ES2337237T3 - Anticuerpo biespecifico anti-cancer de ovario humano-anti-cd3. - Google Patents
Anticuerpo biespecifico anti-cancer de ovario humano-anti-cd3. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo biespecífico contra el cáncer de ovario, que se construye conectando mediante ingeniería genética un anticuerpo de cadena sencilla anti-cáncer de ovario y un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano, en el que el anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano se ha injertado con CDR a través de humanización, mediante un interconector, en el que el interconector que conecta los dos anticuerpos Fv de cadena sencilla comprende la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)** en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)** en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)** en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)** y en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos: **(Ver fórmula)**
Description
Anticuerpo biespecífico
anti-cáncer de ovario
humano-anti-CD3.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
biespecífico anti-cáncer construido mediante
ingeniería genética, a las secuencias de nucleótidos que codifican
dicho anticuerpo biespecífico, a los vectores de expresión que
contienen dichas secuencias de nucleótidos y a células huéspedes que
contienen los vectores.
A diferencia de los anticuerpos naturales, dos
sitios de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico (BsAc)
portan diferentes especificidades, por tanto, es de estructura
química bivalente pero monovalente en la función de unión. Un BsAc
dirigido frente a tanto antígenos asociados a tumores como moléculas
activadoras en células efectoras puede reclutar las células
efectoras inmunológicas en sitios tumorales de manera eficaz y
activarlas para destruir células tumorales específicamente. Los
BsAc son proteínas híbridas que pueden generarse mediante
reticulación química, tecnología de hibridoma o procedimientos
genéticos. En el procedimiento de reticulación química, dos clases
de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos se disociaron
mediante agentes reductores para generar anticuerpos monovalentes y
fragmentos de los mismos. El BsAc resultante se construye mediante
reticulación química de dos anticuerpos monovalentes y fragmentos de
los mismos procedentes de anticuerpos originales diferentes. Esta
estrategia puede usarse para la producción rápida de BsAc a gran
escala, aunque los BsAc pueden inactivarse algunas veces durante la
reticulación y es difícil garantizar la homogeneidad de los
productos. Otra estrategia para la producción de BsAc es la
tecnología de hibridoma mediante la cual se fusionó una línea
celular de hibridoma establecida que secretaba un anticuerpo
monoclonal con células de bazo inmunizadas con el otro antígeno o
se fusionaron entre sí dos líneas celulares de hibridoma
establecidas que secretaban dos anticuerpos monoclonales diferentes
para crear hibridomas híbridos. El primer hibridoma resultante se
denomina hibridoma dimérico e hibridoma tetramérico. Generalmente,
el BsAc producido mediante la tecnología de hibridoma mantiene
altas bioactividades. Sin embargo, los procedimientos son tediosos y
requieren mucho tiempo y no es fácil aislar un BsAc de otros
anticuerpos inactivos y no deseados generados de manera simultánea.
Estos formatos de BsAc encontraron otros problemas predecibles: los
componentes murinos y de tamaño demasiado grande contenidos en el
BsAc son inmunogénicos en pacientes e inducirán la producción de
anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA), lo que puede
impedir volver a usar estos BsAc en la práctica clínica. Además, la
producción y la purificación de estos formatos de BsAc son caros, lo
que limita la aplicación de BsAc en la práctica clínica. La
sustitución de estos procedimientos tradicionales por enfoques de
recombinación génica ha acelerado el progreso en esta área.
Basándose en la tecnología de anticuerpos moleculares pequeños, la
producción de BsAc mediante ingeniería genética tiene ventajas con
respecto a las descritas anteriormente, tales como la estabilidad
del procedimiento, la producción a gran escala, el bajo coste y la
facilidad de uso. La ingeniería genética ha conducido al desarrollo
de diversos formatos de BsAc moleculares pequeños conectando dos
clases diferentes de scFv. Hay tres clases de formatos de BsAc
clasificados por las diferentes uniones. (1) Los
mini-anticuerpos son heterodímeros ensamblados
conectando dos fragmentos scFv entre sí con un dominio
oligomerizado (por ejemplo, motivos de cremallera de leucina
derivados de los factores de transcripción Fos o Jun). (2) Los
diacuerpos son dímeros asociados de manera no covalente que se
ensamblan mediante dos cadenas sencillas VH1-VL2 y
VH2-VL1, conectadas ambas mediante un conector corto
que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dominios
V de la misma cadena. Por tanto, cada cadena sola no puede unirse al
antígeno, sino que la expresión conjunta de las dos cadenas
(VH_{1}-VL_{2} y
VH_{2}-VL_{1}) conduce al ensamblaje de
diacuerpos heterodiméricos que pueden unirse a dos clases de
antígenos. (3) ScBsAc: se usó un interconector para conectar dos
scFv diferentes con diferentes especificidades y se expresó ScBsAc
en las células huésped como un único polipéptido. El intraconector
entre dos dominios dentro de scFv es a menudo
(Gly_{4}Ser)_{3}. Como para el interconector entre dos
scFv, hay dos estrategias para diseñarlo. Para el fin de evitar un
apareamiento falso entre regiones variables heterogéneas, el
interconector es a menudo un conector peptídico corto menor de diez
residuos de aminoácido tal como Gly4Ser. Otra estrategia es
seleccionar un conector más largo para el interconector. En el
laboratorio, un interconector con 25 aminoácidos denominado 205c',
ideado por Gruber en la construcción de un scBsAc
anti-TCR X anti-fluorescente, se
mencionó para uno de los tres interconectores. Se idearon otros dos
interconectores denominados Fc (26 residuos) y HSA, dando ambos como
resultado el plegamiento apropiado de dos scFv y la formación de un
BsAc con dos sitios de unión a antígeno con altas actividades. En
pocas palabras, lo más importante para diseñar interconectores es
garantizar el apareamiento apropiado entre dominios variables y el
plegamiento de las proteínas, dando como resultado la formación de
un BsAc que mantiene las actividades biológicas y la estabilidad.
Deben introducirse algunas propiedades novedosas para facilitar la
purificación y prolongar el tiempo de semivida plasmática.
