ES2336634T3 - Moleculas diana quimericas que tienen una actividad regulable. - Google Patents
Moleculas diana quimericas que tienen una actividad regulable. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2336634T3 ES2336634T3 ES97952131T ES97952131T ES2336634T3 ES 2336634 T3 ES2336634 T3 ES 2336634T3 ES 97952131 T ES97952131 T ES 97952131T ES 97952131 T ES97952131 T ES 97952131T ES 2336634 T3 ES2336634 T3 ES 2336634T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- chimeric
- enzyme
- activity
- analyte
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 130
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 120
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 120
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 61
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 25
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 claims description 11
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 100
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 20
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 6
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108091006094 GTPase-accelerating proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N (6r,7r)-3-[[2-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]pyridin-1-ium-1-yl]methyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=[N+]1CC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CC=3SC=CC=3)[C@H]2SC1 FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- -1 acids nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000010665 Enzyme Interactions Effects 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 101100356020 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) recA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007390 Glycogen Phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108010046163 Glycogen Phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050002220 Green fluorescent protein, GFP Proteins 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101000892448 Neisseria gonorrhoeae Type II restriction enzyme NgoMIV Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010088830 phosphorylase kinase phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000004172 quinoline yellow Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
- C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA MOLECULA DIANA QUMERICA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD QUE SE PUEDE REGULAR O MODULAR MEDIANTE UNA MOLECULA DE UNION. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DE DICHA MOLECULA DIANA QUIMERICA PARA DETECTAR LA PRESENCIA Y/O CANTIDAD DE UN ANALITO DESEADO EN UNA MUESTRA. DICHO ANALITO ES UNA MOLECULA DE UNION, O UN COMPETIDOR DE UNA MOLECULA DE UNION, EL CUAL, TRAS LA UNION A LA MOLECULA DIANA, ALTERA LA ACTIVIDAD DE LA MISMA DE FORMA DETECTABLE. EN UN ASPECTO DE LA INVENCION, UNA MOLECULA DE UNION SE UNE A LA MOLECULA QUIMERICA, INACTIVANDOLA. UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE ENSAYO, COMPITE Y/O DESPLAZA LA MOLECULA DE UNION DE LA QUIMERA, REACTIVANDOLA. LA REAPARICION DE ACTIVIDAD EN PRESENCIA DEL ANALITO, INDICA SU PRESENCIA EN LA MUESTRA DE ENSAYO, Y SU CANTIDAD. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION SE REFIERE A UNA MOLECULA DE UNION QUE REGULA UNA MOLECULA DIANA QUIMERICA, Y A PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION DE LA MISMA.
Description
Moléculas diana quiméricas que tienen una
actividad regulable.
El desarrollo de ensayos para medición de la
presencia y cantidad de sustancias deseadas es sumamente deseable
para una diversidad de propósitos, que incluyen usos médicos,
veterinarios, de investigación, y ambientales. Adicionalmente, es
deseable diseñar y aislar moléculas que tengan una actividad que sea
regulable por una sustancia deseada. Estas moléculas regulables son
útiles para detectar la cantidad y presencia de un analito deseado,
utilizando la capacidad del analito para regular directa o
indirectamente (v.g., por competición) la actividad de la
molécula.
J. Biol. Chem. 271 (agosto 1996), páginas
21251-21256 describe la actividad de
\beta-galactosidasa como sonda molecular para
detectar anticuerpos específicos.
P.N.A.S. USA 92 (junio 1995), páginas
5783-5787 describe un sistema sensor molecular
basado en fosfatasa alcalina manipulada genéticamente.
Prot. Eng. 7 (abril 1994), páginas
509-514, describe la modulación de la actividad
enzimática por fijación de anticuerpos a una proteína híbrida
fosfatasa alcalina-epítope.
WO 92/07090 describe métodos para modificar y
detectar los efectos sobre la interacción de polipéptidos
modificados y sustratos diana.
La presente invención proporciona un método para
determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de
test, que comprende: Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende: (a)
preparar ácidos nucleicos que codifican una enzima quimérica, en
donde la actividad de la enzima quimérica se modula por fijación de
una molécula de fijación, en donde dichos ácidos nucleicos se
preparan por un método que comprende: (i) proporcionar bibliotecas
de oligonucleótidos sintéticos degenerados que codifican mimotopos;
(ii) expresar una biblioteca de enzimas quiméricas candidato
preparadas por inserción de dichos oligonucleótidos en secuencias
de ácido nucleico que codifican una enzima de partida para producir
enzimas quiméricas candidato; (iii) proporcionar una molécula de
fijación; (iv) cribar las enzimas quiméricas candidato expresadas
para determinar si la actividad de la enzima quimérica candidato se
modula por fijación de dicha molécula de fijación a dicha enzima
quimérica candidato e identificar al menos una enzima quimérica con
actividad modulada; y (v) aislar ácidos nucleicos que codifican
dicha enzima quimérica de dicha biblioteca; (b) expresar un ácido
nucleico preparado de acuerdo con la parte (a) para producir una
enzima quimérica; (c) poner en contacto la enzima quimérica con (1)
la muestra de test, (2) una molécula de fijación que se fija a un
mimotopo de la enzima quimérica, y (3) un sustrato sobre el cual
actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla
de reacción; y (d) detectar la cantidad de catálisis del sustrato
producida por la enzima quimérica, en donde la molécula de fijación
modula la catálisis por la enzima quimérica en donde dicho analito
actúa como competidor directo de la interacción de la enzima
quimérica con la molécula de fijación.
La presente invención proporciona también un
método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una
muestra de test, que comprende: (a) preparar una enzima quimérica
por un método como se define en las partes (a) y (b) de la
reivindicación 1; (b) poner en contacto la enzima quimérica con (1)
la muestra de test y (2) un sustrato sobre el cual actúa
catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de
reacción; y (c) detectar la cantidad de catálisis del sustrato
producida por la enzima quimérica, en donde el analito modula la
catálisis por la enzima quimérica.
La Solicitud describe una molécula diana
quimérica que tiene una actividad que puede ser regulada o modulada
por una molécula de fijación. La invención se refiere a métodos de
utilización de la molécula diana quimérica para detectar la
presencia y/o cantidad de un analito deseado en una muestra. El
analito es una molécula de fijación, o un ligando de una molécula
de fijación, molécula que, después de fijación a la molécula diana,
altera la actividad de la molécula diana de una manera detectable.
En un aspecto de la invención, una molécula de fijación se fija a
la molécula quimérica, desactivándola. Un analito en una muestra de
test compite y/o desplaza la molécula de fijación de la quimera,
reactivándola. La reaparición de actividad en presencia del analito
indica su existencia y cantidad en la muestra de test. Otro aspecto
de la invención se refiere a una molécula de fijación que regula
una molécula diana quimérica y métodos de producción de la
misma.
De acuerdo con la presente invención, una
molécula diana (TM) deseada puede modificarse para obtener al menos
un resto de sitio de fijación (BSM) al cual puede fijarse una
molécula de fijación (BM). Después de la fijación de la BM al BSM,
una actividad asociada con la TM se altera de una manera detectable,
v.g., aumentando o reduciendo la actividad de la TM. Así, el BSM
puede actuar como conmutador de regulación, encendiendo o apagando
(totalmente o en parte) una actividad de una TM deseada en
respuesta a la fijación de una BM. El BSM puede seleccionarse
también de tal manera que la fijación de la molécula de fijación
regula la activación de la molécula diana. De acuerdo con la
presente invención, un mimotopo es el BSM preferido. Un BSM puede
manipularse genéticamente en una molécula diana por la inserción de
secuencias, por el reemplazamiento de secuencias presentes en una
molécula con nuevas secuencias, por mutagénesis de secuencias ya
presentes en la molécula, etc. La manipulación genética puede
realizarse de acuerdo con métodos disponibles para el operario
experto.
El término molécula diana "quimérica",
v.g., una "enzima quimérica" significa el producto resultante
después que el resto del sitio de fijación ha sido insertado en la
molécula diana o después que una porción de la molécula diana ha
sido reemplazada por el resto del sitio de fijación. Para mayor
claridad, se hace referencia a la molécula diana antes de la
manipulación genética del BSM, como la molécula diana de partida.
Así, si una enzima es el material de partida, se hace referencia a
la misma como la "enzima de partida". Después de la
manipulación del BSM por manipulación genética, la enzima de partida
se identifica como una "enzima quimérica". En los ejemplos que
siguen, se utiliza \beta-lactamasa como una enzima
de partida en la cual se manipula genéticamente un resto de sitio
de fijación que comprende aminoácidos, para producir una enzima
quimérica. La misma es quimérica, dado que está constituida por
aminoácidos de la enzima de partida y aminoácidos de un resto del
sitio de fijación.
El término "molécula de fijación" significa
una molécula que se fija o une específicamente a un resto del sitio
de fijación. Por el término "específico", se entiende que la
molécula de fijación reconoce la secuencia de aminoácidos definida
dentro de o que incluye la secuencia de aminoácidos del resto del
sitio de fijación. La especificidad puede ser una función de la
secuencia lineal de aminoácidos del resto del sitio de fijación,
sola, o en combinación con aminoácidos presentes originariamente en
la molécula diana o en una inserción o reemplazamiento en otro
sitio. Pueden emplearse diversas moléculas de fijación, que incluyen
anticuerpos, polipéptidos, aptámeros, ácidos nucleicos, fármacos, y
ligandos químicos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales,
policlonales, monocatenarios, anticuerpos manipulados genéticamente,
etc., como es conocido en la técnica. Véase, v.g., Reiter et
al., Nature Biotechnology, 14:1239-1245,
1996; Bird et al., Science,
242:423-426, 1988.
Una molécula de fijación puede fijarse a una
porción específica de una macromolécula denominada un epítope o un
determinante. El epítope puede ser un determinante lineal o un
determinante estructural. Véase, v.g., Abbas et al.,
Cellular and Molecular Immunology, segunda edición, W.B.
Saunders Co., 1991, especialmente las páginas
47-49. Un "mimotopo" es un determinante que es
reconocido por la misma molécula de fijación como un "epítope"
particular, pero que tiene una composición diferente del
"epítope". Por ejemplo, una molécula de fijación puede ser un
anticuerpo que reconoce (es decir, se fija a) un epítope que
comprende una secuencia de aminoácidos lineal. Un "mimotopo"
de este epítope comprende una secuencia lineal diferente de
aminoácidos pero que es todavía reconocida por el mismo anticuerpo.
