ES2337679T3 - Composiciones y procedimientos que implican el sitio ii de los receptores nucleares de hormonas. - Google Patents

Composiciones y procedimientos que implican el sitio ii de los receptores nucleares de hormonas. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a un Sitio II de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende: (a) acoplar una entidad química en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 Å en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I, Tabla IV o Tabla V; (b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha entidad química y dicho Sitio II de GR; y (c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.

Description

Composiciones y procedimientos que implican el sitio II de los receptores nucleares de hormonas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a un sitio de unión, denominado Sitio II, en receptores nucleares de hormonas. La presente descripción describe: medios de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprenden las coordenadas de estructura del Sitio II; sistemas de ordenador capaces de producir representaciones tridimensionales de todo o cualquier parte del Sitio II; procedimientos usados en el diseño e identificación de ligandos del Sitio II y de moduladores de los receptores nucleares de hormonas (NHR); ligandos del Sitio II; moduladores de los NHR; procedimientos para modular los NHR; composiciones farmacéuticas que comprenden moduladores de NHR; moduladores de un NHR para usar en el tratamiento de enfermedades; procedimientos de diseño de mutantes; mutantes de NHR o partes de mutantes de NHR; procedimientos para medir la unión de una molécula de ensayo al Sitio II; y modelos del Sitio II.
Antecedentes de la invención
La familia de los receptores nucleares de hormonas (NHR) de factores de transcripción se unen a ligandos de bajo peso molecular y estimulan o reprimen la transcripción (en The Nuclear Receptor Facts Book, V. Laudet and H. Gronemeyer, Academic Press, pág. 345, 2002). Los NHR estimulan la transcripción uniéndose al ADN e induciendo la transcripción de genes específicos. Los NHR también pueden estimular la transcripción no uniéndose ellos mismos al ADN, si no modulando la actividad de otras proteínas que se unen al ADN (Stocklin, E., y col., Nature (1996) 383:726-8). El proceso de estimulación de la transcripción se llama transactivación. Los NHR reprimen la transcripción interaccionando con otros factores de transcripción o coactivadores e inhibiendo la capacidad de estos otros factores de transcripción o coactivadores para inducir la transcripción de genes específicos. El proceso de represión de la transcripción se llama transrepresión (para una revisión véase The Nuclear Receptor Factsbook, V. Laudet and H. Gronemeyer, Academic Press, pág. 42, 2002). Por ejemplo, se ha mostrado que el receptor de glucocorticoides, receptor de estrógenos, receptor de andrógenos y receptores \alpha y \gamma activados por el proliferador de peroxisoma, reprimen la actividad de los factores de transcripción AP- 1 y NF-\kappa (Jonat, C., y col., Cell, 62, pág. 1189-1204, (1990) Kallio, P.J., y col., Mol. Endocrinol., 9, pág. 1017-1028 (1995), Keller, E.T., y col., J. Biol. Chem., 271, pág. 26267-26275 (1996), Jones, D.C., y col., J. Biol. Chem., 277 (9), pág. 6838-6845, (2002), Ricote, M., y col., Nature, 391, pág. 79-82, (1998), Valentine, J.E., y col., J. Biol. Chem., 275, pág. 25322-25329, (2000).
La familia de receptores nucleares de hormonas incluye el receptor de glucocorticoides (Hollenberg, S.M. y col. (1985) Nature, 318, pág. 635), receptor de progesterona (Misrahi, M. y col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 143, pág. 740), receptor de andrógenos (Lubahn D. B., y col. (1988), receptores de estrógenos (Green, S., y col. (1986) Nature 320, pág. 134), receptor de mineralocorticoides (Arriza, J.L., y col., (1987) Science 237, pág. 268), receptores retinoides (RXR y RAR) (Mangelsdorf, y col. (1990) Nature, 345, pág. 224 y Petkovich M., y col. (1987) Nature 330, pág. 444), receptor de vitamina D, receptor tiroideo (TR) (Nakai, A. y col., (1988) Mol. Endocrinol. 2, pág. 1087), receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) (Greene, M.E., y col. (1995) Gene Expression 4, pág. 281), receptores nucleares huérfanos y otros. El receptor de glucocorticoides, receptor de progesterona, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos y receptor de mineralocorticoides son receptores de hormonas esteroideas (SHR).
Aunque las secuencias varían entre los diferentes receptores nucleares de hormonas, se pueden dividir en dominios funcionales que incluyen un dominio de transactivación N-terminal, un dominio de unión a ADN central y un dominio de ligando y dimerización C-terminal. Los ligandos que se unen a estos receptores actúan de una forma que depende del ligando, el tipo de célula y el promotor, e incluyen, glucocorticoides, progestinas, retinoides, mineralocorticoides y otros. Además de los esteroides, estudios recientes han mostrado que sustancias no esteroides pueden unirse a los receptores nucleares de hormonas e inducir una respuesta biológica (Coghlan, MJ, y col., J. Med. Chem. 44, pág. 2879, 2001). Se puede producir entrecruzamiento de ligandos entre los receptores, por ejemplo, la progesterona se puede unir no solo al receptor de progesterona sino también al receptor de glucocorticoides (Zhang, S., Mol. Endocrínology 10, pág. 24, 1996).
Se han elucidado las estructuras tridimensionales de algunos de los receptores nucleares de hormonas por cristalización o modelado por homología. Un modelado por homología del receptor de glucocorticoides se describe en el documento WO 00/52050, publicado el 8 de septiembre de 2000.
Publicaciones recientes del mismo grupo de investigación: Bledsoe, y col., Cell, publicación en línea de Cell Press, 1 julio, 2002, DOI:10.1016/S0092867402008176; Cell, Vol 110, 93-105, 12 de julio de 2002; y Apolito, y col., en el documento WO 03/015692 A2, publicado el 27 de febrero de 2003; describen la cristalización con éxito y elucidación estructural por rayos x del LBD del receptor de glucocorticoides en forma de dímero. Las coordenadas de estructura de rayos X se proporcionaron en el documento WO 03/015692. Se encontró que se producía la alteración de la estructura de dímero tras mutación de restos seleccionados en la interfase de la dimerización. A pesar de las similitudes estructurales con otros receptores de esteroides, el dímero de LBD de GR representa una configuración de dímero única. El LBD de GR usado para la cristalización era un mutante (F602S) diseñado para proporcionar una construcción de LBD más soluble.
Recientemente también, Kauppi y col. publicaron la estructura de LBD de GR unido a un antagonista, RU-486, en: the Journal of Biological Chemistry Online, JBC Papers In Press as DOI:10.1074/JBC.M212711200, 9 de abril, 2003; y en J. Biol. Chem, Vol. 278, Issue 25, 22748-22754, 20 de junio, 2003. En esta estructura el LBD de GR presenta un desplazamiento significativo de la hélice 12, típico de la acción antagonista. Además del LBD unido al antagonista, también se ha descrito una estructura de dímero similar a la descrita por Bledsoe y col. La estructura del complejo LBD GR-RU-486 se depositó en el RCSB (Inhz.pbd).
Las estructuras tridimensionales de otros receptores nucleares de hormonas se describen como sigue, con la referencia de RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, pdb file format) entre paréntesis: RXRalfa (1 Ibd) Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 375 pág. 377 (1995); PPAR-gamma (2prg) Nolte, R. T., Wisely, G. B., Westin, S., Cobb, J. E., Lambert, M. H., Kurokawa, R., Rosenfeld, M. G., Willson, T. M., Glass, C. K., Milburn, M. V. Nature 395 pág. 137 (1998); RARgamma (21bd) Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 378 pág. 681 (1995); PR (1a28) Williams, S. P., Sigler, P. B. Nature 393 pág. 392 (1998); VitDR (1dbl) Rochel, N., Wurtz, J. M., Mitschler, A., Klaholz, B., Moras, D. Mol. Cell 5 pág. 173 (2000); AR (1e3g) Matias, P. M., Donner, P., Coelho, R., Thomaz, M., Peixoto, C., Macedo, S., Otto, N., Joschko, S., Scholz, P., Wegg, A., Basler, S., Schafer, M., Egner, U., Carrondo, M. A. J. Biol. Chem. 275 pág. 26164 (2000); ERalpha (1a52) Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 pág. 5998 (1998); ERbeta (112j) Shiau, A. K., Barstad, D., Radek, J. T., Meyers, M. J., Nettles, K. W., Katzenellenbogen, B. S., Katzenellenbogen, J. A., Agard, D. A., Greene, G. L. Nat. Struct. Biol. 9 pág. 359 (2002). En general se cree que todos los ligandos esteroideos se unen a receptores nucleares de hormonas en el sitio de unión de ligando clásico, que se denomina Sitio I (Evans, RM. Science 240, pág. 889, 1988). Los estudios de proteólisis limitada y estudios de transfección celular/mutagénesis han delineado los dominios funcionales de receptores nucleares de hormonas que incluyen un dominio de unión al ADN, dominio de unión al ligando y un dominio de transactivación. Estos estudios proporcionaban la prueba de que las hormonas se unían al dominio de unión del ligando. La mutagénesis de GR ha definido la superficie de interacción de dexametasona, definida como Sitio I, que incluye los aminoácidos Met-560, Met-639, Gln-642 and Thr-739 (Lind, U., y col. J. Biol. Chem. 275, pág. 19041, 2000).
Recientemente, se ha descrito un segundo sitio de unión de ligando en ER-\alpha y ER-\beta basado en el análisis computacional y experimentos de acoplamiento con esteroides (van Horn, W. J. Med. Chem. 45, pág. 584, 2002). Este segundo sitio de unión no está completamente delineado. Se ha descrito que no tiene una función obvia, que es un remanente de la evolución y que está ausente en otros receptores nucleares tales como RAR\gamma. Además, no hay ninguna discusión sobre la transrepresión. Además, en la Conferencia de la Sociedad Endocrina de junio de 2003, presentación OR34-1, Wang, Y., Chirgadze, NY, Briggs, SL, Khan, S., Jensen, EV., Burris, TP., "A second binding site for hydroxytamoxifen with the ligand binding domain of estrogen receptor beta", describe la estructura cristalina del receptor de estrógenos unido con 4-hidroxitamoxifeno, en el que el ligando se encuentra en dos sitios: el bolsillo de unión de esteroides habitual y un segundo sitio situado a lo largo del surco hidrófobo cerca de la región de unión del cofactor. Este segundo sitio está remoto respecto a la situación del Sitio II descrito en esta solicitud.
El receptor de glucocorticoides (GR) es un miembro de la familia de receptores nucleares de hormonas de los factores de transcripción, y un miembro de la familia de hormonas esteroideas de los factores de transcripción. El marcaje de afinidad de la proteína receptora de glucocorticoides permitió la producción de anticuerpos contra el receptor, lo cual facilitó la clonación de los receptores de glucocorticoides humanos (Weinberger, y col. Science 228, pág. 740-742, 1985, Weinberger, y col. Nature, 318, pág. 635-641, 1985) y de rata (Miesfeld, R. Nature, 312, pág. 779-781, 1985). Posteriormente se clonaron los receptores de glucocorticoides de otras especies incluyendo los de ratón (Danielson, M. y col. EMBO J., 5, 2513), oveja (Yang, K., y col. J. Mol. Endocrinol. 8, pág. 173-180, 1992), y mono tití (Brandon, D.D., y col., J. Mol. Endocrinol. 7, pág. 89-96, 1991). Hay también una isoforma distinta en el extremo C-terminal de GR denominada GR-beta. Esta isoforma es idéntica a GR hasta el aminoácido 727 y después diverge en los últimos 15 aminoácidos C-terminales. Se sabe que GR-beta se une a glucocorticoides, no puede transactivar, pero se une a ADN (Hollenberg, SM. y col. Nature, 318, pág. 635, 1985, Bamberger, C.M. y col. J. Clin. Invest. 95, pág. 2435, 1995). Es posible que GR-beta se una a compuestos distintos de los glucocorticoides típicos.
Los glucocorticoides que interaccionan con GR se han usado a lo largo de 50 años para tratar enfermedades inflamatorias. Se ha mostrado claramente que los glucocorticoides ejercen una actividad antiinflamatoria a través de la inhibición por GR de los factores de transcripción NF-\kappaB y AP-1. Esta inhibición se denomina transrepresión. Se ha mostrado que el mecanismo primario para la inhibición de estos factores de transcripción por el GR es por una interacción física directa. Esta interacción altera el complejo del factor de transcripción e inhibe la capacidad de NF-\kappaB y AP-1 para estimular la transcripción (Jonat, C., y col. Cell, 62, pág. 1189, 1990, Yang-Yen, H.F., y col. Cell 62, pág. 1205, 1990, Diamond, M.I. y col. Science 249, pág. 1266, 1990, Caldenhoven, E. y col., Mol. Endocrinol. 9, pág. 401, 1995). También se han propuesto otros mecanismos tales como el secuestro de coactivadores por el GR (Kamer Y, y col., Cell 85, pág. 403, 1996, Chakravarti, D. y col., Nature 383, pág. 99, 1996). NF-\kappaB y AP-1 tienen funciones clave en el inicio y perpetuación de trastornos inflamatorios e inmunológicos (Baldwin, AS, Journal of Clin. Investigation 107, pág. 3, 2001, Firestein, G.S., y Manning, A.M. Arthritis and Rheumatism, 42, pág. 609, 1999, Peltz, G., Curr. Opin, in Biotech. 8, pág. 467, 1997). NF-\kappaB y AP-1 están implicados en la regulación de la expresión de una serie de genes inflamatorias e inmunomoduladores que incluyen: TNF-alfa, IL-1, IL-2, IL-5, moléculas de adhesión (tales como Eselectina), quimioquinas (tales como Eoxtaxina y Rantes), Cox-2, y otros.
Aunque los glucocorticoides son agentes antiinflamatorios muy eficaces, su uso sistémico está limitado por sus efectos secundarios que incluyen la diabetes, osteoporosis, glaucoma, síndrome de Cushingoid, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad y otros. (Stanbury, RM, y Graham, EM, Br. J. Opthalmology 82, pág. 704, 1998, Da Silva, JAP., Bijlsma, J. Rheumatic Disease Clinics of North America, 26, pág. 859, 2000).
Además de conducir a la transrepresión, la interacción de un glucocorticoide con el GR puede conducir a la estimulación por el GR de la transcripción de determinados genes. Esta estimulación de la transcripción se denomina transactivación. La transactivación requiere dimerización del GR y unión al elemento de respuesta de glucocorticoides (GRE). La unión del ADN es mediada por los dedos de Zn en el dominio de unión del ADN (Giguere, V. y col., Cell 46, pág. 645, 1986; Rusconi, S. y Yamamoto, K.R. EMBO J, 6, pág. 1309, 1987). Las interacciones específicas de la secuencia de ADN se determinan por la parte C-terminal del primer dedo de Zn (Danielsen, M., y col. Cell 57, pág. 1131, 1989). Se han identificado varios genes diana de GR incluyendo MMTV, metalotioneina, y tirosina aminotransferasa (Ringold, GM y col., Cell 6, pág. 299,1975; Scheidereit, C., y col. Nature, 304, pág. 749, 1983; Hager, LJ, Palmiter RD, Nature 291, 340, 1981; Grange, T., y col. Oncogene, 20, pág. 3028, 2001). La transrepresión, opuesta a la transactivación, puede ocurrir en ausencia de dimerización, y como se ha mencionado antes, se cree que implica la interacción directa del GR con AP-1 y NF-\kappaB.
Estudios recientes usando un ratón transgénico defectuoso en la dimerización de GR que no pueden unir ADN, han mostrado que las actividades de transactivación (unión al ADN) de GR se podrían separar del efecto de transrepresión (no unión al ADN) del GR. Estos estudios también indican que muchos de los efectos secundarios de la terapia de glucocorticoides se deben a la capacidad de GR para inducir transcripción de diferentes genes implicados en el metabolismo, mientras que la transrepresión, que no requiere la unión del ADN, conduce a la supresión de la inflamación. (Tuckermann, J. y col., Cell 93, pág. 531, 1998; Reichardt, HM. EMBO J, 20, pág. 7168, 2001).
Los compuestos que pueden inducir transrepresión del GR sin inducción o con inducción mínima de la transactivación se han denominado "esteroides disociados" (Vayassiere, BM, y col., Mol. Endocrinology, 11, pág. 1249, 1997). Dichos compuestos "disociados" serían útiles para tratar enfermedades inflamatorias. Véase la figura 1 para una descripción gráfica de la transactivación mediada por dímeros de GR frente a la transrepresión mediada por monómeros de GR. Es posible que estos compuestos "disociados" se unan al GR sin inducir dimerización permitiendo que el monómero transreprima AP-1 y NF-\kappaB. Otra posible explicación es que los compuestos "disociados" pueden alterar la conformación del GR para permitir la transrepresión sin inducir una conformación de unión al ADN.
Hay varios ejemplos en la bibliografía de compuestos que tienen actividad disociada, definida por la relación de la concentración eficaz necesaria para inducir la unión al ADN en un ensayo celular con respecto a la concentración eficaz necesaria para la transrepresión o inhibición de la actividad de AP-1 o NF-\kappaB. La primera descripción de un "esteroide disociado" publicada por Vayssiere, y col. Molecular Endocrinology, 11, pág. 1245, 1997, mostró que un derivado de dexametasona tenía una potente actividad antiinflamatoria in vitro e in vivo con inducción mínima de unión al ADN. Estudios posteriores (Coghlan, MJ, y col., J. Med. Chem. 44, pág. 4481, 2001) han mostrado que los compuestos no esteroideos pueden unirse al GR y provocar actividad transrepresiva con actividad de transactivación moderada. Se cree que cada uno de los compuestos descritos antes actúa a través del sitio de unión de la dexameta-
sona.
Recientemente se ha mostrado que el ácido ursodesoxicólico (UDCA) reprime la actividad de NF-\kappaB por una ruta mediada por el GR. El compuesto parece que está "disociado", puesto que no induce la unión al ADN en un ensayo celular. Este compuesto, aunque actúa de una forma dependiente del GR, no compite con la dexametasona por la unión al GR. Aunque la unión directa del UDCA al GR no se ha demostrado, estudios de mutagénesis sugieren que el dominio de unión al ligando (LBD) del GR es necesario para la actividad. (Miura, T., J. Biol. Chem. 276, pág. 47371, 2001). Sin embargo, estos estudios no delinean los aminoácidos específicos que están implicados en la actividad del UDCA.
Se necesitan en la técnica moduladores de los NHR. Un modulador de un NHR puede ser útil para tratar enfermedades asociados con el NHR, es decir, enfermedades asociadas con los productos de expresión de genes cuya transcripción es estimulada o reprimida por los NHR. Por ejemplo, se necesitan en la técnica moduladores del NHR que induzcan inhibición de AP-1 y NF-\kappaB, ya que dichos moduladores serían útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, tales como osteoartritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra huésped.
En la técnica se necesitan compuestos que tengan actividad disociada, ya que dichos compuestos serían útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario sin presentar efectos secundarios indeseados. Por ejemplo, en el caso del GR, aunque los glucocorticoides son agentes antiinflamatorios potentes, su uso sistémico está limitado por sus efectos secundarios. Un compuesto disociado que retenga la eficacia antiinflamatoria de los glucocorticoides mientras que minimiza los efectos secundarios tales como la diabetes, osteoporosis y glaucoma, sería muy beneficioso para un gran número de pacientes con enfermedades inflamatorias.
Son necesarios en la técnica compuestos que antagonicen la transactivación. Por ejemplo, en el caso del GR, dichos compuestos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades metabólicas asociadas con mayores niveles de glucocorticoides, tales como diabetes, osteoporosis y glaucoma.
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Son necesarios en la técnica compuestos que induzcan la transactivación. Por ejemplo, en el caso del GR, dichos compuestos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades metabólicas asociadas con una deficiencia de glucocorticoides. Dichas enfermedades incluyen la enfermedad de Addison.
