ES2336657T3 - Acidos nucleicos para la identificacion de hongos y procedimientos para usarlos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para detectar hongos dimórficos seleccionados de Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei; Paracoccidioides brasiliensis y un híbrido de los mismos, que comprende: detectar la hibridación entre una sonda dimórfica y una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) de un hongo dimórfico en una muestra, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, y en el que la presencia de la hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

Description

Ácidos nucleicos para la identificación de hongos y procedimientos para usarlos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la identificación de hongos, incluyendo procedimientos de identificación de hongos basados en características genéticas únicas, tales como el uso de sondas de ácido nucleico para detectar la presencia e identificar nucleótidos obtenidos de especies y clases de hongos.

Antecedentes de la invención

La incidencia de enfermedades causadas por hongos patógenos y oportunistas ha aumentado a lo largo de la última década. Véase, p. ej., McNeil, M.M., y col., Clin. Infect. Dis. 33:641-47 (2001); Ampel, N.M., y col., Clin. Infect. Dis. 27:1528-30 (1998); National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System report, resumen de datos de enero de 1990 a mayo de 1999, Am. J. Infect. Control 27:520-32 (1999). En seres humanos, estas infecciones fúngicas son especialmente prevalentes en personas con sistemas inmunitarios suprimidos, tales como pacientes VIH positivos y gravemente enfermos. Por ejemplo, Penicillium marneffei es la tercera causa más común de infecciones oportunistas en pacientes con SIDA en Tailandia. Vanittanakom N., Sirisanthana T., Curr. Top. Med. Mycol. 8:35-42 (1997). Además, se ha reconocido que P. chrysogenum y P. citrinum son la causa de la enfermedad humana.

El diagnóstico de infecciones fúngicas es hace normalmente aislando el organismo infeccioso en cultivo, mediante ensayos serológicos o por examen histopatológico del tejido. Véase, p. ej., Hamilton, A.J., Med. Mycol. 36:351-64 (1998). Sin embargo, los hongos patógenos pueden necesitar semanas para crecer y un cultivo positivo puede representar una colonización benigna más que la invasión e infección reales, en especial cuando se aíslan organismos oportunistas. Los ensayos serológicos en una sola muestra de suero para detectar anticuerpo antifúngicos circulando pueden ser poco concluyentes (especialmente en sujetos inmunosuprimidos). La adquisición de sueros pareados de la fase aguda y convaleciente, que es necesaria para un diagnóstico serológico definitivo, requiere de 3 a 4 semanas adicionales antes de poder obtenerse el suero de la fase convaleciente. Morrison C.J., y Lindsley, M.D., en Fungal Pathogenesis: Principles and Clinical Applications (New York: Marcel Dekker Inc., 2001; Calderone R.A., y Cihlar R.L., eds.). Por lo tanto, el examen histopatológico de secciones de tejidos a menudo era el más rápido, y a veces el único procedimiento disponible para diagnosticar la enfermedad fúngica invasiva. Sin embargo, el diagnóstico histopatológico de las infecciones fúngicas se hace a menudo por criterios morfológicos, y los hongos con características morfológicas atípicas pueden ser difíciles de identificar y diagnosticar. Además, los hongos para los cuales se pueden usar diferentes terapias antifúngicas, a menudo parecen morfológicamente similares en secciones de tejidos.

El desarrollo relativamente reciente de la síntesis de ADN automatizada, ha permitido la producción de sondas moleculares con propiedades consistentemente definidas, que pueden dar mayor sensibilidad, especificidad y reproducibilidad en los ensayos. La investigación anterior en la identificación molecular de hongos se ha concentrado típicamente en una sola especie o género de hongo. Véase, p. ej., LoBuglio, K.F., y J.W. Taylor, J. Clin. Microbiol. 33:85-89 (1995); Loffler, J., y col., Med. Mycol. 36:275-79 (1998). Por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.631.132; 5.426.027; 5.635.353; y 5.645.992; y publicación PCT WO 98/50584, describen sondas de ácido nucleico y procedimientos para detectar especies fúngicas, basadas en una determinada región (la región ITS2) del ADNr.

Qin y col. (2001) Abstracts of the Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 41:385, J-838, describen el uso de sondas de ADN específicas de especie, dirigidas a la región espaciadora de transcripción interna 2 (ITS2) para diferenciar P. marneffei de otras especies de Penicillium y de algunos otros hongos médicamente importantes.

El documento WO 99/06596 describe sondas de ácido nucleico dirigidas a la región espaciadora de transcripción interna 2 y a su uso para detectar especies de Candida.

Fujita y col. (1995) J. Clin. Microbiol, 33:4, 962-967, describen un inmunoensayo enzimático en placa de microvaloración para detectar el ADN amplificado por la PCR de especies de Candida.

Elie y col. (1998) J. Clin. Microbiol, 36:11, 3260-3265, describen la identificación de especies de Candida con sondas específicas de especie, dirigidas a la región ITS2 del gen para el ARNr.

El documento US 5955274 describe la detección de aislados fúngicos usando cebadores específicos.

Reiss y col. (1998) Med. Mycol., 36: Suplemento 1, 249-257, describen el diagnóstico molecular y la epidemiología de infecciones fúngicas, incluyendo el uso de sondas de ADN dirigidas a la región ITS2 de las especies de Candida.

White y col. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, San Diego, Academic Press, 315-322, describen la amplificación y secuenciación directa de genes de ADN ribosómicos fúngicos para la filogenética.

El documento US 5558990 describe sondas de ensayo de hibridación dirigidas a la subunidad de ARNr 18S, que distinguen B. dermatitidis y P. brasiliensis de otras especies fúngicas.

Además, algunos procedimientos de identificación molecular de hongos pueden ser muy difíciles o incómodos de llevar a cabo, o requieren un equipamiento especializado y caro. Véase, p. ej., Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 35:1894-96 (1997); Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:2913-19 (1995); y Turenne, C.Y., y col., J. Clin. Microbiol. 37:1846-51 (1999).

Resumen

Se describe un procedimiento para detectar un hongo dimórfico, como se define en las reivindicaciones. Se puede usar cualquier muestra adecuada, incluyendo una muestra biológica (p. ej., sangre, esputo, lavado broncoalveolar o tejido de biopsia), y el ácido nucleico se puede amplificar dentro de la muestra, tal como por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En realizaciones particulares, se detecta e identifica el ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático (PCR-EIA). La presencia del ácido nucleico indica que la muestra estuvo en contacto con el hongo, tal como las muestras que contienen actualmente el hongo. Los hongos dimórficos incluyen, pero no se limitan a Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis y Penicillium marneffei.

Si se usa la PCR para amplificar el ácido nucleico en la muestra, se puede usar un cebador ITS1 o ITS4 (listado en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). Aunque se puede usar la secuencia de ITS3 (SEQ ID NO: 3) como sonda, ITS3 también se puede usar como un cebador para la PCR para amplificar la región ITS2.

Se puede preparar una muestra procesando y extrayendo ácidos nucleicos de una muestra. En algunas realizaciones, se usa una técnica de extracción de ARN de alto rendimiento para extraer el ADN de células fúngicas. En realizaciones particulares, se puede usar una mezcla de varios tipos de microesferas de vidrio diferenciadas por tamaño (p. ej., diámetros de aproximadamente 106 \mum, aproximadamente 0,5 mm y aproximadamente 3 mm) o diferenciadas de acuerdo con una relación de tamaños particular (p. ej., una relación de tamaños de una primera microesfera a una segunda microesfera de aproximadamente 1:5, una relación de tamaños de una segunda microesfera a una tercera microesfera de aproximadamente 1:6, y una relación de tamaños de la primera microesfera a la tercera microesfera de aproximadamente 1:30).

La determinación de si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra, se puede llevar a cabo por una variedad de técnicas. De acuerdo con la presente invención, se hibrida una sonda con un ácido nucleico de ITS2, indicando la detección de la hibridación que el ácido nucleico de ITS2 está presente en una muestra (y que la muestra se ha puesto en contacto con un hongo dimórfico). La sonda comprende al menos 15 nucleótidos contiguos, en algunas realizaciones al menos 20 nucleótidos contiguos, de la secuencia de la sonda: Dm (SEQ ID NO: 4). En realizaciones más particulares, la sonda consiste esencialmente en Dm.

En un aspecto la invención proporciona un procedimiento para detectar un hongo dimórfico seleccionado de: Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei; Paracoccidioides brasiliensis e híbridos de los mismos, que comprende:

detectar la hibridación entre una sonda dimórfica y una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) de un hongo dimórfico en una muestra, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, y en el que la presencia de hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para diferenciar la presencia de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Penicillium marneffei, o Paracoccidioides brasiliensis, aparte de la presencia o ausencia de Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, una especie de Candida o Pneumocystis carinii, que comprende:

poner en contacto una muestra que contiene un hongo dimórfico que tiene una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) con una sonda dimórfica, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4; y

detectar una hibridación entre la secuencia de ácido nucleico del ITS2 y la sonda dimórfica, en el que la detección de la hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

También se describen kits y disposiciones para llevar a cabo estos procedimientos.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1A y 1B. Ilustran un procedimiento generalizado de reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático (PCR-EIA).

Figura 2. Es un diagrama del ADNr fúngico, que incluye los sitios de hibridación de cebadores y sondas.

Figuras 3A y 3B. Ilustran un alineamiento de secuencia que indica la sonda dimórfica (Dm) de varias especies de hongos y las localizaciones de sondas específicas de microbios.

Figura 4. Es una imagen digital de productos de la PCR amplificados a partir de ADN extraído de hongos que usan el procedimiento de alto rendimiento descrito y separados por tamaño en un gel de agarosa.

Figura 5. Es una imagen digital de un gel de agarosa que demuestra la sensibilidad de la PCR basada en el ADN genómico fúngico aislado por el procedimiento de alto rendimiento descrito.

Figura 6. Es una imagen digital de un gel de agarosa que demuestra la detección de amplicones separados por electroforesis en gel.

Figura 7. Es una imagen digital de los productos de la PCR amplificados a partir del ADN fúngico y separados por tamaño en un gel de agarosa.

Lista de secuencias

Las secuencias de ácidos nucleicos listadas en la lista de secuencias adjunta, se muestran usando las abreviaturas de letras convencionales para bases de nucleótidos. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por referencia a la cadena presentada.

SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ácido nucleico del cebador directo universal fúngico ITS1.

SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de ácido nucleico del cebador inverso universal fúngico ITS4.

SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de ácido nucleico de la sonda de captura universal fúngica o cebador directo ITS3.

SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda para hongos dimórficos endémicos.

SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Histoplasma capsulatum.

SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Blastomyces dermatitidis.

SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Coccidioides immitis.

SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Paracoccidioides brasiliensis.

SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Sporothrix schenckii.

SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Penicillium marneffei.

SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Cryptococcus neoformans.

SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Pneumocystis carinii.

SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Penicillium citrinum.

SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de ácido nucleico de una sonda de la región de ITS2 de Penicillium purpurogenum.

Descripción detallada Explicación de los términos

Salvo que se indique lo contrario, se usan términos técnicos de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular, se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 1999; Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994; y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; y otras referencias similares.

Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", se refieren tanto al singular como al plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "una sonda" incluye una o varias sondas y se puede considerar equivalente a la frase "al menos una sonda".

Tal como se usa en el presente documento, el término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, "que comprende una sonda dimórfica" significa "que incluye una sonda dimórfica" sin excluir otros elementos.

El término "o" se refiere a un solo elemento de elementos alternativos expuestos o una combinación de dos o más elementos. Por ejemplo, la frase "la sonda comprende 15 nucleótidos contiguos" de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10, se refiere a una sonda que comprende 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, una sonda que comprende 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 10, o una sonda que comprende 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4 y 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 10.

Con el fin de facilitar la revisión de diferentes realizaciones de la invención, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos:

Amplificación: una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ADN o ARN) se refiere a usar una técnica que aumenta el número de copias de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Un ejemplo de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que una muestra se pone en contacto con un par de cebadores oligonucleótidos en condiciones que permiten la hibridación de los cebadores a un molde de ácido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden en condiciones adecuadas, se disocian del molde, reasocian, extienden y disocian para amplificar el número de copias del ácido nucleico. El producto de amplificación se puede caracterizar por técnicas tales como electroforesis, patrones de escisión de endonucleasa de restricción, hibridación o ligado de oligonucleótidos y/o secuenciación de ácidos nucleicos.