El "mimotopo" difiere al menos en un aminoácido del
"epítope". Un mimotopo puede mimetizar un hapteno y otras
moléculas, con inclusión de moléculas o restos no proteínicos,
v.g., carbohidrato, biotina, etc. Como se ha mencionado, el mimotopo
puede ser también un determinante estructural formado por residuos
de amino-ácidos u otros constituyentes de porciones separadas de la
molécula quimérica. Adicionalmente, el mimotopo puede comprender
constituyentes (v.g., aminoácidos) ya presentes en la TM de partida
y que se mantenían (es decir, no habían sido reemplazados) en la TM
quimérica. Un mimotopo puede seleccionarse como se expone más
adelante, v.g. en los ejemplos, mediante manipulación genética de
aminoácidos aleatorios en una diana y cribado o selección para
reconocimiento por una molécula de fijación deseada.
Una ventaja del empleo de un mimotopo es que no
se requiere conocimiento alguno de la estructura del epítope. Este
conocimiento es en general difícil de adquirir, particularmente si
el epítope es no lineal. En un aspecto de la invención, se crea una
biblioteca de mimotopos y se manipula genéticamente, v.g. se
inserta, en una molécula diana, preferiblemente en un bucle. La
molécula quimérica resultante se criba o selecciona luego respecto
a retención de actividad. El mimotopo puede extraerse de una
secuencia aleatoria, v.g. que contenga cinco aminoácidos,
preferiblemente seis aminoácidos (un hexapéptido aleatorio), o
siete, ocho, nueve o diez, aminoácidos de longitud. En este aspecto
de la invención, después de la identificación de las moléculas diana
quiméricas que tienen actividad retenida, se criban las mismas en
cuanto a reconocimiento por la molécula de fijación deseada. La
molécula de fijación puede ser un anticuerpo para un carbohidrato u
otro hapteno o no hapteno no proteínico, o una secuencia de
aminoácidos. Especialmente en el último caso, no se requiere
información alguna de secuencia para implementar la invención.
La molécula diana puede seleccionarse en cuanto
a una actividad detectable deseada. Por ejemplo, la TM puede ser:
\beta-lactamasa: P. Soumillion et al.,
J. Mol. Biol., 237:415-422, 1994; Plasmina:
L. Jespers et al., comunicación de conferencia; Antígeno
específico de próstata: R. Eerola et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 200:1346-1352, 1994;
Subtilisina: P. Soumillion et al., Appl. Biochem.
Biotechnol., 47:175-190, 1994; Tripsina: D.R. Corey
et al., Gene, 128:129-134, 1993;
Fosfatasa alcalina: J. McCafferty et al., Prot.
Enging., 4:955-961;
\beta-galactosidasa: I.N. Maruyama et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8273-8277,
1994; Nucleasa estafilocócica: J. Ku & P.G. Schultz, Bioorg.
Med. Chem., 2:1413-5, 1994; y J. Light &
R.A. Lerner, Bioorg. Med. Chem., 3:955-67,
1995; Glutation-transferasa: M. Widersten &
B.Mannervick, J. Mol. Biol., 250:115-122,
1995; Lisozima: K. Maenaka et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm., 218:682-687, 1996; y Anticuerpos
catalíticos: K.D. Janda et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91:2532-2536, 1994.
Las moléculas diana arriba mencionadas han sido
presentadas en fago. Las mismas son directamente adecuadas para el
método de selección de un BSM. Otras enzimas pueden presentarse
también en fagos y son útiles para la presente invención, v.g.
esterasas, piruvato-quinasa,
glucosa-oxidasa,
lactato-deshidrogenasa,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
y luciferasa. La TM puede ser también una proteína que posea una
actividad fluorescente (v.g., proteína fluorescente verde, GFP:
Chalfie et al., 1994, Science, 263:802; Cheng et
al., 1996, Nature Biotechnology, 14:606; Levy et
al., 1996, Nature Biotechnology, 14:610) que está
modulada por la fijación de una BM a un BSM contenido en la
proteína fluorescente. La TM puede ser también una molécula
reguladora que activa/desactiva una segunda molécula que tenga una
actividad detectable. Por ejemplo, una proteína activadora de GTPasa
(GAP) estimula una proteína G, tal como una ras. La aptitud de una
GAP para activar una proteína G puede modularse por manipulación
genética de un BSM en la GAP. Después de la fijación de una BM al
BSM de una GAP modificada, la actividad estimulante de la GAP puede
modularse. Su efecto aguas arriba en las proteínas G puede
monitorizarse, v.g., por medición de una actividad de GTPasa de la
proteína G. Véase, v.g. Trahey y McCormick, Science, 238:
542-545, 1987. La TM puede ser también una subunidad
de otra proteína que posee a su vez actividad enzimática u otra
actividad detectable. Adicionalmente, la TM puede ser una enzima de
ácido nucleico, v.g. una ribozima, una enzima de cabeza de
martillo, RNAsa P o una enzima en horquilla. Si se utiliza un ácido
nucleico como la molécula diana, el resto del sitio de fijación
manipulado genéticamente podría comprender usualmente nucleótidos,
sea modificados o existentes naturalmente. La TM puede ser también
un activador o represor de la transcripción implicado en sistemas
de traducción y transcripción in vitro; la detección de
actividad puede realizarse al nivel de la actividad de la enzima o
molécula fluorescente expresada.
La fijación de la BM a la molécula quimérica,
preferiblemente en el BSM, puede afectar a la actividad de diversas
maneras. La molécula de fijación puede desactivar la TM quimérica.
Por el término "desactivar", se entiende que la actividad de
la TM quimérica se reduce o se debilita. La molécula de fijación
puede desactivar la TM quimérica por completo de tal modo que la
misma no posea actividad alguna o posea sólo una actividad
insignificante, o aquélla puede desactivar sólo parte de su
actividad, v.g., se reduce Kcat o se aumenta Km. Una TM quimérica
puede existir en al menos dos conformaciones, una conformación
activa y una inactiva. En el equilibrio, una población de TMs
quiméricas contendrá una mezcla de moléculas, algunas en la
conformación activa y algunas en la conformación inactiva de una
TM. Una BM puede seleccionarse de tal manera que se fije a una
conformación inactiva de una TM. Cuando se añade a la población de
TM quiméricas, la fijación de la BM a las TMs inactivas puede
desplazar el equilibrio de la mezcla a la conformación inactiva.
Como consecuencia, la mezcla tendrá menos actividad en presencia de
la BM que en su ausencia. Así pues, la molécula de fijación modula
la actividad de la TM quimérica por desplazamiento de la población
de TMs quiméricas a una conformación inactiva, reduciendo con ello
la actividad de la población como un todo. Una enzima de partida
seleccionada puede ser serina-proteasa que puede
existir en dos conformaciones diferentes: una activa y una inactiva.
La conformación inactiva es similar a la del zimógeno
correspondiente. El equilibrio puede desplazarse de la conformación
activa a la inactiva por rotura de un puente salino que mantiene la
enzima en su conformación activa; esto puede hacerse por un aumento
de pH que conduzca a la desprotonación del terminal amino de la
cadena peptídica implicada en el puente salino o por modificación
química de este terminal amino. La energética del puente salino es
tal que la conformación activa no está estabilizada fuertemente (2,9
Kcal/mol, véase: A.R. Fersht, J. Mol. Biol., 64:
497-509, 1972) por lo que el equilibrio puede
desplazarse de modo relativamente fácil a la forma inactiva. La
fijación de una BM, v.g., un anticuerpo monoclonal, al aminoácido
terminal puede desplazar el equilibrio en varios órdenes de
magnitud.
La activación de una molécula quimérica puede
ser regulada también por una BM. El ejemplo más simple de activación
es la escisión proteolítica de un enlace peptídico en un zimógeno
para transformarlo en una enzima. Un ejemplo clásico es la
activación de una serina-proteasa, o más
específicamente la activación de quimotripsinógeno en quimotripsina
por escisión proteolítica del enlace peptídico
Arg15-Ile16 por la tripsina. Un anticuerpo, u otra
BM, que se fija a un epítope o un mimotopo manipulado genéticamente
en la región del enlace peptídico escindido puede inhibir la
activación. Otro ejemplo es la inhibición de la fosforilación o
desfosforilación de una enzima cuya actividad está regulada por su
estado de fosforilación. Un ejemplo es la
glucogeno-fosforilasa: cuando la misma está
fosforilada en Ser14, se encuentra esencialmente en su forma activa,
en tanto que la desfosforilación desactiva la enzima. La fijación
de un anticuerpo, u otra BM, a un epítope o mimotopo manipulado
genéticamente en la proximidad del sitio de fosforilación podría
interferir con el mecanismo de activación/desactivación por la
fosforilasa-quinasa y
fosfoprotein-fosfatasa, respectivamente.
De un modo más general, cualquier modificación
posterior a la traducción de una enzima, que contribuye a modular
su actividad, puede ser interferida por fijación de una molécula
extraña a un BSM (v.g., un anticuerpo).
El resto del sitio de fijación puede manipularse
genéticamente en cualquier posición deseada en la molécula diana,
incluso como una fusión con los términos N y C. Uno o más, v.g., 2,
3, 4 ó 5, BSMs puede(n) manipularse genéticamente en el
resto diana en regiones adyacentes o diferentes. Pueden hacerse
manipulaciones genéticas múltiples, v.g. inserciones o
reemplazamientos, de la molécula diana por una diversidad de
razones, v.g., para contribuir al mimotopo (v.g. el mimotopo puede
estar constituido por aminoácidos aportados por manipulación
genética en dos sitios diferentes en la molécula diana), para
proporcionar más de un sitio al cual pueda fijarse una molécula de
fijación, para proporcionar un sitio en el cual una BM activa la
enzima y otro sitio en el cual una segunda BM desactiva la enzima,
etc. Una ventaja de la inserción o reemplazamiento de secuencias de
aminoácidos con un mimotopo en dos sitios (o más) es que puede
construirse un mimotopo discontinuo, proporcionando sitios de
afinidad alta a los cuales puede fijarse una molécula de fijación.
Preferiblemente, como se ha expuesto arriba, la TM quimérica
resultante retiene al menos algo de su actividad después de la
manipulación genética del BSM. Adicionalmente, la unión de una BM
al BSM da como resultado la regulación de la actividad arriba
mencionada de la molécula diana quimérica. Los dos últimos aspectos,
retención de una actividad y regulación de la actividad retenida de
la molécula quimérica resultante por una molécula de fijación, son
aspectos preferidos de la invención. Así, un sitio preferido de
modificación por manipulación genética, v.g., inserción, es una
posición en la cual la actividad de la TM no se elimina sino que,
cuando es reemplazada o modificada por la adición de residuos de
aminoácidos, puede actuar como conmutador de regulación para la
actividad de la TM.
