ES2337043T3 - Metodos de escrutinio empleando un modelo estructural de fih. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar, explorar, caracterizar o diseñar una identidad química que se une a un factor inhibidor de HIF (FIH), comprendiendo dicho método comparar un modelo estructural de FIH con un modelo estructural para dicha entidad química, procediendo dicho modelo estructural del FIH de los factores estructurales o coordenadas estructurales que se muestran en la Tabla 3.
Description
Método de escrutinio empleando un modelo
estructural de FIH.
La presente invención se refiere a métodos de
diseño de inhibidores del FIH usando la estructura cristalina del
FIH.
En células de muchos organismos la exposición a
un entorno en el que el oxígeno está reducido respecto a los
niveles óptimos induce una respuesta hipóxica. En estas células
hipóxicas, la activación de una cascada transcripcional que implica
al factor inducible por hipoxia (HIF) dirige una serie de respuestas
adaptativas que aumentan el suministro de oxígeno o limitan la
demanda de oxígeno. La activación del HIF en el cáncer y en
enfermedades vasculares hipóxicas isquémicas ha puesto de
manifiesto su importante papel en la patología humana y demostró
que la manipulación de la actividad del HIF tiene un potencial
terapéutico importante.
El complejo transcripcional del HIF comprende un
heterodímero \alpha\beta, siendo HIF-\beta una
proteína nuclear constitutiva que se dimeriza con subunidades de
HIF-\alpha reguladas por oxígeno (Semenza, G. L.
(2000) Genes Dev. 14, 1983-1991). La
actividad de HIF-\alpha se suprime por una
modificación dependiente de oxígeno catalizada por una serie de
dioxigenasas dependientes de Fe^{(II)} y 2OG que hidroxilan restos
de HIF-\alpha específicos. En presencia de
oxígeno en HIF-1\alpha humano, la
4-hidroxilación de Pro402 o Pro564 por un conjunto
de isozimas prolil hidroxilasas de HIF (PHD1-3)
(Epstein et al. (2001) Cell 107, 4357; Bruick,
R. K. y McKnight, S. L. (2001) Science 294,
1337-1340) media su reconocimiento por el complejo
ubiquitina ligasa de von Hippel-Lindau (VHL) y su
posterior direccionamiento para la destrucción del proteosoma (Ivan
et al, (2001) Science 292, 464468; Jaakkola
et al. (2001) Science 292,
468-472, WO 02/074981). En un mecanismo
complementario el FIH cataliza la
\beta-hidroxilación de la Asn803 de
HIF-1\alpha (Lando et al, (2002)
Science 295, 858-861) bloqueando la
interacción con el coactivador de la transcripción p300 (Dames
et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
99, 5271-5276; Freedman et al, (2002)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,
5367-5372). En la hipoxia, la limitación de la
actividad enzimática permite que el HIF-\alpha
escape a la destrucción y se vuelva transcripcionalmente activo.
La inhibición de hidroxilasas de HIF activa
fuertemente la cascada transcripcional del HIF incluso en presencia
de oxígeno (Epstein et al. (2001) Cell 107,
4354). Por lo tanto, la inhibición de las hidroxilasas de HIF da
como resultado una respuesta proangiogénica que puede usarse en el
tratamiento de enfermedades cardiovasculares/enfermedades
vasculares hipóxicas isquémicas, incluyendo el infarto de miocardio
y la anemia. Un problema con esta estrategia es que las células
humanas contienen otras enzimas que pertenecen a la misma familia
que las hidroxilasas de HIF, es decir, que utilizan dioxígeno (un
cosustrato), 2-oxoglutarato (2OG) (un cosustrato) y
Fe(II) (un cofactor). Dichas enzimas se ejemplifican por la
fitanoíl coenzima A hidroxilasa, la procolágeno
prolil-4-hidroxilasa, la
procolágeno prolil-3-hidroxilasa, la
gamma-butirobetaína hidroxilasa, Alk B (una enzima
de reparación del ADN) y otras que incluyen 2OG oxigenasas predichas
identificadas en base a los análisis de secuencia que incluyen una
subfamilia relacionada con el FIH (Hewitson et al., J BIOL
CHEM 277 (29): 26351-26355, 2002). Generalmente se
está de acuerdo en que es deseable que los inhibidores de enzimas
usados como agentes farmacéuticos sean selectivos para su diana
deseada o las dianas implicadas en la producción del efecto deseado.
Una ausencia de selectividad puede conducir a efectos secundarios
tóxicos que hacen a los compuestos particulares inadecuados para el
uso en terapia humana o animal. Una estrategia para identificar
compuestos que sean selectivos para la diana deseada consiste en
emprender análisis estructurales, mecánicos y de otro tipo sobre los
agentes deseados y usar la información obtenida para contribuir a
la preparación de compuestos selectivos, o de compuestos más
selectivos (respecto a los previamente conocidos), para su uso como
agentes farmacéuticos para el uso en seres humanos o animales. En
la presente memoria se describen estudios estructurales y de otro
tipo sobre las hidroxilasas de HIF que permiten el diseño de
inhibidores selectivos del FIH y enzimas relacionadas.
Los presentes inventores han identificado ahora
el sitio de hidroxilación de la asparagina 803 de
HIF-1\alpha por FIH. Además, los inventores han
obtenido la estructura cristalina para el FIH, incluyendo la
identificación del sitio de unión y de los restos implicados en la
interacción del FIH con el HIF.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método de identificación, exploración,
caracterización o diseño de una entidad química que mimetiza a o se
une al FIH, comprendiendo dicho método comparar un modelo
estructural de FIH con un modelo estructural para dicha entidad
química, obteniéndose dicho modelo estructural de FIH de factores
estructurales o coordenadas estructurales que se muestran en la
Tabla 3.
La invención también proporciona el uso de las
coordenadas estructurales del FIH de la Tabla 3 que pueden
obtenerse sometiendo a un cristal que comprende el FIH a mediciones
de difracción con rayos X y deduciendo las coordenadas
estructurales a partir de las mediciones de difracción para
identificar, explorar, caracterizar, diseñar o modificar una
entidad química.
Figura 1: sitio de unión a 2OG.
Figura 2: unión de Asn-803.
Figura 3: conformación de CAD en el sitio 1.
Figura 4: conformación de CAD en el sitio 2.
Figura 5: figura que indica el giro formado por
802-804 de HIF-CAD en el sitio
activo del FIH.
Figura 6: conformación del giro formado por los
restos 802-804 de HIF-CAD en el
sitio activo del FIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han identificado la
posición de la asparagina 803 que se hidroxila por el FIH. Además,
los inventores han identificado la estructura cristalina del FIH.
Esta estructura permite por lo tanto la identificación de los
restos aminoacídicos implicados en la unión del FIH al HIF.
La identificación de la interacción y de las
estructuras permite la caracterización o identificación de las
entidades químicas que pueden unirse y, en particular, que pueden
inhibir al FIH. Pueden identificarse varios tipos diferentes de
inhibidores como se analiza con más detalle a continuación.
Los inventores han cristalizado con éxito el FIH
humano. Esta es la primera cristalización del FIH y ha permitido la
determinación de la estructura cristalina. Las coordenadas del
análisis cristalino se exponen en la Tabla 3 a continuación. Los
estudios han permitido el análisis de la unión de la asparagina 803
del HIF y el análisis de la conformación del dominio de activación
c-terminal (CAD) del HIF en los sitios de unión al
FIH. La presente invención proporciona el uso de las coordenadas
estructurales del FIH para identificar, caracterizar, diseñar o
explorar entidades químicas. Las entidades químicas de interés son
las que se unen al FIH y, en particular, que inhiben la actividad
asparaginil hidroxilasa del FIH. Además, pueden identificarse,
caracterizarse o diseñarse entidades químicas que sean asparagina
hidroxilasas modificadas.
Típicamente, las coordenadas estructurales
usadas pueden obtenerse sometiendo a un cristal que comprende el
FIH o un fragmento del mismo a mediciones de difracción de rayos X y
deduciendo las coordenadas estructurales a partir de las mediciones
de difracción para identificar, explorar, caracterizar, diseñar o
modificar una entidad química. Las coordenadas estructurales
indican las posiciones de átomos individuales dentro del cristal y
proporcionan una indicación del espacio disponible para ajustar la
posición de átomos individuales cuando se diseña una entidad
química.
El cristal sometido a métodos de difracción de
rayos X comprende el FIH o un fragmento del mismo. El FIH puede ser
de cualquier fuente pero preferiblemente es un FIH humano. El FIH
puede ser una forma modificada. Por ejemplo, el FIH puede
modificarse por inserción, deleción, adición
N-terminal o C-terminal o
sustitución de un aminoácido por otro aminoácido. Las sustituciones
de aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas. Típicamente,
cuando se cristaliza, un mutante de FIH adoptará una estructura
tridimensional similar a la adoptada por el FIH correspondiente. Un
mutante puede ser un FIH inactivo.
Las referencias a FIH en la presente memoria se
refieren al FIH y homólogos del mismo. Los restos aminoacídicos se
definen con respecto a la posición en el FIH (véase, por ejemplo,
Hewitson et al). Los restos aminoacídicos pertinentes de
homólogos del FIH son los restos aminoacídicos equivalentes
basándose, por ejemplo, en el mejor alineamiento de homólogo con el
FIH.
Un FIH puede aislarse por cualquier medio
adecuado para el uso en estudios de cristalización. Por ejemplo, un
FIH puede purificarse usando medios bioquímicos a partir de una
fuente adecuada. Típicamente, sin embargo, será conveniente
sobreexpresar el FIH en células y purificar el FIH a partir de esas
células. Por lo tanto, puede usarse un polinucleótido que codifique
un FIH en la construcción de un vector. El FIH puede cristalizarse
de acuerdo con cualquier método conocido por los expertos en la
materia. La difracción de rayos X puede realizarse de acuerdo con
cualquier método adecuado. Los datos recogidos a partir de los
experimentos de difracción de rayos X pueden procesarse para
deducir las coordenadas estructurales del FIH usando cualquier
método adecuado.
La invención proporciona el uso de coordenadas
estructurales para identificar, caracterizar, diseñar o explorar
una entidad química. La entidad química puede ser una que se una a
FIH o que actúe como inhibidor de la actividad asparaginil
hidroxilasa. Como alternativa, la entidad química puede ser un FIH
modificado para alterar la actividad de un FIH.
Una entidad química que se une a o inhibe al FIH
es cualquier entidad química capaz de formar una asociación con el
FIH. La unión o inhibición puede ser inespecífica, por ejemplo, de
modo que una entidad también pueda unirse a o inhibir otras 2OG
oxigenasas. Como alternativa, puede diseñarse o identificarse un
agente que se una a o inhiba específicamente asparaginil
hidroxilasas. Puede diseñarse o identificarse un agente que sea un
inhibidor específico del FIH, pero no de otras asparaginil
hidroxilasas.
Las coordenadas estructurales del FIH permiten a
un experto en la materia predecir qué aminoácidos son importantes
en la formación del sitio activo y qué aminoácidos son importantes
en el contacto con el sustrato. El sitio de unión a sustrato puede
mostrarse como una representación bidimensional o una representación
tridimensional producida por modelos físicos o visualizarse en una
pantalla de ordenador. Dichas representaciones pueden usarse para
diseñar, identificar o explorar entidades químicas que se unan a o
inhiban o se prevea que se unen a o inhiben al FIH. Dichas
representaciones también pueden usarse para identificar
modificaciones del FIH para alterar sus características de
actividad.
Los ejemplos de modificaciones en el FIH
incluyen modificaciones para aumentar la unión del FIH por su
sustrato o para alterar la especificidad por su sustrato. Como
alternativa, las modificaciones incluyen las que alteran la
actividad del FIH, por ejemplo, para eliminar la actividad
asparaginil hidroxilasa.