La inmunoterapia mediada por BsAc desempeña un
papel prometedor en la bioterapia clínica para tumores. Lo
siguiente son dos características de BsAc. En primer lugar, los
efectos de destrucción de tumores mediados por BsAc se basan en la
estimulación del sistema inmunitario, sumamente específico con
tumores y libre de restricción por el CMH. En segundo lugar, debido
a la falta de dominio Fc, el BsAc es inocuo para tejidos normales.
Por tanto, la terapia mediada por BsAc es la complementaria a
procedimientos tradicionales tales como cirugía, radioterapia y
quimioterapia. El efecto principal de este enfoque se basa en el
aclaramiento de residuos subclínicos y en la prevención o
eliminación de que el tumor experimente recidiva y metástasis. Un
BsAc no sólo cura tumores, sino que también estimula el sistema
inmunitario para proporcionar y mantener la protección inmunitaria
durante un largo tiempo. Basándose en resultados de experimentos en
ratones y en la práctica clínica, un BsAc preparado para su uso en
ensayos debe tener al menos cinco características tal como sigue:
\ding{172} se dirige a los antígenos tumorales pertinentes con
alta especificidad y afinidad; \ding{173} puede unirse de manera
monovalente a factores activadores en células
efectoras-células citotóxicas y da como resultado
reticulación sólo cuando BsAc se une a antígenos tumorales debido a
la falta de dominio Fc; \ding{174} los BsAc pueden promover la
inflamación y citotoxicidad eficaces producidas selectivamente
mediante el grupo correspondiente de leucocitos en los sitios
tumorales; \ding{175} los BsAc deben humanizarse para minimizar la
inducción de respuesta humana anti-ratón tras usos
repetidos; finalmente, \ding{176} los BsAc no sólo deben ser
suficientemente pequeños para penetrar en tumores sino también
suficientemente grandes para mantenerse en la circulación durante
un tiempo suficiente.
Basándose en estos puntos descritos
anteriormente, se han desarrollado en los últimos años numerosos
BsAc que activan a muchas clases de células efectoras inmunitarias
y que se dirigen a diferentes células tumorales, incluyendo las
células efectoras linfocitos T, células NK, monocitos, macrófagos,
neutrófilos, células LAK (células citotóxicas activadas por
linfoquina) y células TIL (linfocitos infiltrantes de tumores), etc.
Las células T se reconocen comúnmente como las células específicas
principales para las respuestas inmunitarias. CD3 expresado en la
superficie de tolas las células T maduras es el marcador de
superficie común para las células T. CD3 se une a TCR de manera no
covalente, formando el complejo TCR-CD3 completo, y
participa en respuestas inmunitarias contra el estímulo del
antígeno. Actualmente, CD3 es la molécula activadora de superficie
en células efectoras inmunitarias usada más ampliamente y de manera
satisfactoria. Tras unirse un anticuerpo anti-CD3
dentro de BsAc a una molécula CD3 en la superficie de células T, se
producirán numerosos ejemplos tal como sigue para destruir células
tumorales. Estos efectos incluyen: (1) proliferación y
diferenciación de células T. En primer lugar, BsAc puede activar el
resto de células T, dando como resultado una célula Th y una célula
Tc derivadas de las células T efectoras prematuras con CD4^{+} o
CD8^{+}. En segundo lugar, BsAc puede activar numerosas células
de memoria para que proliferen y se diferencien dando células T
efectoras que atacarán y destruirán células tumorales. El número de
células efectoras está directamente relacionado con la velocidad de
eliminación del tumor. (2) Liberación de citoquinas: células Th
CD4^{+} activadas por BsAc pueden secretar una gran cantidad de
IL-2. La IL-2 no sólo estimula la
proliferación de células Th de manera autocrina, sino que también
activa células T CD8^{+} sin tratar de manera paracrina para que
se conviertan en células Tc, dando como resultado la prolongación
de la citotoxicidad de las células Tc. Además, la
IL-2 es una señal coestimuladora para activar
células T. Por tanto, la IL-2 desempeña un papel
vital en los efectos inmunitarios mediados por BsAc. Algunas otras
citoquinas, tales como TNF-\alpha e
IFN-\gamma se producen en el proceso de
activación de células T y pueden producir un efecto "testigo"
inhibiendo el crecimiento de células tumorales "testigo" a
través del medio entre las células. (3) Citotoxicidad: experimentos
in vitro indican que, mediado por BsAc, Tc CD8^{+}
interacciona con células tumorales directamente, libera materiales
citotóxicos a través de exocitosis de gránulos y lisa células diana,
lo que tiene lugar de manera rápida, habitualmente en el plazo de
4-6 horas tras dirigirse a las células tumorales.
Los principales componentes de los materiales citotóxicos son
perforina y serina esterasas o granzimas. Las perforinas pueden
atacar la membrana plasmática y formar canales iónicos, provocando
así la entrada de muchos iones y agua, dando como resultado la
lisis y necrosis de células mientras que las granzimas son similares
a la linfotoxina, que puede activar ADNasas en la células,
provocando así la lisis del ADN nucleico, dando como resultado la
apoptosis de células diana.