El sitio en el que se manipula genéticamente un
BSM, v.g., se inserta en y/o se reemplaza, en la TM puede
seleccionarse de diversas maneras como reconocería el operario
experto. Por ejemplo, si la estructura tridimensional (3D) de la TM
es conocida, puede seleccionarse un sitio por identificación
específica de una localización deseada en la molécula a manipular
genética-mente. para algunos propósitos, puede ser
deseable seleccionar un sitio expuesto en la superficie de la
molécula diana, donde el sitio está disponible para unión de la
molécula de fijación. La estructura 3D puede determinarse de
acuerdo con medios empíricos, v.g., por cristalografía, y/o, puede
deducirse de estructuras y datos de secuencias de aminoácidos
conocidos. Véase, v.g., Holm y Sander, Science, 273:
595-602, 1995. Si la estructura 3D no se conoce, el
sitio de manipulación genética puede seleccionarse sobre la base de
otra información, v.g., cuando la estructura de la proteína no se
conoce, sitios susceptibles de proteólisis limitada o sitios
claramente predichos como bucles por predicción de la estructura
secundaria o por análisis de patrones hidrófobos son adecuados para
modificación por manipulación genética, v.g., inserción o
reemplazamiento. Alternativamente, un BSM puede manipularse
genéticamente en posiciones aleatorias dentro de la TM.
El sitio manipulado genéticamente no se
encuentra preferiblemente en el sitio activo, estando situado más
preferiblemente en una localización alejada de él, v.g.,
aproximadamente a 1, 5, 15, 20 ó 25 \check{A} del mismo. La
actividad de la molécula quimérica tiene que ser regulable por
fijación a la secuencia insertada o reemplazada, con indiferencia
de si la modificación está próxima o alejada del sitio activo.
Moléculas diana y moléculas quiméricas pueden
prepararse por métodos que están disponibles en la técnica. Por
ejemplo, puede emplearse manipulación genética para preparar
moléculas diana y quiméricas que comprenden residuos de aminoácidos
o nucleótidos. En una realización, se emplea un gen clonado como el
material de partida para la molécula diana de partida y la molécula
diana quimérica resultante. En los ejemplos descritos más adelante,
el gen clonado para la enzima de partida
\beta-lactamasa sirve como el material inicial
para producir la enzima quimérica. El BSM puede manipularse
genéticamente en la TM de partida utilizando los diversos métodos
disponibles para el operario experto, v.g., Kunkel, Proc. Natl.
Acad. Sci., 82: 488-492, 1985; Sayers y
Eckstein en "Directed Mutagenesis: A practical approach",
McPherson, compilador IRL Press 1991, pp. 49-69;
Munir et al., J. Biol. Chem.,
267:6584-6589, 1992; Brennan et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 92:5783-5787, 1995. La
manipulación genética puede realizarse también utilizando un vector
de reemplazamiento por recombinación homóloga. Para los propósitos
de la presente invención, cuando una secuencia dentro de un gen de
partida ha sufrido mutagénesis en tal proporción que la secuencia
de aminoácidos difiere la secuencia de partida, el polipéptido
codificado para el gen resultante es quimérico. El mismo es
quimérico dado que una secuencia de aminoácidos diferente, es
decir, un resto de sitio de fijación, ha sido manipulado
genéticamente en la molécula diana de partida. En el ejemplo
específico en que el material de partida es una enzima, y la enzima
sufre mutagénesis por cambio de su secuencia de nucleótidos, una
enzima quimérica resultante comprenderá un resto de sitio de
fijación de aminoácido que ha reemplazado las secuencias de
aminoácidos existentes naturalmente. En una realización, la
secuencia del gen que codifica una enzima de tipo salvaje (u otro
polipéptido) se modifica por la mutagénesis orientada de acuerdo
con los protocolos de Kunkel o Eckstein para introducir dos sitios
de restricción aguas arriba y aguas abajo de la región del gen
direccionada para manipulación genética; preferentemente, se
introduce una mutación en la secuencia codificante al mismo tiempo
de tal manera que la enzima codificada es inactiva; el plásmido,
fagémido o fago que contiene el gen modificado se designará el
"vector". Este vector se digiere en los nuevos sitios de
restricción con las enzimas de restricción correspondientes y el
pequeño fragmento que codifica la secuencia entre los sitios se
descarta. En paralelo, se preparan bibliotecas sintéticas de
oligonucleótidos degenerados de acuerdo con el método de Munir et
al., J. Biol. Chem. 267: 6584-6589,
1992; los mismos contienen, intercalados entre los sitios de
restricción adecuados, secuencias de nucleótidos degeneradas que
codifican reemplazamientos aleatorios de los residuos
correspondientes en la secuencia de la proteína. Alternativamente,
la secuencia de tipo salvaje está reemplazada por una secuencia más
larga de nucleótidos que codificará la inserción de un polipéptido
aleatorio en la posición correspondiente en la secuencia de la
proteína. Después de la restricción, los oligonucleótidos sintéticos
se ligan con el fragmento grande purificado del vector digerido y
la mezcla de ligación se utiliza para transformar células de E.
coli. Típicamente, se producen bibliotecas que contienen
aproximadamente 10^{6} y 10^{8} transformantes. Los clones que
producen enzimas activas se seleccionan a partir de estas (véase más
adelante). La recombinación de clones que producen enzimas activas
en dos bibliotecas en las que se introducen mutaciones aleatorias en
partes diferentes de la secuencia se realiza para producir enzimas
con mimotopos discontinuos.
En una realización en la que se utiliza
manipulación genética, un gen que codifica una molécula diana, v.g.,
una enzima, puede clonarse en un vector de expresión adecuado para
la expresión de un polipéptido en un hospedador deseado. Se
contemplan diversos hospedadores, que incluyen células de mamífero
(v.g. humanas, de mono, o de roedor, tales como HeLa, COS,
Ltk^{-}, o CHO), células de insecto (v.g., Sf9 o Drosophila),
bacterias (v.g., E. coli, Streptococcus, o Bacillus),
levaduras, hongos, o plantas. Véase también Methods in
Enzymology, volumen 185, compilador D.V. Goeddel. La expresión
en Sf9 puede realizarse análogamente a Graziani et al.,
Oncogene, 7: 229-235, 1992. Se han utilizado
sistemas de fago filamentoso para expresar y seleccionar péptidos
en bacterias que se unen a moléculas de fijación, con inclusión de
anticuerpos (Scott y Smith, 249:386-390, 1990;
Grihalde et al., Gene, 166:185-195,
1995), estreptavidina (Kay et al., Gene,
128:59-65, 1993; Devlin et al.,
Science, 249:404-406, 1990),
DNA-ribonucleasa (Rebor y Pabo, Science,
263:671-673, 1994). Véase también Jespers et
al., Biotechnology, 13:378-382, 1995.
Véase también Parmley y Smith, Gene,
76:305-318, 1985; de la Cruz et al., J.
Biol. Chem., 263:4318-4322, 1988; Bass et
al., Proteins, 8:309-314, 1990; Cwirla
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:6378-6382, 1990; McCafferty et al.,
Nature, 348:552-554, 1990; Clackson et
al., Nature, 352:624-628, 1991; Lowman
et al., Biochemistry, 30:10823-10838,
1991; J. McCafferty et al., Prot. Eng., pp.
955-961, 1991; Kang et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88:4363-4366, 1991; Barbas
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:
7978-7982, 1991; Roberts et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2449-2433, 1992.
Polipéptidos preferidos para sistemas de expresión en fago
filamentoso son aquéllos que están plegados adecuadamente en el
fago, o al menos, que se presentan el fago en una forma totalmente
activa. Para identificar si una molécula de partida deseada es
adecuada, un ácido nucleico codificante de la molécula se clona en
el fago de una manera adecuada para expresión. La molécula expresada
se ensaya luego respecto a una actividad de acuerdo con métodos
convencionales. La manipulación genética de un BSM en la molécula
de partida puede realizarse luego de acuerdo con los procedimientos
arriba mencionados. Véase, v.g., Grihalde et al. Secuencias
de control de la expresión se seleccionan por su compatibilidad de
hospedador y para un propósito deseado, v.g., alto número de
copias, cantidades elevadas, inducción, amplificación, expresión
controlada, etc. Otras secuencias que pueden emplearse incluyen
intensificadores tales como los de SV40, CMV, promotores
inducibles, u otros elementos que permiten expresión celular
selectiva o específica.
La invención se refiere también a ácidos
nucleicos que codifican una molécula diana quimérica. Un ácido
nucleico de este tipo puede comprender adicionalmente diversas
secuencias, v.g., una o más secuencias de control de la expresión
enlazada(s) operativamente a una secuencia de nucleótidos que
codifica la molécula diana quimérica. La frase "secuencia de
control de la expresión" significa una secuencia de ácido
nucleico que regula la expresión de un ácido nucleico al cual está
enlazada operativamente. La expresión puede regularse al nivel del
mRNA o de polipéptido. Así, la secuencia de control de la expresión
incluye elementos relacionados con mRNA y elementos realizados con
proteínas. Tales elementos incluyen promotores, intensificadores
(virales o celulares), secuencias de fijación de ribosoma,
terminadores de la transcripción, etc. Una secuencia de control de
la expresión está enlazada operativamente a una secuencia
codificante de nucleótidos cuando la secuencia de control de la
expresión está posicionada de tal manera que efectúa o realiza la
expresión de la secuencia codificante. Por ejemplo, cuando un
promotor está enlazado operativamente en 5' a una secuencia
codificante, la expresión de la secuencia codificante está
impulsada por el promotor. Un ácido nucleico que codifica una
molécula quimérica incluye también ácidos nucleicos que se hibridan
a la misma, v.g., en condiciones severas, tales como condiciones
que permiten la selección de al menos 95 a 99% de identidad de
nucleótidos. Para una TM quimérica que es un polipéptido, una
molécula de ácido nucleico que codifica la misma incluye, v.g.,
degeneración de nucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen DNA y
RNA.
Pueden utilizarse también métodos químicos y/o
sintéticos para crear la molécula quimérica, v.g., los métodos de
construcción de compuestos por química combinatoria, como conocería
el operario experto.
Como se ha mencionado arriba, un aspecto de la
presente invención implica moléculas diana quiméricas que tienen
una actividad que puede estar regulada o modulada por una molécula
de fijación. Por la frase "con lo cual la actividad de la
molécula diana quimérica se modula después de la fijación de una
molécula de fijación", se entiende que la unión de la molécula
de fijación a la TM quimérica, preferiblemente en el BSM, afecta a
la actividad de la TM quimérica de una manera detectable. Si la TM
quimérica es una enzima tal como una
\beta-lactamasa, la molécula de fijación afectará
a su actividad en la hidrólisis del enlace
\beta-lactámico. El efecto de la molécula de
fijación puede ser reducir o incluso eliminar la actividad, v.g.,
reducir o eliminar su capacidad para escindir el enlace
\beta-lactámico. La molécula de fijación puede
afectar también la actividad de otras maneras, v.g., aumentarla,
cambiar su especificidad, activarla, etc.