El procedimiento de amplificación se puede modificar en determinadas realizaciones, incluyendo, por ejemplo, la modificación por etapas adicionales o acoplamiento de la amplificación con otro protocolo. Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 8, se puede usar un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático (PCR-EIA) para la amplificación y diferenciación de hongos. Dicho procedimiento de PCR-EIA se describe en Elie, C.M., y col., J. Clin. Microbiol. 36:3260-65 (1998); y Fujita, S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:962-67 (1995), y dicho procedimiento de PCR-EIA se puede modificar para adecuarse a realizaciones particulares.

Las figuras 1A-B ilustran un procedimiento de PCR-EIA generalizado. Los amplicones desnaturalizados se hibridan con una sonda de captura marcada con biotina (B) y una sonda de detección marcada con digoxigenina (D) en un tubo Eppendorf® antes de la adición a los pocillos de una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina (B). Después se añade el anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante, y los amplicones unidos a los pocillos se detectan colorimétricamente a A_{650nm} después de añadir el sustrato TMB-H_{2}O_{2}.

Otros ejemplos de amplificación incluyen la amplificación por desplazamiento de cadena, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.744.311; amplificación isotérmica sin transcripción, como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.033.881; amplificación por reacción en cadena de reparación, como se describe en el documento WO 90/01069; amplificación por reacción en cadena de la ligasa, como se describe en el documento EP-A-320.308; amplificación por reacción en cadena de la ligasa de llenado de huecos, como se describe en el documento 5.427.930; y amplificación sin transcripción de ARN NASABA^{TM}, como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.025.134.

Animal: un organismo vertebrado o invertebrado pluricelular vivo, una categoría que incluye, por ejemplo mamíferos y pájaros. El término mamífero incluye mamíferos tanto humanos como no humanos. Igualmente, el término "sujeto" incluye sujetos tanto humanos como veterinarios.

Muestra: abarca una muestra obtenida de un animal, planta o el ambiente. Una "muestra ambiental" incluye una muestra obtenida de objetos inanimados o depósitos en un ambiente interior o exterior. Las muestras ambientales incluyen, pero no se limitan a: suelo, agua, polvo y muestras de aire; muestras a granel, incluyendo materiales de construcción, muebles y contenidos de vertederos; y otras muestras de depósitos, tales como residuos de animales, granos recolectados y alimentos.

Una "muestra biológica" es una muestra obtenida de una planta o sujeto animal. Tal como se usa en el presente documento, las muestras biológicas incluyen todas las muestras clínicas útiles para detectar infección por microbios u hongos en sujetos, incluyendo, pero no limitado a células, tejidos y fluidos corporales, tales como: sangre, derivados y fracciones de sangre, tales como suero; bilis extraída; tejido de biopsia o retirado quirúrgicamente, incluyendo tejidos que, por ejemplo, no están fijados, están congelados, fijados en formalina y/o insertados en parafina; lágrimas; leche; raspados de piel; lavados de superficies; orina; esputo; líquido cefalorraquídeo; líquido prostático; pus; aspirados de la médula ósea; lavado broncoalveolar (LBA); y saliva. En realizaciones particulares, la muestra biológica se obtiene de un sujeto animal, tal como sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, LBA, pus o líquido prostático.

ADNc (ADN complementario): Un trozo de ADN que carece de segmentos internos no codificantes (intrones) y secuencias reguladoras de la transcripción. El ADNc también puede contener regiones no traducidas (UTR) que son responsables del control de la traducción en la correspondiente molécula de ARN. El ADNc se puede sintetizar en el laboratorio por transcripción inversa a partir de ARN mensajero extraído de células.

Dimórfico: "Dimórfico" o "térmicamente dimórfico", describe una clase de hongos que presentan morfologías 2 diferentes dependiendo de la temperatura en sus ciclos de vida. A temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC), el hongo dimórfico vive en una fase de tipo moho, incluyendo hifa en crecimiento. A la temperatura corporal (aproximadamente 37ºC), los hongos dimórficos presentan una fase de tipo levadura formando células de tipo levadura.

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Los hongos dimórficos endémicos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes géneros y especies: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis y Penicillium marneffei. Otros hongos dimórficos incluyen, pero no se limitan a Sporothrix schenkii y especies de Candida.

Hongo: organismos unicelulares y pluricelulares, vivos, que pertenecen al Reino de los Hongos. La mayoría de las especies se caracterizan por una falta de clorofila y la presencia de paredes celulares quitinosas, y algunos hongos pueden ser multinucleados. Los ejemplos no limitantes representativos de hongos incluyen los géneros y especies listados en las siguientes Tablas 2, 3 y 5-8, tales como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei, Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, especies de Candida, especies Fusarium, especies de Rhizopus, especies de Aspergillus, especies de Mucor y Pneumocystis carinii.

Homólogo: Una secuencia de nucleótidos que comparte un predecesor común con otra secuencia de nucleótidos; los homólogos divergen cuando una especie que lleva la secuencia predecesora se divide en 2 especies.

Aislado: Un microorganismo "aislado" (tal como una bacteria, hongo o protozoo) se ha separado o purificado sustancialmente de microorganismos de diferentes tipos, cepas o especies. Por ejemplo, una colonia de Penicillium marneffei se consideraría un Penicillium marneffei "aislado". Los microorganismos se pueden aislar por una variedad de técnicas, incluyendo dilución seriada y cultivo.

Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína u orgánulo) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo, en el que el componente se encuentra naturalmente, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácido nucleicos y proteínas purificados por procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos químicamente sintetizados.

ITS2: Una secuencia espaciadora de transcripción interna de ADNr fúngico. Como se ilustra en la figura 2, un diagrama de la región de ADNr fúngica, la secuencia de ITS2 está situada entre las secuencias codificantes 5,8S y 28S. Además, los sitios de hibridación para los cebadores ITS1 e ITS4 se muestran en las regiones de ADNr de 18S y 28S filogénicamente conservadas, con flechas que indican la dirección de la amplificación (ITS1 es un cebador directo, mientras que ITS4 es un cebador inverso). ITS3 (biotina) representa la sonda fúngica universal, biotinilada que se une en la región de ADNr de 5,8S filogenéticamente conservada. Sin embargo, ITS3 no biotinilado también se puede usar como un cebador directo. Sonda (Digox.) representa sondas específicas de especie, marcadas con digoxigenina, que se unen a la región ITS2 menos conservada, por ejemplo (y sin limitación) las sondas listadas en la siguiente
Tabla 1.

Oligonucleótido: Una secuencia de polinucleótidos lineal de entre 5 y 100 bases de nucleótidos de longitud.

Operativamente unido: Una primera molécula, tal como un ácido nucleico o proteína, está operativamente unida a segunda molécula, cuando la primera molécula se pone en una relación funcional con la segunda molécula. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante de ácido nucleico, si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Además, un intrón está operativamente unido a un exón para la función de corte y empalme. En general, las secuencias de nucleótidos operativamente unidas son contiguas, y cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteína, están en el mismo marco de lectura.

ORF (marco de lectura abierto): Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación interno. Estas secuencias normalmente son traducibles en un péptido.

Sondas y cebadores: Las sondas y cebadores de ácidos nucleicos, se pueden preparar fácilmente basándose en moléculas de ácido nucleico proporcionadas en esta invención. Una sonda comprende un ácido nucleido aislado capaz de hibridar con un ácido nucleico molde, y un marcador o molécula indicadora detectable, que se puede unir a una sonda. Los marcadores típicos incluyen isótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzimas. Se discuten procedimientos para el marcado y guía en la elección de los marcadores adecuados para diferentes propósitos, por ejemplo, en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)) y Ausubel y col., eds. (Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, NY, 1999).

Los cebadores son moléculas cortas de ácido nucleico, por ejemplo oligonucleótidos de ADN de 15 nucleótidos o más de longitud. Los cebadores pueden reasociarse con una cadena de ADN diana complementaria por hibridación del ácido nucleico, para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y el cebador se puede extender a lo largo de la cadena de ADN diana, por una enzima ADN polimerasa. Se pueden usar parejas de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, p. ej., por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos.

Los procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores, se describen, por ejemplo en Sambrook y col.; Ausubel y col., eds.; e Innis y col. (PCR Applications, Protocols for Functional Genomics (Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1999)). Las parejas de cebadores de la PCR se pueden obtener de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador destinados a este propósito, tales como Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA; este programa está accesible a través del sitio web del Whitehead Institute).

La especificidad de una sonda o cebador particular aumenta con su longitud. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, un cebador que comprende 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia de ITS2 de P. marneffei, se reasociará con una secuencia diana, tal como otro homólogo de ITS2 de la familia contenida en la genoteca de ADN de P. marneffei con una especificidad mayor que un cebador correspondiente de solo 10 nucleótidos; por lo tanto, con el fin de obtener mayor especificidad, se pueden seleccionar sondas y cebadores que comprenden 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o más nucleótidos consecutivos de secuencias de ITS2 de P. marneffei.

En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico aisladas (tales como sondas y cebadores) que comprenden longitudes especificadas de una secuencia de ITS2 fúngica. Dichas moléculas pueden comprender al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o más nucleótidos consecutivos de la secuencia de ITS2, y se pueden obtener a partir de cualquier región de la secuencia de ITS2. La región de ITS2 se puede subdividir en partes más pequeñas, tales como mitades, tercios, cuartos, quintos, sextos, décimos o veinteavos. Como se describe en el presente documento, estas partes divididas se pueden numerar secuencialmente empezando por la porción adyacente de la región codificante de 5,8S. Solo a modo de ejemplo, una secuencia de ITS2 se puede aportar en mitades, tercios o cuartos basándose en la longitud de secuencia, y las moléculas de ácido nucleico aisladas se pueden obtener de la primera o segunda mitad de las moléculas, cualquiera de los 3 tercios de las moléculas, o cualquiera de los 4 cuartos de las moléculas.

La secuencia de ITS2 generalizada está en un diagrama en la figura 2, y sus secuencias de ITS2 para un hongo particular se pueden clonar y secuenciar usando técnicas estándar (p. ej., como se describe en Sambrook y col.) o se pueden obtener en bases de datos de secuencias privadas o públicas, tales como GenBank. Las secuencias particulares están listadas en la tabla 1 y la lista de secuencias que acompañan.

La secuencia fúngica amplificada por los cebadores ITS1 e ITS4 tiene generalmente aproximadamente 600 nucleótidos de longitud y se puede dividir hipotéticamente en aproximadamente mitades (p. ej., nucleótidos del 1 a aproximadamente el 300 y de aproximadamente el 301 a aproximadamente el 600) o aproximadamente en cuartos (p. ej., nucleótidos del 1 a aproximadamente el 150, de aproximadamente el 151 a aproximadamente el 300, de aproximadamente el 301 a aproximadamente el 450, y de aproximadamente el 451 a aproximadamente el 600), por ejemplo. Sin embargo, como se ha expuesto antes, son posibles otras divisiones en segmentos, tales como décimos, quintos, sextos y octavos. Además, cualquier parte particular de la región de ITS2 se puede identificar con referencia a nucleótidos particulares, por ejemplo (y sin limitación), los nucleótidos 1-55, 40-95, 70-130, 83-157, 200-425 o del 315 al 600.

Como se ilustra en la figura 2, la región de ITS2 está situada entre las secuencias codificantes de 5,8S y 28S del ADNr fúngico. La región de ITS2 tiene aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, y los nucleótidos en la secuencia de ITS2 se pueden numerar empezando con el primer nucleótidos secuencia abajo de la secuencia codificante de 5,8S, y terminando con el último nucleótido directamente antes de la secuencia codificante de 28S. De forma similar al amplicón ITS1-ITS4 entero, la región de ITS2 se puede dividir en segmentos, por ejemplo (y sin limitación), mitades, tercios, cuartos, quintos o décimos.