Actualmente, se usa ampliamente el fragmento Fv
para la construcción de BsAc, puesto que es la unidad mínima con el
sitio de unión a antígeno completo, es pequeño (aproximadamente 1/6
del anticuerpo completo), no tiene dominio Fc, presenta una
inmunogenicidad inferior, penetra fácilmente en la pared de los
vasos sanguíneos y tumores sólidos, se expresa fácilmente en E.
coli y tiene un coste de producción inferior. Sin embargo, Fv
es inestable y fácil de disociar in vivo porque el enlace
covalente entre los dominios VH y VL no puede generarse. Con el fin
de mejorar la estabilidad del fragmento Fv, se usa un intraconector
polipeptídico entre los dominios VH y VL para formar el denominado
ScFv. El intraconector es comúnmente un péptido flexible corto con
15 residuos de aminoácido de longitud tal como
(Gly_{4}Ser)_{3}. En la presente solicitud, dicho
intraconector se usó en ambos ScFv. Tal como se mencionó
anteriormente, hay varios procedimientos para construir BsAc. En la
presente solicitud, se construyó un anticuerpo biespecífico de
cadena sencilla (ScBsAc) conectado mediante un interconector. El
principio general para diseñar interconectores es garantizar el
plegamiento y apareamiento apropiados de dominios variables de dos
anticuerpos, manteniendo además las actividades biológicas y la
estabilidad de dicho anticuerpo. Además, dicho interconector debe
dotar al BsAc de algunas propiedades novedosas, tales como fácil
purificación y tiempo de semivida prolongada en el plasma, etc. Dos
clases de interconectores, Fc y HSA diseñados originalmente en la
presente solicitud como una realización útil proporcionan una idea
novedosa para diseñar interconectores. El interconector 205c'
mencionado en la bibliografía se usó para comparar y verificar la
eficacia de los interconectores diseñados en la presente solicitud y
el valor de dicho diseño en la construcción de BsAc
anti-ovario. (1) Diseño del interconector Fc: con el
fin de minimizar la inmunogenicidad y el tamaño de molécula,
anticuerpos moleculares pequeños están ausentes de dominios Fc dando
como resultado la falta de varias funciones biológicas, tales como
ADCC, CDC y la ruta de activación del complemento clásica. Para
resolver este problema, se idearon los interconectores para que
contuviesen los defectos de anticuerpos modificados mediante
ingeniería genética. IgGI es la molécula más potente en la inducción
de ADCC y CDC entre los cuatro subtipos de IgG. Puede inducir la
ruta de activación del complemento clásica combinándose con Clq con
su secuencia C-terminal de CH_{2}, en la que los
sitios Gly318, Lys320 y Lys322 se ubican en la superficie de la
molécula Fc para formar un agrupamiento en conformación y combinarse
a Clq directamente. Además, Asn297 de CH_{2} contiene un sitio de
glicosilación que es vital para el efecto de ADCC y CDC inducido por
Fc. Por tanto, se seleccionó un fragmento desde 297 hasta 322 de
CH_{2} en IgG humana para construir el interconector de ScBsAc.
Tiene 26 residuos de longitud y contiene el sitio de glicosilación
Asn297, el sitio de unión a Clq Glu318, Lys320 y Lys322 etc. así
como un sitio de EcoRI en el extremo 5' y un sitio de SacI en el
extremo 3' para el fin de clonación génica. Se espera que el ScBsAc
construido mediante esta estrategia tenga el tiempo de semivida
prolongada in vivo y el efecto de inducir CDC de manera
similar a Fc. (2) Interconector HSA: debido al tamaño más pequeño,
los anticuerpos moleculares pequeños tienen un aclaramiento renal
rápido, que da como resultado un tiempo de retención corto en
inmunoterapia provocando así efectos curativos imperfectos aunque
el tiempo de semivida más corto sea beneficioso para el diagnóstico
por obtención de imágenes inmunológicas de tumores. Por tanto, se
ideó el interconector HSA que se espera que prolongue el tiempo de
semivida de ScBsAc in vivo, mejore la estabilidad y
solubilidad de ScBsAc. HSA (albúmina sérica humana) es un importante
componente del suero humano. Se usa ampliamente como vector natural
estable debido a su estabilidad, tiempo de semivida de varias
semanas, falta de actividades inmunológicas y enzimáticas
específicas y lento aclaramiento en el hígado. Se mostró en la
investigación que la estabilidad de proteínas fusionadas con HSA
aumentó de 20 a 40 veces en animales. La molécula de HSA con 585
aminoácidos de longitud está compuesta por tres dominios, poseyendo
el tercer dominio DIII solo la función de vector de la molécula
completa. En el presente documento, se usó un fragmento con 25
residuos desde el 403 hasta el 427 del dominio DIII, que carece de
Cys pero es rico en aminoácidos polares en HSA como otro
interconector en la construcción de BsAc para mejorar la estabilidad
y prolongar el tiempo de semivida in vivo. (3) Interconector
205c': Este interconector es de 25 aminoácidos de longitud ideado
por Gruber en la construcción de scBsAc anti-TCRx
anti-fluorescencia. El fin de utilizar el
interconector 205c' era comparar y verificar la eficacia de los
interconectores diseñados en la presente solicitud y el valor de
dicho diseño en la construcción de BsAc
anti-ovario.*
Para hacer frente al problema de los HAMA
inducido por anticuerpos murinos en la práctica clínica que limita
enormemente el uso repetido y la dosis, provocando además una escasa
eficacia de curación, los anticuerpos murinos deben humanizarse
para minimizar su heterología, que es el asunto más urgente para la
preparación de anticuerpos usados en la práctica clínica. El scFv
contra la molécula CD3 en ScBsAc usado en la presente solicitud es
un anticuerpo reformado a través de humanización. El anticuerpo
reformado, denominado anticuerpo injertado con CDR o anticuerpo
humanizado, se construye injertando regiones determinantes de
complementariedad (CDR) de los dominios variables de anticuerpos de
roedores en las regiones de entramado de dominios variables
humanos. La estructura espacial de los sitios de unión a antígeno de
los anticuerpos está determinada principalmente por seis CDR de
dominios variables. Dichas CDR forman tres bucles, que tienen
efectos decisivos en el reconocimiento
antígeno-anticuerpo, en el sitio superior de
dominios variables soportado por cuatro dominios de lámina \beta.
Dicho anticuerpo reformado mantiene la capacidad de unión a
antígenos así como la mayoría de las características de anticuerpos
humanos, minimizando por tanto la respuesta de HAMA eficazmente.
