguladora de
fosfato 50 mM. Con el fin de prevenir que el cloruro de plata
escapara de los electrodos de referencia, se prepararon algunos
sensores sembrando la superficie del electrodo con una solución de
acetato de celulosa (5% en peso en acetona) y se dejaron secar al
aire antes de la aplicación de la capa de
enzima-membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar el efecto de la
modificación química sobre la actividad y estabilidad de la
creatinina amidohidrolasa, se llevaron a cabo estudios de
PEGilación. Se hicieron modificaciones con PEG utilizando un éster
NHS de PEG (PEG-SPA) a diferentes proporciones de
PEG-SPA con polvo de enzima liofilizada. La enzima
pudo ser modificada fácilmente por el PEG-SPA
(Figura 17) con una pérdida de solamente 30% de actividad mediante
el enlace de un promedio de 5 PEGs por molécula de enzima.
La estabilidad de la enzima en solución
reguladora a 37ºC fue observada después de la modificación (Figura
18). Se observó muy poca diferencia entre la enzima nativa y la
modificada en solución a 37ºC. La vida media de la enzima nativa de
6 días a 37ºC se redujo a 2 días si se incluía EDTA 2 mM en la
solución. Puesto que la creatinina amidohidrolasa es la enzima
probada más inestable, a pH 7.5 y 37ºC, se pueden emplearse
estrategias para estabilizar la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polímeros fueron preparados con
concentraciones de enzimas de 0 150 U/g de polímero y mostraron un
incremento lineal de la actividad específica con el incremento en
la concentración de enzima (Figura 19). Esto asegura que las ratas
medidas bajo estas condiciones no son controladas difusionalmente y
reflejan solamente la rata de reacción enzimática (Yamane,
1977),
Los polímeros inmovilizados fueron probados en
cuando a su posibilidad de reutilización ensayando repetidamente
una muestra de gel individual durante ocho ciclos sin pérdida de
actividad aparente (Figura 20). Como se ve con otras químicas de
poliuretano, la enzima está bien inmovilizada dentro del gel y no se
observa pérdida de enzima (Lejeune and Russell, Biotechnol Bioeng
51:450-457 (1996); Lejeune et al., Biotechnol
Bioeng 54:105-114 (1997); Drevon et al.,
Biotechnol Bioeng 79:785-794 (2002)).
La termoinactivación de la enzima en el polímero
fue determinada incubando muestras de
enzima-polímero en solución reguladora a 37ºC y
retirando las muestras para ensayos periódicamente (Figura 21). La
enzima nativa pierde rápidamente la actividad en la solución
reguladora a 37ºC con una vida media de 6 días. Sin embargo,
después de 90 días a 37ºC en solución reguladora, la enzima
inmovilizada exhibía una retención de la actividad superior al 50%.
Este incremento significativo en la retención de la actividad será
esencial para asegurar una vida media incrementada de los
biosensores de creatinina.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la enzima será aplicada a electrodos
amperométricos que contienen Ag/AgCl, el efecto de los iones plata
sobre la actividad enzimática fue explorado. La inhibición de las
enzimas por los iones plata de los electrodos de referencia ha sido
anotada antes (Schaffar, Anal Bioanal Chem
372:254-260 (2002); Patente de los estados Unidos
No. 4,547,280) y se debería ser adecuadamente establecida puesto que
los iones plata pueden enlazarse muy estrechamente a la enzima
causando pérdida en la actividad. Esto es más preocupante si un
sensor va a ser usado en serie con otros sensores durante un largo
período de tiempo puesto que la enzima tendrá tiempo suficiente
para extraer plata de la solución.