Las representaciones de las estructuras pueden
usarse de otros modos. Por ejemplo, las representaciones del sitio
activo del FIH pueden usarse para modelar restricciones por la
supuesta introducción de enlaces covalentes entre los átomos que se
aproximan cuando el FIH se une a un sustrato. La representación del
sitio activo puede usarse para predecir qué restos del FIH es
probable que estén implicados en el impedimento estérico. Dichos
restos pueden modificarse, sustituirse o delecionarse para disminuir
el impedimento estérico para aumentar la avidez del péptido por sus
sustratos.
En general, será necesario procesar las
coordenadas estructurales que pueden obtenerse de acuerdo con la
invención en métodos basados en ordenador para identificar o
diseñar entidades químicas con la estructura molecular deseada o
para identificar entidades químicas cuya estructura sea
complementaria a toda o parte de otra entidad química de interés.
Por lo tanto, pueden identificarse o diseñarse entidades químicas
que tienen una estructura similar al FIH. Pueden identificarse o
diseñarse entidades químicas que se unen al FIH. Preferiblemente,
dichas entidades químicas se unen al sitio activo del FIH y, en
general, pueden actuar como inhibidores de la actividad asparaginil
hidroxilasa.
Dichos métodos basados en ordenador se dividen
en dos amplias clases: métodos de bases de datos y métodos
diseñados de novo. En los métodos de bases de datos, la
entidad química de interés se compara con todas las entidades
químicas presentes en una base datos de estructuras químicas y con
identidades químicas cuya estructura es de algún modo similar al
compuesto de interés identificado. Las estructuras de la base datos
se basan en datos experimentales generados por RMN o cristalografía
de rayos X, o modelos de estructuras tridimensionales basadas en
datos bidimensionales. En los métodos de diseño de novo, se
generan modelos de entidades químicas, por ejemplo, como las que
podrían unirse al FIH mediante un programa informático usando
información obtenida de estructuras y/o reglas teóricas
conocidas.
De forma similar, las coordenadas estructurales
del FIH pueden usarse para explorar la actividad esperada de
entidades químicas seleccionadas, diseñadas o que se demuestre que
son modulares tales como inhibidores de otras hidroxilasas, por
ejemplo, prolil hidroxilasas. Por ejemplo, los compuestos pueden
explorarse para evaluar la probabilidad de que un inhibidor de
prolil hidroxilasa inhiba además la hidroxilasa FIH. Dichos métodos
de exploración pueden ser útiles en la identificación de agentes que
inhiban selectivamente la prolil hidroxilasa del HIF pero no la
aspariginil hidroxilasa del HIF.
Las entidades químicas diseñadas o seleccionadas
de acuerdo con los métodos de la invención pueden ensayarse y
optimizarse usando una evaluación computacional o experimental. Se
describen con más detalle a continuación métodos experimentales
para ensayar la actividad de la aspariginil hidroxilasa.
Basándose en la estructura del FIH, pueden
identificarse varios tipos diferentes de inhibidores. Estos
inhibidores se analizan con más detalle a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La unidad asimétrica cristalográfica contiene
una molécula de FIH. Sin embargo, el análisis de la simetría
cristalográfica puso de manifiesto una forma dimérica del FIH, que
concuerda con el análisis de electroforesis en gel nativo. La
interfaz dimérica implica a las dos hélices
C-terminales de cada molécula en una disposición de
inmovilización que implica predominantemente interacciones
hidrófobas. Esta interfaz poco habitual entierra un área
superficial de 3210 \ring{A}^{2}, grande de media por
comparación con otras proteínas diméricas de este tamaño. Los
inhibidores de la dimerización incluyen los que se unen a restos que
forman la interfaz de dimerización, incluyendo restos seleccionados
de entre 330-346, tales como Leu-340
e Ile-344. Los inhibidores incluyen péptidos o
peptidomiméticos que se corresponden con todos o parte de los restos
de FIH implicados en la interfaz de dimerización.
Por ejemplo, dichos inhibidores pueden
comprender un fragmento de FIH, por ejemplo, incluyendo los restos
de 340 a 344, preferiblemente incluyendo los restos de 330 a 346.
Dicho fragmento puede tener típicamente 6 ó 10 aminoácidos de
longitud, preferiblemente, hasta 15 ó 20 aminoácidos de longitud.
Como alternativa, pueden usarse homólogos peptídicos, por ejemplo,
que comprenden un homólogo con los restos de 340 a 344 o de 330 a
336, incluyendo 1, 2 o más sustituciones. Los agentes adicionales
incluyen péptidos o peptidomiméticos que pueden diseñarse basándose
en la estructura cristalina para que interfieran con la
dimerización.
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo estructural define la presencia de
Fe(II) en el sitio activo del FIH y, por consiguiente, de
hidroxilasas de HIF relacionadas. El hierro se une de una forma
casi octaédrica por las cadenas laterales de His199, Asp201 e
His279, los grupos 2-oxo y
1-carboxilato de 2OG. En los complejos de
enzima-sustrato existe una posición vacía enfrente
de la His279, que pone de manifiesto que la enzima está preparada
para la unión de dioxígeno. El alojamiento de un ligando enfrente
de la His279 puede requerir la ruptura del enlace de hidrógeno entre
el Asp201 y la Asn803 de CAD (el hierro y el carbono \beta de la
Asn803 están a una distancia de sólo \sim4,9 \ring{A}). La
posterior descarboxilación de 2OG produce presumiblemente una
especie de hierro-oxo [Fe^{(IV)}=O <->
Fe^{(III)}-O] que efectúa la oxidación en el
carbono de la Asn-803 en el dominio de
transactivación C-terminal (CAD) del HIF.
Los compuestos que contienen grupos funcionales
que se unen a hierro son útiles como inhibidores del FIH. Los
ejemplos de dichos compuestos incluyen tioles, alcoholes, fenoles
incluyendo flavonoides tales como quercitina y derivados de la
misma, carbohidratos, hidroxamatos, imidazoles y otros heterociclos,
por ejemplo, heterociclos que contienen nitrógeno.
El Zn^{(II)} se une al FIH de una forma
idéntica al Fe^{(II)} (estructura 3), que concuerda con que el
efecto hipóxico mediado por metales se deba al desplazamiento de
Fe^{(II)} del sitio activo de las hidroxilasas de HIF. Puesto que
ni el Zn(II) ni otros inhibidores metálicos del FIH pueden
sustituir al Fe(II) como cofactor en la catálisis, los
compuestos que preferentemente promueven la unión de un metal
distinto de hierro [tal como Zn(II)] en el sitio activo del
FIH actúan como inhibidores.
Una clase adicional de inhibidores son
inhibidores no metálicos que funcionan por competición con el
Fe(II) por la unión en el sitio activo. Dichos inhibidores
pueden unirse a cualquiera o a todos de la tríada de restos
(His-199, Asp-201,
His-279), que se unen al Fe(II) en el sitio
activo del FIH catalíticamente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las estructuras de FIH:CAD con NOG ponen de
manifiesto que, como el 2OG, está ligado a hierro de una forma
bidentada e implica que es un inhibidor debido a una susceptibilidad
disminuida al ataque por un intermedio (su)peróxido unido a
hierro o por obstaculización de la unión de dioxígeno al metal.
Los estudios estructurales sobre FIH ponen de
manifiesto las interacciones de unión para el 2OG y NOG (véase, por
ejemplo, la Figura 1). El 5-carboxilato del 2OG (y
el carboxilato equivalente del NOG) forma enlaces de hidrógeno con
las cadenas laterales de Lys214, Thr196 y Tyr145; dichas
interacciones no tienen precedentes en otras estructuras de 2OG
oxigenasas. El FIH es además poco común por que la Lys214 está en la
cuarta cadena \beta DSBH (hélice beta bicatenaria), mientras que
los restos de unión a
2OG-5-carboxilato básicos
previamente asignados están al comienzo de la octava cadena
DSBH.
Los estudios estructurales ponen de manifiesto
los restos del FIH que forman el bolsillo en el que se unen el 2OG
y el NOG. Además de los mencionados anteriormente, estos incluyen
las cadenas laterales de Ile-281,
Leu-186, Leu-188,
Phe-207, Thr-196. El conocimiento de
estas interacciones permite el diseño de inhibidores mejorados
(según se miden por los parámetros de unión) y selectivos. Por lo
tanto, por ejemplo, un inhibidor que se une en el bolsillo de unión
de 2OG puede formar interacciones hidrófobas con cualquiera de o
todas las cadenas laterales de Ile-281,
Leu-186, Leu-188,
Phe-207, Thr-196. Además, puede
formar interacciones electrostáticas o de formación de enlaces
hidrógeno con los restos implicados en la unión del
5-carboxilato del 2OG (Lys214,
Thr-196 y Tyr145).
La inhibición selectiva del FIH por inhibidores
que interaccionan con los restos de unión a 2OG se ejemplifica de
la forma siguiente: los análisis cinéticos de una serie de
inhibidores basados en N-oxaloil aminoácidos puso de
manifiesto que el enantiómero R (CI_{50} 0,4 mM) de la
N-oxaloilalanina era significativamente más potente que el
enantiómero S (CI_{50} 2,5 mM). El análisis del bolsillo de
unión a 2OG en el FIH pone de manifiesto que la unión del
enantiómero S está obstaculizada por las interacciones entre su
grupo metilo y la cadena lateral de Thr-196 e
Ile-281 en el bolsillo de unión a 2OG. Se observó
una selectividad inversa (es decir, el enantiómero S era más
potente) tanto para la procolágeno
prolil-hidroxilasa como para las isozimas PHD,
demostrando que debería ser posible desarrollar inhibidores
selectivos para tipos individuales de hidroxilasa de HIF. Dichos
inhibidores pueden o no quelar un metal de sitio activo.
\newpage
Los compuestos incluyen los de la fórmula
general
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada uno de R' y R'', que
pueden ser iguales o distintos, es H, F o alquilo C_{1} a C_{3}
o alquilo sustituido, CH_{2}OH, CH_{2}CO_{2}H o CONH_{2}, X
es COOH, SOOH o CONHH o un éster del mismo, o un grupo
heterocíclico u otro grupo que forme una interacción favorable con
una o más de las cadenas laterales de Lys-214,
Thr-196 y Tyr-145, es decir, los
restos implicados en la unión del 5-carboxilato del
2OG como se puso de manifiesto en los análisis
cristalográficos,
Y es -(CR'''R''')_{n}Z, donde Z es
-NR'''COCOOH, -NR'''CSCOOH, -NR'''COCOSH,
-CHSR'''CONR'''R'''', -CHOR'''CONR'''OR''',
-CHSR'''CONR'''OR''' o
-CHOR'''CONR'''NR'''OR''', donde cada R''', que
puede ser igual o distinto, es H, alquilo, OH u
O-alquilo, n es 0 a 3 y preferiblemente 0, o
\vskip1.000000\baselineskip
donde R'''' es OH, OR''' o NHCOR'''
y W es S, NH u
O.
Por lo tanto, X es un grupo que forma
interacciones favorables con una o más de las cadenas laterales o
interacciona con una o más de las cadenas laterales de
Lys-214, Thr-196 y
Tyr-145, es decir, los restos implicados en la
unión del 5-carboxilato del 2OG. X puede
funcionalizarse como un profármaco de modo que se suministre en el
sitio de acción deseado o tenga propiedades farmacocinéticas
deseables. Como se ha indicado anteriormente, X puede ser un éster
tal como un éster metílico o etílico o derivado amida de versiones
de ácido carboxílico de X.
Si n es 0, Y es típicamente CONHOH,
CONHNH_{2}, NR'''COCOOH, NR'''CSCOOH o NR'''COCOSH. Y es
preferiblemente de un tamaño tal que puede quelar el metal del
sitio activo y mantener al mismo tiempo todas o algunas de las
interacciones de unión favorables que se encuentran en el bolsillo
de unión a 2OG, como se define por análisis cristalográficos. Como
con X, Y puede funcionalizarse como un profármaco.
