ES2337604T3 - Formas cristalinas de un compuesto bifenilico. - Google Patents

Formas cristalinas de un compuesto bifenilico. Download PDF

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Abstract

Sal o base libre farmacéuticamente aceptable cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]netilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico, que tiene la fórmula I: **(Ver fórmula)** o solvato farmacéuticamente aceptable de estas.

Description

Formas cristalinas de un compuesto bifenílico.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevas formas cristalinas de un compuesto bifenílico y sus solvatos, que se espera que sean útiles para tratar enfermedades pulmonares. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos cristalinos o preparadas a partir de tales compuestos, a procedimientos e intermedios para preparar tales compuestos cristalinos, y a métodos para usar tales compuestos para un trastorno pulmonar.
Estado de la técnica
La publicación de patente US nº 2005/0203133 de Mammen et al., cedida junto con la presente, describe nuevos compuestos bifenílicos que se espera que sean útiles para tratar trastornos pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y asma. En particular, en esta Solicitud se describe específicamente el éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico por poseer actividad antagonista del receptor muscarínico o actividad anticolinérgica.
La estructura química del éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico se representa mediante la formula I:
\vskip1.000000\baselineskip
1
El compuesto de fórmula I se ha nombrado usando el software AutoNom comercialmente disponible (MDL, San Leandro, California).
Los agentes terapéuticos útiles para tratar trastornos pulmonares o respiratorios se administran ventajosamente de forma directa al aparato respiratorio mediante inhalación. A este respecto, se han desarrollado varios tipos de dispositivos de inhalación farmacéuticos para administrar agentes terapéuticos mediante inhalación, incluyendo inhaladores de polvo seco (DPI), inhaladores de dosis medida (MDI) e inhaladores nebulizadores. Cuando se preparan composiciones y formulaciones farmacéuticas para uso en tales dispositivos, es muy deseable tener una forma cristalina del agente terapéutico que no sea ni higroscópica ni delicuescente, y que tenga un punto de fusión relativamente elevado (típicamente mayor a aproximadamente 150ºC), permitiendo de este modo que el material sea micronizado sin descomposición significativa.
No se han dado a conocer previamente formas cristalinas del compuesto de fórmula I. En consecuencia, existe la necesidad de formas cristalinas estables, no delicuescentes, del compuesto de fórmula I que tengan niveles aceptables de higroscopia y puntos de fusión relativamente elevados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona formas cristalinas de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (fórmula I). La forma cristalina puede ser una base libre, una sal farmacéuticamente aceptable tal como una sal de difosfato, monosulfato o dioxalato, o un solvato farmacéuticamente aceptable de tal sal.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las formas cristalinas de la invención no son delicuescentes, incluso cuando se exponen a humedad atmosférica. Adicionalmente, las formas cristalinas de la invención tienen niveles aceptables de higroscopia y puntos de fusión aceptables, mayores que aproximadamente 70ºC. Por ejemplo, la sal de difosfato tiene un punto de fusión de aproximadamente 150ºC.
Entre otros usos, las formas cristalinas del compuesto de fórmula I son útiles para preparar composiciones farmacéuticas que se espera que tengan utilidad tratando trastornos pulmonares. En consecuencia, un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden una forma cristalina del compuesto de fórmula I en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. En consecuencia, en una forma de realización, la invención se refiere a una composición que comprende (a) un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I; y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado de un agente antiinflamatorio esteroideo tal como corticosteroide; un agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico; un inhibidor de fosfodiesterasa-4; o una combinación de los mismos; en la que la forma cristalina y el agente se formulan juntos o separadamente. Cuando el agente se formula separadamente, se puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una disolución salina isotónica acuosa que comprende una forma cristalina del compuesto de fórmula I, en la que la disolución tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a 6. En una forma de realización particular, una formulación acuosa para nebulizador se tampona con tampón de citrato hasta un pH de aproximadamente 5. En otra forma de realización particular, la formulación acuosa para nebulizador contiene aproximadamente 0,5 mg/ml de equivalentes de base libre de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico.
En una forma de realización, esta invención proporciona un dispositivo de suministro de fármaco que comprende un inhalador de polvo seco que contiene una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una forma cristalina del compuesto de fórmula I.
El compuesto de fórmula I tiene actividad antagonista del receptor muscarínico. En consecuencia, las formas cristalinas del compuesto de fórmula I son útiles para tratar trastornos pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. De este modo, otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para uso en un método para tratar un trastorno pulmonar, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de Fórmula I para uso en un método para producir broncodilatación en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad productora de broncodilatación de una forma cristalina del compuesto de fórmula I. En una forma de realización, el compuesto se administra mediante inhalación. La invención también proporciona un compuesto de fórmula I en un método para tratar enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I. Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I para uso en un método para antagonizar un receptor muscarínico en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I.
La invención también se refiere a procedimientos para preparar formas cristalinas del compuesto de fórmula I. La invención también proporciona un procedimiento para purificar el compuesto de fórmula I, que comprende formar una sal cristalina o una base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico. La invención se refiere además a productos preparados mediante los procedimientos descritos aquí.
La invención también se refiere a una forma cristalina del compuesto de fórmula I en una forma micronizada; y a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una forma cristalina micronizada del compuesto de fórmula I.
La invención también se refiere a una forma cristalina del compuesto de fórmula I para uso en terapia o como un medicamento. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de una forma cristalina del compuesto de fórmula I para la fabricación de un medicamento, especialmente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno pulmonar o para antagonizar un receptor muscarínico en un mamífero.
Breve descripción de los dibujos
Diversos aspectos de la presente invención se ilustran haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
La Fig.1 muestra un patrón de difracción de rayos X de polvo (PXRD) de una sal cristalina de difosfato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (el compuesto de fórmula I). La Fig. 2 muestra una traza de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para esta sal cristalina. La Fig. 3 muestra una traza de análisis gravimétrico térmico (TGA) para esta sal cristalina. La Fig. 4 muestra una traza de sorción dinámica de humedad (DMS) para esta sal cristalina. La Fig. 5 es una imagen micrográfica de esta sal cristalina. La Fig. 6 y la Fig. 7 muestra un patrón de PXRD y una traza de DSC, respectivamente, para una forma menos estable de una sal cristalina de difosfato.
La Fig. 8 muestra un patrón de PXRD de una sal cristalina de monosulfato del compuesto de fórmula I. Esta sal cristalina se caracteriza además por una traza de TGA en la Fig. 9, la traza de DSC en la Fig. 10, la traza de DMS en la Fig. 11, y la imagen micrográfica en la Fig. 12.
La Fig. 13 muestra un patrón de PXRD de una sal cristalina de dioxalato del compuesto de fórmula I. Esta sal cristalina se caracteriza además por la traza de TGA en la Fig. 14, la traza de DSC en la Fig. 15, la traza de DMS en la Fig. 16, y la imagen micrográfica en la Fig. 17.
La Fig. 18 muestra un patrón de PXRD de la Forma I de la base libre del compuesto de fórmula I. Esta base libre cristalina se caracteriza además por la traza de DSC en la Fig. 19, la traza de TGA en la Fig. 20, la traza de DMS en la Fig. 21, y la imagen micrográfica en la Fig. 22.
La Fig. 23 muestra un patrón de PXRD de la Forma II de la base libre del compuesto de fórmula I. Esta base libre cristalina se caracteriza además por la traza de DSC en la Fig. 24, la traza de TGA en la Fig. 25, y la traza de DMS en la Fig. 26.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona formas cristalinas de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico. La forma cristalina puede ser una base libre, una sal farmacéuticamente aceptable, tal como una sal de difosfato, monosulfato o dioxalato, o un solvato farmacéuticamente aceptable de tal sal. En una forma de realización particular, la forma cristalina es una sal de difosfato.
Definiciones
Cuando se describen los compuestos, composiciones, métodos y procedimientos de la invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados excepto que se indique de otro modo.
El término "solvato" significa un complejo o agregado formado por una o más moléculas de un soluto, es decir, un compuesto cristalino de fórmula I, y una o más moléculas de un disolvente. Tales solvatos tienen típicamente una relación molar sustancialmente fija de soluto y disolvente. Este término también incluye clatratos, incluyendo clatratos con agua. Los disolventes representativos incluyen, a título de ejemplo, agua, metanol, etanol, isopropanol, ácido acético y similar. Cuando el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato.
La expresión "Forma I" se refiere a la base libre cristalina que se prepara mediante un método que usa agua como parte de una mezcla de disolventes como el diluyente inerte. La expresión "Forma II" se refiere a la base libre cristalina que se prepara mediante un método que usa una mezcla de disolventes orgánicos como el diluyente inerte, es decir, sin agua.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que necesita tratamiento. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz para antagonizar un receptor muscarínico es aquella cantidad que logrará el efecto antagonizante deseado. De forma similar, una cantidad terapéuticamente eficaz para tratar un trastorno pulmonar es aquella cantidad que logrará el resultado terapéuticamente deseado, que puede ser prevención, mejora, supresión o alivio de la enfermedad, como se describe más abajo.
El término "tratar" o "tratamiento", como se usa aquí, significa tratar o el tratamiento de una enfermedad o afección médica (tal como COPD) en un paciente tal como un mamífero (particularmente un ser humano), que incluye:
(a)
evitar que aparezca la enfermedad o afección médica, es decir, tratamiento profiláctico de un paciente que se cree que tiene riesgo de contraer o que está predispuesto a tal enfermedad o afección médica;
(b)
mejorar la enfermedad o afección médica, es decir, eliminar o provocar la regresión de la enfermedad o afección médica en un paciente que tiene tal enfermedad o afección médica;
(c)
suprimir la enfermedad o afección médica, es decir, ralentizar o detener el desarrollo de la enfermedad o afección médica en un paciente que tiene tal enfermedad o afección médica; o
(d)
aliviar los síntomas de la enfermedad o afección médica en un paciente que tiene tal enfermedad o afección médica.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable. Por ejemplo, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que se puede incorporar en una composición y se puede administrar a un paciente sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con otros componentes de la composición. Tales materiales farmacéuticamente aceptables típicamente han satisfecho los estándares requeridos de ensayo toxicológico y de fabricación, e incluyen aquellos materiales identificados como ingredientes inactivos adecuados por la US Food and Drug Administration.
La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a una unidad físicamente discreta adecuada para la dosificación a un paciente, es decir, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un compuesto de la invención calculada para producir el efecto terapéutico deseado, ya sea sola o en combinación con una o más unidades adicionales. Por ejemplo, tales formas farmacéuticas unitarias pueden ser cápsulas, comprimidos, pastillas y similares.
Síntesis
Los compuestos cristalinos de la invención se pueden sintetizar a partir de materiales de partida fácilmente disponibles como se describe más abajo y en los Ejemplos. Se apreciará que aunque se dan condiciones específicas del procedimiento (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones en moles de agentes reaccionantes, disolventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones del procedimiento, excepto que se establezca de otro modo. Generalmente, las reacciones se llevan a cabo en un diluyente inerte adecuado, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, acetato de etilo, acetonitrilo, diclorometano, metil-t-butil-éter, y similares, y sus mezclas, típicamente que contienen agua. Al terminar cualquiera de las reacciones anteriores, los compuestos cristalinos se pueden aislar de la mezcla de reacción por cualquier medio convencional tal como precipitación, concentración, centrifugación y similar.
El éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico empleado en la invención se puede preparar fácilmente a partir de materiales de partida y reactivos comercialmente disponibles usando los procedimientos descritos en los Ejemplos, o usando los procedimientos descritos en la publicación de patente US nº 2005/0203133 de Mammen et al.
Las relaciones molares descritas en los métodos de la invención se pueden determinar fácilmente por diversos métodos disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, tales relaciones molares se pueden determinar fácilmente mediante RMN ^{1}H. Como alternativa, se pueden usar métodos de análisis elemental y de HPLC para determinar la relación molar.
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Cristal de sal de difosfato
Una sal de difosfato de la invención contiene típicamente entre aproximadamente 1,8 y 2,2 equivalentes molares de fosfato por equivalente molar del compuesto de fórmula I; incluyendo entre aproximadamente 1,9 y 2,1 equivalentes molares de fosfato por equivalente molar del compuesto de fórmula I.
En general, una sal cristalina de difosfato del compuesto de fórmula I o su solvato farmacéuticamente aceptable se puede preparar poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido fosfórico. Por ejemplo, el éster se puede poner en contacto con ácido fosfórico acuoso diluido para formar una sal amorfa de difosfato, que entonces se pone en contacto con un diluyente inerte.
Para preparar la sal amorfa de difosfato, el éster se disuelve típicamente en ácido fosfórico acuoso, se diluye con agua y se aísla mediante liofilización. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0 y 30ºC, tal como aproximadamente 24ºC. La relación de miligramos del éster a microlitros de ácido fosfórico 1M es aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:4, incluyendo aproximadamente 1:3,5. La sal amorfa de difosfato resultante se pone entonces en contacto típicamente con aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 50 y 70ºC, tal como aproximadamente 60ºC.
En una forma de realización particular, se recogen 500 mg del éster en 5 ml de agua y 1,5 ml de ácido fosfórico 1M. El pH se ajusta hasta aproximadamente pH 5,3 con ácido fosfórico 1M adicional (que es igual a 2,1 equivalentes molares). La disolución transparente se filtra, se congela y se liofiliza hasta sequedad para proporcionar una sal amorfa de difosfato. La sal amorfa de difosfato resultante se añade a una disolución de isopropanol:acetonitrilo (1:1), seguido de la adición de agua. En esta reacción, la relación de miligramos de la sal amorfa de difosfato a mililitros de isopropanol:acetonitrilo es aproximadamente 2:0,9 a aproximadamente 2:2, incluyendo aproximadamente 2:1.
Como alternativa, una sal cristalina de difosfato se puede preparar poniendo en contacto el éster con aproximadamente 2,0 a aproximadamente 2,1 equivalentes molares de ácido fosfórico. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo en un diluyente inerte a una temperatura comprendida entre aproximadamente 40 y 60ºC, tal como aproximadamente 50ºC. En una forma de realización particular, el éster se añade a una disolución de isopropanol:acetonitrilo (1:1), seguido de la adición de agua. Tras calentar, se añade ácido fosfórico. En esta reacción, la relación de gramos del éster a mililitros de ácido fosfórico es aproximadamente 5:14 a aproximadamente 5:18, incluyendo aproximadamente 5:16.
Ambos procedimientos mencionados anteriormente para preparar sales cristalinas de difosfato pueden conducir a la formación de una forma cristalina de difosfato separada, menos estable. La Fig. 6 y la Fig. 7 muestra un patrón de PXRD y una traza de DSC, respectivamente, para esta forma menos estable. El cristal de difosfato menos estable es la forma prevalente; sin embargo, cuando está presente la forma de difosfato menos estable, se puede convertir fácilmente al cristal más estable incrementando el contenido de agua en la mezcla de disolventes, y recalentando la suspensión hasta alrededor 50ºC a aproximadamente 70ºC, típicamente aproximadamente 60ºC, durante aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas, típicamente aproximadamente 2 horas, seguido del enfriamiento hasta la temperatura ambiente toda la noche con agitación lenta.
Cristal de sal de monosulfato
Una sal de monosulfato de la invención contiene típicamente entre aproximadamente 0,8 y 1,2 equivalentes molares de sulfato por equivalente molar del compuesto de fórmula I; incluyendo entre aproximadamente 0,9 y 1,1 equivalentes molares de sulfato por equivalente molar del compuesto de fórmula I.
Una sal cristalina de monosulfato del compuesto de fórmula I o su solvato farmacéuticamente aceptable se puede preparar poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido sulfúrico. Por ejemplo, el éster se puede poner en contacto con ácido sulfúrico acuoso 1N para formar una sal de monosulfato, que entonces se pone en contacto con un diluyente inerte.
