ES2336605T3

ES2336605T3 - Metodo para identificar la proteina diana de un agente y metodo para explorar un agente terapeutico para diabetes usando la proteina diana.

Info

Publication number: ES2336605T3
Application number: ES06782561T
Authority: ES
Inventors: Hideki Endoh; Hiroyuki Yokota; Masahiko Hayakawa; Shinji Soga
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2026-08-09
Also published as: EP1860438A1; EP1860438B1; CA2601869A1; EP1860438A4; EP2124062A1; WO2007020853A1; JPWO2007020853A1; JP4992716B2; DE602006010522D1; US20090041754A1; US8003331B2

Abstract

Un método para explorar un agente para tratar diabetes, que comprende [1] una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida, debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y [2] una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.

Description

Método para identificar la proteína diana de un agente y método para explorar un agente terapéutico para diabetes usando la proteína diana.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para explorar un agente terapéutico para diabetes usando una proteína diana encontrada por el método de identificación de la presente invención.

Antecedentes de la invención

Un gran número de compuestos de bajo peso molecular usados como agentes farmacéuticos todavía permanecen poco claros con respecto a sus mecanismos de acción, a pesar de sus distintas acciones farmacológicas. En general, la mayoría de los agentes farmacéuticos actúan sobre proteínas específicas in vivo y alteran las funciones de las proteínas e inducen acciones farmacológicas como resultado. En los agentes cuyos mecanismos de acción están poco claros, las proteínas como sus dianas no se han identificado. En años recientes, como resultado del avance en la aclaración del sistema de transducción de señal in vivo a nivel molecular, se ha identificado un gran número de moléculas de proteínas específicas necesarias para inducir acciones farmacológicas específicas. Como resultado, el desarrollo de los agentes denominados agentes de dirección de molécula que se dirigen a tales moléculas de proteína específicas últimamente está avanzando, y su proporción está aumentando rápidamente. En el caso de un compuesto cuya proteína diana es evidente, su mecanismo funcional in vivo está claro y la estructura del compuesto se puede modificar con el uso de su potencia para unirse a dicha proteína o un cambio en la actividad enzimática poseída por la proteína como el índice. Por tanto, es fácil realizar estudios con el objetivo de mejorar la farmacocinética, que incluye absorción y degradación, así como actividad farmacológica, de tal forma que es notablemente ventajosa en agentes en desarrollo. En el caso de un compuesto cuya proteína diana no está clara, por el contrario, no es sencillo intentar la mejora de su estructura química con el propósito de mejorar la actividad, incluso cuando se encuentra una acción farmacológica distinta (compárese con Referencia No de patente 1). Además, aunque existen diferencias en grado, los agentes farmacéuticos generalmente tienen tanto acciones farmacológicas deseables (efectos principales) como acciones farmacológicas indeseables (efectos secundarios adversos). Incluso en el caso de agentes de dirección de molécula cuyas proteínas diana llevan los principales efectos y ya están en el mercado, existen muchos casos en los que la información con respecto a las proteínas diana concerniente a los efectos secundarios adversos es escasa, y esto provoca el problema de necesitar tiempo y costes para estudiar la mejora para evitar los efectos secundarios adversos (compárese con Referencia No de Patente 1). De hecho, existe un gran número de agentes farmacéuticos cuyas acciones farmacológicas significativas se conocen, pero sus proteínas diana son poco claras. Como ejemplos representativos, se pueden citar la biguanida, que se ha usado durante mucho tiempo como un agente para tratar la diabetes (compárese con Referencia No de Patente 2) y la talidomida, en la que su presencia se ha reconsiderado en vista de su efecto terapéutico espectacular sobre mieloma múltiple (compárese con Referencia No de Patente 3). Aunque la biguanida tiene una acción hipoglucemiante significativa y la talidomida una acción inhibidora de la angiogénesis significativa, la proteína diana directa para cada uno de estos agentes in vivo no se ha identificado. Por tanto, a pesar de las acciones farmacológicas útiles que poseen estos agentes, fue difícil realizar estudios de mejora para potenciar los efectos. Además de esto, se conocen efectos secundarios adversos graves, tales como acidosis láctica, por biguanida (compárese con Referencia No de Patente 4) y teratogenia por talidomida (compárese con Referencia No de Patente 3), pero los estudios para evitar estos problemas no han avanzado, debido a que sus dianas son poco claras. Por tanto, se demanda la identificación de las proteínas diana de estos agentes.

De forma convencional, era general un método en el que se detecta una proteína que se une directamente a un compuesto de bajo peso molecular y se separa por medios físicos y/o químicos como un medio para identificar una proteína diana sobre la que actúa dicho compuesto. Por ejemplo, se conoce un método en el que se modifica una parte de la estructura de un compuesto y se une a perlas de afinidad de alto peso molecular y una proteína diana unida al compuesto se separa y se purifica por gravedad o fuerza física similar. Además, se realiza un método en el que una etiqueta a usar como un marcador se une a una parte de la estructura de un compuesto y la proteína diana unida a dicho compuesto se detecta químicamente (compárese con Referencia No de Patente 5). En años recientes, también se han realizado intentos para explorar e identificar, a partir de una genoteca de ADNc, un fragmento génico que codifica una proteína que se une al compuesto de interés, mediante un método de dos híbridos en levadura (compárese con Referencia No de Patente 6), un método de presentación en fagos (compárese con Referencia No de Patente 7) y técnicas de biología molecular similares. Sin embargo, a pesar de los intentos que se han mencionado anteriormente por diversos métodos, no es frecuente un caso en el que una proteína diana de un agente se identificó realmente a partir de los estudios realizados en este campo hasta ahora. Los motivos de la baja frecuencia de éxito incluyen que es necesario modificar una parte de la estructura de un compuesto debido a que perlas o una etiqueta se unen al compuesto a usar como la sonda en cada caso de los métodos que se han mencionado anteriormente, de tal forma que es inevitable explorar con respecto a una proteína que se une a una estructura artificial diferente del compuesto original (compárese con Referencias No de Patente 1 y 5). Es decir, esto se convierte en un motivo de identificar erróneamente, como la proteína diana, una proteína no específica que se une a una etiqueta, perla, un complejo de los mismos con un compuesto o sustancia artificial similar que es diferente del agente que tiene la actividad farmacológica original. Además, aunque es esencial para el propósito de encontrar la verdadera proteína diana aplicar la modificación de la estructura de un compuesto a una región que no ejerza influencia sobre la acción farmacológica de dicho compuesto, los agentes y compuestos que tienen dianas poco claras son generalmente pobres en información con respecto a la correlación entre sus estructuras y actividades farmacológicas, de tal forma que existen muchos casos en los que se tienen que usar compuestos modificados en regiones opcionales. Debido a esto, existe una alta frecuencia de seleccionar un compuesto que ha perdido su actividad farmacológica original como la sonda. Esencialmente, es deseable verificar en primer lugar que dicho compuesto al que se ha añadido una etiqueta o perla por modificación todavía mantiene su actividad farmacológica original y después usar el mismo como la sonda, pero ya que la permeabilidad de membrana celular, estabilidad y diversos parámetros similares ejercen influencias, no es sencillo determinar la presencia o ausencia de la actividad farmacológica. Además, ya que la modificación de la estructura de los compuestos requiere tiempo, costes y técnicas especiales, esto es la causa de que los métodos que se han mencionado anteriormente difícilmente se conviertan en un medio de estudio de propósito general. Por otro lado, es posible verificar la unión de una proteína especificada a un compuesto marcado sustituyendo un elemento en la molécula de un compuesto con un radioisótopo (su estructura es igual que antes del marcado), pero ya que no es una modificación que se pueda fijar, no es sencillo explorar la proteína diana a partir de un gran número de proteínas. Además, este método tiene la desventaja de que el compuesto se convierte en inestable por el marcado y los costes aumentan. Como otro motivo de la baja proporción de éxito de exploración de diana de compuesto por los métodos convencionales se puede ejemplificar un punto que ya que cada uno de los métodos que se han mencionado anteriormente realiza la detección y separación de una diana usando la unión directa de un compuesto con una proteína como el índice, es difícil conseguir el hallazgo de diana cuando la afinidad de unión entre el compuesto y la proteína diana es baja. De hecho, en cada uno de los pocos casos de éxito al encontrar una diana por los métodos que se han mencionado anteriormente, la afinidad de unión entre el compuesto y la proteína es alta (compárese con Referencia No de Patente 4). Sin embargo, el grado de actividad farmacológica de un compuesto y su afinidad de unión por una proteína diana no tienen siempre una correlación basándose en el conocimiento obtenido hasta ahora. Más bien, se considera que la fuerte unión de un compuesto a la proteína diana puede no ser necesaria para la inducción de acción farmacológica excluyendo la inhibición irreversible (compárese con Referencia No de Patente 8). Basándose en los anteriores problemas, se ha dirigido el interés a un método para identificar proteínas diana de agentes, que no se podían encontrar por los métodos convencionales.

La chaperona molecular es un grupo de proteínas que ayuda a la formación de estructura de proteína, tal como plegamiento o desnaturalización (desplegamiento) de una molécula de proteína, formación de multímeros y similares (compárese con Referencia No de Patente 9). Ahora se sabe que un gran número de moléculas denominadas generalmente proteína de choque térmico, en las que su expresión está acelerada por estimulación térmica, actúan como chaperona. Entre las chaperonas moleculares, un grupo de moléculas denominadas generalmente familia Hsp60 se denomina particularmente "chaperonina" como una chaperona molecular típica. Estas chaperonas moleculares representadas por la proteína de choque térmico interaccionan con proteínas inestables antes de la finalización de sus estructuras terciarias en su proceso de traducción y las mantienen estables y también tienen la acción de mantener y controlar la estructura de proteína de tal forma que las influencias en la función de proteína intracelular no se provocan acompañadas por un cambio ambiental y de acelerar la ubiquitinación y degradación posterior de sustrato que se convierte en un estado anormal (compárese con Referencia No de Patente 10). Por tanto, la chaperona tiene una propiedad como una molécula funcional que reconoce la estructura no natural de una molécula de proteína como el sustrato. Por otro lado, se ha descrito un método de exploración para identificar el ligando de proteína diana ya conocida, que usa chaperona molecular para la determinación del grado de estado plegado y estado no plegado de la proteína diana en presencia o ausencia de un candidato de ligando (compárese Referencias No de Patente 1 a 6).

La insulina se secreta de la célula P de los islotes pancreáticos de Langerhans y reduce el nivel de azúcar en sangre actuando principalmente sobre músculos, el hígado y grasa para almacenar y consumir azúcar sanguíneo por su captación en las células. La diabetes se induce por la acción insuficiente de esta insulina y existen dos tipos en estos pacientes, a saber, de tipo I, que tienen un trastorno en la producción o secreción de insulina, y de tipo II, en los que es difícil que tenga lugar la aceleración del metabolismo de glucosa por insulina. Aunque el nivel de azúcar en sangre se hace mayor que el de personas sanas en estos dos pacientes, la insulina en sangre pasa a ser absolutamente escasa en el tipo I, mientras que en el tipo II se genera resistencia a insulina en la que la captación o el consumo de azúcar sanguíneo por las células no está acelerado a pesar de la presencia de insulina. La diabetes de tipo II es una denominada enfermedad relacionada con el estilo de vida que se induce por sobrealimentación, poco ejercicio, estrés y causas similares además de un factor hereditario básico. Actualmente, este paciente de tipo II está aumentando rápidamente en naciones avanzadas acompañado por el aumento de la ingesta calórica y ocupa el 95% de los pacientes con diabetes en Japón. Por tanto, está aumentando la necesidad no solamente de un agente hipoglucemiante simple, sino también de tratamiento de diabetes de tipo II para acelerar el metabolismo de glucosa mediante la mejora de la resistencia a insulina como agentes para tratar diabetes. Actualmente se prescriben inyecciones de insulina para el tratamiento de pacientes con diabetes de tipo I. Por otro lado, como el agente hipoglucemiante prescrito para pacientes con diabetes de tipo II, se conocen un agente hipoglucemiante de sistema de sulfonilurea (agente SU) que acelera la secreción de insulina actuando sobre células \beta del páncreas y un inhibidor de \alpha-glucosidasa que retrasa la absorción de glucosa por digestión, además de las inyecciones de insulina. A pesar de que estos mejoran indirectamente la resistencia a insulina, en años recientes se ha usado un derivado de tiazolidina como un agente que mejora más directamente la resistencia a insulina. Su acción es acelerar la captación de glucosa en las células y el uso de glucosa en las células. Se ha demostrado que este derivado de tiazolidina actúa como un agonista del receptor activado por proliferador de peroxisoma gamma (PPAR\gamma) (compárese con Referencia No de Patente 11). Sin embargo, se conoce que el derivado de tiazolidina no solamente mejora la resistencia a insulina, sino que también tiene efectos secundarios adversos de inducir la acumulación de grasa y edema (compárese con Referencia No de Patente 12). Ya que esta inducción de edema es un efecto secundario adverso grave que da como resultado hipertrofia cardiaca, se demanda una molécula diana de fármaco nueva más útil en lugar de PPAR\gamma para la mejora de la resistencia a insulina. Como un agente líder que produce una acción de mejora del metabolismo de glucosa diferente de éste, se conoce un agente hipoglucemiante biguanida que se ha usado durante mucho tiempo (compárese con Referencia No de Patente 13). Se ha descrito que este agente biguanida tiene acciones mejorando el metabolismo de la glucosa por acción glucolítica anaerobia, supresión de gluconeogénesis, supresión de apetito y supresión de absorción intestinal de glucosa y, como resultado, la biguanida mejora la sensibilidad a insulina en el hígado y músculos. Ya que la biguanida no actúa sobre el páncreas y no aumenta la secreción de insulina, tiene la característica de que no provoca obesidad y provoca difícilmente hipoglucemia. La acción de la biguanida no incluye acciones indeseables que poseen los derivados de tiazolidina que se han mencionado anteriormente y las preparaciones de insulina y existen muchos casos en los que en realidad se prescribe en combinación con los otros agentes hipoglucemiantes que se han mencionado anteriormente. En combinación con la reconsideración de años recientes su fuerte acción farmacológica, el agente biguanida ahora mantiene su posición cerca del derivado de tiazolidina como agente de mejora de resistencia a insulina. Pero, por otro lado, se conoce que el agente biguanida tiene el efecto secundario adverso de provocar acidosis láctica aumentando la acumulación de ácido láctico (compárese con Referencia No de Patente 14). A pesar de la historia muy antigua de la biguanida como un agente, una proteína diana distinta, como el caso de PPAR\gamma del derivado de tiazolidina, todavía no se ha identificado. Ya que no se ha obtenido información con respecto a la correlación de la actividad estructural en relación a agentes biguanida y la proteína diana, ha sido difícil realizar hasta la actualidad no solamente un estudio disociado sobre el efecto secundario adverso tal como mejora de acidosis láctica, sino también un estudio de mejora que pretende mejorar la hipoglucemia como el principal efecto. La proteína ATP5B es la subunidad \beta de la F1F0-ATP sintasa, que está codificada en el genoma y realiza su acción después de que se haya transferido a la mitocondria (compárese con Referencias No de Patente 15 y 16). Además, con respecto a las cantidades existentes de ATP5B, se ha descrito que las cantidades de su expresión génica y la cantidad de proteína disminuyen en los músculos de pacientes con diabetes de tipo II en comparación con los de personas sanas (compárese con Referencias No de Patente 17 y 18 y Referencia de Patente 7). Además, se ha descrito que el nivel de fosforilación de ATP5B en músculos de pacientes con diabetes y el nivel de azúcar en sangre en ayunas tienen una correlación inversa (compárese con Referencia No de Patente 18 y Referencia de Patente 7) y los que (por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico) que controlan la expresión de ATP5B, un polipéptido, un anticuerpo, un polinucleótido o un compuesto que se une a un polipéptido y similares pueden ser agentes para tratar enfermedades asociadas con diabetes (compárese Referencia de Patente 7). Existe un informe que describe diversos polipéptidos (3025 sustancias) incluidos en el proteoma mitocondrial del corazón humano que incluyen ATP5B y describe que estos están relacionados con la exploración para un agente para tratar enfermedades (incluyendo diabetes) asociadas con funciones mitocondriales (compárese con Referencia de Patente 8). Sin embargo, no existen informes que indiquen que la proteína ATP5B se una a
biguanida.

Referencia de Patente 1:: Patente de Estados Unidos Nº 5585277

Referencia de Patente 2:: Patente de Estados Unidos Nº 5679582

Referencia de Patente 3:: Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2002/055123

Referencia de Patente 4:: Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/191835

Referencia de Patente 5:: Patente Japonesa Nº 2952848

Referencia de Patente 6:: Patente Europea Nº 0770876

Referencia de Patente 7:: Publicación Internacional Nº 03/020963

Referencia de Patente 8:: Publicación Internacional Nº 03/087768

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Referencia no de Patente 1:: "The Journal of Antibiotics" H. Hatori et al., 2004 vol. 57 Nº 7 págs. 456-461

Referencia no de Patente 2:: "Nippon Rinsho (Japan Clinics)" Y. Yamacaki et al., 2002 vol. 60 Nº 9 págs. 389–92.

Referencia no de Patente 3:: "Drug Discovery Today" Teo SK et al., 2005 vol. 15 Nº 10(2) págs. 107-114

Referencia no de Patente 4:: "Drugs" Lalau JD et al., 1999 vol. 58 Nº 1 págs. 55-60/75-82

Referencia no de Patente 5:: "Nature Biotechnology" (England) 2000, N. Shimizu et al., vol. 18, págs. 877-881

Referencia no de Patente 6:: "Biochemical Pharmacology" 2002, D. Henthorn et al., vol. 63 Nº 9 págs. 1619-1628

Referencia no de Patente 7:: "Chemistry & Biology" Sche PP et al., vol. 6 Nº 10: p. 707 -716. PMID: 10508685

Referencia no de Patente 8:: "Biochemistry (OUTLINES OF BIOCHEMISTRY)" 1987, Eric E. CONN et al.

Referencia no de Patente 9:: "Pharmacology & Therapeutics" 2004, A. Sreedhar et al., vol. 101 Nº 3 págs. 227-257

Referencia no de Patente 10:: "Nature" 1992, Gething MJ, Sambrook J. et al., vol. 355 Nº 6355: págs. 33-45

Referencia no de Patente 11:: "The Journal of Biological Chemistry", (USA), 1995, vol. 270, págs. 12953 -12956

Referencia no de Patente 12:: "Diabetes Frontier", (USA), 1999, vol. 10, págs. 811-818

Referencia no de Patente 13:: "Nippon Rinsho (Japan Clinics)" Y. Yamasaki et al., 2002 vol. 60 Nº 9 págs. 389-92

Referencia no de Patente 14:: "Drugs" Lalau JD et al., 1999 vol. 58 Nº 1 págs. 55 - 60/75 - 82

Referencia no de Patente 15:: "Nature" (USA), 1997, vol. 386, págs. 299 - 302

Referencia no de Patente 16:: "Nature" (USA), 1994, vol. 370 (6491), págs. 621- 628

Referencia no de Patente 17:: "Diabetes" 2002, vol. 51, págs. 1913 -1920

Referencia no de Patente 18:: "The Journal of Biological Chemistry" 2003, vol. 278, págs. 10436 -10442

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Descripción de la invención Problemas a resolver por la invención

La presente invención pretende proporcionar un método para explorar un agente novedoso para tratar diabetes.

Medios para resolver los problemas

Cuando un compuesto actúa y, de este modo, ejerce influencia sobre la función de una proteína diana, se espera que la estructura terciaria de dicha proteína se someta a un cambio por su interacción con el compuesto. Por tanto, se considera que el factor necesario para la acción farmacológica producida por el compuesto no sea una simple unión entre el compuesto y la diana, sino un cambio en la estructura terciaria de la proteína diana por la acción del compuesto. Por consiguiente, los presentes inventores han considerado que cuando es posible explorar una proteína usando dicho cambio como el índice, se puede explorar una proteína diana verdadera que lleva la acción farmacológica de un compuesto con una probabilidad superior a medios convencionales de exploración de diana de compuesto. Además, desarrollando un método para seleccionar y detectar el cambio que se ha mencionado anteriormente no desde el lado del compuesto, sino desde el lado de una proteína diana en respuesta al compuesto, se realizó la identificación de la proteína diana de dicho compuesto sin necesitar modificación de la estructura del compuesto que era inevitable por los métodos convencionales. Es decir, los inventores han observado que una proteína de chaperona molecular conocida como una molécula funcional que reconoce la estructura no natural de una proteína como el sustrato reconoce un cambio de la estructura terciaria de la proteína por un compuesto (un agente cuya proteína diana es desconocida) y, por lo tanto, han construido un método para detectar e identificar una proteína diana de un compuesto (un agente cuya proteína diana es desconocida) usando, como el índice, un cambio en la unión de una proteína intracelular con una proteína de chaperona molecular. Ilustrativamente, los inventores han tenido éxito al detectar un receptor de estrógenos como la proteína diana del compuesto de bajo peso molecular 17\beta-estradiol (Ejemplo 2) y también han tenido éxito al detectar FKBP12 como la proteína diana de FK506 y FK1706, detectando el receptor de glucocorticoides como la proteína diana de dexametasona, detectando el receptor de andrógenos como la proteína diana de dihidrotestosterona, detectando el receptor de mineralocorticoides como la proteína diana de androsterona y detectando la hidrofolato reductasa como la proteína diana de metotrexato (Ejemplo 3). Además, también ha habido éxito al detectar e identificar la proteína diana de un agente para tratar diabetes, biguanida, cuya proteína diana era poco clara en el pasado y se ha encontrado que ésta es ATP5B (Ejemplo 4).

Además, se ha puesto de manifiesto que cuando la proteína ATP5B que se ha mencionado anteriormente como la subunidad \beta de F1F0-ATP sintasa que existe en la membrana mitocondrial, cuya función de unirse a un agente para tratar diabetes biguanida se ha observado por los inventores, se expresa de forma excesiva en una célula, se obstruye la activación de AMP cinasa intracelular (a denominar AMPK en lo sucesivo en este documento) por biguanida (Ejemplo 5). Basándose en estos hallazgos, los inventores han puesto de manifiesto que la proteína ATP5B es la proteína diana en lo que se refiere a la acción farmacológica (efecto principal) de biguanida y, de este modo, construyeron un nuevo método de exploración de un agente para tratar diabetes, que usa dicha proteína. Al hallar que una sustancia obtenida por el método de exploración de la presente invención ciertamente tiene el efecto para tratar diabetes y no tiene efectos secundarios adversos, se proporcionaron una nueva herramienta de exploración y un método de exploración de un agente para tratar diabetes y una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes.