Con el fin de probar la creatinina
amidohidrolasa en cuanto a la inhibición por iones plata, se añadió
nitrato de plata 1 nM a mM a una solución de enzima (<2 \muM)
y se incubó durante varios períodos de tiempo. La enzima fue
retirada entonces de la solución y probada en cuanto a la actividad
de creatinina amidinohidrolasa (Figura 22). Obviamente la plata es
un inhibidor efectivo de la creatinina amidinohidrolasa en altas
concentraciones. La inhibición de la enzima parece ser inmediata
con poco cambio en el impacto desde una incubación de cinco minutos
hasta un tiempo de incubación de una hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de probar la estabilidad del polímero
que contiene las tres enzimas (lo cual podría ser aplicado a
preparaciones en capas), se preparan tres polímeros con enzimas y se
almacenaron en solución reguladora a 37ºC. Los polímeros con
enzimas fueron aplicados a los sensores que contenían hasta 20 veces
más enzimas que las utilizadas en los estudios de estabilidad de
las enzimas. Los polímeros que contenían las enzimas fueron
preparados con 1000 unidades/g de prepolímero de sarcosina oxidasa y
creatinina amidinohidrolasa y 2500 unidades/g de prepolímero de
creatinina amidohidrolasa. Las enzima-polímeros
fueron retiradas periódicamente y probadas en cuanto al consumo de
oxígeno utilizando un monitor de oxígeno cuando los geles fueron
añadidos a 1 mM de creatinina (Figura 23). Los biopolímeros
perdieron solamente el 50% de su actividad después de 11 días en
solución reguladora a 37ºC. Claramente, los polímeros con las tres
enzimas son muy efectivos en la utilización de la creatinina y en
el consumo de oxígeno.
Cuando las muestras de geles con enzima fueron
añadidas a los viales que contenían las capas con los sensores
amperométricos, se presentó una inactivación más rápida (Figura 23).
Esta inactivación probablemente es causada por la presencia de
iones plata en las preparaciones de capas. En efecto, en
experimentos similares con chips de sensores que estaban impresos
con AgCl, la incubación no causó un incremento de la inactivación.
Con base en los datos que muestran la sensibilidad de las tres
enzimas a los iones plata y las pruebas de inmersión que demuestran
la inactivación de los enzima-polímeros por
electrodos de cloruro de plata es importante obviamente prevenir
que haya plata libre en la solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de probar los biosensores con las
tres enzimas que utilizan las membranas de
enzima-poliuretano, se prepararon sensores de
creatinina amperométricos aplicando la
enzima-polímero directamente a los electrodos de
las preparaciones en capas. Los sensores fueron colocados en el
alojamiento de sensores y probados por su estabilidad utilizando un
aparato del flujo y de tensión. Cuando no estaban siendo probados,
los sensores fueron almacenados a 37ºC (en húmedo) Se encontró que
los enzima-polímeros aplicados directamente a las
preparaciones en capa de sensores perdían rápidamente la actividad
(Figura 24), a la vez que, los enzima-polímeros
almacenados en solución retenían la actividad (como se ve en la
Figura 23). Esta pérdida de actividad se presentó independientemente
de si el sensor fue probado o no o si fue almacenado sin prueba
(indicando que la formación de peróxido de hidrógeno no fue la
causa de la desactivación).
Puesto que es evidente que la fuga de plata de
los electrodos puede ser la causa de la inactivación, los electrodos
fueron preparados con una membrana de cubrimiento de acetato de
celulosa sobre los electrodos. Los sensores con las membranas de
acetato de celulosa tenían vidas medias considerablemente mejoradas
(Figura 24). El diseño posterior de mejores membranas o el diseño
de electrodos de referencia libres de plata pueden mejorar
adicionalmente la vida útil de estos sensores.
Mientras que la invención ha sido descrita en
conjunción con realización específicas de la misma, es evidente que
muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes
para los expertos en la técnica a la luz de la descripción
anterior.
Claims (16)
1. Un método para preparar un biosensor de tres
enzimas de uso múltiple para la determinación amperométrica de
creatinina en líquidos biológicos, comprendiendo dicho biosensor una
pluralidad de enzimas inmovilizadas, comprendiendo dicho método la
aplicación a dicho biosensor de una composición
enzima-polímero que comprende dicha pluralidad de
enzimas inmovilizadas, siendo inmovilizadas dichas enzimas por medio
de enlaces covalente, comprendiendo dicho método una etapa inicial
de modificación química de dichas enzimas enlazando una o más
cadenas de polietilen glicol (PEG) por monómero de enzima, donde
dicha pluralidad de enzimas inmovilizadas comprende al menos dos de
creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa y sarcosina
oxidasa.
