ES2336804T3 - Inmovilizacion de una biomolecula utilizando tecnologia de plasma atmosferico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para inmovilizar una biomolécula en una superficie de muestra mediante la generación y mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en: - introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mezclada entre dichos electrodos, - aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y - depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra, en el que dicha atmósfera mixta comprende un precursor polimérico de plasma reactivo y un aerosol que comprende la biomolécula, y en el que dicho precursor polimérico de plasma reactivo se deposita y dicha biomolécula se inmoviliza durante la etapa de deposición.
Description
Inmovilización de una biomolécula utilizando
tecnología de plasma atmosférico.
La presente invención se refiere a técnicas de
plasma, que implican la inclusión de moléculas biológicas en una
capa depositada de plasma.
En la técnica resulta conocido aplicar grupos
funcionales a una superficie mediante tecnología de plasma. En una
segunda etapa, es posible a continuación fijar biomoléculas a dichos
grupos funcionales. Los grupos funcionales pueden obtenerse
mediante la activación de polímeros o mediante la aplicación de una
capa de cobertura con grupos funcionales. En la mayoría de los
casos, la tecnología conocida se refiere a un proceso de por lo
menos dos etapas.
El documento DE19835869 describe la
estabilización de una enzima inmovilizada sobre un sustrato,
especialmente un biosensor o biorreactor. El documento menciona la
aplicación simultánea de enzimas sobre una superficie y la
aplicación de una capa polimérica. La tecnología utilizada es la
deposición en la fase de gas, que crea un entorno inestable para
las biomoléculas y lleva a una degradación no deseada de las
mismas.
La patente EP0351950 se refiere a la utilización
de plasma para inmovilizar la proteína sobre superficies
poliméricas, en la que se utiliza un proceso de dos etapas en el que
las biomoléculas se exponen a un plasma de baja presión (vacío). La
aplicación de biomoléculas se realiza separadamente de la aplicación
de los precursores poliméricos. El proceso descrito es así
únicamente aplicable a sustratos poliméricos.
La patente EP1231470 describe un procedimiento
para la inmovilización de sustancias con tecnología de plasma. Las
biomoléculas se ponen en contacto con el plasma en un proceso de por
lo menos dos etapas: una capa polimérica de plasma opcional se
aplica a una superficie, seguido por la colocación de las
biomoléculas en dicha superficie y la aplicación en vacío de una
película polimérica de plasma en dichas biomoléculas. Es dudoso que
las biomoléculas conserven sus actividades con este procedimiento,
dado que están cubiertas por una película gruesa polimérica.
El documento WO 03/086031 describe un proceso de
plasma atmosférico que comprende pulverizar precursores líquidos en
un plasma que provocan la polimerización. No se hace ninguna mención
específica a las biomoléculas.
El documento "Antimicrobial coatings obtained
in an atmospheric pressure dielectric barrier flow discharge",
de Paulussen et al, actas del simposio de MRS, tomo 724, 1 de
Abril de 2002, p. 246, está relacionado con el desarrollo de
revestimientos poliméricos de plasma incluidas las sustancias
antimicrobiales tales como sales de plata, mediante la adición de
dichas sustancias a una solución precursora.
El documento DE19835869 está relacionado con un
procedimiento para producir capas estables de enzimas sobre un
sustrato vehículo, donde la enzima se inmoviliza en el vehículo, y
donde después o durante la inmovilización, en la fase de gas se
deposita una capa polimérica mediante una técnica de deposición.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento para inmovilizar biomoléculas sobre
una superficie, con el fin de que sea posible utilizar dichas
biomoléculas en interacción específica con otras moléculas de
interés. El objetivo de la presente invención consiste así en
desarrollar un proceso de una etapa totalmente nueva para la
inmovilización de proteínas/enzimas u otras biomoléculas, que sea
aplicable a gran escala a superficies de cualquier tipo. La nueva
metodología debería ofrecer varias ventajas sobre las técnicas
clásicas de inmovilización, incluida una mejor reproducibilidad,
elevada flexibilidad, amplia aplicabilidad, tratamiento directo y,
en consecuencia, unos índices elevados de rendimiento. El nuevo
sistema de tratamiento podría a su vez llevar a aplicaciones
totalmente nuevas que no son factibles con la tecnología del estado
de la técnica actual.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para inmovilizar una biomolécula en una superficie de
muestra mediante la generación y mantenimiento de un plasma frío a
presión atmosférica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
que consisten en:
- \bullet
- introducir una muestra en el espacio entre un primero y un segundo electrodos, encontrándose presente una atmósfera mixta entre dichos electrodos,
- \bullet
- aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y
- \bullet
- depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra,
en el que durante la etapa de deposición, se
depositan e inmovilizan un precursor reactivo y una biomolécula.