El cáncer de ovario sigue siendo la principal
causa de muerte de tumores malignos ginecológicos. La tasa de
supervivencia a cinco años se mantiene solo al 30%. Debido a la
falta de procedimientos de diagnóstico eficaces para el cáncer de
ovario ubicado de manera profunda en la cavidad pélvica y los
síntomas imprecisos asociados con el estadio más temprano, la
mayoría de los pacientes con cáncer de ovario presentan un estadio
avanzado de cáncer. Aunque los procedimientos de operación
quirúrgica avanzan, los fármacos de la quimioterapia se renuevan y
los tratamientos de radioterapia mejoran gradualmente, el pronóstico
del cáncer de ovario no ha mejorado en absoluto. La fácil recidiva
tras la operación quirúrgica y los efectos secundarios y la
tolerancia al fármaco tras el uso repetido de la quimioterapia
influyen enormemente en los efectos del tratamiento. Por tanto,
procedimientos de diagnóstico específicos para estadios más
tempranos de cáncer y el aclaramiento oportuno de focos residuales
son la etapa clave para mejorar el pronóstico. Los BsAc contra los
antígenos relacionados de células de ovario se consideran
herramientas poderosas en la práctica clínica.
Kriangkum et al. describen el desarrollo
y la caracterización de un anticuerpos de cadena sencilla
biespecífico dirigido contra células T y carcinoma de ovario
(Hybridoma, vol. 19, n.º 1, 2000, 33-41).
El objeto de la presente invención es
proporcionar una preparación biológica con baja toxicidad, alta
eficacia y rentabilidad contra cánceres de
ovario-anticuerpo biespecífico
anti-cáncer de ovario humano x
anti-CD3 humano desarrollado mediante tecnología de
ingeniería genética.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica dicho
BsAc.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un vector para dicha secuencia de nucleótidos.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una célula huésped transformada mediante el vector de
expresión usado en la invención.
Figura 1. La presentación esquemática del
plásmido pFUW80.
Figura 2. Las secuencias de nucleótidos de los
dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo
monoclonal anti-ovario y las secuencias de
aminoácidos codificadas por dichas secuencias de nucleótidos.
Figura 3. La actividad de scFv
anti-ovario sometida a prueba mediante ELISA.
Figura 4. La presentación esquemática del
plásmido pROH80.
Figura 5. Las secuencias de nucleótidos de los
dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de scFv
reformado anti-CD3 y las secuencias de aminoácidos
codificadas por dichas secuencias de nucleótidos.
Figura 6. Actividad de unión a antígeno del scFv
reformado anti-CD3 sometida a prueba mediante
FACS.
Figura 7. La presentación esquemática del
plásmido pAL781 y el sitio de clonación múltiple sintetizado.
Figura 8. Las secuencias de nucleótidos de tres
clases de interconectores y las secuencias de aminoácidos
codificadas por dichas secuencias de nucleótidos.
Figura 9. La presentación esquemática del
plásmido pALM.
Figura 10. La presentación esquemática del
plásmido pET\DeltaE
Figura 11. La presentación esquemática del
plásmido pTMF.
Figura 12. La actividad
anti-ovario de BsAc sometida a prueba mediante
ELISA.
Figura 13. Análisis de SDS-PAGE
del anticuerpo biespecífico expresado a partir de pTMF.
Una molécula de anticuerpo consiste en dos
cadenas pesadas y cadenas ligeras idénticas, cada una de las cuales
está compuesta por una región variable y una o más regiones
constantes. La región variable es responsable de la unión con
antígenos y la región constante es responsable principalmente de la
unión con moléculas efectoras. Hay tres bucles flexibles con alta
variabilidad en cada región variable, denominados regiones
determinantes de complementariedad (CDR) que son responsables
principalmente de reconocer antígenos. Las otras partes de las
regiones variables están compuestas por las láminas \beta rígidas
y soportan las denominadas regiones de entramado (FR). Las CDR y FR
se disponen de manera alterna formando la estructura de tipo
"sándwich". En la presente invención, los términos usados
tienen los siguientes significados:
"Anticuerpo Fab" se refiere a un
heterodímero formado por el fragmento Fd (que consiste en la cadena
pesada V_{H} y CHI) y la cadena ligera completa que está
conectada a la primera mediante un disulfuro intercatenario. El
tamaño del "anticuerpo Fab" es 1/3 del anticuerpo completo y
contiene sólo un sitio de unión a antígeno.
"Anticuerpo de cadena sencilla (scFv)" se
refiere a un fragmento de anticuerpo construido mediante ingeniería
genética y a una proteína recombinante que consiste en una región
variable de cadena pesada (V_{H}) y una región variable de cadena
ligera (V_{L}) que está unida a la primera mediante un conector.
El tamaño del scFv es de aproximadamente 1/6 del anticuerpo
completo.
Un "anticuerpo de dominio único" consiste
en la región variable de cadena pesada (V_{H}) o la región
variable de cadena ligera (V_{L}). Dado que este fragmento de
anticuerpo consiste en un solo dominio, se denomina anticuerpo de
dominio único. El tamaño de este fragmento es 1/12 del anticuerpo
completo.
Una "unidad de reconocimiento mínima (URM)"
consiste en una única CDR y su tamaño es de aproximadamente 1/70 o
1/80 del anticuerpo completo.
Un "anticuerpo reformado" se denomina
también "anticuerpo injertado con CDR". Usando síntesis génica
o mutación dirigida al sitio, se sustituyen las CDR en un
anticuerpo humano por las de un anticuerpo murino, por tanto se
mantiene la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo murino.
Sin embargo, debe considerarse que algunos residuos de aminoácido
en las FR humanas pueden interferir en la conformación del sitio de
unión a antígeno formado por las CDR murinas. Por tanto, se
necesita mutar residuos de aminoácido individuales en las FR para
obtener anticuerpos humanizados en el grado máximo y con alta
afinidad.
La presente invención proporciona un anticuerpo
biespecífico modificado mediante ingeniería genética contra
cánceres de ovario tal como se define en la reivindicación 1.
El anticuerpo biespecífico modificado mediante
ingeniería genética contra cáncer de ovario consiste en dos
anticuerpos de cadena sencilla diferentes.