Con el fin de diseñar compuestos que modulen un NHR en formas específicas, se necesita entender cómo los ligandos se unen a un NHR y modular la actividad del NHR.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a los siguientes puntos:
(1) Un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse al Sitio II de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:
(a)
acoplar una entidad química en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I, Tabla IV o Tabla V;
(b)
analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha entidad química y dicho Sitio II de GR; y
(c)
seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.
(2) Un procedimiento de diseño de un ligando de un Sitio II de GR que comprende:
(a)
modelar un Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla 1;
(b)
basándose en dicho modelado, diseñar una entidad química que tenga complementaridad de las características estructurales y químicas con dicho Sitio II de GR; y
(c)
seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.
(3) Un procedimiento para identificar un modulador de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:
(a)
acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;
(b)
analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y
(c)
seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo de modulación del GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador, en el que dicho modulador de dicho GR induce transrepresión.
(4) El procedimiento del punto (3), que además comprende uno o más de los siguientes:
(a)
seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio II de GR; y
(b)
seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I de GR.
(5) El procedimiento del punto (3) o (4), en el que el modulador de GR es un compuesto disociado.
(6) El procedimiento de uno cualquiera de los puntos (3) a (5), en el que el modulador del GR antagoniza un modulador que induce transactivación.
\newpage
(7) El procedimiento del punto (3) en el que el Sito II de GR está compuestos de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2.
(8) Un procedimiento para identificar un ligando de un Sitio II de GR, que comprende:
(a)
acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;
(b)
analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y
(c)
seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador.
Los autores de la invención han identificado un segundo sitio de unión en el dominio de unión al ligando de los receptores nucleares de hormonas (NHR). Se hace referencia a este segundo sitio de unión como Sitio II.
El Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667, de acuerdo con la Tabla I. La Tabla I se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 21.
La Figura 2 muestra los aminoácidos del Sitio II en diferentes NHR humanos. Las coordenadas de estructura del Sitio II en los NHR de la Figura 2 se dan en la Tabla III, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 22. Se dan 2 conjuntos de coordenadas de estructuras de rayos X del Sitio II en GR en la Tabla IV, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 23, y la Tabla V, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 24. La Figura 6, muestra los aminoácidos del Sitio II en el GR de diferentes especies.
Los autores de la invención han encontrado que los ligandos del Sitio II modulan los NHR. Los ligandos del Sitio II inducen transrepresión. Los ligandos del Sitio II tienen actividad disociada. Los ligandos del Sitio II antagonizan la transactivación.
En el contexto de la presente invención, se describen medios de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprenden material de almacenamiento de datos codificados con datos legibles por máquina, que comprenden todas o cualquier parte de las coordenadas de estructura del Sitio II. En el contexto de la presente invención, se describen sistemas de ordenador que comprenden los medios de almacenamiento de datos legibles por máquina de la invención capaces de producir representaciones tridimensionales de todo o cualquier parte del Sitio II. También se describen en el presente documento procedimientos usados en el diseño e identificación de ligandos del Sitio II y moduladores de NHR. El contexto de la presente invención describe: procedimiento de acoplamiento de una molécula de ensayo en todo o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II; procedimientos que comprenden identificar las características estructurales y químicas de todo o cualquier parte del Sitio II; procedimientos de diseño de un ligando del Sitio II, que comprenden modelar todo o cualquier parte del Sitio II y diseñar una entidad química que tiene complementaridad estructural y química con todo o cualquier parte del Sitio II; procedimientos para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a todo o cualquier parte del Sitio II; procedimientos para identificar un modulador de un NHR; y procedimientos para identificar un ligando del Sitio II. En el contexto de la presente invención se describen ligandos del Sitio II. También se describen en el presente documento moduladores de los NHR. En el contexto de la presente invención también se describen procedimientos de modulación del NHR.
En el contexto de la presente invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden moduladores de los NHR. También se describe en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un modulador de un NHR para tratar enfermedades. Dichas enfermedades incluyen enfermedades asociadas con el NHR, enfermedades asociadas con la transactivación del NHR, enfermedades asociadas con la transrepresión del NHR, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades que se pueden tratar por inducción de transrepresión de NHR, y enfermedades que se pueden tratar antagonizando la transactivación de NHR.
La invención proporciona procedimientos de diseño de mutantes, que comprende mutar el Sitio II haciendo una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos, y los NHR mutantes o porciones de NHR mutantes resultantes, comprenden una mutación del Sitio II.
La invención proporciona procedimientos para medir la unión de una molécula de ensayo al Sitio II.
La invención proporciona modelos del Sitio II.
Todos los documentos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo, pero sin limitar, las solicitudes de patente de EE.UU., se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una descripción gráfica de la transactivación mediada por dímeros de GR frente a la transrepresión mediada por monómeros de GR;
la Figura 2 son alineamientos de consenso llevados a cabo usando ICM (Molsoft LLC, La Jolla, CA) entre el LBD de GR humano (receptor de glucocorticoides) y otros LBD de NHR humanos, que indican mediante sombreado los restos del Sitio II, es decir, restos correspondientes a los restos del Sitio II de GR. Los puntos son espaciadores y no representan aminoácidos. Los números se refieren al primer resto en cada línea, son específicos para cada NHR y se basan en el NHR de longitud entera. Para los NHR listados a continuación, con excepción de GR y MR, los datos estructurales se obtuvieron de las referencias de RCSB listadas a continuación, y se usó el sistema de numeración de las referencias de RCSB. Para los GR y MR, los datos estructurales se obtuvieron por modelado por homología usando las referencias bibliográficas siguientes, y se usó el sistema de numeración de estas referencias bibliográficas. Las referencias del RCSB (entre paréntesis) y las referencias de la bibliografía para los diferentes NHR son los siguientes: RXRalfa (SEQ ID NO: 3) (1 lbd) Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 375 pág. 377 (1995); PPAR-gamma (SEQ ID NO: 10) (2prg) Nolte, R. T., Wisely, G. B., Westin, S., Cobb, J. E., Lambert, M. H., Kurokawa, R., Rosenfeld, M. G., Willson, T. M., Glass, C. K., Milburn, M. V. Nature 395 pág. 137 (1998); RARgamma (SEQ ID NO: 4). (2lbd) Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 378 pág. 681 (1995); PR (SEQ ID NO: 5) (1a28) Williams, S. P., Sigler, P. B. Nature 393 pág. 392 (1998); VitDR (SEQ ID NO: 9) (1db1) Rochel, N., Wurtz, J. M., Mitschler, A., Klaholz, B., Moras, D. Mol. Cell 5 pág. 173 (2000); AR (SEQ ID NO: 6) (1e3g) Matias, P. M., Donner, P., Coelho, R., Thomaz, M., Peixoto, C., Macedo, S., Otto, N., Joschko, S., Scholz, P., Wegg, A., Basler, S., Schafer, M., Egner, U., Carrondo, M. A. J. Biol. Chem. 275 pág. 26164 (2000); ERalfa (SEQ ID NO: 7) (1a52) Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. Proc Natl Acad Sci USA 95 pág. 5998 (1998); ERbeta (SEQ ID NO: 8) (1l2j) Shiau, A. K., Barstad, D., Radek, J. T., Meyers, M. J., Nettles, K. W., Katzenellenbogen, B. S., Katzenellenbogen, J. A., Agard, D. A., Greene, G. L. Nat. Struct. Biol. 9 pág. 359 (2002); TRbeta (SEQ ID NO: 12) (1bsx) Wagner, R. L., Darimont, B. D., Apriletti, J. W., Stallcup, M. R., Kushner, P. J., Baxter, J. D., Fletterick, R. J., Yamamoto, K. R. Genes Dev. 12 pág. 3343 (1998). Los datos estructurales de MR y GR se obtuvieron por modelado por homología con PR usando las secuencias de las siguientes referencias: GR (SEQ ID NO: 13), número de acceso PIR QRHUGA, Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M. Nature (1985) 318: 635-641; MR (SEQ ID NO: 11), número de acceso PIR A29613, Arriza, J.L.; Weinberger, C., Cerelli, G., Glaser, T.M., Handelin, B.L., Housman, D.E., Evans, R.M., Science (1987) 237: 268-275;
la Figura 3 es un modelo de homología presentado en formato de cinta con dexametasona (verde) y el Compuesto 15 (violeta) presentados como modelos de llenado de espacio acoplados en el Sitio I y Sitio II, respectivamente. La posición del Sitio I (sitio de la dexametasona) representa el sitio de unión de esteroides clásico (p. ej., de acuerdo con la posición de la progesterona en el PR, 1A28). La posición del Sitio II (sitio del Compuesto 15) representa el nuevo sitio de unión que es el objeto de esta invención;
la Figura 4 son 27 análogos usados en la correlación de la inhibición de AP-1 observada y puntuaciones de energía de contacto calculadas, derivadas del acoplamiento en el modelo por homología del Sitio II de GR. Los números de compuesto se dan a la izquierda de cada compuesto;
la figura 5 es la relación entre las energías de contacto calculadas de una serie de 27 análogos del Compuesto 15 y su % de inhibición de AP-1 (con 10 \muM). Cada análogo se modeló como el enantiómero S y se colocó manualmente en el Sitio II de GR de forma consistente con la orientación representada en la Figura 3. Las energías se calcularon después de minimización de la geometría/energía usando Flo (Colin McMartin, Thistlesoft, Colebrook, CT);
la figura 6 son alineamientos de secuencias de los GR de diferentes especies realizados usando el programa LOOK (Versión 3.5.2, Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). La secuencia para cada GR empieza en el resto 1. Los alineamientos se hicieron basándose en la identidad de secuencia por pares. Los restos del Sitio II están sombreados. Los puntos son espaciadores y no representan aminoácidos. Los números se refieren al primer resto en cada línea, y son específicos para cada GR, y se basan en los GR de longitud entera. Las secuencias de GR se obtuvieron de las siguientes fuentes: ardilla (SEQ ID NO:14) (Saimiri boliviensis boliviensis) (GenBank U87951) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); GR de cerdo (SEQ ID NO: 15) (GenBank AF141371) Gutscher, M., Eder, S., Mueller M. y Claus, R. Enviado a GenBank (08-APR-1999) Institut fuer Tierhaltung und Tierzuechtung (470), FG Tierhaltung und Leistungsphysiologie, Universitaet Hohenheim, Garbenstr. 17, Stuttgart 70599, Alemania; cobaya (SEQ ID NO: 16) (GenBank L13196) Keightley, M.C. y Fuller, P. J. Mol. Endocrinol. 8 (4), 431-439 (1994); mono tití (SEQ ID NO: 17) (GenBank U87953) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); mono Ma'z (SEQ ID NO: 18) (GenBank U87952) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); rata (SEQ ID NO: 19) (GenBank M14053) Miesfeld, R., Rusconi, S., Godowski, P.J., Maler, B.A., Okret, S., Wikstrom, A.C., Gustafsson, J.A. y Yamamoto, K.R. Cell 46 (3), 389-399 (1986); ratón (SEQ ID NO: 20) (GenBank X04435) Danielsen, M., Northrop, J.P. y Ringold, G.M. EMBO J. 5 (10), 2513-2522 (1986); ser humano (SEQ ID NO: 21) (número de acceso PIR QRHUGA) Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641;
la figura 7 es un diagrama de cintas de los LBD de 11 NHR detallados en la figura 2, basado en un paradigma de alineación de consenso (ICM, Molsoft LLC, La Jolla, CA). El modelo de homología del receptor de glucocorticoides (GR) está representado por la cinta azul;
la figura 8 es una demostración gráfica de que en un ensayo artificial muy sensible, las mutaciones en el Sitio II inhiben la capacidad de los ligandos del Sitio II para inducir transactivación, mientras que había un efecto mínimo en el compuesto dexametasona del Sitio I. URL en el eje Y son unidades relativas de luz, una medición de la transactivación. En el eje X se dan varios mutantes y tipo natural. El compuesto A, un ligando del Sitio II, está indicado mediante la barra lisa, más oscura a la izquierda, en cada par de barras. La dexametasona está indicada por la barra rayada, más clara, a la derecha en cada par de barras;
la figura 9 es una demostración gráfica de que el antagonista RU486 del Sitio I inhibe la represión mediada por la dexametasona de la actividad de AP-1, mientras que los compuestos del Sitio II, tales como el Compuesto A y el Compuesto B, actúan de una forma aditiva con la dexametasona, para reprimir la actividad de AP-1. El eje Y indica el % de inhibición de la actividad de AP-1. El eje X indica la concentración de dexametasona. Las concentraciones de RU486, Compuesto A y Compuesto B se indican mediante los símbolos indicados;
la figura 10 es una demostración gráfica de un ensayo para medir indirectamente la interacción de los ligandos del Sitio II con GR, que muestra que los ligandos del Sitio II que no inhiben la dexametasona por sí mismos, pueden desplazar otros ligandos del Sitio II, que inhiben la dexametasona, permitiendo así que la dexametasona se una al GR. El Compuesto D es un ligando del Sitio II que no inhibe la dexametasona. El Compuesto A, Compuesto B y Compuesto C son ligandos del Sitio II que no inhiben la dexametasona por sí mismos. El Compuesto A, Compuesto B y Compuesto C están representados por los símbolos indicados y son los compuestos competidores cuya concentración está representada en el eje X. El eje Y representa el % de inhibición de la unión de la dexametasona;
las figuras 11a y 11b, son demostraciones gráficas de que un ligando del Sitio II inhibe la transcripción mediada por AP-1 de una forma dependiente de GR. Los ejes Y representan unidades relativas de luz (URL), una medición de la actividad de AP-1. En los ejes X, el Compuesto A es un ligando del Sitio II, DEX es dexametasona, y PMA es ácido forbol-mirístico. En la figura 11a, la actividad de AP-1 se mide sin la presencia de GR. En la figura 11b, la actividad de AP-1 se mide en presencia de GR.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la invención han identificado un segundo sitio de unión en el dominio de unión al ligando de los receptores nucleares de hormonas (NHR). Se hace referencia a este segundo sitio de unión como Sitio II.
El Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667, de acuerdo con la Tabla I. Es decir, un Sitio II es cualquier estructura que está dentro de la desviación típica dada. La Tabla I se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 21.
La Figura 2 muestra los aminoácidos del Sitio II en diferentes NHR humanos. Las coordenadas de estructura del Sitio II en los NHR de la Figura 2 se dan en la Tabla III, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 22. Se dan 2 conjuntos de coordenadas de estructuras de rayos X del Sitio II en GR en la Tabla IV, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 23, y la Tabla V, que se encuentra bajo el encabezamiento del Ejemplo 24. La Figura 6, muestra los aminoácidos del Sitio II en el GR de diferentes especies.
Los autores de la invención han encontrado que los ligandos del Sitio II modulan los NHR. Los ligandos del Sitio II inducen transrepresión. Los ligandos del Sitio II tienen actividad disociada. Los ligandos del Sitio II antagonizan la transactivación.
Para todas las presentes invenciones descritas a continuación, se aplica la siguiente información de realizaciones posibles y preferidas.
Dicho Sitio II preferiblemente es un Sitio II de receptor nuclear de hormonas (NHR), más preferiblemente El Sitio II de receptor de hormonas esteroideas (SHR), lo más preferiblemente un Sitio II de receptor de glucocorticoides (GR).
Preferiblemente dicho NHR se selecciona del grupo que consiste en: RXR-alfa; RXR-beta; receptor de progesterona (PR); receptor de andrógenos (AR); receptor alfa de estrógenos (ER-alfa); ER-beta; receptor de vitamina D (VitDR); receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR-gamma); receptor alfa tiroideo (TR-alfa); TR-beta; receptor de mineralocorticoides (MR); y receptor de glucocorticoides (GR). Más preferiblemente, dicho NHR se selecciona del grupo que consiste en: RXR-alfa; RXR-beta; receptor de progesterona (PR); receptor de andrógenos (AR); receptor de vitamina D (VitDR); receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR-gamma); receptor alfa tiroideo (TR-alfa); TR-beta; receptor de mineralocorticoides (MR); y receptor de glucocorticoides (GR). Lo más preferiblemente, dicho NHR se selecciona del grupo que consiste en: RXR-alfa; RXR-beta; receptor de andrógenos (AR); receptor de vitamina D (VitDR); receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR-gamma); receptor alfa tiroideo (TR-alfa); TR-beta; receptor de mineralocorticoides (MR); y receptor de glucocorticoides (GR).
Preferiblemente dicho SHR se selecciona del grupo que consiste en: PR; AR; ER-alfa; ER-beta; MR; y GR. Más preferiblemente, dicho SHR se selecciona del grupo que consiste en: PR; AR; MR; y GR. Lo más preferiblemente, dicho SHR se selecciona del grupo que consiste en: AR; MR; y GR.
Dicho Sitio II de RXR-alfa está compuesto preferiblemente por los aminoácidos L236-P244, A272-A273, Q276-W283, G305-S313, H316-R317, A320-V321, T329, L368-G369, y R372 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de RXR-alfa definen la estructura de los aminoácidos L236-P244, A272-A273, Q276-W283, G305-S313, H316-R317, A320-V321, T329, L368-G369, y R372, de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Por esto se entiende que dichas coordenadas de estructura preferiblemente definen la misma forma que la estructura de los aminoácidos de acuerdo con la Tabla III, o que la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos de acuerdo con la Tabla II, pero no necesariamente que las coordenadas de estructura son idénticas a las de los aminoácidos o átomos de la cadena principal de restos en la tabla, ya que las coordenadas de estructura pueden ser de un sistema de coordenadas distintas de las coordenadas Cartesianas. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II L236-P244, A272-A273, Q276-W283, G305-S313, H316-R317, A320-V321, T329, L368-G369, y R372 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de RAR-gamma preferiblemente está compuesto de los aminoácidos S194-P202, L233-A234, C237-F244, A266-R274, T277-R278, T280-E282, D290, T328-G329 y S332 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de RAR-gamma definen la estructura de los aminoácidos S194-P202, L233-A234, C237-F244, A266-R274, T277-R278, T280-E282, D290, T328-G329 y S332 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II S194-P202, L233-A234, C237-F244, A266-R274, T277-R278, T280-E282, D290, T328-G329 y S332 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho PR está compuesto preferiblemente de los aminoácidos M692-V698, L721-G722, Q725-W732, S754-G762, W765-R766, K769-H770, P780, F818-L819 y K822 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de PR definen la estructura de los aminoácidos M692-V698, L721-G722, Q725-W732, S754-G762, W765-R766, K769-H770, P780, F818-L819 y K822 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II M692-V698, L721-G722, Q725-W732, S754-G762, W765-R766, K769-H770, P780, F818-L819 y K822 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de AR preferiblemente está compuesto de los aminoácidos E678-V684, L708-G709, Q712-W719, S741-A749, W752-R753, T756-N757, P767, F805-L806 y K809 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de AR definen la estructura de los aminoácidos E678-V684, L708-G709, Q712-W719, S741-A749, W752-R753, T756-N757, P767, F805-L806 y K809 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II E678-V684, L708-G709, Q712-W719, S741-A749, W752-R753, T756-N757, P767, F805-L806 y K809 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de ER-alfa preferiblemente está compuesto de los aminoácidos L320-I326, L348-A349, E352-W359, A381-G389, W392-R393, E396, P405, F444-V445 y K448 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de ERalfa definen la estructura de los aminoácidos L320-I326, L348-A349, E352-W359, A381-G389, W392-R393, E396, P405, F444-V445 y K448 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II L320-I326, L348-A349, E352-W359, A381-G389, W392-R393, E396, P405, F444-V445 y K448 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de ER-beta preferiblemente está compuesto de los aminoácidos L273-H279, L297-A298, E301-W308, C330-G338, W341-R342, D345, P354, Y393-L394 y K397 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de ERbeta definen la estructura de los aminoácidos L273-H279, L297-A298, E301-W308, C330-G338, W341-R342, D345, P354, Y393-L394 y K397 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II L273-H279, L297-A298, E301-W308, C330-G338, W341-R342, D345, P354, Y393-L394 y K397 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de VitDR preferiblemente está compuesto de los aminoácidos L136-D144, L182-V183, S186-F193, S215-R223, E226-S227, T229-D231, G238, H279-V280 y M283 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de VitDR definen la estructura de los aminoácidos L136-D144, L182-V183, S186-F193, S215-R223, E226-S227, T229-D231, G238, H279-V280 y M283 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II L136-D144, L182-V183, S186-F193, S215-R223, E226-S227, T229-D231, G238, H279-V280 y M283 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de PPAR-gamma preferiblemente está compuesto de los aminoácidos Y219-P227, R288-S289, A292-Y299, G321-M329, S332-L333, N335-K336, E343, L384-A385 y I388 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de PPAR-gamma definen la estructura de los aminoácidos Y219-P227, R288-S289, A292-Y299, G321-M329, S332-L333, N335-K336, E343, L384-A385 y I388 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II Y219-P227, R288-S289, A292-Y299, G321-M329, S332-L333, N335-K336, E343, L384-A385 y I388 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de MR preferiblemente está compuesto de los aminoácidos E743-I749, L772-A773, Q776-W783, S805-A813, W816-R817, K820-H821, P831, Y869-T870 y K873 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de MR definen la estructura de los aminoácidos E743-I749, L772-A773, Q776-W783, S805-A813, W816-R817, K820-H821, P831, Y869-T870 y K873 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura del Sitio II de los aminoácidos E743-I749, L772-A773, Q776-W783, S805-A813, W816-R817, K820-H821, P831, Y869-T870 y K873 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de TR-beta preferiblemente está compuesto de los aminoácidos T226-Q235, I267-I268, A271-F278, C300-R308, V311-R312, D314-E316, G324, V362-A363 y Q366 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de TR-beta definen la estructura de los aminoácidos T226-Q235, I267-I268, A271-F278, C300-R308, V311-R312, D314-E316, G324, V362-A363 y Q366 de acuerdo con la Tabla III, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con la Tabla III. Más preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II T226-Q235, I267-I268, A271-F278, C300-R308, V311-R312, D314-E316, G324, V362-A363 y Q366 de acuerdo con la Tabla III.