Aunque la longitud de la secuencia de ITS2 es de aproximadamente 200 nucleótidos en hongos, la secuencia puede ser más corta o más larga en una especie fúngica particular, alterando así los números de referencia de los nucleótidos para una especie particular. Por ejemplo, una secuencia de ITS2 de una especie particular que tiene aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, se puede dividir por la mitad por los nucleótidos 1-90 y 91-180, o en cuartos por los nucleótidos 1-45, 46-90, 91-135 y 136-180.

Los segmentos de un amplicón de ITS1-ITS4 o una región de ITS2 pueden incluir uno o más nucleótidos que se solapan en un segmento diferente (mitad, cuarto, tercio, décimo, etc.), siempre que la mayoría de la secuencia esté dentro de un segmento particular. Por ejemplo, una sonda o cebador de 25 nucleótidos que corresponde a los nucleótidos 135 al 160 de un amplicón de ITS1-ITS4 de 600 nucleótidos, se considera que está dentro del primer cuarto de la secuencia, incluso aunque se solapen 10 nucleótidos con el segundo cuarto.

Las moléculas de ácido nucleico se pueden seleccionar para que comprendan al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o más nucleótidos consecutivos de cualquiera de las partes de la secuencia de ITS2 fúngica. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden incluir solo una parte de una sonda o cebador particular, tal como una secuencia de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o más nucleótidos contiguos de un cebador particular, incluyendo (sin limitación) las sondas y cebadores descritos en el presente documento.

Los cebadores incluyen los cebadores fúngicos universales para la amplificación por PCR, conocidos habitualmente como ITS1, ITS3, ITS4. Estos cebadores se listan en la tabla 1, ilustrada en la figura 2, y sus secuencias se proporcionan en los SEQ ID NOS: 1, 2 y 3.

Las secuencias de hongos particulares que corresponden a Dm se ilustran en la figura 3. En esta figura, la secuencia de Dm se indica mediante un recuadro sombreado en la parte superior de la Fig. 3A; las secuencias se comparan con la de Histoplasma capsulatum, con bases idénticas indicadas por un periodo (.) y un hueco en la secuencia indicada por una raya (-). La secuencia Dm empieza aproximadamente en el nucleótido 30 hasta aproximadamente el nucleótido 60 de la secuencia de ITS2, dependiendo de la especie de hongo, por ejemplo (y sin limitación) en el nucleótido 51 en Histoplasma capsulatum, nucleótido 45 en Blastomyces dermatitidis, nucleótido 51 en Coccidioides immitis, nucleótido 45 en Paracoccidioides brasiliensis y nucleótido 44 en Penicillium marneffei. La sonda de Dm incluye la secuencia de nucleótidos particular de Histoplasma capsulatum y secuencias similares, tal como secuencias que presentan una identidad de secuencia de aproximadamente 55% a aproximadamente 100%, tal como una identidad de secuencia de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% o mayor, incluyendo las secuencias particulares de los hongos ilustradas en las figuras 3A-B, con la condición de que dicha secuencia comprenda al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4.

Como otro ejemplo no limitante, la sonda específica de especie sonda Pm para P. marneffei puede comprender al menos 18 nucleótidos consecutivos de la parte que consta de los nucleótidos 90-140 de la secuencia de ITS2 de P. marneffei ITS2. Se ilustran otras sondas específicas de microbio y específicas de especie, en los recuadros sombreados en las figuras 3A-B.

Una "sonda específica de especie" es una sonda que se sabe que es capaz de diferenciar una especie de hongo de otra especie del mismo género. Una sonda "específica de microbio" es una sonda que es capaz de diferenciar una especie de un hongo de otra especie de diferente género, pero que todavía no se ha demostrado que es capaz de diferenciar esta especie de hongo de otra especie del mismo género. Sin embargo, si se demuestra que una sonda específica de microbio es capaz de diferenciar hongos dentro del mismo género, entonces la sonda se puede describir correctamente como "específica de especie". Por ejemplo, la sonda Bd se considera que es una sonda específica de microbio que puede diferenciar B. dermatitidis de otros hongos. Debido a que B. dermatitidis es la única especie actualmente conocida dentro del género de Blastomyces, actualmente no se puede determinar si la sonda Bd también es una sonda específica de especie. Otro ejemplo de una sonda específica de microbio sería una sonda capaz de diferenciar especies de Penicillium de especies de Candida, que se pueden describir como una "sonda específica de género".

Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es uno que tiene una secuencia que no se encuentra de forma natural o tiene una secuencia que se hace por una combinación artificial de los segmentos de secuencia separados de otra forma. Esta combinación artificial se puede llevar a cabo por síntesis química, o más habitualmente, por manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., por técnicas de ingeniería genética.

Identidad de secuencia: La similitud entre dos secuencias de ácido nucleico se expresa en términos de similitud entre las secuencias, denominado también como identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad, similitud u homología; un porcentaje de identidad mayor indica un grado mayor de similitud de secuencia. Los homólogos de secuencias de ITS2 fúngicas tendrán un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinean. Normalmente, las secuencias de ITS2 fúngicas son de aproximadamente 80% a 100% idénticas a nivel de nucleótidos, cuando se comparan homólogos de la misma especie. Sin embargo, en partes particulares de la región de ITS2, la identidad de secuencia puede ser mayor o menor. Por ejemplo, entre los hongos dimórficos, la parte de la región de ITS2 adyacente a la secuencia codificante de 5,8S demuestra mayor identidad de secuencia (tal como aproximadamente de 84 a 100%), mientras que la región de ITS2 adyacente a la secuencia de 28S demuestra menos identidad de secuencia (tal como aproximadamente de 0 a 44%).

La herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST) del NCBI (Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) está disponible en varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para la información biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD) y en internet, para usar en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede acceder a través del sitio web del NCBI. También está disponible en el sitio web de NCBI una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa.

Cuando se compara menos que la secuencia entera para la identidad de secuencia, los homólogos típicamente tienen una identidad de secuencia de al menos 75% en ventanas cortas de 10-20 aminoácidos, y pueden tener identidades de secuencia de al menos 85%, o al menos 90% o incluso 95% o mayor, dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. En el sitio web del NCBI se describen procedimientos para determinar la identidad de secuencia en ventanas cortas.

Estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan solo como guía; es totalmente posible que se puedan obtener homólogos muy significativos que están fuera de estos intervalos proporcionados.

Otra indicación alternativa de que dos moléculas de ácido nucleico están estrechamente relacionadas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y son diferentes con diferentes parámetros ambientales. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5ºC a 20ºC menores que el punto de fusión término (Tf) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. La T_{f} es la temperatura (en condiciones definidas de fuerza iónica y pH) en las que hibrida el 50% de la secuencia diana con una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones de hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de restricciones se encuentran en Sambrook y col. y P. Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) (Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993). Las moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones restrictivas con una secuencia de ITS2 fúngica hibridarán típicamente con una sonda basada en una secuencia entera de ITS2 o partes seleccionadas de la secuencia de ITS2 en condiciones de lavado de 2x SSC a 50ºC.

Para los propósitos de la presente descripción, "condiciones restrictivas" abarca las condiciones en las que la hibridación solo ocurrirá si hay menos de 25% de apareamiento erróneo entre la molécula de hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones restrictivas" pueden dividirse en niveles particulares de restricción para una definición más precisa. Así pues, como se usa en el presente documento, condiciones de "restricción moderada" son aquellas en las que moléculas con más de 25% de apareamiento erróneo no hibridarán; las condiciones de "restricción media" son aquellas en las que las moléculas con más de 15% de apareamiento erróneo no hibridarán; y las condiciones de "restricción alta" son aquellas en las que las secuencias con más de 10% de apareamiento erróneo no hibridarán. Las condiciones "muy restrictivas" son aquellas en las que las secuencias con más de 6% de apareamiento erróneo no hibridarán.

Transformada: Una célula transformada es una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico por técnicas de biología molecular. El término "transformación" abarca todas las técnicas mediante las cuales se puede introducir una molécula de ácido nucleico en dicha célula, incluyendo la transfección con vectores víricos, la transformación con vectores plasmídicos, y la introducción de un ADN desnudo mediante técnicas tales como electroporación, lipofección y aceleración con pistola de partículas.

Vector: Una molécula de ácido nucleico cuando se introduce en una célula huésped, produciendo así una célula huésped transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más ácidos nucleicos marcadores seleccionables y otros elementos genéticos.

Aislamiento de alto rendimiento de ADN fúngico

Se describe un procedimiento de alto rendimiento para aislar el ADN de células procariotas y eucariotas, incluyendo células de bacterias, hongos, protozoos, animales y plantas. Las células se rompen mecánicamente usando materiales granulares plurales, tales como perlas o microesferas y equipamiento de laboratorio estándar. Por ejemplo, la energía mecánica para la disrupción de las células se puede suministrar con un incubador rotatorio (tal como los modelos disponibles en New Brunswick Scientific, Edison, NJ), en lugar de un equipamiento especializado. Después de la disrupción de las células, se hacen precipitar las proteínas celulares, tal como usando una disolución salina concentrada, y las muestras se tratan con RNasa. Los ácidos nucleicos restantes (es decir, ADN) se recogen de la muestra, tal como por columnas de centrifugación o precipitación con alcohol, seguido de centrifugación.

Los materiales granulares pueden estar compuestos de cualquier sustancia, tal como metal, polímero o sílice y los granos individuales pueden tener cualquier forma, por ejemplo (pero no limitado) esférica, cúbica o piramidal. Algunas realizaciones usan microesferas de vidrio.

Los granos pueden ser de cualquier tamaño adecuado. En algunas realizaciones, los granos son de aproximadamente 10 \mum a 5 mm, tal como aproximadamente de 50 \mum a 4 mm, o en realizaciones particulares, aproximadamente de 100 \mum a aproximadamente 3 mm.

Los materiales granulares plurales se pueden diferenciar por el tipo de material o el tamaño de los granos. En algunas realizaciones, se usan microesferas de vidrio de diferentes tamaños, tal como de aproximadamente 100 \mum a aproximadamente 3 mm. En realizaciones particulares, se usan 3 tamaños diferentes de microesferas de vidrio; un primero conjunto de microesferas de vidrio de aproximadamente 100 \mum, tal como 106 \mum; un segundo conjunto de microesferas de vidrio de aproximadamente 0,5 mm; y un tercer conjunto de microesferas de vidrio de aproximadamente 3 mm. En otras realizaciones particulares, las microesferas pueden diferir en diámetro en una relación particular, tal como aproximadamente: 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100, 1:500, o cualquier otra relación dentro de este intervalo. Por ejemplo, y sin limitación, si se usan microesferas de 3 tamaños diferentes, A, B y C, la relación de diámetros de A:B puede ser aproximadamente 1:5, la relación de diámetros B:C puede ser aproximadamente 1:6, y la relación de diámetros A:C puede ser aproximadamente 1:30. Alternativamente, la relación de diámetros puede ser aproximadamente X:Y:Z, en la que X es de aproximadamente 0,05 a 0,2, Y es de aproximadamente 0,3 a 0,7, y Z es de aproximadamente 2,5 a 3,5. En realizaciones particulares, la relación es de aproximadamente 0,1 a 0,5 a 3,0.

En otras realizaciones particulares más, las microesferas se pueden seleccionar de acuerdo con una diferencia de tamaños deseada. Por ejemplo, y sin limitación, se puede proporcionar una diferencia de diámetros de aproximadamente (o al menos aproximadamente) 100 \mum, 200 \mum, 500 \mum, 1 mm, 2 mm o 5 mm.

Se pueden procesar múltiples muestras biológicas juntas con este procedimiento de alto rendimiento. Las muestras se pueden disponer en una ordenación, tal como una placa multipocillos. Cada pocillo puede contener una muestra de la misma o de diferentes fuentes, y se pueden usar placas con diferente número de pocillos, tal como una placa de 18 pocillos, 24 pocillos, 36 pocillos, 48 pocillos, 72 pocillos, 96 pocillos o 120 pocillos. Se pueden usar placas que tienen número mayor de pocillos, y los pocillos individuales pueden ser de cualquier volumen adecuado, tal como (y sin limitación) aproximadamente 0,5 ml, 1,0 ml o 2,0 ml. En realizaciones particulares, se usa una placa de 96 pocillos que tiene pocillos de 2,0 ml.

