ES2337573T3 - Compuestos y procedimientos para la estimacion del estado de inestabilidad de microsatelites (msi). - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que comprende determinar la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición T-25 localizada en la 3''-UTR del gen CASP2 y estimar el estado de MSI a partir de dicha presencia o ausencia de mutaciones en la T-25 localizada en la 3''-UTR del gen CASP2, en el que la presencia de mutaciones es indicativa de la presencia de un estado de MSI-H.
Description
Compuestos y procedimientos para la estimación
del estado de inestabilidad de microsatélites (MSI).
La presente invención proporciona un
procedimiento para la estimación del estado de inestabilidad de
microsatélites (MSI en inglés) de afecciones médicamente relevantes
asociadas al fenotipo de MSI tales como, por ejemplo, lesiones
neoplásicas. El procedimiento está basado en el análisis de una
repetición mononucleotídica monomórfica en la 3'-UTR
del gen de caspasa 2 (CASP2). Basándose en la determinación de la
longitud de la repetición mononucleotídica citada, puede estimarse
la presencia o ausencia de MSI. La determinación de la longitud se
efectúa en un solo procedimiento de PCR. Como alternativa, puede
efectuarse una estimación potenciada combinando el marcador CASP2
con marcadores adicionales tales como BAT25 y BAT26 en un solo
proceso de PCR múltiple.
Se observa un sistema de reparación de errores
de apareamiento de ADN (MMR en inglés) deficiente en aproximadamente
un 10-15% de todos los carcinomas colorrectales y en
hasta un 90% de los pacientes de cáncer colorrectal hereditario sin
poliposis (HNPCC en inglés). Los tumores con defectos del MMR
adquieren mutaciones en tramos de ADN repetitivos cortos, un
fenómeno denominado inestabilidad de microsatélites. La
determinación del estado de los microsatélites en cáncer de colon es
de relevancia creciente puesto que (1) el estado de los
microsatélites es un factor de pronóstico independiente en cáncer
colorrectal, (2) la eficacia de la quimioterapia coadyuvante parece
depender del estado de los microsatélites del tumor, y (3) la
inestabilidad de los microsatélites es la herramienta de selección
molecular más importante para la identificación de pacientes de
HNPCC y familias afectadas por mutaciones de linea germinal en genes
de MMR. Por lo tanto, el ensayo rutinario del MSI parece estar
justificado para todos los casos de cáncer colorrectal.
La inestabilidad de microsatélites se observa en
aproximadamente un 10-15% de los carcinomas
colorrectales esporádicos (CRC en inglés) y hasta en un 90% de los
pacientes de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC)
que albergan mutaciones de linea germinal en genes de reparación de
errores de apareamiento de ADN (MMR) (para una revisión, véase Lynch
y de la Chapelle "Microsatellite instability", N. Engl. J.
Med. 17 de julio de 2003; 349(3):
247-57). Los CRC que exhiben el fenotipo de
inestabilidad de microsatélites (MSI) poseen rasgos patológicos y
clínicos particulares. Los CRC con MSI-H están a
menudo localizados en el colon proximal y presentes con una densa
infiltración de linfocitos intratumorales (Smyrk y col.
"Tumor-infiltrating lymphocytes are a marker for
microsatellite instability in colorectal carcinoma",
Cancer, 15 de junio de 2001; 91(12):
2417-22; Dolcetti y col. "High prevalence of
activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased
neoplastic cell apoptosis in colorectal carcinomas with
microsatellite instability", Am. J. Pathol., junio de
1999; 154(6): 1805-13). Varios estudios
reseñan un mejor pronóstico para pacientes de CRC con
MSI-H (Gryfe y col. "Tumor microsatellite
instability and clinical outcome in young patients with colorectal
cancer", N. Engl. J. Med., 13 de enero de 2000;
342(2): 69-77; Wright y col. "Prognostic
significance of extensive microsatellite instability in sporadic
clinicopathological stage C colorectal cancer", Br. J.
Surg., septiembre de 2000; 87(9):
1197-202); Samowitz y col. "Microsatellite
instability in sporadic colon cancer is associated with an improved
prognosis at the population level", Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev., septiembre de 2001; 10(9):
912-23). De forma interesante, la sensibilidad a la
quimioterapia parece depender del estado de los microsatélites de
células de tumor colorrectal (Claij, "Microsatellite instability
in human cancer: a prognostic marker for chemotherapy?", Exp.
Cell. Res. 10 de enero de 1999; 246(1):
1-10); Hemminki y col. "Microsatellite instability
is a favorable prognostic indicator in patients with colorectal
cancer receiving chemotherapy", Gastroenterology, octubre
de 2000; 119(4): 921-8; Watanabe y col. "A
change in microsatellite instability caused by
cisplatin-based chemotherapy of ovarian cancer",
Br. J. Cancer, 28 de septiembre de 2001; 85(7):
1064-9). El sistema de MMR de ADN parece estar
implicado en la inducción de la apoptosis mediante agentes dañinos
para el ADN, in vitro, varias lineas celulares con un sistema
de reparación de errores de apareamiento defectivo han mostrado ser
resistentes a dichos agentes (Claij "Microsatellite instability in
human cancer: a prognostic marker for chemotherapy?", Exp.
Cell. Res., 10 de enero de 1999; 246(1):
1-10; Bawa y Xiao "A mutation in the MSH5 gene
results in alkylation tolerante", Cancer Res. 1 de julio
de 1997;. 57(13): 2715-20; Carethers y col.
"Mismatch repair proficiency and in vitro response to
5-fluorouracil", Gastroenterology, julio
de 1999, 117(1): 123-31). En un estudio de
Ribic y col. ("Tumor microsatellite-instability
status as a predictor of benefit from
fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon
cancer", N. Engl. J. Med., 17 de julio de 2003;
349(3): 247-57), se observó una tendencia
hacia una supervivencia global más corta en pacientes tratados con
quimioterapia de 5-fluorouracilo
(5-FU) de CRC con MSI-H, mientras
que los pacientes de CRC con MSS se beneficiaban de la terapia con
5-FU coadyuvante. En un estudio diferente, la
supervivencia mejorada de pacientes de CRC tratados con
quimioterapia se limitó a los casos de MSS, mientras que no se
detectó efecto en el grupo de MSI-H (Carethers y
col. "Use of 5-fluorouracil and survival in
patients with microsatellite-unstable colorectal
cancer", Gastroenterology, febrero de 2004; 126(2):
688-9).
Estos datos apuntan a la importancia clínica del
estado de los microsatélites en CRC y proporcionan buenas razones
para un ensayo de MSI rutinario de todos los casos de cáncer
colorrectal. Sin embargo, el procedimiento estándar actual es largo,
laborioso y caro.
Actualmente, el ensayo de MSI se aplica
habitualmente sólo a pacientes preseleccionados según criterios
clínicos (Directrices de Bethesda, Boland y col. "A National
Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer
detection and familial predisposition: development of international
criteria for the determination of microsatellite instability in
colorectal cancer", Cancer Res., 15 de noviembre de 1998;
58(22): 5248-57), debido a que el
procedimiento de ensayo estándar recomendado por el seminario de
ICG-HNPCC (Boland y col. "A National Cancer
Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer
detection and familial predisposition: development of international
criteria for the determination of microsatellite instability in
colorectal cancer", Cancer Res., 15 de noviembre de 1998,
15; 58(22): 5248-57) implica una carga de
trabajo de laboratorio considerable: tienen que amplificarse a
partir del ADN de tejido tumoral y normal cinco marcadores de
microsatélite incluyendo dos repeticiones mononucleotídicas (BAT26 y
BAT25) y tres repeticiones dinucleotídicas (D2S123, D5S346,
D17S250). Se usa un panel de cinco marcadores de MSI adicionales
para la clasificación de MSI de los casos limite. Estos numerosos
marcadores que requieren análisis del ADN normal apareado del mismo
paciente hacen al análisis de MSI un procedimiento de ensayo
laborioso y costoso que no es aplicable para selección de alto
rendimiento.
Por lo tanto, se requiere una estrategia de
ensayo simplificada para ensayos de alto rendimiento. Para reducir
la carga de trabajo del ensayo de MSI, se han sugerido varias
técnicas en publicaciones anteriores. La inmunohistoquímica con
anticuerpos monoclonales específicos de MLH1 y MSH2 se acepta
normalmente como una herramienta útil para identificar a tumores
relacionados con HNPCC (Marcus y col. 1999 "Immunohistochemistry
for hMLH1 and hMSH2: a practical test for DNA mismatch
repair-deficient tumors", Am. J. Surg.
Pathol., octubre de 1999; 23(10):
1248-55'', Lindor y col. "Immunohistochemistry
versus microsatellite instability testing in phenotyping
colorectal tumors", J. Clin. Oncol., 15 de febrero de
2002; 20(4): 897-9; Umar y col. "Revised
Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer
(Lynch syndrome) and microsatellite instability", J. Natl.
Cancer Inst., 18 de febrero de 2004; 96(4):
261-8) y la sensibilidad puede potenciarse
adicionalmente mediante la inclusión de anticuerpos adicionales que
reconocen MSH6 y PMS2. En comparación con el ensayo de MSI basado en
PCR, la IHC tiene algunas ventajas, principalmente los menores
costes que se calcularon que eran menos de un tercio en comparación
con el análisis de MSI estándar (Debniak y col. "Value of
pedigree/clinical data, immunohistochemistry and microsatellite
instability analyses in reducing the cost of determining hMLH1 and
hMSH2 gene mutations in patients with colorectal cancer", Eur.
J. Cancer., enero de 2000; 36(1):
49-54).
Sin embargo, hay varias limitaciones clínicas de
la IHC como procedimiento de selección cuando se usa sola. Se omiten
algunos casos de tumores con MSI-H (Lindor y col.
"Immunohistochemistry versus microsatellite instability
testing in phenotyping colorectal tumors", J. Clin.
Oncol., 15 de febrero de 2002; 20(4):
897-9), y se han reseñado resultados falsos
negativos debido a la heterogeneidad intratumoral, así que se ha
recomendado la tinción de al menos dos muestras independientes para
cada carcinoma (Chapusot y col. "Microsatellite instability and
intratumoural heterogeneity in 100 right-sided
sporadic colon carcinomas", Br. J. Cancer, 12 de agosto de
2002; 87(4): 400-4). Además, pueden resultar
artefactos de tinción del procedimiento de fijación con formalina,
especialmente cuando se usan bloques de tejido grandes (revisado por
Werner y col. 2000). Por tanto, el uso de procedimientos de
detección de MSI basados en PCR es actualmente indispensable para la
correcta clasificación de la MSI.