En una realización preferida, se modifican por
manipulación genética secuencias peptídicas aleatorias en un sitio
seleccionado de una molécula diana, v.g., una enzima. Después de
modificación de la molécula diana de partida para producir una
biblioteca que contenga la molécula diana quimérica resultante con
un BSM manipulado genéticamente por inserción o reemplazamiento, es
deseable seleccionar aquellas moléculas quiméricas que han retenido
una actividad de la molécula diana de partida. Por la frase, "la
molécula diana quimérica tiene una actividad de la molécula diana
de partida", se entiende que la TM de partida tiene una actividad
y la TM quimérica resultante tiene asimismo una actividad. La
actividad de la TM quimérica puede ser diferente cuantitativa o
cualitativamente de la TM de partida. A modo de ilustración, en los
ejemplos que siguen, la enzima de partida es una
\beta-lactamasa. La
\beta-lactamasa es una enzima que hidroliza un
enlace \beta-lactámico. Diversos compuestos
pueden utilizarse como sustratos, con inclusión de penicilinas,
cefalosporinas, ampicilina, etc. Una
\beta-lactamasa quimérica que tiene un resto de
sitio de fijación, que reemplaza o está insertado además de los
aminoácidos existentes naturalmente, poseerá la capacidad para
hidrolizar un enlace \beta-lactámico. Esta
actividad en la \beta-lactamasa quimérica puede
ser, por ejemplo mayor o menor que la enzima de partida (v.g.,
contener una Kcat diferente o una Km diferente), y/o tener una
especificidad de sustrato
diferente.
diferente.
El primer paso consiste en seleccionar moléculas
quiméricas resultantes que retienen la actividad deseada. Si la
actividad deseada es una actividad enzimática, entonces puede
diseñarse un ensayo de selección para la misma. La selección de la
molécula deseada puede realizarse por diversos métodos como
conocería el operario experto. Por ejemplo, la selección puede
realizarse por color (v.g., en el caso en que la escisión por la
enzima produce un producto final que tiene un color detectable), por
conferir resistencia a clones que expresan una enzima activa (v.g.
resistencia a fármacos), etc. En una realización, el cribado se
realiza por extensión en placa de una biblioteca sobre un medio
sólido, adición de un sustrato cromógeno o fluorógeno, y observación
del desarrollo del producto en colonias individuales. La selección
in vivo puede aplicarse cuando la molécula es necesaria para el
crecimiento en presencia de antibióticos (resistencia a los
antibióticos; esta técnica se utiliza con la
\beta-lactamasa en los ejemplos), o cuando la
actividad se utiliza para complementación de un gen esencial
ausente en bacterias auxótrofas (v.g., auxotrofia para un
amino-ácido). La selección in vitro puede utilizarse también
cuando la enzima se presenta en fago; v.g., WO 93/11242.
Para medir la actividad de las enzimas
seleccionadas, puede utilizarse cualquier técnica clásica
espectrofotométrica, fluorométrica, potenciométrica (pHstato). En
particular, puede utilizarse la tecnología ORIGEN^{TM} (IGEN
Gaithersburg, MD) para detección de la formación de producto (Liang
et al., J. Am. Chem. Soc.,
118:9198-9199, 1996; Liang et al., Anal.
Chem., 68:2426-2431, 1996). Un paso siguiente de
selección consiste en identificar clones que se fijan a la molécula
de fijación. En una realización, la molécula diana quimérica se
expresa en un fago. La selección puede realizarse por técnica de
lavado en batea de anticuerpos, cromatografía en columna, etc.
Véase, v.g. Grihalde et al., Gene,
166:187-195 (1995); McNally et al., J.
Bio. Chem., 270:19744-19751, 1995; O'Neil y
Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol., 5:443-449,
1995. En otro aspecto de la invención, se utiliza elución de
sustrato para identificar una actividad de una molécula diana
quimérica que es inhibida por fijación de anticuerpos. Por ejemplo,
una enzima quimérica (v.g., presentada en un fago) que tenga un
mimotopo deseado se selecciona por su capacidad para ser reconocida
por un anticuerpo específico para el mimotopo. Para identificar una
enzima quimérica cuya actividad es inhibida por el anticuerpo, la
enzima quimérica se eluye del anticuerpo por la adición de un
sustrato apropiado. En otra realización, la molécula diana
quimérica se expresa en la superficie de la célula hospedadora (v.g.
una bacteria, una célula de insecto, una célula de mamífero) y la
selección puede realizarse sin lisis celular. La diana quimérica
puede expresarse también en el interior de la célula hospedadora y
realizarse posteriormente la selección, v.g., permeabilización o
lisis de las células, o haciendo de algún otro modo el producto
expresado accesible a la molécula de fijación.
Una molécula diana quimérica puede utilizarse
para detectar la presencia o cantidad de un analito en la muestra
de test. En una realización, una TM quimérica es una enzima
quimérica. La enzima quimérica se pone en contacto con (1) una
muestra de test que contiene un analito, y (2) un sustrato sobre el
cual actúa catalíticamente la enzima TM quimérica, para formar una
mezcla de reacción. La cantidad de analito presente en la mezcla de
reacción se determina por monitorización o detección de la cantidad
de catálisis sobre el sustrato realizada por la enzima quimérica,
en donde el analito modula la catálisis por la enzima quimérica. Una
muestra de test puede ser cualquier muestra que contenga un analito
cuya presencia o cantidad se desea conocer, v.g., fluidos
corporales tales como sangre, suero, orina, heces, o linfa,
homogeneizados de tejido, biopsias, fluidos orgánicos, medio de
cultivo de tejidos, etc. Por "analito" se entiende una molécula
cuya presencia en una muestra de test está siendo detectada. En una
realización, el analito es un anticuerpo, tal como un anticuerpo
específico del antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de
carcinoma embrionario (CEA), c-erbB2, productos de
oncogenes, virales (HIV o hepatitis), bacterianos (de
estafilococos), y la TM quimérica es una enzima quimérica. La
fijación o unión del anticuerpo o BM a la enzima quimérica puede
modular la catálisis sobre el sustrato por la enzima quimérica. La
modulación de la actividad se ha expuesto anteriormente. En un
ejemplo preferido, la actividad enzimática de la enzima quimérica
es reducida (desactivada) por el anticuerpo. Así, la presencia del
anticuerpo analito en la muestra de test puede ser determinada por
monitorización o detección de la reducción de actividad manifestada
por la enzima quimérica, sea como moléculas individuales o como una
población. Alternativamente, el analito es un polipéptido tal como
cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o fragmentos
de las mismas. Cuando la molécula quimérica está combinada con una
molécula de fijación apropiada, se modula su actividad.
En otro aspecto de la presente invención, la
actividad de una mezcla de reacción, que comprende una enzima
quimérica y una molécula de fijación (BM) que modula la actividad de
la enzima quimérica, puede verse afectada ulteriormente por un
analito (un ligando de la molécula de fijación). El analito puede
actuar como un competidor directo de la interacción de la enzima
quimérica con BM; la adición del analito compite o desplaza la
molécula de fijación de la TM, invirtiendo su efecto modulador
sobre la actividad detectable. En una realización, la molécula de
fijación desactiva la TM quimérica; la adición del analito dará como
resultado el restablecimiento de la actividad en la mezcla de
reacción.
El ensayo enzimático puede realizarse de acuerdo
con procedimientos conocidos. Por ejemplo, la actividad puede
monitorizarse temporalmente, cinéticamente, o por punto final. La
enzima quimérica puede encontrarse en solución o sobre un soporte
sólido, v.g. acoplada directamente o por la vía de acoplamiento
biotina-estreptavidina, a materiales tales como
celulosa, Sephadex, plásticos, polipropileno, poliestireno,
polivinilo, nitrato de celulosa, polietileno, nailon,
poli(metacrilato de metilo), etc. El acoplamiento puede
realizarse como conocería una persona con experiencia en la
técnica. Véase, v.g. Methods in Enzymology, volumen 73, para
diversas técnicas sobre sustratos, acoplamiento, y ensayos en
general. Por el término "contacto", de la molécula quimérica
con una muestra de test que contiene el analito o la molécula de
fijación, se entiende que el analito o la molécula de fijación se
pone en contacto con la molécula quimérica por un medio deseado. El
contacto puede realizarse por: adición de una muestra de test a una
solución que contiene la TM quimérica, inmersión de un soporte
sólido que contiene la enzima quimérica en una solución que contiene
el analito o BM, vertido por goteo de una solución que contiene un
analito sobre un soporte sólido que contiene la TM quimérica, etc.
Si se utiliza un sustrato, v.g., en el caso en que una TM quimérica
es una enzima, el sustrato puede ponerse en contacto con la enzima
quimérica al mismo tiempo que el analito, o antes o después, es
decir simultánea o sucesivamente.
Como se ha mencionado, la TM quimérica puede ser
cualquier molécula o analito que pueda adaptarse como conocería una
persona con experiencia ordinaria en la técnica para monitorización
o detección del cambio en la actividad de la TM quimérica
seleccionada.
En otro aspecto de la presente invención, un
analito es un competidor de una molécula de fijación. La presencia
o cantidad de competición con la molécula de fijación se utiliza
para averiguar su presencia. Un ejemplo de un proceso de este tipo
se describe en el Ejemplo 2. Se prepara una molécula quimérica (en
el ejemplo, es \beta-lactamasa) que tiene un
mimotopo reconocido por un anticuerpo específico para una molécula
deseada (en el ejemplo, la misma es el antígeno específico de
próstata o "PSA"). La fijación del anticuerpo al mimotopo
reduce la actividad de la molécula quimérica. El analito (en el
Ejemplo, es PSA) compite con el anticuerpo para fijación al
mimotopo. Así, si está presente el analito, se fija a la molécula
quimérica una cantidad menor del anticuerpo. Con menos anticuerpo
fijado a la molécula quimérica, la molécula quimérica es más activa
que en ausencia del analito.
Los ensayos de la presente invención son útiles
para usos médicos, veterinarios, ambientales, y diagnósticos de
diversos tipos, v.g., para detección de enfermedades, trastornos
patógenos, contaminación ambiental, contaminación de cultivos de
tejidos, etc. Por ejemplo: la presencia de cáncer en un paciente
puede determinarse por detección de la presencia de un antígeno o
anticuerpo característico. Es sabido que los individuos con cáncer
pueden tener niveles elevados de diversos antígenos, tales como
antígeno específico de próstata (PSA) o el antígeno de carcinoma
embrionario (CEA).