Para preparar la sal de monosulfato, el éster se disuelve típicamente en acetonitrilo:agua 1:1, se diluye con ácido sulfúrico acuoso, se diluye con agua y se aísla mediante liofilización. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0 a 30ºC, tal como aproximadamente 24ºC. La relación de miligramos del éster a mililitros de ácido sulfúrico 1N en agua es aproximadamente 325 mg/ml a aproximadamente 285 mg/ml, incluyendo aproximadamente 305 mg/ml. En una forma de realización particular, 442 mg del éster se recogen en 5 ml de acetonitrilo:agua 1:1, y se añaden lentamente 1,45 ml de ácido sulfúrico 1N, mientras se monitoriza el pH. El pH se ajusta entonces hasta aproximadamente pH 3,3. La disolución transparente se filtra, se congela y se liofiliza hasta sequedad para proporcionar una sal de monosulfato. La sal de monosulfato resultante se pone entonces en contacto típicamente con aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de diluyente inerte. En una forma de realización, esta reacción se lleva a cabo a una primera temperatura, y después a una segunda temperatura más baja, estando comprendidas ambas temperaturas entre 50 y 80ºC, tal como entre 60ºC y 70ºC. En una forma de realización particular, la sal de monosulfato se añade a una disolución de isopropanol:acetonitrilo (10:1). En esta reacción, la relación de miligramos de la sal de monosulfato a mililitros de isopropanol:acetonitrilo es aproximadamente 15:3 a aproximadamente 15:0,8, incluyendo aproximadamente 15:1.
En otra forma de realización, esta reacción se lleva a cabo a una primera temperatura y después a dos ciclos de menor temperatura. La primera temperatura está comprendida entre 50 y 80ºC, tal como aproximadamente 70ºC. El primer ciclo de menor temperatura está comprendido entre 60ºC y 30ºC. El segundo ciclo de menor temperatura está comprendido entre 40ºC y 30ºC. En una forma de realización particular, la sal de monosulfato se añade a una disolución de isopropanol:acetonitrilo (10:1). En esta reacción, la relación de miligramos de la sal de monohidrato a mililitros de isopropanol:acetonitrilo está comprendida entre 161:7 y 161:11, incluyendo aproximadamente 161:9.
Cristal de sal de dioxalato
Una sal de dioxalato de la invención contiene típicamente entre aproximadamente 1,8 y 2,2 equivalentes molares de oxalato por equivalente molar del compuesto de fórmula I; incluyendo entre aproximadamente 1,9 y 2,1 equivalentes molares de oxalato por equivalente molar del compuesto de fórmula I.
Una sal cristalina de dioxalato del éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico o su solvato farmacéuticamente aceptable se puede preparar poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido oxálico. Por ejemplo, el éster se puede poner en contacto con ácido oxálico acuoso 1M para formar una sal de dioxalato, que entonces se pone en contacto con un diluyente inerte.
Para preparar la sal de dioxalato, el éster se disuelve típicamente en acetonitrilo:agua 1:1, se diluye con ácido oxálico acuoso, se diluye con agua y se aísla mediante liofilización. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0 y 30ºC, tal como aproximadamente 24ºC. La relación de miligramos del éster a mililitros de ácido oxálico acuoso 1N es aproximadamente 320 mg/ml a aproximadamente 280 mg/ml, incluyendo aproximadamente 300 mg/ml. En una forma de realización particular, 510 mg del éster se recogen en 5 ml de acetonitrilo:agua 1:1, y se añaden lentamente 1,7 ml de ácido oxálico acuoso 1M, mientras se monitoriza el pH. El pH se ajusta entonces hasta aproximadamente pH 3,0. La disolución transparente se filtra, se congela y se liofiliza hasta sequedad para proporcionar una sal de dioxalato.
En una forma de realización, la sal de dioxalato resultante se pone entonces en contacto típicamente con aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 50 y 70ºC, tal como aproximadamente 60ºC. En una forma de realización particular, la sal de dioxalato se añade a una disolución de isopropanol:agua (94:6). En esta reacción, la relación de miligramos de la sal de dioxalato a mililitros de isopropanol:agua es aproximadamente 10:0,8 a aproximadamente 10:3, incluyendo aproximadamente 10:1.
Una sal cristalina de dioxalato también se puede preparar formando un cristal de siembra de una sal cristalina de dioxalato del éster (sintetizada como se describe anteriormente), formando una sal de dioxalato del éster poniendo en contacto el éster con ácido oxálico y disolviendo la sal en un diluyente inerte para forma una disolución, y añadiendo el cristal de siembra a la disolución.
En una forma de realización, una sal de dioxalato se pone típicamente en contacto con aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una primera temperatura comprendida entre aproximadamente 50 y 70ºC, tal como aproximadamente 60ºC. La mezcla se enfría entonces hasta una segunda temperatura comprendida entre aproximadamente 3 y hasta 10ºC, tal como aproximadamente 4ºC. Entonces se añade el cristal de siembra de una sal cristalina de dioxalato del éster. En una forma de realización particular, la sal de dioxalato se añade a una disolución de isopropanol:agua (94:6). En esta reacción, la relación de miligramos de la sal de dioxalato a mililitros de isopropanol:agua es aproximadamente 150:10 a aproximadamente 150:16, incluyendo aproximadamente 150:13.
Cristal de base libre
Una base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico o su solvato farmacéuticamente aceptable se puede preparar poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico con un diluyente inerte.
Para preparar una forma de una base libre cristalina (Forma 1), el éster se pone en contacto típicamente con alrededor 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 y 30ºC, tal como aproximadamente 15ºC. En una forma de realización particular, el éster se añade a una disolución de agua:acetonitrilo (1:1). En esta reacción, la relación de miligramos del éster a mililitros de agua:acetonitrilo es aproximadamente 100:0,3 a aproximadamente 100:1, incluyendo aproximadamente 100:0,5. Como alternativa, la reacción se puede llevar a cabo a una primera temperatura comprendida entre aproximadamente 20 y 30ºC, tal como aproximadamente 25ºC, y después se enfría hasta una segunda temperatura comprendida entre aproximadamente 3 y 10ºC, tal como aproximadamente 4ºC.
Una base libre cristalina también se puede preparar formando un cristal de siembra de una base libre cristalina (sintetizada como se describe anteriormente), formando una base libre cristalina poniendo en contacto el éster con un diluyente inerte y disolviendo el éster cristalino resultante para formar una disolución, y añadiendo el cristal de siembra a la disolución.
En una forma de realización, el éster se pone típicamente en contacto con aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una primera temperatura comprendida entre aproximadamente 50 y 70ºC, tal como aproximadamente 60ºC. La mezcla se enfría entonces hasta una segunda temperatura comprendida entre aproximadamente 3 y 10ºC, tal como aproximadamente 4ºC. Entonces se añade el cristal de siembra de una base libre cristalina del éster, seguido de varios ciclos de calentamiento y enfriamiento. El primer ciclo de calentamiento oscila, por ejemplo, desde aproximadamente 30 hasta 40ºC, y después hasta aproximadamente 50ºC, seguido del enfriamiento hasta la temperatura ambiente. El segundo, tercer y cuarto ciclo de calentamiento implica calentar la muestra hasta una temperatura comprendida entre aproximadamente 50 y 70ºC, tal como aproximadamente 60ºC, seguido del enfriamiento hasta la temperatura ambiente. En una forma de realización particular, el éster se añade a una disolución de agua:acetonitrilo (1:1), seguido de la adición de agua y más acetonitrilo. En esta reacción, la relación de miligramos del éster a mililitros de acetonitrilo y agua es aproximadamente 230:0,1 a aproximadamente 230:0,5, incluyendo aproximadamente 230:0,2.
Para preparar otra forma de una base libre cristalina (Forma II), el éster se pone típicamente en contacto con aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de diluyente inerte. Generalmente, esta reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 y 30ºC, tal como aproximadamente 25ºC. Un diluyente inerte particularmente adecuado es una combinación de acetonitrilo y metil-t-butil-éter. En una forma de realización particular, el éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico se añade a acetonitrilo, seguido de la adición de metil-t-butil-éter y acetonitrilo adicional. En esta reacción, la relación de miligramos del éster a mililitros de acetonitrilo:metil-t-butil-éter (disolución 1:2) es aproximadamente 200 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, incluyendo aproximadamente 70:0,45.
Propiedades cristalinas
Entre otras ventajas, se ha descubierto que la formación de un compuesto cristalino de fórmula I es útil para purificar el compuesto de fórmula I. Por ejemplo, la sal cristalina de difosfato tiene una pureza mayor de 96%, y típicamente mayor de 98%.
Como es bien conocido en el campo de la difracción de rayos X de polvo (PXRD), las alturas relativas de los picos de los espectros de PXRD dependen de un número de factores relacionados con la preparación de la muestra y la geometría del instrumento, mientras que las posiciones de los picos son relativamente insensibles a detalles experimentales. De este modo, en una forma de realización, los compuestos cristalinos de la invención se caracterizan por un patrón de PXRD que tiene ciertas posiciones de los picos.
En una forma de realización, una sal cristalina de difosfato del compuesto de fórmula I se caracteriza por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 6,4\pm0,2, 7,6\pm0,2, 8,6\pm0,2, 13,7\pm0,2, 15,0\pm0,2, 19,4\pm0,2, 21,6\pm0,2, 22,1\pm0,2, 22,9\pm0,2, y 23,7\pm0,2. En una forma de realización particular, esta forma cristalina se caracteriza por un patrón de PXRD que comprende picos de difracción a valores 2\theta de 15,0\pm0,2, 19,4\pm0,2, 21,6\pm0,2, y 23,7\pm0,2. En otra forma de realización, una sal cristalina de difosfato se caracteriza por un patrón de PXRD en el que las posiciones de los picos están sustancialmente de acuerdo con aquellas mostradas en la Fig. 1. Obsérvense las diferencias entre el patrón de PXRD en la Fig. 1 y el patrón de PXRD para la sal de difosfato menos estable según se representa en la Fig. 6.
En una forma de realización, una sal cristalina de monosulfato del compuesto de fórmula I se caracteriza por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 7,7\pm0,2, 8,4\pm0,2, 8,8\pm0,2, 12,6\pm0,2, 13,7\pm0,2, 14,1\pm0,2, 15,3\pm0,2, 16,0\pm0,2, 19,7\pm0,2, 20,6\pm0,2, 23,0\pm0,2, y 24,4\pm0,2. En una forma de realización particular, esta forma cristalina se caracteriza por un patrón de PXRD que comprende picos de difracción a valores 2\theta de 12,6\pm0,2, 19,7\pm0,2, 23,0\pm0,2, y 24,4\pm0,2. En otra forma de realización, una sal cristalina de monosulfato se caracteriza por un patrón de PXRD en el que las posiciones de los picos están sustancialmente de acuerdo con aquellas mostradas en la Fig. 8.
En una forma de realización, una sal cristalina de dioxalato del compuesto de fórmula I se caracteriza por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 7,7\pm0,2, 8,7\pm0,2, 13,5\pm0,2, 14,0\pm0,2, 14,8\pm0,2, 15,4\pm0,2, 15,8\pm0,2, 19,4\pm0,2, 22,9\pm0,2, 23,3\pm0,2, y 24,6\pm0,2. En una forma de realización particular, esta forma cristalina se caracteriza por un patrón de PXRD que comprende picos de difracción a valores 2\theta de 8,7\pm0,2, 14,0\pm0,2, 19,4\pm0,2, y 22,9\pm0,2. En otra forma de realización, una sal cristalina de dioxalato se caracteriza por un patrón de PXRD en el que las posiciones de los picos están sustancialmente de acuerdo con aquellas mostradas en la Fig. 13.
En una forma de realización, una base libre cristalina (Forma 1) del compuesto de fórmula I se caracteriza por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 4,7\pm0,2, 9,6\pm0,2, 12,7\pm0,2, 13,7\pm0,2, 16,7\pm0,2, 17,4\pm0,2, 18,5\pm0,2, 19,4\pm0,2, 20,8\pm0,2, 21,4\pm0,2, 24,2\pm0,2, y 25,6\pm0,2. En una forma de realización particular, esta forma cristalina se caracteriza por un patrón de PXRD que comprende picos de difracción a valores 2\theta de 4,7\pm0,2, 18,5\pm0,2, 20,8\pm0,2, y 25,6\pm0,2. En otra forma de realización, una base libre cristalina (Forma I) se caracteriza por un patrón de PXRD en el que las posiciones de los picos están sustancialmente de acuerdo con aquellas mostradas en la Fig. 18.
En una forma de realización, una base libre cristalina (Forma II) del compuesto de fórmula I se caracteriza por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 4,6\pm0,2, 9,3\pm0,2, 12,9\pm0,2, 13,6\pm0,2, 14,0\pm0,2, 14,6\pm0,2, 16,5\pm0,2, 18,6\pm0,2, 19,1\pm0,2, 20,9\pm0,2, 22,1\pm0,2, 22,7\pm0,2, y 25,7\pm0,2. En una forma de realización particular, esta forma cristalina se caracteriza por un patrón de PXRD que comprende picos de difracción a valores 2\theta de 4,6\pm0,2, 18,6\pm0,2, 22,1\pm0,2, y 22,7\pm0,2. En otra forma de realización, una base libre cristalina (Forma II) se caracteriza por un patrón de PXRD en el que las posiciones de los picos están sustancialmente de acuerdo con aquellas mostradas en la Fig. 23.
Todavía en otra forma de realización, los compuestos cristalinos de fórmula I se caracterizan por su traza de calorimetría diferencial de barrido (DSC). De este modo, una sal cristalina de difosfato del compuesto de fórmula I se caracteriza por su traza de DSC que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 154,5ºC, como se ilustra en la Fig. 2. Obsérvese la diferencia entre la traza de DSC en la Fig. 2 y la traza de DSC para la sal de difosfato menos estable representada en la Fig. 7. La traza de DSC para la sal cristalina estable de difosfato (Fig. 2) muestra una transición a baja temperatura típica, seguido de un pico relativamente intenso a aproximadamente 154,5ºC. Por otro lado, la traza de DSC para la sal cristalina inestable de difosfato (Fig. 7) muestra un hombro distinto antes de una temperatura de fusión mucho más pequeña a aproximadamente 150,3ºC.
De forma similar, una sal cristalina de monosulfato del compuesto de fórmula I se caracteriza por su traza de DSC, que mostró un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 76,5ºC, como se ilustra en la Fig. 10; una sal cristalina de dioxalato se caracteriza por su traza de DSC que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 73,7ºC, como se ilustra en la Fig. 15; una base libre cristalina (Forma I) se caracteriza por su traza de DSC que mostró un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 102,7ºC, como se ilustra en la Fig. 19; y una base libre cristalina (Forma II) se caracteriza por su traza de DSC, que mostró un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 98,6ºC, como se ilustra en la Fig. 24.
Se ha demostrado que los compuestos cristalinos de la invención tienen un perfil reversible de sorción/desorción con un nivel moderado aceptable de higroscopia: una sal cristalina de difosfato del compuesto de fórmula I muestra una ganancia de peso menor de 2% cuando se expone a una humedad relativa de hasta 90%; una sal cristalina de monosulfato muestra una ganancia de peso menor de 4% cuando se expone a una humedad relativa de hasta 90%; una sal cristalina de dioxalato muestra una ganancia de peso menor de 3% cuando se expone a una humedad relativa de hasta 90%; una base libre cristalina (Forma I) muestra una ganancia de peso menor de 6% cuando se expone a una humedad relativa de hasta 90%; y una base libre cristalina (Forma II) muestra una ganancia de peso menor de 4% cuando se expone a una humedad relativa de hasta 90%.
Adicionalmente, se ha encontrado que los compuestos cristalinos de la invención son estables al exponerlos a temperatura elevada y humedad. Por ejemplo, después del almacenamiento durante un mes a 40ºC y 75% de humedad relativa, el análisis mediante cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) no mostró ninguna degradación química detectable (es decir, una degradación menor de 0,5%) para los compuestos cristalinos de la invención.
Estas propiedades de los compuestos cristalinos de la invención se ilustran adicionalmente en los Ejemplos a continuación.
Composiciones y formulaciones farmacéuticas
El compuesto cristalino de fórmula I se administra típicamente a un paciente en forma de una composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones farmacéuticas se pueden administrar al paciente mediante cualquier vía aceptable de administración, incluyendo, pero sin limitarse a, los modos inhalado, oral, nasal, tópico (incluyendo transdérmico) y parenteral de administración. Sin embargo, se entenderá por los expertos en la materia que, una vez que se ha formulado la sal cristalina de la invención, puede no estar más en forma cristalina, es decir, la sal se puede disolver en un vehículo adecuado.
En consecuencia, en una forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y un éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Si se desea, la composición farmacéutica puede contener otros agentes terapéuticos y/o de formulación.
Las composiciones farmacéuticas de la invención típicamente contienen, como agente activo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Típicamente, tales composiciones farmacéuticas contendrán desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 95% en peso del agente activo; incluyendo desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 30% en peso, tal como desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 10% en peso del agente activo.