Para minimizar los costes del ensayo de MSI
basado en PCR, se ha sugerido el uso de BAT26 solo en varios
estudios (Zhou y col. "Determination of the replication error
phenotype in human tumors without the requirement for matching
normal DNA by analysis of mononucleotide repeat microsatellites",
Genes Chromosomes Cancer, febrero de 1998; 21(2):
101-7; Cravo y col. "BAT-26
identifies sporadic colorectal cancers with mutator phenotype: a
correlative study with clinicopathological features and mutations in
mismatch repair genes", J. Pathol., julio de 1999;
188(3): 252-7; Stone y col. "Optimising
methods for determining RER status in colorectal cancers",
Cancer Lett., 28 de febrero de 2000;
149(1-2): 15-20), incluso sin
necesidad de tejido normal coincidente (Hoang y col.
"BAT-26, an indicator of the replication error
phenotype in colorectal cancers and cell lines", Cancer
Res., 15 de enero de 1997; 57(2): 300-3).
Aunque este enfoque puede ser suficiente para la mayoría de casos de
MSI-H, no iguala la sensibilidad del panel estándar
de ICG-HNPCC, puesto que hay resultados falsos
negativos. Adicionalmente, dependiendo del origen étnico de los
individuos ensayados, los alelos de BAT26 acortados que se han
reseñado en hasta un 5,3% (lo más frecuentemente en personas
afroamericanas, Pyatt y col. "Polymorphic variation at the
BAT-25 and BAT-26 loci in
individuáis of African origin. Implications for microsatellite
instability testing", Am. J. Pathol., agosto de 1999;
155(2): 349-53) conducen a una clasificación
de falso positivo cuando el tejido normal correspondiente no está
disponible (Perucho "Correspondence re: C.R. Boland et al.,
A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability
for cancer detection and familial predisposition: development of
international criteria for the determination of microsatellite
instability in colorectal cancer". Cancer Res., 58:
5248-5257, 1998, Cancer Res., 1 de enero de
1999: 59(1): 249-56). De forma similar, se
han detectado alelos de BAT25 aberrantes del "tipo silvestre"
general en 0,6% a 6,8% de los casos (lchikawa y col. "DNA variants
of BAT-25 in Japanese, a locus frequently used for
analysis of microsatellite instability", Jpn. J. Clin.
Oncol., julio de 2001; 31(7): 346-8);
Pyatt y col. 1999). Por lo tanto, Suraweera y col. ("Evaluation of
tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic
mononucleotide repeats and pentaplex PCR",
Gastroenterology, diciembre de 2002; 123(6):
1804-11) recomendaron un sistema de PCR quíntuple
que usaba BAT25, BAT26 y tres marcadores mononucleotídicos
adicionales que permitiera un tipado de microsatélites fiable en la
mayoría de los tumores y lineas celulares gastrointestinales que se
ensayaban. Sin embargo, el estado de MSI de un número considerable
de tumores se pretipaba sólo por marcadores dinucleotídicos o
BAT25/BAT26 solo, impidiendo así la evaluación de la sensibilidad y
especificidad de diagnóstico del sistema quíntuple. Sutter y col.
("Molecular screening of potential HNPCC patients using a
multiplex microsatellite PCR system", Mol. Cell Probes,
abril de 1999; 13(2): 157-65) recomendaron
una combinación de cinco marcadores en un sistema múltiple que
alcanzaba un 100% de sensibilidad y especificidad, pero sólo cuando
se usaba en combinación con el correspondiente tejido
normal.
normal.
El procedimiento actualmente recomendado que usa
el panel marcador ICG-HNPCC estándar con este fin es
costoso y largo. Por lo tanto, es deseable establecer un nuevo
procedimiento de ensayo de microsatélites. Este procedimiento podría
incluir, por ejemplo, un marcador novedoso altamente indicativo de
MSI que podría simplificar los protocolos actuales de evaluación de
MSI.
Los compuestos y procedimientos dados a conocer
según la presente invención proporcionan la mejora del procedimiento
de ensayo de microsatélites. El procedimiento dado a conocer en la
presente memoria tiende a simplificar el análisis de MSI en cáncer
colorrectal sin reducir la sensibilidad ni especificidad de
diagnóstico. Los inventores encontraron que la repetición
mononucleotídica T25 en 3'-UTR del gen CASP2 puede
usarse para una determinación eficaz y sensible del estado de
microsatélites en especímenes. En ciertas realizaciones, el marcador
dado a conocer puede combinarse también con los marcadores de
microsatélites establecidos BAT25 y BAT26 en una reacción de
amplificación múltiple.
En la búsqueda de estrategias de selección más
eficaces, los inventores identificaron sorprendentemente una
repetición T-25 monomórfica en la
3'-UTR del gen CASP2 que puede usarse como marcador
del estado de MSI. Basándose en esta molécula marcadora monomórfica,
se ha diseñado un procedimiento para la estimación del estado de MSI
de afecciones médicamente relevantes asociadas al fenotipo de MSI.
El procedimiento comprende las etapas de i) determinación de la
presencia o ausencia de mutaciones en la repetición
T-25 localizada en la 3'-UTR del gen
CASP2; y ii) estimación del estado de MSI basándose en la presencia
o ausencia de mutaciones, siendo indicativa la presencia de
mutaciones de la presencia del estado de MSI-H.
Figura 1: Amplificación por PCR múltiple de
BAT26, BAT25 y CASP2 de dos CRC con MSI-H (A y B),
un CRC con MSS (C) y un CRC con MSI-L (D). Se
exponen los productos de PCR para BAT26 (azul, longitud relativa
media de producto 117 pb), BAT25 (verde, 122 pb) y CASP2 (azul, 147
pb). Los picos sombreados cubren el área mayor y se definen como la
longitud de producto principal. El intervalo de longitud de producto
observado en ADN normal de individuos sanos está indicado por lineas
de puntos para cada marcador. Se observaron desplazamientos
exclusivamente en tumores con MSI-H, las longitudes
de desplazamiento se indican encima de los correspondientes picos de
producto.
Figura 2: Distribución de las longitudes de
producto de CASP2, BAT25 y BAT26. Se observaron las longitudes de
producto relativas en CRC con MSI-H (columnas
sombreadas) y muestras de ADN no tumoral (columnas negras).
Aproximadamente dos tercios del conjunto de ADN normal ensayado
(principalmente de donantes blancos) presentaron una longitud de
producto de CASP2 principal de 147 pb. Debido a que no se observaron
variaciones que superaran un nucleótido, fue posible la detección de
MSI en todos menos en un caso sin el análisis del correspondiente
tejido normal.
Figura 3: Amplificación por PCR múltiple de
BAT26, BAT25 y CASP2 de dos tumores extracolónicos con
MSI-H. Productos amplificados a partir de cáncer
endometrial con MSI-H (A) y cáncer de ovario con
MSI-H (B). Se observan las longitudes de
desplazamiento mayores para CASP2.
Figura 4: Secuencias como ejemplos de cebadores.
Pares de amplificación de la repetición T-25 de
CASP-2 para un procedimiento según la presente
divulgación.
Es un aspecto de la presente invención un
procedimiento para la estimación del estado de MSI de afecciones
médicamente relevantes asociadas a MSI tales como por ejemplo
tumores. El procedimiento comprende determinar la presencia o
ausencia de mutaciones en la repetición T-25
localizada en la 3'-UTR del gen CASP2. Esto puede
comprender, por ejemplo, la determinación de la longitud del ácido
nucleico de la 3'-UTR.
Se da a conocer un kit para efectuar el
procedimiento según la presente invención.
Se da a conocer también el uso de sondas
complementarias o complementarias inversas del gen CASP2 para la
fabricación de un kit para la estimación del estado de MSI de
afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI.
Es un aspecto adicional de la presente
divulgación un sistema para la estimación del estado de MSI de
afecciones médicamente relevantes basado en la detección de
mutaciones en la repetición T-25 de la
3'-UTR del gen CASP2.
Es un aspecto adicional de la presente
divulgación un ácido nucleico complementario o complementario
inverso del gen CASP2 para la determinación del estado de MSI de
afecciones médicamente relevantes.
La presente invención está basada en la
aplicación de una molécula marcadora que se caracteriza por un alto
grado de frecuencia de mutación en los tumores con
MSI-H de interés y mutaciones no detectables en
especímenes de tejido con MSS. Las características de esta molécula
marcadora posibilitan el establecimiento de un procedimiento de
detección altamente sensible y especifico de casos de
MSI-H basado en una detección de mutación
sencilla.
El gen de casp2 o caspasa 2 como se usa en el
contexto de la presente invención en sus diversas formas
gramaticales designa la caspasa 2, también denominada proteasa de
cisteina relacionada con la apoptosis, localizada en la región
cromosómica 7q34-q35 (UniGene Cluster Hs.433103). Un
corte y empalme alternativos conduce a la transcripción de
diferentes isoformas de CASP2, estando identificada la secuencia de
ácido nucleico de referencia del ADNc más larga que cubre la región
cromosómica más larga y constituida por 11 exones por la secuencia
de nº de acceso NM_032982. Las isoformas alternativas identificadas
por las secuencias de nº de acceso NM_032983, NM_032984 y NM_001224
comparten todas un exón 3' idéntico al exón 11 de la secuencia de
ADNc NM_032982 que contiene la repetición T25 descrita
anteriormente. La proteína codificada por este gen es también
conocida en la técnica como proteasa ICH-1, se
identificada como la proteína P42575 y se clasifica como una enzima
perteneciente al grupo EC 3.4.22. de hidrolasas (base de datos de
nomenclatura de enzimas, SwissProt). La proteína Casp2 es necesaria
para la inducción de la apoptosis relacionada con el estrés mediante
la liberación de citocromo c y Smac de mitocondrias y mediante la
translocación de Bax del citoplasma a mitocondrias (Lassus y col.
2002). Generalmente, el gen de Casp2 como se usa en la presente
memoria designa ácidos nucleicos monocatenarios así como
bicatenarios y por lo tanto comprende secuencias como las
encontradas en la cadena de codificación del gen de Casp2 así como
secuencias inversas complementarias de las mismas. Además, las
secuencias del gen de Casp2 así como fragmentos de las mismas se
entenderán por el término gen de Casp2 o ácido nucleico de
Casp2.
El gen de Casp2 o ácido nucleico de Casp2 como
se usa en el contexto de la presente invención comprenderá además la
repetición T-25 localizada en la
3'-UTR del gen CASP2, según la presente invención
con referencia a la repetición T-25 localizada en
posición nt 2685 a 2709 de la secuencia NM_032982. El gen de Casp2 o
ácido nucleico de Casp2 como se usa en el contexto de la presente
invención designa por lo tanto la secuencia de codificación, las
secuencias reguladoras 5' y las regiones no traducidas 3' del gen de
Casp2.