Es decir, la presente invención se refiere a:

<1> un método para explorar un agente para tratar diabetes, que comprende

[1]: una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y

[2]: una etapa de analizar la unión de dicho polipéptido con la sustancia a ensayar.

<2> el método de exploración descrito en <1>, que comprende además una etapa de confirmar que la sustancia activa la actividad de AMPK y/o tiene una actividad terapéutica para diabetes.

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En la fecha de prioridad de esta solicitud, se conocían las propiedades de chaperona molecular como una molécula funcional que reconoce una estructura no natural de una molécula de proteína que se convierte en el sustrato (Referencia No de Patente 9 y Referencia No de Patente 10) y un método para identificar un ligando de una proteína ya conocida usando chaperona molecular (Referencias de Patente 1 a 6), pero no se conocía ningún método para identificar una proteína diana de un compuesto de bajo peso molecular usando chaperona molecular. En la fecha de prioridad, se conocía la reducción de la cantidad existente de ATP5B en músculos de pacientes con diabetes de tipo II (compárese con Referencias No de Patente 17 y 18 y Referencia de Patente 7) y la correlación inversa entre el nivel de fosforilación de ATP5B en músculos de pacientes con diabetes y nivel de glucosa en sangre en ayunas (compárese con Referencia No de Patente 18 y Referencia de Patente 7), pero la Referencia de Patente 7 describe que la propia ATP5B y los anticuerpos se convierten en agentes para tratar enfermedades asociadas con diabetes, pero no estaba claro el modo de regular la expresión de ATP para generar el efecto terapéutico de diabetes. Existe un informe que describe diversos polipéptidos (3025 sustancias) incluidos en el proteoma mitocondrial del corazón humano que incluyen ATP5B y describe que estos están relacionados con la exploración de un agente terapéutico para enfermedades que incluyen diabetes relacionadas con un gran número de funciones mitocondriales (compárese con Referencia de Patente 8), pero no existe base de que ATP5B esté relacionada con la exploración de un agente para tratar diabetes. Además, en una referencia abierta al público después de la fecha de prioridad de esta solicitud (Publicación Internacional Nº 2005/090992), se describen polipéptidos que incluyen ATP5B como dos o más modificadores de la ruta PTEN y se describe un sistema para detectar la unión de estos modificadores con un compuesto candidato, pero no se describe o sugiere una relación entre un agente que se une específicamente al modificador y la diabetes. Ya que no existen informes en estas referencias que indiquen que la proteína ATP5B y biguanida se unen entre sí, la unión de una proteína ATP5B y biguanida es el conocimiento encontrado por primera vez por los presentes inventores y el método de exploración de agente para tratar diabetes que usa ATP5B y tiene el efecto principal similar al de biguanida (particularmente un método de exploración de agente para tratar diabetes que usa ATP5B y se realiza en coexistencia de biguanida) es una invención realizada por primera vez por los presentes inventores.

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Ventajas de la invención

Mediante el método de exploración de la presente invención que usa la herramienta de exploración de la presente invención (por ejemplo, ATP5B, que es la proteína diana de biguanida), se puede obtener un compuesto que se convierte en un agente para tratar diabetes y tiene un nuevo compuesto madre estructuralmente no análogo, además de un compuesto estructuralmente análogo o biguanida. Este compuesto de estructura no análoga puede convertirse en un nuevo agente para tratar diabetes que no provoca obesidad como una característica de biguanida y también tiene un efecto de provocar difícilmente hipoglucemia. Además de esto, mediante el uso de la unión con la proteína ATP5B como el índice, se hace posible modificar la estructura molecular del compuesto obtenido mientras que se mantiene su efecto principal, de tal forma que se hace posible desarrollar un agente para tratar diabetes que tiene un efecto principal más elevado y un efecto secundario adverso más reducido en comparación con los agentes biguanida convencionales.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración que muestra una banda de ER\alpha en la que su cambio se detectó de un modo dependiente de E2 por un método de arrastre (pull down) que usó una proteína de chaperona molecular como la sonda. Los carriles 1 y 2 muestran los resultados usando GST y los carriles 3 a 6, los resultados del uso de GST-HSPA4.

La Figura 2 es una ilustración que muestra la unión de ATP5B humana con fenformina. El "+" en el dibujo muestra un caso de añadir MTX- fenformina y "-", un caso de no añadir MTX-fenformina. El "Inp." representa la entrada.

La Figura 3 es una ilustración que muestra la desaparición de la capacidad de unión a fenformina por la mutación de ATP5B humana. El "WT" muestra un caso del uso de ATP5B de tipo silvestre y el "E175V" del uso de ATP5B tipo de mutación Glu175Val y "D295V" del uso de ATP5B de tipo mutación Asp295Val. El "+" en el dibujo muestra el caso de añadir MTX-fenformina y "-", un caso de no añadir MTX-fenformina. El "Inp." representa la entrada.

La Figura 4 es una ilustración que muestra la desaparición de la capacidad de activación de AMPK de fenformina (PF), por la sobre-expresión de ATP5B humana. El panel superior muestra un resultado del uso de un anticuerpo anti-fosfo AMPK y el panel inferior, un resultado del uso de un anticuerpo anti-AMPKa. El "+" en el dibujo muestra un caso de añadir fenformina (PF) y "-", un caso de no añadir fenformina (PF).

La Figura 5 es un gráfico que muestra la unión de ATP5B humana con MTX-fenformina (MTX-PF), que depende de la concentración de fenformina (PF). El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad de ATP5B).

La Figura 6 es un gráfico en el que, en un ensayo que muestra la unión de ATP5B humana con fenformina, se permite que una sustancia a ensayar (fenformina libre; PF) esté en contacto entre sí y se detectó si ejerce o no influencia sobre la unión. El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad de ATP5B).

La Figura 7 es un gráfico en el que, en un ensayo que muestra la unión de ATP5B humana con fenformina, se permite que se ponga en contacto una sustancia a ensayar (compuesto A o compuesto B) y se detectó si ejerce o no influencia sobre la unión. El eje de ordenada muestra los recuentos (cantidad de ATP5B).

La Figura 8 es un gráfico que muestra que el compuesto A y el compuesto B muestran acción hipoglucemiante sin provocar acumulación in vivo de ácido láctico. Muestra los cambios periódicos en el valor de azúcar en sangre (A) y del valor de ácido láctico (B), 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de la administración intraperitoneal de compuesto A (cuadrado vacío), metformina (círculo relleno) o disolvente (rombo relleno) a ratones db/db. Del mismo modo se muestran cambios periódicos en el valor de azúcar en sangre (C) y valor de ácido láctico (D) 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de la administración intraperitoneal de compuesto B (cuadrado relleno), metformina (círculo vacío) o disolvente (rombo relleno) a ratones db/db. En cada uno de A y C, el valor de cada tiempo de medición en el grupo de administración de disolvente se considera que es 100 basándose en el valor medido en el minuto 0 y se expresan valores relativos basados en el mismo, donde el eje de ordenada muestra la velocidad del cambio en el valor de azúcar en sangre (%). En cada uno de B y D, el valor medido en el minuto 0 se considera que es 100 y se expresan valores relativos basados en el mismo, donde el eje de ordenada muestra la velocidad del cambio en el valor de ácido láctico (%). El símbolo * indica que el valor p por el ensayo de significación es 0,05 o menor y **, 0,01 o menor del mismo modo.

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Mejor modo para realizar la invención

A continuación se describe con detalle la presente invención. Las técnicas de manipulación génica de esta descripción se pueden realizar de acuerdo con las técnicas conocidas de forma convencional de "Molecular Cloning" Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989'' y similares a menos que se indique de otro modo y las técnicas de manipulación de proteínas se pueden realizar de acuerdo con las técnicas conocidas de forma convencional de "Tanpaku Jikken Protocol (Protein experiment Protocol)" (Shujun-sha, 1997) y similares a menos que se indique de otro modo.

En este documento se describe un método para identificar una proteína (proteína diana) cuya estructura terciaria se cambió en respuesta a un compuesto con el uso de una proteína de chaperona molecular que es una proteína que tiene una función de reconocer un cambio en la estructura terciaria de una proteína in vivo, examinando de forma inclusiva la diferencia en el cambio de la unión de chaperona molecular con una proteína endógena (proteína diana) en el momento de añadir o no añadir un compuesto específico (un agente cuya proteína diana no está clara), seleccionando de este modo una proteína cuya cantidad de unión aumenta solamente cuando se añade un agente a ensayar o cuya cantidad de unión se reduce solamente cuando se añade el agente a ensayar.

El método de identificación es un método para identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que comprende

: [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra estén en contacto entre sí y

: (2) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular,

: [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular esté en contacto con una proteína de célula de muestra y

: (4) una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular y

: [3] una etapa de comparar la proteína detectada por (2) con la proteína detectada por (4).

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La proteína de célula de muestra de acuerdo con esta descripción quiere decir un grupo de proteínas contenidas (expresadas) en una célula que se considera que contiene la proteína diana a explorar (a denominar en lo sucesivo en este documento "célula de muestra"). De acuerdo con el método de identificación, no se limita por el orden de puesta en contacto, condición de la proteína de chaperona molecular (si está aislada, expresada en una célula o contenida en un extracto celular) y condición de la proteína de célula de muestra (si se expresa en una célula intacta o está contenida en un extracto celular), a condición de que el agente a ensayar, la proteína de chaperona molecular y la proteína de célula de muestra se pongan en contacto entre sí. Es decir, el método de identificación incluye un método que usa una proteína de chaperona molecular aislada y purificada y una proteína de célula de muestra contenida en un extracto de célula de muestra (el primer método de identificación), un método que usa una proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra transformada con un vector que comprende una región de longitud parcial o completa de un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra expresada en la célula de muestra transformada (célula intacta) (el segundo método de identificación) y un método que usa una proteína de chaperona molecular en una condición de estar contenida en el extracto que se ha mencionado anteriormente de célula transformada y una proteína de célula de muestra en una condición de estar contenida en el mismo extracto (el tercer método de identificación). En el primer método de identificación se aísla la molécula de chaperona molecular. Por ejemplo, se produce en una gran cantidad expresando una región de longitud parcial o completa de la molécula de chaperona molecular o una región de longitud parcial o completa de la molécula de chaperona molecular fusionada con GST, Flag, His o etiqueta similar en Escherichia coli o bacteria similar, levadura, célula de insecto o similares o mediante un método de síntesis química y después se puede purificar usando un anticuerpo de la proteína de chaperona molecular, anticuerpos de diversas etiquetas fusionadas con la proteína de chaperona molecular o perlas de afinidad o columna de afinidad que tienen alta afinidad por la etiqueta. Alternativamente, también es posible producir y purificar la proteína de chaperona molecular realizando la transcripción y traducción de un fragmento de ADN del gen de chaperona molecular in vitro. En el primer método de identificación, la proteína de chaperona molecular purificada se mezcla y se pone en contacto con un líquido mixto de proteína extraída de una célula de muestra (a saber, un líquido que contiene una proteína de célula de muestra) in vitro en una condición de añadir o no añadir un agente a ensayar y después tanto la proteína de chaperona molecular como las proteínas que se unen a la misma se concentran de acuerdo con el método que se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, una proteína obtenida de una célula de muestra que se une a la proteína de chaperona molecular solamente cuando un agente a ensayar no se añade o una proteína obtenida de una célula de muestra que se une a la proteína de chaperona molecular solamente cuando se añade un agente de ensayar se puede detectar por los métodos que se han descrito en el Ejemplo 2(2) (3), 3, 4 u 8.

El segundo método de identificación es un método para identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que comprende

: [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra expresada en la célula transformada que se ha mencionado anteriormente se pongan en contacto entre sí y

: [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular expresada en una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica proteína de chaperona molecular se ponga en contacto con una proteína de célula de muestra expresada en la célula transformada que se ha mencionado anteriormente y

El tercer método de identificación es un método para identificar una proteína diana de un agente a ensayar, que comprende

: [1] (1) una etapa de permitir que un agente a ensayar, una proteína de chaperona molecular en una condición de estar contenida en un extracto celular de una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra en una condición de estar contenida en el extracto que se ha mencionado anteriormente estén en contacto entre sí y

: [2] (3) una etapa de permitir que una proteína de chaperona molecular en una condición de estar contenida en un extracto celular de una célula de muestra transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular se ponga en contacto con una proteína de célula de muestra en una condición de estar contenida en el extracto que se ha mencionado anteriormente y

: [4] una etapa de detectar una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular y

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El segundo método de identificación y el tercer método de identificación incluyen una etapa de transformar una célula que se considerada que contiene la proteína diana a explorar con un vector que comprende una región de longitud parcial o completa de un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular y que expresa una región de longitud parcial o completa de un polipéptido como la proteína de chaperona molecular o una región de longitud parcial o completa de dicho polipéptido a la que se fusiona GST, Flag, His o etiqueta similar en dicha célula. En el segundo método de identificación, un compuesto del que se desea explorar su proteína diana (a denominar en lo sucesivo en este documento agente a ensayar) se añade (se pone en contacto) o no se añade (no añadido) a la célula transformada que se ha mencionado anteriormente de un estado vivo. De este modo, la proteína de chaperona molecular que se expresa en la célula de muestra transformada que se ha mencionado anteriormente, una proteína de célula de muestra y un agente de muestra o una proteína de chaperona molecular que se expresa en la célula de muestra transformada que se ha mencionado anteriormente y la proteína de célula de muestra se pueden poner en contacto. En el tercer método de identificación, un agente a ensayar se añade (se pone en contacto) o no se añade (no añadido) a un líquido mixto de proteína extraído de la célula transformada que se ha mencionado anteriormente (a saber, un extracto de célula de muestra que contiene una proteína de chaperona molecular y una proteína de célula de muestra). De este modo, la proteína de chaperona molecular en el estado de estar contenida en un extracto de la célula de muestra transformada que se ha mencionado anteriormente, la proteína de célula de muestra en un estado de estar contenida en el mismo extracto y el agente de muestra o la proteína de chaperona molecular en un estado de estar contenida en un extracto de la célula de muestra transformada que se ha mencionado anteriormente y la proteína de célula de muestra en un estado de estar contenida en el mismo extracto se pueden poner en contacto. En el segundo método de identificación y el tercer método de identificación, la proteína que se une a la proteína de chaperona molecular se concentra de acuerdo con el mismo método que el primer método de identificación.

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Proteína de chaperona molecular

Como la proteína de chaperona molecular que se puede usar en el método de identificación se puede usar cualquier proteína de chaperona molecular conocida de forma convencional. De forma ilustrativa, se pueden ejemplificar proteínas típicas que pertenecen a las respectivas familias de Hsp90 (HtpG; la parte entre paréntesis muestra el nombre de Escherichia coli), Hsp70 (DnaJ), Hsp60 (GroEL), Hsp40 (DnaJ), Hsp27 (IbpAB), Hsp104 (CIpB) y GRP78 (DnaK) (A. Sreedhar et al., Pharmacology & Therapeutics, 2004, vol. 101, Nº 3, págs. 227 - 257; D. S. Latchman et al., Cardiovascular Research, 2001, vol. 51, págs. 637 - 646). Además, FKBP56 y Hsp32 conocidas como hemo-oxigenasa-1, sHSP de bajo peso molecular (proteínas de choque térmico pequeñas) y similares también se pueden usar como chaperonas (P. Laksanalamai, Extremphiles, 2004, vol. 8, Nº 1, págs. 1 -11).

Como la proteína de chaperona molecular que se puede usar en el método de identificación, se incluye una chaperona molecular conocida de forma convencional o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que representa una proteína de chaperona molecular conocida de forma convencional en la que de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, más preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de dicha proteína (a denominar en lo sucesivo en este documento "variante funcionalmente equivalente"). Además, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más (preferiblemente del 95% o más, más preferiblemente del 98% o más) con la secuencia de aminoácidos que representa la proteína de chaperona molecular conocida que se ha descrito anteriormente también se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de dicha proteína (a denominar en lo sucesivo en este documento un "polipéptido homólogo"). Además, los orígenes de la variante funcionalmente equivalente y el polipéptido homólogo no se limitan a especies de organismos particulares. Además, no están limitados a polipéptidos naturales, a condición de que se incluyan en la variante funcionalmente equivalente o el polipéptido homólogo y un polipéptido modificado artificialmente mediante ingeniería genética basándose en una secuencia de aminoácidos que representa una proteína de chaperona molecular conocida de forma convencional también se incluye en este documento. En este contexto, la "identidad" que se ha mencionado anteriormente en esta descripción significa el valor de identidad obtenido usando los parámetros dispuestos por defecto por el programa de recuperación NEEDLE (J. Mol. Biol., 1970; 48: 443- 453). Los parámetros que se han mencionado anteriormente son los siguientes.

Penalización por hueco = 10

Penalización por extensión = 0,5

Matriz = EDNAFULL

Se prefieren como la proteína de chaperona molecular proteínas representadas por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 (HSPA1A humano; número de acceso de RefSeq NP_005336, HSPH1 humano; número de acceso de RefSeq NP_006635, HSPCA humano; número de acceso de RefSeq NP_005339, HSPD1 humano; número de acceso de RefSeq NP_955472, DNAJA1 humano; número de acceso de RefSeq NP_001530, HSPB1 humano; número de acceso de RefSeq NP_001531, HSPE1 humano; número de acceso de RefSeq NP_002148, HSPA4 humano; número de acceso de RefSeq NP_002145, HSP90B 1 humano; número de acceso de RefSeq NP_003290, CCT6B humano; número de acceso de RefSeq NP_006575, TCP1 humano; número de acceso de RefSeq NP_110379, HSPA14 humano; número de acceso de RefSeq NP_057383, HSPA9B humano; número de acceso de RefSeq NP_005338, STCH humano; número de acceso de RefSeq NP_008879, HYOU1 humano; número de acceso de RefSeq NP_006380, HSPB5 humano; número de acceso de RefSeq NP_001876, HSPB2 humano; número de acceso de RefSeq NP_001532, DNAJA2 humano; número de acceso de RefSeq NP_005871, DNAJB1 humano; número de acceso de RefSeq NP_006136, DNAJB2 humano; número de acceso de RefSeq NP_006727, HCG3 humano; número de acceso de RefSeq NP_001001394, DNAJB11 humano; número de acceso de RefSeq NP_057390, DNAJC11 humano; número de acceso de RefSeq NP_060668, DNAJC7 humano; número de acceso de RefSeq NP_003306, DNAJC6 humano; número de acceso de RefSeq NP_055602) y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 donde de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de las mismas están delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la proteína o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más (preferiblemente del 95% o más, más preferentemente del 98% o más) con la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 y también se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la proteína. La expresión "se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la proteína" significa que la chaperona molecular se une a una proteína respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína provocado por su unión con un agente a ensayar o la chaperona molecular una vez unida a una proteína de estado no cambiado se separa respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína provocado por su unión con un agente a ensayar. Si la chaperona molecular se "une" o no respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína se puede verificar del mismo modo que en el método para "detectar una proteína que se une a una proteína de chaperona molecular" del método de identificación. Particularmente, con respecto a la variante funcionalmente equivalente y polipéptido homólogo de un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27, se verifica que "se une a una proteína reconociendo un cambio en la estructura terciaria de la proteína" respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína ATP5B provocado por su unión a biguanida (agente a ensayar), basándose en la separación de la proteína de chaperona molecular una vez unida a la proteína ATP5B de estado no cambiado respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína ATP5B provocado por su unión a biguanida. Alternativamente, se verifica por la unión de la chaperona molecular a una proteína respondiendo a un cambio en la estructura terciaria de la proteína TARDBP provocado por su unión a talidomida (agente a ensayar). Estas verificaciones se realizan en las condiciones del Ejemplo 4 o del Ejemplo 8, usando una variante funcionalmente equivalente o polipéptido
homólogo a examinar en lugar de la proteína de chaperona molecular usada en el Ejemplo 4 o el Ejemplo 8.

En el método de identificación entre las proteínas de chaperona molecular, el uso de las proteínas representadas por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 y/o SEC ID Nº: 27 es particularmente deseable. Ya que estas proteínas pertenecen a las respectivas familias que se han mencionado anteriormente de diferentes chaperonas (Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, HSP27, Hsp104 y GRP78), se espera que cada una de las mismas tenga una propiedad característica de cada familia de la proteína de chaperona molecular.

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Método de producción de proteína de chaperona molecular

En el método de identificación se puede producir de forma sencilla una proteína de chaperona molecular y obtener mediante un medio de ingeniería genética y/o bioquímico general usando un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular. Dicho polinucleótido se puede producir de forma sencilla y obtener mediante una técnica general de ingeniería genética basándose en la información de secuencia descrita en esta descripción o información de secuencia conocida de forma convencional. Por ejemplo, se puede obtener del siguiente modo, pero se puede obtener no solamente mediante este método, sino también mediante operaciones conocidas de forma convencional ("Molecular Cloning" [Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y similares]). Por ejemplo, se puede citar (1) un método que usa PCR, (2) un método que usa una técnica habitual de ingeniería genética (a saber, un método en el que se selecciona un transformante que contiene el polipéptido deseado de los transformantes transformados con una genoteca de ADNc) o (3) un método de síntesis química. Se pueden realizar los respectivos métodos de producción del mismo modo como se describe en el documento WO 01/34785.

En el método que usa PCR, se puede producir un polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el "Modo para realizar la invención" 1) Método de producción de gen de proteína, a) Primer método de producción, de la referencia de patente que se ha mencionado anteriormente. Por ejemplo, se extrae ARNm de hígado, cerebro, glándula mamaria o tejido similar humano. A continuación se sintetiza una primera cadena de ADNc realizando una reacción de transferasa inversa de este ARNm en presencia de cebadores aleatorios o cebadores oligo (dT). Se puede obtener un polinucleótido que codifica la proteína de chaperona molecular o una parte de la misma sometiendo la primera cadena de ADNc obtenida de este modo a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos cebadores que se interponen en una región parcial del gen de interés. Más ilustrativamente, se puede producir un polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular mediante el método descrito en el Ejemplo 1.