Para otros aspectos de los ácidos nucleicos,
polipéptidos, anticuerpos, etc., se hace referencia a libros de
texto estándar de biología molecular, ciencia de proteínas, e
inmunología. Véase, v.g., Davis et al. (1986), Basic
Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciences Publishing,
Inc., Nueva York; Hames et al. (1985), Nucleic Acid
Hybridization, IL Press, Molecular Cloning, Sambrook
et al.; Current Protocols in Molecular Biology,
recopilado por F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons,
Inc; Current Protocols in Human Genetics, recopilado por
Nicholas C. Dracopoli et al., John Wiley & Sons, Inc.;
Current Protocols in Protein Science; recopilado por
John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.;
Current Protocols in Immunology; recopilado por John E.
Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
Figs. 1a, 1b y 1c muestran los sitios de
inserción utilizados para generar las bibliotecas lib1 y lib3: lib1.
V103, 2. E104 y 3. Y105; lib3: 4. T271 y 5. M272; sitio catalítico
6. S70.
Figs. 2 y Fig. 3 son curvas que muestran el
efecto inhibidor del anticuerpo psa19 sobre una
\beta-lactamasa mutante psa19A; 302. Fig. 3 es
una curva que muestra un área expandida de Fig. 2, representando la
actividad enzimática como una función de psa19, entre 0 y 50
nM.
Fig. 4 es una curva que muestra el efecto del
anticuerpo psa19 sobre la actividad de p19Rb404 quimérico.
Figs. 5A y 5B son curvas que muestran el efecto
del anticuerpo psa66 sobre la actividad de p66Rb330 quimérico
utilizando dos sustratos diferentes, Centa y PADAC,
respectivamente.
Fig. 6 es una curva que muestra un ensayo de
antígeno psa realizado sobre PenG en presencia de
fago-enzima P19L3-01 y psa
19mAb.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción de las bibliotecas. El fago
filamentoso fd que lleva el gen de \beta-lactamasa
en fusión con la proteína de la cubierta pIII (fDb1A^{+}) se
describió en Soumillion, P., Jespers, L., Bouchet, M.,
Marchand-Brynaert, J., Winter, G. y Fastrez, J.
Selection of \beta-lactamase on Filamentous
Bacteriophage by Catalytic Activity. J. Mol. Biol. 237,
415-422 (1994). El mapa de restricción del fago se
da en la figura 1a; la secuencia del DNA del gen de
\beta-lactamasa R-Tem insertada
entre los sitios de restricción ApaLI y NotI manipulados
genéticamente dentro del gen del fago 3 se representa en la figura
1b junto con la secuencia de aminoácidos codificada. Se
construyeron tres bibliotecas, lib1, lib2 y lib3 por introducción en
el plásmido fDb1a^{+} de sitios de restricción singulares a ambos
lados de las regiones a aleatorizar (por mutagénesis orientada) y
por clonación, entre estos sitios, de pequeños fragmentos de DNA
parcialmente degenerados. Las inserciones se produjeron por
síntesis de oligonucleótidos de las secuencias deseadas y por
conversión de los mismos en DNA bicatenario mediante el
alargamiento de un pequeño iniciador que se hibridaba a la parte 3'
no degenerada de los oligonucleótidos. La biblioteca lib4 se
construyó por el intercambio de un fragmento de restricción
EcoRI-PvuI del plásmido fdB1a^{+} que abarcaba las
mutaciones lib1 en lugar del fragmento no mutado correspondiente
del plásmido fdB1a^{+} en la biblioteca lib3. Las bibliotecas de
DNA se sometieron a electroporación en la cepa TG1 de E.
coli. Detalles adicionales se proporcionan más adelante.
Preparaciones de stock
fago-enzima. Las bibliotecas
fago-enzima se produjeron por propagación de
bacterias electrotransformadas en grandes placas de 530 cm^{2}
que contenían medio LB sólido y tetraciclina a 7,5 \mug/ml. Los
transformantes se dejaron crecer durante 20 h a 37ºC y se
recuperaron luego por lavado de las placas con medio LB. Las
bacterias se desecharon por centrifugación y los fagos se
purificaron de los sobrenadantes por precipitaciones con PEG/NaCl.
Para aumentar el número medio de \beta-lactamasas
presentadas por fago, las bibliotecas de fago se reamplificaron en
medio líquido a 23ºC inmediatamente antes de seleccionarlas sobre
mAbs (1 \beta-lactamasa es presentado por fago a
23ºC comparado con 0,2 \beta-lactamasas por fago a
37ºC, datos no presentados). Las bibliotecas que se seleccionaron
para actividad se produjeron en las mismas condiciones excepto que
se extendieron en placas que contenían ampicilina (a 10 \mug/ml o
a 30 \mug/ml). Los clones individuales se amplificaron en todos
los casos a 23ºC en medio LB líquido.
Ensayos enzimáticos. La actividad de
\beta-lactamasa en el fago se ensayó en solución a
20ºC en tampón de fosfato de Na 50 mM, a pH 7,5. Excepto en los
casos en que se indica otra cosa, se utilizó como sustrato
bencil-penicilina (PenG). La disminución de la
absorbancia se midió a 232 nm en función del tiempo para
proporcionar los valores de kcat expresados en s^{-1} por mol de
fago-enzimas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han insertado secuencias aleatorias de
péptidos en la región 103-105 de la secuencia de la
\beta-lactamasa R-Tem (J.G.
Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:
3737-3741, 1995). El bucle en el borde del sitio
activo, en la región que abarcaba V103-V105, se
seleccionó como sitio de inserción-reemplazamiento
debido a que su posición está próxima a la bolsa catalítica y la
secuencia está poco conservada en esta región entre las
\beta-lactamasas de clase A. Véase Fig. 1c.
Se han construido dos bibliotecas lib1
diferentes, lib1A-B y lib1D sobre la base de un
vector desactivado. Ambas contienen una inserción de 6 aminoácidos
en sustitución de los residuos E104-Y105 y
V103-Y105, respectivamente. El tamaño teórico de
estas bibliotecas es 64.000.000 de secuencias diferentes. El vector
desactivado (fdB1aI1) se produjo por mutagénesis orientada de
fdB1a^{+} utilizando el método del fosforotioato (Nakamaye, K.C.
y Eckstein, F. (1986) Nucl. Acid Res. 14,
9679-9688). Este vector presenta dos sitios de
restricción nuevos, BbsI y SgrAI, y un codón de parada que
desactiva la enzima (esquema 1a).
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1a
Secuencia de fdB1aI1 entre los codones 100 y 109
del gen de \beta-lactamasa (los sitios de
restricción están subrayados, la base insertada para introducir el
codón de parada está escrita en negrilla, y los residuos
codificados se muestran bajo la secuencia de DNA):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon dos casetes de oligonucleótidos
bicatenarios como se muestra en el esquema 1b y 1c por condensación
de un pequeño iniciador en la parte 3' no degenerada del
oligonucleótido sintético que contenía las secuencias aleatorias,
alargamiento del iniciador catalizado por la polimerasa T4 y
purificación en poliacrilamida al 15%.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1b
Secuencia del oligonucleótido que contiene la
casete aleatoria y el iniciador:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
1c
Casete bicatenaria para la construcción de
lib1A-B (los sitios de restricción están subrayados,
los sitios de escisión para BbsI están indicados por flechas).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El vector se restringió con BbnsI y SgrAI y se
purificó en agarosa. La casete se restringió con BbsI y NgoMI. Un
exceso de 10 veces de la casete se ligó luego con el vector. El
vector contaminante fdB1aI1 se eliminó por digestión con BbsI. El
producto se resuspendió en 100 \mul de tampón en la preparación
para electroporación. Dos veces, 4 \mul de esta mezcla de
ligación se utilizaron para transformar células competentes TG1 a
fin de producir las bibliotecas lib1A y lib1B. Muestras de estas
bibliotecas se extendieron en placas sobre medio LB sólido que
contenía 10 \mug/ml de tetraciclina, permitiendo la determinación
del número de clones obtenidos por 4 \mul de electroporación, es
decir: 1,8 x 10^{6} y 4,7 x 10^{6} clones para lib1A y lib1B
respectivamente. Las actividades de las bibliotecas
lib1A-B se evaluaron por extensión de muestras de
bacterias sobre placas con concentraciones diferentes de ampicilina
y recuento de los clones obtenidos después de incubación a 37ºC o
23ºC. Estas titulaciones permitieron la determinación de las
condiciones para seleccionar inequívocamente clones con actividades
mayores que 30-40 s^{-1} (es decir, la incubación
a 37ºC durante 17 horas en las placas LB que contenían 10 \mug/ml
de ampicilina recién disuelta). Las actividades de las bibliotecas
son bajas, dado que solamente un 0,05% y 0,08% de sus clones son
capaces de crecer en 10 \mug de ampicilina/ml a 37ºC. Las medidas
de actividad realizadas sobre varios clones individuales
seleccionados en dichas condiciones confirmaron esta actividad.
Véase Tabla 1. Varios clones individuales han sido secuenciados. La
variabilidad de secuencia es moderada y están presentes clones con
secuencias acortadas. Esto se observó a pesar del hecho de que los
oligonucleótidos degenerados utilizados para construir las
inserciones se purificaron en acrilamida. El paso de purificación
es eficiente, pero las inserciones no son probablemente bien
toleradas en esta región, por lo que se seleccionan los escasos
clones activos correspondiente en gran parte con secuencias
acortadas.
Las fracciones activas de las bibliotecas
lib1A-B han sido producidas en gran escala (=
lib1C_{2} y lib1C_{4}). Lib1A-B deberían
contener 6,4 x 10^{7} veces 0,05%-0,08% clones que crecen en
placas que contienen 10 \mug/ml de ampicilina, es decir entre
32.000 y 51.000 clones. El propósito de los autores de la invención
es producir las bibliotecas completas de fago y DNA. Lo último se
utilizará para crear la biblioteca de recombinación lib4. A fin de
producir material suficiente para aislamiento de la biblioteca de
DNA, fueron necesarias dos tandas de tensión en placas sobre
cápsulas grandes. En la primera tanda, el producto de catorce
electroporaciones de 4 \mul se extendió en placa después de
dilución en 52 ml de medio Soc sobre dos cápsulas de 23 x 23 cm
(medio sólido que contenía 10 \mug/ml de tetraciclina y 10
\mug/ml de ampicilina.) Después de 18 horas de crecimiento a
37ºC, se recogieron las bacterias en 120 ml de medio LB líquido. Una
dilución de 60 veces de la solución de células diluida hasta una
densidad óptica a 600 nm de 0,5 se extendió en 10 cápsulas grandes
para producir 79.000 clones (libC2). El experimento se repitió y se
obtuvieron 150.000 clones (libC4). A partir de éstos, se prepararon
bibliotecas de fago y de DNA, respectivamente, como se describe en
el Ejemplo 1 y por métodos convencionales (Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory). Un pequeño número de clones individuales
se produjeron en cantidad para medir su actividad y determinar su
secuencia. Véase la Tabla 2.