Preferentemente, el precursor reactivo es un gas
o un líquido en la forma de un aerosol.
La biomolécula se selecciona preferentemente de
entre el grupo compuesto de una proteína, un polinucleótido, un
azúcar, un lípido, un factor de crecimiento, una hormona y una
sustancia fisiológicamente activa.
El precursor reactivo puede seleccionarse de
entre el grupo compuesto por un hidrocarburo, un hidrocarburo
fluorado y un compuesto organometálico o una combinación de los
mismos.
La atmósfera mixta puede comprender helio,
argón, nitrógeno, aire, dióxido de carbono, amonio o una combinación
de los mismos.
La muestra puede comprender materiales
metálicos, cerámicos o plásticos, fibras tejidas o no tejidas,
fibras naturales o fibras sintéticas o polvos.
Si es necesario, los electrodos pueden enfriarse
a temperaturas entre 0ºC y 100ºC.
Según la invención, la atmósfera mixta comprende
el precursor reactivo y un aerosol que comprende la biomolécula.
En otra forma de realización alternativa de la
presente invención, el precursor reactivo se administra a la
reminiscencia residual de dicho plasma junto con un aerosol que
comprende una biomolécula, depositándose e inmovilizándose ambos en
una superficie de muestra que se coloca en la misma reminiscencia
residual durante la etapa de deposición.
En el contexto de la presente invención se
contempla que los materiales biotécnicos presenten lugares de
biorreconocimiento diseñados para interactuar específicamente con
otras especies de interés biológicas o no biológicas. La presente
invención permite diseñar y construir superficies robustas de
bioingeniería mediante un tratamiento de plasma frío atmosférico,
que permiten la fijación de todos los tipos de biomoléculas a las
superficies de un modo directo sin utilizar fijadores químicos que
puedan cambiar la configuración y actividad de las biomoléculas o
que puedan implicar costes elevados y problemas referentes a la
homogeneidad. Dicha tecnología puede abrir el camino a un ámbito
completamente nuevo de futuras aplicaciones en el entorno médico,
químico, alimentario, de los materiales y muchos otros sectores
industriales, incluidos, pero sin que esto represente limitación
alguna:
- \bullet
- Biosensores para aplicaciones a gran escala y pequeña escala como, por ejemplo, la detección de contaminantes (dioxinas, sustancias seudo-estrogénicas, antibióticos, microcontaminantes, etc., por ejemplo en el agua y en el aire), diagnósticos biomédicos, ensayos de toxicidad, etc.;
- \bullet
- Laboratorios en un solo chip: la barrera de baja energía para la movilidad en el plano de la superficie puede utilizarse para facilitar reacciones complejas que exigen un grupo de diferentes proteínas, incluidas las aplicaciones en el campo de la bilogía molecular;
- \bullet
- Materiales biomiméticos, por ejemplo para implantes (para imitación del reconocimiento biomolecular);
- \bullet
- Células solares basadas en proteínas de transferencia inmovilizadas de transferencia de carga fotosensible;
- \bullet
- Superficies no contaminantes para diagnósticos médicos, termointercambiadores, y equipo de elaboración de alimentos;
- \bullet
- Revestimientos antimicrobianos para textiles (médicos), plásticos para aplicaciones médicas, envases de alimentos;
- \bullet
- Superficies para controlar directamente la liberación de fármacos;
- \bullet
- Materiales/textiles inteligentes, por ejemplo mediante la incorporación de proteínas en revestimientos conductores poliméricoss de plasmas, que pueden permitir la transmisión de una señal biológica a un procesador;
- \bullet
- Plantillas para crecimiento extracorpóreos y/o in vivo de tejidos funcionales;
- \bullet
- Morfologías cristalinas bioinducidas: las biomoléculas ordenadas en una superficie pueden inducir a la mineralización y las morfologías obtenidas diferir de las clásicas. Dichas superficies minerales pueden encontrar aplicaciones en el desarrollo de materiales y la microelectrónica;
- \bullet
- Revestimientos conductores basados en proteínas conductoras (por ejemplo, el citocromo C en la albúmina sérica bovina);
- \bullet
- Aplicaciones de biocatálisis, por ejemplo, biodegradación de moléculas más resistentes en aguas residuales y la retirada de microcontaminantes, catálisis de reacciones bioquímicas muy específicas para producir compuestos químicos de gran valor (por ejemplo compuestos quirales).