En el método que usa una técnica habitual de ingeniería genética, se puede producir un polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el "Modo para realizar la invención" 1) Método de producción del gen de proteína, b) Segundo método de producción de la referencia de patente que se ha mencionado anteriormente.

En el método que usa un método de síntesis química, se puede producir un polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el "Modo para Realizar la Invención" 1) Método de producción de gen de proteína, c) Tercer método de producción, d) Cuarto método de producción de la referencia de patente que se ha mencionado anteriormente. Ilustrativamente, se puede producir mediante métodos de síntesis peptídica en fase líquida y fase sólida. La síntesis se puede realizar uniendo sucesivamente aminoácidos uno por uno o sintetizando un fragmento polipeptídico que consiste en varios aminoácidos y después uniendo el mismo. El polipéptido de la presente invención obtenido por estos medios se puede purificar de acuerdo con diversos métodos conocidos de forma convencional. La mutación de la secuencia en ocasiones tiene lugar mediante una mutación natural, pero también se puede preparar realizando una modificación artificial. Con respecto a los medios artificiales para preparar los mutantes que se han mencionado anteriormente, además de las técnicas de ingeniería genética tales como el método de sustitución específico de base (Methods in Enzymology, (1987) 154, 350, 367 - 382) de un polinucleótido que codifica el polipéptido que se ha mencionado anteriormente, por ejemplo, se pueden citar el método de fosfotriéster, método de fosfo-amidida y medios de síntesis química similares (Science, 150, 178, 1968). Es posible obtener un polinucleótido que acompaña a la sustitución de bases deseada por su combinación. Alternativamente, es posible generar sustitución de una base no específica en la molécula de polinucleótido repitiendo la operación de PCR o añadiendo ión manganeso o similares a su líquido de reacción.

La proteína de chaperona molecular se puede expresar in vitro o en una célula a ensayar conectando el polinucleótido que codifica proteína de chaperona molecular obtenido como se ha descrito anteriormente cadena abajo de un promotor apropiado por el método descrito en "Molecular Cloning, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989" o similares. Ilustrativamente, añadiendo un polinucleótido que codifica una secuencia de promotor específica cadena arriba del codón de inicio del polinucleótido obtenido como se ha descrito anteriormente y usando esto como el molde, se puede realizar la expresión de la proteína de chaperona molecular por transcripción y traducción del gen en un sistema sin células. Alternativamente, cuando el polinucleótido que codifica proteína de chaperona molecular se integra en un plásmido vector apropiado y se transforma una célula hospedadora por el plásmido, se posibilita la expresión de dicho polipéptido. Todavía alternativamente, se puede preparar y usar una célula en la que se integra una construcción de este tipo en ADN cromosómico. Más ilustrativamente, cuando se integra de nuevo un fragmento que contiene el polinucleótido aislado en un plásmido de vector apropiado, puede transformar células hospedadoras de eucariotas y procariotas. Además, cuando se transfieren un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión génica de estos vectores, se posibilita realizar la expresión de la proteína de chaperona molecular en las respectivas células hospedadoras. La célula hospedadora no está limitada particularmente y puede ser cualquier célula que pueda realizar la expresión de la proteína de chaperona molecular en una cantidad suficiente para el propósito de aplicar al método de la presente invención. Como la célula hospedadora se pueden citar, por ejemplo, una célula COS de célula de mono (Gluzman, Y. (1981) Cell, 23,175-182), una cepa deficiente en deshidrofolato reductasa de célula de ovario de hámster chino (CHO) (Urlaub, G. y Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 - 4220), célula HEK293 obtenida de riñón fetal humano y célula 293- EBNA en la que se transfiere el gen EBNA-1 del virus de Epstein Barr a la misma célula (fabricado por Invitrogen) y similares.

El método para expresar un gen transformando una célula hospedadora se puede realizar, por ejemplo, mediante el método descrito en el método de producción de proteína recombinante del "Modo para realizar la invención", 2) de la referencia de patente que se ha mencionado anteriormente. El vector de expresión a usar en la producción de una célula de expresión de chaperona molecular (vector de expresión para expresión de chaperona molecular) no está limitado particularmente, a condición de que contenga el polinucleótido deseado. Por ejemplo, se puede citar un vector de expresión obtenido insertando el polinucleótido de interés en un vector de expresión conocido de forma convencional seleccionado de forma opcional en respuesta a la célula hospedadora a usar. Como el vector de expresión conocido de forma convencional se pueden citar, por ejemplo, pSV2dhfr que tiene el promotor temprano de SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol., 1, 854 - 864), pEF-BOS que tiene el promotor de factor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322), pCEP4 que tiene el promotor de citomegalovirus (Invitrogen), pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y. (1990) Med. Immunol., 20, 27 - 32), pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature, 329, 840 - 842) y similares. La proteína de chaperona molecular se puede obtener, por ejemplo, transformando una célula hospedadora deseada con el vector de expresión que se ha mencionado anteriormente y realizando la expresión del polipéptido que se ha mencionado anteriormente en dicha célula. Más ilustrativamente, integrando un polinucleótido deseado en un vector de expresión bacteriano, se puede producir una proteína de chaperona molecular deseada en células bacterianas en una gran cantidad. Además, la proteína de chaperona molecular también se puede producir en una gran cantidades usando levadura, una célula de insecto o similares. Además, se puede producir una proteína de chaperona molecular deseada in vitro mediante un método conocido de forma convencional usando el polinucleótido que se ha mencionado anteriormente unido cadena abajo de un cierto promotor. Más ilustrativamente, se puede producir una proteína de chaperona molecular deseada in vitro realizando reacciones de transcripción y traducción in vitro usando, como el molde, el polinucleótido que se ha mencionado anteriormente unido cadena abajo del promotor que se ha mencionado anteriormente.

Mediante el cultivo de la célula que se ha mencionado anteriormente, la proteína de chaperona molecular producida en las células se pueden detectar, determinar y purificar adicionalmente. Por ejemplo, es posible detectar y purificar dicha proteína mediante transferencia de Western o inmunoprecipitación usando un anticuerpo que se une a la proteína de chaperona molecular. Alternativamente, expresando dicha proteína como una proteína de fusión con una proteína marcadora apropiada tal como glutatión-S-transferasa (GST), proteína A, \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa (MBP), dicha proteína se puede detectar mediante transferencia de Western o inmunoprecipitación usando un anticuerpo específico para tal proteína marcadora. Además, la proteína que se ha mencionado anteriormente se pueden purificar haciendo uso de estas proteínas marcadoras. Más ilustrativamente, la proteína que se ha mencionado anteriormente se puede purificar haciendo uso de una proteína marcadora del siguiente modo. En el método, un polinucleótido que codifica una proteína de chaperona molecular (por ejemplo, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27) se integra, por ejemplo, en un vector por lo que se añade un marcador GST o marcador His a la proteína expresada de interés, más ilustrativamente, el pGEX-6P1 (fabricado por Amersham) descrito en el Ejemplo 1 o un PET-28a (Novagen) disponible en el mercado, por ejemplo, y se transfiere a una bacteria y la proteína de chaperona molecular se puede expresar de este modo como una proteína de tipo fusión con GST en el caso de la primera y como una proteína de tipo de fusión con His en el caso de la última. Dicho proteína de tipo fusión se puede purificar de un extracto de proteína obtenido de la célula bacteriana que expresa la proteína, haciendo uso de las propiedades del marcador GST o His. Por ejemplo, cada uno de los plásmidos de expresión de chaperona preparados en el Ejemplo 1 usando pGEX-6P1 se diseña de tal modo que se añade el marcador GST al extremo N de la proteína de chaperona molecular. De este modo, la proteína de chaperona molecular deseada se puede purificar de una célula en la que dicha proteína se expresó, haciendo uso del marcador GST. Más ilustrativamente, la proteína de chaperona molecular fusionada con marcador GST se puede aislar de un extracto de células rotas uniéndose a perlas de glutatión-Sepharose (Glutathione Sepharose 4B; Amersham) y centrifugando el mismo, de acuerdo con el método de arrastre con GST conocido de forma convencional (N. Matsu et al. Jikken Kogaku (Experimental Engineering), vol. 13, Nº 6, página 528, 1994). Por otro lado, con respecto a la purificación de una proteína de chaperona molecular deseada de una célula que expresa dicha proteína haciendo uso el marcador His, la proteína de chaperona molecular fusionada con el marcador His se puede aislar de un extracto de células rotas uniéndose a Ni^{2+}-NTA-Agarosa (fabricado por Funakoshi) y centrifugando el mismo, de acuerdo con el método conocido de forma convencional (Nakahara et al. Jikken Igaku Bessatsu Tanpakushitsu no bunshikan sogo sayo jikkenho (Experimental Medicine, supplement, Experimental methods of the intermolecular interaction of protein), página 32, 1996). Alternativamente, cuando la ocasión lo demande, la proteína de chaperona molecular también se puede purificar mediante un método que no usa una proteína marcadora, por ejemplo, mediante diversas operaciones de separación haciendo uso de sus propiedades físicas y propiedades químicas. Ilustrativamente se pueden ejemplificar la aplicación de ultrafiltración, centrifugación, filtración en gel, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alto rendimiento.

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Agente a ensayar

Aunque no están limitados particularmente, los ejemplos del agente a ensayar incluyen compuestos disponibles en el mercado (incluyendo péptidos), diversos compuestos conocidos de forma convencional (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, un grupo de compuestos obtenidos por las técnicas de química de combinación (N. Terrett et al., Drug Discov. Today, 4 (1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivo microbiano, componentes naturales procedentes de plantas y organismos marinos, extractos de tejidos animales (incluyendo polinucleótidos y péptidos) o los que son compuestos química o biológicamente modificados de los mismos y que tienen distintas acciones farmacológicas. No solamente las acciones deseables para tratamientos médicos, sino también las acciones tóxicas para organismos vivos se incluyen en las acciones farmacológicas.

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Extracto celular

Se puede usar como extracto celular un líquido obtenido extrayendo proteína de un tejido diana primario para el uso en la inducción de la acción farmacológica que posee el agente a ensayar o de una célula cultivada que mantiene la mayoría de las propiedades de dicho tejido. Con respecto al método para extraer proteína de una célula, es deseable usar un método de preparación en respuesta al propósito. Ilustrativamente, de acuerdo con métodos de extracción de proteína conocidos de forma convencional, se selecciona una sustancia ajustada al propósito de SDS, Triton-X, o CHAPS, CHAPSO y diversos tensioactivos similares, la célula que se ha mencionado anteriormente se rompe y se centrifuga usando un tampón que contiene la sustancia y después se separa el sobrenadante y se recupera para usarse como el extracto celular del método. Más ilustrativamente, es deseable que estén contenidos inhibidores de diversas enzimas proteolíticas procedentes de organismos vivos, tales como PMSF (fenilmetil sulfonilfluoruro), EGTA (ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético) y similares, en el tampón a usar en la ruptura y es deseable almacenar el mismo en una condición de -80ºC o menos que pueda mantener de forma estable la proteína congelada hasta su aplicación al método.

Etapa de detectar una proteína que se une a proteína de chaperona molecular

Se considera que cada proteína de chaperona molecular responde a un gran número de proteínas de sustrato por molécula. Sin embargo, se considera que la especificidad de sustrato varía dependiendo de sus tipos. Por tanto, para explorar de forma inclusiva verdaderamente dianas de compuestos que tienen diversas estructuras, es deseable disponer proteínas de chaperona molecular que pertenecen a una gran diversidad de diferentes familias y usar las mismas simultáneamente como la sonda. Más preferiblemente, como se muestra en el ejemplo 2 (3), 3, 4 y 8 de la presente invención, es deseable disponer dos o más proteínas de chaperona molecular procedentes de diferentes familias de chaperona y usar las mismas simultáneamente. Además, en el caso de un sistema de ensayo bioquímico, cuando la proteína a usar como la sonda (proteína de chaperona molecular) está presente en un gran exceso en comparación con la proteína a usar como el sustrato, la especificidad de sustrato de la sonda disminuye, de tal forma que se puede esperar que se reconozca incluso una proteína diferente de la proteína original por la sonda cuando es una molécula análoga a dicho sustrato. Por consiguiente, como el caso del método de arrastre in vitro mostrado en el Ejemplo 2(2), el uso de un sistema en el que se puede usar una gran cantidad de la proteína sonda en la reacción, en comparación con la proteína procedente de célula a usar como el sustrato, es más deseable para permitir la exploración de diana inclusiva de compuestos. Además, se ha descrito que muchas proteínas de chaperona molecular se someten a sus acciones formando un polímero in vivo. Por consiguiente, al realizar el método, es más deseable usar tal extracto de células procedente de muestra de organismo vivo y condiciones de separación, que una chaperona endógena capaz de formar un complejo con la proteína de chaperona molecular (sonda) está presente en la misma como una mezcla, como se muestra en los Ejemplos 2 (2) y 4. Más ilustrativamente, es deseable usar un sistema en el que se permita que una proteína de chaperona molecular (proteína de sonda) reaccione con un extracto celular procedente de una célula que contiene una chaperona endógena, como el método de arrastre in vitro mostrado en el Ejemplo 2(2) de la presente invención.

Para "detectar una proteína que se une a una proteína de chaperona molecular", se realiza la siguiente operación. Una proteína de chaperona molecular y una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular se pueden concentrar de un extracto de célula de muestra extraído de una célula al que se añadió o no se añadió un agente a ensayar o un extracto de célula de muestra al que se añadió o no se añadió un agente a ensayar mediante el método de inmunoprecipitación conocido de forma convencional usando un anticuerpo de la proteína de chaperona molecular o un anticuerpo de un marcador fusionado con la proteína de chaperona molecular. Alternativamente, la proteína de chaperona molecular y una proteína que se une a la proteína de chaperona molecular también se pueden concentrar mediante un método conocido de forma convencional que usa perlas de afinidad o columna de afinidad que tiene afinidad por el marcador que se ha mencionado anteriormente. Como un método ilustrativo, se puede ejemplificar un método de arrastre con GST que usa el péptido purificado uniendo GST o marcador similar. La proteína que se une a la proteína de chaperona molecular se detecta separando el líquido concentrado de proteína de chaperona molecular y su proteína de unión obtenida anteriormente mediante un método de separación de proteína conocido de forma convencional. Por ejemplo, después de separar las mismas por electroforesis en gel de poliacrilamida, la proteína de chaperona molecular y la proteína obtenida de célula de muestra unida a la proteína de chaperona molecular se pueden detectar mediante diversos métodos convencionales detectar proteínas incluyendo métodos de tinción de proteína ya existentes, tales como tinción con plata, tinción con Azul Brillante de Coomassie o Tinción con Gel Negativo (Wako Pure Chemical Industries) ("Idensgi Cloning no Tame no Tanpakushitsu Kozo Kaiseki (Protein Structure Analysis for Gene Cloning)" Hisashi Hirano Tokio Kagaku Doujin 1993 pág. 37 - pág. 40). El método a usar no está limitado al anterior método a condición de que pueda detectar la proteína. Con respecto a las proteínas detectadas por el anterior método, se comparan las proteínas que se unen a la proteína de chaperona molecular en el caso de añadir y de no añadir al agente a ensayar. Comparando ambos casos, se puede identificar una proteína obtenida de célula de muestra cuya unión a la proteína de chaperona molecular cambió en el momento de añadir o de no añadir el agente a ensayar (a saber, la proteína diana del agente a ensayar). Como el método para detectar y comparar un grupo de proteínas obtenidas de células de muestra en el momento de añadir o de no añadir al agente a ensayar se puede ejemplificar la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida conocida de forma convencional. En ese caso, se puede realizar una comparación más precisa cuando se desarrolla por una electroforesis bidimensional. Mediante la comparación de las bandas desarrolladas por la electroforesis basándose en los resultados del caso de la adición del agente a ensayar y los resultados del caso de la no adición del agente a ensayar (a saber, comparando si existe un caso en el que la cantidad de una banda aumenta solamente en el momento de la adición del agente a ensayar o un caso en que la cantidad de una banda aumenta solamente en el momento de la no adición del agente a ensayar), se puede seleccionar una proteína cuya cantidad de unión aumenta solamente en el momento de la adición del agente a ensayar o cuya cantidad de unión disminuye solamente en el momento de la adición del agente a ensayar. Como la proteína cuya cantidad de unión aumenta solamente en el momento de la adición del agente a ensayar o cuya cantidad de unión disminuye solamente en el momento de la adición del agente a ensayar es deseable seleccionar una proteína que se una solamente en el momento de la adición del agente a ensayar o que no se una solamente en el momento de la adición del agente a ensayar. Posteriormente, se identifican las proteínas detectadas y seleccionadas mediante el anterior método. Se determinan las secuencias de aminoácidos presentes en sus moléculas mediante métodos de purificación de proteína conocidos de forma convencional y métodos de identificación de proteína (Schevchenko et al., Analytical Chemistry, vol. 68, pág. 850 - pág. 858, 1996) y basándose en esta información de secuencia de aminoácidos se puede identificar una proteína cuya unión con la proteína de chaperona molecular cambia en el momento de la adición o de la no adición del agente a ensayar (a saber, una proteína diana del agente a ensayar). Ilustrativamente, la proteína diana del agente a ensayar se puede identificar recuperando y purificando la proteína del gel y determinando después su secuencia de aminoácidos mediante un método de espectro de masas o un método conocido de forma convencional. Más ilustrativamente, la identificación de la proteína se puede realizar mediante el análisis de espectro de masas después de digerir la proteína de interés separada por la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida en fragmentos usando tripsina o similares y recuperando la mezcla de péptido formada de este modo del gel (Schevchenko, et al., Analytical Chemistry, vol. 68, pág. 850 - pág. 858, 1996). Alternativamente, después de eluir la proteína de interés del gel por un método de elución eléctrica o similares o después de transferir la proteína de interés sobre el gel a una película de PVDF (fluoruro de polivinilideno) o similares, se convierte en fragmentos mediante una digestión con enzima o una digestión enzimática como lo demande la ocasión y, cuando la ocasión lo demande adicionalmente, los fragmentos peptídicos obtenidos de este modo se separan por una cromatografía líquida, una electroforesis capilar o similares y después se puede realizar la identificación de la proteína mediante un análisis de espectro de masas o un análisis de secuencia de aminoácidos N-terminal o C-terminal (H. Hirano, Proteome Kaiseki - Riron to Hoho - (Proteome Analysis - Theory and Method) Tokyo Kagaku Doujin, 2001). Más ilustrativamente, como se describe en el Ejemplo 4 y Ejemplo 8, la identificación de la proteína diana separada por la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida se puede realizar digiriendo la proteína hasta fragmentos usando tripsina o similares, recuperando la mezcla de péptido formada de este modo del gel y después realizando un análisis de espectro de masa.

Es posible verificar mediante las técnicas de análisis de función génica conocidas de forma convencional que la proteína diana identificada mediante el método es una proteína diana verdadera que produce acciones farmacológicas del agente a ensayar. En primer lugar, ilustrativamente, se puede examinar la presencia o ausencia de unión directa entre el agente a ensayar y la molécula de proteína diana obtenida de este modo mediante el método mostrado a continuación. Una parte o la región de longitud completa de un polipéptido a examinar con respecto a si se une o no al mismo o una parte o la región de longitud completa de un polipéptido a examinar al que se fusionó un marcador GST, Flag, His o similares se expresa en una célula. El polipéptido expresado a examinar se aísla y purifica de dicha célula mediante un método de purificación por afinidad usando la afinidad por el marcador GST, Flag, His o similares o mediante un método de inmunoprecipitación usando un anticuerpo que responde a dicho marcador. Posteriormente, el polipéptido purificado de este modo se mezcla con un agente a ensayar y se aísla el complejo formado por la unión de dicho agente a ensayar y el polipéptido. A continuación, mediante el examen de si dicho agente a ensayar está contenido o no en la muestra realizando un análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas, después de volver a separar los compuestos desnaturalizando dicho complejo con un ácido, calor u otra estimulación y eliminando de este modo la proteína sola, se puede verificar la unión del péptido a examinar con dicho agente a ensayar. Además, como otro método, se puede verificar si el polipéptido a examinar y dicho agente a ensayar se unen entre sí o no mediante ELISA conocido de forma convencional, transferencia de Western, ensayo de unión y métodos similares usando, como la sonda, un agente marcado a ensayar preparado marcando una parte de la estructura molecular del agente a ensayar. Es deseable que se use un radioisótopo que no ejerza influencia sobre la unión con la proteína diana como el marcador del agente a ensayar. Ilustrativamente, por ejemplo, se puede preparar un compuesto marcado sustituyendo un elemento en la molécula del agente a ensayar con un radioisótopo. Mediante el uso de dicho agente marcado a ensayar como la sonda, se puede verificar la unión de un polipéptido con dicho agente a ensayar mediante un método de ELISA en el que el polipéptido a examinar purificado por el método que se ha mencionado anteriormente se inmoviliza. Alternativamente, después de separar el polipéptido a examinar mediante una electroforesis en gel de SDS archilamida conocida de forma convencional y transfiriendo el mismo a una película de nitrocelulosa, también se puede verificar la unión de dicho polipéptido con dicho agente a ensayar mediante un método de Western con proteína (far western) usando el agente marcado que se ha mencionado anteriormente a ensayar como la sonda. Además, después de mezclar el agente marcado a ensayar con el polipéptido a examinar purificado con el método que se ha mencionado anteriormente y lavar los mismos por captura sobre un filtro, se puede verificar la unión de dicho polipéptido con dicho agente a ensayar mediante un denominado ensayo de unión en el que se detecta la cantidad total del complejo formado de este modo del compuesto y péptido midiendo la dosis de radiación obtenida de la sonda marcada. Además, si está presente o no una estructura de cerradura en la proteína diana identificada mediante el método de la presente invención, a la que se puede unir dicho compuesto a ensayar, mediante una técnica de predicción de estructura terciaria de proteína conocida de forma convencional (J. Med. Chem., Dec. 30, 2004, 47 (27): 6804 -11). Además, la cantidad de expresión de la proteína diana que se ha mencionado anteriormente se puede aumentar o disminuir mediante diversos métodos de ensayo bioquímicos y/o de ingeniería genética, tales como el ensayo de anulación de gen conocido de forma convencional a nivel celular usando una técnica de ARN de interferencia (Tuschl T. et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20 (5): págs. 446 - 448) y un ensayo de sobre-expresión génica conocido de forma convencional también a nivel celular, así como la preparación de un animal knockout de gen o preparación de un animal que sobre-expresa un gen y ya que el efecto de acelerar o suprimir el efecto principal o un efecto secundario adverso se encuentra cuando el efecto principal o el efecto secundario adverso se ensaya en estas condiciones, se puede confirmar que una proteína diana codificada por un gen cuya expresión cambió es la proteína diana verdadera. Aunque el método de identificación puede identificar la proteína diana de un agente a ensayar que produce acción farmacológica del agente a ensayar, el método de identificación es más adecuado como un método para identificar una proteína diana que produce una acción farmacológica deseada (efecto principal) entre las acciones farmacológicas del agente a ensayar.