Se utilizaron los mismos protocolos para
producir la biblioteca Lib1D. Se construyó una casete por conversión
del oligonucleótido auto-hibridante representado en
el esquema 1d en su forma bicatenaria (esquema 1e).
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1d
Secuencia del oligonucleótido
auto-hibridante que contiene la casete
aleatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1e
Casete bicatenaria para la construcción de
lib1A-B: los sitios de restricción están subrayados,
y los sitios de escisión para BbsI y NgoM1 se indican por
flechas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de purificación y restricción por BbsI y
NgoM1, esta casete se ligó al vector restringido y purificado con
agarosa fdB1aI1. El vector de clonación contaminante se eliminó por
digestión con BbsI y la mezcla de ligación se utilizó para la
transformación de células TG1 por electroporación. 3 \mul
proporcionaron 9,2 x 10^{6} transformantes entre los cuales 0,11%
producían una enzima suficientemente activa para crecer en un medio
que contenía 10 \mug/ml de Amp. La biblioteca completa (lib1D2) se
produjo como se ha descrito para lib1C2 y lib1C4. La actividad y
secuencia de unos cuantos clones se determinaron. Véase la Tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El bucle que precede a la hélice \alpha11
(residuos 271-272) de
\beta-lactamasa se seleccionó como sitio de
inserción debido a su posición relativamente próxima a la bolsa
catalítica y su pobre conservación de secuencia entre las
\beta-lactamasas conocidas. Esta región está
también bien localizada con relación al sitio de inserción de la
biblioteca lib1 (residuos 103-106) para la
construcción de un epítope no lineal. De hecho, estas dos regiones
se encuentran en los bordes opuestos del sitio activo. Véase Fig.
1c.
En un experimento, los aminoácidos T_{271} y
M_{272} de la \beta-lactamasa se intercambiaron
por una secuencia degenerada de 5 residuos que se intercambiaron
para dar la biblioteca lib3d. Esta biblioteca se construyó
siguiendo la estrategia utilizada para construir las bibliotecas
lib1. El vector desactivado (fdB1aI2) se produjo por mutagénesis
orientada de fdB1a^{+} utilizando el método del fosforotioato
(Nakamaye, K.C. y Eckstein, F. (1986), Nucl. Acid Res. 14,
9679-9688). Este vector presenta dos nuevos sitios
de restricción por BbsI y un codón de parada que desactiva la
enzima (esquema 2a).
\newpage
Esquema
2a
Secuencia de fdB1aI2 entre los codones 267 y 278
del gen de \beta-lactamasa (sitios de restricción
subrayados con los sitios de escisión indicados, base insertada para
introducir un codón de parada en negrita, residuos codificados bajo
la secuencia de DNA):
Se prepararon dos casetes oligonucleotídicas
bicatenarias como se muestra en el esquema 2b y 2c por condensación
de un pequeño iniciador en la parte 3' no degenerada del
oligonucleótido sintético que contenía las secuencias aleatorias,
alargamiento del iniciador catalizado por polimerasa T4 y
purificación en poliacrilamida al 15%.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2b
Secuencia del oligonucleótido que contiene la
casete aleatoria y del iniciador.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2c
Casete bicatenaria para la construcción de
lib3d: los sitios de restricción por Bbs1 están subrayados, y los
sitios de escisión se indican por flechas.
El vector y la casete se restringieron con BbsI.
Un exceso de 10 veces de la casete se ligó luego con el vector. El
vector contaminante fdB1aI2 se eliminó por digestión con BbnsI. El
producto se resuspendió en 100 \mul. 4 \mul de esta mezcla de
ligación se utilizaron para transformar células competentes TG1 y
producir las bibliotecas lib3d. Muestras de estas bibliotecas se
extendieron en placa sobre medio LB sólido que contenía 10
\mug/ml de tetraciclina para determinar el número de clones
obtenidos por 4 \mul de electroporación, es decir: 4,5 x 10^{5}
clones. Las actividades de la biblioteca se evaluaron por extensión
de muestras de bacterias transformadas sobre placas con
concentraciones diferentes de ampicilina y recuento de los clones
obtenidos después de incubación a 37ºC o 20ºC. De 2 a 3% de los
clones demostraron ser activos, es decir aproximadamente 8 x
10^{4} clones diferentes. La metionina en la posición 272 está
fuertemente conservada en los clones activos. Véase la Tabla 4.
Aproximadamente 1/3 de los clones seleccionados sobre 10 \mug de
ampicilina contenían secuencias más cortas que 5 residuos. Esto es
resultado de la presencia durante la clonación de la inserción
degenerada en el vector de \beta-lactamasa de un
pequeño porcentaje de oligonucleótido bicatenario acortado; los
clones de inserción más cortos se seleccionan firmemente después de
ello, dado que son más activos.
Aunque la biblioteca lib3d era suficientemente
grande y activa para recombinarse con lib1, su variabilidad sugirió
la construcción de una segunda biblioteca en la misma región pero
reemplazando únicamente el residuo T_{271}. El tamaño de la
inserción se aumentó a 6 aminoácidos, en lugar de 5, para tener en
cuenta la posición más alejada del nuevo sitio de inserción. La
biblioteca lib3f se construyó análogamente a lib3d por clonación de
una casete en el vector fdB1aI2, representándose la casete en el
esquema 2d.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2d
Casete bicatenaria para la construcción de
lib3f: los sitios de restricción con BbsI están subrayados, y los
sitios de escisión se indican por flechas.
La transformación de TG1 con 4 \mul de mezcla
de ligación proporcionó 7,0 x 10^{6} clones.
La biblioteca producida, lib3f, era muy activa
dado que aproximadamente el 7% de los clones eran capaces de crecer
sobre 10 \mug de ampicilina/ml a 37ºC. La secuenciación de varios
clones seleccionados en dichas condiciones indicó que los clones
activos tienen una gran variabilidad de secuencia y no contienen
secuencias de inserción acortadas. Véase la Tabla 5. Esto es
resultado del hecho de que los oligonucleótidos degenerados se
purificaron en gel de acrilamida.
Las fracciones activas de la biblioteca lib3f se
prepararon sometiendo tres veces a electroporación 100 \mul de
células TG1 con 6 \mul de mezcla de litigación (sic) y diluyendo
en primer lugar hasta 12 ml de medio Soc, y luego hasta 48 ml de
medio LB. Las bacterias se extendieron en 10 cápsulas grandes (23 x
23 cm) y se dejaron crecer durante 18 horas a 37ºC. Las bibliotecas
se recuperaron luego de las placas con tres veces 20 ml de medio LB
a 4ºC. Las bacterias se centrifugaron y el DNA bicatenario se
extrajo por métodos usuales y se purificó en gradientes de CsCl
para proporcionar grandes stocks de DNA; los fagos se purificaron
del sobrenadante (= lib3G). El tamaño de las bibliotecas,
aproximadamente 4 x 10^{6} clones activos diferentes, y la
actividad de la biblioteca lib3G deberían permitir selecciones
directas por afinidad con anticuerpos psa (véase más adelante).
Lib3B se manipuló análogamente para producir la biblioteca activa
lib3E.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las bibliotecas (lib1C2, 1C4 y 1D2 en la región
103-105, y lib3E y 3G en la región
271-272) se seleccionaron sobre ampicilina y
contienen esencialmente clones cuyas kcats son mayores que 40
s^{-1} (es decir \geq4% de actividad de tipo salvaje). Los
tamaños de las bibliotecas lib1 y lib3 son aproximadamente 1 x
10^{4} y 4 x 10^{6} clones, respectivamente.
Se realizó una selección ulterior de la
biblioteca lib3G sobre ampicilina antes de la recombinación de la
misma con la biblioteca lib1. La lib3G es muy grande y tiene una
gran diversidad de secuencias de tal modo que sólo se seleccionaron
los clones más activos. Es de esperar que esto aumente las
probabilidades de obtener una biblioteca recombinante activa. La
biblioteca lib3G se seleccionó en 30 \mug de ampicilina/ml a 37ºC,
lo que permitió la selección del 10% de sus clones. De este modo,
la actividad de la biblioteca se incrementó por un factor de
1,5.
Para construir la biblioteca recombinante, las
bibliotecas lib1C2, 1C4 y 1D2 se agruparon y se recombinaron con la
biblioteca lib3H. Las bibliotecas lib1 agrupadas anteriores y la
biblioteca lib3H se digirieron con EcoRI y PvuI. La biblioteca de
fragmentos grandes derivada de lib1 y la biblioteca de fragmentos
pequeños derivada de lib3H se purificaron en gel, se ligaron, y se
utilizaron para transformaciones. La biblioteca (rec1) era muy
activa, dado que aproximadamente el 20% de sus clones eran capaces
de crecer sobre 10 \mug ampicilina/ml a 37ºC. Esto significa que
el 20% de sus clones tienen actividades mayores que 40 s^{-1}. La
secuenciación de estos clones demostró que únicamente 2 clones/13
contenían simultáneamente una inserción completa en ambas
localizaciones. Véase la Tabla 6. Esta frecuencia es resultado de la
presencia en la biblioteca lib1 de aproximadamente 50% de
inserciones acortadas. Para determinar las actividades de los clones
construidos correctamente, se midieron las kcats de varios clones
no seleccionados sobre ampicilina. Entre 12 clones analizados,
únicamente 2 tenían actividades menores que 10 s^{-1}. Véase la
Tabla 7. Se deduce que los clones bien construidos poseen
actividades relevantes aun cuando la mayoría de ellos son
probablemente incapaces de crecer sobre 10 \mug
ampicilina/ml.
Se adoptaron varios enfoques diferentes de
clonación para obtener una biblioteca recombinante de gran tamaño.
La biblioteca óptima se produjo en gran escala (= lib rec4b) y
contiene aproximadamente 5 x 10^{7} clones diferentes. Esta
biblioteca no se sometió a ningún tratamiento ulterior antes de
selección sobre anticuerpos psa. La selección sobre ampicilina
puede utilizarse para amplificar la proporción de clones bien
construidos.
Se realizaron tres tandas de selección sobre las
bibliotecas lib3j (preparada por reunión de las bibliotecas lib3E,
lib3G(a) y lib3G(b)) y rec4b por lavado en batea sobre
cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M280
de Dynal AS, Oslo, Noruega) saturadas con los anticuerpos
biotinilados psa10 y psa66 como agentes de selección (de CanAg
Diagnostics AB, Gothenburg, Suecia). Los fagos que exhibían
\beta-lactamasas mutantes con afinidad alta para
los anticuerpos se extrajeron de estas bibliotecas. En cada caso se
obtuvo un factor de amplificación mayor que 1000 veces entre la
primera tanda de selección y la tercera (relación del número de
fagos eluidos entre las tandas de selección tercera y
primera-elución a pH bajo o por adición de
sustrato). Esto indica que se consiguió una selección eficiente.