En las composiciones farmacéuticas de la invención se puede usar cualquier vehículo o excipiente convencional. La elección de un vehículo o excipiente particular, o combinación de vehículos o excipientes, dependerá del modo de administración que se use para tratar un paciente particular o tipo de afección médica o enfermedad. A este respecto, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo particular de administración está dentro del alcance de los expertos en las técnicas farmacéuticas. Adicionalmente, los ingredientes para tales composiciones están comercialmente disponibles en, por ejemplo, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. A título de ilustración adicional, las técnicas de formulación convencionales se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7ª edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Los ejemplos representativos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de haba de soja; glicoles como propilenglicol; polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar-agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones tamponadas con fosfato; gases propelentes comprimidos tales como clorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se preparan típicamente mezclando o amasando a conciencia e íntimamente un compuesto de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes opcionales. Si es necesario o se desea, la mezcla resultante uniformemente amasada se puede entonces conformar o cargar en comprimidos, cápsulas, pastillas, botes, cartuchos, dispensadores, y similares, usando procedimientos y equipo convencionales.
En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para administración inhalada. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración inhalada estarán típicamente en forma de un aerosol o un polvo. Tales composiciones se administran generalmente usando dispositivos de suministro bien conocidos tales como un inhalador nebulizador, un inhalador de dosis medida (MDI), un inhalador de polvo seco (DPI) o un dispositivo de suministro similar.
En una forma de realización específica de la invención, la composición farmacéutica que comprende el agente activo se administra mediante inhalación usando un inhalador nebulizador. Tales dispositivos nebulizadores producen típicamente una corriente de aire a alta velocidad que provoca que la composición farmacéutica que comprende el agente activo se pulverice como una niebla que es llevada al aparato respiratorio del paciente. En consecuencia, cuando se formula para uso en un inhalador nebulizador, el agente activo se disuelve típicamente en un vehículo adecuado para formar una disolución. Los dispositivos nebulizadores adecuados están comercialmente disponibles, por ejemplo, de PARI GmbH (Starnberg, Alemania). Otros dispositivos nebulizadores incluyen Respimat (Boehringer Ingelheim), y aquellos descritos, por ejemplo, en la patente US nº 6.123.068 de Lloyd et al. y el documento WO 97/12687 (Eicher et al.), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Una composición farmacéutica representativa para uso en un inhalador nebulizador comprende una disolución acuosa que comprende desde aproximadamente 0,05 \mug/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml de un compuesto cristalino de fórmula I o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En una forma de realización, la formulación acuosa es isotónica. En una forma de realización, la formulación acuosa tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a 6. En una forma de realización particular, la formulación acuosa está tamponada con tampón de citrato hasta un pH de aproximadamente 5. En otra forma de realización particular, la formulación acuosa contiene desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,0 mg/ml de equivalentes de base libre de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico.
En otra forma de realización específica de la invención, la composición farmacéutica que comprende el agente activo se administra mediante inhalación usando un DPI. Tales DPI administran típicamente el agente activo como un polvo que fluye libremente que se dispersa en una corriente de aire del paciente durante la inspiración. A fin de lograr de lograr un polvo que fluya libremente, el agente activo se formula típicamente con un excipiente adecuado tal como lactosa o almidón. La micronización es un método habitual para reducir el tamaño del cristal a aquel adecuado para el suministro pulmonar. Típicamente, el agente activo se microniza y se combina con un vehículo adecuado para formar una suspensión de partículas micronizadas de tamaño respirable, en la que "partículas micronizadas" o "forma micronizada" significa que al menos aproximadamente 90% de las partículas tienen un diámetro menor que aproximadamente 10 \mum. También se pueden usar otros métodos reductores del tamaño de partículas, tales como molienda fina, corte, aplastamiento, machacamiento, molienda, tamizado, trituración, pulverización, etc., en tanto que se pueda obtener el tamaño deseado de partículas.
Una composición farmacéutica representativa para uso en un DPI comprende lactosa seca que tiene un tamaño de partículas entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 100 \mum, y partículas micronizadas de un compuesto cristalino de fórmula I, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Tal formulación de polvo seco se puede obtener, por ejemplo, combinando la lactosa con el agente activo y después amasando en seco los componentes. Como alternativa, si se desea, el agente activo se puede formular sin un excipiente. La composición farmacéutica se carga entonces típicamente en un dispensador de polvo seco, o en cartuchos para inhalación o cápsulas para uso con un dispositivo de suministro de polvo seco.
Los ejemplos de dispositivos de suministro de DPI incluyen Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC; véase, por ejemplo, la patente US nº 5.035.237 de Newell et al.); Diskus (GlaxoSmithKline; véase, por ejemplo, la patente US nº 6.378.519 de Davies et al.); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE; véase, por ejemplo, la patente US nº 4.524.769 de Wetterlin); Rotahaler (Glaxo-SmithKline; véase, por ejemplo, la patente US nº 4.353.365 de Hallworth et al.) y Handihaler (Boehringer Ingelheim). Otros ejemplos de dispositivos adecuados de DPI se describen en las patentes US nº 5.415.162 de Casper et al., nº 5.239.993 de Evans, y nº 5.715.810 de Armstrong et al., y referencias citadas allí. Las descripciones de las patentes mencionadas anteriormente se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Todavía en otra forma de realización específica de la invención, la composición farmacéutica que comprende el agente activo se administra mediante inhalación usando un MDI, que descarga típicamente una cantidad medida del agente activo, o una sal o solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, usando un gas propelente comprimido. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas administradas usando un MDI comprenden típicamente una disolución o suspensión del agente activo en un propelente licuado. Se puede emplear cualquier propelente licuado adecuado, incluyendo clorofluorocarbonos tales como CCI_{3}F, e hidrofluoroalcanos (HFA) tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano (HFA 227). Debido a preocupaciones sobre cómo los clorofluorocarbonos afectan a la capa de ozono, generalmente se prefieren las formulaciones que contienen HFA. Componentes opcionales adicionales de las formulaciones de HFA incluyen codisolventes tales como etanol o pentano, y tensioactivos tales como trioleato de sorbitán, ácido oleico, lecitina, y glicerina. Véanse, por ejemplo, la patente US nº 5.225.183 de Purewal et al., el documento EP 0717987 A2 (Minnesota Mining and Manufacturing Company), y el documento WO 92/22286 (Minnesota Mining and Manufacturing Company), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Una composición farmacéutica representativa para uso en un inhalador de dosis medida comprende desde aproximadamente 0,01 hasta 5% en peso de un compuesto cristalino de fórmula I, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; desde aproximadamente 0 hasta 20% en peso de etanol; y desde aproximadamente 0 hasta 5% en peso de tensioactivo; siendo el resto un propelente de HFA.
Tales composiciones se preparan típicamente añadiendo hidrofluoroalcano enfriado o a presión a un recipiente adecuado que contiene el agente activo, etanol (si está presente) y el tensioactivo (si está presente). Para preparar una suspensión, el agente activo se microniza y entonces combina con el propelente. La formulación se carga entonces en un bote de aerosol, que forma una parte de un dispositivo inhalador de dosis medida. Ejemplos de dispositivos inhaladores de dosis medida, desarrollados específicamente para uso con propelentes de HFA, se describen en las patentes US nº 6.006.745 de Marecki y nº 6.143.277 de Ashurst et al. Como alternativa, una formulación en suspensión se puede preparar secando por pulverización un revestimiento de tensioactivo sobre partículas micronizadas del agente activo. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 99/53901 (Glaxo Group Ltd.) y WO 00/61108 (Glaxo Group Ltd.). Las descripciones de las patentes y publicaciones mencionadas anteriormente se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Para ejemplos adicionales de procedimientos para preparar partículas respirables, y formulaciones y dispositivos adecuados para la dosificación por inhalación, véanse las patentes US nº 6.268.533 de Gao et al., nº 5.983.956 de Trofast; nº 5.874.063 de Briggner et al.; y nº 6.221.398 de Jakupovic et al.; y el documento WO 99/55319 (Glaxo Group Ltd.) y WO 00/30614 (AstraZeneca AB); cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su tota-
lidad.
En otra forma de realización, las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para administración oral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, pastillas, tabletas, saquitos, grageas, polvos, gránulos; o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similar; conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de una sal de la invención como ingrediente activo. La composición farmacéutica se puede envasar en una forma farmacéutica unitaria.
Cuando se destinan a la administración oral en una forma farmacéutica sólida (es decir, como cápsulas, comprimidos, pastillas y similares), las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán típicamente un compuesto cristalino de la presente invención como el ingrediente activo, y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico. Opcional o alternativamente, tales formas farmacéuticas sólidas también pueden comprender: cargas o extendedores tales como almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes tales como glicerol; agentes disgregantes como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y/o carbonato de sodio; agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como alcohol cetílico y/o monoestearato de glicerol; absorbentes tales como caolín y/o arcilla bentonita; lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y/o mezclas de los mismos; agentes colorantes; y agentes tamponantes.
En las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar presentes agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfato de sodio, sulfuro de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Los agentes de revestimiento para comprimidos, cápsulas, pastillas y similares, incluyen los usados para revestimientos entéricos, tales como acetato-ftalato de celulosa (CAP), poliacetato-ftalato de vinilo (PVAP), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, copolímeros de ácido metacrílico-éster de ácido metacrílico, acetato-trimelitato de celulosa (CAT), carboximetiletilcelulosa (CMEC), acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), y similares.
Si se desea, las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo usando, a título de ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables, u otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.
Además, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener opcionalmente agentes opacificantes, y se pueden formular de forma que liberen el ingrediente activo sólo, o preferentemente, en cierta porción del tubo digestivo, opcionalmente de manera retrasada. Los ejemplos de composiciones embebedoras que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas farmacéuticas líquidas adecuadas para administración oral incluyen, a título de ilustración, emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Tales formas farmacéuticas líquidas comprenden típicamente el ingrediente activo y un diluyente inerte tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (especialmente aceites de semilla de algodón, de nuez molida, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y sus mezclas. Las suspensiones, además del ingrediente activo, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y sus mezclas.
Los compuestos cristalinos de la invención también se pueden administrar transdérmicamente usando sistemas de suministro transdérmico y excipientes conocidos. Por ejemplo, un compuesto de la invención se puede mezclar con potenciadores de la permeación tales como propilenglicol, monolaurato de polietilenglicol, azacicloalcan-2-onas y similares, y se puede incorporar en un parche o un sistema de suministro similar. En tales composiciones transdérmicas, si se desea, se pueden usar excipientes adicionales, incluyendo agentes gelantes, emulsionantes y tampones.
Los compuestos cristalinos de la invención también se pueden coadministrar con otros agentes terapéuticos. Esta terapia de combinación implica usar un compuesto de la invención combinado con uno o más de estos agentes secundarios, ya sea formulados juntos (es decir, envasados juntos en una única formulación) o formulados separadamente (por ejemplo, envasados como formas farmacéuticas unitarias separadas). Los métodos para formular juntos múltiples agentes en la misma formulación o en formas farmacéuticas unitarias separadas son bien conocidos en la técnica.
El agente o agentes terapéuticos adicionales se pueden seleccionar de otros broncodilatadores (por ejemplo, inhibidores de PDE_{3}, moduladores 2b de adenosina, y agonistas de receptores \beta_{2} adrenérgicos); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios esteroideos tales como corticosteroides; agentes antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), e inhibidores de PDE_{4}); otros antagonistas del receptor muscarínico (es decir, agentes anticolinérgicos); agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos gram-positivos y gram-negativos o antivirales); antihistaminas; inhibidores de proteasas; y bloqueadores aferentes (por ejemplo, agonistas D_{2} y moduladores de neurocinina).
Una forma de realización particular de la invención se refiere a una composición que comprende (a) un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina del compuesto de fórmula I; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado de un agente antiinflamatorio esteroideo tal como un corticosteroide; un agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico; un inhibidor de fosfodiesterasa-4; o una combinación de los mismos; en la que el compuesto de fórmula I y el agente se formulan juntos o separadamente. En otra forma de realización, (b) es un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico y un agente antiinflamatorio esteroideo. Los agentes secundarios se pueden usar en forma de sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, y, si es apropiado, como esteroisómeros ópticamente puros.
Los agonistas del receptor \beta_{2} adrenérgico representativos que se pueden usar en combinación con compuestos cristalinos de la invención incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol y sismilares, o sus sales farmacéuticamente aceptables. Otros agonistas del receptor \beta_{2} adrenérgico que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, 3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)-fenil]etil}amino)-hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida y 3-(-3-{[7-{(7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}-propil)bencenosulfonamida y compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/066422 (Glaxo Group Ltd.); 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi}butil)-fenil]imidazolidin-2,4-diona y compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/070490 (Glaxo Group Ltd.); 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formi-
lamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formilami-
no)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilami-
no)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-
(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6-
({(2S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)-hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida y
compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/076933 (Glaxo Group Ltd.); 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol y compuestos relacionados descritos en el documento WO 03/024439 (Glaxo Group Ltd.); N-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletil-amino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido-4-hidroxifenil)etilamina y compuestos relacionados descritos en la patente US nº 6.576.793 de Moran et al.; N-{2-[4-(3-fenil-4-metoxifenil)aminofenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2(1H)-quinolinon-5-il)etilamina y compuestos relacionados descritos en la patente US nº 6.653.323 de Moran et al.; y sus sales farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización particular, el agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico es una sal de monohidrocloruro cristalina de N-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido-4-hidroxifenil)etilamina. Cuando se emplea, el agonista del \beta_{2}-adrenorreceptor estará presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Típicamente, el agonista del \beta_{2}-adrenorreceptor estará presente en una cantidad suficiente para proporcionar desde aproximadamente 0,05 \mug hasta 500 \mug por dosis. Las descripciones de las patentes y publicaciones mencionadas anteriormente se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Los agentes antiinflamatorios esteroideos representativos que se pueden usar en combinación con compuestos cristalinos de la invención incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxoandrosta-1,4-dien-17\beta-carbotioico, éster S-(2-oxo-tetrahidrofuran-3S-il) del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-17\alpha-propioniloxi-androsta-1,4-dien-17\beta-carbotioico, ésteres de beclometasona (por ejemplo, el éster de 17-propionato o el éster de 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por ejemplo, el éster de furoato), acetónido de triamcinolona, rofleponida, ciclesonida, propionato de butixocort, RPR-106541, ST-126, y similares, o sus sales farmacéuticamente aceptables. Cuando se emplea, el agente antiinflamatorio esteroideo estará presente en la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz. Típicamente, el agente antiinflamatorio esteroideo estará presente en una cantidad suficiente para proporcionar desde aproximadamente 0,05 \mug hasta 500 \mug por dosis.
Una combinación ejemplar es una forma cristalina del compuesto de fórmula I o solvato del mismo, coadministrado con salmeterol como el agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico, y propionato de fluticasona como el agente antiinflamatorio esteroideo. Otra combinación ejemplar es una forma cristalina del compuesto de fórmula I o un solvato del mismo, coadministrado con una sal cristalina de monohidrocloruro de N-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil)-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido-4-hidroxifenil)etilamina como el agonista del \beta_{2}-adrenorreceptor, y éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxoandrosta-1,4-dien-17\beta-carbotioico como el agente antiinflamatorio esteroideo. Como se señala anteriormente, estos agentes se pueden formular juntos o separadamente.
Otras combinaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo NSAID (por ejemplo, cromoglicato de sodio, nedocromil sódico, e inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) tales como teofilina, inhibidores de PDE4 e inhibidores mixtos de PDE3/PDE4); antagonistas de leucotrienos (por ejemplo, monteleukast); inhibidores de la síntesis de leucotrienos; inhibidores de iNOS; inhibidores de proteasas, tales como inhibidores de triptasa y elastasa; antagonistas de beta-2 integrina y agonistas o antagonistas del receptor de adenosina (por ejemplo, agonistas de adenosina 2a); antagonistas de citocinas (por ejemplo, antagonistas de quimiocinas, tales como un anticuerpo anti-interleucina (anticuerpo \alphaIL), específicamente, una terapia de \alphaIL-4, una terapia de \alphaIL-13, o una combinación de los mismos); o inhibidores de la síntesis de citocinas.