Herramienta de exploración de la presente invención y su uso para la exploración

La herramienta de exploración consiste en lo siguiente (1) a (3).

(1): Una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar una herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en una proteína ATP5B humana (un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2), una variante funcionalmente equivalente de ATP5B (un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3) aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión) y una proteína homóloga a ATP5B (un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o más, preferiblemente del 95% o más, más preferiblemente del 98% o más) con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión) (a denominar polipéptido para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento),

(2): una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar herramienta de exploración de tipo polipéptido de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en un polinucleótido que codifica el polipéptido para uso de herramienta (a denominar polinucleótido para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento) o

(3): una herramienta de exploración de agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida (a denominar una herramienta de exploración de tipo celular de la presente invención en lo sucesivo en este documento), que consiste en una célula que se transforma con el polinucleótido para uso de herramienta y que expresa de este modo los polipéptidos para uso de herramienta (a denominar célula para uso de herramienta en lo sucesivo en este documento).

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El uso de

(1): polipéptidos para uso de herramienta,

(2): polinucleótidos para uso de herramienta o

(3): célula para uso de herramienta para la exploración de un agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida también se incluye en la presente invención.

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De acuerdo con esta descripción, la "herramienta de exploración" significa una sustancia para el uso en la exploración (ilustrativamente, el polipéptido, polinucleótido o célula a usar en la exploración). La "herramienta de exploración de un agente para tratar diabetes, que tiene la misma diana medicinal con biguanida" es una célula o polipéptido que se convierte en el objeto con el que se pone en contacto un compuesto a ensayar o un polinucleótido para obtener o expresar un polipéptido que se convierte en el objeto con el que se pone en contacto un compuesto a ensayar para el uso en la exploración de un agente para tratar diabetes que tiene la misma diana medicinal con biguanida mediante el método de exploración de la presente invención.

Los orígenes de la variante funcionalmente equivalente de ATP5B y polipéptido homólogo de ATP5B no están limitados al ser humano. A condición de que se incluya en uno cualquiera de los polipéptidos para uso de herramienta, se incluyen en los mismos no solamente los mutantes de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 en ser humano, sino también los obtenidos de todos los tipos de organismos que varían desde un vertebrado hasta una bacteria y en los mismos se incluyen no solamente los polipéptidos naturales, sino también los polipéptidos modificados artificialmente mediante técnicas de ingeniería genética basadas en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2. Además, a condición de que se una a biguanida y/o inhiba la activación de AMPK de biguanida por su sobre- expresión, un polipéptido en el que está contenida una secuencia marcadora que se describe más adelante en la variante funcionalmente equivalente de ATP5B o polipéptido homólogo de ATP5B también se incluye en el polipéptido para uso de herramienta. En el Ejemplo 5(5) y (6) que se describen más adelante, se puso de manifiesto que los restos aminoacídicos relacionados en la estructura periférica del sitio 20, particularmente, Glu 175 y Asp 295 en el caso de ATP5B humana, son importantes para la unión de ATP5B con biguanida. Por consiguiente, cuando se introduce una mutación, se puede producir de forma sencilla un polipéptido modificado que mantiene su actividad de unirse con biguanida conservando los restos aminoacídicos relacionados con la estructura periférica del sitio 20, particularmente Glu 175 y Asp 295 en el caso de ATP5B humana e introduciendo una mutación en una parte diferente de ésta.

El polipéptido de ATP5B humana es más deseable entre los polipéptidos para uso de herramienta, ya que la herramienta de exploración de tipo polipéptido y un polinucleótido que codifica polipéptido de ATP5B humana (particularmente preferiblemente en polinucleótido representado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1) entre los polinucleótidos para uso de herramienta, como la herramienta de exploración de tipo polinucleótido de la presente invención y una célula que se transforma con un vector que comprende un polinucleótido que codifica ATP5B humana y de este modo expresa ATP5B humana, entre las células para uso de herramienta, como la herramienta de exploración de tipo polinucleótido de la presente invención.

El polinucleótido para uso de herramienta se puede producir de forma sencilla y obtener mediante técnicas de ingeniería genética generales basándose en la información de secuencia descrita en esta descripción o información de secuencia génica conocida de forma convencional. Como tales técnicas, como se describe en el <Método de producción de proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado anteriormente, se pueden citar operaciones conocidas de forma convencional "Molecular Cloning" [Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y similares], por ejemplo, (1) un método que usa PCR, (2) un método que usa una técnica habitual de ingeniería genética (a saber, un método en el que un transformante que contiene el polipéptido deseado se selecciona de los transformantes transformados con una genoteca de ADNc) o (3) un método de síntesis química. Se pueden realizar los respectivos métodos de producción del mismo modo que el descrito en el documento WO 01/34785.

En el método que usa PCR, se puede obtener un polinucleótido para uso de herramienta o una parte del mismo, por ejemplo, extrayendo ARNm de músculo esquelético, cerebro o tejido humano similar y usando una primera cadena de ADNc del mismo modo como el que se ha descrito en el <Método de producción de proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado anteriormente sometiéndolo a PCR usando dos cebadores que se interponen en una región parcial del polinucleótido para uso de herramienta. Más ilustrativamente, el polinucleótido para uso de herramienta se puede producir, por ejemplo, mediante el método descrito en el ejemplo 5(1). También por el método que usa una técnica habitual de ingeniería genética o el método que usa un método de síntesis química, se puede producir el polinucleótido para uso de herramienta del mismo modo como el que se describe en el <Método de producción de proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado anteriormente.

Del mismo modo como se ha descrito en el <Método de producción de proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado anteriormente, el polinucleótido para uso de herramienta obtenido del anterior modo se puede expresar in vitro o en una célula a ensayar conectando el polinucleótido para uso de herramienta cadena abajo de un promotor apropiado mediante un método conocido de forma convencional (por ejemplo, el método descrito en "Molecular Cloning, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989" o similares). El vector de expresión a usar en la producción de la célula para uso de herramienta (vector de expresión para uso de herramienta) no está limitado particularmente, a condición de que comprenda el polinucleótido para uso de herramienta. Por ejemplo, se puede citar un vector de expresión preparado insertando el polinucleótido para uso de herramienta en un vector de expresión conocido de forma convencional seleccionado opcionalmente en respuesta a la célula hospedadora a usar. El polipéptido para uso de herramienta se puede obtener, por ejemplo, transformando una célula hospedadora deseada con el vector de expresión para uso de herramienta y realizando la expresión del polipéptido para uso de herramienta en dicha célula. Más ilustrativamente, el polipéptido para uso de herramienta se puede producir en una gran cantidad en una célula bacteriana integrando el polinucleótido para uso de herramienta en un vector de expresión bacteriano. Además, el polipéptido para uso de herramienta se puede producir in vitro mediante un método conocido de forma convencional usando el polinucleótido para uso de herramienta unido cadena abajo de un promotor predeterminado. Más ilustrativamente, como se describe en el ejemplo 5(4), el polipéptido para uso de herramienta se puede producir in vitro realizando reacciones de transcripción y traducción in vitro usando, como el molde, el polinucleótido para uso de herramienta que se ha mencionado anteriormente unido cadena abajo de un promotor y usando el sistema TNT (fabricado por Promega).

La célula para uso de herramienta no está limitada particularmente a condición de que se transforme con el vector de expresión para uso de herramienta y comprenda el polinucleótido para uso de herramienta, de tal forma que puede ser una célula en la que se integra el polinucleótido para uso de herramienta en el cromosoma de una célula hospedadora o una célula que comprende el polinucleótido para uso de herramienta en forma de un vector de expresión. Como la célula a usar en la transformación es deseable una célula que responda a biguanida y, más ilustrativamente, es deseable una célula HeLaS3, una célula obtenida de hígado o una célula obtenida de músculo esquelético. Como la célula para uso de herramienta, puede contener un polinucleótido que comprende una secuencia marcadora que se describe más adelante, a condición de que se incluya en el polinucleótido para uso de herramienta. Como la herramienta de exploración de tipo celular de acuerdo con esta descripción es deseable una célula transformada con el vector de expresión para uso de herramienta.

La célula transformante deseada obtenida anteriormente se puede cultivar de acuerdo con un método habitual y el polipéptido para uso de herramienta se produce mediante dicho cultivo. Como el medio a usar en dicho cultivo se pueden seleccionar opcionalmente diversos medios usados de forma generada en respuesta a la célula hospedadora empleada y, en el caso de la célula que se ha mencionado anteriormente HeLaS3, por ejemplo, se puede usar medio esencial mínimo de Eagle (MEM) modificado por Dulbecco complementado con suero fetal bovino (FBS) o componente sérico similar y similares.

Si la ocasión lo demanda, el polipéptido para uso de herramienta producido del anterior modo se puede separar o purificar mediante diversas operaciones de separación conocidas de forma convencional usando las propiedades fisiológicas, propiedades bioquímicas y similares de dicho polipéptido. Además, cuando está contenida una secuencia marcadora (proteína con etiqueta) en el polipéptido para uso de herramienta, es posible realizar la conformación de expresión, purificación y similares de dicho polipéptido usando la proteína marcadora. Los ejemplos de la secuencia marcadora incluyen epítopo Flag, marcador Hexa-Histidina, marcador Hemaglutinina, epítopo myc, glutatión-S-transferasa (GST), proteína A, \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa (MBP) y similares. Además, también es posible obtener el polipéptido para uso de herramienta realizando la expresión de un polipéptido de fusión en el que se inserta una secuencia de aminoácidos específica que se puede reconocer por enterocinasa, factor Xa, trombina y proteasas similares entre una secuencia marcadora y el polipéptido para uso de herramienta, purificándolo usando la proteína marcadora y después digiriendo y retirando el resto de secuencia marcadora por estas
proteasas.

Más ilustrativamente, el polipéptido para uso de herramienta se puede expresar, por ejemplo, usando un vector por el que el marcador GST o marcador His se añade a la proteína de interés, más ilustrativamente, un pGEX-6P1 (Amersham) o pET-28a (Novagen) disponible en el mercado, por ejemplo, como una proteína de tipo fusión con GST en el primer caso o una proteína de tipo fusión con His en el último caso. Dichas proteínas de tipo fusión se pueden purificar de los extractos de proteína obtenidos de las células bacterianas que las expresan del mismo modo que se ha descrito en el <Método de producción de proteína de chaperona molecular> que se ha mencionado anteriormente usando las propiedades del marcador GST o marcador His.

El "polipéptido que se une a biguanida" de acuerdo con esta descripción significa un polipéptido que se une a un compuesto de bajo peso molecular clasificado en biguanida (metformina, fenformina, buformina o similares) y si el polipéptido se "une" o no a biguanida se puede verificar mediante el siguiente método.

Los polipéptidos a examinar con respecto a si se unen o no al mismo se aíslan y purifican. La expresión de los polipéptidos y su aislamiento y purificación se pueden realizar usando los métodos que se han mencionado anteriormente. Posteriormente, se verifica si se unen o no a fenformina mediante el método del Ejemplo 5(4). Un polipéptido cuya unión a fenformina en su concentración de adición de preferiblemente 10 \muM o menos, más preferiblemente 1,0 \muM o menos, aún más preferiblemente 0,1 \muM o menos, se puede confirmar en las condiciones de que dicho ejemplo se considere como un polipéptido que se une a biguanida.

Además, la expresión "inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión" significa que la activación de AMPK en una célula cuando se estimula con biguanida en tal condición que un cierto polipéptido está presente en la célula en una cantidad superior a la habitual, a saber, grado de fosforilación, se reduce en comparación con las células del estado habitual. Se puede verificar si "inhibe la activación de AMPK" o no mediante el método del Ejemplo 5(7). Cuando el aumento en la fosforilación de AMPK por estimulación con fenformina en una célula que sobre-expresa el polipéptido a examinar se reduce en un factor del 50%, preferiblemente del 79%, más preferiblemente del 90% en comparación con el control (una célula que no sobre-expresa el polipéptido a examinar) en las condiciones del Ejemplo 5(7), se considera que el polipéptido a examinar es un polipéptido que inhibe la activación de AMPK de biguanida por su sobre-expresión.

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Método de exploración de la presente invención

Los inventores han observado que cuando se sobre-expresa ATP5B humana (SEC ID Nº: 2) como uno de los polipéptidos para uso de herramienta en células HeLaS3, se inhibe la activación de AMPK en dicha célula por tratamiento con fenformina, metformina o biguanida o similares (Ejemplo 5(7)). Esto significa que la capacidad de activación de AMPK que contribuye al efecto farmacológico de biguanida cambia mediante el cambio de la cantidad de proteína ATP5B que existe en la célula y muestra que ATP5B evidentemente está colocada cadena arriba de AMPK en términos de la señal intracelular de biguanida. Además, los inventores han observado que ATP5B se une bioquímicamente a fenformina como una especie de biguanida (Ejemplo 5(4)). Basándose en estos hallazgos, se puede concluir que ATP5B es una proteína diana verdadera que se une a biguanida y contribuye al efecto farmacológico (efecto principal) de dicho compuesto. De acuerdo con dichos hallazgos, los inventores han puesto de manifiesto que recientemente se puede obtener un compuesto capaz de mostrar un efecto farmacológico similar al efecto de tratamiento de diabetes de biguanida realizando la exploración de un compuesto de bajo peso molecular que activa AMPK y, de este modo, han conseguido un método de exploración de un agente para tratar diabetes.

Los siguientes métodos se incluyen en el método de exploración de la presente invención. Un método para explorar un agente para tratar diabetes, que comprende

[1]: una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y

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La "exploración" de acuerdo con esta descripción de la exploración de una sustancia que tiene la actividad de interés de un gran número de sustancias a ensayar y la detección de si la sustancia es o no una sustancia que tiene la propiedad de interés.

Método de exploración de inhibición competitiva que usa un polipéptido para uso de herramienta

El método de exploración de la presente invención que comprende una etapa de permitir que un polipéptido para uso de herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto entre sí en coexistencia de biguanida se puede conseguir midiendo, en la etapa de detectar la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida por un método de ELISA, método de transferencia de western con proteína, un ensayo de unión o similares usando una biguanida marcada o modificada y dicho polipéptido, un cambio en dicha unión que tiene lugar cuando se permite que esté presente al mismo tiempo una sustancia a ensayar. Ilustrativamente, se usan diversos medios experimentales ejemplificados a continuación. Un polipéptido para uso de herramienta se expresa en una célula. El polipéptido para uso de herramienta expresado se aísla y purifica de dicha célula mediante un método de purificación por afinidad usando su afinidad por un marcador o un método de inmunoprecipitación o similares usando un anticuerpo que responde al polipéptido para uso de herramienta (por ejemplo, un anticuerpo anti-ATP5B o un anticuerpo de marcador). Posteriormente, el polipéptido purificado se mezcla con una sustancia a ensayar y biguanida y el complejo formado de este modo se aísla. A continuación, la sustancia a ensayar y biguanida se vuelven a separar desnaturalizando dicho complejo con un ácido, calor u otra estimulación, la proteína remanente sola se retira y después se examina si la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida se inhibe por la sustancia a ensayar o no examinando si un compuesto de biguanida correspondiente está contenido o no en la misma muestra mediante el análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas. Además, como otro medio, se puede verificar la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida mediante un método de ELISA conocido de forma convencional, método de transferencia de western con proteína, ensayo de unión o método similar usando, como la sonda, una biguanida marcada preparada marcando una parte de su estructura molecular. Ilustrativamente, por ejemplo, se prepara un compuesto marcado sustituyendo un elemento en la molécula de biguanida con un radioisótopo. Usando dicha biguanida marcada como la sonda, se verifica la unión del polipéptido para uso de herramienta purificado y biguanida mediante dicho método ELISA con péptido inmovilizado. Alternativamente, se separan los polipéptidos para uso de herramienta mediante electroforesis en gel de SDS acrilamida conocida de forma convencional y se transfieren a una película de nitrocelulosa y después también se verifica la unión de dicho polipéptido con biguanida mediante el método de transferencia de western con proteína que usa la biguanida marcada que se ha mencionado anteriormente como la sonda. También alternativamente se verifica la unión de un polipéptido para uso de herramienta y biguanida mediante un denominado ensayo de unión en el que se mezclan biguanida marcada y polipéptido para uso de herramienta purificado y se lavan por captura sobre un filtro y después se detecta la cantidad total del complejo formado del compuesto y péptido midiendo la dosis de radiación obtenida de la sonda marcada. El marcado de biguanida no se limita a un radioisótopo y es posible conseguir el propósito modificando una parte de su estructura molecular en tal intervalo que no ejerza influencias sobre sus actividades farmacológicas. Por ejemplo, se puede marcar modificando por la biotinilación de una parte de la estructura molecular de fenformina, metformina o buformina. Además, en este caso, la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida se verifica mediante el método de ELISA o de transferencia de western con proteína del mismo modo como se ha descrito anteriormente con el uso de biotina y avidina y mediante el uso de anticuerpo marcado con avidina o similares. Preferiblemente se verifica la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida mediante el método del Ejemplo 5(4). En la etapa que se ha mencionado anteriormente de verificar la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida, se examina si la unión de dicho polipéptido y biguanida está inhibida o no en presencia de una sustancia a ensayar junto con biguanida. Cuando la concentración de biguanida es 10 \muM, se selecciona una sustancia que tenga un valor de CI_{50} de preferiblemente 10 \muM o menos, más preferiblemente una sustancia de 1 \muM o menos, aún más preferiblemente una sustancia a ensayar de 0,1 \muM o menos, como un agente para tratar diabetes. Cuando la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida se obstruye por la presencia de una sustancia específica a ensayar, se puede considerar que este fenómeno es el resultado de la inhibición competitiva de la unión de biguanida y dicho polipéptido provocada por la unión de dicha sustancia a ensayar al sitio de unión de biguanida en la molécula del polipéptido para uso de herramienta. Con respecto a la verificación de que es evidentemente inhibición de unión competitiva por la sustancia a ensayar, se puede verificar mediante el examen de la obstrucción gradual de biguanida a unir a dicho polipéptido, realizando el cambio gradual de la proporción de concentraciones de la biguanida y sustancia a ensayar a estar presente al mismo tiempo. Mediante el mismo método se puede seleccionar una sustancia que se una al polipéptido para uso de herramienta en competición con biguanida (a saber, un agente para tratar diabetes). Más ilustrativamente, se puede seleccionar una sustancia que se una al polipéptido para uso de herramienta, por ejemplo, mediante el método mostrado en el Ejemplo 6, que se describe más adelante.

Método de exploración de ensayo de unión que usa una célula para uso de herramienta (Ejemplo Comparativo)

El método de exploración de la presente invención, que comprende una etapa de permitir que una célula para uso de herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto entre sí, es un método en el que se permite que una célula para uso de herramienta y una sustancia a ensayar estén en contacto entre sí mezclando las mismas (una etapa de puesta en contacto), una sustancia que se une directamente a dicho polipéptido y actúa sobre el mismo (a saber, un agente para tratar diabetes) se analiza identificando, mediante una espectrometría de masas, los compuestos separados desnaturalizando un complejo formado por la unión de dicha sustancia a ensayar y polipéptido después de su aislamiento (una etapa de analizar la unión) y después se selecciona una sustancia que se une al polipéptido para uso de herramienta (a saber, un agente para tratar diabetes). Como el método para analizar la unión se puede usar el método AS-MS que se ha mencionado anteriormente y similares. Ilustrativamente, se puede realizar, por ejemplo, del siguiente modo. En primer lugar, se deja que una célula para uso de herramienta en la que se expresa un polipéptido para uso de herramienta transformando una célula con un vector que comprende el polipéptido para uso de herramienta esté en contacto con una sustancia a ensayar. Un complejo del polipéptido para uso de herramienta y la sustancia a ensayar que se une al mismo se concentra de la célula que se ha mencionado anteriormente mediante un método de purificación por afinidad usando su afinidad por marcador GST, Flag, His o similares o un método de inmunoprecipitación o similares usando un anticuerpo que responde al polipéptido para uso de herramienta (por ejemplo, un anticuerpo anti-ATP5B o un anticuerpo de marcador). Es deseable que se contenga la misma sustancia a ensayar usada anteriormente para tratar la célula en el líquido de reacción de esta etapa de concentración. Las sustancias que no se unen a dicho polipéptido se eliminan por una resina de adsorción de compuesto de bajo peso molecular o similares y después, la sustancia de bajo peso molecular en el complejo se separa desnaturalizando el complejo obtenido de este modo del polipéptido para uso de herramienta y la sustancia a ensayar que se une al mismo con un ácido, calor u otra estimulación y se elimina la proteína remanente sola. Se selecciona una sustancia que se une al polipéptido para uso de herramienta de sustancias a ensayar identificando las sustancias contenidas en la misma muestra mediante el análisis de espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas. Ilustrativamente, en una condición de 1 \muM en concentración de la sustancia de ensayo a añadir, se selecciona una sustancia que tenga preferiblemente el 5% o más, más preferiblemente el 10% o más, aún más preferiblemente el 50% o más, como la cantidad total de dichas sustancias recuperadas a ensayar, en comparación con el control que no pasa por la etapa de adherirse y eliminar las sustancias a ensayar, como la sustancia que se une al polipéptido para uso de herramienta.