En la presente invención, el anticuerpo
biespecífico modificado mediante ingeniería genética contra cánceres
de ovario es una proteína híbrida que consiste en el Fv de cadena
sencilla contra el cáncer de ovario y el Fv de cadena sencilla
reformado contra el CD3 humano. Dichas proteínas son los productos
expresados, que pueden activar los linfocitos T para destruir
células de cáncer de ovario específicamente, de scFv
anti-ovario y scFv reformado
anti-CD3 conectados mediante tres
interconectores.
\newpage
En anticuerpos biespecíficos de la presente
invención, dicho scFv anti-ovario contiene la
secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que
sigue:
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En anticuerpos biespecíficos de la presente
invención, dicho scFv anti-ovario contiene la
secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera que
sigue:
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\newpage
En anticuerpos biespecíficos de la presente
invención, dicho scFv reformado anti-CD3 humano
contiene la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena
pesada que sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
En anticuerpos biespecíficos de la presente
invención, dicho scFv reformado anti-CD3 humano
contiene la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena
ligera que sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
En los anticuerpos biespecíficos de la presente
invención, el interconector que conecta dos anticuerpos Fv de cadena
sencilla contiene la secuencia de aminoácidos que sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona todavía una
secuencia de nucleótidos que codifica dicho BsAc, que contiene en
el presente documento las secuencias de nucleótidos de dos scFv y
los interconectores entre dos scFv.
\newpage
La presente invención proporciona los plásmidos
de E. coli universales para la construcción y expresión de
BsAc y los plásmidos de expresión que contienen las secuencias de
nucleótidos que codifican BsAc de la presente invención. En la
realización preferida de la presente invención, un plásmido es pALM
derivado del plásmido pAL781, que es un plásmido universal para la
expresión de BsAc. Dicho plásmido tiene las características que
siguen: basándose en el BsAc construido, pueden generarse diferentes
tipos de BsAc sustituyendo cualquier clase de genes de scFv. El
plásmido de pALM que contiene las secuencias de nucleótidos que
codifican BsAc de la presente invención se denominó pALMB. Otro
plásmido es pET\DeltaE, un derivado de pET16 mediante inactivación
del sitio de EcoRI, contiene el operador lac y el promotor
de T7, lo que hace que el pET\DeltaE sea un vector para la
expresión de proteínas diana con eficacia. El plásmido de
pET\DeltaE que contiene las secuencias de nucleótidos que
codifican BsAc de la presente invención se denominó pEMAB. Otro
plásmido es pTMF, que se construyó a partir de pET28a según los
sitios de endonucleasas de restricción de BsAc y para el fin de la
necesidad de investigación adicional y es un plásmido para la
expresión de proteínas no limitadas a BsAc con alta eficacia.
Además de la alta eficacia de la expresión, el plásmido tiene las
características que siguen: tiene varios sitios de endonucleasas de
restricción poco comunes para facilitar la inserción de diversos
genes foráneos en la manera de expresión conjunta o expresión de
fusión; hay un sitio de trombina entre dos grupos de sitios de
endonucleasas de restricción, lo que facilita el aislamiento de la
proteína deseada a partir de la proteína de fusión; hay seis
codones que codifican seis residuos de His en el extremo 3' del
sitio de clonación múltiple, lo que facilita la purificación de
productos expresados con cromatografía de quelación de metales. El
plásmido de pTMF que contiene las secuencias de nucleótidos que
codifican BsAc de la presente invención se denominó pTMAB.
La presente invención proporciona todavía las
células huésped que contienen los vectores de expresión descritos
anteriormente. Dichas células huésped son preferiblemente E.
coli.
Las etapas para la producción de BsAc
modificados mediante ingeniería genética de la presente invención se
describen tal como sigue:
1. Se amplificaron genes de VH y VL del
anticuerpo monoclonal a partir de la línea celular de hibridoma que
secreta anticuerpos monoclonales contra el tumor, respectivamente,
mediante tecnología de PCR usando los cebadores diseñados.
2. Los genes de VH y VL obtenidos contra tumores
se insertaron en el plásmido de expresión de scFv universal, que se
transformó en E. coli, se indujo, se expresó y se
caracterizó.
3. Las secuencias de aminoácidos de VH y VL
reformadas se diseñaron, respectivamente, según los sitios de unión
a antígeno del anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano
OKT3 usando modelado molecular. Las secuencias de nucleótidos se
dedujeron con sesgo de codones de E. coli. Se obtuvieron los
genes completos de VH y VL mediante corte y empalme de los
fragmentos de oligonucleótidos sintéticos usando PCR.
4. Los genes de VH y VL resultantes del
anticuerpo reformado anti-CD3 humano se insertaron
en el vector de expresión de anticuerpo de cadena sencilla
universal, que se transformó en E. coli, se expresó bajo
inducción y se caracterizó.
5. El plásmido con un promotor fuerte se
seleccionó como plásmido de partida. Se diseñaron un fragmento de
ADN que contenía los sitios de endonucleasas de restricción que no
están presentes en el plásmido de partida, dos scFv y tres
interconectores, se sintetizaron y se usaron para sustituir el sitio
de clonación múltiple del plásmido de partida. Las secuencias de
oligonucleótidos sintetizados de los interconectores se insertan en
los sitios correspondientes en el nuevo sitio de clonación múltiple,
respectivamente. Por tanto, se construyeron los vectores
intermedios universales que contenían los interconectores para
BsAc.
6. Se diseñó un par de cebadores y se amplificó
el gen de scFv con sitios de digestión adecuados flanqueantes
mediante PCR a partir del plásmido que contenía el scFv reformado
anti-CD3. Se insertó el fragmento génico en los
vectores intermedios para el anticuerpo biespecífico para producir
vectores de expresión universales basados en
anti-CD3 humano para ScBsAc. Los vectores se
transformaron en E. coli, se expresaron bajo inducción y se
caracterizaron los efectos de los diferentes interconectores sobre
la expresión de scFv.
7. Se obtuvo el fragmento génico del scFv
anti-carcinoma de ovario humano digiriendo el vector
de expresión que contenía el gen de scFv
anti-carcinoma de ovario humano con endonucleasas de
restricción dobles. El vector de expresión para el anticuerpo
biespecífico se construyó insertando dicho fragmento génico en los
correspondientes sitios de restricción del vector de expresión
universal basado en anti-CD3 humano para ScBsAc.