Los inhibidores de fosfodiesterasa-4 (PDE4) o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4 representativos que se pueden usar en combinación con los compuestos cristalinos de la invención incluyen, pero no se limitan a, ácido cis-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona; cis-[4-ciano-4-(3'-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol]; ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexan-1-carboxílico y similares, o sus sales farmacéuticamente aceptables. Otros inhibidores PDE4 o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4 representativos incluyen AWD-12-281 (elbion); NCS-613 (IN-SERM); D-4418 (Chiroscience and Schering-Plough); CI-1018 o PD-168787 (Pfizer); compuestos de benzodioxol descritos en el documento W099/16766 (Kiowa Hakko); K-34 (Kiowa Hakko); V-11294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); compuestos de ftalazinona descritos en el documento W099/47505 (Byk-Gulden); Pumafentrina (Byk-Gulden, ahora Altana); arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); y T2585 (Tanabe Seiyaku).
Los antagonistas muscarínicos (es decir, agentes anticolinérgicos) representativos que se pueden usar en combinación con los compuestos cristalinos de la invención incluyen, pero no se limitan a, atropina, sulfato de atropina, óxido de atropina, nitrato de metilatropina, hidrobromuro de homatropina, hidrobromuro de hiosciamina (d, l), hidrobromuro de escopolamina, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, metantelina, bromuro de propantelina, bromuro de metil anisotropina, bromuro de clidinio, copirrolato (Robinul), yoduro de isopropamida, bromuro de mepenzolato, cloruro de tridihexetilo (Pathilone), metilsulfato de hexociclio, hidrocloruro de ciclopentolato, tropicamida, hidrocloruro de trihexifenidilo, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 y metoctramina y similares, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; o, para los compuestos listados en forma de sal, una sal farmacéuticamente aceptable alternativa de los mismos.
Las antihistaminas (es decir, antagonistas del receptor H_{1}) representativas que se pueden usar en combinación con los compuestos cristalinos de la invención incluyen, pero no se limitan a, etanolaminas tales como maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, hidrocloruro de difenilhidramina, y dimenhidrinato; etilendiaminas, tales como maleato de pirilamina, hidrocloruro de tripelennamina y citrato de tripelennamina; alquilaminas, tales como clorfeniramina y acrivastina; piperazinas, tales como hidrocloruro de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, hidrocloruro de ciclizina, lactato de ciclizina, hidrocloruro de meclizina e hidrocloruro de cetirizina; piperidinas, tales como astemizol, hidrocloruro de levocabastina, loratadina o su análogo descarboetoxi, terfenadina e hidrocloruro de fexofenadina; hidrocloruro de azelastina; y similares, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; o, para los compuestos listados en forma de sal, una sal farmacéuticamente aceptable alternativa de los mismos.
Excepto que se indique de otro modo, las dosis ejemplares adecuadas para los otros agentes terapéuticos administrados en combinación con un compuesto cristalino de la invención están en el intervalo de aproximadamente
0,05 \mug/día a 100 mg/día.
Las siguientes formulaciones ilustran composiciones farmacéuticas representativas de la invención, así como métodos ejemplares de preparación. Opcionalmente se pueden formular uno o más agentes secundarios con el compuesto cristalino de la invención (agente activo primario). Como alternativa, el agente o agentes secundario(s) se puede(n) formular separadamente y coadministrar con el agente activo primario, ya sea simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, en una forma de realización, se puede fabricar una formulación de polvo seco individual para que incluya tanto el compuesto cristalino de la invención como uno o más agentes secundarios. En otra forma de realización, se fabrica una formulación para que contenga el compuesto cristalino de la invención, y se fabrica(n) formulación(es) separada(s) para que contenga(n) el agente o agentes secundarios. Tales formulaciones de polvo seco se pueden envasar entonces en paquetes de blíster separados y se pueden administrar con un dispositivo DPI individual.
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Formulación de polvo seco ejemplar para administración mediante inhalación
Se micronizan 0,2 mg de un compuesto cristalino de la invención, y después se amasa con 25 mg de lactosa. La mezcla amasada se carga entonces en un cartucho para inhalación de gelatina. Los contenidos del cartucho se administran usando un inhalador de polvo.
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Formulación de polvo seco ejemplar para administración mediante un inhalador de polvo seco
Se prepara un polvo seco que tiene una relación de formulación en bruto de compuesto cristalino micronizado de la invención (agente activo) a lactosa de 1:200. El polvo se envasa en un dispositivo para inhalación de polvo seco, capaz de suministrar entre aproximadamente 10 \mug y 100 \mug de agente activo por dosis.
Formulaciones ejemplares para administración mediante un inhalador de dosis medida
Se prepara una suspensión que contiene 5% en peso de un compuesto cristalino de la invención (agente activo) y 0,1% en peso de lecitina dispersando 10 g del agente activo como partículas micronizadas con un tamaño medio menor que 10 \mum en una disolución formada a partir de 0,2 g de lecitina disuelta en 200 ml de agua desmineralizada. La suspensión se secó por pulverización, y el material resultante se micronizó en partículas que tienen un diámetro medio menor que 1,5 \mum. Las partículas se cargan en cartuchos con 1,1,1,2-tetrafluoroetano a presión.
Como alternativa, una suspensión que contiene 5% en peso del agente activo, 0,5% en peso de lecitina y 0,5% en peso de trehalosa se prepara dispersando 5 g del agente activo como partículas micronizadas con un tamaño medio menor que 10 \mum en una disolución coloidal formada a partir de 0,5 g de trehalosa y 0,5 g de lecitina disueltas en 100 ml de agua desmineralizada. La suspensión se seca por pulverización, y el material resultante se microniza en partículas que tienen un diámetro medio menor que 1,5 \mum. Las partículas se cargan en botes con 1,1,1,2-tetrafluoroetano a presión.
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Formulación acuosa ejemplar de aerosol para administración mediante nebulizador
Una composición farmacéutica se prepara disolviendo 0,5 mg de un compuesto cristalino de la invención (agente activo) en 1 ml de una disolución al 0,9% de cloruro de sodio acidificada con ácido cítrico. La mezcla se agita y se somete a ultrasonidos hasta que el agente activo se disuelve. El pH de la disolución se ajusta hasta un valor en el intervalo de 3 a 8 (típicamente aproximadamente 5) mediante adición lenta de NaOH.
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Formulación ejemplar de cápsula de gelatina dura para administración oral
Los siguientes ingredientes se amasan a conciencia y después se cargan en una cápsula de gelatina dura: 250 mg de un compuesto cristalino de la invención, 200 mg de lactosa (secada por pulverización) y 10 mg de estearato de magnesio, para un total de 460 mg de composición por cápsula.
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Formulación ejemplar en suspensión para administración oral
Los siguientes ingredientes se mezclan para formar una suspensión que contiene 100 mg de ingrediente activo por 10 ml de suspensión.
2
Formulación ejemplar inyectable
Los siguientes ingredientes se amasaron y el pH se ajustó a 4 \pm 0,5 usando HCl 0,5 N o NaOH 0,5 N.
3
Utilidad
El compuesto de fórmula I posee actividad antagonista del receptor muscarínico, y por lo tanto es de esperar que la forma cristalina del compuesto de fórmula I sea útil para tratar afecciones médicas mediadas por receptores muscarínicos, es decir, afecciones médicas que mejoran por el tratamiento con un antagonista del receptor muscarínico. Tales afecciones incluyen, a título de ejemplo, trastornos o enfermedades pulmonares, incluyendo las asociadas con obstrucción reversible de las vías respiratorias, tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica y sibilante, y enfisema), asma, fibrosis pulmonar, rinitis alérgica, rinorrea, y similares. Otras afecciones médicas que se pueden tratar con antagonistas del receptor muscarínico son trastornos del aparato genitourinario, tales como vejiga hiperactiva o hiperactividad detrusora y sus síntomas; trastornos del tubo digestivo tales como síndrome de intestino irritable, enfermedad diverticular, acalasia, trastornos de hipermovilidad gastrointestinal y diarrea; arritmias cardíacas tales como bradicardia sinusal, enfermedad de Parkinson; trastornos cognitivos tales como enfermedad de Alzheimer; dismenorrea; y similares.
En consecuencia, en una forma de realización, la invención se refiere a un método para tratar un trastorno pulmonar, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se usa para tratar un trastorno pulmonar, el compuesto cristalino de la invención se administrará típicamente mediante inhalación en múltiples dosis por día, en una única dosis diaria, o en una única dosis semanal. Generalmente, la dosis para tratar un trastorno pulmonar oscilará desde aproximadamente 10 \mug/día hasta 200 \mug/día.
Cuando se administran por inhalación, los compuestos cristalinos de la invención tendrán típicamente el efecto de producir broncodilatación. En consecuencia, en otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir broncodilatación en un paciente, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad productora de broncodilatación de un éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Generalmente, la dosis terapéuticamente eficaz para producir broncodilatación oscilará desde aproximadamente 10 \mug/día hasta 200 \mug/día.
En una forma de realización, la invención se refiere a un método para tratar enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico cristalino, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se usa para tratar COPD o asma, la sal de la invención se administrará típicamente mediante inhalación en múltiples dosis por día, o en una única dosis diaria. Generalmente, la dosis para tratar COPD o asma oscilará desde aproximadamente 10 \mug/día hasta 200 \mug/día. Como se usa aquí, COPD incluye bronquitis obstructiva crónica y enfisema (véase, por ejemplo, Bames, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N Engl J Med 343:269-78 (2000)).
Cuando se usan para tratar un trastorno pulmonar, los compuestos cristalinos de la invención se administran opcionalmente en combinación con otros agentes terapéuticos. En consecuencia, en una forma de realización particular, las composiciones farmacéuticas y métodos de la invención comprenden además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del \beta_{2}-adrenorreceptor, un cortiscosteroide, un agente antiinflamatorio no esteroideo, o una combinación de los mismos.
En otra forma de realización, los compuestos cristalinos de la invención se usan para antagonizar un receptor muscarínico en un sistema biológico, y un mamífero, en particular, tal como ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, seres humanos, etc. En esta forma de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto cristalino de fórmula I se administra a un mamífero. Si se desea, los efectos del antagonismo del receptor muscarínico se pueden determinar entonces usando procedimientos y equipo convencionales.
Las propiedades y utilidad de los compuestos cristalinos de la invención se pueden demostrar usando diversos ensayos in vitro e in vivo, que son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en los siguientes Ejemplos se describen con mayor detalle ensayos representativos.
Ejemplos
Las siguientes Preparaciones y Ejemplos se proporcionan para ilustrar formas de realización específicas de la invención. Sin embargo, estas formas de realización específicas no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera, excepto que se indique específicamente. Las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados, excepto que se indique de otro modo, y cualesquiera otras abreviaturas usadas aquí y no definidas tienen su significado estándar:
AC
adenilil-ciclasa
ACh
acetilcolina
ACN
acetonitrilo
BSA
seroalbúmina bovina
cAMP
3'-5'-monofosfato de adenosina cíclico
CHO
ovario de hámster chino
cM_{5}
receptor M_{5} clonado de chimpancé
DCM
diclorometano (es decir, cloruro de metileno)
DIPEA
N,N-diisopropiletilamina
dPBS
disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
DMSO
dimetilsulfóxido
EDC
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
FBS
suero fetal bovino
FLIPR
lector de placas formadoras de imágenes fluorométricas
HBSS
disolución salina tamponada de Hank
HEPES
ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
hM_{1}
receptor M_{1} clonado humano
hM_{2}
receptor M_{2} clonado humano
hM_{3}
receptor M_{3} clonado humano
hM_{4}
receptor M_{4} clonado humano
hM_{5}
receptor M_{5} clonado humano
HOBT
N-hidroxibenzotriazol
HPLC
cromatografía de líquidos de altas prestaciones
IAP
isopropanol
MCh
metilcolina
MTBE
metil-t-butil-éter
TFA
ácido trifluoroacético
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Cualesquiera otras abreviaturas usadas aquí pero no definidas tienen su significado estándar, generalmente aceptado. Excepto que se señale de otro modo, los reactivos, materiales de partida y disolventes se adquirieron de proveedores comerciales (tales como Sigma Aldrich, Fluka, y similares), y se usaron sin purificación adicional.
Excepto que se indique de otro modo, el análisis de HPLC se llevó a cabo usando un instrumento Agilent (Palo Alto, CA) Serie 1100 equipado con una columna Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm (Agilent) que tiene un tamaño de partículas de 3,5 micrómetros. La detección se realizó mediante absorbancia de UV a 214 nm. Las fases móviles empleadas fueron las siguientes (en volumen): A es ACN (2%), agua (98%) y TFA (0,1%); y B es acetonitrilo (90%), agua (10%) y TFA (0,1%). Los datos de HPLC 10-70 se obtuvieron usando un caudal de 0,5 ml/minuto de 10 a 70% de B a lo largo de un gradiente de 6 minutos (siendo A el resto). De forma similar, los datos de HPLC 5-35 y los datos de HPLC 10-90 se obtuvieron usando 5 a 35% de B, o 10 a 90% de B a lo largo de un gradiente de 5 minutos.
Los datos de espectrometría de masas con cromatografía de líquidos (LCMS) se obtuvieron con un instrumento Applied Biosystems (Foster City, CA) Modelo API-150EX. Los datos de LCMS 10-90 se obtuvieron usando 10 a 90% de la fase móvil B a lo largo de un gradiente de 5 minutos.
Preparación 1 Éster piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se calentaron juntos, a 70ºC, 2-isocianato de bifenilo (97,5 g, 521 mmoles) y 4-hidroxi-N-bencilpiperidina (105 g, 549 mmoles) durante 12 horas. Después, la mezcla de reacción se enfrió hasta 50ºC, y se añadió etanol (1 l), y después se añadió lentamente HCl 6 M (191 ml). La mezcla resultante se enfrió entonces hasta la temperatura ambiente, y se añadió formiato de amonio (98,5 g, 1,56 moles), y después se burbujeó vigorosamente gas nitrógeno a través de la disolución durante 20 minutos. Después se añadió paladio sobre carbón activado (20 g, 10% en peso en base seca), y la mezcla de reacción se calentó a 40ºC durante 12 horas, y después se filtró a través de una almohadilla de Celite. El disolvente se eliminó entonces a presión reducida, y se añadió HCl 1 M (40 ml) al residuo bruto. El pH de la mezcla se ajustó entonces con NaOH 10 N hasta pH 12. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml), y la capa orgánica se secó (sulfato de magnesio), se filtró, y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar 155 g del intermedio del título (100% de rendimiento). HPLC (10-70) Rt = 2,52; m/z: [M + H^{+}] calculado para C_{18}H_{20}N_{2}O_{2} 297,15; encontrado 297,3.
Preparación 2 N-Bencil-N-metilaminoacetaldehído
A un matraz 3 bocas, de 2 l, se añadió N-bencil-N-metiletanolamina (30,5 g, 0,182 moles), DCM (0,5 l), DIPEA (95 ml, 0,546 moles) y DMSO (41 ml, 0,728 moles). Usando un baño de hielo, la mezcla se enfrió hasta aproximadamente -10ºC, y se añadió complejo de trióxido de azufre-piridina (87 g, 0,546 moles), en 4 porciones en intervalos de 5 minutos. La reacción se agitó a -10ºC durante 2 horas. Antes de retirar el baño de hielo, la reacción se paralizó añadiendo agua (0,5 l). La capa acuosa se separó, y la capa orgánica se lavó con agua (0,5 l) y salmuera (0,5 l), y después se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró para proporcionar el compuesto del título que se usó sin purificación adicional.
Preparación 3 Éster 1-[2-(bencilmetilamino)etil]piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
A un matraz 2 l, que contiene el producto de la Preparación 2 en DCM (0,5 l), se añadió el producto de la Preparación 1 (30 g, 0,101 moles) seguido de triacetoxiborohidruro de sodio (45 g, 0,202 moles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche, y después se paralizó mediante adición de ácido clorhídrico 1 N (0,5 l) con agitación vigorosa. Se observaron tres capas, y la capa acuosa se eliminó. Tras lavar con NaOH 1N (0,5 l), se obtuvo una capa orgánica homogénea que se lavó entonces con una disolución saturada de NaCl acuoso (0,5 l), se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró, y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó disolviéndolo en una mínima cantidad de isopropanol y enfriando esta disolución hasta 0ºC para formar un sólido que se recogió y se lavó con isopropanol frío para proporcionar 42,6 g del compuesto del título (95% de rendimiento). MS m/z: [M + H^{+}] calculado para C_{28}H_{33}N_{3}O_{2} 444,3; encontrado 444,6. R_{f}=3,51 min. (10-70 ACN:H_{2}O, HPLC de fase inversa).