Método de exploración de inhibición competitiva que usa una célula para uso de herramienta

Permitiendo que se pongan en contacto una célula para uso de herramienta y una sustancia a ensayar entre sí en coexistencia de biguanida se puede examinar si la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida está inhibida competitivamente o no por dicha sustancia a ensayar y la sustancia a ensayar y el polipéptido para uso de herramienta están unidas entre sí. Ilustrativamente, un complejo del polipéptido de la presente invención y la biguanida que se une al mismo se concentra de una célula en coexistencia de biguanida mediante el mismo proceso del <Método de exploración de ensayo de unión que usa una célula para uso de herramienta> que se ha mencionado anteriormente. Posteriormente, se analiza la unión del polipéptido para uso de herramienta y una sustancia a ensayar. El análisis de la unión se puede realizar mediante el mismo método descrito en el <Método de exploración de inhibición competitiva que usa un polipéptido para uso de herramienta> que se ha mencionado anteriormente. Por ejemplo, en el caso del uso de biguanida modificada con un marcador o similares, se puede realizar determinando la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida usando el ensayo de unión conocido de forma convencional o método similar. Cuando la unión del polipéptido para uso de herramienta y biguanida estaba obstruida por la presencia de una sustancia a ensayar, se puede considerar que la unión de biguanida y el polipéptido para uso de herramienta estaba inhibida competitivamente por la sustancia a ensayar y el polipéptido para uso de herramienta y la sustancia a ensayar estaban unidos entre sí.

Es deseable que el método de exploración de la presente invención comprenda además una etapa, después de analizar la unión del polipéptido para uso de herramienta y una sustancia a ensayar y seleccionar la sustancia que se une al polipéptido para uso de herramienta, de verificar la activación de AMPK por la sustancia seleccionada a ensayar y/o un etapa de verificar su posesión de actividad para tratar diabetes.

La etapa de verificar la activación de AMPK por la sustancia seleccionada se puede realizar, por ejemplo, del siguiente modo. Se cultiva una célula que expresa el polipéptido para uso de herramienta (por ejemplo, célula HeLaS3) después de añadir una sustancia a ensayar o un control de vehículo a la misma. Usando un lisado celular preparado lisando las células cultivadas se detecta el nivel de fosforilación (a saber, el nivel de activación) de AMPK intracelular mediante electroforesis de SDS conocida de forma convencional y transferencia de Western que usa un anticuerpo anti-AMPK con fosforilación (por ejemplo, anticuerpo de fosfo-AMPK-\alpha (Thr 172) fabricado por Daiichi Pure Chemicals. Preferiblemente, se puede verificar la activación de AMPK por la sustancia seleccionada mediante el método del Ejemplo 5(7). Mediante la comparación con el control se selecciona una sustancia que acelera la fosforilación de AMPK como una sustancia que activa AMPK. Como la sustancia que acelera la fosforilación de AMPK se selecciona una sustancia que acelera la fosforilación de AMPK en un factor del 50%, preferiblemente del 70%, más preferiblemente del 90% o más, en comparación con el control.

Como la etapa de verificar la posesión de actividad para tratar diabetes por la sustancia seleccionada se puede ilustrar una etapa de realizar un método de evaluación conocido de forma convencional, por ejemplo, un método para analizar el efecto para tratar diabetes de una sustancia seleccionada como se muestra a continuación. La presencia o ausencia del efecto para tratar diabetes se determina administrando continuamente un compuesto seleccionado por el método de exploración de la presente invención a un animal de modelo de diabetes y verificando su acción hipoglucemiante a demanda de acuerdo con el modo habitual o realizando la verificación de la acción supresora de la hiperglucemia después del ensayo de tolerancia a glucosa oral. Alternativamente, su analiza su efecto para tratar diabetes de tipo II midiendo la resistencia a insulina del ser humano y usando la mejora del valor como el índice. La resistencia a insulina en el ser humano se mide principalmente mediante dos métodos. Uno es medir el nivel de glucosa en sangre y la concentración de insulina después del ayuno y el otro es un método denominado ensayo de tolerancia a glucosa, en el que se administra por vía oral un líquido con glucosa y se comprueba su proporción de aclaramiento del torrente sanguíneo. Además, se puede ejemplificar un método de pinzamiento hiperinsulinémico euglucémico como un método más preciso. Este método se basa en la teoría de que la insulina y la glucosa en sangre se mantienen en ciertas concentraciones y mide periódicamente la cantidad total del líquido con glucosa administrado y la concentración de insulina usada para su metabolismo ("Tonyobyo (Diabetes)" O. Nakagawa 1999 vol. 42 (2): páginas 111 -113). La posesión de actividad para tratar diabetes por la sustancia seleccionada se puede verificar preferiblemente mediante el método descrito en el Ejemplo 7.

Aunque no se limitan particularmente, los ejemplos de la sustancia de ensayo a usar en el método de exploración de la presente invención incluyen compuestos disponibles en el mercado (incluyendo péptidos), diversos compuestos conocidos de forma convencional (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, un grupo de compuestos obtenidos por las técnicas de química de combinación (N. Terrett et al., Drug Discov. Today, 4(1): 41, 1999), sobrenadantes de cultivo microbiano, componentes naturales obtenidos de plantas y organismos marinos, extractos de tejidos animales o compuestos (incluyendo péptidos) preparados modificando química o biológicamente compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados por el método de exploración de la presente invención.

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Composición farmacéutica para uso para el tratamiento de diabetes, método para tratar diabetes y uso de una sustancia para producir la composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de la diabetes

Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de la diabetes puede comprender una sustancia obtenida mediante el método de exploración de la presente invención [por ejemplo, ADN, una proteína (incluyendo anticuerpo o fragmento de anticuerpo), un péptido o un compuesto diferente de eso] como el ingrediente activo. Además, un método para tratar diabetes puede comprender administrar una sustancia obtenida mediante el método de exploración de la presente invención a una dosis eficaz a un objeto que requiere tratamiento de diabetes. Además, se puede usar una sustancia obtenida mediante el método de exploración de la presente invención para producir una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de diabetes. El ingrediente activo en la composición farmacéutica se puede seleccionar mediante el método de exploración de la presente invención. Como el compuesto seleccionado por el método de exploración de la presente invención se puede ilustrar el 2-[(E)-(1H-1,2,4-triazol-3-ilimino)metil]fenol y 6-cloro-9H-purina-2-amina descritos en los Ejemplos 6(2) y 7, que se describen más adelante. En este contexto, se puede realizar la verificación de la presencia del efecto para tratar diabetes usando un método convencional conocido por los expertos en la materia o un método modificado del mismo (compárese, la "etapa de verificar que la sustancia seleccionada tiene actividad para tratar diabetes" que se ha mencionado anteriormente). Las preparaciones farmacéuticas para el uso en el tratamiento de diabetes, que comprenden una sustancia obtenida por el método de exploración de la presente invención [por ejemplo, ADN, proteína (incluyendo anticuerpo o fragmento de anticuerpo), un péptido o un compuesto diferente de eso] como el ingrediente activo se pueden preparar como composiciones farmacéuticas en respuesta al tipo del ingrediente activo que se ha mencionado anteriormente, usando vehículos, cargas y/u otros agentes aditivos farmacológicamente aceptables que se usan generalmente para preparar las mismas. Como la administración, se puede ilustrar la administración oral por comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, polvo muy fino, polvos, soluciones para uso oral o similares o administración parenteral mediante inyecciones para inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intra-articular o similares, supositorios, preparaciones para administración percutánea, preparaciones para administración a través de la mucosa o similares. Particularmente en el caso de péptidos que se digieren en el estómago es deseable la inyección intravenosa o la administración parenteral similar. En la composición sólida para uso en la administración oral se pueden mezclar una o más sustancias activas con al menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona, silicato de magnesio de aluminio o similares. De acuerdo con el modo habitual, la composición que se ha mencionado anteriormente puede contener otros aditivos diferentes del diluyente inerte, tales como un lubricante, un agente disgregante, un agente estabilizante, un agente solubilizante o de ayuda a la solubilización o similares. Cuando la ocasión lo demande se pueden recubrir los comprimidos o las píldoras con un recubrimiento de azúcar o con una película de una sustancia gástrica o enteral o similares. La composición líquida para administración oral puede incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o similares y puede contener un diluyente inerte usado de forma general tal como agua purificada o etanol. Además del diluyente inerte, la composición que se ha mencionado anteriormente puede contener otro agente aditivo tal como un agente humectante, un agente de suspensión, un edulcorante, un agente aromático o un antiséptico. Las inyecciones para administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas asépticas, suspensiones o emulsiones. Las soluciones o suspensiones acuosas pueden incluir agua destilada para inyección, solución salina fisiológica o similares como un diluyente. Las soluciones y suspensiones no acuosas pueden incluir propilenglicol, polietilenglicol, un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva), un alcohol (por ejemplo, etanol), polisorbato 80 o similares como el diluyente. La composición que se ha mencionado anteriormente puede contener además un agente humectante, un agente emulsionante, un agente dispersante, un agente estabilizante, un agente solubilizante o de ayuda a la solubilización, un antiséptico o similares. Las composiciones que se han mencionado anteriormente se pueden esterilizar mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, combinando un germicida o irradiación. Alternativamente, se pueden usar produciendo en primer lugar composiciones sólidas estériles y disolviendo las mismas en agua estéril u otro medio estéril para inyección antes de su uso. La dosis se puede decidir opcionalmente teniendo en cuenta la potencia de la actividad de la sustancia obtenida por el método de exploración de la presente invención, síntomas, edad, sexo y similares de cada objeto al que realizar la administración. Por ejemplo, en el caso de la administración oral, la dosis generalmente es de aproximadamente 0,1 a 100 mg, preferiblemente de 0,1 a 50 mg por día por adulto (60 kg en peso corporal). En el caso de la administración parenteral en forma de inyecciones, es de 0,01 a 50 mg, preferiblemente de 0,01 a 10 mg.

Ejemplos

A continuación se describe la presente invención con detalle basándose en los ejemplos, pero la presente invención no está restringida por dichos ejemplos. En este contexto, a menos que se indique de otro modo, se pueden realizar de acuerdo con los métodos conocidos de forma convencional ("Molecular Cloning" Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y similares). Además, cuando se usan reactivos y kits disponibles en el mercado se pueden realizar de acuerdo con las instrucciones adjuntas a los artículos en el mercado.

Ejemplo 1 Construcción de proteína de chaperona molecular (1) Clonación de gen de chaperona molecular y preparación de plásmido de expresión de proteína de chaperona molecular de fusión con GST

Usando oligonucleótidos representados por las SEC ID Nº: 28 a 77 (números pares para el lado 5', números impares para el lado 3') como cebadores (por ejemplo, un conjunto de cebador para HSPA1A humano por la SEC ID Nº: 28 y la SEC ID Nº: 29, lo mismo se debe aplicar en lo sucesivo en este documento), se prepararon secuencias de ADNc que codifican las regiones de longitud completa de 25 especies de proteínas de chaperona (HSPA1A humano, HSPH1 humano, HSPCA humano, HSPD1 humano, DNAJA1 humano, HSPB1 humano, HSPE1 humano, HSPA4 humano, HSP90B1 humano, CCT6B humano, TCP1 humano, HSPA14 humano, HSPA9B humano, STCH humano, HYOU1 humano, HSPB5 humano, HSPB2 humano, DNAJA2 humano, DNAJB1 humano, DNAJB2 humano, HCG3 humano, DNAJB11 humano, DNAJC11 humano, DNAJC7 humano, DNAJC6 humano), representadas por las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27 realizando PCR usando una ADN polimerasa (Pyrobest DNA polymerase, Takara Shuzo) en condiciones de 3 minutos de reacción de desnaturalización térmica a 95ºC, 35 repeticiones posteriores de un ciclo que consiste en 10 segundos a 98ºC, 30 segundos a 60ºC y 1 minuto y 30 segundos a 74ºC y calentamiento final a 74ºC durante 7 minutos, usando los moldes respectivos; una genoteca de ADNc obtenida de hígado humano (Clontech) para HSPH1, HSPE1, HSP90B1, HSPA9B y DNAJC11, una genoteca de ADNc obtenida de cerebro humano (Clontech) para HSPCA, HSPA1A y HSPD1, una genoteca de ADNc obtenida de célula HeLa (Clontech) para DNAJA1 y HSPA4, una genoteca de ADNc obtenida de glándula mamaria humana (Clontech) para HSPB1, una genoteca de ADNc obtenida de músculo esquelético humano (Clontech) para TCP1, HSPA14, HYOU1 y HSPB2 y muestras de ADNc disponibles en el mercado (Ultimate TM ORF Clones, lnvitrogen) para CCT6B, STCH, HSPB5, DNAJA2, DNAJB1, DNAJB2, HCG3, DNAJB11, DNAJC7 humano y DNAJC6 humano. Se obtuvieron los fragmentos de ADN formados de este modo de aproximadamente 2,58 kpb (HSPH1), 2,2 kpb (HSPCA), 1,93 kpb (HSPA1A), 1,72 kpb (HSPD1), 1,19 kpb (DNAJA1), 0,62 kpb (HSPB1), 0,3 kpb (HSPE1), 2,52 kpb (HSPA4), 2,41 kpb (HSP90B1), 2,04 kpb (HSPA9B), 1,69 kpb (DNAJC11), 1,67 kpb (TCP1), 1,05 kpb (HSPA14), 3,0 kpb (HYOU1), 0,53 kpb (HSPB2), 1,59 kpb (CCT6B), 1,42 kpb (STCH), 0,53 kpb (HSPB5), 1,24 kpb (DNAJA2), 1,02 kpb (DNAJB1), 0,98 kpb (DNAJB2), 0,44 kpb (HCG3), 1,077 kpb (DNAJB11), 1,46 kbp (DNAJC7 humano) y 2,74 kbp (DNAJC6). De las secuencias contenidas en los cebadores, cada una de las muestras de ADNc se diseñó de tal modo que se añaden los siguientes sitios de enzima de restricción a ambos extremos de las mismas, se añaden el sitio BglII y XhoI en el caso del ADNc de HSPH1 y el sitio EcoRV y sitio NotI en el caso del ADNc de HSPA4, el sitio EcoRI y sitio XhoI en el caso del ADNc de STCH, HSPB5, DNAJC6 y DNAJC11, el sitio BglII y sitio NotI en el caso del ADNc de TCP1 y el sitio BamHI y sitio NotI en el caso de ADNc de DNAJA2. En el caso de otras moléculas de ADNc, se diseñaron de tal forma que se añaden el sitio BglII y el sitio XhoI. Para insertar estas moléculas de ADNc en un vector de expresión de fusión con GST pGEX-6P-1 (Amersham Bioscience), cada uno de los fragmentos de ADNc obtenidos mediante la reacción de PCR que se ha mencionado anteriormente se digirieron respectivamente en los sitios de enzima de restricción añadidos respectivamente. 1) En el caso del ADNc digerido con BamHI (o BglII) y XhoI, el vector se usó preparando el mismo en una forma lineal mediante su digestión con las enzimas de restricción BamHI y XhoI y 2) en el caso del ADNc digerido con las enzimas de restricción EcoRV y NotI, el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción SmaI y NotI, 3) en el caso del fragmento de ADNc digerido con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI, el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y 4) en el caso del fragmento de ADNc digerido con las enzimas de restricción BamHI y NotI, el vector se usó tratando el mismo con las enzimas de restricción BamHI y NotI, respectivamente. Una mezcla de cada uno de los fragmentos de ADNc de chaperona tratados con enzima de restricción y el vector se mezcló con un líquido de ADN ligasa (kit de ligación de ADN II; Takara Shuzo) y se trató a 16ºC durante 3 horas, preparando de este modo un plásmido en el cual cada ADNc de chaperona se insertó en el sitio de clonación múltiple de pGEX-6P-1. Realizando la determinación de las secuencias de nucleótidos usando el oligonucleótido mostrado en la SEC ID Nº: 86 como el cebador y usando un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700, Applied Biosystems), se seleccionaron respectivamente las que son las respectivas secuencias de nucleótidos descritas (números de acceso de RefSeq NM_005345, NM_006644, NM_005348, NM_199440, NM_001539, NM_001540, NM_002157, NM_002154, NM_003299, NM_006584, NM_030752, NM_016299, NM_005347, NM_006948, NM_006389, NM_001885,
NM_001541, NM_005880, NM_006145, NM_006736, NM_001001394, NM_016306, NM_018198, NM_003315, NM_014787) y en las que se insertaron simultáneamente la región codificante de cada ADNc de chaperona molecular y la fase de traducción de marcador GST del vector pGEX.

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(2) Purificación de proteína de chaperona molecular de fusión con GST

Un grupo de plásmidos de expresión de fusión con GST obtenidos en (1) que se ha mencionado anteriormente preparados por clonación de 25 especies de chaperona molecular se transfirieron respectivamente a Escherichia coli BL 21 (Takara Bio) mediante su transformación con un método de choque térmico. Después de cultivo con agitación durante una noche usando 2,4 ml de un líquido de cultivo, todo su volumen se transfirió a 400 ml del líquido de cultivo y se cultivó a 37ºC durante 3 horas en un agitador y después se añadió a esto IPTG (Sigma) hasta una concentración final de 2,5 mM y el cultivo con agitación se realizó adicionalmente durante 3 horas para inducir las respectivas proteínas de chaperona de fusión con GST (en lo sucesivo en este documento, denominadas respectivamente GST-HSPA1A (aproximadamente 96 kDa), GST-HSPH1 (aproximadamente 123 kDa), GST-HSPCA (aproximadamente 111 kDa), GST-HSPD1 (aproximadamente 87 kDa), GST-DNAJA1 (aproximadamente 71 kDa), GST-HSPB1 (aproximadamente 59 kDa), GST-HSPE1 (aproximadamente 37 kDa), GST-HSPA4 (aproximadamente 120 kDa), GST-HSP90B1 (aproximadamente 118 kDa), GST-HSPA9B (aproximadamente 100 kDa), GST-DNAJC11 (aproximadamente 89 kDa), GST-TCP1 (aproximadamente 86 kDa), GST-HSPA14 (aproximadamente 81 kDa), GST-HYOU1 (aproximadamente 137 kDa), GST-HSPB2 (aproximadamente 46 kDa), GST-CCT6B (aproximadamente 84 kDa), GST-STCH (aproximadamente 78 kDa), GST-HSPB5 (aproximadamente 46 kDa), GST-DNAJA2 (aproximadamente 72 kDa), GST-DNAJB1 (aproximadamente 64 kDa), GST-DNAJB2 (aproximadamente 62 kDa), GST-HCG3 (aproximadamente 43 kDa), GST-DNAJB11 (aproximadamente 67 kDa), GST-DNAJC7 (aproximadamente 81 kDa) y GST-DNAJC6 (aproximadamente 125 kDa)) (los números entre paréntesis son respectivamente pesos moleculares esperados). Las células se recuperaron y cada proteína de chaperona molecular de fusión con GST se purificó en perlas de glutatión Sepharose de acuerdo con el método de arrastre con GST conocido de forma convencional. Como el control, una proteína del resto de marcador GST sola (a denominar en lo sucesivo en este documento proteína GST; peso molecular esperado aproximadamente 26 kDa) se indujo por expresión del Escherichia coli BL 21 transformado con pGEX-6P-1 y se purificó, del mismo modo como se ha descrito anteriormente. Realizando la separación por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y tinción con Azul Brillante de Coomassie de acuerdo con los métodos conocidos de forma convencional, se confirmó que se purificaron las respectivas proteínas que tenían el peso molecular esperado.

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Ejemplo 2 Detección de receptor de estrógenos como la proteína diana de 17-\beta-estradiol (1) Clonación de gen de receptor de estrógenos y preparación de plásmido de expresión de receptor de estrógenos de fusión con marcador V5

Un ADNc de gen que codifica la región de longitud completa del receptor de estrógenos \alpha (a denominar en lo sucesivo en este documento ER\alpha) como una especie de los receptores de hormona esteroidea mostrado por una base de datos conocida de forma convencional se clonó usando dos especies de cebadores de ADN (SEC ID Nº: 78 y SEC ID Nº: 79) diseñados de acuerdo con la secuencia mostrada por el número de acceso de RefSeq NM_000125. Ilustrativamente, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,78 kpb que codificaba la región de longitud completa de ER\alpha realizando la PCR usando un conjunto de cebadores de la SEC ID Nº: 78 y la SEC ID Nº: 79 y usando una genoteca de ADNc obtenida de célula HeLa (Clontech) como el molde. La reacción de PCR se realizó a 98ºC (1 minuto) y 35 repeticiones posteriores de un ciclo que consiste en 98ºC (5 segundos), 55ºC (30 segundos) y 72ºC (5 minutos), usando una ADN polimerasa (Pyrobest DNA Polymerase; Takara Shuzo). El fragmento de ADN obtenido de este modo se sub-clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1A/5-His-TOPO; Invitrogen) usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El cebador representado por la SEC ID Nº: 79 se diseñó de tal modo que un epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de la proteína V de SV5 de paramixovirus, Southern JA, J Gen. Virol. 72, 1551 - 1557, 1991) y un marcador His 6 (lindner P, BioTechniques 22, 140-149, 1997), excluyendo el codón de terminación, se continúan en la misma fase del triplete del gen de ER\alpha en el lado 3' después de la clonación. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido de este modo se determinó usando cebadores que se unen a la región promotora de T7 en el vector (kit TOPO TA Cloning; Invitrogen; SEC ID Nº: 89) y un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700; Applied Biosystems). Como resultado, se confirmó que el ADNc que codifica el ER\alpha humano mostrado por el número de acceso de RefSeq NM_000125 se inserta en el vector de expresión que se ha mencionado anteriormente pcDNA3.1/V5-His-TOPO. En lo sucesivo en este documento, este plásmido de expresión se denomina pcDNA-ER.