El efecto de los mAbs sobre la actividad de las
enzimas se determinó después de incubación de los
fago-enzimas con diversas concentraciones de mAb
durante al menos 10 minutos antes de añadir el sustrato. Las tasas
de hidrólisis se determinaron siempre en condiciones en las que la
concentración de sustrato es al menos tres veces mayor que la
K_{m} de las enzimas modificadas, fijadas o no a su mAb
respectivo. Las constantes de disociación entre las enzimas y los
mAbs
se determinaron a partir de las curvas de inhibición presentadas en Fig. 2 sobre la base de las ecuaciones siguientes:
se determinaron a partir de las curvas de inhibición presentadas en Fig. 2 sobre la base de las ecuaciones siguientes:
donde [E]_{t} y
[mAb]_{t} son las concentraciones totales de enzima y
anticuerpo respectivamente, [E.mAb] es la concentración del
complejo enzima-mAb, kd es la constante de
disociación del complejo enzima-mAb, kcat E y kcat
E.mAb son las constantes catalíticas de la enzima libre y el
complejo.
Después de la tercera tanda de selección, se
determinó el efecto de la fijación del anticuerpo psa sobre la
actividad de PenG como sustrato en las bibliotecas seleccionadas; se
observó una ligera inhibición en el caso de la biblioteca rec4b
seleccionada con psa66 (\sim20% a 3,3 x 10^{-7}M de psa66). Este
efecto inhibidor alcanzaba 40-45% cuando se
utilizaron sustratos mayores (PADAC o Centa).
La caracterización de los fagos eluidos de la
tercera tanda de selección indicó que se ejercía una selección
fuerte sobre la región lib3 de las bibliotecas. Únicamente se
observó en esta localización una pequeña variabilidad de secuencia.
Véanse las tablas 8 y 9. No pudo encontrarse conservación de
secuencia alguna en la región lib1. Esta región podía contribuir
sin embargo a la fijación del anticuerpo, dado que los residuos de
tipo salvaje están reemplazados en estos clones. Sin embargo, se
cree que los epítopes psa10 y psa66 son probablemente lineales. En
el caso de los fagos seleccionados sobre psa66, pudo derivarse un
motivo de consenso SX_{(1-0)}L/IQ. Este motivo
estaba presente también en los clones aislados previamente de una
biblioteca creada en el bucle \omega (lib2) después de selección
sobre el mismo anticuerpo. Este motivo no se encuentra en la
secuencia de psa. Con psa66, se ha seleccionado un mimotopo. Se
encontró una secuencia HPQ en varios clones seleccionados sobre
psa10. Esto sugiere que la selección se llevó a cabo, al menos
parcialmente, sobre estreptavidina en lugar de hacerlo sobre el
anticuerpo. Dado que era visible un ligero precipitado en la
preparación biotinilada de psa10, es posible que el anticuerpo
estuviera desnaturalizado y no recubriera las cuentas de
estreptavidina. Se testó si la actividad de las bibliotecas lib3j y
rec4b, seleccionadas sobre psa10, podría estar regulada por
fijación de estreptavidina, pero no se obtuvo resultado positivo
alguno. Se observó una tenue estimulación en el caso de la
biblioteca rec4b.
Se han analizado varios clones individuales
seleccionados en psa66 de las bibliotecas lib3j y rec4b. Todos
ellos poseen altas actividades. Véase la Tabla 9. En cambio, no se
encontró regulación alguna en el caso de los clones aislados de la
biblioteca lib3j. Los clones seleccionados eran muy diversos, dado
que la secuencia en la región lib1 es variable y el nivel de
modulación dependía de los clones pero estaba comprendido
principalmente entre 30 y 60% de inhibición en PADAC (R.N. Jones
et al., Clin. Microbiol., 15:677-683,
1982) o Centa (R.N. Jones et al., Clin. Microbiol,
15:954-958, 1982) (a 3,3 x 10^{-7} M de psa66).
Este porcentaje puede ser tan alto como 70% o más cuando la
concentración de psa66 se incrementa a 1,7 x 10^{-6}M. La
inhibición es menos importante cuando se utiliza como sustrato
PenG. Se cree que la diferencia de comportamiento es en gran parte
resultado probablemente de la diferencia en el tamaño de los
sustratos, hidrolizándose menos rápidamente los sustratos mayores
en presencia del anticuerpo fijado. La inhibición máxima (a [psa66]
= \infty) se ha calculado para uno de los clones mejor regulados
(p66Rb316) y alcanza 68% en PADAC y 75% en Centa (kd = 1,2 x
10^{-7}M). Dado que la biblioteca rec4b seleccionada con psa66
parece contener muchos individuos diferentes, no puede excluirse
que estén presentes en ella clones mejor regulados.
En el clon p66Rb316, los residuos de tipo
salvaje E_{104}-Y_{105} están reemplazados por
T_{104}G_{105} y el residuo de tipo salvaje T_{271} está
reemplazado por DGSRQ. Inesperadamente, R_{275} está mutado a
Q_{275}. Estas secuencias no están presentes en el antígeno
específico de próstata (psa). Por consiguiente, el anticuerpo
monoclonal reconoce un mimotopo.
Se llevaron a cabo tres tandas de selección
sobre la biblioteca lib3j por lavado en batea utilizando el
anticuerpo psa19 (CanAg Diagnostics AB, Gothenburg, Suecia). Se
analizaron varios clones para regulación de la actividad por
fijación de psa19. Para realizar tales ensayos de actividad, la
enzima del fago se diluyó en tampón de fosfato 50 mM a pH 7, a una
concentración de 2,4 x 10^{-9}M. El anticuerpo monoclonal PSA19 se
añadió a una concentración final que varía entre cero y 2,6 \muM.
Después de 10 minutos, el sustrato
(bencil-penicilina) se añadió a una concentración
final de 5 x 10^{-4}M. La actividad se midió por determinación de
la tasa de disminución de la absorbancia a 232 nm. Una gráfica del
efecto inhibidor del anticuerpo monoclonal psa19 sobre la actividad
catalítica de la \beta-lactamasa mutante en el
fago identificado como psa19Aj302 y extraída de la biblioteca lib3j
se muestra en Figs. 2 y 3. Fig. 3 es una versión expandida de Fig.
2. La misma representa las actividades como función de [psa19]
entre 0 y 50 nM. La actividad se reduce a 60% para una concentración
del anticuerpo psa19 de 4 x 10^{-9}M y a 17% para saturación.
Esto permite la detección del analito psa a una concentración de nM
por observación de un aumento en la actividad.
En el clon psa19Aj302, el residuo de tipo
salvaje T_{271} estaba reemplazado por SWPVKS. Inesperadamente,
R_{275} estaba también mutado a Q_{275}. Estas secuencias no
están presentes en PSA. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal
reconoce un mimotopo.
Se aplicaron también tres tandas de selección a
la biblioteca rec4b utilizando el anticuerpo psa19. Se encontró un
clon cuya actividad estaba regulada por fijación del anticuerpo psa
(psa1919Rb404). El fago-enzima se diluyó en tampón
de fosfato 50 mM a pH 7, a una concentración de 2,4 x 10^{-9}M. El
anticuerpo psa se añadió a una concentración final que varía entre
cero y 2,6 \muM. Después de 10 minutos, se añadió el sustrato
(bencil-penicilina) a una concentración final de 5
x 10^{-4}M. Se midió la actividad por determinación de la tasa de
disminución de la absorbancia a 232 nm. Se encontró una kcat de 134
s^{-1} en ausencia de psa19. La fijación de psa19 inhibe la
actividad al 8% de la encontrada en ausencia de anticuerpo. La mitad
del efecto se observa a una concentración de psa19 de 50 nM (Kd = 5
x 10^{-8}M para el complejo entre psa19 y el mutante de
\beta-lactamasa). Véase Fig. 4. La secuenciación
de este clon reveló que los residuos de tipo salvaje
E_{104}-Y_{105} estaban reemplazados por
Q_{104}-G_{105} y el residuo de tipo salvaje
T_{271} estaba reemplazado por la secuencia GPWPRQ. Esta
secuencia no está presente en psa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han construido dos grandes bibliotecas, a
saber, lib3j y rec4b. Estas bibliotecas son muy activas y permitían
la selección de anticuerpos de clones cuyos valores kcat oscilan
entre 3 y 13% del correspondiente al clon Fdb1a de tipo salvaje. La
construcción de una biblioteca activa se supuso que era un requisito
previo en el descubrimiento de mutantes regulables de
\beta-lactamasa. La Tabla 10 recopila los
resultados del cribado de lib3 y lib4.
Una selección simple y satisfactoria por
afinidad de la biblioteca rec4b ha permitido clones que están
fuertemente regulados por su pareja de fijación, es decir, por el
anticuerpo psa66.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se llevó a cabo la identificación de varios
clones bien regulados aislados en mAbs de psa a partir de las
bibliotecas lib3 y lib4. La mayoría de los clones contienen una
inserción completa en el bucle C (clones lib3 y lib4) pero
únicamente mutaciones puntuales en el bucle A (clones lib4). La
falta de una inserción completa en el bucle A es resultado del
hecho de que aproximadamente el 50% de los clones lib1 activos
utilizados para la construcción de la biblioteca lib4 no contenían
un inserción completa. Estos clones proceden de la selección in
vivo para actividad de las bibliotecas lib1 debido a que tienen
una ventaja de crecimiento sobre la mayoría de los clones lib1,
correcta pero deficientemente activos (los clones que contienen
selecciones incorrectas representan menos del 0,1% de los clones
lib1 no seleccionados). En el bucle C, se encuentran varias
mutaciones "extra" fuera de la región mutagenizada, pero
dentro del fragmento sintetizado in vitro utilizado para
clonar las bibliotecas. Estos clones parecen haber sido también
amplificados preferentemente durante la selección in vivo
para actividad. Todos los clones se testaron sobre el sustrato de
penicilina bencilpenicilina (PenG) y sobre el sustrato de
cefalosporina PADAC. Únicamente se ilustran los resultados obtenidos
con el sustrato que daba las inhibiciones más importantes. Los
valores de inhibición (actividades relativas) se determinaron en
presencia de una concentración saturante de mAb.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la biblioteca lib1 por lavado en
batea directamente sobre las Dynabeads M280 para extraer enzimas de
fago reguladas por fijación a estreptavidina. Se encontró un clon
con una kcat de 20 s^{-1}, una constante de fijación de
estreptavidina Kd = 1,2 x 10^{-7} y un factor de inhibición de
1,3. La adición de biotina a una concentración de 5 x 10^{-7}
restablecía la actividad a la observada en ausencia de
estreptavidina. La secuencia del péptido insertado entre L_{102}
y S_{106} en sustitución de V_{103}-Y_{105}
era YHPQNS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo tres tandas de selección
sobre la biblioteca Rec4B por lavado en batea utilizando el
anticuerpo psa66 (CanAg Diagnostics AB, Gothenburg, Suecia). El
clon p66Rb330 se seleccionó y se analizó en cuanto a regulación de
la actividad por fijación de psa66. Se utilizaron dos sustratos. El
efecto observado dependía del sustrato. Véanse Figs. 5A y 5B. Con
Centa como sustrato, se observó una activación de 1,72 veces. Con
PADAC, se observó una inhibición de 2,6 veces. Ambas curvas
activación/inhibición pueden ajustarse con la misma constante de
fijación entre el anticuerpo monoclonal psa66 y la enzima: Kd = 360
nM. Este clon se ha secuenciado: los residuos de tipo salvaje
V_{103}-Y_{105} estaban reemplazados por LLAGY,
y los residuos de tipo salvaje T_{271}-R_{275}
estaban reemplazados por DLGAV. Estas secuencias no están presentes
en PSA y por tanto el anticuerpo monoclonal reconoce un
mimotopo.