Cuando Y contiene un anillo aromático como se ha
indicado anteriormente puede comprender otros sistemas de anillo
incluyendo anillos de arilo o arilo funcionalizado, así como anillos
heterocíclicos y heterocíclicos funcionalizados. Los anillos
anteriores pueden funcionalizarse adicionalmente para optimizar la
unión en el sitio activo del FIH.
Inesperadamente, las estructuras de complejos ES
pusieron de manifiesto dos sitios de unión separados que implicaban
al CAD_{795-806} (es decir, los restos
795-806 del dominio de transactivación
C-terminal del HIF) (Sitio 1) y al
CAD_{813-822} del HIF (Sitio 2) con áreas
superficiales de contacto de 1640 \ring{A}^{2} y 1080
\ring{A}^{2}, respectivamente (véanse, por ejemplo, las
figuras). Los restos de CAD en estas regiones están conservados en
todas las secuencias de HIF-1\alpha y
HIF-2\alpha conocidas. La densidad de electrones
para el sitio 1 era de buena calidad, estando sólo la cadena lateral
de Tyr798 poco definida, mientras que para el sitio 2 era de un
nivel y calidad inferiores, reflejando probablemente una unión más
débil en este sitio. El CAD_{804-806} y,
presumiblemente también el CAD_{807-811}, para el
que no se observó densidad, no forman interacciones directas con el
FIH. El análisis cinético empleado para investigar la importancia
relativa de los Sitios 1 y 2 puso de manifiesto que los fragmentos
que contienen sólo Sitio 1 se hidroxilan por FIH pero menos
eficazmente que los que contienen ambos sitios, demostrando que
ambos son importantes en la unión y que ambos pueden aprovecharse en
estudios de inhibición.
En el Sitio 1 los restos del
CAD_{795-803} están unidos en una hendidura y
adoptan una conformación en gran parte extendida unida al FIH por
diez enlaces de hidrógeno. La Asn803 de CAD está sorprendentemente
enterrada en el sitio activo y directamente adyacente al
Fe^{(II)}. La Asn803 y la Ala804 del CAD forman un giro estrecho,
estabilizado por un enlace de hidrógeno entre el carbonilo de la
cadena principal de la Val802 y la NH de la Ala804 que proyecta la
cadena lateral de la Asn803 hacia el Fe^{(II)}. La cadena lateral
de la Asn803 del CAD está orientada con precisión por tres enlaces
de hidrógeno para permitir la hidroxilación en la posición
pro-S del carbono \beta de acuerdo con las
asignaciones de RMN (véase anteriormente). La amida primaria de la
Asn803 del CAD está intercalada entre el resto Tyr102 del FIH y el
Fe^{(II)} y forma enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales
de los restos Gln239 y Arg238 del FIH, restos localizados en el
inserto en el motivo DSBH. Significativamente, los sitios de unión
a sustrato y Fe^{(II)} se unen directamente puesto que el
nitrógeno de la cadena principal de la Asn803 del CAD también forma
un enlace de hidrógeno (\sim3 \ring{A}) con el oxígeno del
carboxilato del Asp201 que no está formando un complejo con el
hierro. Seis enlaces de hidrógeno adicionales estabilizan la unión
del FIH al CAD_{795-801}.
Al contrario que el Sitio 1, el Sitio 2 se
localiza en la superficie del FIH e implica sólo dos enlaces de
hidrógeno. El CAD_{816-823} del Sitio 2 forma una
hélice \alpha que concuerda exactamente con la estructura de esta
región en complejo con CBP/p300 (Dames et al., (2002)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,
5271-5276; Freedman et al, (2002) Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 5367-5372).
Como en ese complejo, las Leu818, Leu819 y Leu822 altamente
conservadas están situadas en un bolsillo hidrófobo en la superficie
del FIH y constituyen la base de la interacción de unión y de este
modo no es posible que estos restos se unan simultáneamente a
CBP/p300 y FIH.
La conformación de bucle extendido adoptada por
los restos del CAD en el Sitio 1 contrasta con la conformación
\alpha-helicoidal adoptada por los mismos restos
cuando forman complejo con el 1^{er} dominio adaptador de la
transcripción de unión a cinc (TAZ1) de CBP/p300 (Dames et
al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,
5271-5276; Freedman et al, (2002) Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 5367-5372).
La estructura desordenada observada para el CAD y otros restos del
HIF-\alpha cuando están libres en solución puede
reflejar por tanto la necesidad de adoptar más de una conformación
para la formación de complejos con diferentes proteínas.
Los cambios en la conformación del CAD en la
unión se complementan por cambios en el FIH que ponen de manifiesto
un proceso de unión por ajuste inducido; el Trp296 del FIH
experimenta una rotación de 50º alrededor del
C_{beta}-C_{alfa} para alojar la Val802 del
CAD, mientras que tanto la Tyr102 como la Tyr103 se ordenan más.
Pruebas adicionales del ajuste inducido vienen de las diferencias
significativas en la resolución entre las estructuras obtenidas con
y sin fragmentos de CAD unidos, reflejando el ordenamiento del FIH
que se produce en la unión (la estructura 4, para una comparación,
representa el FIH formando complejo con Fe^{(II)} y 2OG en
solitario). La interferencia en los cambios conformacionales
implicados en la respuesta hipóxica, en particular los que implican
la región de CAD, por ejemplo, mediante el uso de pequeñas
moléculas o mediante terapia génica o de proteínas, puede permitir
la manipulación de la respuesta hipóxica para permitir respuestas
pro- o anti-angiogénicas.
Por lo tanto, los estudios estructurales definen
(i) los restos del FIH implicados en la unión al CAD del HIF, (ii)
la conformación del FIH cuando está unido el CAD y (iii) la
conformación del CAD cuando está unido al FIH. Estos resultados son
útiles en el diseño de inhibidores selectivos de FIH y enzimas
relacionadas. Las características de los sitios de unión al FIH
pueden usarse para mediar una unión más estrecha de los inhibidores
al FIH o para obtener inhibidores que no se unan estrechamente al
FIH, es decir, evitar la inhibición del FIH.
Los inhibidores que se unen a o próximos al
Sitio 1 pueden aprovechar las interacciones electrostáticas, de
formación de enlaces de hidrógeno y/o hidrófobas con
Tyr-102, Asp-104,
Lys-106, Asp-201,
Glu-202, Gln-147,
Gln-239, los restos 299-303,
His-313, Ala-317,
Ile-318, Asn-321,
Lys-324, Arg-238,
Trp-296,
Asn-321-Lys-324.
Los inhibidores que se unen en el Sitio 1 pueden mimetizar o
mimetizar parcialmente la conformación de giro adoptada por el CAD
cuando está unido en el Sitio 1.
Los inhibidores que se unen a o próximos al
Sitio 2 pueden aprovechar las interacciones electrostáticas, de
formación de enlaces de hidrógeno y/o hidrófobas con los restos
Thr-149, Leu-150,
Asn-151, Asp-152 y los restos
Val-159, Phe-162,
Leu-163, Trp-167,
Gln-181, Leu-182,
Thr-183, Ser-184,
Asn-185. Los inhibidores que se unen en el Sitio 2
pueden mimetizar o mimetizar parcialmente la conformación helicoidal
adoptada por el CAD cuando está unido en el Sitio 2.
Se reconoce que no es necesario que los
inhibidores se unan tanto al Sitio 1 como al 2, aunque pueden
hacerlo, y que el Sitio 1 se prefiere sobre el Sitio 2.
Los restos 801-805 del CAD que
se unen en el Sitio 1, y en particular los restos
802-805 forman una conformación de giro en la que
la distancia del C=O de la cadena principal del 802 a la NH de la
cadena principal del 804 es de aproximadamente 2,8 \ring{A}.
Incluyendo el enlace de H formado entre la NH de la
Ala-804 y el O del carbonilo de la
Val-802 del CAD de HIF-1alfa, el
giro contiene 7 átomos en un pseudoanillo.
Los giros son especialmente susceptibles de
mimetismo por análogos útiles para la inhibición de enzimas o la
unión a receptor. La bibliografía de química médica está llena de
ejemplos de dichos miméticos de giros. Éstos pueden modificarse por
métodos conocidos para unirse a dianas específicas, en particular
dado el conocimiento de la estructura diana.
Pueden encontrarse ejemplos de miméticos de
giros y sus modificaciones en las siguientes revisiones: Hannessian
et al, TETRAHEDRON 53: 12789-12854 22 SEP
1997; Gillespie et al, BIOPOLYMERS 43:
191-127 1997; y Burgess et al, ACCOUNTS CHEM
RES 34: 826-835 2001). Los ejemplos recientes de
descripciones primarias de giros incluyen los siguientes (y
referencias en los mismos) Maier et al, EUR J ORG CHEM:
2686-2689, 2002; Reid et al, J AM CHEM SOC
124: 5673-5683, 2002; Mahadevan et al, J
BIOMOL STRUCT DYN 19: 775-788 2002; Eguchi et
al, J MED CHEM 45: 1395-1398 2002; De Borggraeve
et al, TETRAHEDRON LETTERS 42: 5693-5695
2001; Kohn et al, TETRAHEDRON LETT 42:
4453-4457 2001; Eguchi et al, TETRAHEDRON
LETT 42: 1237-1239 2001; Manzoni et al,
TETRAHEDRON 57: 249-255 2001; Jiang et al,
HELV CHIM ACTA 83: 3097-3112 2000; Derrer et
al, J CHEM SOC PERK T 1: 2957-2967 2000; Belvisi
et al, EUR J ORG CHEM: 2563-2569 2000;
Claridge et al, BIOORG MED CHEM LETT 6:
485-490 1996.
Estos incluyen compuestos de la fórmula
general:
en la que R^{1} es tal que puede
formar una interacción electrostática o de enlace de H con
Gln-237 y/o Arg-238,
preferiblemente CR^{8}R^{9}CONH_{2} o un análogo del mismo
donde R^{8} es hidrógeno o un péptido o peptidomimético (tal como
los compuestos por \beta-aminoácidos o isoésteres
de péptidos) y R^{9} es hidrógeno, opcionalmente alquilo
funcionalizado, opcionalmente arilo funcionalizado, heteroarilo o
cualquier combinación de los mismos tal como CH_{2}CONH_{2},
R^{2} es hidrógeno o un grupo que interaccionará de forma
favorable con la Tyr-102 del FIH, R^{3} es H o un
grupo que puede formar un enlace de H con el
Asp-201, Z^{1} es >C=O o >CR^{5}R^{9}
donde R^{5} es hidrógeno, opcionalmente alquilo, arilo o
heteroarilo funcionalizado o cualquier combinación de los mismos,
R^{12} es un como se define para R^{5} o es NHR^{6} donde
R^{6} es COR^{5} o SO_{2}R^{5} y X^{1} es NR^{4},
NR^{4}C(R^{5})_{2},
C(R^{5})_{2}NR^{4} u O o NH donde R^{4} es
COR^{5} o SO_{2}R^{5}. En ésta y en las otras fórmulas cada
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7},
R^{8}, R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} puede ser igual o
distinto. En particular, estos compuestos pueden tener una de las
fórmulas
en las que los radicales son como
se han definido anteriormente y R^{7} y R^{8} son de forma
independiente péptidos o peptidomiméticos o peptidomiméticos en
parte, tales como los que contienen o consisten en restos de
beta-aminoácidos, enlaces uretano, sulfonamida o
fosfonamida.
Otros compuestos que pueden usarse son los que
poseen la fórmula
en la que Q representa H u OH y
R^{7} y R^{8} son como se ha definido
anteriormente.
Los compuestos adicionales que pueden usarse
poseen la fórmula
en la que R^{1}, R^{2}, R^{5}
y R^{9} son como se han definido anteriormente y D es S, O, NH o
CHR^{9}=CHR^{9}. Por lo tanto, el anillo unido al anillo de seis
miembros es un anillo heterocíclico de cinco miembros o un anillo
arilo.