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(2) Preparación de célula de expresión de receptor de estrógenos humano y detección de proteína diana 17-\beta estradiol por el método de identificación de la presente invención

Usando reactivo Lipofect amine 2000 (Invitrogen), el pcDNA-ER que se ha mencionado anteriormente se transfirió de forma transitoria a una célula COS-7 (ATCC) cultivada en una placa de 10 cm hasta un estado del 70% de confluencia. Después de 30 horas de cultivo y retirada posterior del medio, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y después se lisaron añadiendo 1,0 ml de un tampón A (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, NP-40 al 0,5%). Este extracto celular se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos para retirar el precipitado y se recogió la fracción soluble del sobrenadante (en lo sucesivo en este documento, extracto celular de expresión de ER). El ER\alpha conocido como una proteína diana que muestra el efecto farmacológico de 17-\beta estradiol (a denominar E2 en lo sucesivo en este documento) (Green S. & P. Chambon Trends Genet. 1988 Nov; 4 (11): págs. 309 -314) está contenido en la fracción soluble de este extracto celular. Además, como un control, una fracción soluble de extracto celular de célula COS-7 no transferida (en lo sucesivo en este documento, extracto celular de COS-7 de control) se preparó del mismo modo. Se examinó si una proteína diana, ER, realmente se puede detectar o no mediante el método de identificación de la presente invención usando una proteína de chaperona, proteína HSPA4. Una porción de 1 \mug de proteína GST-HSPA4 o proteína GST (preparada en el Ejemplo 1(2) que se ha mencionado anteriormente) purificada en las perlas de glutatión Sepharose se mezcló con el extracto celular de expresión de ER que se ha mencionado anteriormente o extracto celular de COS-7 de control y se agitó a 4ºC durante 1 hora en una condición de añadir o no añadir 10 \muM de E2. Después de esto, la proteína que se une a la proteína GST-HSPA4 o GST en las perlas se co-precipitó por centrifugación. Esto se suspendió en el tampón A' que se ha mencionado anteriormente (un tampón preparado cambiando la concentración de NaCl en el tampón A a 100 mM) y se volvió a co-precipitar por centrifugación. Después de repetir esta operación 4 veces, las proteínas en el precipitado se separaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida de acuerdo con un método conocido de forma convencional y las cantidades de ER\alpha como la proteína diana de E2 se compararon por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-ER\alpha (MC-20; Santa Cruz). Como resultado (Figura 1), cuando se usó el extracto celular de expresión de ER, se detectó una banda de ER\alpha de aproximadamente 70 kDa, que no se detecta cuando se usa el extracto celular de COS-7 de control, en la condición de no adición de E2 (carril 5). Por otro lado, la banda de ER\alpha se detectó sólo ligeramente en la condición de E2 añadido (carril 6). Basándose en estos resultados, se demostró que la detección de la proteína diana de un agente a ensayar se puede detectar sin requerir la modificación del compuesto, comparando la proteína que se une a una proteína de chaperona molecular en el momento de añadir o de no añadir dicho agente a ensayar, en realidad, usando la proteína de chaperona molecular.

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(3) Detección de proteína diana de 17-\beta estradiol por el método de identificación de la presente invención

En el Ejemplo 2(2) descrito anteriormente, se demostró que la detección de la proteína diana de un agente a ensayar se puede detectar comparando la proteína que se une a una proteína de chaperona molecular en el momento de añadir o de no añadir dicho agente a ensayar, usando la proteína de chaperona molecular. En el siguiente ejemplo, se confirmó que el método de identificación de la presente invención es útil incluso cuando se usan chaperonas moleculares diferentes de la usada en el Ejemplo 2(2). Es decir, en este Ejemplo (3), se examinó si la proteína diana ER se puede detectar o no en realidad mediante el método de identificación de la presente invención del mismo modo que en el ejemplo 2(2) usando las 25 especies de proteínas de chaperona del Ejemplo 1(2). El ensayo se realizó del mismo modo que en el Ejemplo 2(2), excepto porque se usó una mezcla en la que las 25 especies que se han mencionado anteriormente de proteínas de fusión con GST (Ejemplo 1(2)) se dividieron en 3 grupos de 8 ó 9 especies de acuerdo con su peso molecular y se mezclaron en porciones de 0,2 \mug, en lugar del uso de proteína HSPA4 como la proteína de chaperona o 1,4 \mug de proteína GST y porque se realizó transferencia de Western usando un anticuerpo anti-V5 (Invitrogen) que reconoce el epítopo V5 fusionado a ER y las intensidades de señal de las bandas obtenidas de este modo se convirtieron en números como valores medidos de la densidad por área unitaria usando el sistema de formación de imágenes VersaDoc (Bio-Rad). Los detalles de las 8 ó 9 especies mezcladas de proteínas de chaperona de fusión con GST son 3 grupos; un grupo en el que se mezcló un grupo de chaperonas que tenían pesos moleculares relativamente altos, GST-HSPH1, GST-HSPA4, GST-HSPCA, GST-HYOU1, GST-DNAJC6, GST-HSP90B1, GST-HSPA9B y GST-DNAJC11, un grupo en el que se mezcló un grupo de chaperonas que tenía un grado medio de pesos moleculares, GST-HSPA1A, GST-HSPD1, GST-DNAJA1, GST-TCP1, GST-CCT6B, GST-HSPA14, GST-DNAJC7 y GST-STCH y un grupo en el que se mezcló un grupo de chaperonas que tenían pesos moleculares relativamente bajos, GST-HSPB1, GST-HSPE1, GST-DNAJA2, GST-DNAJB11, GST-DNAJB1, GST-DNAJB2, GST-HSPB2, GST-HSPB5 y GST-HCG3. Como resultado (Tabla 1), en cada caso del uso de los grupos de mezcla de proteína de chaperona se detectó una banda de ER\alpha de aproximadamente 70 kDa, que no se detecta cuando se usa el extracto celular de COS-7 de control, del extracto celular de expresión de ER, en la condición de no adición de E2, y la banda de ER\alpha se detectó sólo ligeramente en la condición de E2 añadido. El ER(L), ER(M) y ER(H) en la tabla muestran los resultados del uso del grupo que se ha mencionado anteriormente de chaperonas que tienen pesos moleculares relativamente bajos, un grupo de chaperonas que tienen un grado medio de pesos moleculares y un grupo de chaperonas que tienen pesos moleculares relativamente altos, respectivamente. Basándose en estos resultados, se confirmó que la detección de la proteína diana de un agente a ensayar se puede detectar comparando la proteína en el momento de añadir o de no añadir dicho agente a ensayar, incluso cuando se usa simultáneamente una gran diversidad de proteínas de chaperona molecular.

A continuación se muestra que fue posible identificar diversas proteínas diana de respectivos agentes mediante el método de identificación de la presente invención usando diversas chaperonas moleculares, en el Ejemplo 3, Ejemplo 4 y Ejemplo 8. Con respecto a los que no se describieron con detalle en cada ejemplo se realizaron ensayos de acuerdo con el Ejemplo 2 que se ha mencionado anteriormente. En este contexto, las intensidades de señal de las bandas obtenidas por la transferencia de Western se convirtieron en números como valores medidos de la densidad por área unitaria usando el sistema de formación de imágenes VersaDoc (Bio-Rad).

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Ejemplo 3 Método de identificación de la presente invención usando diversas chaperonas moleculares

Se conoce que FKBP 12 es una de las proteínas diana de FK 506 y FK 1706 (J. Biol. Chem. 1993 Nov 5; 268 (31): 22992 - 22999, Eur. J. Pharmacol. 2005 Feb 10; 509 (1): 11 -19). Se conoce que el receptor de glucocorticoides (en lo sucesivo en este documento GR) como una especie de receptores de hormona esteroidea humana es una proteína diana que muestra el efecto farmacológico de dexametasona (J. Clin. Invest. 1995 Jun; 95 (6): 2435 - 2441). Se conoce que la deshidrofolato reductasa humana (a denominar en lo sucesivo en este documento DHFR) es una proteína diana que muestra el efecto farmacológico de metotrexato (en lo sucesivo en este documento MTX) (J. Med. Chem. 2000 Oct 19; 43 (21): 3852-3861). El receptor de andrógenos (en lo sucesivo en este documento AR), que se conoce como la proteína diana de 5a-dihidrotestosterona (en lo sucesivo en este documento DHT) (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1993 Dec; 46 (6): 699 - 711) está contenido en la fracción soluble de una célula obtenida de próstata humana, célula LNCaP (ATCC). El receptor de mineralocorticoides (en lo sucesivo en este documento MR), que se conoce como la proteína diana de aldosterona (Science 1987 Jul 17; 237 (4812): 268 - 275), está contenido en la fracción soluble de una célula obtenida de vaso sanguíneo humano, HUVEC (ATCC).

Mediante la preparación de las siguientes respectivas fracciones solubles de extracto celular se puede detectar si las proteínas diana que se han mencionado anteriormente de respectivos agentes están presentes en dichas fracciones solubles de extracto celular mediante el método de identificación de la presente invención usando los respectivos grupos de proteína de chaperona. En este contexto, entre los agentes, se sintetizaron FK 506 (documento JP-B-03-038276) y FK 1706 (Patente Europea Nº 346.427) y se usaron otros agentes adquiridos en Sigma. Cada una de las bandas de FKBP 12, GR y DHFR se detectó mediante la transferencia de Western usando un anticuerpo que reconoce el marcador V añadido a las respectivas proteínas diana del mismo modo en el Ejemplo 2(3) que se ha mencionado anteriormente y las bandas de AR y MR mediante la transferencia de Western usando anticuerpos disponibles en el mercado (N-20 y C-19, Santa Cruz).

(a): Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 (ATCC) en la que se sobre-expresó un ADNc génico que codifica la región de longitud completa de FKBP 12 humano (número de acceso de RefSeq NM_054014) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de FKBP 12)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas de chaperona; GST-HSPH1, GST-HSPA4, GST-HSPCA, GST-HYOU1, GST-DNAJC6, GST-HSP90B1, GST-HSPA9B, GST-HSPA1A y GST-DNAJC11.

(b): Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 en la que se sobre-expresó un ADNc de gen que codifica la región de longitud completa de GR (número de acceso de RefSeq NM_001024094) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de GR)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas de chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4.

(c): Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa S3 en la que se sobre-expresó un ADNc de gen que codifica la región de longitud completa de DHFR (número de acceso de RefSeq NM_000791) (a denominar en lo sucesivo en este documento extracto celular de expresión de DHFR)/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteína chaperona; GST-HSPD1, GST-DNAJA1, GST-HSPB1 y GST-HSPE1

(d): Fracción soluble de LNCaP/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4

(e): Fracción soluble de HUVEC/un grupo mixto de proteínas respectivas de proteínas chaperona; GST-HSPA1A, GST-HSPH1, GST-HSPCA y GST-HSPA4

(f): Fracción soluble de extracto celular de célula HeLa (en lo sucesivo en este documento, extracto de célula HeLa de control; control de (a) a (c) que se ha mencionado anteriormente)

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Como resultado (Tabla 1), cuando se usaron el extracto celular de expresión de FKBP 12, el extracto celular de expresión de GR y el extracto celular de expresión de DHFR, se detectaron las bandas de FKBP 12, GR y DHFR que no se detectan cuando se usa el extracto celular de HeLa de control de forma más clara en la condición añadida de cada agente, en comparación con la condición no añadida. Además, se detectó la banda de AR más claramente en la condición no añadida de DHT y se detectó la banda de MR más claramente en la condición añadida de aldosterona. Basándose en estos resultados, se confirmó, de manera similar al caso del Ejemplo 2, que la proteína diana de los agentes a ensayar se puede detectar comparando proteínas que se unen a proteínas de chaperona molecular en el momento de añadir o de no añadir dichos agentes a ensayar mediante el uso de diversas proteínas de chaperona molecular.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Ejemplo 4 Identificación de proteína diana de biguanida usando chaperona molecular

Usando el método que se ha mencionado anteriormente mostrado en el Ejemplo 2(2), se realizó un intento de explorar la proteína diana de biguanida cuya proteína diana directa no ha estado clara a pesar de su efecto farmacológico significativo como un agente para tratar diabetes. En primer lugar se suspendió una célula obtenida de músculo esquelético de rata, célula L 6 (ATCC) en un medio esencial mínimo (\alphaMEM, Invitrogen) que contenía suero fetal de ternero al 10% (FCS) y se cultivó en una placa recubierta con colágeno de 15 cm de diámetro (Asahi Techno Glass) hasta alcanzar el estado confluente. Las células resultantes se lavaron dos veces con 15 ml de tampón fosfato (PBS) enfriado con hielo y después se lisaron añadiendo 2,0 ml del tampón que se ha mencionado anteriormente A y se recogió el extracto celular usando un rascador. Este extracto celular se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar el precipitado y se recogió la fracción soluble del sobrenadante. La fenformina (Sigma), que es una especie de biguanida y cuya acción hipoglucemiante se ha reconocido clínicamente (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group: The Lancet, 352, 854 (1998)) se añadió a la fracción soluble de este extracto celular hasta una concentración final de 50 \muM, o no se añadió a esto, y en tal condición, se realizó el ensayo de arrastre añadiendo 1 g de la proteína GST-HSPA4 purificada en las perlas de glutatión Sepharose del mismo modo que en el Ejemplo 2(2) que se ha mencionado anteriormente. Después de 1 hora de agitación a 4ºC, la proteína que se une a GST-HSPA4 en las perlas se co-precipitó por centrifugación. En este contexto, para evitar la salida de la proteína de chaperona molecular de las perlas, la proteína de chaperona molecular y las perlas se usaron reticulando las mismas químicamente de antemano mediante un método conocido de forma convencional. Ilustrativamente, la proteína GST-HSPA4 purificada en las perlas de glutatión Sepharose se lavó con solución de borato sódico 0,2 M y después se trató a 4ºC durante 45 minutos suspendiendo en DMP 20 mM. Después de lavar esto con solución de monoetanolamina 0,2 M para detener la reacción, esto se lavó añadiendo solución de glutatión 20 mM para eliminar la proteína de chaperona molecular no reticulada y se usó la sustancia resultante como la sonda. Después de co-precipitar la proteína que se une a GST-HSPA4, esto se suspendió en el tampón A' que se ha mencionado anteriormente al que se añadió o no se añadió 50 \muM de concentración final de fenformina y se volvió a co-precipitar por centrifugación. Después de repetir esta operación 4 veces, las proteínas en el precipitado se separaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida, de acuerdo con un método conocido de forma convencional y las proteínas se detectaron mediante un método de tinción con plata conocido de forma convencional. Como resultado, se detectó una gran banda de proteína de aproximadamente 60 kDa, en la que su cantidad de unión a la proteína de chaperona molecular está reducida en el momento de añadir fenformina en comparación con el caso de ninguna adición. Se considera que dicha proteína es una de la proteína diana de fenformina, cuya estructura terciaria cambia por la adición de fenformina. Por tanto, esta banda se recortó, la proteína se digirió hasta fragmentos usando tripsina y la mezcla de péptidos formada de este modo se recuperó del gel para realizar la identificación de la proteína mediante análisis de espectro de masas de acuerdo con el método conocido de forma convencional (Schevchenko, et al., Analytical Chemistry, Vol. 68, páginas 850 a 858, 1996). Como resultado, se puso de manifiesto que la proteína en dicha banda es ATP5B (número de acceso de RefSeq NP_599191).

Ejemplo 5 Inspección de la unión de ATP5B y biguanida y respuesta a biguanida de ATP5B (1) Clonación de gen de ATP5B humana y preparación de plásmido de expresión de ATP5B humana

En primer lugar, se realizó la clonación del gen de ATP5B humana. Mediante la síntesis de los cebadores representados por la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 81 y usando dichos cebadores se realizó un intento de amplificar el ADNc de longitud completa de ATP5B humana de una genoteca de ADNc obtenida de músculo esquelético humano (Clontech) por PCR. La reacción de PCR se realizó usando una ADN polimerasa (TAKARA LA Taq; Takara Shuzo), calentando a 94ºC (3 minutos) y después repitiendo 35 veces un ciclo que consistía en 94ºC (30 segundos), 58ºC (1,5 minutos) y 72ºC (4 minutos) y se realizó de nuevo la PCR usando el producto de PCR como el molde en las mismas condiciones. Como resultado de separar el producto de PCR por una electroforesis en gel de agarosa, se confirmó que se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1600 pares de bases. Por consiguiente, el mismo fragmento de ADN en el líquido de reacción se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1/V5-His-TOPO; Invitrogen) usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El cebador usado en este caso, representado por la SEC ID Nº: 81, se diseñó para excluir la secuencia de codón de terminación de ATP5B humana de tal forma que un epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de la proteína V de SV5 de paramixovirus, Southern J. A., J. Gen. Virol. 72,1551 - 1557, 1991) se continúa con el triplete génico de ATP5B humana en la misma fase en el lado 3' después de la clonación. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido de este modo se determinó usando cebadores que se unen a la región promotora de T7 en el vector (kit TOPO TA Cloning; Invitrogen, SEC ID Nº: 89) y un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700; Applied Biosystems). Como resultado, se confirmó que esto es un clon que comprende la secuencia de ADNc de longitud completa para ATP5B humana mostrada por la SEC ID Nº: 1. En lo sucesivo en este documento, este plásmido de expresión se denomina pcDNA-ATP5B. Se inspeccionó mediante el siguiente ensayo que la ATP5B, que se encontró mediante el método de identificación de la presente invención y se consideró que era una proteína diana de biguanida, es la proteína diana verdadera que produce la acción farmacológica (efecto principal) de biguanida. En este sentido, ya que todos los métodos convencionales para explorar proteínas diana de compuestos usan solamente la unión directa de un compuesto y una proteína como el índice, se obtiene un gran número de proteínas capaces de unirse a dicho compuesto, pero la probabilidad de encontrar una proteína relacionada en realidad con el efecto farmacológico del compuesto en general es baja. A diferencia de los métodos convencionales, el método de la presente invención intenta encontrar la diana de un compuesto usando un cambio estructural terciario de una proteína a la que se une el compuesto como el índice, de tal forma que se puede esperar necesariamente que la proteína encontrada de este modo no es una simple proteína de unión del compuesto, sino una molécula de proteína cuya función cambia en gran medida por dicho compuesto.

(2) Clonación de gen de DHFR y preparación de plásmido de expresión de DHFR de tipo fusión con GST

La DHFR que se ha descrito en el Ejemplo 3 que se ha mencionado anteriormente es una proteína cuya capacidad de unirse a MTX se conoce (Proc. Natl. Acad. Estados Unidos, vol. 87, Nº 8: págs. 2955-2959, 1990). Para usar en el siguiente ejemplo como la herramienta para detectar la unión bioquímica de ATP5B y biguanida, el ADNc de longitud completa del gen de DHFR humana (número de acceso de RefSeq NM_000791) se clonó en las mismas condiciones del Ejemplo 2(1) usando una genoteca de ADNc de linfocitos humanos (Clontech) como el molde y usando cebadores de las secuencias de nucleótidos representadas por la SEC ID Nº: 84 y la SEC ID Nº: 85. Después de clonar el fragmento de ADNc de DHFR obtenido de este modo de aproximadamente 560 pares de bases en pcDNA3.1/V5-His-TOPO, el fragmento de ADNc de DHFR se cortó usando los sitios de enzima de restricción BamHI y XhoI añadidos a ambos extremos de los cebadores que se han mencionado anteriormente. Al mismo tiempo, un vector de expresión de proteína de fusión con GST pGEX-6P-1 (Amersham) se convirtió a una forma de cadena recta digiriendo el mismo con las enzimas de restricción BamHI y XhoI. Una mezcla de ambas se mezcló con un líquido de ADN ligasa (kit de ligación de ADN II; Takara Shuzo) y se trató a 16ºC durante 3 horas, preparando de este modo un plásmido en el que el ADNc de DHFR se inserta en el sitio de clonación múltiple de pGEX-6P-1 (a denominar en lo sucesivo en este documento pGEX-DHFR). Realizando la determinación de la secuencia de nucleótidos del mismo modo que en el ejemplo que se ha mencionado anteriormente usando el oligonucleótido mostrado en la SEC ID Nº: 86 como el cebador, se seleccionó un plásmido en el que se insertaron simultáneamente la región codificante de ADNc de DHFR y la fase de traducción de marcador GST del vector pGEX.

(3) Expresión y purificación de proteína DHFR de tipo fusión con GST

El pGEX-DHFR preparado en el Ejemplo 5(2) descrito anteriormente se transfirió a Escherichia coli BL 21 mediante su transformación por un método de choque térmico. Después del cultivo con agitación durante una noche usando 2,4 ml de un líquido de cultivo, todo su volumen se transfirió a 400 ml del líquido de cultivo y se cultivó a 37ºC durante 3 horas en un agitador y después se añadió a esto IPTG (Sigma) hasta una concentración final de 2,5 mM y el cultivo con agitación se realizó adicionalmente durante 3 horas para inducir la expresión de una proteína de DHFR de fusión con GST (a denominar en lo sucesivo en este documento GST-DHFR). Las células se recuperaron, y el GST-DHFR se purificó en perlas de glutatión Sepharose de acuerdo con el método de arrastre con GST conocido de forma convencional. Como el control, una proteína del resto de marcador GST solo (a denominar en lo sucesivo en este documento proteína de GST) se indujo por la expresión del Escherichia coli BL 21 transformado con pGEX-6P-1 y se purificó, del mismo modo como se ha descrito anteriormente. Realizando la separación por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y tinción con Azul Brillante de Coomassie de acuerdo con los métodos conocidos de forma convencional, se confirmó que se purificó la proteína que tiene el peso molecular esperado (GST-DHFR, 45 kDa, GST proteína; 26 kDa).

(4) Unión bioquímica de biguanida y ATP5B

Usando la proteína GST-DHFR preparada en el Ejemplo 5(3) descrito anteriormente, se examinó la presencia o ausencia de unión bioquímica de biguanida y proteína ATP5B. Ilustrativamente, usando la propiedad de DHFR de unirse a metotrexato (MTX), se preparó un compuesto en el que se fusionó metotrexato con una parte de la estructura molecular de una especie de biguanida fenformina, diclorhidrato de ácido (2S)-5-[(3-{[{[amino(imino)metil]amino}(imino)metil]amino}propil)amino]-2-({4-[[(2,4-diaminopteridin-6-il)metil](metil)amino]benzoil}amino)-5-oxo-
pentanoico (a denominar en lo sucesivo en este documento MTX-fenformina), este compuesto se fijó al GST-DHFR purificado en perlas de glutatión Sepharose uniéndose a su resto de MTX y se verificó la presencia o ausencia de la unión con ATP5B en el lado sobresaliente de fenformina por el método de arrastre con GST. En primer lugar, se preparó el MTX-fenformina usando técnicas de síntesis orgánica conocidas de forma convencional de acuerdo con el siguiente esquema de reacción.