Esta repetición tiene una longitud de 25
nucleótidos según la entrada de la base de datos citada. Esta
repetición T-25 según la presente invención se
considera monomórfica. En el contexto de la presente invención, la
repetición T-25 monomórfica puede tener también la
longitud de repetición de T-24 y
T-26. Como se usa en el contexto de la presente
invención, el término "repetición T-25" puede
comprender también las formas T-24 y
T-26.
La repetición T-25 citada
localizada en la posición nt 2685 a 2709 de la secuencia NM_032982
exhibe una longitud de fragmento relativa de 148 nucleótidos en un
sistema de amplificación como se da a conocer en la presente memoria
en los ejemplos.
La repetición T-25 como se da a
conocer en la presente memoria es monomórfica ya que no pudieron
detectarse longitudes alélicas relativas de menos de 146 nt ni de
más de 148 nt en muestras originarias de individuos sanos normales.
La longitud alélica relativa, como se usa en la presente memoria,
designará una longitud de fragmento especifica de alelo generada en
una reacción de amplificación de ácido nucleico. Por lo tanto, el
término "monomórfico" como se usa en el contexto de la presente
invención designa la longitud uniforme de la repetición
T-25 presente en muestras de individuos sanos
normales e incluye un intervalo de desviación de \pm 1 nucleótido.
Los alelos que contienen una repetición T-24,
T-25 o T-26 se considera que son
monomórficos respecto al microsatélite de la repetición
T-25.
Las longitudes alélicas de 146 nt y 148 nt
respectivamente citadas anteriormente se detectan usando un sistema
de detección como se da en el ejemplo 1. Es conocido por los
expertos en la técnica que, debido a cuestiones técnicas, pueden
aparecer pequeñas variaciones de las longitudes relativas de
producto detectadas. En ciertas realizaciones de la presente
invención, la variación de las longitudes de los fragmentos
detectados puede limitarse a 1 pb o menos por el diseño del sistema
de detección. Generalmente, el sistema de detección para aplicación
según la presente divulgación debe asegurar una sensibilidad y/o
especificidad adecuadas del procedimiento de análisis de MSI. Sin
embargo, por ejemplo, podría incluirse una muestra de referencia en
cada análisis. En esta realización, la muestra de referencia podría
usarse como control externo y puede consistir en cualquier producto
de PCR de CASP2 con una longitud de producto determinada
anteriormente. Además, pueden aplicarse diversos otros
procedimientos para la detección de mutaciones. Las longitudes
alélicas detectadas en el sistema de detección respectivo dependen
de los parámetros del sistema. Los expertos en la técnica sabrán
cómo deben corregirse las longitudes alélicas respectivas
correspondientemente a las correcciones de los parámetros del
sistema de detección. En el contexto de la presente divulgación, se
citarán las longitudes alélicas de 146 nt y 148 nt respectivamente
que pueden detectarse con el sistema de detección como se da a
conocer en los ejemplos siguientes. Sin embargo, estará comprendida
cualquier longitud alélica determinada usando otro sistema, pero
correspondiente a las longitudes alélicas citadas, cuando se usen
las longitudes alélicas citadas en la presente memoria.
Generalmente, una longitud alélica que difiera de la longitud
alélica dada en el número de acceso NM_032982 en +2 nt o -2 nt o más
en la repetición oligo-T localizada en la
3'-UTR de la secuencia citada, se considerará que es
indicativa de la presencia de una mutación.
La repetición T-25 de CASP2 dada
a conocer en la presente memoria exhibe mutaciones en cánceres con
MSI-H con alta prevalencia. No están presentes
alteraciones de CASP2 en muestras de carcinoma colorrectal con MSS
de control. La longitud de desplazamiento media en CRC con
MSI-H detectada en un ensayo de detección de CASP2
basado en PCR es comparable con la observada con BAT26 y BAT25.
Finalmente, en individuos sanos normales no se observaron alelos que
difirieran en más de un nucleótido de la longitud relativa de tipo
silvestre para la repetición T-25 en la
3'-UTR de CASP2. En comparación con los marcadores
adicionales en el panel múltiple sugerido por Suraweera (Suraweera y
col., 2002), la repetición mononucleotídica T-25 de
CASP2 exhibe una mayor frecuencia de mutación y una longitud de
desplazamiento media más larga.
En una realización de la presente divulgación,
puede aplicarse una combinación de CASP2 con los dos mononucleótidos
BAT25 y BAT26 del panel ICG-HNPCC estándar para
mejorar la sensibilidad y especificidad de
diagnóstico.
diagnóstico.
Generalmente, la molécula marcadora dada a
conocer en la presente memoria es aplicable a todas las afecciones
médicamente relevantes en que está indicado un análisis del estado
de MSI para estimación del diagnóstico o para estratificación de
individuos para una terapia adecuada. Dichas afecciones médicamente
relevantes comprenden, por ejemplo, tumores de diversas clases y
naturalezas.
Es conocido por los expertos en la técnica que
la aplicabilidad de ciertos marcadores para análisis de MSI puede
variar entre diferentes tipos de tumores (Lawes y col., 2003) así
como entre diferentes etapas de un tipo tumoral. Se ha reseñado
recientemente que BAT26 mostró menor sensibilidad en adenomas
colorrectales (Grady y col., 1998), cáncer de ovario (Sood y col.,
2001) y cáncer endometrial con deleciones de pares de bases medias
significativamente reducidas (Duval y col., 2002).
En los experimentos que condujeron a la presente
divulgación, los inventores pudieron mostrar que CASP2 es un
marcador de microsatélite de aplicación más universal. Resultó que
la repetición T-25 en la 3'-UTR del
gen CASP2 era indicativa del estado de MSI-H en
todas las entidades tumorales ensayadas y que estaban ausentes
mutaciones en tumores con MSS. Además de carcinomas colorrectales
con MSI-H, los adenomas colorrectales, carcinomas
endometriales, cánceres de ovario y cánceres uroteliales presentaron
desplazamientos marcados de la repetición T-25 de
CASP2 (Ejemplos 2 y 3). Por lo tanto, una amplia aplicabilidad es un
rasgo del marcador de microsatélite dado a conocer en la presente
memoria.
Las moléculas de ácido nucleico según la
presente divulgación pueden comprender cualquier clase de
polinucleótidos o fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos
pueden incluir, por ejemplo, moléculas monocatenarias (de
codificación o de no codificación) o bicatenarias y pueden ser ADN
(genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN comprenden
tanto ARNhn (que contiene intrones) como ARNm (que no contiene
intrones). Según la presente divulgación, los polinucleótidos pueden
estar también ligados a otras moléculas tales como materiales de
soporte o moléculas marcadoras de detección y pueden contener,
aunque no es necesario, secuencias de codificación o no codificación
adicionales. El término ácidos nucleicos como se usa en la presente
invención comprenderá también cualquier clase de ácidos nucleicos
sintéticos o modificados tales como polinucleótidos sintéticos o
fragmentos de los mismos, ácidos peptidonucleicos (APN) o similares.
Los tipos específicos de dichos ácidos nucleicos sintéticos o
modificados son conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas
realizaciones, los ácidos nucleicos sintéticos pueden comprender
nucleósidos infrecuentes o artificiales o análogos de los
mismos.
En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos
según la presente invención son ácidos nucleicos modificados o
alterados. La alteración o modificación puede efectuarse para
alterar las condiciones de hibridación necesarias o para introducir
mareajes o moléculas informadoras o por cualquier otra razón. Los
tipos específicos de dichos ácidos nucleicos sintéticos o
modificados son conocidos por los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos
sintéticos pueden comprender nucleósidos (por ejemplo, con
componentes de azúcar alterados o con componentes de purina o
pirimidina alterados, etc.) o nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos
tiofosfato o fosforotioato) o análogos de los mismos infrecuentes o
artificiales. Dichas alteraciones pueden comprender, por ejemplo, la
introducción de mareajes tales como mareajes radioactivos (por
ejemplo, como radioisótopos emisores de radiación ^{32}P,
^{35}S, ^{14}C, ^{3}H, etc.), la introducción de componentes
coloreados o fluorescentes (por ejemplo, maleimida, yodoacetamida,
etc.) o de restos de unión tales como biotina o similares en los
ácidos nucleicos. En ciertas realizaciones, la introducción de
grupos tiol en el componente de azúcar y/o pirimidina o purina (por
ejemplo, 4-tiouridina o similar) puede tener cierta
ventaja para la reacción de detección posterior. Las formas
reactivas de tintes fluorescentes tales como, por ejemplo, verde
Oregon 488, verde de rodamina, rojo de rodamina, rojo Texas,
fluoresceina, tetrametilrrodamina, biotina, ésteres de
DSB-biotina y DNP-succinimidilo
pueden usarse para marcar los ácidos nucleicos aplicados en los
procedimientos según la presente invención. Según sea el caso, los
mareajes pueden acoplarse mediante espaciadores a los ácidos
nucleicos. Dichos espaciadores comprenden, por ejemplo, espaciadores
de aminohexanoilo o similares. En ciertas realizaciones de la
presente invención, los ácidos nucleicos se modifican de modo que
permitan el análisis FRET de la reacción de hibridación. Los
procedimientos para la provisión de ácidos nucleicos modificados y
alterados son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos
anteriores de modificaciones, alteraciones y mareajes son sólo para
ejemplificación y no se pretende que limiten el alcance de la
invención. Son conocidos por los expertos en la técnica diversas
otras modificaciones y mareajes para ácidos nucleicos. En ciertas
realizaciones de la invención, puede aplicarse cualquiera de los
procedimientos conocidos en la técnica para uso en un procedimiento
según la presente divulgación.
Los ácidos nucleicos para aplicación en un
procedimiento según la presente divulgación son ácidos nucleicos de
un gen CASP2 como se define anteriormente. Los ácidos nucleicos
según la presente divulgación pueden ser también complementarios o
complementarios inversos de cualquier ácido nucleico de CASP2. Los
ácidos nucleicos para uso en un procedimiento según la presente
divulgación pueden desviarse a este respecto de la estructura
primaria de la secuencia de ácido nucleico dada en el número de
acceso NM_032982. Estas desviaciones o variaciones de la estructura
primaria de los ácidos nucleicos pueden comprender, por ejemplo,
sustituciones de ácidos nucleicos por nucleótidos infrecuentes o
artificiales. Los ácidos nucleicos modificados se caracterizan por
que hibridan con un ácido nucleico derivado del número de acceso
NM_032982 en condiciones de hibridación estándar aplicadas para la
clase o tipo respectivo de ácido nucleico. Los expertos en la
técnica saben cuáles condiciones de hibridación tienen que aplicarse
para asegurar una hibridación especifica de los diferentes tipos de
ácidos nucleicos o ácidos nucleicos modificados o APN.