Preparación 3A Éster 1-[2-(bencilmetilamino)etil]piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
El compuesto del título se preparó mediante mesilación de N-bencil-N-metiletanolamina, que después se hizo reaccionar con éster piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico en una reacción de alquilación.
Un matraz de 500 ml (matraz reactor) se cargó con N-bencil-N-metiletanolamina (24,5 ml), DCM (120 ml), NaOH (80 ml; 30% en peso) y cloruro de tetrabutilamonio. Mezclando a velocidad lenta durante la reacción, la mezcla se enfrió hasta -10ºC (baño de enfriamiento), y el embudo de adición se cargó con DCM (30 ml) y cloruro de mesilo (15,85 ml), que se añadió gota a gota a un caudal constante durante 30 minutos. La adición fue exotérmica, y la agitación se continuó durante 15 minutos mientras la temperatura volvía a equilibrarse hasta -10ºC. La reacción se mantuvo durante al menos 10 minutos para asegurar la hidrólisis completa del cloruro de mesilo en exceso.
Un matraz de 250 ml se cargó con éster piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (26 g; preparado como se describe en la Preparación 1) y DCM (125 ml), se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente, y la mezcla se enfrió brevemente hasta 10ºC para formar una suspensión. La suspensión se cargó entonces en el matraz reactor vía el embudo de adición. El baño de enfriamiento se retiró, y la mezcla de reacción se calentó hasta 5ºC. La mezcla se transfirió a un embudo de separación, las capas se dejaron reposar, y la capa acuosa se eliminó. La capa orgánica se volvió a transferir al matraz reactor, se reanudó la agitación, la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente, y la reacción se monitorizó mediante HPLC durante un total de 3,5 horas.
El matraz reactor se cargó con NaOH (disolución 1M; 100 ml), se agitó, y las capas se dejaron reposar. La capa orgánica se separó, se lavó (disolución sat. de NaCl), su volumen se redujo parcialmente a vacío, y se sometió a lavados repetidos con IPA. Los sólidos se recogieron y se dejaron secar al aire (25,85 g, 98% de pureza). Se obtuvieron sólidos adicionales mediante procesamiento adicional del licor madre (reducción de volumen, IPA, enfriamiento).
Preparación 4 Éster 1-(2-metilaminoetil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
A un matraz de hidrogenación Parr se añadió el producto de la Preparación 3 (40 g, 0,09 moles) y etanol (0,5 l). El matraz se inundó con gas nitrógeno, y se añadió paladio sobre carbón activado (15 g, 10% en peso (base seca), 37% peso/peso) junto con ácido acético (20 ml). La mezcla se mantuvo en el hidrogenador Parr a una atmósfera de hidrógeno (\sim50 psi) durante 3 horas. Después, la mezcla se filtró y se lavó con etanol. El filtrado se condensó, y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de DCM. Se añadió lentamente acetato de isopropilo (10 volúmenes) para formar un sólido que se recogió para proporcionar 22,0 g del compuesto del título (70% de rendimiento). MS m/z: [M + H^{+}] calculado para C_{21}H_{27}N_{3}O_{2} 354,2; encontrado 354,3. R_{f} = 2,96 min. (10-70 ACN:H_{2}O, HPLC de fase inversa).
Preparación 5 Éster 1-{2-[(4-formilbenzoil)metilamino]etil}piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
A un matraz de tres bocas, de 1 l, se añadió 4-carboxibenzaldehído (4,77 g, 31,8 mmoles), EDC (6,64 g, 34,7 mmoles), HOBT (1,91 g, 31,8 mmoles), y DCM (200 ml). Cuando la mezcla fue homogénea, se añadió lentamente una disolución del producto de la Preparación 4 (10 g, 31,8 mmoles) en DCM (100 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas, y después se lavó con agua (1 x 100 ml), HCl 1N (5 x 60 ml), NaOH 1N (1 x 100 ml), salmuera (1 x 50 ml), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para producir 12,6 g del compuesto del título (92% de rendimiento; 85% de pureza basada en HPLC). MS m/z: [M + H^{+}] calculado para C_{29}H_{31}N_{3}O_{4} 486,2; encontrado 486,4. R_{f} = 3,12 min. (10-70 ACN:H_{2}O, HPLC de fase inversa).
Ejemplo 1 Éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
6
A un matraz tres bocas, de 2 l, se añadió isonipecotamida (5,99 g, 40,0 mmoles), ácido acético (2,57 ml), sulfato de sodio (6,44 g) e isopropanol (400 ml). La mezcla de reacción se enfrió hasta 0-10ºC con un baño de hielo, y se añadió lentamente una disolución de éster 1-{2-[(4-formilbenzoil)metilamino]etil}piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (11 g, 22,7 mmoles; preparado según se describe en la Preparación 5) en isopropanol (300 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y después se enfrió hasta 0-10ºC. Se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (15,16 g, 68,5 mmoles) en porciones, y esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró entonces a presión reducida hasta un volumen de aproximadamente 50 ml y esta mezcla se acidificó con HCl 1N (200 ml) hasta pH 3. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se extrajo con DCM (3 x 250 ml). La fase acuosa se enfrió entonces hasta 0-5ºC con un baño de hielo, y se añadió disolución acuosa al 50% de NaOH para ajustar el pH de la mezcla hasta 10. Esta mezcla se extrajo entonces con acetato de isopropilo (3 x 300 ml), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (100 ml), con salmuera (2 x 50 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron para producir 10,8 g del compuesto del título (80% de rendimiento. MS m/z: [M + H^{+}] calculado para C_{35}H_{43}N_{5}O_{4} 598,3; encontrado 598,6.
R_{f} = 2,32 min. (10-70 ACN:H_{2}O, HPLC de fase inversa).
Ejemplo 2 Sal cristalina de difosfato del éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se recogieron 500 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (0,826 mmoles de material puro al 96%; preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 5 ml de agua y 1,5 ml de ácido fosfórico 1M. El pH se ajustó hasta aproximadamente pH 5,3 con 0,25 ml adicionales de ácido fosfórico 1M (que es igual a 2,1 equivalentes molares). La disolución transparente se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros, se congeló y se liofilizó hasta sequedad para producir una sal de difosfato amorfa.
Se disolvieron 20 mg de la sal de difosfato amorfa en 2 ml de IPA:ACN (1:1). Se añadieron 0,1 ml de agua, y la mezcla se calentó hasta 60ºC con agitación. La mayoría de los sólidos se disolvieron. La suspensión se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente, con agitación, toda la noche. Los cristales resultantes se recogieron por filtración y se secaron al aire durante 20 minutos para dar el compuesto del título (18,5 mg, 93% de rendimiento) como un sólido cristalino blanco. Cuando se examinaron con un microscopio usando luz polarizada, los cristales mostraron cierta birrefringencia.
Ejemplo 3 Sal cristalina de difosfato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se combinaron 5,0 g de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (base libre; preparado como se describe en el Ejemplo 1) con 80 ml de IPA:ACN (1:1). Se añadieron 4,0 ml de agua, y la mezcla se calentó hasta 50ºC con agitación, formando una disolución transparente. A esto se añadieron gota a gota, a 50ºC, 16 ml de ácido fosfórico 1M. La disolución turbia resultante se agitó a 50ºC durante 5 horas, y después se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente, con agitación lenta, toda la noche. Los cristales resultantes se recogieron por filtración y se secaron al aire durante 1 hora, después a vacío durante 18 horas, para dar el compuesto del título (5,8 g, 75% de rendimiento) como un sólido cristalino blanco (98,3% de pureza mediante HPLC).
Ejemplo 4 Sal cristalina de monosulfato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se recogieron 442 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (0,739 mmoles de material de 96% de pureza; preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 5 ml de H_{2}O:ACN (1:1), y se añadieron lentamente 1,45 ml de ácido sulfúrico 1N, mientras se monitorizaba el pH. El pH se ajustó hasta aprox. pH 3,3. La disolución transparente se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros, se congeló y se liofilizó hasta sequedad para dar una sal de monosulfato.
Se disolvieron 30,3 mg de la sal de monosulfato en 1,65 ml de IPA:ACN (10:1). La suspensión se calentó colocando el vial en un baño de agua precalentado a 60ºC, durante 30 minutos. Se formó un material viscoso, y el calor se incrementó hasta 70ºC durante 30 minutos. Puesto que el material siguió estando viscoso, la calefacción se redujo hasta 60ºC, y la mezcla se calentó una hora adicional. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Después de 4 días, el material pareció ser sólido, y la muestra se dejó reposar durante nueve días adicionales. El sólido se filtró entonces y se secó usando una bomba de vacío durante 1 hora para dar el compuesto del título (23 mg, 76% de rendimiento).
Ejemplo 5 Sal cristalina de monosulfato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se disolvieron 161 mg de la sal de monosulfato (preparada como se describe en el Ejemplo 4) en 8,77 ml de IPA:ACN (10:1). La suspensión se calentó colocando el vial en un baño de agua precalentado a 70ºC, durante 1,5 horas. Se formaron gotitas de aceite en 5 minutos. La calefacción se redujo hasta 60ºC, y la mezcla se calentó durante 1,5 horas adicionales, seguido del calentamiento a 50ºC durante 40 minutos, a 40ºC durante 40 minutos, después a 30ºC durante 45 minutos. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente. Al día siguiente, el material se observó en un microscopio, observándose agujas y placas. El material se calentó entonces a 40ºC durante 2 horas, a 35ºC durante 30 minutos, y después a 30ºC durante 30 minutos. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente. El sólido se filtró entonces y se secó usando una bomba de vacío durante 1 hora para dar el compuesto del título (117 mg, 73% de rendimiento).
Ejemplo 6 Sal cristalina de dioxalato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se recogieron 510 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (0,853 mmoles de material de 96% de pureza; preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 5 ml de H_{2}O:ACN (1:1), y se añadieron lentamente 1,7 ml de ácido oxálico acuoso 1M, mientras se monitorizaba el pH. El pH se ajustó hasta aprox. pH 3,0. La disolución transparente se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros, se congeló y se liofilizó hasta sequedad para dar una sal de dioxalato.
Se disolvieron 31,5 mg de la sal de dioxalato en 2,76 ml de 94% de IPA/6% de H_{2}O. La mezcla se agitó en un baño de agua precalentado a 60ºC, durante 2,5 horas. Después de 25 minutos, toda la muestra estaba en disolución. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Al día siguiente, había una pequeña cantidad de material viscoso. El vial se refrigeró a 4ºC. Después de 4 días, el material viscoso todavía estaba presente. El vial se colocó entonces a temperatura ambiente y se observó un mes más tarde. El material pareció ser sólido, y se observó que era cristalino en un microscopio. El sólido se filtró entonces y se secó usando una bomba de vacío durante 1 hora para dar el compuesto del título (20 mg, 63,5% de rendimiento).
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Ejemplo 7 Sal cristalina de dioxalato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico
Se disolvieron 150 mg de la sal de dioxalato (preparada como se describe en el Ejemplo 6) en 13,1 ml de 94% de IPA/6% de H_{2}O. La mezcla se agitó en un baño de agua precalentado a 60ºC, durante 2,5 horas. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. El vial se refrigeró a 4ºC. Después de 6 días, se observó un material oleoso con lo que pareció ser un cristal en el lado del vial. El vial se dejó entonces alcanzar la temperatura ambiente, en cuyo momento se añadieron siembras (material cristalino procedente del Ejemplo 6) y se dejaron reposar durante 16 días. Durante este tiempo, se observaron que aparecieron más cristales de la disolución. El sólido se filtró entonces y se secó usando una bomba de vacío durante 14 horas para dar el compuesto del título (105 mg, 70% de rendimiento).
Ejemplo 8 Base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (Forma I)
Se disolvieron 109 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 0,56 ml de H_{2}O:ACN (1:1). La suspensión se dejó en un vial (la tapa se colocó de manera suelta en la parte superior) para permitir un tiempo de evaporación más lento. El vial se colocó en un entorno de caudal de nitrógeno, aunque el nitrógeno no se usó para la evaporación, sólo para el entorno. Un precipitado era visible en un día, que se observó que era cristalino en un microscopio. El sólido se colocó entonces en una línea de alto vacío para eliminar todo el disolvente para dar el compuesto del título. Recuperación cuantitativa, pureza de 97,8% mediante HPLC.
En un procedimiento alternativo, tras la disolución en H_{2}O:ACN (1:1) (aproximadamente 350 mg/ml), el vial se almacenó a 5ºC, y el precipitado era visible al segundo día. El sólido se filtró, se aclaró con agua, y se secó a alto vacío toda la noche. La recuperación fue 55%, teniendo el sólido 98,2% de pureza, y teniendo el líquido una pureza de 92,8%.
Ejemplo 9 Base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (Forma I)
Se disolvieron 50,4 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 0,144 ml de H_{2}O:ACN (1:1). La suspensión se dejó en un vial (la tapa se colocó de manera suelta en la parte superior) para permitir un tiempo de evaporación más lento. El vial se refrigeró a 4ºC durante 6 días. Un precipitado era visible después de 2 días. El sólido se filtró y se colocó en una línea de alto vacío para eliminar todo el disolvente y dar el compuesto del título como un sólido blanco (27,8 mg, 55,2% de rendimiento).
Ejemplo 10 Base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (Forma I)
Se disolvieron 230 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 0,2 ml de H_{2}O:ACN (1:1), usando una pequeña calefacción. La mezcla se calentó entonces en un baño de agua a 70ºC, durante 2 horas. La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente, después se refrigeró a 4ºC durante 1 hora. Entonces se añadieron 50 \mul de agua (desprovista de aceite), seguido de la adición de 40 \mul de ACN para hacer que la muestra volviese a la disolución. Se añadieron siembras (material cristalino procedente del Ejemplo 8) con agitación lenta a temperatura ambiente. Se empezaron a formar cristales, y la mezcla se dejó reposar toda la noche, con agitación lenta. Al día siguiente, se aplicó un ciclo de calentamiento/enfriamiento (30ºC durante 10 minutos, 40ºC durante 10 minutos, después 50ºC durante 20 minutos). La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar toda la noche, con agitación lenta. Al día siguiente, se aplicó un segundo ciclo de calentamiento/enfriamiento (60ºC durante 1 hora, observándose disolución a 70ºC). La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar toda la noche, con agitación lenta. Al día siguiente, había cristales presentes, y se aplicó un tercer ciclo de calentamiento/enfriamiento (60ºC durante 3 horas). La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar toda la noche, con agitación lenta. Al día siguiente, se aplicó un ciclo de calentamiento/enfriamiento (60ºC durante 3 horas, enfriamiento lento, después 60ºC durante 3 horas). La calefacción se apagó, y la mezcla se dejó enfriar toda la noche, con agitación lenta. Después de 3 días, el sólido se filtró y se colocó en una línea de alto vacío para eliminar todo el disolvente y dar el compuesto del título.
Ejemplo 11 Base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (Forma II)
Se disolvieron 70 mg de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico (preparado como se describe en el Ejemplo 1) en 0,1 ml de ACN. Tras la adición de 0,3 ml de MTBE, la disolución pareció turbia. Se añadieron 50 \mul adicionales de ACN para aclarar la disolución (155 mg/ml de ACN:MTBE =1:2). La mezcla se dejó en el vial y se tapó. Aparecieron cristales al día siguiente. El sólido se filtró entonces y se colocó en una línea de alto vacío para eliminar todo el disolvente y dar el compuesto del título.
Ejemplo 12 Difracción de rayos X de polvo
Los patrones de difracción de rayos X de polvo se obtuvieron con un difractómetro Rigaku usando una radiación Cu Ka (30,0 kV, 15,0 mA). El análisis se llevó a cabo con el goniómetro funcionando en modo de barrido continuo de 3º por minuto con un tamaño de etapa de 0,03º a lo largo de un intervalo de 2 a 45º. Las muestras se prepararon en soportes de muestra de cuarzo, como una capa delgada de material en polvo. El instrumento se calibró con un estándar de silicio metálico.
El patrón de PXRD para una muestra de la sal de difosfato del Ejemplo 2 mostró que el material era cristalino. En la Fig. 1 se muestra un patrón de PXRD representativo para una muestra de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3. El patrón de PXRD para una muestra de la sal de monosulfato del Ejemplo 4 mostró que el material era cristalino. En la Fig. 8 se muestra un patrón de PXRD representativo para una muestra de la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 5. El patrón de PXRD para una muestra de la sal de dioxalato del Ejemplo 6 mostró que el material era cristalino. En la Fig. 13 se muestra un patrón de PXRD representativo para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 7. El patrón de PXRD para una muestra de la base libre (Forma I) de los Ejemplos 8 y 9 mostró que el material era cristalino. En la Fig. 18 se muestra un patrón de PXRD representativo para una muestra de la base libre (Forma I) del Ejemplo 10. En la Fig. 23 se muestra un patrón de PXRD representativo para una muestra de la base libre (Forma II) del Ejemplo 11.