Un ejemplo particular, no limitante, de este procedimiento de alto rendimiento se proporciona en el ejemplo 2.

Sondas

Se describen sondas capaces de hibridar ADNr fúngico aislado, algunas de las cuales son específicas de especie o específicas de microbio. Además, las sondas que diferencian hongos dimórficos (que, a su vez, pueden ser específicas de microbio o específicas de especie) de otros hongos de tipo levadura, o especies de levaduras, se describen y se denominan "sondas dimórficas". Las sondas específicas de especie, específicas de microbio y dimórficas, incluyen secuencias obtenidas de la secuencia de ITS2 de ADN fúngico.

Se describe una sonda dimórfica particular, Dm, en la tabla 1 y en la figura 3. Otras sondas de ejemplo, no limitantes, incluyen sondas específicas de especie y específicas de microbio listadas en las tablas 1-3.

En algunas realizaciones, las sondas específicas de especie corresponden a secuencias en la mitad, tercio, cuarto, quinto, sexto o décimo secuencia arriba del ITS2, tal como secuencias adyacentes a la secuencia codificante de 28S, mientras que las sondas dimórficas son como se definen en las reivindicaciones. Sin embargo, en algunas realizaciones, una parte menor de la secuencia de la sonda corresponde a secuencias que están dentro de la secuencia codificante de 5,8S y 28S. Las sondas dimórficas particulares corresponden a secuencias de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos, tal como aproximadamente 25 nucleótidos, dentro de la porción de la región de ITS2 de aproximadamente el nucleótido 40 a aproximadamente el nucleótido 80, en la que dichas sondas dimórficas son como se definen en las reivindicaciones, mientras que las sondas específicas de microbio corresponden a secuencias de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, tal como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, dentro de la parte de la región de ITS2 de aproximadamente el nucleótido 90 a aproximadamente el nucleótido 200.

Detección de secuencias de ADNr fúngicas

La presencia de un hongo en una muestra se puede detectar usando la sonda y secuencias de cebador descritas en el presente documento. El ADN fúngico se puede detectar directamente o amplificar antes de la detección, e identificar el hongo a partir del cual el ADN se ha originado, se puede confirmar por sondas oligonucleótidas específicas de microbio y/o dimórficas. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para cualquier propósito en el que se desee la detección de hongos, incluyendo aplicaciones de diagnóstico y pronóstico, tal como en el laboratorio y en el marco clínico.

Las muestras adecuadas incluyen cualquier muestra ambiental o biológica convencional, incluyendo muestras clínicas obtenidas de un sujeto humano o veterinario, por ejemplo sangre o fracciones de sangre (p. ej., suero), esputo, saliva, lavados orales, raspados de piel, tejidos de biopsia, LBA, líquido cefalorraquídeo o fluido prostático. Las técnicas estándar para adquirir dichas muestras están disponibles, véase, p. ej., Schluger y col., J. Exp. Med. 176:1327-33 (1992); Bigby y col., Am. Rev. Respir. Dis. 133:515-18 (1986); Kovacs y col., NEJM 318:589-93 (1988); y Ognibene y col., Am. Rev. Respir. Dis. 129:929-32 (1984). El suero y otras fracciones de sangre se pueden preparar de acuerdo con técnicas estándar; aproximadamente 200 \mul de suero es una cantidad adecuada para la extracción de ADN para usar en reacciones de amplificación. Véase, p. ej., Schluger y col.; Ortona y col., Mol. Cell Probes 10:187-90 (1996).

La muestra se puede usar directamente o se puede procesar, tal como por adición de disolventes, conservantes, tampones u otros compuestos o sustancias.

Una vez obtenida una muestra, se extrae el ADN usando procedimientos estándar. Por ejemplo, la preparación rápida del ADN se puede llevar a cabo usando un kit disponible en el comercio (p. ej., InstaGene Matrix, BioRad, Hercules, CA; el kit de aislamiento NucliSens, Organon Teknika, Países Bajos; el kit QIAGEN Tissue Kit, QIAGEN, Inc., Valencia, CA). La técnica de preparación del ADN se puede elegir para dar una preparación de nucleótidos que es accesible y se puede llevar a la amplificación de ácidos nucleicos. Los procedimientos de extracción y preparación de ADN particulares incluyen (sin limitación) el procedimiento de alto rendimiento descrito antes y el procedimiento descrito a continuación en el ejemplo 1.

Las secuencias de nucleótidos fúngicas se pueden detectar por la hibridación de una sonda oligonucleótida con moléculas de ácido nucleico extraídas de una muestra biológica o ambiental, incluyendo una muestra clínica. La secuencia de las sondas oligonucleótidas adecuada corresponderá a una región dentro de una o más de las secuencias de nucleótidos fúngicas descritas en el presente documento. Se pueden usar técnicas estándar para hibridar sondas oligonucleótidas fúngicas con secuencias diana, tal como las técnicas descritas en las patentes de EE.UU. nº 5.631.132; 5.426.027; 5.635.353; y 5.645.992; y publicación PCT WO 98/50584.

En algunas realizaciones, la sonda se marca para que sea detectable de alguna forma, con un marcador isotópico o no isotópico; en realizaciones alternativas, se marca el ácido nucleico diana (molde). Los marcadores no isotópicos pueden comprender, por ejemplo, una molécula fluorescente o luminiscente, o una enzima, cofactor, sustrato enzimático o hapteno. La sonda se incuba con una preparación monocatenaria de ADN, ARN o una mezcla de ambos, y se determina la hibridación después de la separación de las moléculas mono y bicatenarias. Alternativamente, las sondas se pueden incubar con una preparación de nucleótidos después de ser separadas por tamaño y/o carga e inmovilizadas en un medio adecuado.

En algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos fúngicas diana en una muestra, se amplifican antes de usar una sonda de hibridación para la detección. Por ejemplo, puede ser ventajoso amplificar parte o toda la secuencia de ITS2, después detectar la presencia del conjunto de secuencias amplificadas. Se puede usar cualquier procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En realizaciones particulares, se usa el procedimiento de PCR-EIA para la amplificación y detección de hongos; la PCR-EIA se describe en el presente documento, en el ejemplo 8. y se ilustra en las figuras 1-2.

El uso secuencial de cebadores fúngicos universales para la amplificación por la PCR y las sondas específicas de microbios se pueden usar para identificar los hongos. Los cebadores fúngicos universales dirigidos a las regiones ITS1 e ITS4 del ADNr (véase la figura 2) permiten la amplificación de una parte principal del ADNr de la mayoría de los hongos, en lugar de una sola especie de hongo. El gen de ADNr ofrece una diana de amplificación adecuada, no solo porque contiene sitios de unión para cebadores fúngicos universales, sino también porque el cromosoma en el que está localizado este gen contiene aproximadamente 100 copias de genes que ofrecen "preamplificación" para aumentar el rendimiento del amplicón y la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el uso de cebadores universales y una diana génica de múltiples copias (ADNr) tiene más utilidad y es más sensible para identificar hongos en muestras diversas, que lo que ofrecen las dianas génicas de otras realizaciones.

Aunque la PCR-EIA ofrece un procedimiento de detección del amplicón e identificación de hongos, se pueden usar otros procedimientos de identificación. Los amplicones se pueden producir usando cebadores específicos de microbios y se pueden detectar por electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Véase, p. ej., Aoki, F. H., y col., J. Clin. Microbiol. 37:315-20 (1999). La presencia de una banda en dicho gel de agarosa se considera un resultado positivo usando cebadores específicos. Sin embargo, debido a que diferentes especies de hongos pueden producir amplicones de tamaños similares, la detección del tamaño del amplicón se puede complementar con otros procedimientos de identificación.

Alternativamente, la presencia de un patrón de bandas único después de la digestión del ADN fúngico con enzimas de restricción, incluyendo el ADN obtenido por amplificación, tal como por PCR, se puede usar para la identificación de especies, incluyendo procedimientos conocidos normalmente como la "huella genética", basados en el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) o análisis de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD). Véase, p. ej., Morace, G., M. y col., J. Clin. Microbiol. 35:667-72 (1997).

Se pueden usar sondas específicas de especie para obtener una identificación final de un hongo usando transferencia Southern, transferencia en ranura, transferencia en mancha, y otro procedimiento similar. Véase, p. ej., Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 35:1894-96 (1997); Sandhu, G.S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:2913-19 (1995); y Tanaka, K., y col., J. Clin. Microbiol. 34:2826-28 (1996). Además, Turenne y col. (J. Clin. Microbiol. 37:1846-51 (1999)) desarrollaron un procedimiento de identificación usando cebadores universales, en el que los hongos se identifican por el tamaño exacto del ADN amplificado usando un sistema de electroforesis capilar fluorescente automa-
tizado.

Las sondas descritas en el presente documento no solo proporcionan un medio para identificar hongos en el cultivo, sino que también ayudan en la identificación histológica de los hongos en otras muestras, tal como muestras medioambientales y biológicas. La aplicación de estas sondas a los hongos en secciones de tejidos puede permitir la diferenciación de organismos verdaderamente invasivos de simples colonizadores, y se pueden usar múltiples técnicas para identificar hongos en tejidos usando estas sondas. En algunas realizaciones, el ADN fúngico se extrae del tejido y se identifica por PCR-EIA. En otras realizaciones, las sondas se pueden usar para la hibridación in situ, permitiendo la localización de ADN fúngico directamente en el tejido. En otras realizaciones más, se puede usar la combinación de la PCR y los procedimientos de hibridación in situ, en los que el ADN diana se amplifica y se hibrida in situ. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos debe considerarse mutuamente exclusivo.

La PCR-EIA permite la amplificación y detección de pequeñas cantidades de ADN, tal como cantidades de solo unos nanogramos, unos picogramos o menos. En principio, la PCR-EIA es capaz de detectar solos unas pocas moléculas de ADN fúngico presente en una muestra. Sin embargo, la sensibilidad de un ensayo basado en la PCR, tal como PCR-EIA, se puede potenciar con diferentes modificaciones de la técnica. Por ejemplo, la PCR anidada utiliza un segundo conjunto de cebadores, internos con respecto al conjunto original de cebadores, para reamplificar el ADN diana usando los amplicones a partir de la primera PCR como un molde, para la segunda PCR. Véase, p. ej. Podzorski, R. P., y D. H. Persing, en Manual of Clinical Microbiology, 6^{a} ed., P.R. Murray, y col. (eds.), (ASM Press, Washington, DC, 1995); y Rappelli, P., R., y col., J. Clin. Microbiol. 36:3438-40 (1998). Además, la reacción de la PCR se puede continuar a lo largo de más ciclos, continuando el aumento geométrico del ADN amplificado, y están disponibles formas alternativas de la polimerasa Taq que tienen mayor estabilidad y precisión a lo largo de un número mayor de ciclos de la PCR. Las polimerasas Taq disponibles en el comercio se pueden obtener en Roche Molecular Systems (Pleasanton, CA), Seikagaku America (Falmouth, CT), y otros proveedores comerciales.

Ordenaciones de perfiles fúngicos

En un aspecto, la presente invención proporciona una ordenación como se define en las reivindicaciones.

Una ordenación como se define en el presente documento, se puede usar para seleccionar en una muestra la presencia de un hongo. Dichas ordenaciones se pueden usar para detectar e identificar rápidamente un hongo, por ejemplo, un hongo dimórfico o un hongo de una especie o género particular, tal como Penicillium marneffei.

Las ordenaciones son disposiciones de localizaciones accesibles en un sustrato, conteniendo cada dirección un ácido nucleico, tal como una sonda. En algunas realizaciones, cada dirección corresponde a un solo tipo o clase de ácido nucleico, tal como una sola sonda, aunque un ácido nucleico particular puede encontrarse de forma repetida en múltiples direcciones. Una "microordenación" es una ordenación en miniatura que requiere el examen microscópico o asistido de otra forma, para detectar la hibridación. Las "macroordenaciones" mayores permiten reconocer cada dirección a simple vista, y en algunas realizaciones, se puede detectar una señal de hibridación sin aumentos adicionales. Las direcciones se pueden marcar, insertar en una guía separada o identificar de otra forma por la localización.