En estas fórmulas R^{8} y R^{9} pueden
optimizarse para unirse en el canal que une los sitios de unión a
2OG y sustrato peptídico y al propio sitio de unión a 2OG.
Los péptidos cíclicos actúan como miméticos del
giro adoptado por CAD en el Sitio 1. El ciclo puede formarse por
enlaces peptídicos, enlaces disulfuro o enlaces
C-C.
Es bien conocido que los inhibidores de enzimas
compiten por la unión en más de un sitio de unión a sustrato o
cosustrato, que a veces se denominan inhibidores bisustrato, pueden
ser útiles. Pueden encontrarse ejemplos en Wang et al,
BIOCHEMISTRY-US: 15676-15683 2001; y
Lerner et al, ANGEW CHEM INT EDIT 40,
4040-4041, 2001.
En el caso del FIH y de otras 2OG oxigenasas,
pueden ser útiles inhibidores bisustrato ya que pueden estar
presentes características de unión a 2OG en más de una enzima
mientras que el sustrato de CAD es único. Por lo tanto, los
inhibidores que se unen a ambos sitios de unión pueden mostrar una
selectividad mejorada sobre los que se unen al sitio de unión a 2OG
solamente. Los análisis estructurales permiten la identificación de
dichos inhibidores bisustrato. Los sitios de unión a 2OG y CAD están
unidos entre sí por un "canal" que se extiende desde el grupo
2-oxo del 2OG (o NOG) hasta el carbono beta de la
Asn-803 en los complejos de
FIH.Fe.2OG/NOG.HIF(CAD). En las estructuras este
"canal" aparece vacío pero puede ocuparse por moléculas de
agua. La distancia desde el C del grupo 2-oxo del
2OG hasta el C beta de la Asn-803 es de
aproximadamente 6 \ring{A}. la distancia desde el
C-3 del 2OG hasta el C beta de la Asn 803 es de
aproximadamente 6,6 \ring{A}. La información de los análisis
estructurales permite la identificación de inhibidores bisustrato,
incluyendo los siguientes:
Estos son compuestos de fórmulas (II) a (IV)
como se han definido anteriormente excepto por que están modificados
de modo que también puedan unirse en el bolsillo de unión a 2OG
como se define por la información cristalográfica. Por lo tanto,
R^{2} o R^{1} están modificados de modo que pueden unirse en el
bolsillo de unión a 2OG. La modificación adopta una forma tal que
la fórmula general de R^{1} o R^{2} es A-X,
donde X es como se ha definido anteriormente, y A une a X con (II).
A es de una longitud apropiada de modo que X pueda unir a la
fórmula 1 los restos del 5-carboxilato del 2OG, como
se ha analizado anteriormente en el encabezamiento Inhibidores que
aprovechan los sitios de unión a 2OG.
Más generalmente, los inhibidores bisustrato del
FIH pueden tener la fórmula:
en la que X es como se ha definido
anteriormente, B es un grupo enlazador y C es una entidad que se une
a parte del sitio de unión a CAD del FIH, en general,
CONH_{2}.
B es típicamente un grupo polimetileno que tiene
generalmente de 6 a 8 átomos de carbono o un grupo equivalente en el
que uno o más de los átomos de carbono se sustituyen por un
heteroátomo, particularmente O, S o N, y puede funcionalizarse, por
ejemplo, con tiol, alcohol, carboxilato, ácido hidroxámico u oxalato
para mediar la unión a Fe. Tiene preferiblemente una longitud de 6
a 8 átomos de carbono o su equivalente. Como alternativa, B es un
grupo de enlace que posee un anillo, preferiblemente de 5 a 7
miembros, al que se une C.
Otra clase de inhibidores se unen al complejo de
enzima-sustrato, es decir, a
FIH.Fe(II).HIF(CAD). Los análisis estructurales
permiten la identificación de dichos inhibidores. Como se ha
descrito anteriormente, los sitios de unión a 2OG y CAD están unidos
entre sí por un "canal" que se extiende desde el grupo
2-oxo del 2OG (o NOG) hasta el carbono beta de la
Asn-803 en los complejos
FIH.Fe.2OG/NOG.HIF(CAD).
Los inhibidores de este tipo pueden definirse
como X-[B]-[E], donde X es como se ha definido anteriormente, B es
un grupo enlazador como se ha definido anteriormente y E es una
entidad que se une a parte del CAD cuando está unido al HIF. E puede
unirse al oxígeno del carbonilo de la cadena principal de la
Asn-803 del CAD y al grupo NH_{2} de la amida
primaria de la Asn-803.
Otra clase de inhibidores se basa en análogos de
sustrato que pueden experimentar parte del ciclo catalítico pero que
se detienen en una fase intermedia o causan una reacción aberrante
que da como resultado daños o inhibición. La observación de que el
FIH cataliza la hidroxilación de la Asn-803 en la
posición beta junto con los análisis estructurales permiten el
diseño de dichos inhibidores. Dichos compuestos incluyen análogos de
los sustratos (inhibidores) en los que la Asn-803 se
sustituye con un análogo que no experimenta oxidación, tal como
derivados de beta-fluoro-asparagina,
beta-di-fluoro-asparagina,
beta-metil-asparagina,
beta-dimetil-asparagina. Como
alternativa, pueden prepararse derivados que experimenten oxidación
para dar un agente que pueda oxidarse para dar un grupo inactivante
tal como un grupo epóxido o quelante de metales (dichos inhibidores
basados en el mecanismo se denominan a veces inhibidores suicidas).
En el caso del FIH incluyen
alfa-beta-deshidroasparagina y
beta-metilenasparagina.
Estos incluyen un compuesto que tiene la
fórmula
en la que X representa un resto de
valina o un análogo del mismo e Y representa un resto alanina o un
análogo del mismo, R^{10} es flúor o alquilo
C_{1}-C_{3}, especialmente metilo y R^{11} es
flúor, alquilo C_{1}-C_{3} o hidrógeno, es
decir, el resto especificado es \beta-mono- o
di-fluoroasparagina o \beta-mono-
o
di-metilenasparagina.
Como alternativa, el compuesto anterior puede
desaturarse, es decir, es un
alfa/beta-deshidroaminoácido (R^{11} no está
presente) o R^{10} y R^{11} pueden sustituirse por un grupo
metileno, es decir, el resto es
\alpha,\beta-deshidro-asparagina
o \beta-metilenasparagina.
Si se desea, el resto valina se une a una o más
unidades del péptido DESGLPQLTSYDCE- en el orden dado, por ejemplo,
a ácido glutámico E en solitario o a, por ejemplo, ácido aspártico
(D)-cisteína (C)-ácido glutámico (E)-, o una cadena
más larga tal como PQLTSYDCE-.
Para los compuestos de esta invención los
anillos arilo adecuados incluyen fenilo y naftalenilo, que pueden
funcionalizarse adicionalmente o fusionarse con otros sistemas de
anillo. Los anillos heterocíclicos adecuados incluyen sistemas de
anillo de tiofeno, piridina, quinolina, isoquinolina, pirimidina,
pirazina, pirona, cromona, cumarina, indol, isoindol, indolizina,
benzofurano, piridazina, purina, oxazol, pirazol, isotiazol,
pirrolidina, piperidina, indolina, benzotiafeno, morfolina,
benzimidazol, azepina, azacina, azoína, oxepina, oxocina, oxoína,
piperazina, oxazina, tiazina, tiepina, tiocina, tioína, furano,
imidazol, azol, diazol, triazol y tetrazol que pueden
funcionalizarse o fusionarse con otros sistemas de anillo.
Dichos grupos y cadenas alquilo y arilo están
típicamente funcionalizados por alcohol, flúor, tiol, un ácido
carboxílico, ácido fosfónico o fosfónico, ácido sulfónico u otro
grupo quelante, en el caso de las cadenas típicamente por un grupo
alquilo. En las fórmulas descritas en la presente memoria, una
cadena de alquilo C_{1} a C_{6} lineal o ramificada puede ser
un grupo metilo, etilo, propilo, butilo, iso-butilo,
terc-butilo, pentilo, neopentilo, terc-pentilo o un
grupo hexilo primario, secundario o terciario. Preferiblemente, los
grupos alquilo son metilo, los anillos heterocíclicos preferidos son
pirrolidina y tetrahidropirano y los anillos aromáticos preferidos
son benceno, naftaleno y piridina.
Los compuestos que son ácidos pueden estar
presentes en forma de sales, tales como sales de sodio.
La estructura cristalina del FIH también permite
la identificación de los restos implicados en la actividad
asparaginil hidroxilasa del FIH. Las estructuras cristalinas puede
usarse por lo tanto para diseñar un FIH modificado, por ejemplo,
que tenga una actividad asparaginil hidroxilasa reducida o ninguna
actividad asparaginil hidroxilasa, por ejemplo, por mutación de un
resto crítico dentro del sitio activo. En la alternativa, los
restos implicados en la unión a sustrato pueden identificarse y
modificarse, por ejemplo, para permitir que la asparaginil
hidroxilasa acepte otros sustratos aparte del HIF. Por ejemplo, por
extensión o reducción del bolsillo de unión a asparagina. Dichas
asparaginil hidroxilasas modificadas pueden producirse entonces
usando técnicas convencionales. La actividad esperada puede
ensayarse después como se describe con más detalle a continuación,
por ejemplo, para identificar si la actividad hidroxilasa con
respecto al HIF se ha reducido o eliminado o, como alternativa,
para evaluar la actividad o la unión a asparaginilo respecto a otros
sustratos.
Los compuestos que se han identificado de
acuerdo con la presente invención pueden analizarse adicionalmente
en ensayos para controlar la actividad de la enzima asparagina
hidroxilasa directamente. Los agentes que inhiben o reducen la
actividad asparagina hidroxilasa de HIF reducen la hidroxilación de
HIF-\alpha y conducen a un aumento en la
interacción con P300 y, en particular, el dominio CH1 y por lo tanto
la activación de la transcripción. Esto a su vez conducirá a la
activación de las defensas locales sistémicas frente a la hipoxia o
isquemia que pueden incluir promover la angiogénesis, la
eritropoyesis, el metabolismo energético, la inflamación, la
función vasomotora y también afectarán a los respuestas
apoptópicas/proliferativas.
Se describen a continuación con más detalle
varios ensayos diferentes que pueden realizarse para ensayar la
actividad de moduladores de la actividad hidroxilasa de HIF o de una
FIH identificada de acuerdo con la presente invención y, en
particular, de la actividad asparagina hidroxilasa, o que afecten a
la regulación de la interacción de HIF-\alpha con
p300 en una célula y que afecten por tanto a la actividad mediada
por HIF. Algunos de estos ensayos utilizan polipéptidos de HIF y
asparagina hidroxilasas de HIF. Típicamente, los ensayos pueden
utilizar una asparagina hidroxilasa de HIF humana tal como FIH o un
fragmento variante de una asparagina hidroxilasa de HIF humana.
Estos componentes se describen con más detalle a continuación. Cada
uno de estos componentes, cuando sea necesario, pueden
proporcionarse en forma purificada o no purificada, por ejemplo,
como extractos celulares o por purificación del componente
pertinente a partir de dichos extractos. Como alternativa, el
componente pertinente puede expresarse usando técnicas de expresión
recombinante y purificarse para el uso en el ensayo. Como
alternativa, los componentes pueden expresarse de forma recombinante
en una célula para el uso en ensayos basados en células.