Dicho Sitio II de GR preferiblemente está compuesto de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Figura 2. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II de GR definen la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I, Tabla III, Tabla IV o Tabla V, o definen la estructura de los aminoácidos mencionados antes de acuerdo con las coordenadas de estructura descritas en Bledsoe, y col., Cell, publicación en línea de Cell Press, 1 de julio de 2002; DOI: 10.1016/S0092867402008176, o definen la estructura de los átomos de la cadena principal de los restos conservados de acuerdo con cualquiera de los antes mencionados. Preferiblemente, dichas coordenadas de estructura de dicho Sitio II son las coordenadas de estructura de los aminoácidos del Sitio II E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I, Tabla III, Tabla IV o Tabla V.
Dicho Sitio II de GR se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: Sitio II de GR humano compuesto por los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Figura 6; Sitio II de GR de ardilla compuesto por los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Figura 6; Sitio II de GR de cerdo compuesto por los aminoácidos E501-V507, L530, G531, Q534-W541, S563-A571, W574, R575, R578, Q579, P589, Y627, L628 y K631 de acuerdo con la Figura 6; Sitio II de GR de cobaya compuesto por los aminoácidos E531-V537, L560, G561, Q564-W571, S593-A601, W604, R605, K608, Q609, P619, Y557, L558 y K561 de acuerdo con la Figura 6; Sitio II de GR de mono tití compuesto por los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Figura 6; Sitio II de GR de mono Ma'z compuesto por los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Figura 6; Sitio 11 de GR de rata E555-V561, L584, G585, Q588-W595, S617-A625, W628, R629, R632, Q633, P643, Y681, L682 y K685 de acuerdo con la Figura 6; y Sitio II de GR de ratón E543-V549, L572, G573, Q576-W583, S605-A613, W616, R617, R620, Q621, P631, Y669, L670 y K673 de acuerdo con la Figura 6.
Dicho receptor nuclear de hormonas puede ser de cualquier origen, preferiblemente humano.
Dicho receptor de glucocorticoides puede ser de cualquier origen, preferiblemente de ser humano, rata, ratón, oveja, mono tití, ardilla, cerdo, cobaya o mono Ma'z. Lo más preferiblemente dicho receptor de glucocorticoides es humano.
Dicho Sitio II de NHR puede ser nativo o mutante. Preferiblemente, dicho Sitio II de NHR es un Sitio II de NHR nativo. Dicho Sitio II de SHR puede ser nativo o mutante. Preferiblemente, dicho Sitio II de SHR es un Sitio II de SHR nativo. Dicho Sitio II de GR puede ser nativo o mutante. Preferiblemente dicho Sitio II de GR es un Sitio II de GR nativo.
Dicho Sitio II se puede encontrar en una proteína de cualquier origen, incluyendo mamífero, fúngico, bacteriano y vegetal. Preferiblemente dicho Sitio II se encuentra en una proteína de mamífero, más preferiblemente en una proteína humana.
Preferiblemente, los átomos de la cadena principal de los restos conservados de dicho Sitio II tienen una a desviación típica menor que 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ó 1,5 \ring{A}. Más preferiblemente menor que 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,03, 1,02, ó 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,93, 0,92, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 Á, lo más preferiblemente 1,02, 0,92 ó 0,0\ring{A} respecto de los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I.
Preferiblemente los átomos de la cadena principal de los restos conservados de dicho Sitio II tienen una desviación típica menor que 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ó 1,5 \ring{A}. Más preferiblemente menor que 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,03, 1,02, ó 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,93, 0,92, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 \ring{A}, lo más preferiblemente 1,02, 0,92 ó 0,0 \ring{A} con respecto a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla IV.
Preferiblemente los átomos de la cadena principal de los restos conservados de dicho Sitio II tienen una desviación típica menor que 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ó 1,5 \ring{A}. Más preferiblemente menor que 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,03, 1,02, ó 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,93, 0,92, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 Á, lo más preferiblemente 1,02, 0,92 ó 0,0 \ring{A} con respecto a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla V.
Dichas coordenadas de estructura pueden ser las determinadas para un Sitio II al que se une un ligando o al que no se une un ligando. Dichas coordenadas de estructura pueden ser las determinadas para un Sitio II de un dominio de unión a ligando en el que un ligando del Sitio I se une al Sitio I. Dichas coordenadas de estructura pueden ser las determinadas para un Sitio II de un NHR que está en forma de monómero, dímero u otra forma.
Como se ilustra en la Figura 3, la cavidad circunscrita por el Sitio II y la cavidad circunscrita por el Sitio I (en GR, el sitio de unión de la dexametasona) comparten una sección de pared común. Es decir, los aminoácidos son comunes tanto al Sitio II como al Sitio I. Sin embargo, la cavidad circunscrita por el Sitio II es distinta de la cavidad circunscrita por el Sitio I, puesto que las dos cavidades están en lados opuestos de la pared común. Se acopló manualmente la dexametasona al Sitio I de GR (véase el ejemplo 10) y se determinó que los siguientes aminoácidos están a distancia de contacto, es decir a 2-3 Angstroms, de la dexametasona y por lo tanto componen el Sitio I de GR: M560, L563, N564, L566, G567, Q570, M601, M604, A605, L608, R611, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748. Los siguientes restos de aminoácidos son comunes tanto al Sitio I como al Sitio II de GR: L566, G567, Q570, M601, M604, A605 y R611. Los siguientes restos de aminoácidos son únicos para el Sitio II de GR, es decir, no son parte del Sitio I de GR: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667. Los siguientes restos de aminoácidos son únicos del Sitio I de GR, es decir, no son parte del Sitio II de GR: M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748. Los aminoácidos en otros NHR y GR no humanos correspondientes a los aminoácidos de GR citados antes, se pueden ver en las Figuras 2 y 6, respectivamente. Los autores de la invención han identificado el Sitio II en los NHR como un sitio de unión cuyos ligandos modulan los NHR.
Los autores de la invención definieron el Sitio II mediante el uso de coordenadas de estructura del dominio de unión al ligando (LBD) del receptor de glucocorticoides (GR), que se proporcionan en la Tabla I. Las coordenadas de estructura del LBD de GR se determinaron usando modelado por homología, y después se confirmaron basándose en la elucidación estructural por rayos X del LBD de GR proporcionado por Apolito, y col., en el documento WO 03/015692 A2, publicado el 27 de febrero, 2003, y Kauppi y col., en Journal of Biological Chemistry Online, JBC documento pendiente de publicación como DOI:10.1074/JBC.M212711200, 9 de abril, 2003. Por lo tanto, es adecuada alguna descripción de los modelos por homología y coordenadas de estructura.
Los modelos por homología son útiles cuando no hay información experimentad disponible de la estructura tridimensional de la proteína de interés. Se puede construir un modelo tridimensional basándose en la estructura conocida de una proteína homóloga (Greer y col., 1991, Lesk, y col., 1992, Cardozo, y col., 1995, Sali, y col., 1995). Los expertos en la materia entenderá que un modelo por homología se construye basándose primero en la identificación de un molde, o proteína de estructura conocida, que es similar a la proteína que no tiene estructura conocida. Este se puede hacer mediante la alineación por pares de secuencias usando programas tales como el módulo MODELLER encontrado en InsightII (Accelrys, Inc., San Diego, CA).
Los expertos en la materia entenderán que un conjunto de coordenadas de estructura para una proteína o parte de una proteína es un conjunto de puntos relativo que define una forma en tres dimensiones. Por una serie de razones, incluyendo las que se dan a continuación, las coordenadas de estructura que definen dos formas idénticas o casi idénticas pueden variar ligeramente. Si las variaciones están dentro de un error típico aceptable comparado con las coordenadas originales, la forma tridimensional resultante se considera que es equivalente. Así, por ejemplo, se espera que un ligando que se une a la estructura definida por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I, también se una a un sitio que tiene una forma que está dentro del error aceptable. Dichos sitios con estructuras dentro del error típico aceptable, se considera que están dentro del alcance de esta invención.
Por lo tanto, son necesarios diferentes análisis computacionales para determinar si una molécula o una parte de la misma, es suficientemente similar a todo o partes del modelo descrito por homología para ser considerada equivalente. Dichos análisis se pueden llevar a cabo en aplicaciones de software actuales, tales como InsightII (Accelrys Inc., San Diego, CA) Versión 2000 descrita en el Manual de Usuario, en la red (www.accelrys.com) o aplicaciones de software disponibles en el conjunto de software SYBYL (Tripos Inc., St. Louis, MO).
Usando la herramienta de superposición en el programa InsightII, por ejemplo, se pueden hacer comparaciones entre diferentes estructuras y diferentes conformaciones de la misma estructura. El procedimiento usado en InsightII para comparar estructuras se divide en 4 etapas: 1) carga de las estructuras que se van a comparar; 2) define las equivalencias de átomos en esas estructuras; 3) lleva a cabo una operación de ajuste; y 4) analiza los resultados. Cada estructura se identifica por un nombre. Una estructura se identifica como objetivo (es decir, la estructura fija); la segunda estructura (es decir, la estructura móvil) se identifica como la estructura origen. Puesto que la equivalencia de átomos en InsightII está definida por el usuario, para el propósito de esta invención, se definirán átomos equivalentes como átomos de la cadena principal de la proteína, también conocidos como átomos de la cadena principal de los restos (N, C\alpha, C y O) para todos los restos entre las dos estructuras que se comparan. También se considerarán solo operaciones de ajuste rígidas. Cuando se usa un método de ajuste rígido, la estructura móvil se traslada y se rota para obtener un ajuste óptimo con la estructura objetivo. La operación de ajuste usa un algoritmo que computa la traslación y rotación óptimas que hay que aplicar a la estructura móvil, de modo que la diferencia del valor medio cuadrático de los pares especificados de átomos equivalentes es un mínimo absoluto. Este número, dado en Angstroms (\ring{A}), lo da InsightII.
Las coordenadas tridimensionales dan la posición de los centros de todos los átomos en una molécula de proteína y normalmente se expresan en coordenadas Cartesianas (p. ej., distancias en tres direcciones, cada una perpendicular a la otra), o coordenadas polares (p. ej., grupos de pares de ángulo/distancia de un origen universal), o coordenadas internas (p. ej., grupos de pares de ángulo/distancia desde un centro de átomo al siguiente). Por lo tanto, es posible que un grupo de coordenadas completamente diferentes definan una forma idéntica o similar, dependiendo de qué sistema de coordenadas se use.
Las variaciones pequeñas en las coordenadas individuales, que salen de la generación de modelos por homología similares usando diferentes moldes de alineación y/o usando diferentes procedimientos de generación del modelo por homología, tendrán efectos minoritarios en la forma general.
Las variaciones en las coordenadas también se pueden generar debido a las manipulaciones matemáticas de las coordenadas de estructura. Por ejemplo, las coordenadas de estructura expuestas en la Tabla I se podrían manipular por fraccionamiento de las coordenadas de estructura, adiciones o sustracciones de números enteros a conjuntos de las coordenadas de estructura, inversión de las coordenadas de estructura o cualquier combinación de los anteriores.
Podría esperarse que las coordenadas de estructura de una estructura de rayos X real de una proteína tuvieran alguna variación respecto del modelo por homología de esta misma proteína. Por ejemplo, la posición de cadenas laterales puede variar en cierta medida. Como ejemplos, las coordenadas del Sitio II de GR del modelo por homología se compararon con las coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR disponibles de las descripciones del documento WO 03/015692 A2, 27 de febrero, 2003 Apolito, y col. y Kauppi y col., en Journal of Biological Chemistry Online, JBC documento pendiente de publicación como DOI:10.1074/jbc.M212711200, 9 de abril, 2003, fichero RCSB: 1nhz.pdb (LBD de GR unido a un antagonista, RU 486). Cuando los átomos de la cadena principal de los restos del Sitio II del modelo por homología, es decir E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I se compararon, se obtuvieron desviaciones típicas (DT) de 0,92 y 1,02 \ring{A} entre el modelo por homología de los restos del Sitio II de la Tabla I y los restos del Sitio II de Apolito, y entre el modelo por homología de los restos del Sitio II de la Tabla I y los restos del Sitio II de Kauppi, respectivamente. Estas observaciones resaltan la similitud de la estructura del moldeo por homología del Sitio II con las estructuras cristalinas reales.
Las variaciones en las coordenadas de estructura pueden deberse a mutaciones, adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una proteína que se estudia.
Las variaciones en las coordenadas de estructura pueden deberse a variaciones en proteínas cuya forma se describe por las coordenadas de estructura dadas. Por ejemplo, las operaciones de ajuste rígido (véase el ejemplo 13) entre el modelo por homología de LBD de GR y varios NHR estrechamente relacionados que se sabe que tienen estructura y función similares (es decir LBD del receptor de progesterona, LBD del receptor de andrógenos, LBD del receptor alfa de estrógenos y LBD del receptor beta de estrógenos, como ejemplos) dieron desviaciones típicas (DT) del Sitio II en comparaciones de átomos de la cadena principal de los restos conservados de 0,57-0,71 \ring{A}. Estas desviaciones típicas del Sitio II podrían ser mayores si estuvieran presentes otros factores de variación descritos antes en los cálculos. Los LBD de GR de especies no humanas también pueden tener ligeras variaciones de la forma con respecto a la de los LBD de GR humanos, definidos por las coordenadas de estructura de la Tabla I.
Para los propósitos de esta invención, cualquier estructura que tenga una desviación típica de los átomos de la cadena principal de los restos (N, C\alpha, C, O) inferior a 2,0 Angstroms (\ring{A}) cuando se superpone con los átomos de la cadena principal de los restos relevantes descritos por las coordenadas de estructura listadas en la Tabla I, se considera que es equivalente. Preferiblemente, la desviación típica es menor que 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ó 1,5 \ring{A}. Más preferiblemente menor que 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,03, 1,02, ó 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,93, 0,92, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 \ring{A}, lo más preferiblemente 1,02, 0,92 ó 0,0 \ring{A}.
En el contexto de la presente invención, "conservado" se refiere a una parte de la cadena principal de la proteína que se encuentra en común entre dos proteínas. Es decir, si se alinean partes de dos proteínas y se comparan usando las coordenadas tridimensionales de sus átomos de la cadena principal de los restos para ver la superposición, y la comparación de las coordenadas de estructura de los átomos de la cadena principal de los restos da una DT de 2,0 \ring{A} o menos, entonces los átomos de la cadena principal de los restos se considera que son conservados entre las dos proteínas.
Los autores de la invención hicieron las invenciones reivindicadas por una serie de experimentos descritos a continuación en los ejemplos. Para ayudar a entender la invención, se resumen en el presente documento esta serie de experimentos.
Se sintetizaron 27 compuestos, que son análogos, y se mostró que inhibían la unión a GR en los ensayos de unión al Sitio I de GR e inducían la transrepresión en los ensayos de transrepresión celular de AP-1. Se ensayaron algunos de estos compuestos en ensayos de transcripción celular y se mostró que inducían transactivación mínima o no inducían. Por lo tanto, se mostró que estos compuestos tenían actividad disociada.
Se sintetizaron 12 análogos de los 27 compuestos (algunos de los cuales están entre los 27 compuestos) y las mezclas racémicas se separaron en enantiómeros. Cada uno de estos 24 enantiómeros se ensayó en el ensayo de unión a GR y en el ensayo de transrepresión celular. Se observó que el enantiómero S de cada pareja inducía actividad inhibidora de AP-1 cuando estaba presente el GR, pero no inhibía bien la unión de la dexametasona al GR, mientras que el enantiómero R de cada pareja inducía una actividad inhibidora de AP-1 mínima cuando estaba presente el GR e inhibía bien la unión de la dexametasona al GR. También se ensayó cada enantiómero en el ensayo de transcripción celular e indujeron transactivación mínima o no indujeron. Esto sugiere que hay un sitio alternativo en GR al que se unen estos compuestos, que no da como resultado la inhibición de la unión de la dexametasona al GR.
Se construyó un modelo por homología del dominio de unión al ligando (LBD) de GR usando la estructura cristalina conocida del receptor de progesterona (PR). El Sitio II en el LBD de GR se identificó por la complementaridad de la forma tridimensional y características funcionales entre el Sitio II y los compuestos que tienen actividad inhibidora de AP-1. Se llevó a cabo el acoplamiento manual de uno de dichos compuestos y se confirmó la identidad del Sitio II y su función en la transrepresión. Se calcularon las energías de unión del enantiómero S de los 27 compuestos al Sitio II y se correlacionaron con la actividad inhibidora de AP-1 de estos compuestos. Esta correlación positiva confirmó además la identidad y función del Sitio II.
Puesto que las energías de unión al Sitio II se correlacionan con la actividad inhibidora de AP-1 y todos los compuestos en los que se ensayó la unión al Sitio II son compuestos disociados, se determinó que el Sitio II era una diana para estos compuestos que tienen actividad inhibidora de AP-1 así como para los compuestos que tienen actividad disociada.
Se realizaron estudios adicionales para elucidar la relación entre la unión al Sitio II y la unión al Sitio I. Se usaron simultáneamente un enantiómero S y dexametasona en ensayos de transrepresión celular y ensayos de transcripción celular. En los ensayos de transrepresión celular, se observó que el compuesto disociado (es decir, el enantiómero S) y la dexametasona tenían un efecto aditivo en la actividad inhibidora de AP-1. En los ensayos de transcripción celular se observó que la presencia de un compuesto disociado junto con la dexametasona reducía la transactivación comparado con la dexametasona sola.
El ensayo de transcripción celular se realizó con una valoración de la dexametasona en presencia o ausencia de cada uno de ambos enantiómeros de la pareja. Otra vez, se observó un efecto aditivo en la actividad inhibidora de AP-1 de los enantiómeros y la dexametasona. En contraste, el antagonista del Sitio I RU 486 inhibía la capacidad de la dexametasona para inducir transrepresión.
Otros estudios realizados han mostrado que las mutaciones en el Sitio II alteran la capacidad de un enantiómero S para modular la función del GR. En un sistema de ensayo artificial, muy sensible, para medir la transactivación, se mostró que mutaciones en los restos 543 ó 607 prevenían que el compuesto indujera transactivación, mientras que en la proteína natural se observaba transactivación. La dexametasona inducía la transactivación tanto en los mutantes como en la proteína natural.