8. Dicho vector de expresión de 7 se transformó
en E. coli. Se expresó BsAc bajo inducción. La masa
molecular, la cantidad de expresión y la forma de expresión se
analizaron mediante SDS-PAGE. La actividad
antitumoral de los productos expresados se sometió a prueba
mediante ELISA. La actividad anti-CD3 humano de los
productos expresados se sometió a prueba mediante FACS. La
especificidad y capacidad anti-tumoral mediada por
los productos expresados se sometió a ensayo usando células Jurkat
o linfocitos de sangre periférica humana.
9. Se construyó el vector de expresión con alta
eficacia y se insertó el gen de BsAc en dicho vector, dando como
resultado el vector de expresión con alta eficacia para BsAc.
10. El vector construido con alta eficacia se
transformó en las células huésped.
11. Se cultivaron las células huésped
transformadas y se indujeron para la expresión de dicho BsAc.
12. Se aisló el BsAc expresado.
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Además, la presente invención se refiere todavía
a las composiciones farmacológicas para los tratamientos o la
prevención de tumores que contienen el anticuerpo biespecífico según
la reivindicación 1 y los vectores farmacéuticos de la presente
invención y a usos del anticuerpo biespecífico según la
reivindicación 1 en la preparación de fármacos para los
tratamientos o la prevención de tumores.
La presente invención se describirá ahora
adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos que pretenden ser
solamente ilustrativos.
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Se clonaron los genes de VH y VL del anticuerpo
monoclonal COC183B2 contra el carcinoma de ovario humano,
respectivamente, mediante tecnología de RT-PCR y PCR
con cebadores que hibridaban con las secuencias de FR1 y FR4 de la
región VH o VL de inmunoglobulina de ratón (figura 2). Se clonaron
los fragmentos VH y VL en el plásmido pUC19 y se verificaron
mediante secuenciación de ADN. Se creó el plásmido pFVB2 insertando
los genes de VH y VL en el plásmido pFUW80 (figura 1) construido
por el laboratorio con el orden de VH y VL desde el extremo 5'
hasta el 3' y hay un conector (Gly_{4}Ser)_{3} entre VH y
VL. Se usó la cepa Top10 de E. coli para la propagación del
plásmido y se verificó el plásmido positivo mediante digestión con
endonucleasas de restricción apropiadas. Se transformó la cepa
XL1-Blue de E. coli con pFVB2 y se infectó
mediante el fago auxiliar M13KO7. Se rescataron las partículas de
fago y se sometió a ensayo la actividad de unión del anticuerpo
frente al fago mediante ELISA indirecto. Los resultados indican que
la actividad de unión del anticuerpo es 2,5 veces superior que la
del control negativo, lo que demuestra que el anticuerpo scFv anti-
carcinoma de ovario se construyó satisfactoriamente.
Se diseñaron las secuencias de aminoácidos de VH
y VL reformadas, respectivamente, según los sitios de unión a
antígeno del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3
humano OKT3 usando modelado molecular. Se dedujeron las secuencias
de nucleótidos con sesgo de codones de E. coli. Se obtuvieron
los genes de VH y VL (figura 5) mediante corte y empalme de los
fragmentos de oligonucleótidos sintéticos usando PCR. Se insertaron
los genes de VH y VL del anticuerpo reformado
anti-CD3 humano en el vector de expresión de
anticuerpo de cadena sencilla universal pROH80 (figura 4) en la
orientación de VL-(Gly_{4}Ser)_{3}-VH
desde el extremo 5' hasta el 3'. Se usó la cepa Top10 de E.
coli para la propagación del plásmido de producción pROCD3 y se
verificaron los plásmidos positivos mediante digestión con
endonucleasas de restricción apropiadas. Se recogieron colonias
individuales de la placa de Top10 transformada y se incubaron en
medio LB con antibióticos correspondientes a 37ºC durante la noche.
Se transfirió una alícuota del cultivo al medio nuevo con la
proporción del 1-5% y agitación a 37ºC hasta que se
alcanzó una DO_{600} de 0,5-1,0. Se añadió IPTG a
la concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de
proteínas diana. Se sometió a ensayo la actividad de unión a
antígeno del scFv reformado anti-CD3 mediante FACS.
Los resultados demuestran que la tasa de inhibición competitiva del
scFv reformado anti-CD3 frente al anticuerpo
monoclonal anti-CD3 era del 18% (figura 6), lo que
implica que el scFv reformado anti-CD3 humano se
construyó y expresó satisfactoriamente.
Se construyó un vector de expresión con sitios
de endonucleasas de restricción adecuados para la inserción de dos
scFv descritos anteriormente y un interconector. Se eligió el
plásmido pAL-781 (figura 7) como vector de partida
para construir el vector para anticuerpos biespecíficos. En la
presente invención, se diseñó un fragmento de oligonucleótido con
55 pb y se sintetizó para sustituir los sitios de clonación múltiple
(MCS) en pAL-781. Este vector intermedio se
denominó pALM. El nuevo MCS contiene el codón de iniciación ATG
integrado en el sitio de endonucleasas de restricción NdeI.
Se insertó el fragmento génico de scFv
anti-carcinoma de ovario entre XhoI y
EcoRI, se insertó el interconector entre EcoRI y
SacI y se insertó el fragmento génico de scFv reformado
anti-CD3 entre SacI y BamHI. Y lo
siguiente fue el fragmento de ADN (CATCAC)_{3} que
codificaba 6 His y el codón de terminación TAA. Ninguno de los
componentes mencionados anteriormente podía sustituirse por otro
mediante digestión e inserción. Se insertaron 3 clases de los
fragmentos de interconectores sintéticos (figura 8) en los sitios
de restricción apropiados en pALM. Se construyeron
satisfactoriamente tres vectores intermedios para ScBsAc:
pALM-Fc; pALM-HSA y
pALM-205c' (figura 9) y se verificaron mediante
digestión y secuenciación de ADN.