Ejemplo 13 Análisis térmico
Se llevó a cabo una calorimetría diferencial de barrido (DSC) usando un módulo de TA Instruments Modelo Q-10 con un controlador de análisis térmico. Los datos se recogieron y se analizaron usando el software de TA Instruments Thermal Solutions. Se pesó de forma exacta una muestra de aproximadamente 1-4 mg en una bandeja de aluminio con tapa. La muestra se evaluó usando una rampa de calentamiento lineal de 10ºC/min. desde la temperatura ambiente hasta aproximadamente 300ºC. La celda de DSC se purgó con nitrógeno seco durante el uso.
Una traza de DSC representativa para una muestra de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3 mostró dos transiciones a aproximadamente 63,8ºC y 154,3ºC, como se observa en la Fig. 2. Esta traza de DSC demuestra que esta sal cristalina de difosfato tiene una estabilidad térmica aceptable a buena, con un pico de fusión a aproximadamente 154,5ºC y ninguna descomposición térmica por debajo de 150ºC. La traza de DSC también mostró un comienzo de flujo de calor endotérmico a aproximadamente 135ºC.
Una traza de DSC representativa para una muestra de la sal de monosulfato del Ejemplo 4 mostró dos transiciones a aproximadamente 57ºC y 73,2ºC. Una traza de DSC representativa para una muestra de la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 5 mostró una transición a 76ºC, como se observa en la Fig. 10, demostrando que esta sal cristalina de monosulfato tiene un pico de fusión a aproximadamente 76,5ºC.
Una traza de DSC representativa para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 6 mostró dos transiciones a 69,2ºC y 122,8ºC. Una traza de DSC representativa para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 7 mostró una transición a 73ºC, como se observa en la Fig. 15. Esta traza de DSC demuestra que esta sal cristalina de dioxalato tiene un pico de fusión a aproximadamente 73,7ºC.
Una traza de DSC representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 8 mostró una transición a 90,4ºC. La traza de DSC para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 9 mostró dos transiciones a 86,1ºC y 103,6ºC. Una traza de DSC representativa para una muestra de la base libre cristalina del Ejemplo 10 (Forma I) mostró dos transiciones en una bandeja cerrada (83,9ºC y 102,1ºC), pero una transición a 102,5ºC en una bandeja abierta (el pico más temprano es debido a agua y/o disolventes), como se observa en la Fig. 19. Esta traza de DSC demuestra que esta base libre cristalina tiene excelente estabilidad térmica, con el pico de fusión a aproximadamente 102,7ºC, y nada de descomposición térmica por debajo de 80ºC. La traza de DSC también mostró un comienzo de flujo de calor endotérmico a aproximadamente 90ºC.
Una traza de DSC representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma II) del Ejemplo 11 mostró una transición a 98,6ºC, como se observa en la Fig. 24, demostrando que esta base libre cristalina tiene excelente estabilidad térmica, con el pico de fusión a aproximadamente 98,6ºC, y nada de descomposición térmica por debajo de 75ºC. La traza de DSC también mostró un comienzo de flujo de calor endotérmico a aproximadamente 75ºC.
Se llevó a cabo un análisis termogravimétrico (TGA) usando un módulo TA Instruments Modelo Q-50 equipado con una capacidad de alta resolución. Los datos se recogieron y se analizaron usando software TA Instruments Thermal Solutions. Se colocó una muestra que pesa aproximadamente 10 mg sobre una bandeja de platino, y se barrió con una tasa de calentamiento de alta resolución desde la temperatura ambiente hasta 300ºC. La balanza y las cámaras del horno se purgaron con caudales de nitrógeno durante el uso.
Una traza de TGA representativa para una muestra de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (8,2%) a temperaturas por debajo de 155ºC, como se observa en la Fig. 3.
La traza de TGA para una muestra de la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 4 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (12,6%) a temperaturas por debajo de 116ºC. Una traza de TGA representativa para una muestra de la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 5 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (13,7%) a temperaturas por debajo de 150ºC, como se observa en la Fig. 9.
La traza de TGA para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 6 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (15,4%) a temperaturas por debajo de 125ºC. Una traza de TGA representativa para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 7 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (12,7%) a temperaturas por debajo de 125ºC, como se observa en la Fig. 14.
La traza de TGA para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 8 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (7,3%) a temperaturas por debajo de 75ºC. La traza de TGA para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 9 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (5,2%) a temperaturas por debajo de 70ºC. Una traza de TGA representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 10 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (3,8%) a temperaturas por debajo de 98ºC, como se observa en la Fig. 20.
Una traza de TGA representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma II) del Ejemplo 11 mostró una pérdida de disolventes y/o agua (3,0%) a temperaturas por debajo de 98ºC, como se observa en la Fig. 25.
Estas trazas de TGA indican que los compuestos cristalinos de la presente invención pierden una pequeña cantidad de peso desde la temperatura ambiente hasta temperaturas moderadamente elevadas (por ejemplo, 75-150ºC), lo que es consistente con la pérdida de humedad residual o disolvente.
Ejemplo 14 Evaluación de la sorción de humedad dinámica
Se llevó a cabo una evaluación de sorción de humedad dinámica (DMS) (también conocida como un perfil de sorción-desorción de humedad) usando un sistema SGA-100 con microbalanza atmosférica de VTI (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Se usó un tamaño de muestra de aproximadamente 10 mg, y la humedad se ajustó al valor ambiental al comienzo del análisis. Un análisis de DMS típico consistió en tres barridos: ambiente hasta 2% de humedad relativa (RH), 2% de RH a 90% de RH, 90% de RH a 5% de RH, a una tasa de barrido de 5% de RH/etapa. La masa se midió cada dos minutos, y la RH se cambió al siguiente valor (+/- 5% de RH) cuando la masa de la muestra fue estable en 0,01% durante 5 puntos consecutivos.
Una traza de DMS representativa para una muestra de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3 mostró un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia, con una ganancia de peso de 3,3% cuando se expone a 2-90% de RH, y una ganancia de peso de 0,6% en el intervalo de humedad de 40-75% de RH, como se muestra en la Fig. 4.
Una traza de DMS representativa para una muestra de la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 5 mostró un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia, con una ganancia de peso de 10% cuando se expone a 2-90% de RH, y una ganancia de peso de 1,8% en el intervalo de humedad de 40-75% de RH, como se muestra en la Fig. 11.
Una traza de DMS representativa para una muestra de la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 7 mostró un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia, con una ganancia de peso de 5,3% cuando se expone a 2-90% de RH, y una ganancia de peso de 1,1% en el intervalo de humedad de 40-75% de RH, como se muestra en la Fig. 16.
Una traza de DMS representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma I) del Ejemplo 10 mostró un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia, con una ganancia de peso de 10% cuando se expone a 2-90% de RH, y una ganancia de peso de 1,2% en el intervalo de humedad de 40-75% de RH, como se muestra en la Fig. 21.
Una traza de DMS representativa para una muestra de la base libre cristalina (Forma II) del Ejemplo 11 mostró un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia, con una ganancia de peso de 9% cuando se expone a 2-90% de RH, y una ganancia de peso de 1,3% en el intervalo de humedad de 40-75% de RH, como se muestra en la Fig. 26.
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Estas trazas de DMS demuestran que los compuestos cristalinos de la presente invención tienen un perfil de sorción/desorción reversible con baja higroscopia. Los compuestos cristalinos tienen una ganancia de peso aceptable cuando se exponen a un amplio intervalo de humedades. Los perfiles de sorción/desorción de humedad reversible demuestran que los compuestos cristalinos de la presente invención poseen una higroscopia aceptable y no son delicuescentes.
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Ejemplo 15 Evaluación de la estabilidad del estado sólido
Se almacenaron muestras de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3, de aproximadamente 1-2 mg cada una, en múltiples viales de borosilicato de 3 ml a -20ºC (recipiente cerrado) y 40ºC/75% de RH (recipiente abierto y cerrado). A intervalos específicos, todos los contenidos de un vial representativo se analizaron mediante el siguiente método de HPLC:
\quad
Columna: Xterra Ms C18, 4,6 x 250 mm, 5 \mum (Part No. 186000494); fase móvil A: 0,1 M de NH_{4}Ac, pH 7,0; fase móvil B: 100% de ACN; caudal: 1 ml/min.; volumen de inyección: 10 \mul; detector: 240 nm; gradiente - tiempo en minutos (% de fase móvil B): 0,0 (8); 5,00 (28); 22,00 (42); 30,00 (100); 35,00 (100); 35,10 (8); y 45,00 (8). Las muestras se prepararon como disoluciones madres de 0,5 mg/ml en disolución salina normal tamponada con citrato 10 mM, pH 5.
Para la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3, la pureza inicial de las muestras fue 98,3%, según se determina mediante el porcentaje del área de HPLC. Tras el almacenamiento durante seis semanas, para las muestras mantenidas bajo todas las condiciones, no hubo cambio detectable en la pureza química, ni cambio observable en el aspecto del material, y los análisis mediante DSC y TGA no mostraron diferencias detectables.
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Ejemplo 16 Análisis elemental
Los siguientes porcentajes elementales para muestras de los compuestos cristalinos de la invención se determinaron mediante análisis de combustión usando un analizador elemental Flash EA 1112 (CE Elantech, Lakewood, NJ).
Para la sal cristalina de monosulfato del Ejemplo 5: 52,88% de carbono, 7,10% hidrógeno, 8,81% de nitrógeno, 27,17% de oxígeno, y 4,03% de azufre (esperado); 52,11% de carbono, 6,90% de hidrógeno, 8,42% de nitrógeno, 24,94% de oxígeno, y 4,06% de azufre (resultados).
Para la sal cristalina de dioxalato del Ejemplo 7: 54,54% de carbono, 6,57% de hidrógeno, 8,15% de nitrógeno, y 30,74% de oxígeno (esperado); 56,33% de carbono, 6,90% de hidrógeno, 8,22% de nitrógeno, y 26,32% de oxígeno (resultados).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 Micronización
Una muestra de 13 g de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3 se micronizó con un molino de chorro para dar 8,7 g de un polvo blanco que fluye libremente con una birrefringencia observada al examinarlo microscópicamente (67% de recuperación). Antes de la micronización, el difosfato cristalino tuvo una pureza inicial de 98,1%, según se determina mediante el porcentaje de área de HPLC. La pureza del material micronizado fue la misma. El contenido de agua del material premicronizado fue 6,54% en peso, y el contenido de agua del material micronizado fue 6,23% en peso.
No se encontraron problemas durante el proceso de micronización. La distribución de tamaños de partículas fue la siguiente:
7 
\newpage
No se observaron cambios significativos en el patrón de difracción de rayos X de polvo, en TGA, DSC, DMS, pureza química, pureza quiral y contenido de humedad para el material micronizado, en comparación con el material sin micronizar. Por ejemplo, como se señala en el Ejemplo 14, una traza de DMS representativa para una muestra de la sal cristalina de difosfato del Ejemplo 3 mostró una ganancia de peso de 0,6% en el intervalo de humedades de 40-75% de RH, mientras que el material micronizado mostró una ganancia de peso de 0,7% en este intervalo de humedades.
Ejemplo 18 Estabilidad de la disolución para inhalación
Se preparó una disolución con 0,5 mg/ml de equivalentes de base libre (usando una sal cristalina de difosfato preparada como se describió en el Ejemplo 3) en 10 mM de disolución salina normal tamponada con citrato, pH 5. La solubilidad de la sal cristalina fue mayor que 40 mg/ml de equivalente de base libre en el tampón. Se observó una degradación menor de 0,5% después del almacenamiento durante un mes a 40ºC/75% de RH.
Ensayo 1 Ensayo de unión de radioligando Preparación de membranas a partir de células que expresan los subtipos del receptor muscarínico hM_{1}, hM_{2}, hM_{3} y hM_{4}
Estirpes celulares CHO que expresan de forma estable subtipos de receptores muscarínicos hM_{1}, hM_{2}, hM_{3} y hM_{4} clonados humanos, respectivamente, se hicieron crecer hasta casi confluencia en medio que consiste en F-12 de HAM suplementado con FBS al 10% y 250 \mug/ml de geneticina. Las células se hicieron crecer en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC, y se recogieron con 2 mM de EDTA en dPBS. Las células se recogieron por centrifugación de 5 minutos a 650 x g, y los peletes celulares se almacenaron congelados a -80ºC, o las membranas se prepararon inmediatamente. Para la preparación de las membranas, los peletes celulares se resuspendieron en tampón de lisis y se homogeneizaron con un destructor de tejidos Polytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 ráfagas). Las membranas brutas se centrifugaron a 40.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El pelete de membranas se resuspendió entonces con tampón de resuspensión, y se homogeneizó de nuevo con el destructor de tejidos Polytron. La concentración de proteínas de la suspensión de membranas se determinó por el método descrito en Lowry, O. et al., 1951, Journal of Biochemistry 193:265 (1951). Todas las membranas se almacenaron congeladas en alícuotas a -80ºC, o se usaron inmediatamente. Las alícuotas de las membranas del receptor hM_{5} preparadas se adquirieron directamente en Perkin Elmer, y se almacenaron a -80ºC hasta su uso.
Ensayo de unión de radioligandos para subtipos hM_{1}, hM_{2}, hM_{3} y hM_{4} del receptor muscarínico
Se llevaron a cabo ensayos de unión de radioligandos en placas de microtitulación de 96 pocillos en un volumen total de ensayo de 100 \mul. Las membranas de las células CHO que expresan de manera estable el subtipo muscarínico hM_{1}, hM_{2}, hM_{3}, hM_{4} o hM_{5} se diluyeron en tampón de ensayo hasta las siguientes concentraciones de proteínas diana específicas (\mug/pocillo): 10 \mug para hM_{1}, 10-15 \mug para hM_{2}, 10-20 \mug para hM_{3}, 10-20 \mug para hM_{4} y 10-12 \mug para hM_{5}. Las membranas se homogeneizaron brevemente usando un destructor de tejidos Polytron (10 segundos) antes de la adición a la placa de ensayo. Se llevaron a cabo estudios de unión por saturación para determinar los valores de K_{D} del radioligando, usando cloruro de L-[N-metil-^{3}H]escopolamina metilo ([^{3}H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmoles, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) a concentraciones comprendidas entre 0,001 nM y 20 nM. Se llevaron a cabo ensayos de desplazamiento para la determinación de los valores de K_{i} de los compuestos de ensayo, con [^{3}H]-NMS a 1 nM y once concentraciones diferentes de compuesto de ensayo. Los compuestos de ensayo se disolvieron inicialmente hasta una concentración de 400 \muM en el tampón de dilución, y a continuación se diluyeron en serie 5x con tampón de dilución hasta concentraciones finales que están comprendidas entre 10 pM y 100 \muM. El orden y los volúmenes de adición a las placas de ensayo fueron los siguientes: 25 \mul de radioligando, 25 \mul de compuesto de ensayo diluido, y 50 \mul de membranas. Las placas de ensayo se incubaron durante 60 minutos a 37ºC. Las reacciones de unión se terminaron por filtración rápida sobre placas de filtro de fibra de vidrio GF/B (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) pretratadas en BSA al 1%. Las placas de filtro se enjuagaron tres veces con tampón de lavado (HEPES 10 mM) para eliminar la radioactividad no unida. Las placas se secaron entonces al aire, y se añadió a cada pocillo 50 \mul de fluido de centelleo de líquidos Microscint-20 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Las placas se contaron entonces en un contador de centelleo de líquidos Topcount de PerkinElmer (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Los datos de unión se analizaron mediante análisis de regresión no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de competición por un sitio. Los valores de K_{i} para los compuestos de ensayo se calcularon a partir de los valores IC_{50} observados y el valor de K_{D} del radioligando usando la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng Y.; Prusoff WH. (1973) Biochemical Pharmacology 22(23):3099-108 (1973)). Los valores de K_{i} se convirtieron en valores de pK_{i} para determinar la media geométrica y los intervalos de confianza del 95%. Estos resúmenes estadísticos se volvieron a convertir a continuación en valores de K_{i} para el informe de los datos.