[Quím. 1]

2

Posteriormente, se examinó la unión de fenformina y ATP5B mediante el método de arrastre con GST usando el MTX-fenformina purificado que se ha mencionado anteriormente y proteína GST-DHFR. En primer lugar, usando 1,0 \mug del pcDNA-ATP5B que se ha mencionado anteriormente preparado en el Ejemplo 5(1) como el molde, se preparó proteína ATP5B humana marcada con radioisótopo mediante transcripción y traducción in vitro mezclando 40 \mul de un sistema TNT (TNT^{R} Quick Coupled Transcription/Translation System; Promega) y 0,74 MBq de un radioisótopo (redivue Pro-mix L-[35S]; Amersham) y se unió al mismo de acuerdo con los protocolos. Una porción de 15 \mul de esta preparación líquida de proteína de ATP5B humana y 1 \mug para cada una de la proteína GST o GST-DHFR, purificado en las perlas de glutatión Sepharose, se mezclaron y agitaron a 4ºC durante 1 hora después de añadir 0,3 ml de tampón A a lo mismo. Después de esto, la proteína que se une a la proteína GST o GST-DHFR en perlas se co-precipitó por centrifugación. Después de repetir esta operación 4 veces, las proteínas en el precipitado se separaron por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida de acuerdo con un método conocido de forma convencional y la proteína unida a la sonda se detectó por una autorradiografía. En todas las etapas de este ensayo, se añadieron 10 \muM en una concentración final del MTX-fenformina que se ha mencionado anteriormente o no se añadieron al tampón y se compararon los resultados. Como resultado, como se muestra en la Figura 1, se detectó in vitro una banda de proteína ATP5B humana de aproximadamente 60 kDa sintetizada in vitro en forma de unión al GST-DHFR, solamente en la condición de añadir el MTX-fenformina. Esta banda de proteína de ATP5B humana no se detectó cuando la proteína GST no se mezcló o en una condición de no añadir el MTX-fenformina. De este modo, se observó que la ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a fenformina.

(5) Predicción de sitio de unión de biguanida existente en la superficie de la molécula de ATP5B

A partir de los resultados del Ejemplo 5(4) que se ha mencionado anteriormente, se confirmó que la proteína ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a fenformina. Por consiguiente, se examinó si está presente o no una estructura de cerradura a la que se pueda unir la biguanida en la superficie de la molécula de proteína ATP5B en un ordenador basándose en los datos del análisis de estructura cristalina con rayos X de ATP5B bovina. Ilustrativamente, la predicción se realizó en una región (sitio) en la que se considera que la unión de biguanida es posible, en la superficie proteica de ATP5B como una de las subunidades de F1F0-ATP sintasa (F1 indica polímero extramembrana y F0 indica polímero intramembrana). Los datos de estructura cristalina se obtuvieron del "Banco de Datos de Proteína RCSB" como una ID de 1BMF. Están contenidas moléculas de heptámero (3 subunidades \alpha (cadenas A, B y C), 3 subunidades \beta (cadenas D, E y F) y 1 subunidad \gamma (cadena G)) de F1-ATP sintasa mitocondrial bovina (F1-ATPasa mitocondrial bovina) en el 1BMF. La ATP5B es la subunidad \beta de F1-ATPasa como la región extracelular de F1F0-ATP sintasa (Nature, 1997, 386: 299 - 302, Nature, 1994, 370 (6491): 621 - 628) y la ATP5B bovina tiene una identidad del 99% con ATP5B humana en términos de restos aminoacídicos (la ATP5B humana tiene 529 restos y la ATP5B bovina tiene 482 restos y ATP5B humana es más larga en 46 restos en el extremo N y en 1 resto en el extremo C). Entre las moléculas de heptámero de la F1-ATP sintasa mitocondrial bovina que se ha mencionado anteriormente, solamente la cadena De, que es ATP5B bovina y una de las subunidades \beta y la cadena A y la cadena C como subunidades \alpha adyacentes a la misma (a denominar en lo sucesivo en este documento complejo \alpha\beta\alpha) se usaron en el análisis. Ph4Dock, que es una función preparada en el software MOE (entorno de operación molecular) de Chemical Computing Group Inc. (CCG) se usó en el análisis. El Ph4Dock es una función para explorar automáticamente una estructura de complejo estable incluyendo su posición de unión usando un ordenador, proporcionando únicamente una estructura terciaria de un ligando y un receptor (J. Med Chem. 2004 Dec 30; 47 (27): 6804 -11). Proporcionando información estructural de metformina y fenformina, que son especies de biguanida e información estructural del complejo \alpha\beta\alpha usando esta función, se exploran sitios en el complejo \alpha\beta\alpha, a los que se unen estos compuestos. Los resultados de realizar la exploración de los sitios sobre la superficie de la molécula de proteína ATP5B bovina, que hacen posible la formación de un cuerpo de complejo estable por la unión de cada uno de metformina y fenformina y el complejo \alpha\beta\alpha, se muestran en la siguiente
Tabla 2.

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TABLA 2

3

4

La Tabla 2 muestra los sitios a los que se unen respectivamente la metformina y fenformina y los valores de energía de la unión en ese momento (U_ele + U_vdw). El sitio en la tabla indica el sitio de unión y los sitios de unión se numeran en orden de naturaleza hidrófoba mayor y superior por motivo de conveniencia. El U_ele representa la energía de interacción electrostática y el U_vdw, la energía van der Waals, respectivamente, y se dispusieron 20 candidatos y se inscribieron en orden de valores menores de U_ele + U_vdw. En el cálculo de la mecánica molecular, se usó el campo de fuerza mmff94s. En este caso, cuando se supuso que la metformina y fenformina usan la misma molécula como la diana medicinal, los sitios de unión a los que se unen metformina y fenformina en común son solamente el sitio 20 y el sitio 29. Además, ya que la ATP5B humana preparada en el Ejemplo 5(4) que se ha mencionado anteriormente realizando la transcripción y traducción in vitro se une a fenformina, se puede observar que ATP5B se puede unir a biguanida, no solamente en un estado de complejo sino también sola por sí misma. Por tanto, cuando se limita a un sitio en el que ATP5B por sí misma forma un sitio de unión, el sitio 20 en solitario permanece como el candidato. Basándose en lo anterior, se predijo que la metformina y fenformina se unen al sitio 20 del complejo \alpha\beta\alpha. Para inspeccionar la predicción que se ha descrito anteriormente, a saber, la unión directa de fenformina al sitio 20, se puede realizar encontrando el resto más importante para la unión de fenformina y mostrando experimentalmente que la capacidad de unión desaparece cuando el resto muta. Por consiguiente, cuando se observó unión de fenformina y el sitio 20, se predijo la presencia de 3 patrones de modo de unión como resultado. Se observó que se realiza un reconocimiento molecular cooperativo en cada uno de estos modos de unión por 3 restos de Glu 125, Glu 241 y Asp 245 (cada número muestra la posición del resto aminoacídico contando desde el lado amino-terminal de la molécula de ATP5B bovina) como restos aminoacídicos en la molécula de ATP5B. Por consiguiente, en realidad se preparó una ATP5B humana de tipo mutación de acuerdo con el método mostrado en el siguiente ejemplo, sustituyendo respectivamente Glu 175 y Asp 295 en la molécula de ATP5B humana, que se corresponde al Glu 125 y Asp 245 entre los 3 restos aminoacídicos que se han mencionado anteriormente de ATP5B bovina y se examinó su capacidad de unirse a fenformina.

(6) Preparación de plásmido de expresión de ATP5B humana de tipo mutación e inspección de la capacidad de unión de biguanida de la ATP5B humana de tipo mutación

Usando el plásmido de expresión que se ha mencionado anteriormente pcDNA-ATP5B como el molde y usando los respectivos conjuntos de cebadores de las secuencias de nucleótidos representadas por la SEC ID Nº: 87 y la SEC ID Nº: 81 y la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 88, dos fragmentos de ADN de aproximadamente 530 pares de bases del lado 5' y aproximadamente 1080 pares de bases de lado 3' de ADNc que tienen una mutación en la que la 175ª posición de aminoácido, Glu, de ATP5B humana estaba sustituida por Val, se amplificaron por PCR. La reacción de PCR, solución madre de clonación y determinación de la secuencia de nucleótidos eran iguales que los métodos mostrados en el Ejemplo 5(1). Usando una mezcla equivalente de los dos productos de PCR obtenidos de este modo como el molde, se realizó la PCR usando los cebadores representados por la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 81 esta vez, obteniendo de este modo un ADNc de longitud completa de aproximadamente 1600 pares de bases que codifica un ATP5B de tipo mutación Glu 175 Val. El fragmento de ADNc obtenido de este modo se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1N5-His-TOPO, Invitrogen) y después, la secuencia de nucleótidos insertada en el vector se identificó usando el cebador sintético representado por la SEC ID Nº: 90 para confirmar que se formó la mutación Glu 175 Val en ATP5B. El plásmido de expresión obtenido de este modo se denomina en lo sucesivo en este documento pcDNA-ATP5B(E175V). A continuación, usando conjuntos respectivos de cebadores de las secuencias de nucleótidos representadas por la SEC ID Nº: 91 y la SEC ID Nº: 81 y la SEC ID Nº: 80 y la SEC ID Nº: 92, se obtuvo un ADNc de longitud completa que codifica una ATP5B de tipo de mutación a Asp 295 Val mediante el mismo método y se preparó un vector de expresión pcDNA-ATP5B(D295V). Usando los pcDNA-ATP5B(E175V) y el pcDNA-ATP5B(D295V) preparados anteriormente, se inspeccionó la capacidad de unión de la proteína ATP5B de tipo mutación Glu 175 Val o Asp 295 Val con fenformina mediante el ensayo de arrastre de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo 5(4) que se ha mencionado anteriormente. Como resultado, como se muestra en la Figura 3, fue posible confirmar la unión de fenformina, que se puede confirmar mediante la ATP5B de tipo silvestre mediante una banda, pero no fue posible confirmar la unión por la ATP5B de tipo mutación Glu 175 Val o Asp 295 Val debido a que la banda desapareció. Mediante este hecho, se demostró experimentalmente que Glu 175 y Asp 295 de la proteína ATP5B humana son importantes para la unión con fenformina. Además, como se muestra por los resultados del Ejemplo 5(4), se observó que la
proteína ATP5B humana como uno de los polipéptidos para uso de herramienta se une directamente a fenformina.

(7) Detección de la capacidad de activación de AMPK de biguanida en células que sobre-expresan ATP5B humana o LKB1

Aunque la proteína diana directa de biguanida todavía no se ha encontrado, se ha puesto de manifiesto que activa la AMP cinasa intracelular (AMPK) mediante su fosforilación (Zhou, G. et al. J. Clin. Invest. 2001 Oct; 108 (8):
1167 - 74). Ya que la actividad de AMPK es mejorar el metabolismo de glucosa acelerando la captación de glucosa, se considera que esta activación de AMPK es la ruta de reacción principal que produce el efecto para tratar diabetes que es el efecto farmacológico de biguanida. En el caso de que la ATP5B encontrada por el método de identificación de la presente invención sea la molécula diana verdadera que lleva el efecto farmacológico (efecto principal) de biguanida, la proteína ATP5B se debe colocar más cadena arriba de la activación de AMPK en el sistema de transducción de señal intracelular que se activa por biguanida. Por consiguiente, para inspeccionar por un experimento que la molécula de ATP5B que se une a biguanida realmente se coloca cadena arriba de la activación de AMPK, se examinó si la activación de AMPK por biguanida se somete a una influencia o no en una condición en la que se expresa excesivamente ATP5B en una célula.

Para el propósito que se ha mencionado anteriormente, en primer lugar se realizó la clonación de un ADNc génico que codifica LKB 1 que se ha demostrado que es una de las enzimas que fosforilan AMPK (Hardie DG, J. Cell Sci. 2004 Nov 1; 117 (Pt 23): págs. 5479 - 5487) y la preparación de un plásmido de expresión de LKB1. Del mismo modo que en el método descrito en el Ejemplo 5(1), se prepararon cebadores de oligo de ADN representados por la SEC ID Nº: 82 y la SEC ID Nº: 83 y se clonó un ADNc de longitud completa del gen LKB1 humano mediante PCR usando una genoteca de ADNc obtenida de riñón humano (Clontech) como el molde. La PCR se realizó en las mismas condiciones del Ejemplo 5(1) que se ha mencionado anteriormente y el fragmento de ADN amplificado de este modo de aproximadamente 1300 pares de bases se insertó en el vector de expresión pcDNA3.1/V5-His-TOPO. Como resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de inserción del plásmido conseguido, se confirmó que es un clon que consiste en la secuencia de ADNc de longitud completa de LKB1 humano mostrado por el número de acceso de RefSeq NM_000455. En lo sucesivo en este documento, este plásmido de expresión se denomina pcDNA-LKB1. Este plásmido de expresión pcDNA-LKB1 y el pcDNA-ATP5B preparado en el Ejemplo 5(1) que se ha mencionado anteriormente o un vector vacío (pcDNA3.1) (Invitrogen) se transfirieron a la célula HeLa S3. La célula HeLa S3 (ATCC) se cultivó en una placa de cultivo de 6 pocillos (diámetro de pocillo de 35 mm) hasta que alcanzó un estado del 70% de confluencia, añadiendo 2 ml de medio esencial mínimo DMEM (Gibco) que contenía suero fetal bovino al 10% (Sigma) a cada pocillo de la placa de cultivo. El medio se sustituyó por 1 ml por pocillo de un medio sin suero OPTI MEM I (Invitrogen) y se transfirieron de forma transitoria 3,0 \mug/pocillo de cada uno del vector vacío (pcDNA3.1), pcDNA-LKB1 y pcDNA-ATP5B usando Lipofect amine 2000 (Invitrogen). Después de 12 horas de cultivo, esto se sustituyó por 2 ml/pocillo de DMEM que contenía suero fetal bovino al 10% del cual se habían retirado sustancias de bajo peso molecular por tratamiento con carbono activado y se cultivaron adicionalmente durante 36 horas. Esto se cultivó adicionalmente durante 1 hora (1 h) en una condición de añadir fenformina (Sigma) a una concentración final de 1 mM o el disolvente (DMSO) en solitario. El medio se desechó y las células se lavaron con un tampón fosfato (a denominar en lo sucesivo en este documento PBS, y después, las células se lisaron añadiendo 0,15 ml del tampón A que se ha mencionado anteriormente (sin embargo, la concentración de NaCl era 150 mM y se añadieron diversos inhibidores de fosfatasa; Na_{3}VO_{4} 2 mM, NaF 10 mM, \beta-glicerofosfato 25 mM, Na_{2}MoO_{4} 0,2 mM, ácido ocadaico 20 nM). La actividad de AMPK en las células se detectó al nivel de fosforilación de moléculas mediante una electroforesis en SDS conocida de forma convencional y una transferencia de Western que usa un anticuerpo anti-AMPK con fosforilación (anticuerpo de fosfo-AMPK-\alpha (Thr172), Daiichi Pure Chemicals). En este caso, para confirmar que no existe diferencia en la cantidad de proteína de AMPK\alpha (una subunidad de AMPK que se somete a fosforilación) entre muestras, se realizó simultáneamente una transferencia de Western que usa un anticuerpo anti-AMPK\alpha (Daiichi Pure Chemicals). Como resultado, como se muestra en la Figura 4, se observó que el nivel de fosforilación de AMPK estaba significativamente acelerado y activado en cualquiera de la célula transferida con vector vacío que se ha mencionado anteriormente y la célula en la que se expresó LKB1 transfiriendo pcDNA-LKB1, cuando se trató con fenformina, en comparación con el caso de tratar con el disolvente. Sin embargo, en la célula en la que se expresó ATP5B humana transfiriendo pcDNA-ATP5B, no se observó activación de AMPK por tratamiento con fenformina. Cuando el mismo ensayo se realizó añadiendo 10 mM en concentración final de la metformina (Sigma) en lugar de fenformina, no se encontró activación de AMPK en la célula expresada de ATP5B humana similar al caso del tratamiento con fenformina. Esto significa que la capacidad de activación de AMPK que contribuye al efecto farmacológico de fenformina, metformina o biguanida similar cambia cuando la cantidad de proteína ATP5B que está presente en la célula cambia y demuestra que ATP5B se coloca evidentemente cadena arriba de AMPK en la señal intracelular de biguanida. Cuando se tienen en cuenta tanto este hecho como otro hecho de que se demostró la unión bioquímica de ATP5B y fenformina mediante el ejemplo que se ha mencionado anteriormente, se puede concluir que la ATP5B se une a biguanida y es la proteína diana verdadera que contribuye al efecto farmacológico de dicho compuesto. En este contexto, el fenómeno en el que la activación de AMPK por biguanida, a saber, la aceleración de la fosforilación, estaba obstruida por la sobre-expresión de ATP5B, se puede explicar por una de las siguientes teorías. Se puede explicar mediante un mecanismo en el que ATP5B tiene originalmente una acción de suprimir la fosforilación de AMPK y la biguanida activa AMPK uniéndose a ATP5B y evitando de este modo su acción supresora de AMPK. Alternativamente, se puede explicar que ya que la molécula de ATP5B que actúa formando un complejo con una molécula endógena se sobre-expresó en solitario, la biguanida se purgó (eliminó) uniéndose a un exceso de monómero de ATP5B y, como resultado, no se encontró aceleración de fosforilación de AMPK generada originalmente por biguanida mediante un complejo que incluye ATP5B. En este contexto, tal fenómeno en el que las acciones de los compuestos están desplazadas entre sí por sobre-expresión de una proteína diana se conoce generalmente y también se usa como un medio para identificar que una proteína especificada es una proteína diana de un compuesto (Curr. Genet. 2002; 41 (3): pág. 142 - 149, J. Biol. Chem. 2005; 280 (13): pág. 1223 -12238, Proc. Natl. Acad. USA 1996; 93 (21): 11919 - 11924, Yeast, 1998 14 (10): 935 - 942). En cualquiera de una de las anteriores explicaciones de teorías, no existe ningún cambio en el hecho de que ATP5B es la proteína diana que contribuye al efecto farmacológico de biguanida y que la sustancia que se une a ATP5B tiene el mismo efecto farmacológico (efecto principal) de biguanida. Basándose en los anteriores resultados, se demostró que un compuesto que puede inducir el mismo efecto principal del efecto farmacológico producido por biguanida como un agente para tratar diabetes usando la misma ruta de señal intracelular (a saber, un agente para tratar diabetes) se puede seleccionar usando los polipéptidos para uso de herramienta que incluyen ATP5B como la proteína diana de biguanida como un agente para tratar diabetes (a saber, usando como una herramienta de exploración de un agente para tratar diabetes).

Ejemplo 6 Método para explorar un agente para tratar diabetes usando un polipéptido para uso de herramienta (1) Método de exploración

Se muestra un método de exploración que puede seleccionar una sustancia a ensayar (a saber, un agente para tratar diabetes) que se une a un polipéptido, usando biguanida y ATP5B como uno de los polipéptidos para uso de herramienta y usando un cambio en la unión de dicho polipéptido y biguanida como el índice. La unión de ATP5B y biguanida se puede detectar de acuerdo con el Ejemplo 5(4) que se ha mencionado anteriormente. Como se muestra en la Figura 5, cuando la concentración de MTX-fenformina (1,0, 10, 100 \muM) a estar presente aumenta en el método descrito en el Ejemplo 5(4), se detectó claramente su unión a la proteína ATP5B. Cuando se añadió fenformina libre (10 \muM) a este sistema como una sustancia a ensayar, se demostró que la unión de dicha proteína y MTX-fenformina está obstruida como se muestra en la Figura 6. Cuando la fenformina añadida en este caso se sustituye por una sustancia de ensayo que se desea evaluar, se puede examinar si dicha sustancia de ensayo ejerce o no un cambio en la unión de la proteína ATP5B y MTX-fenformina (biguanida) y se puede explorar una sustancia que inhibe competitivamente la unión de biguanida y un polipéptido de uso de herramienta y se une al polipéptido para uso de herramienta, a saber, un agente para tratar diabetes. Cuando, entre las condiciones que se han descrito anteriormente, la concentración de MTX-fenformina es de 10 \muM, se selecciona una sustancia que tiene un valor de CI_{50} de 10 \muM o menor, preferiblemente una sustancia de 1 \muM o menor, más preferiblemente una sustancia de 0,1 \muM o menor como un agente para tratar diabetes.

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(2) Exploración de un agente para tratar diabetes

De acuerdo con el método de exploración de (1) que se ha mencionado anteriormente, la exploración se realizó añadiendo diversos compuestos como las sustancias a ensayar en lugar de fenformina libre en una condición de 10 \muM en concentración de MTX-fenformina (MTX-PH) y se encontraron 2 compuestos, 2-[(E)-(1H-1,2,4-triazol-3-ilimino)metil]fenol (Maybridge, a denominar compuesto A en lo sucesivo en este documento) y 6-cloro-9H-purina-2-amina (Aurora, a denominar compuesto B en lo sucesivo en este documento) como resultado de esto como compuestos de acierto. Es decir, como se muestra en la Figura 7, se demostró que estos 2 compuestos obstruyen la unión de ATP5B y MTX-fenformina por la adición de 10 \muM de los mismos. Además, cada uno de estos compuestos mostró una capacidad de activación de AMPK significativa por el ensayo de detección de capacidad de activación de AMPK mostrado en el Ejemplo 5(7) que se ha mencionado anteriormente y esta capacidad de activación desapareció por la sobre-expresión de ATP5B similar al caso de fenformina y metformina mostrado en el Ejemplo 5(7) que se ha mencionado anteriormente. Estos resultados muestran que tanto el compuesto A como el compuesto B que se han mencionado anteriormente activan AMPK intracelular interaccionado directamente con el sitio de unión de biguanida de ATP5B. Al mismo tiempo, se confirmó que realmente se puede seleccionar un compuesto que tiene la capacidad de activación de AMPK similar a la de biguanida mediante el método de exploración de un agente para tratar diabetes que usa el polipéptido de esta descripción, mostrado en el Ejemplo 6(1).