Un aerosol compuesto de una biomolécula se
administra a un plasma frío atmosférico junto con un precursor
polimérico de plasma, ya sea gaseoso o líquido. Si es necesario, al
plasma se le pueden añadir aerosoles de mezclas o mezclas de
diferentes aerosoles, posiblemente junto con los precursores
gaseosos. Es importante incorporar las biomoléculas en un
revestimiento polimérico de tal modo que se conserve por lo menos
parte de la actividad o estructura biológica. La presente invención
constituye un proceso de una etapa. Además, cualquier sustrato, de
cualquier forma o material, puede revestirse con biomoléculas
utilizándose el procedimiento de la presente invención.
Una ventaja principal de la presente invención
es su capacidad para tratar los materiales de un modo rentable y a
gran escala, lo cual no es posible con la tecnología del estado de
la técnica actual.
El procedimiento de inmovilización según la
presente invención comprende la incorporación de biomoléculas, y
proteínas en particular, en revestimientos polimerizados finos de
plasma. Con este fin, los aerosoles que contengan estas proteínas u
otras biomoléculas se administrarán a un plasma frío atmosférico
junto con precursores poliméricos líquidos o gaseosos. La
configuración preferida de plasma que deberá utilizarse cuando se
aplique la presente invención es la descarga de barrera dieléctrica
(DBD), que se compone de una reminiscencia uniforme. La
inmovilización de biomoléculas no es viable con la tecnología de
plasma de vacío o baja presión RF (13, 56 MHz), bien estudiada, por
una serie de razones, pero principalmente debido a la presencia de
especies altamente energéticas en el plasma que provocan un daño
importante a las proteínas o pueden incluso destruirlas. Además, el
tratamiento de proteínas y soluciones de proteína es impracticable
en condiciones de vacío.
El tratamiento de plasma a presión atmosférica
es una tecnología relativamente nueva -los primeros informes son
del año 1990- y ofrece muchas ventajas sobre la tecnología de plasma
en vacío, incluida la capacidad de trabajo en línea, los costes de
proceso notablemente menores y la compatibilidad con prácticamente
cualquier tipo de material de sustrato. La característica más
importante de los plasmas de presión atmosférica en este contexto
es no obstante la ausencia de especies altamente energéticas en el
plasma. Aunque las moléculas complejas precursoras se fracturan
cuando se exponen al plasma en vacío, mantienen su estructura en
gran medida en los plasmas a presión atmosférica. Dicho fenómeno se
atribuye a la longitud reducida media de recorrido libre de las
especies activas debido a la presencia de altas cantidades de
moléculas de gas. En consecuencia, dicha nueva tecnología permite
también la incorporación de biomoléculas en revestimientos con
únicamente modificaciones menores. Las soluciones que contienen
biomoléculas/proteínas, ya sea acuosas o con disolventes añadidos,
pueden administrarse al plasma como un aerosol junto con un
hidrocarburo líquido o gaseoso o un precursor polimérico de
molécula híbrida orgánica/inorgánica. En consecuencia, las
biomoléculas presentes en las gotas pueden incorporarse en
revestimientos finos poliméricos de plasma cuando están expuestas a
la superficie y muestran su actividad. La incorporación de
biomoléculas puede realizarse físicamente (mediante su inserción) o
mediante el enlace covalente, dependiendo de las condiciones de
reacción y el tipo de precursor utilizado. Durante este proceso,
las proteínas no estarán obligadas a cambiar su conformación a fin
de fijarse a una superficie dado que el revestimiento,
preferentemente un revestimiento con un alto contenido de agua, se
formará sobre las proteínas, estabilizándolas y protegiéndolas de
ese modo. No obstante, continúa siendo importante que la orientación
de las proteínas en la proximidad de la superficie permita que
expongan sus lugares biológicamente activos o que la densidad de
enlace cruzado del polímero de plasma sea lo suficientemente baja
para permitir la difusión de los sustratos coincidentes en las
proteínas completamente empotradas. Los precursores que contienen
grupos funcionales como las aminas y los carboxilos se fijarán
químicamente a las biomoléculas aunque esto es menos probable que
ocurra con precursores como los alcanos. En el último caso, sí
podría tener lugar la inserción de proteínas en un revestimiento.
Los precursores incluyen las moléculas orgánicas (como compuestos
acrílicos, alcanos, alquenos, etc.) y moléculas hibridas
orgánicas/inorgánicas (como HMDSO y TEOS).