En algunas realizaciones, una ordenación de perfil fúngico es una colección de sondas separadas en las direcciones de la ordenación. Como un ejemplo no limitante, la ordenación puede contener las sondas listadas en la tabla 1. La ordenación de perfil fúngico después se pone en contacto con una muestra que se sospecha que contiene ácidos nucleicos fúngicos en condiciones que permiten que se produzca la hibridación entre la sonda y los ácidos nucleicos en la muestra. Se puede usar cualquier muestra que contenga potencialmente, o incluso que se sospeche que contiene, ácidos nucleicos fúngicos, incluyendo extractos de ácidos nucleicos, tales como preparaciones de ADN o ARN no amplificadas. Una señal de hibridación de una dirección individual en la ordenación indica que la sonda hibrida con un nucleótido en la muestra. El sistema permite el análisis simultáneo de una muestra por sondas plurales y da información que identifica el ADN o ARN fúngico contenidos en la muestra. También se describe en el presente documento una ordenación que contiene ADN o ARN fúngico, en el que la ordenación se pone en contacto con una muestra que contiene una sonda. Se puede marcar la sonda o el ADN o ARN fúngico para facilitar la detección de la hibridación.

Los ácidos nucleicos se pueden añadir a un sustrato de ordenación en forma seca o líquida. Se pueden añadir otros compuestos o sustancias a la ordenación, así como tampones, estabilizantes, reactivos para detectar la señal de hibridación, agentes emulsionantes o conservantes.

En una ordenación, se puede acceder a cada ácido nucleico en la ordenación, su localización se puede determinar de forma fiable y segura en al menos las dos dimensiones de la superficie de la ordenación. Por lo tanto, las matrices ordenadas permiten la asignación de la localización de cada ácido nucleico en el momento en el que se pone en la ordenación. Normalmente, se proporciona un mapa de ordenación o clave para correlacionar cada dirección con el ácido nucleico adecuado. Las ordenaciones ordenadas se disponen a menudo en un patrón de rejilla simétrica, pero los ácidos nucleicos se pueden disponer en otros patrones (p. ej., en líneas distribuidas radialmente, un patrón de "radios y rueda", o agrupaciones ordenadas).

Una dirección en la ordenación puede ser de cualquier forma y tamaño adecuados. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se suspenden en un medio líquido y se introducen en pocillos cuadrados o rectangulares en el sustrato de ordenación. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden introducirse en regiones que son esencialmente triangulares, ovales, circulares o irregulares. La forma general de la propia ordenación también puede variar, aunque en algunas realizaciones es sustancialmente plana y de forma rectangular o cuadrada.

Las matrices de perfil fúngico pueden variar de estructura, composición y funcionalidad pretendida, y pueden basarse en un formato de macroordenación o microordenación, o una combinación de los mismos. Dichas ordenaciones pueden incluir, por ejemplo, al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 100 o más direcciones, normalmente con un solo tipo de ácido nucleico en cada dirección. En el caso de macromatrices, normalmente no se requiere un equipamiento sofisticado para detectar una señal de hibridación en las matrices, aunque puede ayudar a la cuantificación el barrido estándar y/o técnicas y equipamiento de cuantificación. Por lo tanto, el análisis de macroordenaciones como se describe en el presente documento, se puede llevar a cabo en la mayoría de los hospitales, laboratorios de investigación médica y agrícola, universidades u otras instituciones, sin necesidad de invertir en equipamiento de lectura especializado y caro.

Los ejemplos de sustratos de las matrices descritas en el presente documento incluyen vidrio (p. ej., vidrio funcionalizado), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO_{2}, SiN_{4}, nitrocelulosa de silicio modificada, poli(fluoruro de vinilideno), poliestireno, politetrafluoroetileno, policarbonato, nailon, fibra o combinaciones de los mismos. Los sustratos ordenación pueden ser rígidos y relativamente no flexibles (p. ej., vidrio o una membrana soportada) o flexibles (tal como una membrana polímera). Una línea de productos disponible en el comercio adecuada para las ordenaciones de sondas descritas en el presente documento, son las placas de la línea Microlite de Microtiter® disponibles en Dynex Technologies UK (Middlesex, Reino Unido), tales como la placa Microlite 1 + 96-pocillos, o la placa 384 Microlite + 384 - pocillos.

Las direcciones en la ordenación deben ser discretas, en cuanto que las señales de hibridación de las direcciones individuales deben ser distinguibles de las señales de las direcciones vecinas, sea a simple vista (macroordenaciones) o por barrido o lectura por un equipo o con ayuda de un microscopio (microordenaciones).

Las direcciones en una macroordenación pueden ser de tamaño relativamente grande, tal como suficientemente grandes para permitir la detección de una señal de hibridación sin ayuda de un microscopio u otro equipo. Por lo tanto, las direcciones de una macroordenación pueden ser tan pequeñas como aproximadamente 0,1 mm de ancho, con una separación de aproximadamente la misma distancia. Alternativamente, las direcciones pueden ser de aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 5, 7 ó 10 mm de ancho, con una separación de una distancia similar o diferente. En algunas realizaciones se usan direcciones mayores (mayores de 10 mm de ancho). El tamaño global de la ordenación normalmente se correlaciona con el tamaño de las direcciones (es decir, normalmente se encontrarán direcciones mayores en matrices mayores, mientras que se pueden encontrar direcciones menores en matrices menores). Sin embargo, dicha correlación no es necesaria.

Las ordenaciones en el presente documento se pueden describir por sus densidades, el número de direcciones en un área superficial especificada determinada. Para las macromatrices, la densidad de la ordenación puede ser aproximadamente una dirección por decímetro cuadrado (o una dirección en una región de 10 cm por 10 cm del sustrato de ordenación) a aproximadamente 50 direcciones por centímetro cuadrado (50 dianas en una región del sustrato de 1 cm por 1 cm). Para las microordenaciones, la densidad de ordenación normalmente será una o más direcciones por centímetro cuadrado, por ejemplo, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2.500 o más direcciones por centímetro cuadrado.

El uso del término "ordenación" incluye las ordenaciones encontradas en la tecnología de microchip de ADN. Como un ejemplo no limitante, las sondas pueden estar contenidas en un microchip de ADN similar a los productos de GeneChip® y productos relacionados disponibles en el comercio en Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA). Brevemente, un microchip de ADN es una ordenación miniaturizada, de alta densidad, de sondas en un sustrato de pastilla de vidrio. Se seleccionan sondas particulares, y se diseñan máscaras fotolitográficas para usar en un procedimiento basado en la síntesis química en fase sólida y técnicas de fabricación fotolitográfica, similares a las usadas en la industria de semiconductores. Las máscaras se usan para aislar los sitios de exposición del chip, y las sondas se sintetizan químicamente en estos sitios, con cada sonda en una localización identificada en la ordenación. Después de la fabricación, la ordenación está lista para la hibridación. La sonda o el ácido nucleico dentro de la muestra se pueden marcar, tal como con un marcador fluorescente, y después de hibridación, se pueden detectar y analizar las señales de hibridación.

Detección de infección y enfermedad

El procedimiento también incluye el diagnóstico o detección de determinadas clases de infecciones con hongos dimórficos, usando la sonda Dm (o un fragmento o variante de la misma) para detectar la presencia de infección con un hongo dimórfico, seleccionado de: H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis, P. brasiliensis, o P. marneffei. Una vez establecida la presencia de la infección fúngica dimórfica usando la sonda Dm, estas diferentes infecciones fúngicas dimórficas se pueden distinguir más unas de otras, por exposición de la muestra a una sonda específica de microbios o específica de especie, tal como la sonda Hc (o un fragmento o variante de la misma) que se une específicamente a H. capsulatum pero no a B. dermatitidis, C. immitis, P. brasiliensis, o P. marneffei; la sonda Bd que se une específicamente a B. dermatitidis pero no a H. capsulatum, C. immitis, P. brasiliensis o P. marneffei; la sonda Ci (o un fragmento o variante de la misma) que se une específicamente a C. immitis pero no a H. capsulatum, B. dermatitidis, P. brasiliensis o P. marneffei; la sonda Pb (o un fragmento o variante de la misma) que se une específicamente a H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis o P. marneffei; y/o la sonda Pm (o un fragmento o variante de la misma) que se une específicamente a P. marneffei pero no a H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis o P. brasiliensis.

Tal como se usa en el presente documento, cada sonda específica de especie o específica de microbio se refiere a una sonda que se une a la secuencia de ácido nucleico de una especie con una especificidad suficiente para distinguir diferentes especies entre sí. En ejemplos particulares, esta especificidad es al menos 3,0, o al menos 7,0, medida por un índice de EIA (EI) igual a la densidad óptica del ADN de ensayo (es decir, la sonda ensayada) dividido entre la densidad óptica de un blanco de agua. Un ejemplo particular, no limitante de determinación del EI se proporciona en el ejemplo 10.

En algunos ejemplos, una sonda se puede unir a dos especies de forma detectable (como Bd que se une a B. dermatitidis con una especificidad mayor (11,9) que con la que se une a C. immitis (4,3)), pero la mayor especificidad se puede usar para distinguir las dos. Alternativamente, una muestra con ácido nucleico que se une de forma detectable a la sonda Bd también puede hibridar con la sonda Ci, para distinguir la infección por B. dermatitidis de C. immitis.

Cuando se hace referencia a sondas específicas de especie o específicas de microbio, se entiende que se refiere a una sonda que tiene una especificidad de sonda que se une con EI de al menos 3,0 para el ácido nucleico del hongo de interés, tal como H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis, P. brasiliensis o P. marneffei. Los ejemplos particulares, no limitantes, de sondas específicas de microbio son Hc, Ci o Pb, mientras que Pm es un ejemplo particular, no limitante, de una sonda específica de especie. Sin embargo, las sondas específicas de especie y específicas de microbio también se refieren a variantes, fragmentos y sondas mayores que contienen las secuencias específicas de especie o específicas de microbio de las secuencias descritas.

Una sonda específica para un hongo dimórfico se refiere a una sonda que tiene una secuencia que se une al ácido nucleico de un hongo dimórfico con suficiente especificidad para distinguir el hongo de un hongo no dimórfico, tal como S. schenckii, C. neoformans, u otros organismos tales como P. carinii. En ejemplos particulares, la sonda se une específicamente al hongo dimórfico con una especificidad con EI de al menos 2,5, 3,0 o 5,0.

Una "variante" de una sonda incluye secuencias que tienen secuencias de ácido nucleico alterada, pero retienen la capacidad para unirse a las secuencias diana (e identificar la diana fúngica) con suficiente especificidad. En algunos ejemplos particulares, se cambian como máximo, 1, 2, 5 ó 10 ácidos nucleicos, o la sonda retiene una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90% o 95% de la sonda original. Las variantes también incluyen secuencias de sonda a las que se ha añadido una secuencia de ácido nucleico adicional, mientras que todavía retienen la especificidad de las sondas indicadas. Los fragmentos incluyen secuencias de sondas acortadas (o subsecuencias) de una sonda que también retiene la especificidad indicada.

Se puede seleccionar en cualquiera de estas variantes o fragmentos la retención de la especificidad determinando el EI de la variante o fragmento, tal como (y sin limitación) por el ensayo descrito en el ejemplo 10. Sin embargo, debido a que el EI se basa en una relación, y no en una medición absoluta, se pueden usar otras técnicas para medir la hibridación, en lugar de la densidad óptica de un colorante coloreado.

Kits

Los cebadores y las sondas oligonucleótidas descritos en el presente documento se pueden suministrar en forma de un kit para usar en la detección de hongos, incluyendo kits para cualquiera de las ordenaciones descritas antes. En dicho kit, se proporciona una cantidad adecuada de uno o más de los cebadores y/o sondas oligonucleótidos, en uno o más envases o se mantienen en un sustrato. Un cebador o sonda oligonucleótidos se pueden proporcionar suspendidos en una disolución acuosa o en forma de un polvo liofilizado, por ejemplo. El o los envases en los que se suministra el o los oligonucleótidos pueden ser cualquier envase convencional que pueda mantener la forma suministrada, por ejemplo, tubos de microfuga, ampollas o botellas. En algunas aplicaciones, se pueden proporcionar parejas de cebadores en cantidades de uso unitarias previamente medidas en tubos individuales, normalmente desechables, o envases equivalentes. Con dicha disposición, la muestra en la que se va a ensayar la presencia de ácidos nucleicos fúngicos se puede añadir a los tubos individuales y llevar a cabo directamente la amplificación.