La determinación del estado de MSI presente en
muestras en ciertas realizaciones de la presente divulgación está
basada en la detección de la presencia o ausencia de mutaciones en
los ácidos nucleicos de CASP2. La mutación como se usa en el
contexto de la presente invención puede comprender inserciones o
deleciones de uno o varios nucleótidos (o repeticiones
nucleotídicas) en las secuencias de microsatélite especificadas.
Con respecto a la repetición
T-25 dada a conocer en la presente memoria,
cualquier longitud de repetición de la repetición
T-25 en un procedimiento según la presente invención
que sea T-23 o menor o T-27 o mayor
(correspondiente a longitudes alélicas de 146 nt o menos y 150 nt o
más en un sistema de detección como se ejemplifica en la presente
memoria) se considera como indicativa de la presencia de una
mutación. En ciertas realizaciones de la presente invención, una
longitud alélica diferente de la longitud alélica dada en el número
de acceso NM_032982 en +2 o más nucleótidos o -2 o más nucleótidos
en la repetición oligo-T localizada en la
3'-UTR de la secuencia citada será considerada como
indicativa de la presencia de una mutación. La presencia de
mutaciones en la repetición T-25 monomórfica según
la presente invención es indicativa del estado de
MSI-H.
La inestabilidad de microsatélites (MSI) como se
usa en la presente memoria designa un tipo de inestabilidad genética
presente en ciertos tumores epiteliales humanos que se caracteriza
por variaciones de longitud en secuencias de ADN repetitivas cortas.
A lo largo del texto de la presente invención, los términos MSI o
fenotipo de MSI pueden usarse intercambiablemente. En contraposición
con ello, está el fenotipo de MSS (microsatélites estables). El
acrónimo MSI-H como se usa en la presente memoria
denominará un fenotipo que se caracteriza por un alto nivel de MSI
según las recomendaciones de la ICG-HNPCC (Boland y
col. 1998).
El estado de microsatélites como se usa en el
contexto de la presente invención designa la presencia o ausencia de
MSI o fenotipo de MSI-H. La estimación del estado de
MSI según la presente divulgación puede efectuarse usando la
detección de la presencia o ausencia de mutaciones en uno o más
microsatélites. Los microsatélites que pueden usarse para tipado de
MSI comprenden microsatélites localizados intergénicamente o
superpuestos con regiones cromosómicas que contienen genes. Los
microsatélites relacionados con genes pueden localizarse en la
región 5' no traducida (UTR), la región de codificación,
3'-UTR o regiones intrónicas.
Se dan a continuación procedimientos para la
detección de la presencia o ausencia de mutaciones.
Las afecciones médicamente relevantes asociadas
a MSI a las que puede aplicarse el procedimiento dado a conocer en
la presente memoria comprenden cualquier enfermedad asociada a
inestabilidad de microsatélites. En una realización, dichas
enfermedades son tumores. Son ejemplos de tumores asociados a
inestabilidad de microsatélites los tumores del tracto anogenital,
el tracto colorrectal (por ejemplo, carcinoma colorrectal, adenoma
colorrectal, pólipos colorrectales, etc.), el tracto
gastrointestinal (por ejemplo, cáncer gástrico, carcinoma del
intestino delgado, pólipos del intestino delgado, tumores de los
conductos biliares, carcinoma pancreático, etc.) y el tracto
respiratorio, tumores endometriales (por ejemplo, carcinoma
endometrial, hiperplasia endometrial, etc.), tumores del sistema
nervioso central (por ejemplo, glioblastoma multiforme,
meduloblastoma, etc.), tumores de próstata, tumores de mama (por
ejemplo, carcinoma de mama), etc.
Una muestra según el procedimiento dado a
conocer en la presente memoria puede comprender cualquier muestra
que comprenda ácidos nucleicos de tejidos afectados por un trastorno
o sospechosos de estar afectados por un trastorno asociado a la
inestabilidad de microsatélites como se describe anteriormente. Las
muestras se originan en el tracto anogenital, el tracto colorrectal,
el tracto gastrointestinal, el tracto respiratorio y otras regiones
en que aparecen afecciones médicamente relevantes asociadas a la
inestabilidad de microsatélites.
Las muestras pueden comprender diversas clases
de muestras de relevancia clínica tales como, por ejemplo, fluidos
corporales tales como por ejemplo sangre, plasma, suero,
secreciones, frotis, orina, semen, bilis, líquidos, etc. Además, las
muestras pueden comprender heces, biopsias, muestras de células y
tejidos. Las biopsias como se usa en el contexto de la presente
invención pueden comprender, por ejemplo, muestras de resección de
tumores, muestras de tejido preparadas por medios endoscópicos o
biopsias de aguja de órganos.
En ciertas realizaciones, las muestras pueden
originarse en pulmón, bronquio, tracto respiratorio inferior, tracto
respiratorio superior, cavidad oral, estómago, esófago, intestino
delgado, colon ascendente, colon transversal, colon descendente o
colon sigmoideo, recto, ano, etc.
En ciertas realizaciones, la muestra puede ser
una muestra histológica, una biopsia o una muestra citológica tal
como, por ejemplo, un frotis, una torunda, un lavado que contienen
fluido corporal. En ciertas realizaciones de la invención, las
muestras pueden comprender especímenes fijados o conservados tales
como especímenes citológicos o histológicos. La fijación o
conservación pueden efectuarse mediante cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la técnica que comprenden fijación con
alcohol, imbibición en parafina, fijación con formalina o similares.
Las muestras pueden comprender en ciertas realizaciones heces o
muestras obtenidas mediante medios endoscópicos tales como por
ejemplo gastroscopia, colonoscopia, etc.
Para los procedimientos según la presente
divulgación, las muestras pueden procesarse o prepararse de manera
adecuada para permitir la detección de las moléculas marcadoras bajo
examen. En ciertas realizaciones, dichos procedimientos comprenden
procedimientos para el aislamiento o la concentración de ácidos
nucleicos de las muestras. Dichos procedimientos pueden comprender
también la eliminación de los otros componentes de las muestras
tales como, por ejemplo, incubación con enzimas para la degradación
de ciertos compuestos tales como proteínas.
En una realización, puede aplicarse una etapa de
concentración de células. Esta etapa puede comprender una
centrifugación, una clasificación celular por ejemplo por citometría
de flujo o similar, una concentración inmunoquímica de células
(usando anticuerpos dirigidos contra epítopos de superficie celular)
o cualquier otro procedimiento adecuado conocido por los expertos en
la técnica. La concentración de células puede estar relacionada con
la concentración de células en general o incluso con la
concentración de tipos celulares específicos. En una realización, la
concentración puede efectuarse mediante microdisección de
preparaciones de tejido. Generalmente, las muestras que comprenden
células afectadas por las afecciones médicamente relevantes bajo
investigación son adecuadas para la aplicación de un procedimiento
según la presente invención. En una realización, se aplican muestras
en que al menos un 10% del contenido celular total está afectado por
la afección médicamente relevante bajo investigación. En otra
realización, al menos un 50% del contenido celular total está
afectado por la afección médicamente relevante bajo
investigación.
En ciertas realizaciones, las muestras
comprenden ácidos nucleicos originarios de células de las regiones
del cuerpo citadas. Generalmente, los ácidos nucleicos se preparan a
partir de las muestras mediante procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los ácidos
nucleicos de las muestras pueden prepararse de un modo que permita
un análisis de los ácidos nucleicos mediante el procedimiento de
detección respectivo. La extracción de ácidos nucleicos de muestras
puede efectuarse mediante diversos procedimientos y puede emplearse
un amplio intervalo de reactivos o kits comercialmente disponibles
adecuados con este fin. Posteriormente, los ácidos nucleicos
purificados pueden someterse a reacciones de detección adecuadas
tales como, por ejemplo, reacciones de amplificación o
hibridación.
Los procedimientos de detección para aplicación
en la presente invención comprenden procedimientos para la detección
de ácidos nucleicos en general así como procedimientos para la
detección de mutaciones en ácidos nucleicos.
La detección de la presencia o ausencia de
mutaciones puede efectuarse mediante cualquier procedimiento
adecuado para la detección de mutaciones en moléculas de ácido
nucleico conocidos por los expertos en la técnica. Los
procedimientos adecuados para el análisis de mutaciones en ácidos
nucleicos, y especialmente de mutaciones de deleción o inserción en
ácidos nucleicos, son conocidos por los expertos en la técnica.
Dichos procedimientos pueden comprender, por ejemplo, cualquier
procedimiento aplicado en el curso de la detección de la longitud de
ácidos nucleicos tal como, por ejemplo, procedimientos de
electroforesis (por ejemplo, electroforesis en gel, electroforesis
capilar, etc.), procedimientos cromatográficos (por ejemplo,
procedimientos de centrifugación en gradiente u otros procedimientos
de centrifugación adecuados), procedimientos de espectrometría de
masas, procedimientos de escisión endonucleolítica y
exonucleolítica, etc.
La detección de los ácidos nucleicos o de
mutaciones de los ácidos nucleicos respectivos puede emplear
cualquier procedimiento informador adecuado. Dichos procedimientos
pueden comprender la aplicación de moléculas informadoras tales como
compuestos coloreados, compuestos fluorescentes, compuestos emisores
de luz, compuestos emisores de radiación o una estructura de unión
adecuada para interacción especifica con otras moléculas. Dichos
mareajes pueden comprender FITC, biotina, estreptavidina o
similares. Dichas moléculas informadoras pueden aplicarse en forma
de mareajes unidos covalente o no covalentemente a sondas o
cebadores.
En ciertas realizaciones, los procedimientos
para la detección de mutaciones pueden comprender reacciones de
amplificación de ácido nucleico. Son conocidas por los expertos en
la técnica reacciones de amplificación adecuadas y pueden comprender
amplificación basada en ADN así como amplificación basada en ARN.
Las reacciones de amplificación según la presente invención pueden
comprender PCR, LCR, NASBA, etc. La reacción de amplificación puede
efectuarse usando uno o más cebadores específicos.
En una realización, una reacción de
amplificación comprende la amplificación de un solo ácido nucleico.
En otra realización, la amplificación se lleva a cabo en forma de
una reacción de amplificación múltiple que amplifica simultáneamente
un conjunto de varios ácidos nucleicos. En aún otra realización,
pueden efectuarse una o más reacciones en cadena de la polimerasa.
Pueden efectuarse más de una PCR secuencialmente o de manera
múltiple.
En una realización, la reacción de amplificación
da lugar a fragmentos de ácido nucleico de 50 pb a aproximadamente
500 pb de longitud. En una realización preferida de la invención, la
longitud de los productos de amplificación es de 75 pb a 300 pb de
longitud. En una realización más preferida, la longitud del producto
de amplificación es de 100 pb a 200 pb.