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Ejemplo 7 Acción hipoglucemiante de los compuestos de acierto y medición de su influencia en el nivel de ácido láctico en sangre

Como se ha descrito en el Ejemplo 6 que se ha mencionado anteriormente, el compuesto A y el compuesto B encontrados por el método de exploración de la presente invención tiene la capacidad de activar AMPK en células. A continuación, se examinó si estos compuestos tienen o no la acción hipoglucemiante in vivo similar al caso de biguanida. Al mismo tiempo, también se examinó la acción de los 2 compuestos que se han mencionado anteriormente sobre el aumento del valor de ácido láctico en sangre como un efecto secundario adverso de biguanida. Un total de 15 animales de 11 semanas de edad de ratones db/db (BKS.Cg + Leprdb/+ Leprdb/Jcl; CLEA Japan) como un ratón modelo de diabetes se dividieron en 3 grupos, que consistía cada uno en 5 animales. Cada uno de metformina (Sigma) y el compuesto A que se ha mencionado anteriormente se disolvieron en un disolvente (Cremophor al 5%, metil celulosa al 0,2%: MC) hasta una concentración de 30 mg/ml o hasta mg/ml. La metformina se administró a una dosis de 300 mg/kg de peso corporal y el compuesto A a 100 mg/kg de peso corporal en las cavidades abdominales de 5 animales respectivos del ratón que se ha mencionado anteriormente y se compararon con un grupo al que se administró el mismo volumen del vehículo (Cremophor al 5%, MC al 0,2%) en solitario. Se dejaron en ayunas al mismo tiempo de la administración y se recogieron muestras sanguíneas de la cola de cada animal 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de esto para medir el nivel de azúcar en sangre y el nivel de ácido láctico en sangre. Se midió en nivel de azúcar en sangre usando un analizador simplificado de azúcar en sangre (ACU Check Active II; Roche) y se midió el nivel de ácido láctico en sangre usando un analizador simplificado de ácido láctico (Lactate Pro; Arkray Marketing), respectivamente. Del mismo modo, 12 animales del ratón db/db de 18 semanas de edad se dividieron en 3 grupos, 4 animales por cada grupo. Cada uno de metformina (Sigma) y el compuesto B que se ha mencionado anteriormente se disolvieron en solución salina fisiológica hasta una concentración de 30 mg/ml o 9 mg/ml. Se administró metformina a una dosis de 300 mg/kg de peso corporal y el compuesto A a 100 mg/kg de peso corporal a las cavidades abdominales de los 4 respectivos animales del ratón que se ha mencionado anteriormente y se compararon con un grupo al que se administró el mismo volumen del vehículo (solución salina fisiológica) en solitario. Del mismo modo que anteriormente, se dejaron en ayunas al mismo tiempo de la administración y se midieron respectivamente el nivel de azúcar en sangre y el nivel de ácido láctico en sangre 0 minutos, 90 minutos y 180 minutos después de esto del mismo modo que se ha descrito anteriormente. Como resultado, en comparación con el grupo de administración de vehículo, la metformina mostró una acción hipoglucemiante significativa después de 90 minutos y 180 minutos en cada ensayo. Cada uno del compuesto A y el compuesto B mostraron que la acción hipoglucemiante después de 90 minutos y 180 minutos tenía una diferencia significativa (Figura 8A y C). Por otro lado, se observó un aumento significativo en el nivel de ácido láctico en sangre en el grupo de administración de metformina después de 90 minutos en cada ensayo, pero tanto el compuesto A como el compuesto B no indujeron aumento del nivel de ácido láctico en sangre (Figura 8B y D). Basándose en este resultado, se confirmó que se puede encontrar realmente un nuevo agente terapéutico para la diabetes que tiene una acción hipoglucemiante significativa similar a la de biguanida mediante el método de exploración de la presente invención. Además, ya que las dos especies que se han mencionado anteriormente de compuestos no inducen aumento del nivel de ácido láctico en sangre conocido como un efecto secundario adverso de biguanida, se confirmó que la exploración de un nuevo agente terapéutico para diabetes, que tiene el efecto principal (acción farmacológica de biguanida; a saber, efecto para tratar diabetes) pero que no tiene un efecto secundario adverso (a saber, aumento de nivel de ácido láctico en sangre) se puede realizar mediante el método de exploración de la presente invención.

Aplicabilidad industrial

El método de exploración de la presente invención se puede aplicar a la exploración de un agente para tratar diabetes. Aunque la invención se ha descrito con referencia a realizaciones específicas de la misma, están incluidos cambios y modificaciones obvios para los expertos en la materia en el alcance de la invención.

Texto libre de lista de secuencias

La explicación de "Secuencia Artificial" se describe en el encabezado numérico <223> en la siguiente lista de secuencias. Ilustrativamente, las respectivas secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 28 a 77, 84 a 89, 91 y 92 de la lista de secuencias son secuencias de cebador sintetizadas artificialmente. Dos o más bandas de proteína que están presentes solamente cuando se añadió talidomida se detectaron. Estas proteínas son un grupo de proteínas en las que la unión de dichas proteínas y la mezcla de proteína de chaperona molecular cambió por la adición de talidomida, a saber, un grupo de proteínas en las que sus estructuras terciarias cambió por la adición de talidomida. Estas bandas se recortaron, las proteínas se digirieron en fragmentos usando tripsina y, después, las mezclas peptídicas formadas de este modo se recuperaron del gel y se sometieron a la identificación de proteínas mediante análisis de espectro de masas del mismo modo que el método del Ejemplo 4. Como resultado, se puso de manifiesto que la proteína contenida en una banda de aproximadamente 45 kDa que está presente solamente cuando se añade talidomida es TARDBP (número de acceso de RefSeq NP_031401).

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Ejemplo 9 Inspección de respuesta a talidomida de TARDBP

Se conoce que TARDBP es un factor de transcripción que tiene la capacidad de unirse a ADN, ARN y ácidos nucleicos similares y tiene una acción de suprimir VIH (Ou SH et al. Virol 1995 June; 69 (6): 3584 - 3596). Ya que se conoce una acción significativa anti-VIH de talidomida (ME Franks et al., Lancet 2004; 363 (9423): 1802-1811), no existe incoherencia al pensar que TARDBP es una proteína diana de talidomida. Aunque todavía no se ha conocido una proteína como diana directa de talidomida, se ha descrito que suprime la producción de factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) o citosina similar de células (Franks ME et al., Lancet 2004; 363 (9423): 1802 -1811). Por tanto, se realizó un intento de inspeccionar si la proteína diana de talidomida, TARDBP, encontrada por el método de la presente invención en el Ejemplo 8 que se ha mencionado anteriormente es la molécula diana verdadera que lleva el efecto principal de talidomida, realizando un experimento que usa un cambio en la producción de TNF-\alpha de una célula como el índice.

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(1) Clonación de gen de TARDBP y preparación de plásmido de expresión de TARDBP

De acuerdo con la secuencia génica de TARDBP humano en el número de acceso de RefSeq NM_007375, se sintetizaron cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos representadas por la SEC ID Nº: 93 y la SEC ID Nº: 94 y se realizó un intento de amplificar ADNc de longitud completa de TARDBP humano por PCR a partir de una genoteca de ADNc obtenida de linfocitos humanos (Clontech) usando dichos cebadores. La PCR se realizó usando una ADN polimerasa (TAKARA LA Taq; Takara Shuzo) calentando a 94ºC (3 minutos) y después repitiendo 35 veces un ciclo que consiste en 94ºC (30 segundos), 58ºC (1,5 minutos) y 72ºC (4 minutos). Como resultado de separar el producto de PCR mediante una electroforesis en gel de agarosa, se confirmó que se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1250 pares de bases. Por consiguiente, este fragmento de ADN en el líquido de reacción se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1/V5-His-TOPO; Invitrogen) usando un sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen). El cebador usado en este caso, representado por la SEC ID Nº: 94, se diseñó de tal modo que se retiró el codón de terminación de dicho gen de tal forma que un epítopo V5 obtenido de vector (obtenido de la proteína V de SV5 de paramixovirus, Southern J A, J. Gen. Virol. 72, 1551 -1557, 1991) y un marcador His 6 (Lindner P, BioTechniques 22, 140 -149, 1997) continúan en la misma fase del triplete génico de TARDBP en el lado 3' después de la clonación. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido obtenido de este modo se determinó usando los cebadores que se unen a la región promotora de T7 en el vector (kit TOPO TA Cloning, Invitrogen, SEC ID Nº: 89) y un kit de secuenciación (Applied Biosystems) y un secuenciador (secuenciador de ADN ABI 3700, Applied Biosystems). Como resultado, se confirmó que es un clon que comprende el ADNc de longitud completa que codifica el TARDBP humano, mostrado por el número de acceso de RefSeq NM_007375 (SEC ID Nº: 95). En lo sucesivo en este documento, este plásmido de expresión se denomina pcDNA-TARDBP.

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(2) Preparación de célula de alta expresión de TARDBP y medición de expresión de TNF-\alpha en dicha célula

El pcDNA-TARDBP o un vector vacío (pcDNA3.1) (Invitrogen) se transfirió a una célula HeLa S3. Ilustrativamente, la célula HeLa S3 (ATCC) se cultivó en primer lugar en una placa de cultivo de 12 pocillos hasta que alcanzó un estado del 70% de confluencia, añadiendo 1 ml de medio esencial mínimo DMEM (Gibco) que contenía suero fetal bovino al 10% (Sigma) a cada pocillo de la placa de cultivo. El medio se sustituyó por 0,5 ml por pocillo de un medio sin suero OPTI-MEM I (Invitrogen) y 0,8 \mug/pocillo del pcDNA-TARDBP o pcDNA3.1 se transfirieron transitoriamente usando Lipofect amine 2000 (Invitrogen). Después de 12 horas del cultivo, esto se sustituyó por 1 ml/pocillo de DMEM que contenía suero fetal bovino al 10% y se cultivó adicionalmente durante 12 horas. Esto se cultivó adicionalmente durante 16 horas en una condición de añadir o no añadir ácido ocadaico (Wako Pure Chemical Industries) hasta una concentración final de 50 nM. En este caso, se añadió 100 \muM de talidomida a una parte de las células simultáneamente con el tratamiento con ácido ocadaico. El medio se desechó, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y después, estas células se congelaron y almacenaron a -80ºC.

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(3) Medición de la expresión de TNF-\alpha en células

Se preparó ARN total a partir de cada célula congelada en el Ejemplo 9(2) que se ha mencionado anteriormente, usando un reactivo para uso de extracción de ARN (Isogen; Nippon Gene) y de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo. El ARN total de preparado de este modo después se trató con una desoxirribonucleasa (Nippon Gene), se sometió a tratamiento con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y se disolvió en agua estéril. Usando 1 \mug de este ARN total se realizó su transcripción inversa en un ADNc monocatenario en un sistema de 20 \mul usando un kit para uso de reacción de transcripción inversa (Kit Advantage^{TM} RT-for-PCR, Clontech). Se diseñaron y sintetizaron seis oligonucleótidos (SEC ID Nº: 97 a SEC ID Nº: 102) como cebadores de PCR para la medición de la cantidad de expresión génica. Se usó una combinación de la SEC ID Nº: 97 y la SEC ID Nº: 98 para el gen de \beta-actina humana y la combinación de la SEC ID Nº: 99 y la SEC ID Nº: 100 para el gen de TNF-\alpha humano y una combinación de la SEC ID Nº: 101 y la SEC ID Nº: 102 para el gen de TARDBP humano, respectivamente. Se realizó la medición en tiempo real de la amplificación por PCR por el sistema de detección de secuencia PRISM^{TM} 7700 en un sistema de 25 \mul usando las 6 especies que se han mencionado anteriormente, 3 conjuntos de cebadores y de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo. En cada sistema, se usaron 5 \mul de ADNc monocatenario, 12,5 \mul de reactivo SYBR Green 2 x y 7,5 pmol de cada cebador. En este caso, se usó el ADNc monocatenario almacenado en (2) diluyendo el mismo 100 veces. En este contexto, se diluyeron 0,1 \mug/\mul de un ADN genómico humano (Clontech) y se usó una porción de 5 \mul de lo mismo en lugar del ADNc monocatenario. Se realizó la PCR, después de calentamiento a 50ºC durante 10 minutos y posteriormente 95ºC durante 10 minutos, repitiendo 45 ciclos de un proceso que consiste en 2 etapas de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos. Las cantidades de expresión del gen de TNF-\alpha humano y el gen de TARDBP humano en cada muestra se corrigieron por la cantidad de expresión del gen de \beta-actina basándose en la siguiente ecuación.

[Cantidad de expresión corregida de TNF-\alpha o TARDBP] = [Cantidad de expresión del gen de TNF-\alpha o TARDBP (datos sin procesar) / [Cantidad de expresión del gen de \beta-actina (datos sin procesar)]

Al comparar las cantidades de expresión de los genes de TNF-\alpha y TARDBP, se calcularon las cantidades relativas considerando la cantidad de expresión en una célula, a la que se transfirió un vector vacío (pcDNA3.1) y que se trató solamente con el disolvente (DMSO), como 100, con los resultados mostrados en la Figura 9 y la Figura 10. Los valores en los dibujos representan el promedio \pm D.T. Como se muestra en la Figura 9, se confirmó que la cantidad de expresión de TARDBP estaba acelerada en la célula transferida con pcDNA-TARDBP (célula de alta expresión de TARDBP) por un factor de aproximadamente 7 veces en comparación con la célula transferida con vector vacío (célula de control). Como se muestra en la Figura 10, se observó que la expresión de TNF-\alpha de la célula de control está aumentada en gran medida (hasta 80 veces) mediante el tratamiento con ácido ocadaico. Ya que la adición de talidomida suprimió esta aceleración de la expresión de TNF-\alpha por ácido ocadaico casi en el 50%, se confirmó que la acción de talidomida se puede detectar en dicha célula. Por otro lado, en el caso de la célula de alta expresión de TARDBP, la acción de acelerar la expresión de TNF-\alpha por la célula mediante la adición de ácido ocadaico era prácticamente igual en comparación con la célula de control, pero no se observó la acción de suprimir la expresión de TNF-\alpha por la adición de talidomida. Este resultado se puede explicar de forma sencilla basándose en una suposición de que la talidomida que originalmente debe actuar se purgó (retiró) del interior de la célula debido a la unión de talidomida en la célula y una cantidad excesiva de proteína TARDBP provocada por la sobre-expresión de TARDBP. Se conoce que TARDBP es un factor de transcripción que tiene la actividad de unirse a ADN, ARN y ácidos nucleicos similares. Es decir, ya que se considera que TARDBP es una molécula en un complejo funcional que consiste en dos o más factores de transcripción esenciales para la inducción de la expresión de TNF-\alpha, se considera que la inducción de la expresión de TNF-\alpha no está acelerada cuando la molécula en solitario se sobre-expresa, pero cuando la función de dicha molécula está inhibida por talidomida, se pierde la función del complejo de transcripción esencial para la inducción de la expresión de TNF-\alpha y, como resultado, se suprime la producción de TNF-\alpha. Basándose en los anteriores resultados, se consideró que la proteína TARDBP que se une chaperona molecular solamente cuando se añade talidomida, encontrada por el método de identificación de la presente invención, es una molécula relacionada con el control de la expresión de TNF-\alpha que se considera que es uno de los mecanismos moleculares que llevan el efecto farmacológico de talidomida. Basándose en esto, se demostró que el método de identificación de la presente invención se puede usar para la identificación de proteínas diana sin aplicar modificación de agentes a ensayar, además de la identificación de la ATP5B diana de biguanida mostrada en el ejemplo que se ha mencionado anteriormente.

Aplicabilidad industrial

El método de exploración de la presente invención se puede aplicar a la exploración de un agente para tratar diabetes. La herramienta de exploración de la presente invención se puede usar en la exploración que se ha mencionado anteriormente. El método de identificación de la presente invención es útil como un método de identificación de proteínas diana que son útiles para estudiar la mejora de agentes existentes. Aunque la invención se ha descrito con referencia a realizaciones específicas de la misma, los cambios y las modificaciones evidentes para los expertos en la materia están incluidos en el alcance de la invención.

Texto libre de lista de secuencias

La explicación de "Secuencia artificial" se describe en el encabezado numérico <223> en la siguiente lista de secuencias. Ilustrativamente, las respectivas secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 28 a 77, 84 a 89, 91 y 92 de la lista de secuencias son secuencias de cebador sintetizadas artificialmente.

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<110> Astellas Pharma Inc.

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<120> Un método para la identificación de dianas farmacológicas y un método para explorar fármaco antidiabético usando la diana identificada

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<130> A06034

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<150> JP2005-234673

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<151> 12-08-2005

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<150> JP2005-279582

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<151> 27-09-2005

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<160> 102

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 1590

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1587)

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<223> Inventores: Endoh, Hideki; Yokota, Hiroyuki; Soga, Shinji; Hayakawa, Masahiko

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<400> 1

5

6

7

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<210> 2

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<211> 529

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

8

9

10

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<210> 3

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<211> 641

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

11

12

13

14

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<210> 4

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<211> 858

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

15

16

17

18

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<210> 5

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<211> 732

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

19

20

21

22

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<210> 6

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<211> 573

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

23

24

25

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<210> 7

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<211> 397

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

26

27

\newpage

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<210> 8

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<211> 205

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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28

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<210> 9

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

29

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<210> 10

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<211> 840

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

30

31

32

33

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<210> 11

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<211> 803

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

34

35

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 530

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

38

39

40

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<210> 13

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<211> 556

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

41

42

43

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<210> 14

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<211> 509

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>14

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 679

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400>15

46

47

48

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<210> 16

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<211> 471

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

49

50

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 999

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

52

53

54

55

56

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<210> 18

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<211> 175

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 182

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

58

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<210> 20

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<211> 412

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

59

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 340

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

62

63

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<210> 22

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<211> 324

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

64

65

66

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<210> 22

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<211> 145

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

67

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<210> 24

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<211> 358

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

68

69

70

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<210> 25

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<211> 559

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

71

72

73

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<210> 26

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<211> 484

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

74

75

76

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<210> 27

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<211> 913

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

77

78

79

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 28

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ttggatccat ggccaaagcc gcggcgatcg g

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31

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<400> 29

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ttctcgagct aatctacctc ctcaatggtg ggg

\hfill

33

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ttagatctat gtcggtggtg gggttggacg

\hfill

30

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ttctcgagct agtccaagtc catattaaca g

\hfill

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ttggatccat gcctgaggaa acccagaccc

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30

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ttctcgagtt agtctacttc ttccatgcgt gatg

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34

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ttggatccat gcttcggtta cccacagtct ttc

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33

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ttctcgagtt agaacatgcc acctcccata cc

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ttggatccat ggtgaaagaa acaacttact acgatg

\hfill

36

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ttctcgagtt aagaggtctg acactgaaca ccac

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34

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ttggatccat gaccgagcgc cgcgtcccc

\hfill

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ttctcgagtt acttggcggc agtctcatcg g

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ttggatccat ggcaggacaa gcgtttagaa ag

\hfill

32

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ttctcgagtc agtctacgta ctttccaaga atg

\hfill

33

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aagatatcca tgtcggtggt gggcatag

\hfill

28

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aagcggccgc tcaatcaatg tccatttcag gaag

\hfill

34

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aaggatccat gagggccctg tgggtgctgg

\hfill

30

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ttctcgagtt acaattcatc tttttcagct gtagatt

\hfill

37

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aaggatccat ggctgcgata aaggccgtca ac

\hfill

32

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ttctcgagtc atttgagaga agacatccca gctc

\hfill

34

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aatgatcaat ggaggggcct ttgtccgtgt tc

\hfill

32

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ttgcggccgc tcaatcatta agggctccag agtga

\hfill

35

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aaggatccat ggcggccatc ggagttcacc

\hfill

30

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<220>

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ttctcgagct aagatgctat ctcaatagag attgc

\hfill

35

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aaggatccat gataagtgcc agccgagctg ca

\hfill

32

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ttctcgagtt actgtttttc ctccttttga tcttc

\hfill

35

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<210> 54

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 54

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aagaattcat ggccagagag atgacgatct tag

\hfill

33

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<211> 35

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<212> ADN

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ttctcgagtc agttgaagtt ggttttttgt aaatg

\hfill

35

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 56

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aagaattcat ggcagacaaa gttaggaggc ag

\hfill

32

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<212> ADN

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<220>

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<400> 57

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ttctcgagtt atagttcgtc gttcttcaaa ggcc

\hfill

34

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcat ggacatcgcc atccaccacc c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagct atttcttggg ggctgcggtg ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat gtcgggccgc tcagtgccac at

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtc agggctcaac tatggctgcc tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat ggctaacgtg gctgacacga ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcggccgc ttactgatgg gcacactgca ctcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat gggtaaagac tactaccaga cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagct atattggaag aacctgctca agta

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat ggcatcctac tacgagatcc tag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtc agaggatgag gcagcgagag g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat ggtggactac tacgaggtgc tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtc actgaaggca gagaaaaggg gt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggatccatg gctccgcaga acctgagcac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtc aatatccttg cagtccattg tatac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcat ggcgacggcc ttgagcgagg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtt atccatctgt atcgatcctg tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatccat ggcggcgacc gagccggag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtt agccaaattg aaaaaagaaa ttccc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcat gaaagattct gaaaataaag gtgcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctcgagtt aatataaggg cttttggcct tggtt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaccatga ccctccacac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgtggca gggaaaccc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgttggggt ttgtgggtcg gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgaatgc tcttcagcca gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggaggtgg tggacccgca gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgcttg caggccgaca gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccatgg ttggttcgct aaactg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgagttaa tcattcttct catatacttc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgcagggc tggcaagcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccagagtt catggtaatg agtgttgagc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcaacact cattaccatg aactctggag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcagaatca tgaatgtcat tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaatactt cagagtccaa gaaggtcaag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgaccttc ttggactctg aagtattcag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtctgaat atattcgggt aaccg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattccccag ccagaagact tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222>(1)..(1242)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

81

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

83

84

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggactatg acttagttgc gtta

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accttcaccg ttccagtttt taa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctggtatg agcccatcta tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtagacc tgcccagact cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagttcttat ggtgcaggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagtcaca ccatcgtcc

\hfill

19

Claims

1. Un método para explorar un agente para tratar diabetes, que comprende

[1]: una etapa de permitir que (1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2, (2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 en la que de 1 a 10 aminoácidos de la misma están delecionados, sustituidos y/o insertados y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida, debido a sobre-expresión, (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 y que también se une a biguanida y/o inhibe la activación de AMPK por biguanida debido a sobre-expresión o (4) una célula transformada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en (1) a (3) esté en contacto con una sustancia a ensayar en coexistencia de biguanida y

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un método de exploración de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una etapa de confirmar que la sustancia activa la actividad de AMPK y/o tiene una actividad terapéutica para diabetes.