Un estudio posterior demostró que tanto un enantiómero S como la dexametasona actúan de una forma dependiente de GR.
Los estudios realizados hasta la fecha sugieren que ambos enantiómeros interaccionan con el Sitio II. El ejemplo 17 muestra que tanto los enantiómeros R (Compuesto B) como los S (Compuesto A) actúan de una forma aditiva con los niveles de saturación de la dexametasona para suprimir la actividad de AP-1. Puesto que la dexametasona se une al Sitio I, lo más probable es que los enantiómeros R y S interaccionen con el Sitio II para potenciar de forma alostérica la actividad represiva.
Las siguientes definiciones se proporcionan para describir de forma más completa la invención en sus diferentes aspectos. Se pretende que las definiciones sean útiles como guía y para la elucidación, y no se pretende que limiten la invención descrita y sus realizaciones. Se pueden proporcionan definiciones adicionales en otras partes de esta memoria descriptiva.
Las expresiones "receptor nuclear de hormonas" y "NHR", como se usan en el presente documento, se refieren a un miembro de la familia de receptores nucleares de hormonas de los factores de transcripción que se une a ligandos de bajo peso molecular y estimula o reprime la transcripción. Los NHR incluyen, pero sin limitar, receptores de glucocorticoides (GR), receptores de progesterona (PR), receptores de andrógenos (AR), receptores de estrógenos (ER), receptor de mineralocorticoides (MR), receptores retinoides (RXR y RAR), receptores de vitamina D (VitDR), receptores tiroideos (TR), receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR) y receptores nucleares huérfanos (es decir, receptores para los que los ligandos todavía no se han identificado) que se unen a hormonas nucleares. El "receptor nuclear de hormonas" incluye receptores nucleares huérfanos, que son productos génicos que manifiestan características estructurales de los receptores nucleares de hormonas y se identificaron sin ningún conocimiento previo de su asociación con un ligando putativo.
Las características estructurales que definen un receptor nuclear de hormonas, incluyendo un receptor nuclear huérfano, son las cuatro siguientes características (descritas por Giguere, V. (1999) Endocrine Reviews 20(5) pág. 689): 1. Un NHR tiene un dominio modulador que incluye el dominio de AF-1 responsable en parte de la función de activación de la transcripción. Los dominios moduladores también pueden incluir regiones para promotores y cofactores específicos de células y pueden interaccionar con coactivadores de receptores de esteroides (SRC). 2. Un NHR tiene un dominio de unión al ADN (DBD) compuesto de dos módulos de dedos de cinc compuestos de 60-70 aminoácidos y una extensión carboxi-terminal (CTE) que proporciona interacciones proteína-proteína y proteína-ADN tras la unión al receptor homo o heterodímero. 3. Un NHR tiene una región bisagra que es la bisagra entre el DBD y el dominio de unión al ligando carboxi-terminal. Esta región bisagra es variable en la estructura primaria y la longitud de la secuencia de aminoácidos. 4. Un NHR tiene un dominio de unión al ligando (LBD) que contiene el patrón de AF-2 (que corresponde a la hélice 12 de los NHR) y proporciona una región estructurada de modo que AF-12 (hélice 12) es empaqueta cerca del núcleo del LBD formando una interfase con al menos 3 otras hélices del núcleo. La interfase está implicada con la unión de polipéptidos coactivadores o correpresores.
El "receptor nuclear de hormonas" y "NHR" como se usan en el presente documento, se refieren a NHR de cualquier origen, incluyendo, pero sin limitar: receptor de glucocorticoide como describen Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641; receptor de progesterona como describen Misrahi, M. y col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 143, pág. 740; receptor de andrógenos como describen Lubahn D. B., y col. (1988); receptores de estrógenos como describen Green, S., y col. (1986) Nature 320, pág. 134); receptor de mineralocorticoides como describen Arriza, J.L., y col., (1987) Science 237, pág. 268; receptores de retinoides (RXR y RAR) como describen Mangelsdorf, y col. (1990) Nature, 345, pág. 224 y Petkovich M., y col. (1987) Nature 330, pág. 444; receptor de Vitamina D, receptor tiroideo (TR) como describen Nakai, A. y col., (1988) Mol. Endocrinol. 2, pág. 1087; receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) como describen Greene, M.E., y col. (1995) Gene Expression 4, pág. 281; RXRalfa (11 bd) como describen Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 375 pág. 377 (1995); PPARgamma (2prg) como describen Nolte, R. T., Wisely, G. B., Westin, S., Cobb, J. E., Lambert, M. H., Kurokawa, R., Rosenfeld, M. G., Willson, T. M., Glass, C. K., Milburn, M. V. Nature 395 pág. 137 (1998); RARgamma (21bd) como describen Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 378 pág. 681 (1995); PR (1a28) como describen Williams, S. P., Sigler, P. B. Nature 393 pág. 392 (1998); VitDR (1db1) como describen Rochel, N., Wurtz, J. M., Mitschler, A., Klaholz, B., Moras, D. Mol. Cell 5 pág. 173 (2000); AR (1e3g) como describen Matias, P. M., Donner, P., Coelho, R., Thomaz, M., Peixoto, C., Macedo, S., Otto, N., Joschko, S., Scholz, P., Wegg, A., Basler, S., Schafer, M., Egner, U., Carrondo, M. A. J. Biol. Chem. 275 pág. 26164 (2000); ERalfa (1a52) como describen Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. Proc Natl Acad Sci USA 95 pág. 5998 (1998); ERbeta (1l2j) como describen Shiau, A. K., Barstad, D., Radek, J. T., Meyers, M. J., Nettles, K. W., Katzenellenbogen, B. S., Katzenellenbogen, J. A., Agard, D. A., Greene, G. L. Nat. Struct. Biol. 9 pág. 359 (2002); TRbeta (1bsx) como describen Wagner, R. L., Darimont, B. D., Apriletti, J. W., Stallcup, M. R., Kushner, P. J., Baxter, J. D., Fletterick, R. J., Yamamoto, K. R. Genes Dev. 12 pág. 3343 (1998); GR, número de acceso PIR QRHUGA, como describen Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S.; Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641; MR, número de acceso PIR A29613, como describen Arriza, J.L.; Weinberger, C., Cerelli, G., Glaser, T.M., Handelin, B.L., Housman, D.E., Evans, R.M., Science (1987) 237: 268-275. Los receptores nucleares huérfanos incluyen, pero sin limitar: Rev Erb(alfa) (1hlz) como describen Sierk, M.L., y col., Biochemistry (2001) 40: pág. 12833; Pxr (1 ilh) como describen Watkins, R.E., y col., Science (2002) 292: pág. 2329; ERR3 (1kv6) como describen Greschik, H., y col., Mol. Cell (2002) 9: pág. 303; Nurrl (1ovl) como describen Wang, Z., y col., Nature (2003) 423: pág. 555; ERR1 como describen Guiguere, V., y col., Nature (1988) 331: 91-94. Otros NHR, incluyendo receptores nucleares huérfanos, incluyen los descritos en: The Nuclear Receptor Facts Book, V. Laudet y H. Gronemeyer, Academic Press, pág. 345, 2002; y Francis y col., Annu. Rev. Physiol. 2003,
65:261-311.
Las expresiones "receptor de hormonas esteroideas" y "SHR", como se usan en el presente documento, se refieren a un miembro de la familia de receptores nucleares de hormonas de los factores de transcripción que se unen a esteroides y estimulan o reprimen la transcripción. Los SHR incluyen, pero sin limitar, receptores de glucocorticoides (GR), receptores de progesterona (PR), receptores de andrógenos (AR), receptores de estrógenos (ER), receptor de mineralocorticoides (MR), y receptores huérfanos (es decir, receptores para los que los ligandos todavía no se han identificado) que se unen a esteroides. Estas expresiones, como se usan en el presente documento, se refieren a receptores de hormonas esteroideas de cualquier origen, incluyendo, pero sin limitar, humanas.
Las expresiones "receptor de glucocorticoides" y "GR", como se usan en el presente documento, se refieren a un miembro de la familia de receptores nucleares de hormonas de los factores de transcripción que se unen a glucocorticoides y estimulan o reprimen la transcripción, y a la isoforma GR-beta. Estas expresiones, como se usan en el presente documento, se refieren a receptores de glucocorticoides de cualquier origen, incluyendo pero sin limitar: receptor de glucocorticoides humano Weinberger, y col. Science 228, pág. 740-742, 1985, y Hollenberg, S.M., Weinberger, C., 0ng, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M.; Nature (1985) 318: 635-641; receptor de glucocorticoides de rata como describen Miesfeld, R. Nature, 312, pág. 779-781, 1985; receptor de glucocorticoides de ratón como describen Danielson, M. y col. EMBO J., 5, 2513; receptor de glucocorticoides de oveja como describen Yang, K., y col. J. Mol. Endocrinol. 8, pág. 173-180, 1992; receptor de glucocorticoides de mono tití como describen Brandon, D.D., y col., J. Mol. Endocrinol. 7, pág. 89-96, 1991; GR-beta humano como describen Hollenberg, SM. y col. Nature, 318, pág. 635, 1985, Bamberger, C.M. y col. J. Clin Invest. 95, pág. 2435, 1995; de ardilla (Saimiri boliviensis boliviensis) (GenBank U87951) como describen Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); GR de cerdo (GenBank AF141371) como describen Gutscher, M., Eder, S., Mueller, M. y Claus, R. enviado a GenBank (08-APR- 1999) Institut fuer Tierhaltung und Tierzuechtung (470), FG Tierhaltung und Leistungsphysiologie, Universitaet Hohenheim, Garbenstr. 17, Stuttgart 70599, Alemania; de cobaya (GenBank L13196) como describen Keightley, M.C. y Fuller, P.J. Mol. Endocrinol. 8 (4), 431-439 (1994); de mono tití (GenBank U87953) como describen Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); de mono Ma'z (GenBank U87952) como describen Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); de rata (GenBank M14053) como describen Miesfeld, R., Rusconi, S., Godowski, P.J., Maler, B.A., Okret, S., Wikstrom, A.C., Gustafsson, J.A. y Yamamoto, K.R. Cell 46 (3), 389-399 (1986); de ratón (GenBank X04435) como describen Danielsen, M., Northrop, J.P. y Ringold, G.M. EMBO J. 5 (10), 2513-2522 (1986); humano (Protein Information Resource (PIR) Accession Number QRHUGA) como describen Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641.
La expresión "sitio de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma, se asocia de forma favorable, es decir, se une, con otra molécula, siendo dicha otra molécula un ligando del sitio de unión. Un sitio de unión, tal como el Sitio II, es análogo a una pared y circunscribe un espacio denominado una "cavidad" o "bolsillo". El ligando del sitio de unión se sitúa en la cavidad.
El término "se une" en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere a una condición de proximidad entre moléculas, compuestos químicos o entidades químicas. La asociación puede ser no covalente (es decir, sin enlace o reversible), en el que la yuxtaposición está energéticamente favorecida por enlaces de hidrógeno o interacciones de van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente (es decir, con enlace o irreversible).
El término "sumergido", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso en el que el cristal de proteína se transfiere a una disolución que contiene el compuesto de interés.
Las expresiones "al menos una parte de", "una parte de" y "cualquier parte de", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, cuando se refieren al Sitio II, o las coordenadas de estructura del Sitio II, o la cavidad circunscrita por el Sitio n, se refieren a todo o cualquier parte del Sitio II, o las coordenadas de estructura del Sitio II, o la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que el Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} respecto a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I. Preferiblemente, las expresiones se refieren a un número suficiente de restos o las correspondientes coordenadas de estructura de modo que sean útiles en el acoplamiento o modelado de un ligando en la cavidad circunscrita por el Sitio II. Preferiblemente, las expresiones comprenden uno o más de los siguientes restos o las correspondientes coordenadas de estructura: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667. Estos son los restos del Sitio II que no son solo parte del Sitio I. Más preferiblemente, las expresiones comprenden uno o más de los siguientes restos o las correspondientes coordenadas de estructura: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Y663, L664 y K667. Preferiblemente, las expresiones se refieren a al menos 4 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 8 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 restos de aminoácidos, lo más preferiblemente al menos 30 restos de aminoácidos.
El término "mutante", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína o parte de proteína, que tiene una o más deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones o sustituciones de aminoácidos comparado con la proteína natural relevante o parte relevante de la proteína natural. Una proteína natural es la que se encuentra en la naturaleza. Un Sitio II mutante está dentro del alcance de la invención siempre que la desviación típica en los átomos de la cadena principal de los restos conservados entre dicho Sitio II mutante y los restos del Sitio II de acuerdo con la Tabla I esté dentro de 2,0 Angstroms. Un mutante puede tener una actividad igual, similar o alterada comparado con la proteína natural. La actividad se refiere a la transrepresión, transactivación y unión al ligando. Los mutantes preferidos tienen una identidad de secuencia de al menos 25%, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 50%, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 75% y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 95% respecto a la proteína natural o parte de la proteína natural.
La expresión "desviación típica" significa la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones de la media. Es una forma de expresar la desviación o variación de una tendencia u objetivo. Para el propósito de esta invención, la "desviación típica" define la variación de la cadena principal de una proteína o parte de una proteína respecto de la parte relevante de la cadena principal de otra proteína, tal como el LBD definido por las coordenadas de estructura de la Tabla I.
La expresión "coordenadas de estructura", "coordenadas estructurales", "coordenadas atómicas" o "coordenadas de estructura atómica", se refieren a las coordenadas que especifican la posición de los centros de los átomos de una molécula de proteína o complejo molecular. Las expresiones incluyen, pero sin limitar, coordenadas Cartesianas, coordenadas polares y coordenadas internas. Las coordenadas de estructura se pueden generar por cualquier medio, incluyendo la construcción de un modelo por homología o derivación de ecuaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) de una molécula o complejo molecular en forma cristalina. Los datos de difracción se usan para calcular el mapa de densidad electrónica de la unidad que se repite del cristal. Después, los mapas de densidad electrónica se usan para establecer las posiciones de los átomos individuales de la molécula o complejo molecular.
El término "molécula", como se usa en el presente documento, tiene el significado usado generalmente en la materia e incluye, pero sin limitar, proteínas, ácidos nucleicos y compuestos químicos, incluyendo compuestos orgánicos pequeños. Los "compuestos orgánicos pequeños" también se conocen como "moléculas orgánicas pequeñas" o "moléculas pequeñas".
El término "complejo" o expresión "complejo molecular", como se usan en el presente documento, se refiere a una asociación covalente o no covalente de una molécula con su ligando.
La expresión "entidad química", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos químicos, complejos de al menos dos compuestos químicos, y fragmentos de dichos compuestos o complejos químicos. Un modulador puede ser una entidad química. Un ligando puede ser una entidad química.
El término "compuesto", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico.
La expresión "molécula de ensayo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, preferiblemente un compuesto químico, en el que se van a ensayar las características específicas.
El término "ligando", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se une a otra molécula o parte de otra molécula.
El término "modulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula cuya presencia induce una actividad en la molécula que modula. Un modulador puede unirse a la molécula que modula, es decir, ser un ligando de la molécula que modula. Un modulador preferido es un ligando de la molécula que modula. Los moduladores incluyen, pero sin limitar, moléculas orgánicas pequeñas, compuestos químicos, péptidos, peptidomiméticos (p. ej., péptidos cíclicos, análogos peptídicos o péptidos restringidos) y ácidos nucleicos. Los moduladores pueden ser naturales o sintéticos. Los moduladores preferidos son moléculas orgánicas pequeñas.
El término "modelado", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere al desarrollo de una construcción matemática que imita la geometría molecular real y el comportamiento de proteínas y moléculas pequeñas. Estas construcciones matemáticas incluyen, pero no se limitan a: cálculos de energía para una geometría dada de una molécula que usa campos de fuerza y procedimientos ab initio conocidos en la materia; minimización de energía usando gradientes de energía calculados como átomos que se desplazan para producir así una energía menor; búsqueda conformacional, es decir, localización de mínimos de energía locales; dinámica molecular en la que un sistema molecular (una molécula o complejo de ligando/proteína) se propaga hacia adelante por incrementos de tiempo de acuerdo con la mecánica de Newton usando técnicas conocidas en la materia; cálculos de propiedades moleculares tales como campos electrostáticos, hidrofobicidad y lipoficidad; cálculo de superficies moleculares accesibles al disolvente y otras, e interpretación de las propiedades moleculares de esas superficies; comparación de moléculas usando correspondencias átomo-átomo u otros criterios tales como superficies y propiedades; relaciones estructura-actividad cuantitativas, en las que las características moleculares o propiedades que dependen de estas se correlacionan con datos de actividad o bioensayo.
La expresión "ajuste espacial", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere a cuando la estructura tridimensional de un compuesto se acomoda geométricamente en una cavidad o bolsillo de una proteína, tal como la cavidad circunscrita por el Sitio II.
Las expresiones "acoplamiento" y "realizar una operación de ajuste", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere a la colocación computacional de una entidad química (p. ej., un ligando potencial, preferiblemente una molécula orgánica pequeña) en un espacio (es decir, cavidad) al menos parcialmente encerrado por la estructura de proteína (es decir, sitio de unión), de modo que se puede evaluar la complementaridad de las características estructurales y químicas (es decir, contactos de unión) entre la entidad química y los componentes del sitio de unión, en términos de interacciones típicas de los complejos proteína/ligando. Específicamente, las características estructurales y químicas pueden incluir interacciones tanto de enlace como de no enlace, y más generalmente, las interacciones de no enlace que se producen en el volumen de los complejos de proteína/ligando reversibles, incluirán fuerzas tales como enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas o de carga, interacciones de van der Waals, e interacciones hidrófobas. Dicha colocación se podría llevar a cabo manual o automáticamente usando software diseñado para este propósito.
Los términos "transreprime" o "transrepresión", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere al proceso en el que un NHR reprime la transcripción inhibiendo a un factor de transcripción o coactivador para inducir la transcripción. El término no está limitado por ningún mecanismo de acción específico, ningún factor de la transcripción o coactivador específicos, o ningún gen específico cuya transcripción se reprima. AP-1 y NK-\kappaB son dos factores de transcripción, entre otros, que pueden ser inhibidos por un NHR.
Los términos "transactiva" o "transactivación", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere al procedimiento en el que un NHR estimula la transcripción, por unión al ADN e inducción de la transcripción, o por modulación de la actividad de otra proteína de unión al ADN que incluye la transcripción. El término no está limitado a ningún mecanismo de acción específico o ningún gen cuya transcripción sea estimulada.
La expresión "expresión de genes dependiente de NF-\kappaB", como se usa en el presente documento, se refiere a la expresión de aquellos genes que están bajo el control regulador del factor de transcripción NF-\kappaB. Dichos genes incluyen, pero sin limitar, los genes inflamatorios y relacionados con el sistema inmunitario que codifican TNF-alfa, IL-1, IL-2, IL-5, moléculas de adhesión (tales como E-selectina), quimioquinas (tales como Eoxtaxina y Rantes), y Cox-2.
La expresión "expresión de genes dependiente de AP-1", como se usa en el presente documento, se refiere a la expresión de los genes que están bajo el control regulador del factor de transcripción AP-1. Dichos genes incluyen, pero sin limitar, los genes inflamatorios y relacionados con el sistema inmunitarios que codifican TNF-alfa, IL-1, IL-2, IL-5, moléculas de adhesión (tales como E-selectina), quimioquinas (tales como Eoxtaxina y Rantes), y Cox-2.
La expresión "compuesto disociado", como se usa en el presente documento, se refiere a un modulador de un NHR que induce la transrepresión e induce transactivación mínima o no induce. La expresión "actividad disociada" se refiere a la actividad en la que un compuesto disociado induce transrepresión e induce transactivación mínima o no induce.
Los términos "tratar", "trata" o "tratamiento", en todas sus formas gramaticales, como se usa en el presente documento, se refiere a la prevención, reducción o mejora, alivio parcial o completo, o cura de una enfermedad, trastorno o afección.