Además, aparte de la presencia de radicales de
baja energía, las condiciones de la reacción en plasmas fríos y no
equilibrados son muy suaves: baja temperatura (temperatura ambiente
hasta 60ºC) y presión ambiente. Hasta este momento no se ha
publicado literatura ni ninguna patente sobre la producción de
revestimientos biofuncionales similares mediante la tecnología de
plasma a presión atmosférica.
Una descarga de plasma a presión atmosférica se
obtiene entre dos electrodos paralelos colocados horizontalmente
con un tamaño de 45 \times 45 mm, ambos cubiertos con una capa de
alúmina (AL_{2}O_{3}) de un espesor de 2 mm. La distancia entre
los electrodos cubiertos es 2 mm. El electrodo superior se pone a
masa. El electrodo inferior está conectado a una fuente de energía
de CA de frecuencia variable (ENI, modelo RPG - 50). La frecuencia
de la fuente de energía de CA se fija a 2 kHz. Con el fin de
desarrollar ensayos en un entorno controlado, la configuración de
electrodos está montada en una cámara cerrada que se evacua y se
llena posteriormente con el gas vehículo antes del inicio de la
deposición.
Como gas vehículo se utiliza helio. El caudal de
flujo del gas vehículo se controla mediante un controlador de
caudal de masa y se fija en 20 l/min. El hexametildisiloxano (HDMSO)
se utiliza como precursor reactivo. Se añade al gas portador inerte
en la forma de un aerosol. Al plasma se añade simultáneamente otro
aerosol, que contiene una solución acuosa de estreptavidina. El
tiempo de deposición se fija en 1 min. Se observa la deposición del
revestimiento de la superficie de ambos electrodos y en los
sustratos fijados a estos electrodos. El espesor de los
revestimientos es igual a 175 nm. Se evaluó la presencia de
estreptavidina en el revestimiento del polímero de plasma obtenido
y la capacidad de la estreptavidina de fijar la biotina etiquetada
fluorescentemente después de la inmovilización utilizando el
microscopio de fluorescencia. Después de utilizar el ensayo de
fijación de la biotina etiquetada fluorescentemente, pudo observarse
una señal, lo que indica que la estreptavidina se inmovilizó en el
revestimiento, conservando aún por lo menos parte de su actividad de
fijación.
Se obtiene una descarga de plasma frío a presión
atmosférica entre dos electrodos paralelos colocados horizontalmente
con un tamaño de 8 \times 15 cm, ambos cubiertos con una placa de
vidrio flotante de un espesor de 3 mm. La distancia entre los
electrodos es 2 mm. El electrodo inferior está conectado a tierra y
a un elemento Peltier que puede proporcionar refrigeración a
temperatura ambiente, si es necesario. El elemento Peltier está a su
vez conectado a una aleta de enfriamiento que está refrigerada por
un ventilador. El electrodo superior está conectado a una fuente de
energía de CA de frecuencia variable. A los electrodos se aplica un
campo de CA de 8 kHz y de 20 kV.
El helio se utiliza como gas vehículo. El caudal
de flujo del gas vehículo se controla mediante un controlador de
caudal de masa y se fija en 6 l/min. El acetileno se utiliza como
precursor reactivo. Se mezcla con el gas inerte vehículo y se
administra al plasma a una velocidad de caudal de 0,3 l/min. Al
plasma se añade simultáneamente un aerosol, que contiene una
solución acuosa de avidina. El tiempo de deposición se fija en 30
segundos. En la superficie de ambos electrodos y en los sustratos
de vidrio y silicona fijados a los electrodos se deposita un
revestimiento. El espesor del revestimiento es igual a 25 nm tal
como determina el análisis de microscopio de electrones de escaneo
(SEM) de los sustratos de silicona revestidos. Se evaluó la
presencia de avidina en el revestimiento polimérico de plasma
obtenido y la capacidad de la avidina para fijarse a la biotina
etiquetada fluorescentemente después de la inmovilización
utilizándose el microscopio de fluorescencia. Después de utilizar
el ensayo de fijación de la biotina etiquetada fluorescentemente,
pudo observarse una señal, lo que indica que la avidina se
inmovilizó en el revestimiento, conservando aún por lo menos parte
de su actividad de fijación. Se efectuó el análisis de difusión por
rayos X de ángulo pequeño con incidencia rasante (GISAX) a fin de
obtener información sobre la estructura y tamaño de la avidina
inmovilizada. Aparentemente por lo menos parte de la avidina
inmovilizada ha conservado su estructura y forma original y, en
consecuencia, su actividad.