Se diseñó un par de cebadores para la
amplificación del gen de scFv frente a CD3 con sitios de digestión
flanqueantes SacI en el extremo 5' y BamHI en el
extremo 3' a partir del plásmido que contenía scFv reformado
anti-CD3 mediante PCR. Se insertó el fragmento
génico en el vector intermedio para el anticuerpo biespecífico para
producir el vector de expresión universal basado en
anti-CD3 humano para ScBsAc. Se transformó el vector
resultante en la cepa GI724 de E. coli y se expresó la
proteína. Los resultados indican que las tres clases de
interconectores no tenían efectos negativos sobre la expresión de
scFv.
Se obtuvo el fragmento génico del scFv
anti-carcinoma de ovario humano digiriendo el vector
de expresión que contenía el gen del scFv
anti-carcinoma de ovario humano con endonucleasas de
restricción XhoI y EcoRI. Se construyó el vector de
expresión para el anticuerpo biespecífico insertando dicho fragmento
génico en el vector de expresión universal basado en
anti-CD3 humano para ScBsAc. Se propagaron los
plásmidos resultantes en la cepa GI724 de E. coli, se
verificaron mediante digestión con endonucleasas de restricción
apropiadas y se denominaron pAMAB.
Se recogieron colonias individuales de la cepa
GI724 de E. coli que albergaban pAMAB y se incubaron en medio
RM durante la noche a 30ºC. Se transfirió una alícuota del cultivo
a medio nuevo con la proporción del 20%. Cuando la DO_{550} del
cultivo alcanzó 0,5-1,0, se añadió triptófano a la
concentración final de 100 ug/ml para inducir la expresión de la
proteína diana. Tras 3 horas de inducción, se precipitó el cultivo
mediante centrifugación a 3.000 rpm durante 10 min. a 4ºC. Se
resuspendió el sedimento celular en 1/2 del volumen de cultivo de
PBS y se rompió mediante ultrasonidos en un baño de hielo durante 20
s por 6-8 veces con intervalos de 1 min. seguido
por centrifugación a 4ºC a 12.000 rpm durante 20 min. Se resuspendió
el precipitado en PBS con el mismo volumen que el sobrenadante. Se
analizaron el sonicado, el sobrenadante y el precipitado de
sonicación mediante SDS-PAGE al 12% con el vector
pALM vacío como control negativo. Se encontró proteína con peso
molecular de 52 kDa tanto en el sobrenadante como en el
precipitado. El resultado indicaba que la proteína diana se
expresaba parcialmente en forma soluble. La proteína soluble podía
usarse directamente para identificar la actividad biológica del
anticuerpo biespecífico.
Se sometió a ensayo la actividad de unión a
antígeno del scFv anti-carcinoma de ovario en el
anticuerpo biespecífico mediante ELISA directo. Se revistió una
placa de ELISA con anticuerpo biespecífico a 4ºC durante la noche.
Los pocillos revestidos con anticuerpo monoclonal
anti-ovario se fijaron como control positivo. Se
lavó la placa 3 veces con PBST (PBS-Tween 20 al
0,05%) durante 5 min. Se añadió HRP-OC183B_{2}
diluido en suero de cabra al 3% y se incubó a 37ºC durante 1 h.
Tras lavar la placa 3 veces con PBST, se añadió el sustrato de HRP
y se incubó durante 20 min. a temperatura ambiente en la oscuridad.
Se añadió H_{2}SO_{4} 2 M para detener la reacción. Se leyeron
las placas a 492 nm (datos mostrados en la figura 12). Todos los
valores de DO_{492} del anticuerpo biespecífico eran 2,5 veces
superiores a los del control negativo y cambiaron con un gradiente
entre las diferentes diluciones de anticuerpo biespecífico. Los
datos indican que el scFv anti-ovario en el
anticuerpo biespecífico tiene la actividad de unión a antígenos
asociados con carcinoma de ovario.
Se sometió a ensayo la actividad de unión a
antígeno del scFv reformado anti-CD3 en el
anticuerpo biespecífico mediante FACS según el principio de
inhibición competitiva. Se lavaron 1x10^{6} células Jurkat nuevas
en un tubo de FACS 3 veces con PBS que contenía suero bovino fetal
al 2% y NaN_{3} al 0,1%. Se añadió anticuerpo biespecífico antes
de incubar las células a 4ºC durante 45 min. Las células incubadas
con PBS se fijaron como control positivo. Tras lavar 3 veces con PBS
que contenía suero bovino fetal al 2% y NaN_{3} al 0,1%, se
incubaron las células con anticuerpo monoclonal murino
anti-CD3 durante 30 min. a 4ºC. Tras lavar 3 veces
con PBS que contenía suero bovino fetal al 2% y NaN_{3} al 0,1%,
se incubaron las células con anticuerpo de cabra
anti-IgG de ratón-FITC (con la
dilución de 1: 50) durante 45 min. a 4ºC. Tras lavar 2 veces con PBS
que contenía suero bovino fetal al 2% y NaN_{3} al 0,1%, se
resuspendieron las células en 500 ul de PBS y se sometieron a ensayo
en FACSort. Los datos indican que el anticuerpo biespecífico puede
inhibir enormemente la actividad de unión a antígeno del anticuerpo
monoclonal de ratón anti-CD3. La tasa de inhibición
es del 18%, lo que demuestra que el scFv reformado
anti-CD3 en el anticuerpo biespecífico tiene
actividad de unión a CD3. Los resultados indican que dos scFv dentro
del anticuerpo biespecífico mantienen ambos sus actividades de unión
a antígeno.