La cantidad de cada cebador oligonucleótido suministrada en el kit puede ser cualquier cantidad adecuada, y puede depender de la diana comercializada a la que se dirige el producto. Por ejemplo, si el kit está adaptado para investigación o uso clínico, la cantidad proporcionada de cada cebador oligonucleótido será probablemente una cantidad suficiente para cebar varias reacciones de amplificación por PCR. Se pueden encontrar directrices generales para determinar las cantidades adecuadas en Innis y col., Sambrook y col., y Ausubel y col. Un kit puede incluir más de dos cebadores, con el fin de facilitar la amplificación por la PCR de un número mayor de secuencias de nucleótidos fúngicas.

En algunas realizaciones, los kits también pueden incluir los reactivos necesarios para llevar a cabo las reacciones de amplificación por la PCR, incluyendo los reactivos de preparación de muestra de ADN, tampones adecuados (p. ej., tampón de polimerasa), sales (p. ej., cloruro magnésico) y desoxirribonucleótidos (dNTP).

Los kits como se definen en las reivindicaciones, pueden incluir sondas de oligonucleótidos marcadas o no marcadas, para usar en la detección de secuencias de nucleótidos fúngicas. Los kits comprenden una sonda dimórfica como se define en las reivindicaciones.

También se pueden suministrar una o más secuencias de control para usar en las reacciones de la PCR en el kit. Secuencias de control positivo adecuadas pueden ser esenciales, como las que se discuten más adelante.

Las realizaciones particulares incluyen un kit para detectar e identificar un hongo, basado en las ordenaciones descritas antes. Dicho kit incluye al menos dos sondas diferentes (como se ha descrito antes) e instrucciones. Un kit puede contener más de dos sondas diferentes, tales como al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 100 o más sondas. Las instrucciones pueden incluir direcciones para obtener una muestra, procesar la muestra, preparar las sondas y/o poner en contacto cada sonda con una parte alícuota de la muestra. En algunas realizaciones, el kit incluye un dispositivo o aparato para separar las diferente sondas, tales como envases individuales (p. ej., microtúbulos) o un sustrato de ordenación (p. ej., una placa de microvaloración de 96 pocillos o 384 pocillos). En realizaciones particulares, el kit incluye sondas preenvasadas, tales como sondas suspendidas en medio adecuado en envases individuales (p. ej., tubos Eppendorf® sellados individualmente) o los pocillos de un sustrato de ordenación (p. ej., placa de microvaloración de 96 pocillos sellada con una película plástica protectora). En otras realizaciones particulares, el kit incluye equipamiento, reactivos e instrucciones para extraer y/o purificar nucleótidos de una muestra.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar características particulares de determinadas realizaciones.

Ejemplo 1 Aislamiento de ADN fúngico

Se inoculó una medida (loopful) de B. dermatitidis en fase de levadura (cepas 4478, KL-1 (ATCC 26198), o A2 (ATCC 60916)), en 10 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón (Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD) en un matraz Erlenmeyer de 50 \mul y se incubó a 37ºC en un agitador rotatorio (140 rpm) durante 48 a 72 h. Después, la suspensión se transfirió a un tubo de centrífuga de 30 ml (Oak Ridge, Nalge, Rochester, NY) y se centrifugó durante 3 minutos a 2000 x g. Se extrajo el ADN genómico y se purificó usando un kit comercial DNA (PureGene Yeast y kit de aislamiento de ADN Gram Positivo; Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se hicieron crecer cultivos en fase de moho de Sporothrix schenckii (ATCC 58251) y Penicillium marneffei (cepas ATCC 64101, ATCC 58950, y JH05 (regalo de Dr. William Merz, Johns Hopkins Medical School, Baltimore, MD)) en 50 ml de caldo de dextrosa Sabouraud (Difco) en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se incubaron a 25ºC en un agitador rotatorio durante 5 días. El cultivo crecido se recogió por filtración a vacío a través de papel de filtro estéril, y la materia celular se lavó 3 veces con H_{2}O destilada estéril, por filtración. La torta de filtración celular después se separó del filtro y se puso en una placa Petri estéril, que después se cerró por los bordes con Parafilm® (American Can, Neenah, WI) y se congeló a -20ºC hasta su uso.

El ADN se extrajo triturando la torta de filtración celular con un mortero y mano de mortero, en presencia de nitrógeno líquido. Justo antes de su uso, se separó una parte de la torta de filtración celular congelada, de aproximadamente 2,56 cm de diámetro, de la placa Petri con fórceps estériles y se puso en un mortero estéril enfriado con hielo (de 15,24 cm de diámetro). Se añadió nitrógeno líquido para cubrir la torta de filtración y se añadió lo necesario para mantener la torta de filtración congelada durante la trituración. La torta de filtración fúngica se trituró hasta un polvo fino con una mano de mortero estéril. Después se extrajo el ADN fúngico y se purificó usando tratamientos seriados de proteinasa K y RNasa, seguido de extracción con fenol y precipitación con etanol por procedimientos estándar. Véase, Maniatis, y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982).

Otros ADN los suministraron generosamente como regalo las siguientes personas: Histoplasma capsulatum (cepas G186B (ATCC26030), Down, FL-1, y B295 (var. duboisii)), Dr. Brent Lasker, Centers for Disease Control y Prevention (CDC), Atlanta, Ga; Coccidioides immitis (cepas C635 y C735), Dr. Garry Cole, Medical College of Ohio, Toledo, Ohio; Paracoccidioides brasiliensis (cepas 265, Pb18, rh, suelo (suelo aislado de Venezuela)), Dr. Maria Jose Soares Mendes Giannini, Facultad de de Ciencias Farmacéuticas, UNESP, Araraquara, Brasil y Dr. Juan McEwen; Corporación Para Investigaciones Biológicas, Medellín, Colombia; C. neoformans (cepas 9759-MU-1 (serotipo A), BIH409 (serotipo B), K24066TAN (serotipo C) y 9375 (serotipo D)) y todos los ADN de las especies de Candida (Candida albicans (cepa B311), Candida glabrata (CDC Y-65) Candida krusei (CDC 259-75), Candida tropicalis (CDC 38), y Candida parapsilosis (ATCC 22019)), Ms. Cheryl Elie, CDC; y Pneumocytis carinii (aislado de rata), Dr. Charles Beard, CDC.

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Ejemplo 2 Preparación de alto rendimiento de ADN fúngico Hongos

Aspergillus fumigatus (ATCC 42202); Candida albicans (CBS-2730); Fusarium solani (ATCC 52628); Mucor racemosus (ATCC 22365); Pseudallescheria boydii (ATCC 36282); Sporothrix schenckii (ATCC 28184). Candida albicans se cultivó en agar de dextrosa Sabouraud a 37ºC, Sporothrix schenckii se cultivó en agar de dextrosa de patata a 27ºC, y las otras 4 especies restantes se cultivaron en agar de dextrosa de patata a 37ºC.

Extracción de ADN de alto rendimiento

Se añadieron 3 tipos de perlas de vidrio lavadas con ácido a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos profundos que contenía 2 ml de muestra por pocillo (Bellco Glass, Inc., Vinely, NJ). Las cantidades y tipos de perlas de vidrio usadas fueron: (1) 100 \mul de perlas de vidrio de 106 \mum (Sigma Chemical Co., St Louis, MO); (2) 100 \mul de perlas de vidrio de 3 mm (Coming, Inc., Coming, NY); y (3) 150 \mul de perlas de vidrio de 0,5 mm (BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Después se añadieron a cada pocillo células o conidias (10^{8}) de los hongos listados antes, suspendidos en 400 \mul de tampón de TSTE. La placa se cerró con una tapa y se agitó durante 30 min a 500 rpm en un incubador rotatorio (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) equipado con una bandeja utilitaria de acero inoxidable para contener la placa.

Purificación del ADN

El ADN extraído de cada pocillo se purificó diluyendo primero la disolución del pocillo en 300 \mul de NaCl 6 M en un tubo de centrífuga de 2 ml y con agitación vortical durante 30 segundos. Cada tubo se centrifugó a 2750 x g durante 30 minutos, y se transfirieron aproximadamente 700 \mul del líquido sobrenadante a un tubo Eppendof de 1,5 ml nuevo, donde se lavó por centrifugación con 700 \mul de isopropanol. El líquido sobrenadante se separó y se añadieron al tubo 300 \mul de etanol al 70%. La muestra se volvió a centrifugar a 10.000 x g durante 30 minutos, se separó el líquido sobrenadante, y el sedimento se secó al aire durante 30 min. Después de secado al aire, se añadieron 50 \mul de TE y 1 \mul de RNasa 500 \mug/ml. Después, la muestra se incubó a 37ºC durante 30 min. El ADN después se volvió a suspender en 50 \mul de tampón de TE.

Cuantificación del ADN

La cantidad de ADN aislada en cada muestra se calculó usando la relación A_{260/280nm}. Las mediciones de absorbancia se llevaron a cabo usando un fluorómetro Hoefer DyNA^{TM} 200 con 2 \mul de colorante Hoescht 333258 diluido para la detección de ADN de intervalo bajo (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) añadidos a cada 2 \mul de muestra.

Amplificación por PCR

Se usaron los cebadores universales ITS3 e ITS4 para amplificar una región del gen de ARNr fúngico (véase la figura 1). La mezcla de reacción contenía 5 \mul de 10x tampón de PCR; 1 \mul de dNTPs (0,2 \muM); 0,5 \mul de cada cebador (20 \muM); 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Roche); y 2 \mul de ADN molde (5 ng). Las muestras se pusieron en un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600 a 95ºC durante 30 minutos para desnaturalizar el ADN y después durante 36 ciclos a 95ºC durante 30 segundos (desnaturalización); 58ºC durante 30 segundos (reasociación); 72ºC durante 1 minuto (extensión); y se llevó a cabo una etapa de extensión final de 72ºC durante 10 minutos.

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Ejemplo 3 Comparación de la preparación de alto rendimiento de ADN fúngico con procedimientos estándar

La técnica de alto rendimiento descrita en el ejemplo 2, se comparó con otras técnicas de extracción de ADN estándar.

Extracción de ADN por digestión enzimática

La digestión enzimática con liticasa se llevó a cabo mediante mezcla vortical suave después de suspender 10 células o conidias en 500 \mul de tampón de lisis A (sorbitol 1 M, fosfato sódico (monobásico) 0,05 M, 2-mercaptoetanol al 0,1%, liticasa 100 \mug/ml (Sigma Chemical Co.)). Después, las suspensiones de células se incubaron en un modo estacionario durante 3 h a 37ºC. Los núcleos se lisaron por adición de 100 \mul de tampón de lisis B (SDS al 10% y EDTA 0,05 M (pH 8,0) (Sigma Chemical Co.)).

Extracción de ADN por batidora de perlas de vidrio

Se suspendieron células o conidias (10 ) en 400 \mul de tampón de TSTE (Triton X-100 al 5%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) y se transfirieron a un tubo de 2 ml que contenía 400 \mul de perlas de vidrio (Q-BIOgene, Carlsbad, CA). Se añadió el tampón de TSTE (400 \mul, véase antes) y el tubo se puso en un instrumento FastPrep® (Q-BIOgene). La muestra se procesó durante 45 segundos en el ajuste más alto y después se enfrió sobre hielo durante 5 minutos.

Extracción de ADN por trituración en nitrógeno líquido

El procedimiento se llevó a cabo en una campana extractora. Las células o conidias (10 ) se transfirieron a un mortero estéril, previamente enfriado, usando un bucle estéril de inoculación. Se añadieron 5 ml de nitrógeno líquido, las células se congelaron y se trituraron manualmente hasta un polvo fino usando una mano de mortero. Se añadió 1 ml de tampón de TSTE (véase antes) y se dejó sumergir el mortero y la mano de mortero en el tampón durante 30 minutos antes de transferir el líquido a un tubo de centrífuga de 2 ml.