2. El método de la reivindicación 1, donde
dichas enzimas son inmovilizadas simultáneamente en la composición
enzima-polímero.
3. El método de la reivindicación 1, donde
dichas enzimas son aplicadas a dicho sensor simultáneamente.
4. El método de la reivindicación 1, donde antes
de dicha modificación dicha sarcosina oxidasa se pone en contacto
con un inhibidor en una cantidad efectiva para prevenir la
inactivación durante la modificación.
5. El método de la reivindicación 4, donde dicho
inhibidor es ácido
pirrol-2-carboxílico o ácido
(metiltio) acético.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho polímero es seleccionado
del grupo consistente de poliuretano, cloruro de polivinilo,
poliéster, policarbonato, copolímero de acetato de vinilo, nylon,
poli (1,4-butilentereftalato), propionato de
celulosa, copolímero de etileno/ácido acrílico, polibutadieno,
polietileno, polipropileno, poliimida, película acrílica,
poliestireno y fluoruro de polivinilo.
7. El método de la reivindicación 4, donde dicha
composición enzima-polímero comprende
poliuretano.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el biosensor comprende al menos
un electrodo de trabajo, al menos un electrodo de referencia y al
menos un contraelectrodo.
9. El método de la reivindicación 8, donde la
composición enzima-polímero se aplica a dicho
electrodo de trabajo, dicho electrodo de referencia y dicho
contraelectrodo.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, donde
dicho electrodo de referencia es un electrodo Ag/AgCl.
11. El método de la reivindicación 10, donde
dicho electrodo de referencia está recubierto con un material que
limita la difusión de iones plata que emanan de dicho electrodo de
referencia, previniendo por tanto el contacto entre los iones plata
y las enzimas.
12. Un método para la preparación de una
composición enzima-polímero que comprende
- (a)
- modificar químicamente una pluralidad de enzimas que comprende al menos una de (1) creatinina amidohidrolasa (2) creatina amidinohidrolasa y (3) sarcosina oxidasa enlazando una o más cadenas de poli (etilen glicol) (PEG) por monómero de enzima, donde antes de dicha modificación dicha sarcosina oxidasa se pone en contacto con un inhibidor en una cantidad efectiva para prevenir la inactivación durante la modificación, y
- (b)
- poner en contacto una solución que contiene dicha pluralidad de enzimas modificadas con una solución de polímero bajo condiciones que permiten la polimerización, donde dichas enzimas se hacen inmovilizadas covalentemente, formando por lo tanto una composición enzima-polímero.
13. El método de la reivindicación 12, donde
dicho inhibidor es un ácido
pirrol-2-carboxílico o ácido
(metiltio) acético.
14. El método de la reivindicación 12 o 13,
donde dicho polímero es seleccionado de un grupo consistente de
poliuretano, cloruro de polivinilo, poliéster policarbonato,
copolímero de acetato de vinilo, nylon, poli
(1,4-butilentereftalato), propionato de celulosa,
copolímero de etileno/ácido acrílico, polibutadieno, polietileno,
polipropileno, poliimida, película acrílica, polistireno y fluoruro
de polivinilo.
15. El método de la reivindicación 14, donde
dicha composición enzima-polímero comprende
poliuretano.
16. Un biosensor para tres enzimas de uso
múltiple para la determinación amperométrica de creatinina en
líquidos biológicos que comprende una composición
enzima-polímero que comprende las enzimas creatinina
amidohidrolasa, creatina aminohidrolasa y sarcosina oxidasa, donde
al menos una de las dichas enzimas está enlazada a una o más
cadenas de polietilen glicol (PEG) e inmovilizada en la composición
por dicha una o más cadenas de PEG.
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