En este ensayo, un menor valor de K_{i} indica que el compuesto de ensayo tiene una mayor afinidad de unión por el receptor ensayado. Se encontró que los compuestos de formula I tienen un valor de K_{i} menor que aproximadamente 5 nM para el subtipo del receptor muscarínico M_{3} cuando se ensaya en este o en un ensayo similar.
Ensayo 2 Ensayos de potencia funcional del receptor muscarínico Bloqueo de la inhibición, mediada por el agonista, de la acumulación de cAMP
En este ensayo, la potencia funcional de un compuesto de ensayo se determinó midiendo la capacidad del compuesto de ensayo para bloquear la inhibición por oxotremorina de la acumulación de cAMP mediada por forskolina en células CHO-K1 que expresan el receptor hM_{2}.
Se llevaron a cabo ensayos de cAMP en un formato de radioinmunoensayo usando el Sistema de Ensayo de Activación de Adenilil Ciclasa en Flashplate, con ^{125}I-cAMP (NEN SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), según las instrucciones del fabricante.
Las células se enjuagaron una vez con dPBS y se recogieron con disolución de tripsina-EDTA (tripsina al 0,05%/
EDTA 0,53 mM) como se describió en la sección anterior de Preparación de cultivos celulares y membranas. Las células desprendidas se lavaron dos veces mediante centrifugación a 650 x g durante cinco minutos en 50 ml de dPBS. El pelete celular se resuspendió después en 10 ml de dPBS, y las células se contaron con un contador de partículas dual Coulter Z1 (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las células se centrifugaron nuevamente a 650 x g durante cinco minutos, y se resuspendieron en tampón de estimulación hasta una concentración de ensayo de 1,6 x 10^{6} - 2,8 x 10^{6} células/ml. El compuesto de ensayo se disolvió inicialmente hasta una concentración de 400 \muM en tampón de dilución (dPBS suplementado con 1 mg/ml de BSA (0,1%)), y entonces se diluyó en serie con tampón de dilución hasta concentraciones molares finales comprendidas entre 100 \muM y 0,1 nM. La oxotremorina se diluyó de manera similar.
Para medir la inhibición por oxotremorina de la actividad de AC (adenilil ciclasa), se añadieron a los pocillos de ensayo del agonista 25 \mul de forskolina (concentración final 25 \muM diluida en dPBS), 25 \mul de oxotremorina diluida, y 50 \mul de células. Para medir la capacidad de un compuesto de ensayo para bloquear la actividad de AC inhibida por oxotremorina, se añadieron a los pocillos de ensayo restantes 25 \mul de forskolina y oxotremorina (concentraciones finales de 25 \muM y 5 \muM, respectivamente, diluidas en dPBS), 25 \mul de compuesto de ensayo diluido, y 50 \mul de células.
Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 37ºC y se detuvieron mediante adición de 100 \mul de tampón de detección enfriado en hielo. Las placas se sellaron, se incubaron toda la noche a temperatura ambiente, y se contaron a la mañana siguiente en un contador de centelleo de líquidos TopCount de PerkinElmer (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). La cantidad de cAMP producido (pmoles/pocillo) se calculó basándose en los recuentos observados para las muestras y patrones de cAMP, como se describe en el manual del usuario del fabricante. Los datos se analizaron mediante análisis de regresión no lineal con el paquete informático GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuación de regresión no lineal de competición por un sitio. Se usó la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular la K_{i}, usando la EC_{50} de la curva de respuesta frente a la concentración de oxotremorina y la concentración del ensayo de oxotremorina como la K_{D} y [L], respectivamente. Los valores de K_{i} se convirtieron en valores de pK_{i} para determinar la media geométrica y los intervalos de confianza del 95%. Estos resúmenes estadísticos se volvieron a convertir a continuación en valores de K_{i} para el informe de los datos.
En este ensayo, un menor valor de K_{i} indica que el compuesto de ensayo tiene una mayor actividad funcional en el receptor ensayado. Se encontró que el compuesto de fórmula I tiene un valor de K_{i} menor que aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la inhibición por oxotremorina de la acumulación de cAMP mediada por forskolina en células CHO-K1 que expresan el receptor hM_{2}, cuando se ensaya en este ensayo o en un ensayo similar.
Bloqueo de la unión de [^{35}S]GTP\gammaS mediada por el agonista
En un segundo ensayo funcional, la potencia funcional de los compuestos de ensayo se determinó midiendo la capacidad de los compuestos para bloquear la unión de [^{35}S]GTP\gammaS estimulada por oxotremorina en células CHO-K1 que expresan el receptor de hM_{2}.
En el momento del uso, las membranas congeladas se descongelaron y después se diluyeron en tampón de ensayo con una concentración de tejido diana final de 5-10 \mug de proteína por pocillo. Las membranas se homogeneizaron brevemente usando un destructor de tejidos PT-2100 de Polytron, y después se añadieron a las placas de ensayo. En cada experimento se determinó el valor de EC_{90} (concentración eficaz para una respuesta máxima del 90%) para la estimulación de la unión de [^{35}S]GTP\gammaS por el agonista oxotremorina.
Para determinar la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la unión de [^{35}S]GTP\gammaS estimulada por oxotremorina, se añadió lo siguiente a cada pocillo de placas de 96 pocillos: 25 \mul de tampón de ensayo con [^{35}S]GTP\gammaS (0,4 nM), 25 \mul de oxotremorina (EC_{90}) y GDP (3 \muM), 25 \mul del compuesto de ensayo diluido y 25 \mul de membranas de células CHO que expresan el receptor hM_{2}. Las placas de ensayo se incubaron entonces a 37ºC durante 60 minutos. Las placas de ensayo se filtraron sobre filtros GF/B pretratados con BSA al 1%, usando un cosechador PerkinElmer de 96 pocillos. Las placas se enjuagaron con tampón de lavado enfriado con hielo, durante 3 x 3 segundos, y después se secaron con aire o a vacío. Se añadió líquido de centelleo Microscint-20 (50 \mul) a cada pocillo, y cada placa se selló y se contó la radioactividad en un Topcounter (PerkinElmer). Los datos se analizaron mediante análisis de regresión no lineal con el paquete informático GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuación de regresión no lineal de competición por un punto. Se usó la ecuación de Cheng-Prusoff para calcular la K_{i}, usando los valores de IC_{50} de la curva de respuesta frente a la concentración para el compuesto de ensayo y la concentración de oxotremorina en el ensayo como la K_{D} y [L], la concentración del ligando, respectivamente.
En este ensayo, un menor valor de K_{i} indica que el compuesto de ensayo tiene una mayor actividad funcional en el receptor ensayado. Se encontró que el compuesto de fórmula I tiene un valor de K_{i} menor que aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la unión de [^{35}S]GTP\gammaS estimulada por oxotremorina en células CHO-K1 que expresan el receptor hM_{2}, cuando se ensaya en este ensayo o en un ensayo similar.
Bloqueo de la liberación de calcio, mediada por el agonista, mediante ensayos FLIPR
Los subtipos del receptor muscarínico (receptores M_{1}, M_{3} y M_{5}), que se acoplan a proteínas Gq, activan la ruta de la fosfolipasa C (PLC) con la unión del agonista al receptor. Como resultado, la PLC activada hidroliza el difosfato de fosfatil-inositol (PIP_{2}) a diacilglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato de fosfatidilo (IP_{3}), que a su vez genera liberación de calcio de los depósitos intracelulares, es decir, el retículo endoplásmico y sarcoplásmico. El ensayo FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) aprovecha este aumento de calcio intracelular usando un colorante sensible al calcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) que produce fluorescencia cuando se une el calcio libre. Este fenómeno de fluorescencia se mide en tiempo real por el FLIPR, que detecta el cambio en la fluorescencia procedente una monocapa de células clonadas con receptores M_{1} y M_{3} humanos y M_{5} de chimpancé. La potencia antagonista se puede determinar mediante la capacidad de los antagonistas para inhibir los aumentos, mediados por el agonista, en el calcio intracelular.
Para los ensayos FLIPR de estimulación de calcio, las células CHO que expresan de manera estable los receptores hM_{1}, hM_{3} y cM_{5} se sembraron en placas FLIPR de 96 pocillos la noche antes de que se llevase a cabo el ensayo. Las células sembradas se lavaron dos veces mediante Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) con tampón de FLIPR (HEPES 10 mM, pH 7,4, cloruro de calcio 2 mM, probenecida 2,5 mM en HBSS (disolución salina tamponada de Hank) sin calcio ni magnesio) para eliminar el medio de crecimiento y dejar 50 \mul/pocillo de tampón de FLIPR. Las células se incubaron entonces con 50 \mul/pocillo de FLUO-4AM 4 \muM (se preparó una solución 2x) durante 40 minutos a 37ºC, dioxido de carbono al 5%. Tras el periodo de incubación con el colorante, las células se lavaron dos veces con tampón de FLIPR, dejando un volumen final de 50 \mul/pocillo.
Para determinar la potencia antagonista, se determina en primer lugar la estimulación, dependiente de la dosis, de la liberación de Ca^{2+} intracelular para la oxotremorina, de modo que la potencia antagonista se puede medir más tarde frente a la estimulación por la oxotremorina a una concentración de EC_{90}. Las células se incubaron en primer lugar con tampón de dilución del compuesto durante 20 minutos, seguido de adición del agonista, que se lleva a cabo mediante el FLIPR. Se generó un valor de EC_{90} para la oxotremorina según el método detallado en la sección de medición mediante FLIPR y reducción de datos más abajo, junto con la fórmula EC_{F} = ((F/100-F)^1/H) * EC_{50}. Se prepara una concentración de oxotremorina de 3 x EC_{F} en placas de estimulación, de modo que se añade una concentración EC_{90} de oxotremorina a cada pocillo en las placas de ensayo de inhibición del antagonista.
Los parámetros usados para el FLIPR fueron: duración de la exposición de 0,4 segundos, potencia del láser de 0,5 vatios, longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda de emisión de 550 nm. El valor de referencia se determinó midiendo el cambio de fluorescencia durante 10 segundos antes de la adición del agonista. Después de la estimulación con el agonista, el FLIPR midió continuamente el cambio de fluorescencia cada 0,5 a 1 segundo durante 1,5 minutos, para capturar el cambio de fluorescencia máximo.
El cambio de fluorescencia se expresa como la fluorescencia máxima menos la fluorescencia del valor de referencia, para cada pocillo. Los datos en bruto se analizan frente al logaritmo de la concentración de fármaco mediante regresión no lineal con GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo integrado para la respuesta a la dosis sigmoidea. Los valores de K_{i} del antagonista se determinaron mediante Prism usando el valor de EC_{50} de la oxotremorina como la K_{D} y la EC_{90} de la oxotremorina para la concentración del ligando, según la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng y Prusoff, 1973).
En este ensayo, un menor valor de K_{i} indica que el compuesto de ensayo tiene una mayor actividad funcional en el receptor ensayado. Se encontró que el compuesto de fórmula I tiene un valor de K_{i} menor que aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la liberación del calcio, mediada por el agonista, en células CHO que expresan de manera estable el receptor hM_{3}, cuando se ensaya en este o en un ensayo similar.
Ensayo 3 Determinación de la duración de la broncoprotección en modelo de cobaya de broncoconstricción inducida por acetilcolina
Este ensayo in vivo se usó para evaluar los efectos broncoprotectores de los compuestos de ensayo que muestran actividad antagonista del receptor muscarínico. Grupos de seis cobayas macho (Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI), que pesan entre 250 y 350 g, se identificaron individualmente mediante tarjetas de jaula. Durante todo el estudio, a los animales se les permitió el acceso libre a la comida y al agua.
Los compuestos de ensayo se administraron por inhalación durante 10 minutos en una cámara dosificadora de exposición de todo el cuerpo (R&S Molds, San Carlos, CA). Las cámaras dosificadoras se dispusieron de modo que se suministró simultáneamente un aerosol a las 6 cámaras individuales de un colector central. Los cobayas se expusieron a un aerosol de un compuesto de ensayo o vehículo (WFI). Estos aerosoles se generaron a partir de disoluciones acuosas usando un LC Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) portado por una mezcla de gases (CO_{2} = 5%, O_{2} = 21% y N_{2} = 74%) a una presión de 22 psi. El caudal de gas a través del nebulizador a esta presión de funcionamiento fue de aproximadamente 3 l/minuto. Los aerosoles generados se introdujeron en las cámaras mediante presión positiva. No se usó aire de dilución durante el suministro de las disoluciones aerosolizadas. Durante la nebulización de 10 minutos, se nebulizaron aproximadamente 1,8 ml de disolución. Este valor se midió por gravimetría comparando los pesos antes y después de la nebulización del nebulizador lleno.
Los efectos broncoprotectores de los compuestos de ensayo administrados por inhalación se evaluaron usando pletismografía de cuerpo completo a 1,5, 24, 48 y 72 horas después de la dosis.
Cuarenta y cinco minutos antes del comienzo de la evaluación pulmonar, cada cobaya se anestesió con una inyección intramuscular de cetamina (43,75 mg/kg), xilazina (3,50 mg/kg) y acepromazina (1,05 mg/kg). Después de que la zona quirúrgica se rasura y se limpia con alcohol al 70%, se realiza una incisión de 2-3 cm en la línea media del aspecto ventral del cuello. A continuación, la vena yugular se aisló y se canuló con un catéter de polietileno relleno con disolución salina (PE-50, Becton Dickinson, Sparks, MD), para permitir infusiones intravenosas de ACh (acetilcolina) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en disolución salina. La tráquea se disecó entonces libre y se canuló con un tubo de teflón 14G (#NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Si se requiere, la anestesia se mantiene mediante inyecciones intramusculares adicionales de la mezcla anestésica mencionada anteriormente. La profundidad de la anestesia se monitoriza y se ajusta si el animal responde al pinchado de su pata, o si el ritmo respiratorio es mayor que 100 respiraciones/minuto.
Una vez finalizadas las canulaciones, se colocó al animal en un pletismógrafo (#PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) y se insertó una cánula esofágica de presión (PE-160, Becton Dickinson, Sparks, MD) para medir la presión de conducción pulmonar (presión). El tubo traqueal de teflón se acopló a la abertura del pletismógrafo para permitir que el cobaya respirase aire de la habitación procedente del exterior de la cámara. La cámara se selló entonces. Se usó una lámpara calefactora para mantener la temperatura corporal, y los pulmones de los cobayas se inflaron 3 veces con 4 ml de aire usando una jeringuilla de calibración de 10 ml (#5520 Series, Hans Rudoph, Kansas City, MO) para asegurar que las vías respiratorias inferiores no se colapsaban y que el animal no padecía hiperventila-
ción.
Una vez determinados los valores de referencia dentro del intervalo de 0,3-0,9 ml/cm de H_{2}O para la aceptación, y dentro del intervalo de 0,1-0,199 cm de H_{2}O/ml por segundo para la resistencia, se inició la evaluación pulmonar. Un programa informático de medición pulmonar Buxco permitió la recolección y derivación de los valores pulmo-
nares.
El comienzo de este programa inició el protocolo experimental y la recogida de datos. Los cambios de volumen a lo largo del tiempo que se producen dentro del pletismógrafo con cada respiración se midieron mediante un transductor de presión Buxco. Integrando esta señal a lo largo del tiempo, se calculó una medición de caudal para cada respiración. Esta señal, junto con los cambios de presión de conducción pulmonar, que se recogieron usando un transductor de presión Sensym (#TRD4100), se conectó mediante un pleamplificador Buxco (MAX 2270) a una interfaz de recogida de datos (n^{os} SFT3400 y SFT3813). Todos los otros parámetros pulmonares procedían de estas dos
entradas.
Se recogieron valores de referencia durante 5 minutos, después de cuyo periodo los cobayas se expusieron a ACh. Se infundió ACh (0,1 mg/ml) por vía intravenosa durante 1 minuto desde una bomba de jeringuilla (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) a las siguientes dosis y tiempos prescritos desde el comienzo del experimento: 1,9 \mug/minuto a los 5 minutos, 3,8 \mug/minuto a los 10 minutos, 7,5 \mug/minuto a los 15 minutos, 15,0 \mug/minuto a los 20 minutos, 30 \mug/minuto a los 25 minutos y 60 \mug/minuto a los 30 minutos. Si la resistencia o cumplimiento no vuelve a los valores de referencia a 3 minutos después de cada dosis de ACh, los pulmones de los cobayas se inflan 3 veces con 4 ml de aire procedente de una jeringuilla de calibración de 10 ml. Los parámetros pulmonares registrados incluían la frecuencia de la respiración (respiraciones/minuto), cumplimiento (ml/cm de H_{2}O) y resistencia pulmonar (cm de H_{2}O/ml por segundo). Una vez completadas las mediciones de la función pulmonar en el minuto 35 de este protocolo, el cobaya se retiró del pletismógrafo y se le practicó la eutanasia mediante asfixia con dióxido de carbono.