Comparación de resultados

El ADN se purificó y amplificó por PCR sustancialmente como se ha descrito en el ejemplo 2, excepto que la etapa de centrifugación inicial de la purificación del ADN se llevó a cabo a 10.000 x g durante 30 minutos, en lugar de 2750 x g durante 30 minutos como se usaba en el procedimiento de alto rendimiento.

La extracción del ADN por el procedimiento de alto rendimiento descrito en el ejemplo 2 era inesperadamente superior a los otros 3 procedimientos de digestión enzimática, batidora con perlas de vidrio, y trituración con nitrógeno líquido. El procedimiento de alto rendimiento requería el tiempo de producción mínimo (menos de 2 horas, comparado con las hasta 4 horas para otros procedimientos de extracción de ADN), no necesitaba equipamiento especializado (a diferencia del procedimiento de batidora con perlas de vidrio, que requiere un instrumento FastPrep), y se podían procesar de una vez hasta 96 muestras (comparado con una sola muestra o unas pocas muestras para la digestión enzimática y el procedimiento de trituración en nitrógeno líquido, y hasta 12 muestras para el procedimiento de batidora con perlas de vidrio). Además, el procedimiento de alto rendimiento producía un rendimiento de ADN adecuado para propósitos de tipificación (30 \pm 2 ng/\mul, n = 6) y no se necesitaban enzimas caras (comparado con el procedimiento de degradación enzimática). La figura 4 es una impresión digital de un gel de agarosa que muestra productos de la PCR después de aislar el ADN usando el procedimiento de alto rendimiento. La calle M es una escala de ADN en 100 pb (de 1000 a 100 pb), mientras que las calles 1 a 6 son amplicones de F. solani, M. racemosus, S. schenckii, A. umigatus, P. boydii y C. albicans, respectivamente. La figura 5 es una impresión digital de un gel de agarosa que demuestra la sensibilidad de la PCR basada en el ADN genómico de (A) A. fumigatus (B) C. albicans, aislado por el procedimiento de alto rendimiento. Calles 1 a 6, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, y 1 fg de ADN, respectivamente, después de amplificación por la PCR. Calle 7, control agua. Calle M, escala de ADN en 100 pb (1000 a 100 pb).

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Ejemplo 4 Preparación de cebadores y sondas

Todos los cebadores y sondas se sintetizaron por la química de la \beta-cianoetil-fosforamidita, usando un sintetizador de ADN automatizado 394 o Expedite (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). ITS3, una secuencia fúngica universal situada en la región 5,8S del gen de ARNr y contenido en la región amplificada por los cebadores ITS1 e ITS4 (véase Lott, y col., Yeast 9:1199-206 (1993); y White, T.J., y col., en M.A. Innis, y col. (ed.), PCR Protocols: A guide to methods and applications (Academic Press, San Diego, CA, 1990) se biotiniló en el extremo 5' por incorporación de dimetoxitritilbiotina-carbono-6-fosforamidita durante su síntesis. Después, esta sonda biotinilada (ITS3-B) se purificó por cromatografía líquida de fase inversa. Las sondas marcadas con digoxigenina se sintetizaron con un grupo amina 5'-terminal usando 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Research, Sterling, VA), mezclado con un exceso molar de 10 veces de éster de N-hidroxisucciminida del ácido digoxigenina-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en tampón de carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,0, y se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Las sondas marcadas con digoxigenina después se purificaron por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa. Véase, Becker, y col., J. Chromatogr. 326:293-299 (1985).

Las secuencias y localizaciones del gen de ARNr de estos cebadores y sondas, se representan en la tabla 1 y la figura 1, respectivamente. Todos los cebadores y sondas los sintetizaron CDC Biotechnology Core Facility.

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Ejemplo 5 Sondas específicas de microbio

Las secuencias de ADN de la región ITS2 del gen de ARNr fúngico (véase la figura 1) se obtuvieron de GenBank y se listan en la tabla 1.

TABLA 1 Secuencias de cebadores y sondas oligonucleótidos

1

2

Los hongos que no tenían secuencias disponibles en GenBank (P. brasiliensis, S. schenckii y P. marneffei) se secuenciaron usando un kit de secuenciación de ciclo terminador de colorante (ABI PRISM, Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA) y las secuencias se depositaron desde entonces en GenBank por el laboratorio de lo autores de la invención o por otros (números de acceso: Sporothrix schenickii, AF117945; P. brasiliensis, AF322389; P. marneffei, L37406). Brevemente, las amplificación de ADN primario se llevaron a cabo usando ITS1 e ITS4 como cebadores. El ADN se purificó usando columnas de centrifugación QIAquick (Qiagen Corp., Chatsworth, CA) y se eluyeron con 50 ml de tampón de Tris-EDTA esterilizado con calor (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). La secuenciación se llevó a cabo tanto en la dirección directa como en la inversa. La mezcla de reacción de la PCR (20 \mul) que contenía 9,5 \mul de premezla de terminación, 2 \mul (1 ng) de molde de ADN, 1 \mul de cebador (cebador directo o inverso, 3,2 pmol) y 7,5 \mul de H_{2}O destilada esterilizada con calor, se puso en un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600 precalentado (96ºC) durante 25 ciclos de 96ºC durante 10 s, 50ºC durante 5 s, y 60ºC durante 4 min. Después, el producto de la PCR se purificó antes de secuenciación usando columnas de centrifugación CentriSep (Princeton Separations, Inc., Adelphia, NJ). Después, el ADN se secó a vacío, se volvió a suspender en 6 \mul de formamida-EDTA (5 \mul de formamida desionizada más 1 \mul de EDTA 50 mM, pH 8,0), y se desnaturalizó durante 2 min a 90ºC antes de someterlo a secuenciación usando un secuenciador de ADN capilar automatizado (ABI Systems, Modelo 373, Bethesda, MD).

Las secuencias se alinearon y se llevó a cabo una comparación para determinar las secuencias únicas que se podían usar para el desarrollo de sondas de oligonucleótidos marcadas con digoxigenina específicas. La selección inicial de especificidad de las secuencias de las sondas se llevó a cabo usando el software BLAST (GCG, Madison, WI). Las secuencias de sondas que se determinó que eran únicas se sintetizaron después y se marcaron con digoxigenina como se ha descrito antes.

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Ejemplo 6 Amplificación por PCR usando ITS1 e ITS4 como cebadores

La mezcla de reacción de la PCR consistía en tampón de Tris-HCl 10 mM que contenía KCl 50 mM, pH 8,0 (Roche), MgCl_{2} 1,5 mM (Roche), dNTP 0,2 mM (TaKaRa Shuzo Co. Ltd; Otsu, Shiga, Japón) y 1,25 U de polimerasa Taq (TaKaRa Shuzo). Los cebadores ITS1 e ITS4 se añadieron con una concentración final de 0,2 mM cada uno. El ADN molde se añadió con una concentración final de 1 ng por 50 \mul de mezcla de reacción. Para cada experimento, al menos un tubo de reacción recibió agua en lugar de ADN molde como control negativo. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Modelo 9600 (Perkin Elmer, Emeryville CA). La desnaturalización inicial del ADN molde se logró calentando a 95ºC durante 5 minutos. A esto le siguieron 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 58ºC, y 1 min a 72ºC. Se llevó a cabo una etapa final de extensión durante 10 min a 72ºC. Se incluyeron controles adecuados y se tomaron precauciones para la contaminación de la PCR. Fujita, S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:962-67 (1995); Kwok, S., y R. Higuchi, Nature 339:237-38 (1989).

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Ejemplo 7 Confirmación de la amplificación por PCR por electroforesis en gel de agarosa

Para verificar que la diana de ADN específico se había amplificado adecuadamente y era del tamaño esperado, los amplicones de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y las bandas se visualizaron después de tinción con bromuro de etidio.

Los geles consistían en agarosa LE al 1% (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) y agarosa NuSieve GTG al 1% (FMC Bioproducts, Rockly, Me.) o agar Metaphore al 2% (FMC Bioproducts) disueltos en tampón de TBE (Tris 0,1 M, ácido bórico 0,09 M, EDTA 0,001 M, pH 8,4). Se combinaron 5 \mul de los amplicones de la PCR con 1 \mul de colorante de rastreo (Roche) y después se añadieron a cada pocillo de gel de agarosa. La electroforesis se llevó a cabo a 70-80 V durante 45-60 minutos. El gel se tiñó con bromuro de etidio durante 30 min y se lavó con agua desionizada durante 30 min antes de examen con un transiluminador UV.

La amplificación del ARNr usando los cebadores ITS1 e ITS4 dio como resultado un amplicón de aproximadamente 600 pb para todos los hongos ensayados. Como se ilustra en la figura 7, los tamaños moleculares de los amplicones eran especialmente similares entre los hongos dimórficos. En la figura 7, las abreviaturas de las calles son (de izquierda a derecha): PM, marcadores de peso molecular (digestión con HaeIII del plásmido \varphiX174, Roche, Indianapolis, Ind.); H. capsulatum, ADN amplificado de cepas de H. capsulatum B293 (var. duboisii), Down y Fls-1; B. dermatitidis, ADN amplificado de cepas de B. dermatitidis 4478, KL-1 y A2; C. immitis, ADN amplificado de cepas de C. immitis C635 y C735; C. neoformans, ADN amplificado de cepas de C. neoformans 9759-MU-1 (serotipo A), BIH409 (serotipo B), K24066TAN (serotipo C), y 9375 (serotipo D); calles CA, CG, CK, CT y CP, ADN amplificado de C. albicans (cepa B311); C. glabrata (CDC Y-65), C. krusei (CDC 259-75), C. tropicalis (cepa CDC 38), y C. parapsilosis (ATCC 22019), respectivamente; calle B, blanco de agua (control negativo). Las mayores diferencias en el tamaño de los amplicones se observaron entre las 5 especies de Candida ensayadas y eran particularmente pronunciadas para C. glabrata y C. krusei comparado con todas las demás especies de Candida. Sin embargo, la identificación específica de los hongos usando solo el tamaño de los amplicones no fue posible y en general no es recomendable. Podzorski, R.P., y D.H. Persing, en P.R. Murray, y col. (eds.), Manual of ClinicalMicrobiology, 6^{a} ed. (ASM Press, Washington, D.C., 1995), 130-157. Por lo tanto, se diseñaron sondas para identificar específicamente hongos usando el procedimiento de identificación de PCR-EIA descrito en el Ejemplo 8.

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Ejemplo 8 Reacción en cadena de la polimerasa-Inmunoensayo enzimático (PCR-EIA)

La identificación por EIA de los productos de la PCR se llevó a cabo como describen Elie, C. M., y col., J. Clin. Microbiol. 36:3260-65 (1998) y Fujita, S., y col., J. Clin. Microbiol. 33:962-7 (1995), con modificaciones pequeñas. Las figuras 1A-B ilustran este protocolo. Brevemente, los tubos que contenían 10 \mul de amplicones de la PCR desnaturalizados con calor (5 min a 95ºC) se pusieron sobre hielo, y se añadieron 200 \mul de tampón de hibridación (4X SSC, pH 7,0, HEPES 0,02 M, EDTA 0,002 M, Tween 20 al 0,15%) que contenía 10 ng de ITS3-B y 10 ng de una sonda específica marcada con digoxigenina. Las muestras se mezclaron y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Se añadieron 100 \mul de la mezcla por duplicado a cada pocillo de una placa de microvaloración, de 96 pocillos, recubierta de estreptavidina (Roche) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en una agitador de placa de microvaloración (\sim350 rpm, Labline Instruments, Melrose Park, IL). Las placas de microvaloración se lavaron 6 veces con disolución salina tamponada con fosfato 0,01 M, pH 7,2 (GibcoBRL, Life Technologies, Gry Isly, NY), que contenía Tween 20 al 0,05% (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) (PBST) antes de añadir 100 \mul de una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-digoxigenina, marcada con peroxidasa de rábano picante (150 U/ml, Roche) por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y después se lavaron 6 veces con PBST. Después se añadió sustrato de 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB)-H_{2}O_{2} (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD) a los pocillos y se dejó que se desarrollara la reacción de color a temperatura ambiente durante 15 min. La densidad óptica de cada pocillo se leyó inmediatamente a una longitud de onda de 650 nm en un lector de placa de microvaloración UVMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se hizo la media de la densidad óptica de los pocillos duplicados y se usó en el análisis de los resultados. Después, los resultados de densidad óptica se convirtieron en un índice de EIA (EI) que se calculó dividiendo el valor de la densidad óptica de los pocillos que habían recibido ADN de ensayo entre la densidad óptica del control de agua de la PCR: D.O. de ADN de ensayo/D.O. del blanco de agua = EI.