La expresión "enfermedad asociada con NHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de expresión de un gen cuya transcripción es estimulada o reprimida por un NHR. La estimulación es a través de la transactivación. La represión es a través de la transrepresión. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la transrepresión de NHR, enfermedades asociadas con la transactivación de NHR, enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de NHR, y enfermedades que se pueden tratar antagonizando la transactivación de NHR.
La expresión "enfermedad asociada con SHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de expresión de un gen cuya transcripción es estimulada o reprimida por un SHR. La estimulación es a través de la transactivación. La represión es a través de la transrepresión. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la transrepresión de SHR, enfermedades asociadas con la transactivación de SHR, enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de SHR, y enfermedades que se pueden tratar antagonizando la transactivación de SHR.
La expresión "enfermedad asociada con GR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de expresión de un gen cuya transcripción es estimulada o reprimida por un GR. La estimulación es a través de la transactivación. La represión es a través de la transrepresión. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la transrepresión de NHR, enfermedades asociadas con la transactivación de GR, enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de GR, y enfermedades que se pueden tratar antagonizando la transactivación de GR.
La expresión "enfermedad asociada con la transrepresión de NHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transreprimida por un NHR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos asociados inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, y enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de NHR.
La expresión "enfermedad asociada con la transrepresión de SHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transreprimida por un SHR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos asociados inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, y enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de SHR.
La expresión "enfermedad asociada con la transrepresión de GR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transreprimida por un GR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, enfermedades asociadas con la expresión de genes dependiente de AP-1, y enfermedades que se pueden tratar por inducción de la transrepresión de GR.
La expresión "enfermedad asociada con la transactivación de NHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transactivada por un NHR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama, insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria, y enfermedad de Addison.
La expresión "enfermedad asociada con la transactivación de SHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transactivada por un SHR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama, insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria, y enfermedad de Addison.
La expresión "enfermedad asociada con la transactivación de GR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de transcripción de un gen cuya transcripción es transactivada por un GR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama, insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria, y enfermedad de Addison.
La expresión "enfermedad asociada con la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de expresión de un gen bajo el control regulador de NF-\kappaB. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario; cáncer y trastornos tumorales, tales como tumores sólidos, linfomas y leucemia; infecciones fúngicas tales como micosis fungoides; lesión isquémica o por reperfusión tal como lesión isquémica o por reperfusión que puede haber ocurrido durante el trasplante de órganos, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular u otras causas; y enfermedades de replicación de ADN y ARN víricos, tales como herpes símplex de tipo 1 (HSV-1), herpes símplex de tipo 2 (HSV-2), hepatitis (incluyendo hepatitis B y hepatitis C), citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y de inmunodeficiencia humana (VIH).
La expresión "enfermedad asociada con la expresión de genes dependiente de AP-1", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con el producto de expresión de un gen bajo el control regulador de AP-1. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario; cáncer y trastornos tumorales, tales como tumores sólidos, linfomas y leucemia; e infecciones fúngicas tales como micosis fungoides.
La expresión "enfermedades o trastornos inflamatorios o asociados con el sistema inmunitario", como se usa en el presente documento, abarca cualquier afección, enfermedad o trastorno que tiene un componente inflamatorio o inmunitario, incluyendo, pero sin limitar, cada una de las siguientes afecciones: rechazo de trasplante (p. ej., riñón, hígado, corazón, pulmón, páncreas (p. ej., células de los islotes), médula ósea, córnea, intestino pequeño, aloinjertos de piel, homoinjertos de piel (tales como los usados en el tratamiento de quemaduras), xenoinjertos de válvula del corazón, enfermedad del suero, y enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, diabetes juvenil, asma, enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), pioderma gangrenosa, lupus (lupus eritematoso sistémico), miastenia grave, psoriasis, dermatitis, dermatoimiositis; eczema, seborrea, inflamación pulmonar, uveítis del ojo, hepatitis, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis autoinmune, síndrome de Behcet o Sjorgen (ojos/boca secos), anemia perniciosa o inmunohemolítica, aterosclerosis, enfermedad de Addison (enfermedad autoinmune de las glándulas suprarrenales), insuficiencia suprarrenal idiopática, enfermedad poliglandular autoinmune (también conocida como síndrome poliglandular autoinmune), glomerulonefritis, escleroderma, morfea, liquen plano, vitíligo (despigmentación de la piel), alopecia aerata, alopecia autoinmune, hipopitituarismo autoinmune, síndrome de Guillain-Barre, y alveolitis; enfermedades de hipersensibilidad mediadas por linfocitos T, incluyendo hipersensibilidad por contacto, hipersensibilidad de tipo retardado, dermatitis de contacto (incluyendo la debida a envenenamiento por hiedra), urticaria, alergias de la piel, alergias respiratorias (fiebre del heno, rinitis alérgica) y enteropatía sensible al gluten (enfermedad celiaca); enfermedades inflamatorias tales como osteoartritis, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda, síndrome de Sezary y enfermedades vasculares que tienen un componente inflamatorio o de proliferación tales como reestenosis, estenosis y arterosclerosis. Las enfermedades o trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario también incluyen, pero sin limitar: enfermedades endocrinas, trastornos reumáticos, enfermedades del colágeno, enfermedad dermatológica, enfermedad alérgica, enfermedad oftálmica, enfermedad respiratoria, enfermedad hematológica, enfermedad gastrointestinal, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, hiperplasia suprarrenal congénita, tiroiditis no supurativa, hipercalcemia asociada con cáncer, artritis psoriásica, artritis reumatoide incluyendo la artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, bursitis aguda y subaguda, tenosinovitis agua no específica, artritis gotosa aguda, osteoartritis postraumática, sinovitis de osteoartritis, epicondilitis, lupus eritematoso sistémico, carditis reumática aguda, pénfigo, dermatitis bullosa herpetiforme, eritema multiforma grave, dermatitis exfoliante, psoriasis, dermatitis seborreica, rinitis alérgica estacional o perenne, enfermedad del suero, asma bronquial, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, reacciones de hipersensibilidad a fármacos, conjuntivitis alérgica, queratitis, herpes zóster oftálmico, iritis e iridociclitis, coriorretinitis, neuritis óptica, sarcoidosis sintomática, tuberculosis pulmonar fulminante o diseminada cuando se usa quimioterapia, trombocitopenia púrpura idiopática en adultos, trombocitopenia secundaria en adultos, anemia hemolítica adquirida (autoinmune), leucemias y linfomas en adultos, leucemia aguda en la infancia, colitis ulcerativa, enteritis regional, enfermedad de Crohn, síndrome de Sjorgen, vasculitis autoinmune, esclerosis múltiple, miastenia grave, espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, rechazo de trasplante de órganos sólidos, sepsis y alergia.
La expresión "enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de NHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de NHR. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitar, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario.
La expresión "enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de SHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de SHR. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitar, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario.
La expresión "enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de GR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar por inducción de la transrepresión de GR. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitar, enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario.
La expresión "enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de NHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de NHR. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitar: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama e insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria.
La expresión "enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de SHR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de SHR. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitar: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama e insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria.
La expresión "enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de GR", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad que se puede tratar antagonizando la transactivación de GR. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad, hipertensión, obesidad, depresión, y SIDA, estado de curación de heridas, cáncer de próstata, cáncer de mama e insuficiencia suprarrenal primaria o secundaria.
Sistemas de ordenador y medios de almacenamiento de datos legibles por máquina
Los autores de la invención han identificado un segundo sitio de unión en el dominio de unión al ligando de los NHR, denominado Sitio II, y proporcionan en el presente documento las coordenadas de estructura del Sitio II. Las coordenadas de estructura se pueden usar en el diseño e identificación de ligandos del Sitio II y moduladores de los NHR. Con el fin de usar así las coordenadas de estructura, puede ser necesario convertirlas en una forma tridimensional. Esto se logra por el uso de software disponible en el comercio que, junto con un ordenador, puede generar representaciones gráficas tridimensionales de moléculas o partes de las mismas a partir de un conjunto de coordenadas de estructura proporcionadas en un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina que comprenden todas o cualquier parte de las coordenadas de estructura del Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I.
También se describe en el presente documento un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina, que consisten en todas o cualquier parte de las coordenadas de estructura de un Sitio II.
Como se ilustra en la Figura 3, la cavidad circunscrita por el Sitio II y la cavidad circunscrita por el Sitio I comparten una sección de pared común. Es decir, los aminoácidos son comunes tanto al Sitio II como al Sitio I. Sin embargo, la cavidad circunscrita por el Sitio II es distinta de la cavidad circunscrita por el Sitio I, puesto que las dos cavidades están en lados opuestos de la pared común. Se acopló manualmente la dexametasona al Sitio I de GR (véase el ejemplo 10) y se determinó que los siguientes aminoácidos están a distancia de contacto, es decir a 2-3 Angstroms, de la dexametasona y por lo tanto componente el Sitio I de GR: M560, L563, N564, L566, G567, Q570, M601, M604, A605, L608, R611, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748. Los siguientes restos de aminoácidos son comunes tanto al Sitio I como al Sitio II de GR: L566, G567, Q570, M601, M604, A605 y R611. Los siguientes restos aminoácidos son únicos para el Sitio II de GR, es decir, no son parte del Sitio I de GR: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667. Los siguientes restos de aminoácidos son únicos del Sitio I de GR, es decir, no son parte del Sitio II de GR: M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748. Los aminoácidos en otros NHR y GR no humanos correspondientes a los aminoácidos de GR citados antes, se pueden ver en las Figuras 2 y 6, respectivamente. Los autores de la invención han identificado recientemente el Sitio II y su función, y han sido los primeros en identificar el Sitio II en los NHR como un sitio de unión cuyos ligandos modulan los NHR.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina, en el que los datos: (a) comprenden todas o parte de las coordenadas de estructura de un Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; y (b) no comprenden las coordenadas de estructura que describen átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de uno o más de los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I. Preferiblemente, dichos datos no comprenden las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de todos los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I. Preferiblemente, la desviación típica de la parte (b) es inferior a 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ó 1,5 \ring{A}, más preferiblemente menor que 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,03, 1,02, ó 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,93, 0,92, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 \ring{A}, lo más preferiblemente 1,02, 0,92 ó 0,0 \ring{A}.
Los medios de almacenamiento de datos legibles por máquina de la presente invención se usan en un ordenador. El ordenador es capaz de producir una representación tridimensional del sitio II, y comprende diferentes componentes, incluyendo el medio de almacenamiento de datos legibles por máquina, usado para producir la representación tridimensional.
Por lo tanto, el contexto de la presente invención describe además un sistema de ordenador capaz de producir una representación tridimensional de todo o cualquier parte del Sitio II, en el que dicho sistema de ordenador comprende: (a) un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina, que comprenden todas o parte de las coordenadas de estructura del Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; (b) una memoria operativa para almacenar instrucciones para procesar dichos datos legibles por máquina; (c) una unidad de procesamiento central acoplada con dicha memoria operativa y dicho medio de almacenamiento de datos legibles por máquina para procesar dichos datos legibles por máquina en la representación tridimensional; y (d) una pantalla acoplada con dicha unidad de procesamiento de datos para mostrar dicha representación tridimensional.
En el presente documento también se describe un sistema de ordenador, como se ha descrito antes, en el que los datos legibles por máquina, consisten en todas o cualquier parte de las coordenadas de estructura del Sitio II.
El contexto de la presente invención también describe un sistema de ordenador capaz de producir una representación tridimensional de todo o cualquier parte del Sitio II, en el que dicho sistema de ordenador comprende: (a) un medio de almacenamiento de datos legibles por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina, en el que los datos: (i) comprenden todas o cualquier partes de las coordenadas de estructura del Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; y (ii) no comprende las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de uno o más de los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I; (b) una memoria operativa para almacenar instrucciones para procesar dichos datos legibles por máquina; (c) una unidad de procesamiento central acoplada con dicha memoria operativa y dicho medio de almacenamiento de datos legibles por máquina para procesar dichos datos legibles por máquina en la representación tridimensional; y (d) una pantalla acoplada con dicha unidad de procesamiento central para mostrar dicha representación tridimensional. Preferiblemente, dichos datos no comprenden las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de todos los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I.
Para toda la presente invención, preferiblemente dichas coordenadas de estructura son coordenadas Cartesianas, coordenadas polares o coordenadas internas. Lo más preferiblemente dichas coordenadas de estructura son coordenadas Cartesianas.
Para toda la presente invención, preferiblemente dichas coordenadas de estructura son de al menos 4 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 8 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 15 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 25 aminoácidos, lo más preferiblemente de al menos 30 aminoácidos.
Para toda la presente invención, dichas coordenadas de estructura pueden ser las determinadas para un Sitio II al que se une un ligando o al que no se une ligando. Dichas coordenadas de estructura pueden ser las determinadas para un Sitio II de un NHR que es un monómero, dímero u otra forma.
Un experto en la materia reconocerá que puede haber varias realizaciones de los componentes del sistema de ordenador. Una realización de un sistema de ordenador usa System 10 como se describe en el documento W0 98/11134, cuya descripción se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Brevemente, una versión del sistema de ordenador comprende una unidad de procesamiento central ("CPU"), una memoria operativa que puede ser, p. ej. RAM (memoria de acceso aleatorio) o memoria "central", memoria de almacenamiento masivo (tal como una o más unidades de disco o unidades de CD-R0M), uno o más terminales de pantallas de rayos catódicos ("CRT"), uno o más teclados, uno o más puntos de entrada y uno o más puntos de salida, todos los cuales están interconectados por un sistema de bus bidireccional.
El hardware de introducción de datos, acoplado con el ordenador por los puntos de entrada, se puede implementar en una variedad de formas. Los datos legibles por máquina de esta invención se pueden introducir mediante el uso de uno o más módems conectados por una línea de teléfono o una línea de datos. Alternativamente o adicionalmente, el hardware de introducción de datos puede comprender unidades de CD-ROM o unidades de discos. Junto con una terminal de pantalla se puede usar también un teclado como un dispositivo de introducción de datos.
El hardware de salida de datos, acoplado con el ordenador por los puntos de salida, puede implementarse de forma similar mediante dispositivos convencionales. A modo de ejemplo, el hardware de salida de datos puede incluir una terminal de pantalla de CRT para mostrar una representación gráfica de una región o dominio de la presente invención, usando un programa tal como QUANTA como se describe en el presente documento. El hardware de salida de datos también puede incluir una impresora, de modo que pueda producirse una copia en papel, o una unidad de disco, para almacenar la salida para su uso posterior.
En el funcionamiento, la CPU coordina el uso de diferentes dispositivos de introducción y salida de datos, coordina accesos de datos del almacenamiento masivo y accesos a y desde la memoria operativa, y determina la secuencia de etapas del procesamiento de datos. Hay una serie de programas que se pueden usar para procesar los datos legibles por máquina de esta invención. Dichos programas se discuten con referencia a los procedimientos computacionales de descubrimiento de fármacos descritos en el presente documento. Las referencias específicas a los componentes del sistema de hardware se incluyen, según sea adecuado, a lo largo de la siguiente descripción del medio de almacenamiento de datos.
Para los propósitos de la presente invención, cualquier medio de almacenamiento de datos magnético que pueda ser codificado con datos legibles por máquina sería suficiente para cumplir los requisitos de almacenamiento del sistema. El medio podría ser un disco flexible o disco duro convencionales, que tengan un sustrato adecuado, que puede ser convencional, y un recubrimiento adecuado, que puede ser convencional, por uno o ambos lados, que contenga dominios magnéticos, cuya polaridad u orientación pueda ser alterada magnéticamente, por ejemplo, El medio también puede tener una apertura para recibir el eje de una unidad de disco u otro dispositivo de almacenamiento de datos.
Los dominios magnéticos del recubrimiento de un medio pueden polarizarse u orientarse de modo que codifiquen de una forma que puedan ser datos legibles por máquina convencionales, para ejecutar con un sistema tal como el sistema descrito en el presente documento.
Otro ejemplo de un medio de almacenamiento adecuado que también podría ser codificado con dichos datos legibles por máquina, o conjunto de instrucciones, que podría realizarse mediante un sistema, tal como el sistema descrito en el presente documento, podría ser un medio de almacenamiento de datos de lectura óptica. El medio podría ser un disco compacto de memoria solo de lectura (CD-R0M) o un medio reescribible tal como un disco óptico-magnético que es de lectura óptica y de escritura magneto-óptica. El medio preferiblemente tiene un sustrato adecuado, que puede ser convencional, y un recubrimiento adecuado, que puede ser convencional, normalmente de un lado del sustrato.
En el caso de un CD-R0M, como es conocido, el recubrimiento es reflectante y es impreso por una pluralidad de punteaduras para codificar los datos legibles por máquina. La disposición de las punteaduras es leída por la luz láser que se refleja en la superficie del recubrimiento. Se proporciona un recubrimiento protector, que preferiblemente es sustancialmente transparente sobre la parte superior del recubrimiento reflectante.
En el caso de un disco magneto-óptico, como es conocido, el recubrimiento no tiene punteaduras sino una pluralidad de dominios magnéticos cuya polaridad u orientación puede ser leída midiendo la polarización de la luz láser reflejada del recubrimiento. La disposición de los dominios codifica los datos como se ha descrito antes.
Procedimientos para diseñar e identificar ligandos del Sitio II y moduladores de los NHR
En el contexto de la presente invención, se describe el uso del diseño de fármacos racional o basado en estructura y la selección virtual para diseñar o identificar potenciales ligandos y moduladores del Sitio II.
La identidad del Sitio II como se describe en el presente documento, permite la práctica de las siguientes técnicas realizadas habitualmente en el diseño basado en estructura y la selección virtual.
Usando un modelo tridimensional de todo o cualquier parte del Sitio II, se puede acoplar una molécula de ensayo, es decir, ligando potencial o modulador potencial, en una cavidad circunscrita en el Sitio II, es decir, se puede realizar una operación de ajuste entre una molécula de ensayo y el Sitio II. Después del acoplamiento, se pueden analizar en la molécula de ensayo la complementaridad de las características estructurales y químicas con todo o cualquier parte del Sitio II. Las características estructurales y químicas incluyen, pero sin limitar, una cualquiera de las siguientes: interacciones de van der Waals, interacciones por enlaces de hidrógeno, interacción de carga, interacciones hidrófobas e interacciones de dipolos.
Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento de acoplamiento de una molécula de ensayo, que comprende acoplar la molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por un Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I. El procedimiento además comprende analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas de la molécula de ensayo en todo o cualquier parte de dicho Sitio II.
Se puede crear un modelo tridimensional usando procedimientos conocidos en la materia, incluyendo, pero sin limitar, el uso de software tal como InsightII (Accelrys, Inc., San Diego, CA), SYBYL (Tripos Associates, St. Louis, MO), y Flo (Colin McMartin, Thistlesoft, Colebrook, CT). El acoplamiento se puede hacer de forma manual o usando una variedad de software, incluyendo, pero sin limitar, DOCK (Kuntz y col. 1982), GOLD (Cambridge Crystallographic Data Center, 12 Union Road, Cambridge, UK), o Flo (Thistlesoft, High Meadow, 603 Colebrook Raod, Colebrook, CT). El análisis de la complementaridad de las características estructurales y químicas incluye cualquier procedimiento de a) cuantificación de las características de los componentes atómicos encontrados en una molécula ligando y molécula de proteína (p. ej., carga, tamaño, forma, polarizabilidad, hidrofobicidad, etc.), y b) cuantificación de las interacciones entre dichas características en la molécula ligando, la molécula de proteína y el complejo de proteína/ligando, determinado usando cualquier serie de procedimientos conocido en la materia (p. ej., campos de fuerza de la mecánica molecular y/o mecánica cuántica). El análisis de la complementaridad de las características estructurales y químicas puede realizarse, por ejemplo, visualmente o puntuando funciones basándose en interacciones de ligando-sitio computadas como se implementa en DOCK, GOLD o Flo.