Típicamente, un polinucleótido que codifica el
componente pertinente se proporciona dentro de un vector de
expresión. Dichos vectores de expresión se construyen de forma
rutinaria en la técnica y pueden implicar, por ejemplo, el uso de
ADN plasmídico y de iniciadores, promotores, potenciadores y otros
elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de
poliadenilación que pueden ser necesarias y que se sitúan en la
orientación correcta para permitir la expresión de la proteína
completa. Serán muy fácilmente evidentes para los expertos en la
materia vectores adecuados tales como los descritos con más detalle
en la presente memoria con respecto a las hidroxilasas de HIF. Las
secuencias promotoras pueden ser promotores inducibles o
constitutivos dependiendo del formato de ensayo seleccionado. El
promotor puede ser específico de tejido. Se describen con más
detalle en la presente memoria ejemplos de promotores y otras
secuencias flanqueantes para el uso en los vectores de expresión
con respecto a las hidroxilasas de HIF de la invención y, en
particular, a las hidroxilasas de HIF humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos pueden usar un sustrato de una
asparagina hidroxilasa de HIF y en particular un sustrato que
contiene asparagina de la enzima. En particular, dichos sustratos
pueden usarse en ensayos para controlar la actividad de un
modulador de la actividad asparagina hidroxilasa de HIF. El sustrato
puede ser un polipéptido de HIF o un análogo peptídico del mismo.
Típicamente, se usará como sustrato un polipéptido de HIF.
Puede usarse cualquier sustrato adecuado en el
que se hidroxile un resto asparagina por un FIH. En realizaciones
preferidas de la invención, dicho sustrato es un polipéptido de HIF
tal como una proteína de subunidad HIF-1\alpha o
HIF-2\alpha o fragmento de cualquiera de ellas o
un análogo peptídico de la subunidad o fragmento. Preferiblemente,
el péptido de HIF-\alpha lleva una respuesta
regulada por oxígeno. Preferiblemente, el péptido de
HIF-\alpha tiene un dominio CAD y es capaz de la
interacción regulada por oxígeno con p300 y de la activación de la
transcripción aguas abajo. Preferiblemente, dichos péptidos de
HIF-\alpha son capaces de interaccionar con el
dominio CH1 de p300. Preferiblemente, dichos polipéptidos de HIF,
fragmentos o análogos peptídicos incorporan un resto asparagina
equivalente a la Asn 803 definido con respecto al
HIF-1\alpha. El equivalente de asparagina a la
Asn 803 de HIF-1\alpha puede determinarse por
alineamiento de la variante, fragmento o análogo de HIF con la
secuencia del HIF-1\alpha para obtener el mejor
alineamiento de secuencia e identificar de este modo el equivalente
de asparagina a la Asn 803 de HIF-1\alpha.
Un polipéptido de HIF puede ser de origen
eucariota, en particular una proteína de subunidad
HIF-\alpha o fragmento de la misma de un ser
humano u otro mamífero. Como alternativa, el polipéptido puede ser
de origen de C. elegans. En esos ensayos que controlan la
hidroxilación de HIF-\alpha a través de su
interacción con p300, el polipéptido de HIF tiene la capacidad de
unirse a una proteína p300 de longitud completa de tipo silvestre o
a un fragmento de la misma que comprenda el dominio CH1.
Preferiblemente, dicha unión es capaz de activar la transcripción
en un entorno celular hipóxico.
Se han clonado varias proteínas de subunidad
HIF\alpha. Éstas incluyen HIF-1\alpha, cuya
secuencia está disponible como número de acceso de Genbank U22431,
HIF-2\alpha, disponible como número de acceso de
Genbank U81984 y HIF-3\alpha, disponible como
números de acceso de Genbank AC007193 y AC079154. Todas estas son
proteínas de subunidad HIF-\alpha humana y todas
pueden usarse en la invención. También pueden usarse en la
invención proteínas de subunidad HIF-\alpha de
otras especies, incluyendo HIF-1\alpha murina
(números de acceso AF003695, U59496 y X95580),
HIF-1\alpha de rata (número de acceso Y09507),
HIF-2\alpha murina (números de acceso U81983 y
D89787) y HIF-3\alpha murina (número de acceso
AF060194).
Una proteína HIF-\alpha de
interés particular es la proteína de subunidad
HIF-\alpha de C. elegans. El sistema de
C. elegans puede usarse en ensayos de la presente
invención.
Se encuentran varias características
estructurales comunes en las dos proteínas de subunidad
HIF-\alpha identificadas hasta la fecha. Algunas
de estas características se identifican en O'Rourke et al
(1999, J. Biol. Chem., 274; 2060-2071) y
pueden estar implicadas en las funciones de transactivación de las
proteínas de subunidad HIF-\alpha. Una o más de
estas características estructurales comunes son características
preferidas de los polipéptidos de HIF.
Pueden usarse variantes de las subunidades
HIF-\alpha anteriores, tales como variantes
sintéticas que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 45%
con una subunidad HIF-\alpha de origen natural
(particularmente con una subunidad HIF-\alpha
humana, tal como, por ejemplo, HIF-1\alpha),
preferiblemente, una identidad de al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
95% o 98%. Dichas variantes pueden incluir sustituciones o
modificaciones como se han descrito anteriormente con respecto a
hidroxilasas de HIF. La actividad de aminoácidos también puede
calcularse como se ha descrito anteriormente con respecto a
hidroxilasas de HIF.
Los fragmentos de HIF también pueden incluir
funcionalidades no peptidilo y pueden optimizarse con fines de
ensayo de modo que se disminuya el nivel de identidad. Dichas
funcionalidades pueden unirse covalentemente tal como azúcares o
unirse no covalentemente tal como iones metálicos.
Los polipéptidos de HIF\alpha como se
describen en la presente memoria pueden ser fragmentos de la
proteína de subunidad HIF-\alpha o variantes como
se han descrito anteriormente, con tal de que dichos fragmentos
conserven la capacidad de interaccionar con un dominio CH1 de p300
de tipo silvestre. Cuando se usan restos aminoacídicos
proteinogénicos, dichos fragmentos tienen de forma deseable un
tamaño de al menos 20, preferiblemente al menos 40, 50, 75, 100,
250 ó 400 aminoácidos. De forma deseable, dichos fragmentos incluyen
asparagina 803.
Los ensayos basados en células de la presente
invención pueden implicar la regulación positiva de un
HIF-\alpha endógeno o la expresión de un
HIF-\alpha por técnicas recombinantes y, en
particular, de HIF-1\alpha.
La presente invención proporciona un método de
ensayo para un agente identificado como un modulador de la
hidroxilación de asparagina del factor inducible por hipoxia. El
método comprende poner en contacto una asparagina hidroxilasa de
HIF y una sustancia de ensayo en presencia de un sustrato de la
hidroxilasa en condiciones en la que se produzca la hidroxilación
de asparagina en ausencia del sustrato de ensayo y determinar la
hidroxilación de asparagina del sustrato. En un ensayo alternativo,
la asparagina hidroxilasa de HIF y la sustancia de ensayo se ponen
en contacto en presencia del sustrato de la hidroxilasa en
condiciones en la que no se produzca la hidroxilación en ausencia
del sustrato de ensayo. La determinación de cualquier hidroxilación
de asparagina se controla para identificar si el agente actúa
activamente como promotor de asparagina hidroxilasa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se ha descubierto que el FIH hidroxila el
HIF-\alpha en un resto asparagina dentro del
dominio CAD. Esta hidroxilación media la unión de p300 y, en
particular, reduce la unión de p300. Dicha unión conduce a la
activación de la transcripción. Esta interacción y activación
también pueden usarse como base para un ensayo de la invención.
Dichos ensayos pueden usarse para ensayar la
actividad de inhibidores de la actividad asparagina hidroxilasa de
HIF y, por lo tanto, se realizan preferiblemente en condiciones en
las que tendría lugar la hidroxilación de asparagina en ausencia de
la sustancia de ensayo. Los ensayos también pueden usarse para
ensayar la actividad de inhibidores que sean específicos para
asparagina hidroxilasas de HIF y que no tengan actividad o que sean
menos activos con otras hidroxilasas, por ejemplo, tales como prolil
hidroxilasas de HIF u otras asparagina/ácido aspartámico
hidroxilasas. Los ensayos también pueden usarse para ensayar la
actividad de moduladores de hidroxilasa, tales como inhibidores de
la prolil hidroxilasa de HIF que no se espera que tengan actividad
sobre el FIH basándose en estudios de modelado estructural y, por
lo tanto, pueden usarse para identificar inhibidores que sean
específicos para la prolil hidroxilasa.
El formato exacto de cualquiera de los métodos
de exploración o ensayo puede variarse por los expertos en la
materia usando la experiencia y conocimientos de rutina. El experto
en la materia es bien consciente de la necesidad de emplear además
experimentos controlados apropiados. Los ensayos pueden implicar
controlar la hidroxilación de asparagina de un sustrato adecuado,
controlar la utilización de sustratos y cosustratos, controlar la
producción de los productos esperados entre la enzima y su sustrato.
Los métodos de ensayo también pueden implicar la exploración de la
interacción directa entre componentes en el sistema. Como
alternativa, pueden realizarse ensayos que controlen los efectos
aguas abajo tales como la unión de HIF por p300 y efectos aguas
abajo mediados por HIF, tales como la transcripción mediada por HIF
usando construcciones indicadoras adecuadas o por control de la
regulación positiva de los genes o alteraciones en las patrones de
expresión de genes que se sabe que están regulados directamente o
indirectamente por HIF.
Se conocen en la técnica y se describen y
ejemplifican en la presente memoria diversos métodos para determinar
la hidroxilación. Puede usarse cualquier método adecuado para
determinar la actividad de la hidroxilasa de HIF tal como por
utilización de sustrato o cosustrato, aparición de producto tal como
hidroxilación de péptido o efectos aguas abajo mediados por
productos hidroxilados o no hidroxilados.
Pueden realizarse ensayos para controlar
directamente la hidroxilación del resto asparagina pertinente u otra
posición. Como alternativa, pueden realizarse ensayos para
controlar la reducción de cofactores o cosustratos. Como
alternativa, dichos ensayos pueden controlar los efectos aguas abajo
de la hidroxilación de HIF o de hecho la inhibición de la
hidroxilación de HIF, por ejemplo, por control de la interacción
entre el HIF y p300 o la transcripción mediada por HIF. Como
alternativa, pueden usarse construcciones de gen indicador dirigidas
por promotores regulados por HIF. También se proporcionan ensayos
para la identificación de potenciadores de la actividad de la
asparagina hidroxilasa de HIF. Dichos potenciadores pueden usarse
para reducir la actividad de HIF\alpha.
En una realización, se proporciona un sustrato
adecuado de la asparagina hidroxilasa de HIF. Éste puede ser
HIF-\alpha o un fragmento del mismo, que incluye
un dominio CAD o que incluye un resto equivalente a la Asn 803 de
HIF-1\alpha. El sustrato puede no hidroxilarse
inicialmente en la posición Asn 803. Esto puede conseguirse
proporcionando sustratos polipeptídicos sintéticos o por producción
de polipéptidos de HIF-\alpha en células
bacterianas, células de insecto o células de mamífero o en sistemas
de transcripción y traducción in vitro. Como alternativa,
pueden realizarse ensayos sobre un intervalo de tiempo seleccionado
de modo que el sustrato se produzca durante el transcurso del
ensayo, inicialmente en forma no hidroxilada.
El sustrato, enzima y compuesto inhibidor
potencial pueden incubarse juntos en condiciones que, en ausencia
de inhibidor, proporcionen la hidroxilación de la Asn 803 y el
efecto del inhibidor puede determinarse por determinación de la
hidroxilación del sustrato. Esto puede conseguirse por cualquier
medio adecuado. Pueden recuperarse sustratos polipeptídicos
pequeños y someterse a análisis físico tal como espectrometría de
masas o cromatografía, o a análisis funcional, tal como la
capacidad para unirse a p300 (o desplazar una molécula indicadora
de p300). Dichos métodos se conocen como tales en la técnica y
pueden realizarse usando la experiencia y conocimientos de rutina.
La determinación puede ser cuantitativa o cualitativa. En ambos
casos, pero particularmente en el último, la determinación
cualitativa
puede realizarse en comparación con un control adecuado, por ejemplo, un sustrato incubado sin el inhibidor potencial.
puede realizarse en comparación con un control adecuado, por ejemplo, un sustrato incubado sin el inhibidor potencial.
Los compuestos inhibidores que se identifican de
esta forma pueden recuperarse y formularse como composiciones
farmacéuticas.