En una realización, puede aplicarse un sistema
de amplificación de ácido nucleico como se detalla en los ejemplos
de la presente memoria.
Sin embargo, pueden aplicarse diversos otros
procedimientos para la detección de los ácidos nucleicos o de
mutaciones de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, las longitudes
alélicas detectadas en el sistema de detección respectivo dependen
de los parámetros del sistema. Los expertos en la técnica saben cómo
tienen que corregirse las longitudes alélicas respectivas
correspondientes a correcciones en el sistema de detección. En el
contexto de la presente invención, se citarán las longitudes
alélicas que pueden detectarse con el sistema de detección como se
da a conocer en los ejemplos de la presente memoria. Sin embargo,
cualquier longitud alélica determinada usando otro sistema pero
correspondiente a las longitudes alélicas citadas estará comprendida
cuando se usen las longitudes alélicas citadas en la presente
memoria.
Los cebadores para llevar a cabo la reacción de
amplificación en un procedimiento según la presente divulgación se
diseñan de modo que den lugar a productos de amplificación de las
longitudes de fragmento citadas. Generalmente, son cebadores para
uso según la presente divulgación moléculas de ácido nucleico
capaces de hibridar con una secuencia de ácido nucleico diana. Los
cebadores son ácidos nucleicos capaces de hibridar con ácidos
nucleicos del gen CASP2 o fragmentos de los mismos. Dichos cebadores
comprenden, por ejemplo, ácidos nucleicos complementarios o
complementarios inversos de ácidos nucleicos de CASP2 o de ácidos
nucleicos complementarios inversos de ácidos nucleicos de CASP2. El
diseño de los cebadores adecuados puede efectuarse usando diversas
herramientas para selección de cebador conocidas por los expertos en
la técnica. Los ejemplos de cebadores adecuados pueden
seleccionarse, por ejemplo, de los siguientes pares:
1fwd
5'-CTGCCTCAAAGGGACTGC-3'
1rev 5'
-CCTTCCCGATCCTTGATAAGT-3' correspondiente a una
longitud del producto de amplificación de 144 pb
2fwd 5'
-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
2rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación de 148
pb
3fwd 5'-
AACCTTTATCCCTGCTTATCTGA-3'
3rev 5'- AGTTGGAGCTTGCAGTGAGC-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 148 pb
4fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
4rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 149 pb
5fwd
5'-ACTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
5rev
5'-AGAATGGCGTGAACCCGGGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 144 pb
6fwd
5'-GAAACTTCCCAACTTCCCTGT-3'
6rev
5'-GGCGTGAACCCGGGAGTTGG-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 142 pb
7fwd
5'-AAACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
7rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATCA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 278 pb
8fwd
5'-AACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
8rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATC-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 277 pb
9fwd
5'-CTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
9rev
5'-GGATCATGAGGTCAGGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 277 pb
10fwd 5'-ACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT
T-3'
10rev
5'-CATGAGGTCAGGAGATCAA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 305 pb
11 fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
\newpage
\global\parskip0.960000\baselineskip
11 rev
5'-TTTGGGAGGCTGAGGTGGGT-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 328 pb
122fwd
5'-AACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
122rev
5'-ACTTTGGGAGGCTGAGGTGGG-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 332 pb.
Los expertos en la técnica saben cómo pueden
seleccionarse cebadores y podrían encontrar otras alternativas para
los pares de cebadores para inclusión en un kit según la presente
divulgación. Además, los cebadores dados pueden usarse en
combinaciones distintas de las dadas. Por tanto, los cebadores de
codificación de cualquiera de los pares de cebadores dados pueden
usarse con un cebador inverso adecuado seleccionado de uno
cualquiera de los pares de cebadores dados o un cebador
completamente diferente. Los expertos en la técnica saben cómo
elegir los pares de cebadores adecuados. En ciertas realizaciones,
la longitud de los amplímeros puede ser superior a 200 pb o inferior
a 100 pb dependiendo de las condiciones de amplificación.
En ciertas realizaciones, las sondas o cebadores
pueden marcarse detectablemente. Los mareajes adecuados pueden ser
compuestos coloreados, compuestos fluorescentes, compuestos emisores
de luz, compuestos emisores de radiación o de estructura de unión
adecuada para interacción especifica con otras moléculas. Dichos
mareajes pueden comprender FITC, biotina, estreptavidina o
similares.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, la detección de mutaciones en la repetición
T-25 del gen de caspasa 2 puede usarse con fines de
diagnóstico en combinación con la detección de mutaciones en otras
regiones de microsatélites. Generalmente, puede emplearse cualquier
otra región de microsatélites conocida por estar asociada al estado
de MSI. En ciertas realizaciones de la invención, el microsatélite
de T-25 de caspasa 2 puede usarse en combinación con
los microsatélites de los genes BAT25 y/o BAT26.
Además, puede aplicarse una combinación de
repetición T-25 con microsatélite BAT40. En una
realización de la presente invención, la detección de mutaciones en
la repetición T-25 del gen de caspasa 2 puede
combinarse con la detección de mutaciones de todos o algunos genes
incluidos en el panel Bethesda (D2S123, D17S250, D5S346). En ciertas
realizaciones, pueden efectuarse combinaciones que emplean dos o
varios microsatélites para examen de diagnóstico de tejido normal.
Las combinaciones más adecuadas adicionales para la determinación
del estado de microsatélites pueden comprender la determinación de
mutaciones en una o más de las regiones de microsatélites
seleccionadas del grupo que comprende: CASP2, BAT25, BAT26, BAT40,
APdelta3, U79260, PPP3CA, CTNNB1, GTF2E1 y otras.
Los expertos en la técnica saben cómo pueden
seleccionarse los cebadores adecuados para efectuar la reacción de
la presente invención. Los cebadores adecuados de algunos de los
marcadores citados anteriormente comprenden:
- BAT40
- fwd ATTAACTTCCTACACCACAAC
- \quad
- rev GTAGAGCAAGACCACCTTG
- D2S123
- fwd AAACAGGATGCCTGCCTTTA
- \quad
- rev GGACTTTCCACCTATGGGAC
- D17S250
- fwd GGAAGAATCAAATAGACAAT
- \quad
- rev GCTGGCCATATATATATTTAAACC
- D5S346
- fwd ACTCACTCTAGTGATAAATCG
- \quad
- rev AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT
- GTF2E1
- fwd CCCTTCCTTGCTGTCACTACA
- \quad
- rev TGAACCCAGGAGGCAGAG
- PPP3CA
- fwd GTCGCAGCACTAAAAATGGA
- \quad
- rev GAAGGGCATTCAAGCACACT
- CTNNB1
- fwd AATTTAGCAAACCCTAGCCTTG
- \quad
- rev AAGAGCTACTTCAAAGCAAGCA
- APdelta3
- fwd AGCAGTGGCAGCTCAGAAAT
- \quad
- rev GCCTCTTGATCACGTCCAA
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
- U79260
- fwd TTTGTTATATCCCATTAGGTGCC
- \quad
- rev AGCCTGGTGACAGAGTGAGAC
\vskip1.000000\baselineskip
Es otro aspecto de la presente divulgación un
kit para efectuar los procedimientos dados a conocer en la presente
memoria. Un kit comprende uno o más agentes de unión que reconocen
específicamente un ácido nucleico de CASP2. En ciertas
realizaciones, los kits pueden proporcionarse en forma de
dispositivos de diagnóstico in vitro.
Un dispositivo de diagnóstico in vitro es
un kit que se pretende para estimación del diagnóstico de una
afección médicamente relevante de muestras de cuerpo humano o
animal. En ciertas realizaciones, será un dispositivo de diagnóstico
in vitro cualquier dispositivo que entre dentro del alcance
de la definición de dispositivo médico de diagnóstico in
vitro como se da en la directiva 98/79 EC, articulo 1 (b):
- \quad
- "dispositivo médico de diagnóstico in vitro" significa cualquier dispositivo médico que sea un producto reactivo, calibrador, material de control, kit, instrumento, aparato, equipo o sistema, usado solo o en combinación, que el fabricante pretende usar in vitro para el examen de especímenes, incluyendo donaciones de sangre y tejido, derivados del cuerpo humano, única o principalmente con el fin de proporcionar información referente a un estado fisiológico o patológico; o referente a una anormalidad congénita; o para determinar la seguridad y compatibilidad con receptores potenciales; o para controlar medidas terapéuticas''.
El dispositivo de diagnóstico in vitro se
aplicará también a IVD de clase I de EE.UU. y en general a
dispositivos de diagnóstico in vitro que se proporcionan sin
reivindicaciones respecto a su desempeño de diagnóstico. Por lo
tanto, se entenderá también que cualquier clase de ASR o similar es
un dispositivo de diagnóstico in vitro como se usa en la
presente memoria. En una realización, el dispositivo de diagnóstico
in vitro se caracteriza por reactivos de detección fijados a
una fase sólida específicos de una molécula marcadora.
Los agentes de unión incluidos en los kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro pueden comprender
moléculas de ácido nucleico de cualquier clase y naturaleza tales
como, por ejemplo, polinucleótidos o fragmentos de los mismos. Los
polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, moléculas
monocatenarias (de codificación o no de codificación) o
bicatenarias, y pueden ser ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN.