Un modelo tridimensional del Sitio II se puede usar para identificar las características estructurales y químicas que pueden estar implicadas en la unión de los ligandos al Sitio II. Las características estructurales y químicas identificadas se pueden usar para diseñar ligandos o moduladores del Sitio II o identificar moléculas de ensayo como ligandos o moduladores del Sitio II.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un procedimiento para identificar características estructurales y químicas que comprende identificar las características estructurales y químicas de todo o cualquier parte de un Sitio II, usando un modelo tridimensional de todo o cualquier parte del Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I. La identificación de características estructurales y químicas se puede realizar por medios conocidos en la materia, tal como mediante el uso de DOCK, GOLD o Flo.
El diseño basado en estructura a menudo implica modelización. La modelización es el desarrollo de una construcción matemática diseñada para imitar la geometría molecular real y el comportamiento en proteínas y moléculas pequeñas. Estas construcciones matemáticas incluyen, pero sin limitar: cálculos de energía para una geometría dada de una molécula usando campos de fuerza o procedimientos ab initio conocidos en la materia; minimización de energía usando gradientes de energía calculados como átomos desplazados para producir así una energía menor; búsqueda conformacional, es decir, localización de mínimos de energía locales; dinámica molecular en la que un sistema molecular (una molécula sola o complejo de ligando/proteína) se propaga hacia adelante por incrementos de tiempo de acuerdo con la mecánica de Newton usando técnicas conocidas en la materia; cálculos de propiedades moleculares tales como campos electrostáticos, hidrofobicidad y lipoficidad; cálculo de superficies moleculares accesibles al disolvente y otras e interpretación de las propiedades moleculares de esas superficies; comparación de moléculas usando correspondencias átomo-átomo u otros criterios tales como superficies y propiedades; relaciones estructura-actividad cuantitativas, en las que las características moleculares o propiedades que dependen de estas se correlacionan con datos de actividad o bioensayo. Se encuentran disponibles una serie de sistemas de modelización por ordenador en los que se pueden introducir una secuencia y estructura (es decir, coordenadas de estructura) de una proteína o parte de una proteína. Los ejemplos de dichos sistemas de modelado por ordenador incluyen, pero sin limitar InsightII (Accelrys, Inc., San Diego, CA), SYBYL (Tripos Associates, St. Louis, M0), y Flo (Colin McMartin, Thistlesoft, Colebrook, CT). El sistema de ordenador después genera los detalles estructurales de una o más regiones en las que un ligando potencial se une, de modo que se puede determinar la complementaridad de las características estructurales y químicas de los potenciales ligandos. El diseño en estos sistemas de modelado en general se basa en el compuesto que es capaz de asociarse estructural y químicamente con la proteína, es decir, tener complementaridad de las características estructurales y químicas. Además, el compuesto debe poder asumir una conformación que le permita asociarse con la proteína. Algunos sistemas de modelado y diseño calculan el potencial efecto inhibidor o de unión de un potencial modulador antes de la síntesis y ensayo reales. Usando el modelado se pueden diseñar compuestos nuevos usando un sitio de unión vacío. Alternativamente, se pueden diseñar compuestos que incluyen alguna parte de un ligando conocido, es decir, hecho en el sitio. El ligando conocido puede haberse determinado por selección virtual. Los programas de diseño incluyen, pero sin limitar, LUDI (Bohm 1992), LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis MO) y DOCK (Kuntz y col., 1982).
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención se describe un procedimiento para diseñar un ligando del Sitio II que comprende: (a) el modelado de todas o cualquier parte de un Sitio II; y (b) basándose en dicho modelado, el diseño de una entidad química que tenga complementaridad de las características estructurales y químicas con todo o cualquier parte de dicho Sitio II; en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I. La entidad química se diseña para ajustar espacialmente en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II. La entidad química se puede diseñar manualmente sin ayuda de software de ordenador sea de forma nueva o incluyendo alguna parte de un ligando conocido. La entidad química se puede diseñar por ordenador sea de forma nueva o incluyendo alguna parte de un ligando conocido. El diseño por ordenador puede usar una base de datos de la cual se eligen entidades químicas basadas en este modelo. El procedimiento puede comprender además: (c) acoplar la entidad química en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por dicho Sitio II; y (d) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas de la entidad química con todo o cualquier parte del Sitio II. El procedimiento puede comprender además analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas de una segunda entidad química con todo o cualquier parte de dicho Sitio II, tal como cuando la operación de modelado desarrolla un ligando en el sitio.
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También se describe en el presente documento un procedimiento para diseñar un modulador de un NHR que comprende: (a) modelar todas o cualquier parte de un Sitio II; y (b) basándose en dicha modelización, diseñar una entidad química que tenga complementaridad de las características estructurales y químicas con todo o cualquier parte de dicho Sitio II; en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I. La entidad química se diseña para ajustar espacialmente en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II. La entidad química se puede diseñar manualmente sin ayuda de software de ordenador sea de forma nueva o incluyendo alguna parte de un ligando conocido. La entidad química se puede diseñar por ordenador sea de forma nueva o incluyendo alguna parte de un ligando conocido. El diseño por ordenador puede usar una base de datos de la cual se eligen entidades químicas basadas en el modelo. El procedimiento puede comprender: (c) acoplar la entidad química en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por dicho Sitio II; y (d) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas de la entidad química con todo o cualquier parte del Sitio II. El procedimiento puede comprender además analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas de una segunda entidad química con todo o cualquier parte de dicho Sitio II, tal como cuando la operación de modelado desarrolla un ligando en el sitio.
Los procedimientos de selección virtual, es decir procedimientos para evaluar el potencial de entidades químicas para unirse a una proteína o parte de una proteína dada, se conocen en la materia. Estos procedimientos a menudo usan bases de datos como fuentes de las entidades químicas y a menudo se usan en el diseño de ligandos. A menudo estos procedimientos empiezan por la inspección visual del sitio de unión en la pantalla del ordenador. Después, las entidades químicas seleccionadas se pueden colocar, es decir, acoplar, en una o más posiciones y orientaciones en el sitio de unión y se puede analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas.
En la selección virtual, el acoplamiento molecular se puede realizar usando un software tal como InsightII, ICM (Molsoft LLC, La Jolla, CA), y SYBYL, seguido de minimización de energía y dinámica molecular con campos de fuerza de mecánica molecular estándar tales como CHARM y MMFF. Los ejemplos de los programas de ordenador que ayudan en la selección de las entidades químicas útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitar, GRID (Goodford, 1985), AUTODOCK (Goodsell, 1990), y DOCK (Kuntz y col. 1982). Las bases de datos de entidades químicas que se pueden usar incluyen, pero sin limitar, ACD (Molecular Designs Limited), Aldrich (Aldrich Chemical Company), NCI (National Cancer Institute), Maybridge (Maybridge Chemical Company Ltd), CCDC (Cambridge Crystallographic Data Center), CAST (Chemical Abstract Service) y Derwent (Derwent Information Limited).
Por ejemplo, se pueden usar programas tales como DOCK (Kuntz y col. 1982) con las coordenadas de estructura del sitio II para identificar entidades químicas de las bases de datos o bases de datos virtuales de moléculas pequeñas. Estas moléculas pueden ser, por lo tanto, candidatos adecuados para la síntesis y ensayo. Dicho procedimiento de selección virtual puede incluir, pero sin limitar, las siguientes etapas:
1) Selección de una entidad química de una base de datos o de otro sitio y colocación de la entidad química en una o más orientaciones en toda o cualquiera parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que el Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I.
2) Caracterización de las características estructurales y químicas de la entidad química y del sitio de unión, tales como interacciones de van der Waals, interacciones por enlaces de hidrógeno, interacción de cargas, interacción por enlaces hidrófobos, e interacciones de dipolos.
3) Opcionalmente, selección de una base de datos o de cualquier otro sitio, de una entidad química que se puede juntar con o puede sustituir la entidad química acoplada y ajustar espacialmente en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II.
4) Evaluación de la entidad química acoplada usando una combinación de esquemas de puntuación que tienen en cuenta las interacciones de van der Waals, interacciones por enlaces de hidrógeno, interacción de cargas e interacciones hidrófobas, es decir, evaluación de la complementaridad de las características estructurales y químicas.
Tras la selección de las entidades químicas preferidas, se puede visualizar la relación entre ellas y con el Sitio II y después ensamblarlo en un solo ligando potencial. Los programas útiles en el ensamblaje de las entidades químicas individuales incluyen, pero sin limitar, SYBYL y LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis MO), LUDI (Bohm 1992) y 3D Database systems (Martin 1992).
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a todo o cualquier parte del Sitio II que comprende: a) acoplar una entidad química en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por un sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la entidad química y todo o cualquier parte de dicho sitio II. La entidad química se puede seleccionar de una base de datos. El procedimiento puede comprender además una etapa en la que una segunda entidad química se junta con la primera entidad química que se ha acoplado y analizado, y la entidad química resultante se acopla y analiza.
Los ligandos diseñados o identificados usando los procedimientos descritos en el presente documento, se pueden sintetizar y seleccionar en un ensayo de unión al Sitio II de NHR (tal como se describe en los Ejemplos 15 y 18), o en un ensayo diseñado para ensayar la actividad funcional (tal como el ensayo de transrepresión celular descrito en el Ejemplo 3 y el ensayo de transcripción celular descrito en el Ejemplo 4, y ensayos de competición descritos en los Ejemplos 11 y 12). Los ejemplos de ensayos útiles en la selección de potenciales ligandos o moduladores incluyen, pero sin limitar, selección en ensayos in vitro, in Silico y ensayos de alto rendimiento.
Igualmente y además del procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse al Sitio II, se pueden seleccionar moléculas de ensayo, usando medios computacionales y ensayos biológicos, para identificar ligandos del Sitio II y moduladores de los NHR. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un procedimiento para identificar un modulador de un NHR. El procedimiento comprende las siguientes etapas, que se llevan a cabo preferiblemente, pero no necesariamente, en el orden dado: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II, y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR. Se identifica una molécula de ensayo como un modulador de un NHR, si la complementaridad de las características estructurales y químicas y/o la modulación superan un nivel deseado. Un compuesto que estimula o inhibe una actividad medida en un ensayo celular en más de 10%, es un modulador preferido. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) selección de la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II; y e) selección de la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
Un ensayo biológico de modulación de un NHR incluye, pero sin limitar: un ensayo de transrepresión, tal como se describe en el Ejemplo 3; un ensayo de transactivación, tal como se describe en el Ejemplo 4; un ensayo de competición de transrepresión tal como se describe en el Ejemplo 11; y un ensayo de competición de transactivación, tal como se describe en el Ejemplo 12. Un ensayo que caracteriza la unión al Sitio II incluye, pero sin limitar, cualquiera de los ensayos descritos en los Ejemplos 15 y 18. En el contexto de la presente invención, se describe un procedimiento para identificar un ligando del Sitio II. El procedimiento comprende las siguientes etapas, que se llevan a cabo preferiblemente, pero no necesariamente, en el orden dado: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II, y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II. Una molécula de ensayo que se une al Sitio II se identifica como un ligando del Sitio II. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
En el procedimiento descrito antes de identificación de un modulador de un NHR y el procedimiento de identificación de un ligando del Sitio II, se pueden usar las coordenadas de estructura de un Sitio II de un primer NHR, mientras que los ensayos biológicos (es decir, ensayo biológico de modulación de un NHR, o ensayo que caracteriza la unión al Sitio II, o ensayo que caracteriza la unión al Sitio I) se pueden llevar a cabo usando un segundo NHR. Preferiblemente, las coordenadas de estructura de un Sitio II son del mismo NHR que el NHR usado en los ensayos biológicos.
En los presentes procedimientos, un modulador de un NHR puede inducir una o más de las 4 siguientes actividades en el NHR. No se pretende que la lista sea inclusiva. (1) Un modulador de un NHR puede inducir transrepresión. (2) Un modulador de un NHR puede inducir transactivación. (3) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir transrepresión. (4) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir la transactivación.
Preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un modulador de un SHR, más preferiblemente un modulador de GR.
Un modulador de un NHR, SHR o GR que induce transrepresión incluye, pero sin limitar, un compuesto disociado.
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Preferiblemente, dicho modulador de un NHR induce transrepresión. Más preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado. Más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de SHR. Lo más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de GR.
"Toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II" preferiblemente se refiere a suficiente parte de la cavidad para que sea útil en el acoplamiento o modelado de un ligando en la cavidad. Preferiblemente, toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por uno o más de los siguientes restos: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667. Estos son los restos del Sitio II que no son también parte del Sitio I. Preferiblemente, toda o cualquier parte de la cavidad está circunscrita por al menos 4 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 5 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 8 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 restos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 restos de aminoácidos, lo más preferiblemente al menos 30 restos de aminoácidos.
Las coordenadas de estructura del Sitio II de un primer NHR se pueden usar en los procedimientos anteriores cuando se está interesado en un segundo NHR. Por ejemplo, se pueden usar las coordenadas de estructura del Sitio II de GR en un procedimiento cuando el objetivo final es evaluar el potencial de una entidad química para unirse al Sitio II de otro NHR, por ejemplo, el receptor de andrógenos. Esto es porque, basándose en la similitud estructural entre diferentes NHR, es posible que un modulador del Sitio II de GR, o variantes estructurales de un modulador del Sitio II de GR, se pueda unir al Sitio II en otros NHR. Es conocido en la materia que un solo esteroide se puede unir a múltiples NHR. Por ejemplo, el cortisol se puede unir no solo al GR sino también al receptor de mineralocorticoides. Se cree que está unión del cortisol se produce a través del Sitio L.
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Ligandos del Sitio II y moduladores de NHR
Los autores de la invención han identificado el Sitio II en los NHR y han identificado ligandos del Sitio II como moduladores de los NHR y por lo tanto candidatos a fármacos.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un ligando del Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I.
Un ligando se puede identificar por cualquier ensayo reconocido en la materia para la unión al Sitio II, tales como los ensayos descritos en los Ejemplos 15 y 18.
Los ligandos preferidos se han identificado de acuerdo con un procedimiento de la invención, descrito en el presente documento. Es decir, los ligandos preferidos se identificaron por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a dicho Sitio II. Una molécula de ensayo que se une al Sitio II se identifica como un ligando del Sitio II. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
Los ligandos preferidos son los ligandos de un Sitio II de NHR, más preferiblemente de un Sitio II de SHR, lo más preferiblemente de un Sitio II de GR. En el contexto de la presente invención, también se describe un modulador de un NHR identificado de acuerdo con un procedimiento de la invención, descrito en el presente documento. Es decir, en el contexto de la presente invención se describe un modulador de un NHR, en el que dicho modulador se ha identificado por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR. Una molécula de ensayo se identifica como un modulador de un NHR, si la complementaridad de las características estructurales y químicas y la modulación superan un nivel deseado. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un sitio II; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
Preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un ligando del Sitio II. Los moduladores preferidos son moduladores de un NHR, más preferiblemente de un SHR, lo más preferiblemente de un GR.
En el contexto de la presente invención, se describe también un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio II. Un modulador de un NHR que es un ligando del Sitio II es parte de la invención independientemente de cómo se ha identificado el modulador.
Como se ha expuesto previamente, el término "modulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula cuya presencia induce una actividad en la molécula que modula. La siguiente información sobre moduladores se aplica a todos los de la presente invención.
Un modulador se puede unir a la molécula que modula, es decir ser un ligando de la molécula que modula. Un modulador preferido es un ligando de la molécula que modula. En la presente invención, un modulador preferido es un ligando del Sitio II. Los moduladores incluyen, pero sin limitar, moléculas orgánicas pequeñas, compuestos químicos, péptidos, péptidomiméticos (p. ej., péptidos cíclicos, análogos peptídicos, o péptidos restringidos) y ácidos nucleicos. Los moduladores pueden ser naturales o sintéticos. Los moduladores preferidos son moléculas orgánicas pequeñas.
Un modulador de un NHR puede inducir una o más de las siguientes 4 actividades en el NHR. No se pretende que la lista sea inclusiva. (1) Un modulador de un NHR puede inducir transrepresión. (2) Un modulador de un NHR puede inducir transactivación. (3) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir transrepresión. (4) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir la transactivación.
Un tipo de modulador de un NHR es uno que induce transrepresión. Los ejemplos de este tipo de modulador son esteroides (tales como glucocorticoides y dexametasona) y compuestos disociados, los cuales se discuten ambos más adelante. Se describen varios de dichos moduladores en los Ejemplos. Dicho modulador es útil en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario. Un modulador que induce transrepresión y tiene un efecto sinérgico (es decir, tiene un efecto aditivo) con otro modulador que induce transrepresión, como se describe en los Ejemplos 11 y 17, está incluido en la definición de un modulador que induce transrepresión.
Otro tipo de modulador es un compuesto disociado. Un compuesto disociado es un modulador que induce transrepresión mientras que induce transactivación mínima o no induce. Es decir, un compuesto disociado induce la actividad (1) anterior, pero no induce o induce poco la actividad (2) anterior. Se describen varios de dichos moduladores en los ejemplos. Un compuesto disociado puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para causar transactivación, es decir, un compuesto disociado puede producir la actividad (4) anterior, tal como el compuesto descrito en los ejemplos 11 y 12. Los compuestos disociados que inducen actividad inhibidora de AP-1 y NF-\kappaB sin producir actividad de unión al ADN, son útiles para tratar enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario, tales como la terapia de inmunosupresión. AP-1 y NF-\kappaB son factores de transcripción que regulan la expresión de un gran número de genes implicados en las respuestas inmunitarias e inflamatorias. Estos genes incluyen TNF-alfa, IL-2, IL-5, E-selectina, Eoxtaxina, Rantes, Cox-2, entre otros. A modo de ejemplo, los glucocorticoides, que inhiben la actividad tanto de AP-1 como de NF-\kappaB, son unos de los fármacos antiinflamatorios más potentes conocidos hasta la fecha. Los glucocorticoides se usan para tratar más de 50 enfermedades, sin embargo, su uso en pacientes a menudo está limitado por los efectos secundarios de osteoporosis, diabetes, glaucoma, pérdida muscular, hinchamiento facial, cambios de personalidad y otros. Se cree que un compuesto que inhibe NF-\kappaB y AP-1 sin inducir la unión del ADN (es decir, sin causar transactivación) tendría la mayor parte de los efectos antiinflamatorios de los glucocorticoides sin los efectos secundarios.
Otro tipo de modulador es uno que induce la transactivación sin inducir transrepresión. En el caso de GR, dicho modulador que induce la unión del ADN y transcripción puede ser útil para tratar la enfermedad de Addison u otros trastornos metabólicos en los que los niveles de glucocorticoides en la circulación son menores de lo normal, y en los que producir transrepresión no es conveniente.
Otro tipo de modulador es uno que induce tanto transrepresión como transactivación. Los ejemplos de este tipo de moduladores son esteroides tales como glucocorticoides y dexametasona. Dicho modulador es útil en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y asociados con el sistema inmunitario.
Otro tipo de modulador es uno que antagoniza un modulador que induce transactivación. Estos moduladores inhiben la transcripción. Dicho modulador se describe en el Ejemplo 12. Estos moduladores también pueden inducir transrepresión. En el caso del GR, puede ser útil un modulador que antagoniza, un modulador que induce transactivación para tratar enfermedades metabólicas tales como diabetes, hipertensión, obesidad, glaucoma, depresión y SIDA, y en la curación de heridas. Se cree que algunas de estas enfermedades son causadas, al menos en parte, por niveles de glucocorticoides en la circulación mayores de lo normal. La inhibición de la transactivación o unión del ADN inducida por el mayor nivel de glucocorticoides en la circulación mejora o atenúa algunas o todas estas enfermedades. Preferiblemente, el modulador de GR que antagoniza un modulador que induce transactivación, no induce también transrepresión.
Todos los moduladores de NHR y ligandos del Sitio II pueden ser útiles para elucidar el mecanismo de regulación de la transcripción mediado por los NHR. Estos moduladores y ligandos podrían usarse en estudios celulares y animales para determinar el requisito de los NHR en la inducción o inhibición de la expresión génica, la asociación de coactivadores y correpresores con los NHR, y la función de chaperonas en la regulación de la actividad de NHR, entre otros experimentos.