Se repitió el procedimiento descrito en el
ejemplo 2 utilizándose un precursor líquido, siendo este precursor
la pirrola, en lugar de acetileno. La pirrola se administró a la
zona de plasma como un aerosol. De nuevo, se observó la deposición
del revestimiento sobre la superficie de ambos electrodos y sobre
los sustratos de vidrio y silicona fijados a su superficie. El
espesor del revestimiento fue igual a 35 nm después de 30 segundos
de deposición.
La configuración de reactor descrita en el
ejemplo 2 se utilizó para la inmovilización de la albúmina sérica
bovina (BSA). El helio se administró a la zona de plasma a una
velocidad de caudal de 6 l/min. La pirrola se utilizó como
precursor reactivo. Se añadió al gas vehículo inerte como aerosol.
Al plasma se añadió simultáneamente otro aerosol, conteniendo una
solución acuosa de BSA. A los electrodos se aplicó un campo de CA de
2 kHz y 20 kV. El tiempo de deposición se fijó en 30 segundos. En
la superficie de ambos electrodos y sobre los sustratos de vidrio y
silicona fijados a los electrodos se depositó un revestimiento. El
espesor del revestimiento es igual a 35 nm tal como se determinó
por el análisis de microscopio de electrones de escaneo (SEM) de los
sustratos de silicona revestidos. Se efectuó el análisis de rayos X
de ángulo pequeño (GISAX) con el fin de obtener información sobre
la estructura y tamaño del BSA inmovilizado. Aparentemente, una
parte sustancial de la BSA inmovilizada ha conservado su estructura
y forma original y, en consecuencia, su actividad.
Una solución de albúmina sérica bovina (BSA) se
coloca sobre un sustrato de vidrio. Después de secar la muestra
durante 12 horas a temperatura ambiente, se coloca sobre el
electrodo inferior de la configuración descrita en el ejemplo 2, y
se administra helio y acetileno a la zona entre los electrodos a un
caudal de flujo de 6 y 0,3 l/min, respectivamente. Después de 10
segundos de deposición, se obtuvo una capa con un espesor de 3 a 5
nm. Se analizó la muestra por medio del análisis de rayos X de
ángulo pequeño (GISAX) y, aparentemente, la BSA conservó su
estructura y tamaño original en gran medida después de este tipo de
tratamiento.
Claims (8)
1. Procedimiento para inmovilizar una
biomolécula en una superficie de muestra mediante la generación y
mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura
entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas que consisten en:
- \bullet
- introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mezclada entre dichos electrodos,
- \bullet
- aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y
- \bullet
- depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra,
en el que dicha atmósfera mixta comprende un
precursor polimérico de plasma reactivo y un aerosol que comprende
la biomolécula, y en el que dicho precursor polimérico de plasma
reactivo se deposita y dicha biomolécula se inmoviliza durante la
etapa de deposición.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el precursor polimérico de plasma reactivo es un gas o un
líquido en la forma de un aerosol.
3. Procedimiento para inmovilizar una
biomolécula en una superficie de muestra mediante la generación y el
mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura
entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas que consisten en:
- -
- introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mixta entre dichos electrodos,
- -
- aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y
- -
- depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra,
en el que durante la etapa de deposición se
deposita un precursor polimérico de plasma reactivo y se inmoviliza
una biomolécula, y en el que el precursor polimérico de plasma
reactivo se administra a la luminiscencia residual de dicho plasma
junto con un aerosol que comprende una biomolécula, depositándose e
inmovilizándose ambos sobre una superficie de muestra que está
dispuesta en la misma luminiscencia residual durante la etapa de
deposición.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la biomolécula se selecciona de
entre el grupo constituido por una proteína, un polinucleótido, un
azúcar, un lípido, un factor de crecimiento, una hormona.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el precursor polimérico de plasma
reactivo se selecciona de entre el grupo constituido por un
hidrocarburo, un hidrocarburo fluorado y un compuesto
organometálico o una combinación de los mismos.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la atmósfera mixta comprende
helio, argón, nitrógeno, aire, dióxido de carbono, amonio o una
combinación de los mismos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra comprende materiales
metálicos, cerámicos o plásticos, fibras tejidas o no tejidas,
fibras naturales o fibras sintéticas o polvos.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que los electrodos se enfrían a
temperaturas entre 0ºC y 100ºC.
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