Las moléculas de ARN comprenden tanto ARNhn (que contiene intrones)
como ARNm (que no contiene intrones). Los polinucleótidos incluidos
en un kit pueden estar también ligados a cualquier otra molécula tal
como materiales de soporte o moléculas marcadoras de detección, y
pueden contener, pero no necesariamente, secuencias de codificación
o no codificación adicionales. Los ácidos nucleicos proporcionados
como partes de un kit pueden comprender también cualquier clase de
ácido nucleico sintético o modificado tal como polinucleótidos
sintéticos o modificados o fragmentos de los mismos, ácidos
peptidonucleicos (APN) o similares. Son conocidos tipos específicos
de dichos ácidos nucleicos sintéticos o modificados por los expertos
en la técnica. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos
sintéticos pueden comprender nucleósidos (por ejemplo, con
componentes de azúcar alterados o con componentes de purina o
pirimidina alterados, etc.) o nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos
de tiofosfato o fosforotioato) o análogos de los mismos infrecuentes
o artificiales. Dichas alteraciones pueden comprender, por ejemplo,
la introducción de mareajes tales como marcadores radiactivos (por
ejemplo, en forma de radioisótopos emisores de radiación ^{32}P,
^{35}S, ^{14}C, ^{3}H, etc.), la introducción de componentes
coloreados o fluorescentes (por ejemplo, maleimida, yodoacetamida,
etc.) o de restos de unión tales como biotina o similares en los
ácidos nucleicos. En ciertas realizaciones, la introducción de
grupos tiol en el componente de azúcar y/o pirimidina o purina (por
ejemplo, 4-tiouridina o similar) puede tener cierta
ventaja para la reacción de detección posterior. Pueden usarse
formas reactivas de tintes fluorescentes tales como, por ejemplo,
verde Oregon 488, verde de rodamina, rojo de rodamina, rojo Texas,
fluoresceina, tetrametilrrodamina, biotina, ásteres de
DSB-biotina y DNP-succinimidilo para
marcar los ácidos nucleicos para uso en los kits y los dispositivos
de diagnóstico in vitro según la presente divulgación. Según
sea el caso, los marcadores pueden acoplarse con los ácidos
nucleicos mediante espaciadores. Dichos espaciadores contienen, por
ejemplo, espaciadores de aminohexanoilo o similares. En ciertas
realizaciones, los ácidos nucleicos se modifican de modo que
permitan el análisis FRET de la reacción de hibridación. Los
procedimientos para la provisión de ácidos nucleicos modificados o
alterados son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos
anteriores de modificaciones, alteraciones y marcadores son sólo
para ejemplificación y no se pretende que limiten el alcance de la
invención. Son conocidos por los expertos en la técnica diversas
otras modificaciones y marcadores para ácidos nucleicos. En ciertas
realizaciones, puede aplicarse cualquiera de los procedimientos
conocidos en la técnica para la inclusión de ácidos nucleicos en un
kit o dispositivo de diagnóstico in vitro según la presente
divulgación.
En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos
pueden proporcionarse en forma de sondas o cebadores para efectuar
reacciones de hibridación de ácido nucleico o amplificación de ácido
nucleico. Las sondas y cebadores pueden ser de cualquier clase y
naturaleza conocida por los expertos en la técnica. Preferiblemente,
los cebadores son de un tamaño de 5 a 50 nt, más preferiblemente de
un tamaño de 10 nt a 35 nt y lo más preferiblemente de un tamaño de
15 nt a 25 nt. Los expertos en la técnica saben cómo seleccionar
cebadores adecuados para la reacción de amplificación de ácido
nucleico. El tamaño de los cebadores depende de las condiciones de
amplificación así como de la secuencia del ácido nucleico para
amplificar. Por lo tanto, bajo ciertas circunstancias, pueden
preferirse cebadores mayores, mientras que en condiciones de
amplificación estándar conocidas por los expertos en la técnica,
pueden ser aplicables los tamaños de cebador como se prefieren
anteriormente.
En ciertas realizaciones, pueden incluirse
componentes adicionales en un kit o dispositivo de diagnóstico in
vitro según la presente divulgación. Dichos componentes pueden
comprender, por ejemplo, reactivos útiles o necesarios en una
reacción de amplificación de ácido nucleico que comprenden una o más
enzimas polimerasas, sustratos para la reacción de amplificación,
tampones y/o activadores o similares.
Además, en ciertas realizaciones los kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro pueden comprender
compuestos para uso en el acondicionamiento, purificación o
concentración de muestras o ácidos nucleicos que comprenden fases
sólidas (por ejemplo, partículas, perlas, perlas magnéticas de
cualquier forma tal como, por ejemplo, en forma de columnas de
centrifugación, columnas cromatográficas o similares), dispositivos
para centrifugación o cromatografía, tubos listos para usar y/o
filtros y/o membranas. También pueden incluirse (adicionalmente) en
ciertas realizaciones de la presente invención reactivos y tampones
adecuados para la preparación de ADN genómico a partir de muestras
dadas (por ejemplo, de células, suspensiones celulares, tejidos y/o
heces y/o sangre y/o esputo). En ciertas realizaciones adicionales
de los kits y dispositivos de diagnóstico in vitro, el
empaquetado de dichos kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro puede ser adecuado para uso en sistemas automatizados.
Cada uno de los rasgos anteriores de los kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro puede aplicarse a los
kits de la presente divulgación solo o en combinación con cada uno
de los demás rasgos, en una combinación con algunos de los demás
rasgos (más de uno) o incluso en una combinación con todos los demás
rasgos dados.
En una realización, un kit puede comprender un
par de cebadores para el desempeño de una reacción de amplificación.
El par de cebadores puede dar lugar a amplímeros de una longitud de
100 pb a 200 pb. El par de cebadores puede tener en ciertas
realizaciones secuencias seleccionadas de los siguientes pares de
cebadores:
1fwd
5'-CTGCCTCAAAGGGACTGC-3'
1rev
5'-CCTTCCCGATCCTTGATAAGT-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación de 144
pb
2fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
2rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación de 148
pb
3fwd 5'-
AACCTTTATCCCTGCTTATCTGA-3'
3rev 5'- AGTTGGAGCTTGCAGTGAGC-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 148 pb
4fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
4rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 149 pb
5fwd
5'-ACTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
5rev
5'-AGAATGGCGTGAACCCGGGA-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 144 pb
6fwd
5'-GAAACTTCCCAACTTCCCTGT-3'
6rev
5'-GGCGTGAACCCGGGAGTTGG-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 142 pb
7fwd
5'-AAACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
7rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATCA-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 278 pb
8fwd
5'-AACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
8rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATC-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 277 pb
9fwd
5'-CTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
9rev
5'-GGATCATGAGGTCAGGAGA-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 277 pb
\newpage
\global\parskip0.910000\baselineskip
10fwd 5'-ACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT
T-3'
10rev
5'-CATGAGGTCAGGAGATCAA-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 305 pb
11fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
11 rev
5'-TTTGGGAGGCTGAGGTGGGT-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 328 pb
122fwd
5'-AACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
122rev
5'-ACTTTGGGAGGCTGAGGTGGG-3'
correspondiente a una longitud de producto de amplificación predicho
de 332 pb.
Los expertos en la técnica saben cómo pueden
seleccionarse cebadores y podrían encontrar otras alternativas para
los pares de cebadores para inclusión en un kit. Además, los
cebadores dados pueden usarse en combinaciones distintas de las
dadas. Por tanto, los cebadores de codificación de cualquiera de los
pares de cebadores dados pueden usarse con un cebador inverso
adecuado seleccionado de uno cualquiera de los pares de cebadores
dados o de un cebador completamente diferente. Los expertos en la
técnica saben cómo elegir los pares de cebadores adecuados. En
ciertas realizaciones, la longitud de los amplímeros puede ser
superior a 200 pb o inferior a 100 pb dependiendo de las condiciones
de la amplificación.
En ciertas realizaciones, el kit comprende
adicionalmente compuestos para la detección de mutaciones en otros
genes. Dichos genes pueden seleccionarse de un grupo que comprende,
pero sin limitación, CASP2, BAT25, BAT26, BAT40, APdelta3, U79260,
PPP3CA, CTNNB1 y GTF2E1.
Un aspecto adicional de la presente divulgación
está relacionado con el uso de sondas y cebadores específicos del
gen CASP2 dado a conocer con el número de acceso NM_032982. Las
sondas y cebadores pueden ser complementarios o complementarios
inversos de la secuencia de ácido nucleico dada en dicho número de
acceso. Las sondas o cebadores pueden ser ácidos nucleicos de
cualquier clase y naturaleza como se definen anteriormente.
Fabricar un kit o dispositivo de diagnóstico
in vitro como se usa en este contexto designa cualquier
acción que pretenda proporcionar de modo comercial a clientes un kit
o dispositivo de diagnóstico in vitro como se definen
anteriormente. Dicha acción comprende acciones tales como la
fabricación de partes de un kit o dispositivo de diagnóstico in
vitro acabado, el ensamblaje de las partes en un kit, y volver a
empaquetar, etiquetar y/o restaurar los kits o dispositivos de
diagnóstico in vitro.
A este respecto, la presente divulgación designa
también un procedimiento para el desarrollo de kits y dispositivos
de diagnóstico in vitro haciendo uso de las sondas y
cebadores específicos del gen CASP2 dado a conocer con el número de
acceso NM_032982. Dichas sondas y cebadores pueden usarse a este
respecto como ayuda en el desarrollo de kits y dispositivos de
diagnóstico in vitro o ser parte de los kits y dispositivos
de diagnóstico in vitro en desarrollo.
El desarrollo como se usa en el contexto de la
presente divulgación estará relacionado con todas las actividades de
diseño y desarrollo efectuadas para posibilitar a un fabricante la
producción controlada de un kit o dispositivo de diagnóstico in
vitro acabado pretendida para la distribución comercial o la
venta de dicho kit o dispositivo de diagnóstico in vitro. El
desarrollo de kits y dispositivos de diagnóstico in vitro
como se usan en el contexto de la presente divulgación estará
relacionado en consecuencia con todas las actividades en relación
con el diseño y desarrollo, verificación de diseño y desarrollo,
validación de diseño y desarrollo, estimación de los datos de
desempeño, evaluación de los datos de seguridad y eficacia de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro. En una realización, el
desarrollo estará relacionado con el ensayo de los resultados de
diseño y desarrollo de kits y dispositivos de diagnóstico in
vitro para adecuación respecto al uso pretendido propuesto. El
uso pretendido a este respecto se entenderá como los fines de
detección o diagnóstico para los que el kit o dispositivo de
diagnóstico in vitro se aplicará.
El procedimiento de desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro como se da a conocer en
la presente memoria puede emplear las sondas y cebadores como se dan
a conocer en la presente memoria en todas las etapas del diseño,
desarrollo, verificación, validación, provisión de datos para
solicitud de registro y autorización/aprobación, o pueden emplearse
las sondas y cebadores como se dan a conocer en la presente memoria
sólo en una o varias de las etapas citadas de diseño y desarrollo
del kit o dispositivo de diagnóstico in vitro. En una
realización, el procedimiento de desarrollo de los kits o
dispositivos de diagnóstico in vitro según la presente
divulgación es un procedimiento para el diseño y desarrollo de
dichos kits o dispositivos de diagnóstico in vitro en el que
las sondas y cebadores como se dan a conocer en la presente memoria
se usan para la verificación y/o validación del diseño y desarrollo.