Los moduladores de los NHR se pueden encontrar realizando cualquier ensayo de transrepresión, ensayo de transactivación, ensayo de competición de transrepresión o ensayo de competición de transactivación, reconocido en la materia. Dichos ensayos incluyen, pero sin limitar, los ensayos descritos en los Ejemplos 3, 4, 11 y 12.
Para un modulador de un NHR que induce transrepresión, tal como e incluyendo un compuesto disociado, un modulador preferido induce transrepresión con una CI50 entre 0,1 nM y 10 \muM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 1 \muM (tal como entre 33 nM y 275 nM, o entre 15 nM y 275 nM), más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, lo más preferiblemente entre 0,1 nM y 10 nM. La transrepresión se puede medir por cualquier procedimiento reconocido en la materia, tal como ensayos de transrepresión celular descritos en el Ejemplo 3. La CI50 es la concentración de modulador que causa 50% de represión de la transcripción.
Para un modulador de un NHR que induce transactivación mínima, tal como e incluyendo un compuesto disociado, un modulador preferido induce transactivación con una CE50 mayor que 1 nM, preferiblemente mayor que 100 nM, más preferiblemente mayor que 1 \muM, y lo más preferiblemente mayor que 40 \muM. La transactivación se puede medir por cualquier procedimiento reconocido en la materia, tal como ensayos de transcripción celular descritos en el Ejemplo 4. Una CE50 es la concentración de modulador necesaria para causar 50% de estimulación de la transcripción.
Para un compuesto disociado, un compuesto disociado preferido tiene una constante de disociación mayor que 0,1, más preferiblemente mayor que 10, más preferiblemente mayor que 100 (tal como entre 167 y 1000, o entre 137 y 1000), lo más preferiblemente mayor que 1000. La constante de disociación se calcula dividiendo la CE50 para la transactivación entre la CI50 para la transrepresión.
Para un modulador de un NHR que antagoniza un modulador que induce transactivación, un modulador preferido antagoniza con una CI50 entre 0,1 nM y 10 \muM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 1 \muM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, lo más preferiblemente entre 0,1 nM y 10 nM.
Para un modulador de un NHR que induce transactivación, un modulador preferido induce transactivación con una CI50 entre 0,1 nM y 10 \muM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 1 \muM, más preferiblemente entre 0,1 nM y 100 nM, lo más preferiblemente entre 0,1 nM y 10 nM.
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Procedimientos de modulación de un receptor nuclear de hormonas
Los moduladores de la presente invención se pueden usar para modular un NHR. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un procedimiento de modulación de un NHR que comprende administrar un modulador de un NHR en una cantidad suficiente para modular el NHR,
en el que dicho modulador de un NHR es un ligando de un Sitio II o se ha identificado por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR. Una molécula de ensayo se identifica como un modulador de un NHR, si la complementaridad de las características estructurales y químicas y la modulación superan un nivel deseado. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
La invención proporciona un procedimiento de inducción de transrepresión que comprende administrar un modulador de un NHR en una cantidad suficiente para causar transrepresión, en el que dicho modulador de un NHR es un ligando del Sitio II o se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
La invención proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de genes dependiente de AP-1, que comprende administrar un modulador de un NHR en una cantidad suficiente para inhibir la expresión de genes dependiente de AP-1, en el que dicho modulador de un NHR es un ligando del Sitio II o se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
La invención proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, que comprende administrar un modulador de un NHR en una cantidad suficiente para inhibir la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB, en el que dicho modulador de un NHR es un ligando del Sitio II o se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
La invención proporciona un procedimiento para antagonizar la transactivación que comprende administrar un modulador de un NHR en una cantidad suficiente para antagonizar la transactivación, en el que dicho modulador en un NHR es un ligando del Sitio II o se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
Los ligandos preferidos usados en los procedimientos de la presente invención se identificaron por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II. Una molécula de ensayo que se une al Sitio II se identifica como un ligando del Sitio II. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
Los procedimientos se pueden poner en práctica in vitro o in vivo. Cuando se ponen en práctica in vitro, el procedimiento puede usar cualquiera de una serie de sistemas in vitro reconocidos en la materia, incluyendo los ensayos descritos en los Ejemplos 3 y 4. Los procedimientos in vivo incluyen, pero sin limitar, cualquiera de las formas descritas en la siguiente sección en los procedimientos de tratamiento.
Composiciones farmacéuticas
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica comprende: (a) un modulador de un NHR que se ha identificado por un procedimiento que comprende: (i) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; (ii) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y (iii) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y (b) un soporte, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una molécula de ensayo se identifica como un modulador de un NHR, si la complementaridad de las características estructurales y químicas y la modulación superan un nivel deseado. El procedimiento para identificar un modulador del Sitio II puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende un modulador de un NHR que es un ligando del Sitio II y un soporte, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ligandos preferidos del Sitio II se identificaron por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II. Una molécula de ensayo que se une al Sitio II se identifica como un ligando del Sitio II. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
En las presentes composiciones farmacéuticas, un modulador de un NHR puede inducir una o más de las 4 actividades siguientes en el NHR. No se pretende que la lista sea inclusiva. (1) Un modulador de un NHR puede inducir transrepresión. (2) Un modulador de un NHR puede inducir transactivación. (3) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir transrepresión. (4) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir la transactivación.
Preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un modulador de un SHR, más preferiblemente un modulador de GR.
Un modulador de un NHR, SHR o GR que induce transrepresión incluye, pero sin limitar, un compuesto disociado.
Preferiblemente, dicho modulador de un NHR induce transrepresión. Más preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado. Más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de SHR. Lo más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de GR.
La composición farmacéutica puede comprender además al menos un agente terapéutico adicional. Los "agentes terapéuticos adicionales" abarcan, pero sin limitar, un agente o agentes seleccionados del grupo que consiste en un inmunosupresor, un agente anticancerígeno, un agente antivírico, un agente antiinflamatorio, un agente antifúngico, un antibiótico, un compuesto antihiperproliferación vascular, un agente antidiabético, o un agente antidepresivo.
La expresión "excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, adyuvante o vehículo que se puede administrar a un sujeto, junto con un modulador de la presente invención, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo. Los excipientes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitar, los siguientes: intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas autoemulsionantes para el suministro de fármacos ("SEEDS") tales como succinato de d-tocoferol-polietilenglicol 1000, tensioactivos usados en las formas de dosificación farmacéutica, tales como Tweens u otras matrices de suministro polimérico, proteínas del suero tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. También se pueden usar ciclodextrinas tales como \alpha, \beta y \gamma-ciclodextrina o derivados químicamente modificados tales como hidroxialquilciclodextrinas, incluyendo 2 y 3-hidroxipropil-\beta-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados, para potenciar el suministro de los moduladores de la presente invención.
Las composiciones de la presente invención pueden contener otro u otros agentes terapéuticos como se describe más adelante, y se pueden formular, por ejemplo, usando vehículos o diluyentes sólidos o líquidos convencionales, así como aditivos farmacéuticos de un tipo adecuado al modo de administración deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, aromas, etc.) de acuerdo con técnicas tales como las conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica,
Los moduladores se pueden administrar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; vía sublingual, bucal, parenteral tal como por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal o técnicas de infusión (p. ej., como disoluciones o suspensiones acuosas o no acuosos inyectables estériles); por vía nasal tal como por pulverizadores de inhalación; vía tópica, tal como en forma de una crema o pomada; o vía rectal, tal como en forma de supositorios; en formulaciones de unidades de dosificación que contienen vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos. Los presentes moduladores pueden administrarse, por ejemplo, en una forma adecuada para la liberación inmediata o extendida. La liberación inmediata o prolongada se puede lograr usando composiciones farmacéuticas adecuadas, que comprenden los presentes moduladores, o en particular en el caso de la liberación prolongada, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos o bombas osmóticas. Los presentes moduladores también se pueden administrar por liposomas.
Las composiciones de ejemplos para la administración oral incluyen suspensiones que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido algínico o alginato sódico como agente de suspensión, metilcelulosa como potenciador de la viscosidad, y edulcorantes o agentes de sabor como los conocidos en la técnica; y comprimidos de liberación inmediata que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina, fosfato de dicalcio, almidón, estearato magnésico y/o lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, extensores, disgregantes, diluyentes y lubricantes, tales como los conocidos en la técnica. Los presentes moduladores también pueden suministrarse por la cavidad oral por administración sublingual y/o bucal. Los comprimidos moldeados, comprimidos por presión o comprimidos liofilizados, son formas de ejemplo que se pueden usar. Las composiciones de ejemplo incluyen las que formulan el o los presentes moduladores con diluyentes de disolución rápida, tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o ciclodextrinas. También están incluidas en dichas formulaciones excipientes de alto peso molecular tales como celulosas (avicel) o polietilenglicoles (PEG). Dichas formulaciones también pueden incluir un excipiente para ayudar a la adhesión de la mucosa, tales como hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa sódica (SCMS), copolímero de anhídrido maleico (p. ej., Gantrez), y agentes para controlar la liberación tales como copolímero poliacrílico (p. ej., Carbopol 934). También se pueden añadir lubricantes, deslizantes, aromas, agentes colorantes y estabilizantes para facilitar la fabricación y uso.
Las composiciones de ejemplo para la administración nasal por aerosol o inhalación, incluyen disoluciones salinas que pueden contener, por ejemplo, alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad y/o otros agentes solubilizantes o dispersantes tales como los conocidos en la
materia.
Las composiciones de ejemplo para la administración parenteral incluyen disoluciones o suspensiones inyectables que pueden contener, por ejemplo, diluyentes o disolventes adecuados, no tóxicos, aceptables para vía parenteral, tales como manitol, 1,3-butanodiol, agua, disolución de Ringer, una disolución isotónica de cloruro sódico, u otros agentes dispersantes o humectantes o de suspensión adecuados, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos, y ácidos grasos, incluyendo ácido oleico. El término "parenteral" como se usa en el presente documento incluye la inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.
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Las composiciones de ejemplos para la administración rectal incluyen supositorios que pueden contener, por ejemplo, un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao, ésteres de glicéridos sintéticos o polietilenglicoles, que son sólidos a temperatura ambiente, pero licuan y/o se disuelven en la cavidad rectal para liberar el
fármaco.
Las composiciones de ejemplo para la administración tópica incluyen un vehículo tópico tal como Plastibase (aceite mineral gelificado con polietileno).
La cantidad eficaz de un modulador de la presente invención la puede determinar el experto en la materia, e incluye cantidades de dosificación de ejemplo para un ser humano adulto de aproximadamente 0,1 a 500 mg/kg de peso corporal del modulador activo por día, que se puede administrar en una sola dosis o en forma de dosis divididas individuales, tal como de 1 a 5 veces al día. Se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto particular puede variar y dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del modulador específico usado, la estabilidad metabólica y duración de la acción del modulador, la especie, edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el modo y tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, y gravedad de la afección particular. Los sujetos preferidos para el tratamiento incluyen animales, más preferiblemente especies de mamíferos tales como seres humanos y animales domésticos tales como perros, gatos u similares, sometidos a enfermedades asociadas a NHR.
Los moduladores de la presente invención se pueden usar solos o combinados entre sí y/o con otro u otros agentes terapéuticos adecuados útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con NHR, tales como inmunosupresores, agentes anticancerígenos, agentes antivíricos, agentes antiinflamatorios, agentes antifúngicos, antibióticos, compuestos antihiperproliferación vascular, agente antidiabéticos, o agentes antidepresivos. Dichos otros agente o agentes terapéuticos se pueden administrar antes, simultáneamente con o después de la administración de los compuestos de la presente invención.
Los ejemplos de dichos otros agentes terapéuticos incluyen los siguientes: ciclosporinas (p. ej., ciclosporina A), CTLA4-Ig, anticuerpos tales como anti-TNF-\alpha (tales como Remicade), anti-ICAM-3, receptor anti-IL-2 (Anti-Tac), anti-CD45RB, anti-CD2, anti-CD3 (OKT-3), anti-CD4, anti-CD80, anti-CD86, anticuerpo monoclonal OKT3, agentes bloqueadores de la interacción entre CD40 y CD154 (también conocido como "gp39"), tales como anticuerpos específicos para CD40, y/o CD154, proteínas de fusión construidas a partir de CD40 y/o CD154/gp39 (p. ej., CD40Ig y CD8gp39), inhibidores, tales como inhibidores de la translocación nuclear, de la función de NF-\kappaB, tales como desoxiespergualina (DSG), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como ibuprofeno, celecoxib, rofecoxib, inhibidores de la cox-2, y aspirina, antibióticos tales como penicilina y tetraciclina, esteroides tales como prednisona o dexametasona, compuestos de oro, agentes antivíricos tales como abacavir, agentes antiproliferativos tales como micofenolato, 5-fluorouracilo, cisplatino, metotrexato, leflunomida, FK506 (tacrolimus, Prograf), fármacos citotóxicos tales como azatiprina y ciclofosfamida, inhibidores de TNF-\alpha tales como tenidap, anticuerpos anti-TNF (tales como Remicade) o receptor del TNF soluble (tal como Enbrel), y rapamicina (sirolimus o Rapamune) o derivados de los mismos. Los otros agentes terapéuticos anteriores, cuando se usan en combinación con los moduladores de la presente invención, se pueden usar, por ejemplo, en las cantidades indicadas en la Guía de Referencia Médica "Physicians' Desk Reference" (PDR) o las determinadas por el experto en la materia.
Procedimientos de uso
Los moduladores de la presente invención se pueden usar para tratar enfermedades. En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR para tratar una enfermedad asociada con el NHR, en el que dicho modulador de un NHR se ha identificado por un procedimiento que comprende:
a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR. Una molécula de ensayo se identifica como un modulador de NHR si la complementaridad de las características estructurales y/o químicas y la modulación superan un nivel deseado. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio II para tratar una enfermedad asociada con un NHR.
Preferiblemente dicha enfermedad asociada con el NHR es una enfermedad asociada con un SHR y dicho modulador de un NHR es un modulador de un SHR. Lo más preferiblemente, dicha enfermedad asociada con el NHR es una enfermedad asociada con el GR y dicho modulador de un NHR es un modulador de GR.
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En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR para tratar una enfermedad asociada con la transactivación del NHR, en la que dicho modulador de un NHR se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio II, para tratar una enfermedad asociada con la transactivación de NHR.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR para tratar enfermedades asociadas con la transrepresión de NHR, en la que dicho modulador de un NHR se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio, para tratar enfermedades asociadas con la transrepresión de NHR.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR para tratar una enfermedad asociada con la expresión de genes dependiente de AP-1 o la expre-
sión de genes dependiente de NF-\kappaB, en la que dicho modulador se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio II, para tratar una enfermedad asociada con la expresión de genes dependiente de AP-1 o la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio o asociado con el sistema inmunitario, en la que dicho modulador de un NHR se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que es un ligando de un Sitio II, para tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio o asociado con el sistema inmunitario, en el que dicha enfermedad o trastorno inflamatorio o asociado con el sistema inmunitario comprende inhibir la expresión de genes dependiente de AP-1 o la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB administrando dicho modulador de un NHR en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de genes dependiente de AP-1 o la expresión de genes dependiente de NF-\kappaB.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que induce transrepresión, para tratar una enfermedad tratable por inducción de la transrepresión de NHR, en la que dicho modulador de un NHR se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que induce transrepresión, para tratar una enfermedad tratable por inducción de la transrepresión de NHR, en la que dicho modulador de un NHR es un ligando de un Sitio II.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que antagoniza la transactivación para tratar una enfermedad tratable por antagonización de la transactivación de NHR, en la que dicho modulador de un NHR se ha identificado por el procedimiento descrito antes.
En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende al menos un modulador de un NHR que antagoniza la transactivación para tratar una enfermedad tratable por antagonización de la transactivación de NHR, en la que dicho modulador de un NHR es un ligando de un Sitio II.
Los ligandos preferidos del Sitio II para usar en el tratamiento, se identificaron por un procedimiento que comprende: a) acoplar una molécula de ensayo en toda o cualquier parte de la cavidad circunscrita por el Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de restos conservados descritos por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y todo o cualquier parte de dicho Sitio II; y c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión a un Sitio II. Una molécula de ensayo que se une al Sitio II se identifica como un ligando del Sitio II. El procedimiento puede comprender además una o más de las siguientes etapas: d) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo biológico de modulación de un NHR; y e) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I.
Un ligando preferido del Sitio II se ha identificado por selección de una molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio II.
Preferiblemente dicho NHR es un SHR, más preferiblemente un GR. En el contexto de la presente invención, se describe una composición farmacéutica que comprende un modulador de un NHR para inducir una o más de las 4 actividades siguientes en el NHR. No se pretende que esta lista sea inclusiva. (1) Un modulador de un NHR puede inducir transrepresión. (2) Un modulador de un NHR puede inducir transactivación. (3) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir transrepresión. (4) Un modulador de un NHR puede inhibir o antagonizar la capacidad de otro modulador para inducir la transactivación.
Preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un modulador de un SHR, más preferiblemente un modulador de GR.
Un modulador de un NHR, SHR o GR que induce transrepresión incluye, pero sin limitar, un compuesto disociado.
Preferiblemente dicho modulador de un NHR induce transrepresión. Más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado. Más preferiblemente dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de SHR. Lo más preferiblemente, dicho modulador de un NHR es un compuesto disociado de GR.
Preferiblemente, dicho sujeto es un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano.
Se puede usar otro u otros agentes terapéuticos, tal como los descritos antes en la sección de las composiciones farmacéuticas con los moduladores en los presentes procedimientos. Como se describe en el presente documento, dichos otro u otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, simultáneamente o después de la administración de la o las composiciones farmacéuticas, como se describe en el contexto de la presente invención.
Los modos de administración útiles en la presente invención se han descrito antes en la sección de composiciones farmacéuticas.
En una realización particular, los moduladores de la presente invención son útiles para el tratamiento de los trastornos de ejemplo antes mencionados, independientemente de su etiología, por ejemplo, para el tratamiento de rechazo de trasplante, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino e infecciones víricas.
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Procedimientos de diseño de mutantes
Los autores de la invención han identificado el Sitio II en los NHR como un sitio de unión cuyos ligandos modulan los NHR. Ahora que se sabe que el Sitio II es una región de interés, se pueden hacer mutantes de los NHR y mutantes de partes de los NHR, en los que el Sitio II está mutado.
Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento de diseño de un mutante que comprende hacer una o más mutaciones de aminoácidos en el Sitio II. El mutante así diseñado puede ser un NHR o una parte de un NHR, tal como el LBD.
Preferiblemente la o las mutaciones son una deleción o sustitución de uno o más de los aminoácidos de dicho Sitio II. Cuando la o las mutaciones son una inserción de aminoácido, preferiblemente el o los aminoácidos insertados se insertan a continuación de un aminoácido de dicho Sitio II.
Preferiblemente, una mutación implica uno o más de los siguientes aminoácidos en el GR humano: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667, o uno o más de los correspondientes aminoácidos en otro NHR o GR no humano como puede verse en las figuras 2 y 6, respectivamente. Preferiblemente, una mutación implica uno o más de los siguientes aminoácidos en el GR humano: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Y663, L664 y K667, o uno o más de los correspondientes aminoácidos en otro NHR o GR no humano, como puede verse en las figuras 2 y 6, respectivamente. Preferiblemente, la deleción o sustitución es de uno o más de los aminoácidos mencionados antes o aminoácidos correspondientes, y preferiblemente la inserción es a continuación de uno o más de los aminoácidos mencionados antes o aminoácidos correspondientes.
El procedimiento puede comprender además, usar todo o parte de un modelo de un Sitio II para visualizar todo o parte del Sitio II en su forma mutada o nativa. Preferiblemente, dicho modelo es un modelo tridimensional.