Los ensayos de acuerdo con la presente invención
pueden implicar el control de la interacción entre p300 y HIF. La
interacción entre HIF y p300 está mediada por la hidroxilación de
HIF. Podría controlarse la transcripción y expresión de genes que
se sabe que se regulan positivamente o que se regulan negativamente
por la presencia de HIF. En particular, la regulación positiva de
los genes regulados por HIF demostraría la inhibición de la
hidroxilación de asparagina mientras que la regulación negativa
sugeriría una potenciación o promoción de la hidroxilación de
asparagina.
En realizaciones alternativas, pueden
proporcionarse construcciones indicadoras en las que se proporcionan
promotores mediados por HIF unidos operativamente a un gen
indicador. Podría usarse cualquier gen indicador adecuado, tal como
por ejemplo enzimas que puedan usarse después en ensayos
colorimétricos, fluorométricos, de resonancia de fluorescencia o
espectrométricos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La asparagina hidroxilasa de HIF es una
oxigenasa dependiente de 2OG. En los métodos de ensayo descritos en
la presente memoria, típicamente la asparagina hidroxilasa de HIF y
el sustrato de la hidroxilasa se ponen en contacto en presencia de
un cosustrato, tal como 2-oxoglutarato (2OG). La
actividad hidroxilasa de la hidroxilasa de HIF puede determinarse
por determinación de la renovación del cosustrato. Esto puede
conseguirse determinando la presencia y/o la cantidad de productos
de reacción, tales como sustrato hidroxilado o ácido succínico. La
cantidad de producto puede determinarse respecto a la cantidad
sustrato. Típicamente, en dichas realizaciones el sustrato puede
ser un polipéptido de HIF-\alpha y, por ejemplo,
el producto medido puede ser un polipéptido de
HIF-\alpha hidroxilado.
Como alternativa, la determinación de punto
final puede basarse en la conversión de HIF\alpha o fragmentos
peptídicos (incluyendo péptidos sintéticos y recombinantes)
derivados de HIF\alpha en productos detectables. Los péptidos
pueden modificarse para facilitar los ensayos de modo que puedan
realizarse rápidamente y puedan ser adecuados para una exploración
de alto rendimiento.
Por ejemplo, puede usarse HPLC de fase inversa
(columna de C-18 octadecilsilano) para separar los
sustratos peptídicos sintéticos de partida para hidroxilasa de HIF
de los productos hidroxilados de asparagina, ya que los últimos
tienen un menor tiempo de retención en la columna. Las
modificaciones de este ensayos o ensayos alternativos para
actividad hidroxilasa de HIF pueden emplear, por ejemplo, técnicas
espectrométricas de masas, espectroscópicas y/o de fluorescencia
como se conocen bien en la técnica (Masimirembwa C. et al
Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening (2001) 4
(3) 245-263, Owicki J. (2002) J. Biomol. Screen. 5
(5) 297-305, Gershkovich A et al (1996) J.
Biochem. Biophys. Meths. 33 (3) 135-162, Kraaft G.
et al (1994) Meths. Enzymol. 241 70-86). Las
técnicas fluorescentes pueden emplear versiones del sustrato
modificado de una forma tal para realizar u optimizar ensayos
espectroscópicos o de fluorescencia.
Por ejemplo, el polipéptido de HIF\alpha puede
inmovilizarse, por ejemplo, sobre una perla o placa, y la
hidroxilación del resto apropiado detectarse usando un anticuerpo u
otra molécula de unión que se una al dominio de unión de CAD de
HIF\alpha con una afinidad diferente cuando la asparagina 803 está
hidroxilada de cuando el resto no está hidroxilado. Dichos
anticuerpos pueden obtenerse por medio de técnicas convencionales
que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, usando un péptido
de HIF\alpha hidroxilado.
La unión de una molécula que discrimine entre la
forma hidroxilada y no hidroxilada de un polipéptido de HIF\alpha
puede evaluarse usando cualquier técnica disponible para los
expertos en la materia que puede implicar la determinación de la
presencia de un marcador adecuado.
Los métodos de ensayo también pueden adoptar la
forma de un ensayo in vivo. El ensayo in vivo puede
realizarse en una línea celular tal como una cepa de levadura en la
que se expresen los polipéptidos o péptidos pertinentes a partir de
uno o más vectores introducidos en la célula.
Los ensayos pueden realizarse usando ensayos
basados en células, basados en órganos o en animales completos
realizados in vivo. Dichos ensayos pueden utilizar la
expresión endógena de los nucleótidos y/o polipéptidos de una
hidroxilasa de HIF. En otras formas de la invención, la regulación
positiva de hidroxilasas de HIF endógenas específicas puede
conseguirse mediante estimuladores de la expresión de las mismas.
Dichos estimuladores pueden ser factores de crecimiento o
compuestos químicos que regulen positivamente asparagina
hidroxilasas de HIF específicas. En otra forma del ensayo, pueden
introducirse construcciones de nucleótidos en células o animales
transgénicos para aumentar la producción de una o más asparagina
hidroxilasas de HIF específicas.
El HIF formando un complejo con p300 activa
elementos de respuesta a la hipoxia que se encuentran en los
promotores y/o potenciadores de genes endógenos que están regulados
por dichos complejos de HIF. Dichos elementos de respuesta a la
hipoxia también pueden aislarse y unirse operativamente a genes
indicadores para ensayar la actividad del complejo de HIF a través
de la detección y/o cuantificación del gen indicador o su producto.
Por lo tanto, en una forma adicional de la invención se ensayará la
actividad de un polipéptido de HIF-\alpha que
está regulado por una asparagina hidroxilasa de HIF por medición de
los efectos del complejo de HIF sobre la expresión de un gen
endógeno o un gen indicador que esté unido funcionalmente a un
elemento de respuesta a la hipoxia que se une a HIF. Los ejemplos
de genes endógenos que están regulados de este modo se van a
encontrar en el papel del translocador nuclear de aril
hidrocarburos (ARNT) en la inducción hipóxica de la expresión
génica véase, por ejemplo, Studies in ARNT-deficient
cells. S. M. Wood, J. M. Gleadle, C. W. Pugh, O. Hankinson, P. J.
Ratcliffe. Journal of Biological Chemistry 271 (1996)
15117-15123 y Hypoxia inducible expression of
tumor-associated carbonic anyhydrases, C. C. Wykoff,
N. J. P. Beasley, K. J. Turner, J. Pastorek, A. Sibtain. G. D.
Wilson, H. Turely, K. Talks, P. H. Maxwell, C. W. Pugh, P. J.
Ratcliffe, A. L. Harris. Cancer Research 60 (2000)
7075-7083. Los ejemplos incluyen, pero sin
limitación, la isoforma 1 del transportador de glucosa, la
fosfoglicerato quinasa 1, la isoforma 9 de la anhidrasa carbónica y
el factor de crecimiento endotelial vascular. Cada uno de dichos
genes contienen uno o más elementos de respuesta a la hipoxia que
pueden aislarse y unirse operativamente como copias individuales o
múltiples a un gen indicador para la medición de la actividad de un
polipéptido de HIF-\alpha que varía de acuerdo con
la actividad de una hidroxilasa de HIF.
La actividad de genes o productos génicos que
están regulados por un polipéptido de HIF-\alpha
de acuerdo con la actividad de una hidroxilasa de HIF afecta a la
fisiología celular, orgánica y animal. Pueden usarse ensayos que
utilizan una respuesta funcional específica que está regulada de
acuerdo con la actividad de un polipéptido de
HIF-\alpha de acuerdo con la actividad de una
hidroxilasa de HIF. Dichas respuestas incluyen la velocidad de
captación de glucosa o análogos de glucosa que no están
metabolizados, el desarrollo de vasos sanguíneos por angiogénesis y
la actividad de una enzima anhidrasa carbónica. Se reconoce que
muchas otras respuestas que funcionan a nivel celular o sistémico
están controladas por la actividad de un polipéptido de
HIF-\alpha de acuerdo con la actividad de una
hidroxilasa de HIF y pueden utilizarse como ensayos de dicha
actividad hidroxilasa de HIF en aspectos adicionales de la
invención.
Un polipéptido de HIF-\alpha
que es un sustrato para una hidroxilasa de HIF puede fusionarse con
un polipéptido adicional para provocar que la actividad de dicha
hidroxilasa de HIF regule la actividad del péptido de fusión. Por
consiguiente, una forma adicional de la invención proporciona el
ensayo de la actividad de un polipéptido de fusión. En la forma
preferida dicho polipéptido de fusión puede contener la totalidad de
parte de un polipéptido de HIF-\alpha,
particularmente incluyendo la Asn 803 o el dominio CAD. El dominio
de unión a ADN Gal4 que incluye los aminoácidos
1-143 junto con la secuencia activadora cadena
arriba (UAS) que se une a Gal es un ejemplo de dicho factor de
transcripción y elemento de respuesta a ADN afín cuyo funcionamiento
puede ensayarse por los expertos en la materia.
También puede ser ventajoso modular una
asparagina hidroxilasa de HIF selectivamente como una sola diana o
en grupos de hidroxilasas seleccionados, así como una familia
completa. Por lo tanto, los agentes que modulan la actividad
asparagina hidroxilasa de HIF son preferiblemente específicos, es
decir, tienen un efecto aumentado o potenciado sobre una asparagina
hidroxilasa de HIF respecto a otras oxigenasas dependientes de
2OG.
Por lo tanto, los métodos de ensayo que se
describen en la presente memoria pueden comprender además poner en
contacto el compuesto de ensayo con una o más oxigenasas
dependientes de 2OG en condiciones en las que dichas oxigenasas
dependientes de 2OG sean normalmente activas y determinar la
actividad de dichas oxigenasas. Una diferencia en la actividad en
la presencia respecto a la ausencia de compuesto de ensayo es
indicativa de que el compuesto de ensayo modula la actividad de las
una o más oxigenasas dependientes de 2OG.
Un compuesto de ensayo que proporciona una
modulación aumentada o potenciada de una asparagina hidroxilasa de
HIF, respecto a las una o más oxigenasas dependientes de 2OG muestra
selectividad o especificidad por la hidroxilasa de HIF.
Las oxigenasas dependientes de 2OG pueden
incluir, por ejemplo, clavaminte sintasa, Alk B
desacetoxicefalosporina C sintasa,
colágeno-prolil-4-hidroxilasa,
colágeno prolil-3-hidroxilasa, lisil
hidroxilasa, aspartil hidroxilasa, fitanoíl coenzima A hidroxilasa
o gamma-butirobetaína hidroxilasa. Las oxigenasas
dependientes de 2OG pueden ser polipéptidos de mamíferos,
preferiblemente humanos.
Un compuesto, sustancia o agente que se descubra
que tiene capacidad de afectar a la actividad hidroxilasa de una
asparagina hidroxilasa de HIF, o los compuestos a los que se hace
referencia en la presente memoria como inhibidores de FIH tienen
potencial terapéutico y de otro tipo en varios contextos. Para el
tratamiento terapéutico, dicho compuesto puede usarse en
combinación con cualquier otra sustancia activa, por ejemplo, para
terapia antitumoral otro compuesto o terapia antitumoral, tal como
radioterapia o quimioterapia.
Un agente identificado usando una o más
exploraciones primarias (por ejemplo, en un sistema sin células) que
tiene la capacidad de modular la actividad de hidroxilación de
asparagina de HIF\alpha de una hidroxilasa de HIF puede evaluarse
adicionalmente usando una o más exploraciones secundarias. Una
exploración secundaria puede implicar el ensayo de un aumento o
disminución en la cantidad de HIF-\alpha o
actividad de HIF, por ejemplo, como se manifiesta por el nivel de
un gen diana de HIF o un proceso presente en una célula en presencia
del agente respecto a la ausencia del agente.