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Ejemplo 9 Análisis estadístico

Se usó el ensayo t de Student para determinar las diferencias entre el EI medio de la hibridación de la sonda respecto al ADN homólogo y heterólogo. Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor de P era menor o igual a 0,05.

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Ejemplo 10 Especificidad de la sonda

Se diseñaron sondas marcadas con digoxigenina dirigidas a la región de ITS2 del ADNr para detectar específicamente los amplicones de la PCR de los hongos de tipo levadura médicamente más importantes. Además de las sondas específicas de microbio, también se diseñó una sonda como una sonda de selección primaria (Dm; SEQ ID NO: 4) con la que identificar solo los patógenos fúngicos dimórficos, sistémicos. La especificidad de estas sondas se confirmó usando el procedimiento de PCR-EIA en un patrón cuadriculado como se muestra en la tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

La sonda de selección dimórfica (Dm) hibridó satisfactoriamente con los amplicones de la PCR de todas las cepas de los hongos dimórficos sistémicos principales (H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis, P. brasiliensis y P. marneffei) pero no con el ADN de cualquiera de las cepas de los hongos de tipo levadura (S. schenckii, C. neoformans, especies de Candida o P. carinii).

Se ensayaron las sondas específicas de microbio (Hc, Bd, Ci, Pb, Pm, Ss, Cn y Pc), diseñadas para detectar solo el ADN amplificado a partir de sus hongos homólogos, contra los amplicones de la PCR de todas las cepas de los hongos de tipo levadura tanto homólogos como heterólogos. Los resultados en la tabla 2 demuestran que las sondas específicas de microbio hibridan con el ADN de hongos homólogos y no con el ADN de hongos heterólogos (P<0,001 o P<0,05) con excepciones minoritarias. Se observó algo de reactividad de la sonda de B. dermatitidis cuando se ensayó contra el ADN de C. immitis. Sin embargo, la señal de hibridación para la sonda de B. dermatitidis ensayada contra el ADN de B. dermatitidis era significativamente mayor que la del ADN de C. immitis (11,9 \pm 2,0 frente a 4,3 \pm 0,8, P<0,01). Además, el inverso (es decir, la sonda de C. immitis ensayada contra el ADN de B. dermatitidis) era negativo y se podía usar para diferenciar los dos hongos por un procedimiento de eliminación. Había también una señal de hibridación observada para la sonda de H. capsulatum hecha reaccionar con el ADN de C. albicans (15,5 \pm 1,4 frente a 6,5 \pm 1,0, P<0,001), pero no se observó señal para ninguna de las otras especies de Candida ensayadas usando esta sonda. Sin embargo, la sonda dimórfica no hibridaba con el ADN de C. albicans y la sonda de C. albicans no hibridaba con el ADN de H. capsulatum (no se muestran los datos; véase Elie y col., y Fujita y col.).

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Ejemplo 11 Confirmación de la especificidad de la sonda usando múltiples cepas de hongos homólogos y heterólogos

Para analizar mejor la capacidad de las sondas para hibridar con ADN solo de hongos homólogos, se ensayó el ADN de múltiples cepas de cada uno de los hongos dimórficos sistémicos en la PCR-EIA. Los resultados se muestran en la tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

La sonda diseñada para identificar todos los hongos dimórficos sistémicos (Dm) hibridados con ADN de todas las cepas de H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis y P. brasiliensis ensayadas. Además, las sondas específicas para hongos dimórficos individuales (Hc, Bd, Ci, Pb) hibridaron solo con el ADN aislado de hongos homólogos, pero no con el ADN aislado de hongos heterólogos. La señal de hibridación pequeña observada para la sonda de B. dermatitidis ensayada contra el ADN de C. immitis era similar para ambas cepas de C. immitis ensayadas.

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Ejemplo 12 Sensibilidad de las sondas usando el procedimiento de PCR-EIA

Para evaluar el límite de sensibilidad del procedimiento de PCR-EIA comparado con el de la detección de amplicones por la electroforesis en gel de agarosa, se diluyó en forma seriada el ADN de H. capsulatum (cepa Down) antes de la amplificación por PCR y después se evaluó tanto por la electroforesis en gel de agarosa como por PCR-EIA. La figura 6 es una impresión digital de un gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio, que demuestra la detección de amplicones con una concentración tan baja como 16 pg de ADN. En la figura 6, la calle 1 contiene marcadores de peso molecular (regla molecular AmpliSize, BioRad, Hercules, CA); calles 2 a 8, pg de ADN por reacción: 20.000; 10.000; 2.000; 400; 80; 16 y 3,2, respectivamente. En contraste, se pudo detectar tan poco como 3,2 pg de ADN por PCR-EIA, como se demuestra en la Tabla 4.

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TABLA 4 Evaluación de la sensibilidad del ensayo de PCR-EIA

6

Ejemplo 13 Diferenciación de Penicillium marneffei Microorganismos

Se usaron aislados clínicos o cultivos obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC), o del CDC Mycotic Diseases Branch Laboratory. Véase la siguiente tabla 5.

Aislamiento de ADN

Se extrajo ADN de todas las especies usando el kit FastDNA (Q-BIOgene, Carlsbad, CA) con modificación pequeña.

\newpage

Diseño de sondas

Se usaron cebadores fúngicos universales, ITS3 e ITS4, para amplificar la región de ADNr de ITS2. Se diseñaron sondas de oligonucleótidos a partir de los datos de secuencia de GenBank para la región ITS2 de especies de Penicillium, o se secuenciaron por procedimientos capilares estándar, si las secuencias no estaban disponibles en GenBank.

Amplificación por PCR

La mezcla de reacción contenía 5 \mul de 10 x tampón de PCR, dNTP 0,2 \muM, 0,5 \mul de cada cebador (20 \muM), ADN polimerasa Taq (2,5 U, Roche), ADN molde (5 ng), y agua destilada estéril para llevar el volumen a 50 \mul. Las condiciones de amplificación de la PCR eran 5 min de desnaturalización a 95ºC, seguido de 30 ciclos de 95ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s, y 72ºC durante 1 min, llevada a cabo en un ciclador térmico Perkin-Elmer descrito antes. Después se llevó a cabo una etapa de extensión final de 72ºC durante 5 min. La electroforesis se llevo a cabo a 80 V durante aproximadamente 1 hora, en geles compuestos de agarosa al 1% (peso/volumen). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio, se visualizaron con un transiluminador UV y se fotografiaron.

EIA

El ADN amplificado por PCR se hibridó con sondas marcadas con digoxigenina específicas de especie y una sonda biotiniliada universal, y después el complejo se añadió a placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina y se capturaron. Después, se llevó a cabo un EIA colorimétrico para detectar el ADN capturado usando anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante y sustrato TMB-H_{2}O_{2}, como se ilustra en las figuras 1A-B.

Análisis estadístico

Se usó el ensayo t de Student para determinar las diferencias significativas entre los valores de absorbancia medios de las reacciones de ADN homólogos y heterólogos con sondas. Las diferencias se consideraban significativas cuando el valor de P era menor o igual a 0,05.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Fuente y características de los aislados

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9

10

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TABLA 6 Especificidad de la sonda de P. marneffei frente a ADN de 13 especies de Penicillium

11

TABLA 7 Especificidad de la sonda de P. marneffei frente a géneros no Penicillium

12

TABLA 8 Especificidad de las sondas de especies de Penicillium frente a ADN de otros hongos

13

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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<110> CENTROS DE CONTROL Y PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES

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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HONGOS

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<130> 6395-63352

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<150> US 60/325.241

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<151> 2001-09-26

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<160> 12

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador directo universal

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tccgtaggtg aacctgcgg

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Cebador inverso universal

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda de captura universal

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gcatcgatga agaacgcagc

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda para todos los hongos dimórficos endémicos

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda para Histoplasma capsulatum

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda para Blastomyces dermatitidis

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Sonda para Coccidioides immitis

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<210> 8

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<211> 16

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda para Paracoccidioides brasiliensis

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

cactcatgga ccccgg

\hfill

16

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<210> 9

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda para Sporothrix schenckii

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacgcgcagc tcttttta

\hfill

18

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<210> 10

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda para Penicillium marneffei

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggttggtca ccaccata

\hfill

18

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<210> 11

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda para Cryptococcus neoformans

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<400> 11

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cctatggggt agtcttcgg

\hfill

19

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<210> 12

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Sonda para Pneumocystis carinii

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<400> 12

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gtagtagggt taattcaatt

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20

Claims (27)

1. Procedimiento para detectar hongos dimórficos seleccionados de Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei; Paracoccidioides brasiliensis y un híbrido de los mismos, que comprende:

detectar la hibridación entre una sonda dimórfica y una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) de un hongo dimórfico en una muestra, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, y en el que la presencia de la hibridación indica la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

2. Procedimiento para diferenciar la presencia de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis, Penicillium marneffei, o Paracoccidioides brasiliensis, aparte de la presencia o ausencia de Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, una especie de Candida, o Pneumocystis carinii, que comprende:

poner en contacto una muestra que contiene un hongo dimórfico que tiene una secuencia de ácido nucleico del espaciador de transcripción interna 2 (ITS2) con una sonda dimórfica, en el que la sonda dimórfica tiene una secuencia que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4; y

detectar una hibridación entre la secuencia de ácido nucleico de ITS2 y la sonda dimórfica, en el que la detección o la hibridación indican la presencia de un hongo dimórfico en la muestra.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende amplificar la secuencia de ácido nucleico de ITS2 de la muestra, generando así una secuencia de ITS2 amplificada.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de ácido nucleico de ITS2 se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa o la reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usa un cebador que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en la reacción en cadena de la polimerasa o la reacción en cadena de la polimerasa-inmunoensayo enzimático.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende:

extraer ADN de la muestra; y

poner en contacto la sonda dimórfica con el ADN.

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7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que además comprende:

detectar una hibridación entre una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio y una secuencia de ácido nucleico de un hongo dimórfico en la muestra.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la sonda dimórfica comprende al menos 20 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la sonda dimórfica consiste en el SEQ ID NO: 4.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la muestra es una muestra biológica o ambiental.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que detectar la hibridación comprende detectar un marcador en la sonda dimórfica.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el marcador comprende un isótopo radiactivo, sustrato enzimático, cofactor, ligando, agente quimioluminiscente, agente fluorescente, hapteno o una enzima.

16. Kit para detectar la presencia de un hongo dimórfico en una muestra biológica, que comprende: una sonda dimórfica que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

17. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la sonda dimórfica consiste en el SEQ ID NO: 4.

18. Kit de acuerdo con la reivindicación 16 o reivindicación 17, que además comprende un cebador que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

19. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende un cebador para amplificar la secuencia de ITS2.

20. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio.

21. Kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio comprende el SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

22. Ordenación para seleccionar en una muestra la presencia o contaminación por un hongo dimórfico seleccionado de: Histoplasma capsulatum; Blastomyces dermatitidis; Coccidioides immitis; Penicillium marneffei y Paracoccidioides brasiliensis, que comprende:

una pluralidad de sondas dimórficas, en la que al menos una sonda dimórfica comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4, y

un sustrato, en el que la pluralidad de sondas dimórficas están dispuestas sobre el sustrato.

23. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la ordenación es una microordenación.

24. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, en la que al menos una sonda dimórfica comprende al menos 20 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4.

25. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 24, en la que al menos una sonda dimórfica consiste en SEQ ID NO: 4.

26. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 22, que además comprende una sonda específica de especie o una sonda específica de microbio.

27. Ordenación de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la sonda específica de especie o la sonda específica de microbio, comprende el SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.