En otra realización, el procedimiento de desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro es un procedimiento para
la provisión de datos para solicitud de registro y
autorización/aprobación de los kits y/o dispositivos de diagnóstico
in vitro ante las autoridades reguladoras nacionales o
regionales y/u organismos reguladores nacionales o regionales
(notificados), en el que las sondas y cebadores como se dan a
conocer en la presente memoria se usan para la provisión de datos
técnicos, datos de desempeño o datos de seguridad y eficacia
respecto al kit o dispositivo de diagnóstico in vitro. En una
realización adicional, el procedimiento de desarrollo de kits y
dispositivos de diagnóstico in vitro es un procedimiento en
el que se combinan los últimos procedimientos.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Es un aspecto adicional un sistema para la
estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes
basado en la detección de mutaciones en la repetición
T-25 de la 3'-UTR del gen CASP2. El
sistema puede comprender varios componentes incluyendo, pero sin
limitación, al menos un componente para la detección y/o evaluación
de niveles y/o intensidades de señal, en el que las señales son
indicativas de la presencia o ausencia de mutaciones en la
repetición T-25 de la 3'-UTR del gen
CASP2, al menos un componente para la correlación de los niveles y/o
intensidades de señal detectados y/o evaluados con datos clínicos,
en el que los datos clínicos están relacionados con la esperanza de
éxito y/o la eficacia de las medidas terapéuticas aplicadas a la
afección médicamente relevante bajo investigación.
El sistema puede estar informatizado en ciertas
realizaciones.
El componente para la detección y/o evaluación
de los niveles y/o intensidades de señal, en el que las señales son
indicativas de la presencia o ausencia de mutaciones en la
repetición T-25 de la 3'-UTR del gen
CASP2, puede comprender dispositivos de cualquier clase y naturaleza
aplicados para análisis de los resultados de los procedimientos
dados a conocer en la presente memoria para la detección de
mutaciones. En ciertas realizaciones, el componente puede ser un
dispositivo aplicable para la detección de señales de fluorescencia,
un dispositivo aplicable para la detección de la absorción de luz o
similar.
El componente para la correlación de los niveles
y/o intensidades de señal detectados y/o evaluados con datos
clínicos, en el que los datos clínicos están relacionados con la
esperanza de éxito y/o eficacia de las medidas terapéuticas
aplicadas a la afección médicamente relevante bajo investigación,
puede comprender un medio de almacenamiento para almacenar y/o
proporcionar información sobre la esperanza de éxito y/o eficacia de
las medidas terapéuticas en correlación con la presencia o ausencia
de mutaciones en la repetición T-25 de la
3'-UTR del gen CASP2. Dichos medios de
almacenamiento pueden ser, por ejemplo, una base de datos, una
genoteca, un fichero o cualquier otro medio adecuado. El medio de
almacenamiento puede proporcionarse de forma digital o analógica.
Los medios de almacenamiento para aplicación en un sistema según la
presente invención pueden comprender, por ejemplo,
micro(chips) de ordenadores, cualquier medio de
almacenamiento digital, formatos basados en papel, medios de
almacenamiento de base magnética, medios de almacenamiento
fotográficos, microfichas o cualquier otro formato adecuado.
El sistema puede usarse en ciertas realizaciones
para un procedimiento de estimación de la terapia adecuada de
individuos. Un aspecto adicional de la presente invención es por lo
tanto un procedimiento informatizado para crear una estrategia para
la terapia de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que
comprende i) comparar los datos que representan la presencia o
ausencia de mutaciones en la repetición T-25
localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 con datos
clínicos que comprenden información sobre la presencia o ausencia de
mutaciones en dicha repetición T-25 e información
sobre el curso de la enfermedad de los pacientes y el resultado
mediante un medio de comparación; ii) crear subgrupos de datos que
representan individuos según la presencia o ausencia de mutaciones y
suministrar los subgrupos a un medio de estimación; y iii) estimar
la comparación basada en los subgrupos de datos mediante el medio de
estimación y suministrar la estimación del medio de estimación a un
medio de ajuste de terapia, ajustando el medio de ajuste de terapia
una terapia adecuada para los individuos según la estimación. Es un
aspecto adicional de la presente divulgación ácidos nucleicos para
efectuar un procedimiento de estimación del estado de MSI de
afecciones médicamente relevantes. Dichos ácidos nucleicos pueden
comprender sondas y cebadores útiles para la detección de la
presencia o ausencia de mutaciones en la repetición
T-25 localizada en la 3'-UTR del gen
CASP2.
En una realización, los ácidos nucleicos pueden
comprender, por ejemplo, (pares de) cebadores para el desempeño de
una reacción de amplificación. Los cebadores pueden dar lugar a
amplímeros de una longitud de, por ejemplo, 100 pb a 200 pb. El par
de cebadores puede tener en ciertas realizaciones secuencias
seleccionadas de los siguientes pares de cebadores:
1fwd
5'-CTGCCTCAAAGGGACTGC-3'
1rev
5'-CCTTCCCGATCCTTGATAAGT-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación de 144
pb
2fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
2rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación de 148
pb
3fwd 5'-
AACCTTTATCCCTGCTTATCTGA-3'
3rev 5'- AGTTGGAGCTTGCAGTGAGC-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 148 pb
4fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
4rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 149 pb
5fwd
5'-ACTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
5rev
5'-AGAATGGCGTGAACCCGGGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 144 pb
6fwd
5'-GAAACTTCCCAACTTCCCTGT-3'
6rev 5' -GGCGTGAACCCGGGAGTTGG-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 142 pb
7fwd
5'-AAACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
7rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATCA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 278 pb
8fwd
5'-AACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
8rev
5'-ATCATGAGGTCAGGAGATC-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 277 pb
9fwd 5'
-CTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
9rev 5' -GGATCATGAGGTCAGGAGA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 277 pb
10fwd 5'-ACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT
T-3'
10rev
5'-CATGAGGTCAGGAGATCAA-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 305 pb
11fwd 5'
-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
11rev
5'-TTTGGGAGGCTGAGGTGGGT-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 328 pb
12fwd 5'
-AACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
12rev
5'-ACTTTGGGAGGCTGAGGTGGG-3'
correspondiente a una longitud del producto de amplificación
predicho de 332 pb.
Los expertos en la técnica saben cómo pueden
seleccionarse los cebadores y podrían encontrar otros alternativos a
los pares de cebadores para inclusión en un kit según la presente
divulgación. Además los cebadores dados pueden usarse en
combinaciones distintas de las dadas. Por tanto, los cebadores de
codificación de cualquiera de los pares de cebadores pueden usarse
con un cebador inverso adecuado seleccionado de uno cualquiera de
los pares de cebadores dados o de un cebador completamente
diferente. Los expertos en la técnica saben cómo elegir los pares de
cebadores adecuados. En ciertas realizaciones, la longitud de los
amplímeros puede ser superior a 200 pb o inferior a 100 pb,
dependiendo de las condiciones de amplificación.
La presente divulgación proporciona compuestos y
procedimientos para el desempeño mejorado de la estimación del
estado de MSI en afecciones médicamente relevantes asociadas al
MSI.
Lo siguiente se pretende únicamente como
ejemplificación de la invención y no se pretende que limite el
alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aisló ADN genómico de especímenes de CRC
fijados con formalina y embebidos en parafina (n=117) después de
microdisección manual usando un kit comercialmente disponible
(DNeasy Tissue KIT, Qiagen, Hilden, Alemania). Para la evaluación de
la distribución alélica, se aisló ADN genómico de muestras de tejido
no enfermo de donantes no relacionados (n=200).
Se llevó a cabo el tipado de la inestabilidad de
microsatélites usando el panel marcador de ICG-HNPCC
estándar como se describe en (Boland y col. 1998, Sutter y col.
1999). Se clasificaron los tumores como de microsatélites altamente
inestables (MSI-H) si más de un 30% de los
marcadores exhibían inestabilidad, de microsatélites poco inestables
(MSI-L) con inestabilidad en sólo un marcador, o de
microsatélites estables (MSS) si no se detectaron
inestabilidades.
Los cebadores de PCR para la amplificación de
T_{25}-CASP2 (fwd
5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3' y rev
5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3') se
diseñaron usando el software "Primer3" (Whitehead, MIT,
EE.UU.). Los cebadores de PCR de codificación se marcaron en 5' con
isotiocianato de fluoresceina (FITC; BAT26 y
T_{25}-CASP2) o tinte fluorescente HEX (BAT25),
respectivamente. Se llevó a cabo la PCR múltiple en un volumen de
reacción total de 25 \mul usando una concentración final de 200
\muM de dNTP, 12,5 pM de cada cebador, 1x tampón de PCR
(Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM), MgCl_{2} 1,5
mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa Taq (GIBCO/BRL, Eggenstein,
Alemania). Se usaron 50 ng de ADN genómico como molde. Se sometieron
las mezclas de reacción a las siguientes etapas: desnaturalización
inicial a 94ºC durante 5 min, seguido de 38 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 s, asociación a 55ºC durante 30
s, extensión a 72ºC durante 1 min y una etapa de extensión final a
72ºC durante 7 min. Se sometieron a electroforesis los productos de
PCR en geles de agarosa al 2%.
Para el análisis de fragmentos, se mezclaron 2
\mul de productos de PCR apropiadamente diluidos con 12 \mul de
formamida y 0,2 \mul de ROX500 de longitud estándar (Applied
Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se separaron las diluciones con
ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) usando el
conjunto de filtros D. Se analizaron tamaño, altura y perfiles de
los picos de microsatélites usando el software GeneScan 3.7 (Applied
Biosystems). El producto de PCR con el área de pico mayor se definió
como el alelo principal. Para cada tumor, se contó el número de
bases desplazadas en comparación con la mucosa normal
correspondiente, y se calcularon las deleciones medias de pares de
bases para cada marcador de microsatélite mononucleotídico. El
análisis estadístico y representaciones gráficas (diagrama
Box-Whisker, histograma) se efectuaron usando el
software Statistica 6.0 (StatSoft, Tulsa, EE.UU.).
Durante la búsqueda de microsatélites
localizados en las regiones 3' no traducidas
(3'-UTR) de genes relevantes para cáncer, se
identificó una repetición T_{25} localizada en la
3'-UTR del gen de caspasa 2 (CASP2). Para ensayar la
sensibilidad y especificidad de diagnóstico de la
T_{25}-CASP2, se analizó la inestabilidad en el
locus T_{25}-CASP2 de especímenes de cáncer
colorrectal tipados previamente en su estado de microsatélite usando
el panel marcador de ICG-HNPCC estándar (Boland y
col. 1998) como MSI-H (n=57) o no
MSI-H (MSI-L, n=10; MSS, n=50). En
todos los CRC con MSI-H, se observaron mutaciones de
T_{25}-CASP2 (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Círculos negros- mutados, círculos blancos- tipo
silvestre, n.a.- no analizable
Por tanto, la T_{25}-CASP2
superaba a los marcadores de ICG-HNPCC estándar con
las frecuencias de mutación mayores, BAT25 y BAT26, en sensibilidad
de diagnóstico del fenotipo MSI-H (mutaciones en
56/57 casos cada uno). En contraposición, no se observaron
mutaciones en ninguna de las muestras de CRC con MSS o
MSI-L (no
mostrado).
mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Para reducir adicionalmente la carga de trabajo
necesaria para el tipado de microsatélites, se evaluó la
aplicabilidad de T_{25}-CASP2 para el análisis de
MSI sin el correspondiente tejido normal. Con este fin, se requieren
marcadores con una distribución alélica monomórfica. Para ensayar si
T_{25}-CASP2 satisfacía este criterio, se
determinó la distribución de longitud alélica en ADN normal
(especímenes de tejido no tumoral y sangre periférica) de 200
donantes no relacionados. El producto de PCR más frecuentemente
observado (128 individuos, 64,0%) era de 147 pb de longitud
(designado como alelo de tipo silvestre), se detectó un producto de
146 pb en 18 casos (9,0%) y un producto de 148 pb en 54 casos
(27,0%). No se observaron alelos adicionales más cortos de 146 pb ni
más largos de 148 pb de longitud. Por tanto, se encontró que
T_{25}-CASP2 era casi monomórfica (wt \pm 1 pb,
según la definición de Hoang y col. 1997 e Ichikawa y col. 2001) en
200 muestras de ADN normal. Se representa en la Figura 1 una
comparación de las longitudes de producto obtenidas a partir de
muestras de ADN normal y muestras de CRC con
MSI-H.