Puede usarse una hidroxilasa de HIF o un
polipéptido de HIF en terapias que incluyen el tratamiento con
polipéptidos de longitud completa o fragmentos de los mimos o
polipéptidos modificados de otro modo, por ejemplo, para potenciar
la estabilidad o asegurar el direccionamiento, incluyéndose junto
con otros agentes activos tales como anticuerpos. Por ejemplo, la
mutación de HIF-1\alpha para sustituir la Asn 803
con otro resto aminoacídico puede impedir la hidroxilación y por lo
tanto promover la interacción de HIF-\alpha con
p300 y estimular la activación de la transcripción.
En general, un agente, compuesto o sustancia que
sea un modulador se proporciona en una forma aislada y/o
purificada, es decir, sustancialmente pura. Esto puede incluir estar
en una composición en la que represente al menos aproximadamente
90% del ingrediente activo, más preferiblemente al menos
aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente
98%. Cualquier composición de este tipo puede incluir, sin embargo,
materiales de vehículo inertes u otros excipientes farmacéuticamente
y fisiológicamente aceptables, tales como los necesarios para un
suministro, liberación y/o estabilización correcta del agente
activo. Típicamente, la concentración en dichas composiciones es de
0,1 a 50%, generalmente de 0,5 a 20%, especialmente de 1 a 10% en
peso basándose en el peso de la composición. Como se indica a
continuación, una composición puede incluir además de un compuesto
modulador como se describe, una o más moléculas distintas de uso
terapéutico, tales como un agente antitumoral.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El propósito terapéutico/profiláctico puede
estar relacionado con el tratamiento de una afección asociada con
niveles o actividad de HIF reducidos o subóptimos o aumentados, o
afecciones en las que se tienen niveles de HIF normales, pero en
las que es deseable una modulación en la actividad de HIF tal como
un aumento o disminución en la actividad de HIF, tales como:
- (i)
- afecciones isquémicas, por ejemplo, isquemia de órganos, incluyendo insuficiencia vascular coronaria, cerebrovascular y periférica. La terapia puede aplicarse de dos formas; después de un daño tisular declarado, por ejemplo, un infarto de miocardio (para limitar el daño de tejido) o profilácticamente para prevenir una isquemia, por ejemplo, promover colaterales de arterias coronarias en el tratamiento de la angina;
- (ii)
- cicatrización de heridas y regeneración de órganos;
- (iii)
- auto-, alo- y xeno-trasplante;
- (iv)
- presión arterial sistémica;
- (v)
- cáncer; comúnmente el HIF\alpha está regulado positivamente en células tumorales y tiene efectos importantes sobre el desarrollo tumoral y la angiogénesis;
- (vi)
- trastornos inflamatorios;
- (vii)
- presión sanguínea arterial pulmonar, enfermedad neurodegenerativa.
\vskip1.000000\baselineskip
La modulación de la actividad prolil hidroxilasa
de HIF en una persona, un órgano o un grupo de células puede
aprovecharse de diferentes formas para obtener un beneficio
terapéutico:
(a) Autónoma no celular: El sistema del HIF se
usa por las células para influir en la producción de sustancias que
señalizan a otras células. Después, estas señales pueden tener
efectos (i) en un sitio distante (por ejemplo, la eritropoyetina
actúa sobre la médula ósea) o (ii) localmente (los factores de
crecimiento angiogénico aumentan la formación local de vasos
sanguíneos). Por lo tanto, la manipulación del comportamiento
autónomo no celular por alteración de la actividad hidroxilasa es
útil en el tratamiento de la anemia y la isquemia local, por
ejemplo, en el ojo, cerebro, corazón y extremidades. Muchas otras
señales que están implicadas en aspectos de la homeostasis
fisiológica pueden ajustarse o se sabe que se ajustan por activación
del HIF. Por consiguiente, la alteración de la actividad prolil
hidroxilasa de HIF puede usarse para potenciar o iniciar una
respuesta útil para un beneficio terapéutico o para prevenir o
mejorar una respuesta perjudicial. Por ejemplo, esta estrategia
puede usarse para alterar el apetito o la presión arterial en los
lechos sistémico o pulmonar.
(b) Autónoma celular: El sistema del HIF también
se usa por células para regular el metabolismo celular y las
decisiones relacionadas con la diferenciación, proliferación y
apoptosis. Por lo tanto, la manipulación del sistema del HIF puede
usarse para alterar la viabilidad y el comportamiento de las
células. Puede conseguirse un aumento en la viabilidad celular por
aumento de la activación de HIF, por ejemplo, en un tejido
isquémico. Esta estrategia también puede usarse en la mejora de la
viabilidad de células beta pancreáticas como un medio de mejoría de
la diabetes o de mejora de la viabilidad o función de un grupo o
grupos de neuronas en la enfermedad de Parkinson, enfermedad de
motoneurona o formas de demencia. En una estrategia diferente, la
señal del HIF puede manipularse para impedir que prolifere un grupo
de células o para promover su muerte o diferenciación. Por ejemplo,
puede usarse la activación transitoria del sistema de HIF en un
tumor maligno para provocar la muerte de un número sustancial de
células tumorales.
La posición en la Asn803 del
HIF-1\alpha humano que se hidroxila se identificó
como se describe en lo siguiente. Se clonaron secuencias de ADNc
que codifican FIH-1 en el vector pET28a(+) (de
Novagen) para dar la proteína FIH-1 con un marcador
His_{6} N-terminal para facilitar la purificación.
La purificación de material bruto por cromatografía de afinidad de
níquel, seguida de escisión con trombina del marcado His_{6} y
cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex S75) produjo una
proteína de pureza >95% por análisis de SDS-PAGE.
La espectrometría de masas confirmó la identidad de la especie
aislada. El péptido de 19 restos que comprende los aminoácidos
788-806 del HIF-1\alpha humano se
modificó por incubación en aerobiosis con FIH-1 FIH
(Hewitson et al., J BIOL CHEM 277 (29):
26351-26355, 2002) en presencia de ascorbato, DTT,
catalasa, 2-oxoglutarato y hierro (II) durante 30
minutos a 37ºC. La reacción se interrumpió por enfriamiento a 4ºC y
adición de un volumen equivalente de metanol. Se eliminó el
precipitado por centrifugación y el sobrenadante se purificó
mediante HPLC usando una columna Jupiter C4 (15 cm x 4,6 mm). El
péptido se eluyó usando un gradiente de acetonitrilo en ácido
trifluoroacético a 0,1%, se secó por congelación a partir del
disolvente de HPLC para el análisis de aminoácidos y espectrométrico
de masas. La muestra se secó por congelación por segunda vez a
partir de D_{2}O en preparación para el análisis de RMN.
La hidroxilación catalítica mediada por
FIH-1 de un péptido sintético de 19 restos que
corresponde a los restos 788-806 del
HIF-1\alpha se confirmó mediante análisis
espectrométrico de masas de material purificado por HPLC: Péptido
nativo de 19 aminoácidos [M+2H]^{2+} = 1026,67 Da, péptido
modificado de 19 aminoácidos [M+2H]^{2+} = 1034,61 Da, una
diferencia de masa de +8 Da de los iones con carga doble que se
corresponde con +16 Da en el péptido (oxígeno). La degradación de
Edman N-terminal del péptido producto dio la
siguiente secuencia: DESGLPQLTSYDCEVxA, donde x no era asparagina.
El pico de este ciclo (16º) de la degradación de Edman corría a una
posición similar a la del patrón de
\beta-hidroxiasparagina. La hidrólisis ácida del
péptido modificado seguida de análisis de aminoácidos demostró la
presencia de ácido \beta-hidroxiaspártico
solamente.
Los cambios de desplazamiento químico tanto de
^{1}H como de ^{13}C entre el sustrato peptídico de 19
aminoácidos y el producto de incubación purificado por HPLC se
evaluaron mediante experimentos de HSQC
^{1}H-^{13}C 2D. En el sustrato se asignó que
un agrupamiento de cuatro resonancias
\beta-CH_{2} pertenecían a
Asp-1, Tyr-11,
Asp-12 y Asn-16 de acuerdo con sus
desplazamientos de ^{1}H y ^{13}C (Evans, J. N. S. (1995)
Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, Oxford,
Reino Unido). En el producto era evidente a partir de los espectros
tanto de HSQC 2D como de protones 1D que sólo estaban presentes tres
de estas cuatro resonancias. La comparación de los dos espectros
indica que la señal asignada al carbono \beta de la
Asn-16 (a \deltaH 2,813 y 2,695 ppm y \deltaC
37,40 ppm en el sustrato) había desaparecido, concordando con la
hidroxilación del resto asparagina en su carbono \beta. Las
resonancias debidas a los dos restos de ácido aspártico se habían
desplazado ligeramente, presumiblemente debido a cambios en el
estado de protonación y ahora aparecen a un desplazamiento químico
^{1}H similar al de los protones \beta de la asparagina en el
sustrato. Una diferencia en el estado de oxidación de la cisteína
entre las dos muestras es poco probable dados los desplazamientos
químicos casi idénticos para el carbono \beta e hidrógenos del
cisteinilo. El cambio de un doblete doble a un doblete simple para
el hidrógeno \beta del resto hidroxilado también descarta
cualquier posibilidad de que las alteraciones observadas en el
espectro de RMN se deban a agregación. Han aparecido dos nuevas
resonancias en el espectro de producto a \deltaH 4,913 ppm y
\deltaC 56,26 ppm y a \deltaH 4,654 ppm y \deltaC 72,22 ppm.
Estas resonancias se correlacionan entre sí en el espectro COSY 2D y
comparten una constante de acoplamiento
^{1}H-^{1}H de 2,4 Hz y por lo tanto se les
asigna el CH^{\alpha}-CH^{\beta} de la
asparagina hidroxilada. La aparición de estas resonancias también
coincide con la desaparición de las resonancias \deltaH 4,706 ppm
y \deltaC 51,43 ppm observadas en los espectros de sustrato, a la
que por tanto se le asigna el CH^{\alpha} de la asparagina
precursora antes de la modificación. La comparación de la constante
de acoplamiento CH^{\alpha}-CH^{\beta} de 2,4 Hz
observada para la Asn-803 hidroxilada con valores
de la bibliografía sugería que se producía el isómero
treo.
Resumiendo los experimentos de RMN anteriores:
Los experimentos de HSQC proporcionaron pruebas directas de que la
hidroxilación se producía en el carbono \beta de la asparagina
diana, apareciendo el carbono \beta hidroxilado
significativamente desprotegido (a 72,22 ppm) y el carbono \alpha
adyacente desprotegido en menor grado (a 56,26 ppm) respecto a su
asparagina precursora. Cambios de estas magnitudes en los
desplazamientos químicos de ^{13}C no concuerdan con la
hidroxilación del nitrógeno de la cadena lateral, pero concuerdan
con la hidroxilación del carbono \beta. Además, el espectro de
^{13}C de DL-treo-\beta-hidroxiasparagina
libre (este estudio) tiene resonancias a 58,63 ppm y 73,85 ppm que
se corresponden con carbonos \alpha y \beta. La asignación de
producto también concuerda con desplazamientos químicos de
RMN-^{1}H de los hidrógenos \alpha y \beta en
los restos \beta-hidroxiaspartilo en dominios tipo
EGF que son de 4,48 ppm y 4,36 ppm, respectivamente (con respecto
al agua a 4,75 ppm) cuando está ausente el calcio (Selander et
al, Biochemistry 29, 8111-8118). El
análisis de la constante de acoplamiento descrito en la presente
memoria sugiere que el isómero treo es el formado en la
hidroxilación de la Asn-803 por
FIH-1.