Los datos se evaluaron de una de dos maneras:
(a)
Se calculó la resistencia pulmonar (R_{L}, cm de H_{2}O/ml por segundo) a partir de la relación de "cambio de presión" a "cambio de caudal". La respuesta R_{L} a ACh (60 \mug/min, IH) se calculó para los grupos del vehículo y del compuesto de ensayo. La respuesta media a ACh en los animales tratados con el vehículo, en cada tiempo de pretratamiento, se calculó y se usó para calcular el % de inhibición de la respuesta a ACh, en el tiempo de pretratamiento correspondiente, a cada dosis del compuesto de ensayo. Las curvas para "R_{L}" de respuesta frente a la dosis de inhibición se ajustaron con una ecuación logística de cuatro parámetros usando GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California), para estimar la ID_{50} broncoprotectora (dosis requerida para inhibir la respuesta broncoconstrictora de ACh (60 \mug/min.) en un 50%). La ecuación usada fue la siguiente:
8
en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% de inhibición del aumento inducido por ACh en R_{L}). Y comienza en el Mín. y se aproxima asintóticamente al Máx. con forma sigmoidea.
(b)
La cantidad PD_{2}, que se define como la cantidad de ACh o de histamina necesaria para producir el doble de la resistencia pulmonar de referencia, se calculó usando los valores de la resistencia pulmonar derivados del caudal y de la presión en un intervalo de exposiciones a ACh o a histamina usando la siguiente ecuación (que se obtuvo de una ecuación usada para calcular los valores PC_{20} descritos en la American Thoracic Society. Guidelines for methacholine and exercise challenge testing - 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161: 309-329 (2000)):
9
en la que: C_{1} es la concentración de ACh o histamina que precede a C_{2}; C_{2} es la concentración de ACh o histamina que da como resultado al menos un aumento de dos veces de la resistencia pulmonar (R_{L}); R_{0} es el valor R_{L} de referencia; R_{1} es el valor R_{L} después de C_{1}; y R_{2} es el valor R_{L} después de C_{2}. Una dosis eficaz se define como una dosis que limita la respuesta de la broncoconstricción a una dosis de 50 \mug/ml de ACh hasta el doble de la resistencia pulmonar del valor de referencia (PD_{2(50)}).
El análisis estadístico de los datos se realizó usando la prueba de la t de Student de dos colas. Un valor P <0,05 se consideró significativo. Generalmente, se prefieren compuestos de ensayo que tienen una PD_{2(50)} menor que aproximadamente 200 \mug/ml para la broncoconstricción inducida por ACh a 1,5 horas después de la dosis en este ensayo. Se espera que el compuesto de fórmula I tenga una PD_{2(50)} menor que aproximadamente 200 \mug/ml para la broncoconstricción inducida por ACh a 1,5 horas después de la dosis, cuando se ensayo en este ensayo o en uno similar.
Ensayo 4 Ensayo de salivación de cobayas por inhalación
Cobayas (Charles River, Wilmington, MA) que pesaban 200-350 g se aclimataron durante al menos 3 días después de la llegada en la colonia de cobayas enjaulada. El compuesto de ensayo o vehículo se dosificó mediante inhalación (IH) durante un periodo de tiempo de 10 minutos en una cámara dosificadora con forma de pastel (R&S Molds, San Carlos, CA). Las disoluciones de ensayo se disolvieron en agua esterilizada y se suministraron usando un nebulizador relleno con 5,0 ml de disolución de dosificación. Se encerró a los cobayas en la cámara de inhalación durante 30 minutos. Durante este periodo, se encerró a los cobayas en un área de aproximadamente 110 cm^{2}. Este espacio es adecuado para que los animales giren libremente, se recoloquen y se acicalen. Después de 20 minutos de aclimatación, los cobayas se expusieron a un aerosol generado a partir de un LS Star Nebulizer Set (modelo 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc., Midlothian, VA) accionado por aire de la jaula a una presión de 22 psi. Una vez terminada la nebulización, los cobayas se evaluaron a las 1,5, 6, 12, 24, 48 ó 72 h. después del tratamiento.
Los cobayas se anestesiaron una hora antes del ensayo con una inyección intramuscular (IM) de una mezcla de 43,75 mg/kg de ketamina, 3,5 mg/kg de xilazina y 1,05 mg/kg de acepromazina a un volumen de 0,88 ml/kg. Se colocó a los animales en posición ventral en una manta calefactada (37ºC) con una inclinación de 20 grados con su cabeza en pendiente cuesta abajo. Una almohadilla de gasa de 2 x 2 pulgadas de 4 capas (Nu-Gauze General-use sponges, Johnson and Johnson, Arlington, TX) se insertó en la boca de los cobayas. Cinco minutos después, se administró el agonista muscarínico pilocarpina (3,0 mg/kg, s.c.), y la almohadilla de gasa se desechó inmediatamente y se sustituyó por una nueva almohadilla de gasa pesada previamente. Se recogió la saliva durante 10 minutos, en cuyo momento la almohadilla de gasa se pesó y se registró la diferencia de peso para determinar la cantidad de saliva acumulada (en mg). Se calculó la cantidad media de saliva recogida para los animales que reciben el vehículo y cada dosis de compuesto de ensayo. La media del grupo del vehículo se consideró como 100% de salivación. Los resultados se calcularon usando los medias de resultados (n = 3 o mayor). Los intervalos de confianza (95%) se calcularon para cada dosis en cada punto de tiempo usando ANOVA de dos vías. Este modelo es una versión modificada del procedimiento descrito en Rechter, "Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation" Ata. Pharmacol. Toxicol. 24:243-254 (1996).
Se calculó el peso medio de saliva en los animales tratados con el vehículo, en cada tiempo de pretratamiento, y se usó para calcular el % de inhibición de la salivación, en el tiempo de pretratamiento correspondiente, a cada dosis. Los datos de respuesta frente a la dosis de inhibición se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando GraphPad Prism, versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California), para estimar la ID_{50} (dosis requerida para inhibir el 50% de salivación provocada por pilocarpina) del anti-sialagogo. La ecuación usada es la siguiente:
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en la que X es el logaritmo de la dosis, Y es la respuesta (% de inhibición de la salivación). Y comienza en el Mín., y se aproxima asintóticamente al Máx. con forma sigmoidea.
Se usó la relación de ID_{50} del antisialagogo a ID_{50} broncoprotectora para calcular el índice de selectividad pulmonar aparente del compuesto de ensayo. Generalmente, se prefieren los compuestos que tienen un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que aproximadamente 5. Se espera que el compuesto de fórmula I tenga un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que aproximadamente 5, cuando se ensaya en este o en un ensayo similar.
Ensayo 5 Respuestas depresoras inducidas por metacolina en cobayas conscientes
En estos estudios se usaron cobayas macho Sprague-Dawley adultas sanas (Harlan, Indianápolis, IN), que pesan entre 200 y 300 g. Bajo anestesia de isoflurano (para efecto), los animales se instrumentaron con catéteres habituales para la arteria carótida y la vena yugular (tubería PE-50). Los catéteres se exteriorizaron usando un túnel subcutáneo al área subescapular. Todas las incisiones quirúrgicas se suturaron con seda 4-0 Ethicon Silk, y los catéteres se bloquearon con heparina (1000 unidades/ml). A cada animal se le administró disolución salina (3 ml, S.C.) al final de la cirugía, así como buprenorfina (0,05 mg/kg, I1VI). Se dejó que los animales se recuperaran sobre una almohadilla calefactora antes de devolverlos a sus jaulas.
Aproximadamente 18 a 20 horas tras la cirugía, los animales se pesaron, y el catéter de la arteria carótida en cada animal se conectó a un transductor para registrar la tensión arterial. Se registraron la tensión arterial y el ritmo cardíaco usando un sistema de adquisición Biopac MP-100. Se dejó que los animales se aclimatasen y se estabilizasen durante un período de 20 minutos.
Cada animal se expuso a MCh (0,3 mg/kg, IV), administrada a través de la tubería de la vena yugular, y se monitorizó durante 10 minutos la respuesta cardiovascular. Los animales se colocaron entonces en la cámara de dosificación de cuerpo completo, que está conectada a un nebulizador que contiene la disolución de compuesto de ensayo o de vehículo. La disolución se nebuliza durante 10 minutos usando una mezcla gaseosa de aire respirable y dióxido de carbono al 5%, con un caudal de 3 litros/minuto. Los animales se retiraron entonces de la cámara de cuerpo completo y se devolvieron a sus jaulas respectivas. A 1,5 y 24 horas después de la dosificación, los animales se volvieron a exponer a MCh (0,3 mg/kg, IV), y se determinó la respuesta hemodinámica. Después, los animales se eutanasiaron con pentobarbital sódico (150 mg/kg, IV).
MCh produce una disminución en la tensión arterial media (MAP), y una disminución en la frecuencia cardíaca (bradicardia). La disminución del pico, a partir del valor de referencia, en MAP (respuestas depresoras) se mide para cada exposición a MCh (antes y después de la dosificación mediante IH). Los efectos del tratamiento sobre las respuestas de MCh se expresan como % de inhibición (media +/- SEM) de las respuestas depresoras del control. Para ensayar los efectos de tratamiento y del tiempo de pretratamiento, se usó un ANOVA de dos vías con el ensayo post-hoc apropiado. Se espera que las respuestas depresoras a MCh no cambien relativamente a 1,5 y 24 horas después de la dosificación de inhalación con vehículo.
Se usó la relación de ID_{50} del antisialagogo a ID_{50} broncoprotectora para calcular el índice de selectividad pulmonar aparente del compuesto de ensayo. Generalmente, se prefieren los compuestos que tienen un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que 5. Se espera que el compuesto de fórmula I tenga un índice de selectividad pulmonar aparente mayor que 5, cuando se ensaya en este o en un ensayo similar.

Claims (30)

1. Sal o base libre farmacéuticamente aceptable cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]netilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico, que tiene la fórmula I:
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o solvato farmacéuticamente aceptable de estas.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la sal o la base libre cristalina de fórmula 1 es una sal de difosfato, caracterizado porque al menos uno de (i) tiene un patrón de difracción de rayos X de polvo que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 6,4\pm0,2, 7,6\pm0,2, 8,6\pm0,2, 13,7\pm0,2, 15,0\pm0,2, 19,4\pm0,2, 21,6\pm0,2, 22,1\pm0,2, 22,9\pm0,2, y 23,7\pm0,2; y (ii) una traza de análisis calorimétrico diferencial de barrido que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 154,5ºC.
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la sal o la base libre cristalina de fórmula I es una sal de monosulfato, caracterizado por al menos uno de (i) un patrón de difracción de rayos X de polvo que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 7,7\pm0,2, 8,4\pm0,2, 8,8\pm0,2, 12,6\pm0,2, 13,7\pm0,2, 14,1\pm0,2, 15,3\pm0,2, 16,0\pm0,2, 19,7\pm0,2, 20,6\pm0,2, 23,0\pm0,2, y 24,4\pm0,2; y (ii) una traza de análisis calorimétrico diferencial de barrido que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 76,5ºC.
4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la sal o la base libre cristalina de fórmula I es una sal de monosulfato, caracterizado por al menos uno de (i) un patrón de difracción de rayos X de polvo que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 7,7\pm0,2, 8,7\pm0,2, 13,5\pm0,2, 14,0\pm0,2, 14,8\pm0,2, 15,4\pm0,2, 15,8\pm0,2, 19,4\pm0,2, 22,9\pm0,2, 23,3\pm0,2, y 24,6\pm0,2; y (ii) una traza de análisis calorimétrico diferencial de barrido que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 73,7ºC.
5. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la sal o la base libre cristalina de fórmula I es una base libre, caracterizado por al menos uno de (i) un patrón de difracción de rayos X de polvo que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 4,7\pm0,2, 9,6\pm0,2, 12,7\pm0,2, 13,7\pm0,2, 16,7\pm0,2, 17,4\pm0,2, 18,5\pm0,2, 19,4\pm0,2, 20,8\pm0,2, 21,4\pm0,2, 24,2\pm0,2, y 25,6\pm0,2; y (ii) una traza de análisis calorimétrico diferencial de barrido que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 102,7ºC.
6. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la sal o la base libre cristalina de fórmula 1 es una base libre, caracterizado por al menos uno de (i) un patrón de difracción de rayos X de polvo que tiene dos o más picos de difracción a valores 2\theta seleccionados de 4,6\pm0,2, 9,3\pm0,2, 12,9\pm0,2, 13,6\pm0,2, 14,0\pm0,2, 14,6\pm0,2, 16,5\pm0,2, 18,64\pm0,2, 19,1\pm0,2, 20,9\pm0,2, 22,1\pm0,2, 22,7\pm0,2, y 25,7\pm0,2, y (ii) una traza de análisis calorimétrico diferencial de barrido que muestra un flujo de calor endotérmico máximo a aproximadamente 98,6ºC.
7. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Composición según la reivindicación 7, que comprende además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado de agonistas del receptor \beta_{2} adrenérgico, agentes antiinflamatorios esteroideos, inhibidores de fosfodiésterasa-4, y combinaciones de estos; en la que el compuesto y el agente están formulados juntos o separadamente.
9. Composición según la reivindicación 8, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico y de un agente antiinflamatorio esteroideo.
10. Composición según la reivindicación 8, en la que el agonista del receptor \beta_{2} adrenérgico es una sal de monohidrocloruro de N-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido-4-hidroxifenil)etilamina.
11. Composición según la reivindicación 8, en la que el agente antiinflamatorio esteroideo es éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxoandrosta-1,4-dien-17\beta-carbotioico.
12. Composición según la reivindicación 7, en la que la composición se formula para una administración por inhalación.
13. Composición según la reivindicación 7, en la que el vehículo es una disolución salina isotónica acosa que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.
14. Composición según la reivindicación 13, que comprende un tampón de citrato.
15. Dispositivo de suministro de fármaco que comprende un inhalador de polvo seco que contiene la composición según la reivindicación 7.
16. Forma cristalina de compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en forma micronizada.
17. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y el compuesto según la reivindicación 16.
18. Composición según la reivindicación 17, en la que el vehículo es lactosa.
19. Procedimiento para preparar el compuesto según la reivindicación 2, que comprende poner en contacto éster 1-(2{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido fosfórico.
20. Procedimiento para preparar el compuesto según la reivindicación 3, que comprende poner en contacto éster 1-(2{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmeti)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido sulfúrico.
21. Procedimiento para preparar el compuesto según la reivindicación 4, que comprende:
\quad
formar un cristal de siembra de una sal de dioxalato de éster 1-(2{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico poniendo en contacto éster 1-(2{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilaminoletil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido oxálico;
\quad
formar una sal de dioxalato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilaminoletil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino]etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con ácido oxálico, y disolver la sal en un diluyente inerte para formar una disolución, y
\quad
añadir el cristal de siembra a la disolución.
22. Procedimiento para preparar el compuesto según la reivindicación 5 ó 6, que comprende:
\quad
formar un cristal de siembra de una base libre cristalina poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoil-piperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con un diluyente inerte;
\quad
formar una base libre cristalina poniendo en contacto éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilaminoletil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico con un diluyente inerte, y disolver el éster cristalino resultante para formar una disolución; y
\quad
añadir el cristal de siembra a la disolución.
23. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un procedimiento para purificar éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico, que comprende formar una sal cristalina o una base libre cristalina de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metil-amino]etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico.
24. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en terapia o como un medicamento.
25. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento.
26. Uso según la reivindicación 25, en el que el medicamento es para tratar un trastorno pulmonar.
27. Uso según la reivindicación 25, en el que el medicamento es para producir broncodilatación.
28. Uso según la reivindicación 25, en el que el medicamento es para tratar enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma.
29. Sal de disfosfato, monosulfato o dioxalato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]-metilaminoletil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico.
30. Compuesto según la reivindicación 29, que es una sal bifosfato de éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]-metilamino}etil)piperidin-4-ílico de ácido bifenil-2-ilcarbámico.
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