Se sembró la línea celular de ovario humana,
células SKOV3 (células diana), en placas de 96 pocillos con
aproximadamente 1x10^{4}/pocillo. Se añadieron anticuerpos
biespecíficos renaturalizados a partir de cuerpos de inclusión a
tres volúmenes diferentes de 5 ul, 10 ul y 20 ul. Se incubaron las
placas en el incubador con CO_{2} durante la noche. Se añadieron
células Jurkat (células efectoras) a diferentes razones de células
efectoras:células diana. Se incubaron las placas en el incubador
con CO_{2} a 37ºC durante 48 h. Se añadieron 25 ul de MTT a cada
pocillo. Tras la incubación a 37ºC durante 4 h, se vaciaron las
placas y se añadieron 100 ul de SDS ácido (HCl 0,1 N, SDS al 1%) a
cada pocillo. Tras la incubación a 37ºC durante la noche, se leyeron
las placas a 570 nm. Se calculó la tasa de citotoxicidad según la
fórmula a continuación.
Tal como se muestra en la tabla 1, la tasa de
citotoxicidad de las células efectoras contra las células diana
aumentó en el caso de la adición de anticuerpo biespecífico (figura
13). La tasa de citotoxicidad aumenta con el aumento de la
concentración de anticuerpo biespecífico, lo que indica que el
anticuerpo biespecífico desencadena el efecto destructor directo de
células efectoras contra células diana.
Para fines de producción, se construyó un vector
de expresión de alto rendimiento para la sobreexpersión del
anticuerpo biespecífico. pET\DeltaE (figura 10) derivado de pET16
mediante el sitio de EcoRI inactivo es un vector de expresión
de alto rendimiento basado en el promotor de T7. Se insertó el
fragmento génico del anticuerpo biespecífico a partir de pAMAB con
XhoI y BamHI en los mismos sitios de pET\DeltaE
digerido con las mismas endonucleasas de restricción, produciendo
pEMAB. Se expresaron proteínas tras transformar pEMAB en la cepa
BL21(DE3) de E. coli. Sin embargo, expresada a partir
de pET\DeltaE, la proteína diana se fusionó a una etiqueta de
(His)_{10}, que no podía purificarse mediante IMAC tan
eficazmente como las proteínas fusionadas a (His)_{6}. Por
tanto, se construyó el plásmido pTMF (figura 11) derivado de
pET28a. pTMF contiene el promotor de T7 para la sobreexpresión de
proteínas diana y varios sitios de restricción poco comunes que se
usaron para facilitar la inserción de genes foráneos seguido por la
fusión o expresión conjunta de proteínas diana. Se diseñó un sitio
de trombina entre dos grupos de sitios de restricción. Tras la
purificación, las proteínas diana podían separarse de las proteínas
de fusión mediante proteolisis en el sitio de trombina. Flanqueando
el extremo 3' de MCS está la secuencia que codifica la etiqueta de
His_{6} que podía usarse en IMAC.
Se insertó el fragmento génico del anticuerpo
biespecífico digerido a partir de pAMAB con XhoI y
BamHI en pTMF para generar el plásmido pTMAB. Se
transformaron las cepas BL21(DE3) de E. coli con
pTMAB, se recogieron colonias individuales y se hicieron crecer
hasta que el valor de DO_{550} alcanzó 0,5. Se indujo la expresión
de proteínas añadiendo IPTG hasta una concentración final de 0,4
mM. Tras 3 horas de inducción, se precipitó el cultivo mediante
centrifugación, se rompieron los sedimentos celulares mediante
ultrasonidos y se analizó el sonicado mediante
SDS-PAGE (figura 14). En las proteínas de células
completas totales, el 27% es anticuerpo biespecífico, el 16% del
cual es soluble. El nivel de expresión es idóneo en el área de
producción.
Un anticuerpo biespecífico
anti-carcinoma de ovario humano X
anti-CD3 humano puede unirse simultáneamente tanto
a células T como a células de carcinoma de ovario y entonces activar
a las células T para que destruyan las células de carcinoma de
ovario. Este modelo de anticuerpo biespecífico puede usarse como
fármacos biológicos para el tratamiento del carcinoma de
ovario.
<110> Institute of Genetics, Chinese
Academy of Sciences Beijing AnBoTe Gene Engineering Technology Co.
Ltd.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo biespecífico
anti-cáncer de ovario
humano-anti-cd3
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<130> IP02019
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 354
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(354)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 118
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 336
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<222> (1 )..(336)
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<211> 112
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<221> CDS
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<210> 7
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<211> 321
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<213> Artificial
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<221> CDS
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<222> (1)..(321)
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 107
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<212> PRT
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<211> 78
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(78)
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<223>
\newpage
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<400> 9
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<210> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<400> 10
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1 )..(75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Artificial
\newpage
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<400> 12
\hskip1cm
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<212> ADN
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1 )..(75)
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<223>
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<213> Artificial
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<400> 14
\hskip1cm
Claims (9)
1. Un anticuerpo biespecífico contra el cáncer
de ovario, que se construye conectando mediante ingeniería genética
un anticuerpo de cadena sencilla anti-cáncer de
ovario y un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3
humano, en el que el anticuerpo de cadena sencilla
anti-CD3 humano se ha injertado con CDR a través de
humanización, mediante un interconector,
en el que el interconector que conecta los dos
anticuerpos Fv de cadena sencilla comprende la secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
en el que el dominio variable de
cadena pesada de dicho scFv anti-ovario contiene la
secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
en el que el dominio variable de
cadena ligera de dicho scFv anti-ovario contiene la
secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
en el que el dominio variable de
cadena pesada de dicho scFv injertado con CDR
anti-CD3 humano contiene la secuencia de
aminoácidos:
y en el que el dominio variable de
cadena ligera de dicho scFv injertado con CDR
anti-CD3 humano contiene la secuencia de
aminoácidos:
2. Una secuencia de nucleótidos que codifica un
anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1.
3. La secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 2, comprendida en un vector de expresión.
4. Una célula huésped que comprende una
secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 2
y 3.
5. La célula huésped según la reivindicación 4,
que es E. coli.
6. Una composición farmacológica para el
tratamiento y/o la prevención de tumores que comprende un anticuerpo
biespecífico según la reivindicación 1.
7. La composición farmacológica según la
reivindicación 6, en la que el tumor es cáncer de ovario.
8. Uso de un anticuerpo biespecífico según la
reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de tumores.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que
el tumor es cáncer de ovario.
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