MSI-H.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de MSI sin tejido de control normal
requiere un umbral que define la inestabilidad en cierto locus de
microsatélite. Para T_{25}-CASP2, no se observaron
productos más largos de 148 pb ni más cortos de 146 pb en muestras
de ADN de especímenes de CRC con MSS no tumorales. Por lo tanto,
cualquier longitud de producto <146 pb o >148 pb se definió
como indicativa de MSI en el locus T_{25}-CASP2.
En un tumor con MSI-H (HD-35), el
producto T_{25}-CASP2 amplificado a partir de ADN
tumoral era de 146 pb (correspondiente a un desplazamiento de -1
nucleótido en comparación con tejido de control normal del mismo
paciente). En este caso, el fenotipo MSI-H se habría
omitido con la amplificación de T_{25}-CASP2 a
partir de tejido tumoral solo.
Por lo tanto, se estableció un protocolo
múltiple que combina T_{25}-CASP2, BAT25 y BAT2 6
en una PRC. Al usar este enfoque, se clasificaron 117/117 (100%) de
muestras de CRC correctamente como MSI-H o no
MSI-H. Se presentan en la Figura 2 ejemplos de
patrones de fragmentos obtenidos mediante este enfoque múltiple.
Se detecta el fenotipo MSI-H más
fácilmente si está acompañado por grandes deleciones y/o inserciones
en los loci de microsatélites usados para el tipado de MSI. Para
BAT26, la deleción media de pares de bases era la mayor, con 8,8 pb
(DE \pm 3,2), seguido de CASP2 (8,1 pb \pm 2,9) y BAT25 (6,0 pb
\pm 2,3). En consecuencia, el marcador
T_{25}-CASP2 novedoso estaba en el intervalo entre
los marcadores mononucleotídicos BAT26 y BAT25 respecto a la
deleción media de pares de bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La preparación de adenomas colorrectales,
extracción de ADN y análisis de microsatélites se efectuaron como se
describe en el ejemplo 1.
Se analizaron en 14 adenomas colorrectales, que
se hablan tipado anteriormente como MSI-H usando el
panel marcador ICG-HNPCC estándar (Boland y col.
1998), los desplazamientos en la repetición mononucleotídica T25
localizada en la 3'-UTR del gen CASP2. Se representa
en la Tabla 2 la frecuencia de mutación de los loci de
microsatélites CASP2, BAT25 y BAT26.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las longitudes medias de desplazamiento
observadas en adenomas colorrectales fueron de 6,0 para CASP2, 4,6
para BAT25 y 5,0 para BAT26. Por tanto, CASP2 superó a BAT25 y BAT26
en la detección de carcinomas colorrectales de MSI-H
respecto a la sensibilidad y la longitud media de
desplazamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La preparación de muestras de tejido tumoral,
extracción de ADN y análisis de microsatélites se efectuaron como se
describe en el ejemplo 1. Para la amplificación de BAT25, se usó un
cebador oligonucleotídico no codificante alternativo
(5'-TATGGCTCTAAAATGCTCTGTTC-3'),
dando como resultado una longitud media de producto principal de 109
nt (Figura 3).
Se analizaron en malignidades extracolónicas
(n=7), que se hablan tipado anteriormente como MSI-H
usando el panel marcador ICG-HNPCC estándar (Boland
y col. 1998), los desplazamientos en la repetición mononucleotídica
T25 localizada en la 3'-UTR del gen CASP2. Para
amplificación, se aplicó un sistema múltiple que combinaba CASP2,
BAT25 y BAT26 en una reacción (descripción detallada en el ejemplo
1). Usando este enfoque, se clasificaron 7 (100%) de 7 lesiones
tumorales extracolónicas correctamente como MSI-H.
Estas lesiones comprendían cáncer endometrial (n=4), cáncer
urotelial (n=2) y cáncer de ovario (n=1). Se detectaron
desplazamientos en todos los loci mononucleotídicos ensayados en
todos los tumores. La amplificación de BAT26 y BAT25 falló en una
reacción de un carcinoma endometrial, respectivamente. Se enumeran
en la Tabla 2 las longitudes de desplazamiento para CASP2, BAT25 y
BAT26. Se presentan en la Figura 3 los patrones de pico de tumores
EC3 y
OC1.
OC1.
Longitudes de desplazamiento (nucleótidos)
observadas en lesiones tumorales extracolónicas
MSI-H (EC- cáncer endometrial, UC- cáncer urotelial,
OC- cáncer de ovario).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo por conveniencia del lector. No forma parte del
documento de patente europea. Aunque se ha tenido un gran cuidado al
recopilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y
la OEP declina cualquier responsabilidad a este respecto.
\bulletLynch; de la Chapelle.
"Microsatellite instability". N. Engl. J. Med., 17 de
julio de 2003, vol. 349 (3), 247-57.
\bulletSmyrk y col.
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Claims (8)
1. Un procedimiento de estimación del estado de
MSI de afecciones médicamente relevantes asociadas a MSI que
comprende determinar la presencia o ausencia de mutaciones en la
repetición T-25 localizada en la
3'-UTR del gen CASP2 y estimar el estado de MSI a
partir de dicha presencia o ausencia de mutaciones en la
T-25 localizada en la 3'-UTR del gen
CASP2, en el que la presencia de mutaciones es indicativa de la
presencia de un estado de MSI-H.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la afección médicamente relevante es un tumor.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que el tumor se selecciona de un grupo que comprende tumores del
tracto anogenital, tumores del tracto colorrectal, carcinoma
colorrectal, adenoma colorrectal, pólipos colorrectales, tumores del
tracto gastrointestinal, carcinoma del intestino delgado, pólipos
del intestino delgado, tumores de los conductos biliares, carcinoma
pancreático, tumores del tracto respiratorio, tumores endometriales,
carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, tumores del sistema
nervioso central, glioblastoma multiforme, meduloblastoma, tumores
de próstata, tumores de mama y carcinoma de mama.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la determinación de la presencia o
ausencia de mutaciones en la repetición T-25
localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 se lleva a
cabo usando sondas o cebadores de ácidos nucleicos como agentes de
unión para la reacción de detección.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de detección se
lleva a cabo usando una reacción de hibridación de ácido nucleico o
una reacción de amplificación de ácido nucleico.
6. Un kit para efectuar un procedimiento de
estimación del estado de MSI de afecciones médicamente relevantes
asociadas a MSI, que comprende al menos un par de cebadores que
permiten la amplificación de un ácido nucleico que comprende la
repetición T-25 localizada en la
3'-UTR del gen CASP2, seleccionados de un grupo
constituido por los pares de cebadores
- a)
- 2fwd 5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
- \quad
- 2rev 5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
- b)
- 3fwd 5'- AACCTTTATCCCTGCTTATCTGA-3'
- \quad
- 3rev 5'- AGTTGGAGCTTGCAGTGAGC-3'
- c)
- 4fwd 5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCTT-3'
- \quad
- 4rev 5'-GAGCTTGCAGTGAGCTGAGA-3'
- d)
- 5fwd 5'-ACTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
- \quad
- 5rev 5'-AGAATGGCGTGAACCCGGGA-3'
- e)
- 6fwd 5'-GAAACTTCCCAACTTCCCTGT-3'
- \quad
- 6rev 5'-GGCGTGAACCCGGGAGTTGG-3'
- f)
- 7fwd 5'-AAACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
- \quad
- 7rev 5' -ATCATGAGGTCAGGAGATCA-3'
- g)
- 8fwd 5'-AACTTCCCAACTTCCCTGTTC-3'
- \quad
- 8rev 5'-ATCATGAGGTCAGGAGATC-3'
- h)
- 9fwd 5'-CTTCCCAACTTCCCTGTTCTT-3'
- \quad
- 9rev 5' -GGATCATGAGGTCAGGAGA-3'
- i)
- 10fwd 5'-ACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT T-3'
- \quad
- 10rev 5'-CATGAGGTCAGGAGATCAA-3 '
- j)
- 11fwd 5'-CCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
- \quad
- 11 rev 5'-TTTGGGAGGCTGAGGTGGGT-3'
- k)
- 12fwd 5'-AACCTAGAAACCTTTATCCCTGCT-3'
- \quad
- 12rev 5'-ACTTTGGGAGGCTGAGGTGGG-3'.
7. Un procedimiento informatizado para crear una
estrategia para la terapia de afecciones médicamente relevantes
asociadas a MSI que comprende i) comparar los datos que representan
la presencia o ausencia de mutaciones en la repetición
T-25 localizada en la 3'-UTR del gen
CASP2 con datos clínicos que comprenden información sobre la
presencia o ausencia de mutaciones en dicha repetición
T-25 e información sobre el curso de la enfermedad
de los pacientes y el resultado mediante un medio de comparación;
ii) crear subgrupos de datos que representan individuos según la
presencia o ausencia de mutaciones y suministrar los subgrupos a un
medio de valoración; y iii) estimar la comparación basada en los
subgrupos de datos mediante el medio de valoración y suministrar la
valoración del medio de valoración a un medio de ajuste de terapia,
ajustando el medio de ajuste de terapia la terapia adecuada para
individuos según la estimación.
8. Un par de cebadores de ácido nucleico
complementarios y complementarios inversos del gen CASP2 que se
diseñan para permitir la amplificación de un ácido nucleico de 50 a
500 nt de longitud que comprende la repetición T-25
localizada en la 3'-UTR del gen CASP2 para uso en un
procedimiento de estimación del estado de MSI de afecciones
médicamente relevante asociadas a MSI según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
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