Dos informes (Darnes et al., (2002)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,
5271-5276; Freedman et al, (2002) Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 5367-5372)
ponen de manifiesto cómo la \beta-hidroxilación de
la Asn-803 de HIF-1\alpha estaría
dañando la formación de complejo con p300. Aunque la posición de
hidroxilación no se identificó en ningún informe, ambos sugieren que
la hidroxilación en la posición pro-S del
carbono \beta, es decir, para dar el isómero treo-(2S,
3S), interferiría con la formación del enlace de hidrógeno que
mantiene la conformación \alpha-helicoidal
adoptada por esta parte del HIF-1\alpha y también
generaría la necesidad de una desolvatación energéticamente
desfavorable del grupo hidroxilo. Un choque estérico entre el grupo
hidroxilo pro-S insertado y la
Ile-353 (numeración de Dames et al (2002)
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,
5271-5276) de p300 alteraría la interacción de las
dos proteínas. Presumiblemente también se usa el mismo mecanismo
para anular la interacción de HIF-1\alpha y p300.
El descubrimiento de que es la posición beta de la
Asn-803 la que está modificada y las implicaciones
mecánicas asociadas puede usarse en el diseño de compuestos que se
unan a p300 desplazando de este modo el HIF-alfa, y
en el diseño de inhibidores de FIH (véase a continuación); en ambos
casos para hacer posibles agentes farmacéuticos
pro-angiogénicos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para obtener un complejo de FIH:CAD adecuado
para el análisis de rayos X sin oxidación del CAD o del Fe^{(II)},
se cocristalizan FIH y diversos fragmentos de CAD de siete a
cincuenta y dos restos con Fe^{(II)} y 2OG en condiciones
anaerobias. También se obtuvieron estructuras para el FIH en
complejo con Fe^{(II)} y N-oxaloilglicina (NOG, un
inhibidor del FIH) (anaeróbicamente) y Zn^{(II)} y NOG
(aeróbicamente). Estas estructuras se resolvieron por reemplazo
molecular usando un modelo obtenido por dispersión anómala múltiple
en apo-FIH sustituido con selenometionina. Se
obtuvieron complejos cristalinos de FIH:CAD con
CAD_{786-826}, Fe^{(II)} y NOG o 2OG
(estructuras 1 y 2, Tabla 1), CAD_{775-826} con
Zn^{(II)} y NOG (estructura 3). Los intentos de cristalización con
CAD_{787-806}, CAD_{850-862}
(HIF-2\alpha, equivalente a
CAD_{802-814} de HIF-1\alpha) y
CAD_{800-806} no dieron como resultado complejos
de FIH:CAD; los análisis en solución indicaban que los fragmentos de
CAD más cortos de veinte restos no son sustratos eficaces in
vitro.
Se prepararon FIH,
CAD_{775-826} y CAD_{786-826}
como se describe (Hewitson et al., J BIOL CHEM 277 (29):
26351-26355, 2002). Se produjo FIH sustituido con
selenometionina (SeMet) usando un protocolo de inhibición
metabólica y medio LeMaster complementado con
L-selenometionina 50 mg/l. La incorporación de SeMet
era >95% por ESI-MS. La cristalización en
aerobiosis de SeMet FIH (a 11 mg ml^{-1}) se consiguió por
difusión de vapor por gota colgante a 17ºC. Las aguas madres
consistían en sulfato de amonio 1,2 M, PEG 400 a 4% y Hepes 0,1 M
pH 7,5. La cristalización de complejos de FIH:Fe:fragmento de CAD se
consiguió en una atmósfera anaerobia de argón en una caja de
manipulación con guantes Belle Technology (O_{2}
0,3-0,4 ppm) usando las mismas aguas madres y una
solución que contenía FIH (a 11 mg ml^{-1}), Fe^{2+} (1 mM),
2OG/NOG (2 mM) y fragmento CAD (1 mM). La cristalización de
FIH:Zn:fragmento de CAD se consiguió aeróbicamente en condiciones
similares. Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis peptídica
en fase sólida o se adquirieron en Biopeptide Co. (San Diego,
Estados Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cristales se criocongelaron sumergiéndolos
en nitrógeno líquido y se recogieron los datos de rayos X a 100 K
usando una corriente de nitrógeno. Se logró la crioprotección por
transferencia secuencial a una solución que contenía sulfato de
amonio 1,2 M, PEG 400 a 3%, Hepes 0,1 M pH 7,5 y glicerol 10%
seguido de 24%. Se recogió un conjunto de datos de dispersión
anómala múltiple (MAD) a tres longitudes de onda a una resolución de
2,9 \ring{A} en la línea de haz 14,2 de la Fuente de Radiación
Sincrotrón, Daresbury, Reino Unido. Se recogieron datos de los
cristales de complejos de FIH:CAD en las líneas de haz 14,2, 9,6 ó
9,5 usando detectores ADSC Quantum 4 (14,2 y 9,6) o MarCCD (9,5).
Todos los datos se procesaron con el programa MOSFLM y la serie CCP4
[Collaborative Computational Project Number 4 Acta
Crystallogr. D50, 760-763 (1994)]. Los
cristales pertenecían al grupo espacial P4_{1}2_{1}2. Se
localizaron seis posiciones de selenio y se calcularon las fases
usando el programa SOLVE (Terwilliger et al. D55,
849-861, 1999). Se realizó una modificación de la
densidad que aumentaba la cifra de mérito de 0,56 a 0,66 usando
RESOLVE (Terwilliger Acta Crystallogr. D56,
965-972 2000).
Se construyó un modelo inicial usando el
programa O (Jones et al, Acta Crystallogr. A47,
110-119, 1991) y se refinó frente a los datos de
SeMet (longitud de onda lejana) usando el programa CNS (Brunger
Acta Crystallogr. D54, 905-921 1998).
Un ciclo de recocido simulado seguido de refinamiento de factor
B agrupado llevó el R_{libre} a 36,2%. Después de
una reconstrucción y refinamiento adicionales que llevaron el
R_{libre} a 32,3%, el modelo se transfirió al conjunto de
datos de 2,15 \ring{A}. La reconstrucción y refinamiento usando
REFMAC5 incluyendo la adición de Fe, sustrato y moléculas de
disolvente, y el refinamiento de los parámetros de TLS llevó el
factor R convencional a 17,8% y el R_{libre} a
21,3%. Los siguientes restos están ausentes en el modelo actual:
1-15 y 304-306 del FIH,
786-794, 807-811 y
824-826 del fragmento de CAD. De acuerdo con
PROCHECK no hay valores atípicos de Ramachandran y 90,7% de los
restos tienen las conformaciones de cadena principal más
favorables. Para el péptido de CAD, 77,8% de los restos están en la
región más favorable con los restantes 22,2% en regiones
adicionalmente permitidas.
Otras estructuras se resolvieron por reemplazo
molecular usando las coordenadas de los datos de 2,15 \ring{A} y
refinamiento usando REFMAC5. En todas las estructuras la densidad de
electrones para el Fe y 2OG/NOG era visible durante todo el
refinamiento. Se observó una diferencia positiva significativa en la
densidad de electrones entre el hierro y el carbono \beta de la
Asn803 de CAD. Puesto que las diferencias de factor B entre
el FIH y el CAD implican que el CAD no tiene una ocupación de 100%,
esto puede representar un modo de unión alternativo para el
1-carboxilato 2OG en ausencia de sustrato aunque
también podría deberse a la ligación de una molécula de agua, de
nuevo en ausencia de sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
El núcleo del FIH comprende un motivo de hélice
beta bicatenaria (DSBH o "rollo de gelatina") formado por ocho
cadenas \beta, \beta8-\beta11 y
\beta14-\beta17. Los restos
220-259 forman un inserto entre las cadenas 4 y 5
de la DSBH. La cara inferior de la DSBH está flanqueada por cuatro
cadenas \beta adicionales de la región N-terminal
para formar una lámina \beta antiparalela de ocho miembros. La
cadena \beta1 N-terminal biseca la cara de la
DSBH opuesta al sitio activo. La cadena \beta1 tiene un giro de
360º localizado en una secuencia PXXP entre sus interacciones con
\beta14 y \beta2. Una cadena \beta situada de forma similar
se encuentra en la mayoría de las 2OG oxigenasas, aunque no siempre
de la misma región de la proteína. El motivo de
lámina-hélice-lámina formado por
\beta1, \alpha1 y \beta2 está conservado en todas las enzimas
de esta clase excepto la prolina 3-hidroxilasa y se
encuentra un plegamiento similar en esta región en la quercetina
2,3-dioxigenasa (QD) que utiliza Cu^{(II)}
relacionada (Fusetti et al, STRUCTURE 10 (2):
259-268 2002). La topología del FIH lo define
inequívocamente como un miembro de unión a hierro de la familia
estructural de las cupinas que ya incluye la QD y la fosfomanosa
isomerasa Tipo II que utiliza Mn^{(II)} (Clissold, P. M., y
Ponting, C. P. (2001) Trends Biochem. Sci. 26,
79).
El FIH tiene una similitud de secuencia
significativa con la región de homología JmjC de los factores de
transcripción jumonji (Clissold, P. M., y Ponting, C. P. (2001)
Trends Biochem. Sci. 26, 79; Hewitson et al., J
BIOL CHEM 277 (29): 26351-26355, 2002). Estas
proteínas son miembros de la superfamilia estructural de las cupinas
y se han implicado en el crecimiento celular y el desarrollo
cardiaco. Los restos de unión a hierro de la 2OG oxigenasa se han
identificado en algunos dominios JmjC pero no se han señalado como
motivos de unión a hierro. Las búsquedas de secuencias a la luz de
la estructura del FIH ponen de manifiesto muchas proteínas JmjC con
restos conservados que incluyen tanto este motivo como otros,
incluyendo los restos del FIH Lys214 y Thr196 que pocas veces están
implicados en la unión al 5-carboxilado de 2OG. Por
lo tanto, la estructura pone de manifiesto que el FIH es uno de una
gran familia de oxigenasas dependientes de hierro y 2OG implicadas
en la regulación de la transcripción. Puesto que algunos de los
dominios JmJC asignados distintos del FIH están asociados con
enfermedades y fenotipos particulares su inhibición (por ejemplo)
puede ser de valor terapéutico. (Véase, por ejemplo, Hu et
al, ONCOGENE 20 (47): 6946-6954 18 OCT 2001 y
Clissold, P. M., y Ponting, C. P. (2001) Trends Biochem. Sci.
26, 79 y referencias citadas en el mismo).
Tabla 2. Alineamiento de secuencia parcial del
FIH con una selección de proteínas que contienen dominio JmjC. La
estructura secundaria del FIH está indicada encima del alineamiento.
Los restos de unión a 2OG seleccionados que se encuentran en el FIH
se indican mediante triángulos oscuros debajo del alineamiento y los
dos restos de unión a hierro mediante triángulos claros. Los
números de acceso de SWALL se indican a la izquierda del
alineamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (7)
1. Un método para identificar, explorar,
caracterizar o diseñar una identidad química que se une a un factor
inhibidor de HIF (FIH), comprendiendo dicho método comparar un
modelo estructural de FIH con un modelo estructural para dicha
entidad química, procediendo dicho modelo estructural del FIH de los
factores estructurales o coordenadas estructurales que se muestran
en la Tabla 3.
2. Uso de las coordenadas estructurales del FIH
de la Tabla 3 para identificar, explorar, caracterizar, diseñar o
modificar una entidad química.
3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que dicha entidad química se une al FIH.
4. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha entidad química
se selecciona para inhibir la actividad asparaginil hidroxilasa del
FIH.
5. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha entidad química
forma interacciones hidrófobas con cualquiera o todas las cadenas
laterales de uno o más restos aminoacídicos de dicho polipéptido
seleccionado de Leu186, Leu188, Thr196, Phe207 e Ile281.
6. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha entidad química
forma interacciones electrostáticas o de formación de enlaces de
hidrógeno con uno o más restos aminoacídicos de dicho polipéptido
seleccionado de Tyr145, Thr196 y Lys214.
7. Un método o uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores que comprende además poner en
contacto dicha entidad química in vitro con el HIF o un
fragmento del mismo o un homólogo de cualquiera de los mismos que
incorpore la asparagina 803, con el FIH o un homólogo del mismo que
mantenga la actividad asparaginil hidroxilasa del FIH y controlar
la hidroxilación de la asparagina 803.
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