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca 3 se cribó y se seleccionó de ella
el clon P19L3-01. Véanse el Ejemplo 3 y la Tabla 10.
Este clon exhibía la inhibición óptima con el mAb psa19 (kd = 5
nM). Este clon se dejó crecer y se utilizó en un estudio de su
respuesta a la competición con el antígeno psa y el mAb psa10. Se
utilizó como sustrato PenG en tampón de fosfato 50 mM de pH 7,5, en
presencia de 1 nM del fago-enzima
P19L3-01, 5 nM de mAb psa19, 200 ng/ml de BSA con
diversas concentraciones de antígeno psa. Los niveles de antígeno
psa se hicieron variar desde 0,1 nM a 150 nM. Se utilizó la kcat
(s^{-1}) como medida de la actividad. Véase Fig. 6.
Claims (11)
1. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende:
(a) preparar ácidos nucleicos que codifican una
enzima quimérica, en donde la actividad de la enzima quimérica se
modula por fijación de una molécula de fijación, en donde dichos
ácidos nucleicos se preparan por un método que comprende:
- (i)
- proporcionar bibliotecas de oligonucleótidos sintéticos degenerados que codifican mimotopos;
- (ii)
- expresar una biblioteca de enzimas quiméricas candidato preparadas por inserción de dichos oligonucleótidos en secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima de partida para producir enzimas quiméricas candidato;
- (iii)
- proporcionar una molécula de fijación;
- (iv)
- cribar las enzimas quiméricas candidato expresadas para determinar si la actividad de la enzima quimérica candidato se modula por fijación de dicha molécula de fijación a dicha enzima quimérica candidato e identificar al menos una enzima quimérica con actividad modulada; y
- (v)
- aislar ácidos nucleicos que codifican dicha enzima quimérica de dicha biblioteca;
(b) expresar un ácido nucleico preparado de
acuerdo con la parte (a) para producir una enzima quimérica;
(c) poner en contacto la enzima quimérica con
(1) la muestra de test, (2) una molécula de fijación que se fija a
un mimotopo de la enzima quimérica, y (3) un sustrato sobre el cual
actúa catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla
de reacción; y
(d) detectar la cantidad de catálisis del
sustrato producida por la enzima quimérica, en donde la molécula de
fijación modula la catálisis por la enzima quimérica en donde dicho
analito actúa como competidor directo de la interacción de la
enzima quimérica con la molécula de fijación.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual la molécula de fijación es un anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de test, que comprende:
(a) preparar una enzima quimérica por un método
como se define en las partes (a) y (b) de la reivindicación 1;
(b) poner en contacto la enzima quimérica con
(1) la muestra de test y (2) un sustrato sobre el cual actúa
catalíticamente la enzima quimérica, para formar una mezcla de
reacción; y
(c) detectar la cantidad de catálisis del
sustrato alcanzada por la enzima quimérica, en donde el analito
modula la catálisis por la enzima quimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
4. En método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual el analito y el sustrato se ponen en contacto con la
enzima quimérica simultáneamente.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual el analito se pone en contacto con la enzima quimérica
antes del contacto del sustrato con la enzima quimérica.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual el analito es un anticuerpo.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el cual la enzima de partida es
\beta-lactamasa.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 3, en el cual la muestra de test contiene el analito.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual el analito es antígeno específico de próstata.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 3, en el cual la muestra de test es suero.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
3, en el cual el analito es un anticuerpo específico para el
antígeno específico de próstata.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US757425 | 1977-01-06 | ||
| US08/757,425 US6500660B1 (en) | 1996-11-27 | 1996-11-27 | Chimeric target molecules having a regulatable activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2336634T3 true ES2336634T3 (es) | 2010-04-14 |
Family
ID=25047774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97952131T Expired - Lifetime ES2336634T3 (es) | 1996-11-27 | 1997-11-26 | Moleculas diana quimericas que tienen una actividad regulable. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6500660B1 (es) |
| EP (1) | EP0958351B1 (es) |
| JP (1) | JP4416185B2 (es) |
| AT (1) | ATE449166T1 (es) |
| AU (1) | AU5571998A (es) |
| DE (1) | DE69739664D1 (es) |
| DK (1) | DK0958351T3 (es) |
| ES (1) | ES2336634T3 (es) |
| PT (1) | PT958351E (es) |
| WO (1) | WO1998023731A2 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002214798B2 (en) * | 2000-11-08 | 2006-10-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method of identifying antibacterial compounds |
| WO2003004989A2 (en) | 2001-06-21 | 2003-01-16 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
| KR100428998B1 (ko) * | 2001-09-10 | 2004-04-28 | 한국과학기술원 | 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법 |
| GB0209878D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| TR201820051T4 (tr) * | 2008-06-19 | 2019-01-21 | Prothix Bv | Anti-faktör XI Antikorlarının Trombüs Oluşumunun Engellenmesi Veya Tedavisi İçin Kullanılması |
| DE102022000897A1 (de) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Ruhr-Universität Bochum, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Implantierbarer Biosensor |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002757A1 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-21 | Saramane Pty. Ltd.; | Hybrid proteins or polypeptides |
| EP0397834B1 (en) * | 1988-10-28 | 2000-02-02 | Genentech, Inc. | Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants |
| WO1992007090A1 (en) * | 1990-10-22 | 1992-04-30 | Genentech, Inc. | Methods for modifying and detecting the effects on the interaction of modified polypeptides and target substrates |
| AU4238893A (en) * | 1992-05-07 | 1993-11-29 | Regents Of The University Of California, The | Novel diphtheria toxin-based molecules |
| US5674681A (en) * | 1994-12-06 | 1997-10-07 | Rothenberg; Barry E. | Methods to identify hemochromatosis |
-
1996
- 1996-11-27 US US08/757,425 patent/US6500660B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-26 ES ES97952131T patent/ES2336634T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-26 AU AU55719/98A patent/AU5571998A/en not_active Abandoned
- 1997-11-26 EP EP97952131A patent/EP0958351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-26 PT PT97952131T patent/PT958351E/pt unknown
- 1997-11-26 DE DE69739664T patent/DE69739664D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-26 JP JP52642798A patent/JP4416185B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-26 DK DK97952131.7T patent/DK0958351T3/da active
- 1997-11-26 AT AT97952131T patent/ATE449166T1/de active
- 1997-11-26 WO PCT/IB1997/001643 patent/WO1998023731A2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE449166T1 (de) | 2009-12-15 |
| EP0958351A2 (en) | 1999-11-24 |
| DK0958351T3 (da) | 2010-03-15 |
| WO1998023731A2 (en) | 1998-06-04 |
| JP4416185B2 (ja) | 2010-02-17 |
| DE69739664D1 (de) | 2009-12-31 |
| JP2001515346A (ja) | 2001-09-18 |
| US6500660B1 (en) | 2002-12-31 |
| WO1998023731A3 (en) | 1998-11-12 |
| PT958351E (pt) | 2010-02-17 |
| AU5571998A (en) | 1998-06-22 |
| EP0958351B1 (en) | 2009-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT1658858E (pt) | Utilização de toxina botulínica para o tratamento da disfunção urinária recalcitrante | |
| JP5051958B2 (ja) | 大腸菌ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼに基づくタンパク質とタンパク質、タンパク質と低分子およびタンパク質核酸の相互作用を検出するためのタンパク質断片相補性分析（ＰＣＡ） | |
| JP4251406B2 (ja) | ウォーク―スルー突然変異誘発 | |
| Sahin-Toth et al. | Properties of permease dimer, a fusion protein containing two lactose permease molecules from Escherichia coli. | |
| US5314817A (en) | Catalytic and reactive polypeptides and methods for their preparation and use | |
| US6194550B1 (en) | Systematic polypeptide evolution by reverse translation | |
| WO1992002536A1 (en) | Systematic polypeptide evolution by reverse translation | |
| CN108017712B (zh) | 一种鲨鱼抗体来源的蛋白骨架及其应用 | |
| Fastrez | In vivo versus in vitro screening or selection for catalytic activity in enzymes and abzymes | |
| Moore et al. | The development of β-lactamase as a highly versatile genetic reporter for eukaryotic cells | |
| ES2336634T3 (es) | Moleculas diana quimericas que tienen una actividad regulable. | |
| Vanwetswinkel et al. | Selection of β-lactamases and penicillin binding mutants from a library of phage displayed TEM-1 β-lactamase randomly mutated in the active site Ω-loop | |
| JP2001514849A (ja) | コイルドコイルおよび付加部位を含むポリペプチド | |
| Suliman et al. | Directed evolution provides insight into conformational substrate sampling by SrtA | |
| Nixon et al. | Rational and “irrational” design of proteins and their use in biotechnology | |
| WO2003060073A2 (en) | An in vivo protein screen based on enzyme-assisted chemically induced dimerization ('cid') | |
| Siemers et al. | Modifying the specificity and activity of the Enterobacter cloacae P99 β-lactamase by mutagenesis within an M13 phage vector | |
| US7138265B1 (en) | Chimeric target molecules having a regulatable activity | |
| Ting et al. | Phage‐display evolution of tyrosine kinases with altered nucleotide specificity | |
| US6566062B1 (en) | Method for identifying a nucleic acid | |
| Strobel et al. | In vitro selection for enzymatic activity: A model study using adenylate cyclase | |
| Hung et al. | Biphasic denaturation of human placental alkaline phosphatase in guanidinium chloride | |
| Park et al. | Genetic screen to dissect protein–protein interactions: ribonuclease inhibitor–ribonuclease A as a model system | |
| KR0173131B1 (ko) | 워크-쓰루우 돌연변이생성 | |
| Gutierrez | Kinase Cdk1 and kinesin Kar3 regulate the Dam1 complex in its role to strengthen kinetochore-microtubule attachment |