La mutación incluye una o más deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones o sustituciones de aminoácidos, comparado con la proteína nativa. El experto en la materia conoce diferentes procedimientos para hacer mutaciones. Un mutante puede tener una actividad igual similar o alterada, comparado con la proteína nativa. La actividad se refiere a la transrepresión, transactivación y unión a ligando. Los mutantes preferidos tienen una identidad de secuencia de al menos 25%, más preferiblemente una identidad de secuencia de 50%, más preferiblemente una identidad de secuencia de 75%, y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de 95% con la proteína nativa.
Un mutante diseñado por el procedimiento de la invención que tiene la misma o similar actividad biológica que el NHR nativo o una parte nativa del NHR, puede ser útil para cualquier propósito para el que sea útil el nativo. Un mutante diseñado por el procedimiento de la invención que tiene la actividad biológica alterada respecto al nativo, puede ser útil en ensayo de unión para ensayar la capacidad de un ligando potencial para unirse o asociarse con el Sitio II. Un mutante diseñado por el procedimiento de la invención que tiene la actividad biológica alterada respecto al nativo, puede ser útil en la elucidación posterior de la función biológica del Sitio II.
El Ejemplo 16 ilustra el diseño de mutantes que comprende hacer una o más mutaciones de aminoácidos en el
Sitio II.
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Mutantes del Sitio II
En el contexto de la presente invención, se describe un mutante de NHR o una parte mutante de un NHR, que comprende una o más mutaciones de aminoácidos en el Sitio II.
Dicha parte mutante de un NHR preferiblemente comprende un LBD mutante del NHR, más preferiblemente consiste en un LBD mutante del NHR.
Preferiblemente la o las mutaciones son una deleción o sustitución de uno o más aminoácidos del Sitio II. Cuando la o las mutaciones son la inserción de un aminoácido, preferiblemente el o los aminoácidos insertados se insertan a continuación de un aminoácido del Sitio II.
Preferiblemente, una mutación implica uno o más de los siguientes aminoácidos en un GR humano: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667, o uno o más de los correspondientes aminoácidos en otro NHR o GR no humano como puede verse en las figuras 2 y 6, respectivamente. Preferiblemente, una mutación implica uno o más de los siguientes aminoácidos en el GR humano: E537-V543, V571-W577, S599-W600, F602-L603, F606-A607, W610, R614, Y663, L664 y K667, o uno o más de los correspondientes aminoácidos en otro NHR o GR no humano, como puede verse en las figuras 2 y 6, respectivamente. Preferiblemente, la deleción o sustitución es de uno o más de los aminoácidos mencionados antes o aminoácidos correspondientes, y preferiblemente la inserción es a continuación de uno o más de los aminoácidos mencionados antes o aminoácidos correspondientes.
La mutación incluye una o más deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones o sustituciones de aminoácidos, comparado con la proteína nativa. El experto en la materia conoce diferentes procedimientos para hacer mutaciones. Un mutante puede tener una actividad igual, similar o alterada, comparado con la proteína nativa. La actividad se refiere a la transrepresión, transactivación y unión a ligando. Los mutantes preferidos tienen una identidad de secuencia de al menos 25%, más preferiblemente una identidad de secuencia de 50%, más preferiblemente una identidad de secuencia de 75%, y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de 95% con la proteína nativa.
Un mutante de la invención que tiene la misma o similar actividad biológica que el NHR nativo o una parte nativa del NHR, puede ser útil para cualquier propósito para el que sea útil el nativo. Un mutante de la presente invención que tiene la actividad biológica alterada respecto al nativo, puede ser útil en ensayo de unión para ensayar la capacidad de un ligando potencial para unirse o asociarse con el Sitio II. Un mutante de la presente invención que tiene la actividad biológica alterada respecto al nativo, puede ser útil en la elucidación posterior de la función biológica del Sitio II.
En mutantes preferidos, la mutación consiste en 5 o menos sustituciones, más preferiblemente 4 o menos sustituciones, más preferiblemente 3 o menos sustituciones, más preferiblemente 2 o menos sustituciones, lo más preferiblemente 1 sustitución. Una sustitución es preferiblemente una sustitución de aminoácido conservativa.
En mutantes preferidos, la mutación consiste en 3 o menos deleciones, más preferiblemente 2 o menos deleciones, lo más preferiblemente 1 deleción.
En mutantes preferidos, la mutación consiste en 2 o menos sustituciones y 2 o menos deleciones.
El ejemplo 16 ilustra mutantes que comprenden hacer una o más mutaciones de aminoácidos en el Sitio II.
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Ensayo de unión al Sitio II
El contexto de la presente invención se refiere a un procedimiento para medir la unión de una molécula de ensayo al Sitio II, que comprende: (a) incubar un NHR con un ligando del Sitio II y dicha molécula de ensayo; y (b) medir la capacidad de dicha molécula de ensayo para competir por la unión a dicho Sitio II con dicho ligando; en el que dicha capacidad para competir se la medida de la unión de dicha molécula de ensayo al sitio II. El procedimiento puede comprender además la capacidad de dicha molécula de ensayo para modular un NHR nativo y modular un NHR mutado en el Sitio II.
El ligando del Sitio II se puede identificar por cualquier procedimiento reconocido en la materia, tales como los descritos en los Ejemplos 15 y 16.
El NHR puede estar en forma purificada, en una forma parcialmente purificada o en un lisado celular.
Con el fin de medir la capacidad de dicha molécula de ensayo para competir por la unión al Sitio II con dicho ligando, el ligando se puede marcar, tal como por radiomarcaje o marcador fluorescente. La unión se puede medir usando cualquier técnica reconocida en la materia, tal como la atenuación de la fluorescencia, polarización de fluorescencia, unión a filtro, ensayo de centelleo de proximidad, entre otros. La capacidad para competir se determina comparando el valor medido con el compuesto marcado solo, con el valor medido en presencia de la molécula de ensayo no marcada. Una disminución de la señal medida indica la unión de la molécula de ensayo.
La capacidad de dicha molécula de ensayo para modular un NHR nativo y para modular un NHR mutado en el Sitio II se puede determinar midiendo la transrepresión y transactivación usando procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos 3 y 4.
Se describe uno de dichos ensayos de unión al Sitio II en el Ejemplo 18. El Ejemplo 18 proporciona un procedimiento de medición de la unión a una molécula de ensayo al Sitio II por: incubación de dicha molécula de ensayo con un NHR, un ligando del Sitio I (tal como FITC-dexametasona), y un ligando del Sitio II conocido que inhibe la unión del ligando del Sitio I al Sitio I. Una molécula de ensayo que no inhiba la unión del ligando del Sitio I al Sitio I y se una al Sitio II desplazará al ligando del Sitio II conocido, dejando así que el ligando del Sitio I se una al Sitio I. La unión del ligando del Sitio I al Sitio I puede medirse. La comparación de la unión del ligando del Sitio I al Sitio I en presencia del ligando del Sitio II, con y sin molécula de ensayo proporciona una medida de la unión relativa de la molécula de ensayo al Sitio II. Con el fin de medir la capacidad de dicho ligando del Sitio I a unirse al Sitio I, el ligando del Sitio I se puede marcar, tal como por radiomarcaje o marcador fluorescente. La unión se puede medir usando cualquier técnica reconocida en la materia, tal como atenuación de la fluorescencia, polarización de fluorescencia, unión a filtro, ensayo de centelleo de proximidad, entre otros.
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Modelos del Sitio II
Los autores de la invención han identificado el Sitio II en los NHR como un sitio de unión cuyos ligandos modulan los NHR. Se han centrado en el Sitio II como una región de interés en los NHR. Ahora que se sabe que el Sitio II es una región de interés, se pueden hacer modelos del Sitio II, tales como modelos tridimensionales, útiles en el diseño de fármacos.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, se describe un modelo que comprende todo o cualquier parte de un Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I.
En una realización preferida, el modelo consiste en todo o cualquier parte del Sitio II.
En otra realización preferida, el modelo: (a) comprende todo o cualquier parte de un Sitio II, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I; y (b) no comprende las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de uno o más de los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I. Preferiblemente, dichos datos no comprenden las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de todos los aminoácidos M560, L563, N564, L608, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748 de acuerdo con la Tabla I. Preferiblemente, la desviación típica de la parte (b) es menor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente menor que 1,0 \ring{A}, todavía más preferiblemente menor que 0,9, 0,8, 0,7, 0,6 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ó 0,1 \ring{A}, lo más preferiblemente 0,0 \ring{A}.
Un modelo de un Sitio II de la presente invención, puede ser cualquier tipo de modelo reconocido en la materia, incluyendo, pero sin limitar: modelos tridimensionales; y modelos de definición de campos estéricos/electrostáticos, que se pueden usar para estudiar/computar las interacciones putativas que pueden experimentar los ligandos. Un modelo tridimensional se puede producir mediante el uso de coordenadas de estructura, tales como diagramas de cintas.
Un modelo tridimensional de un Sitio II de la presente invención, es útil para diseñar e identificar ligandos y moduladores de los NHR.
Debe entenderse que un experto en la materia podrá hacer diferentes modificaciones en las composiciones y procedimientos descritos antes, aplicando el nivel habitual del experto en la materia, sin salirse del espíritu o alcance de la invención. Se pretende que todas dichas modificaciones estén incluidas dentro de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar el objeto de la invención y no se pretende que limiten la invención.
Ejemplo 1 Síntesis de compuesto
Los 51 compuestos usados en los siguientes ejemplos se sintetizaron como sigue. Estos compuestos y sus síntesis se describen en la solicitud provisional en tramitación junto con la presente titulada "Modulators of the Glucocorticoid Receptor and Method," número de expediente del apoderado QA266PSP, solicitud de EE.UU. nº 60/396.877, presentado el 18 de julio, 2002, y en la solicitud de utilidad en tramitación junto con la presente titulada "Modulators of the Glucocorticoid Receptor and Method," número de expediente del apoderado QA266NP, solicitud de EE.UU. nº, presentada simultáneamente con la presente. El contenido de la solicitud de EE.UU. nº 60/396.877 y QA266NP se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
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Preparaciones
Las preparaciones expuestas a continuación son para la síntesis de reactivos que no se obtuvieron de fuentes comerciales y se usaron para la preparación de los compuestos. Todas las estructuras químicas en las tablas y esquemas son racémicos salvo que se especifique lo contrario.
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Preparación 1
4-[1-(4-Fluoro)naftil]aminotiazol 1a
1 
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Etapa 1
A una disolución de 4'-fluoro-1'-acetonaftona (28,69 mmol, 5,4 g) en 1,4-dioxano (18,0 ml) a 0ºC se añadió bromo (35,13 mmol, 5,61 g). Después de 3 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a vacío para dar 7,66 g (R: 100%) del producto de la etapa 1.
Etapa 2
A una disolución del producto de la etapa 1 (28,69 mmol, 7,66 g) en alcohol etílico (20 ml) a temperatura ambiente se añadió tiourea (36,13 mmol, 2,75 g). Después de 1 h a temperatura ambiente se formó un precipitado. A la mezcla de reacción se añadió agua (100 ml) y el sólido se recogió por filtración a vacío. Después el sólido se lavó con agua (3 x 100 ml) y diclorometano (3 x 100 ml). Después el sólido se secó a vacío para dar 5,5 g (R: 75%) del compuesto del título 1a. EM (E^{+}) m/z 245 (MH^{+}).
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De una forma similar se prepararon los siguientes compuestos a partir de la correspondiente cetona.
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2 
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Preparación 2
4-[1 -(4-Fluoro)naftil]aminoimidazol 2a 
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3 
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Etapa 1
A una disolución del producto de la preparación 1a, etapa 1 (18,73 mmol, 5,0 g) en DMF (15 ml) a temperatura ambiente, se añadió 1-acetilguanidina (57,43 mmol, 5,80 g). Después de 5 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 ml). Las fases orgánicas se concentraron a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice (eluido con metanol en diclorometano al 5%) para dar 2,0 g (R: 39%) del producto de la etapa 1. EM (E+) m/z: 270 (MH^{+}).
Etapa 2
A una disolución del producto de la etapa 1 (7,43 mmol, 2,0 g) en metanol (17 ml) se añadió agua (8,5 ml) y HCl 12 N (12,0 ml). Después de 1 h a reflujo, la mezcla de reacción se concentró a vacío hasta aproximadamente 15 ml. La disolución resultante después se purificó y se neutralizó por SPE de intercambio catiónico para dar 1,66 g (R: 99%) del compuesto del título 2a. EM (E+) m/z: 228 (MH^{+}).
De una forma similar, se prepararon los siguientes compuestos a partir de las correspondientes cetonas.
4 
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Preparación 3
4-(1-Naftil)aminooxazol 3a
5 
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Etapa 1
A una disolución de 1-acetonaftona (29,38 mmol, 5,0 g) en ácido acético glacial (10,0 ml) a t.a. se añadió bromo (30,06 mmol, 4,80 g) en ácido acético glacial (5,0 ml). Después de 5 minutos, la mezcla de reacción se vertió sobre hielo triturado y se extrajo con diclorometano para dar 7,31 g (R: 100%) del producto de la etapa 1. EM (E+) m/z: 250 (MH^{+}).
Etapa 2
A una disolución del producto de la etapa 1 (5,50 mmol, 1,37 g) en alcohol etílico (10 ml) se añadió urea (27,50 mmol, 1,65 g). Después de 2 horas a reflujo, la mezcla de reacción se concentró a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice (eluida con acetato de etilo al 30% en hexano) para dar 100 mg (R: 9%) del compuesto del título 3a. MS (E+) m/z. 211 (MH^{+}).
Preparación 6
4-[1 -(6-Metoxi)naftil]-3-aminotiazol 6a 
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6 
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Etapa 1
A una disolución de ácido 6-metoxi-1-naftoico (0,5 g, 2,47 mmol, 1,0 equiv.) en diclorometano (10 ml) a temperatura ambiente, se añadió una disolución de cloruro de oxalilo (2 M en diclorometano, 2,5 ml, 5,0 mmol, 2 equiv.). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y el exceso de cloruro de oxalilo se separó a vacío. El residuo se disolvió en metanol y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se separó a vacío, dando 0,45 g (84%) del producto de la etapa 1: CL/EM (m/z 217, (M-H)^{+}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,82 (d, 1H), 8,03 (dd, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,44 (t, 1H), 7,26 (dd, 1H), 7,16 (s, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,95 (s, 3H).
Etapa 2
Referencia: P. Chen, P.T. Cheng, S.H. Spergel, R. Zahler, X. Wang, J. Thottathil, J.C. Barrish, R.P. Polniaszek, Tetrahedron Letters, 38, 3175 (1997).
A una disolución del producto de la etapa 1 (0,238 g, 1,1 mmol, 1,0 equiv.) y cloroyodometano (0,32 ml, 4,4 mmol, 4 equiv.) en THF (5 ml) se añadió una disolución de LDA (2 M, 2,2 ml, 4,0 equiv.) en THF (10 ml) gota a gota en 30 minutos, manteniendo la temperatura de la disolución a -78ºC. La disolución de la reacción se agitó a -78ºC durante 10 minutos. Se añadió gota a gota una disolución de ácido acético (1,5 ml) en THF (10 ml) en 10 minutos. Después de agitar durante 10 minutos adicionales a -78ºC, la disolución se inactivó con acetato de etilo y disolución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se lavó con disolución saturada de bisulfito sódico, disolución saturada de cloruro sódico, se secó con sulfato sódico y se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en hexano al 10%) para dar 0,23 g (90%) del producto de la etapa 2: CL/EM (m/z 235, (M+H)^{+}); RMN ^{1}H (CDCl_{3})) \delta 8,82 (d, 1H), 8,03 (dd, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,44 (t, 1H), 7,26 (dd, 1H), 7,16 (s, 1H), 4,80 (s, 2H), 3,95 (s, 3H).
Etapa 3
A una disolución del producto de la etapa 2 (0,23 g, 1,0 mmol, 1,0 equiv.) en etanol (5 ml) a temperatura ambiente se añadió tiourea (90 mg, 1,2 mmol, 1,2 equiv.). La disolución de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se formó un precipitado amarillo. La reacción se inactivó por adición de agua y acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron a vacío para dar 200 mg (78%) del compuesto del título 6a: CL/EM (m/z 235, (M+H)^{+}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,1 (d, 1H), 7,9 (m, 1H), 7,43 (m, 2H), 7,25 (m, 1H), 7,10 (dd, 1H), 6,65 (s, 1H), 3,95 (s, 3H).
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Preparación 7
4-[1-(6-Metoxi)naftil]-3-aminoimidazol 7a
7
Etapa 1
A una disolución del producto de la preparación 6, etapa 2 (0,5 g, 2,14 mmol, 1,0 equiv.), en etanol (5 ml) a temperatura ambiente, se añadió 1-acetilguanidina (650 mg, 6,42 mmol, 3,0 equiv.). La disolución de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se inactivó por adición de agua y acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3X). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico y se concentraron a vacío para dar 0,2 g (35%) del producto de la etapa 1: CL/EM (m/z 282, (M+H)^{+}).
Etapa 2
A una disolución del producto de la etapa 1 (0,2 g, 0,7 mmol, 1,0 equiv.) en metanol (5 ml) se añadió agua (1,0 ml) y ácido clorhídrico (12 N, 1,0 ml). La disolución de la reacción se calentó a reflujo durante 1 h, después de lo cual se separó el disolvente a vacío. La mezcla bruta se purificó por SPE de intercambio catiónico para dar 0,12 g (70%) del compuesto del título 7a: CL/EM (m/z 240, (M+H)^{+}).
Preparación 14
8
Etapa 1
Ref: B. Bacle y G. Levesque, Polymer Communications, 28, 36 (1987).
Se cargó un matraz de 1 litro con antraceno (14 g, 0,078 mol, 1,0 equiv.), hidroquinona (0,8 g, 0,008 mol, 0,1 equiv.), ácido metacrílico (14 ml, 0,156 mol, 2,0 equiv.) y xileno (500 ml). La disolución se calentó a reflujo durante 1 día. La disolución se enfrió y se concentró a vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se extrajo con NaOH 1 N (3x). La fase acuosa se acidificó con HCl 1 N, y el producto se extrajo con acetato de etilo (3x). Las fases orgánicas combinadas se concentraron a vacío para dar la mezcla del producto bruto. La recristalización con hexano y acetato de etilo dio 8 g (40%) de la etapa 1, producto 14: CL/EM (m/z 263 (M-H)^{+}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 7,08-7,25 (m, 8H), 4,37 (s, 1H), 4,25(t, 1H), 2,61 (dd, 1H), 1,39 (dd, 1H), 1,07 (s, 3H).
Etapa 2
El producto 14 de la etapa 1 se resolvió en sus correspondientes enantiómeros, 14(R) y 14(S) por HPLC preparativa quiral con las siguientes condiciones, Columna: Chiracel®-OJ, 5 X 50 cm, Fase móvil: ácido trifluoroacético/acetonitrilo: 1/1000 (vol/vol), Temperatura: ambiente, Caudal: 70 ml/min, Inyección: 1,5 gramos en 50 ml de disolvente, Detección: UV (250 nm), Tiempos de retención para el enantiómero R, 30 min, enantiómero S, 52 min, Condiciones de HPLC analítica, Columna: Chiracel®-OJ, 4,6 X 250 cm, Fase móvil: ácido trifluoroacético/acetonitrilo: 1/1000 (vol/vol), Temperatura: ambiente, Caudal: 1,5 ml/min, Detección: UV (250 nm), Tiempos de retención: enantiómero R, 6,5 min, enantiómero S, 15 min.
De una forma similar, se prepararon los siguientes compuestos a partir del correspondiente 9-nitroantraceno y 9-antracenocarbonitrilo (Referencia: P.V. Alston, R.M. Ottenbrite, J. Newby, J. Org. Chem. J. Org. Chem. 44, 4939 (1979)) y se resolvieron en los enantiómeros de acuerdo con el procedimiento de la Etapa 2.
9 
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Ejemplos
Ejemplo 1 (compuesto 1)
10
A una disolución del producto de la Preparación 14, etapa 1 (20 mg, 0,075 mmol, 1,0 equiv.) en acetonitrilo (2 ml) se añadió hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etilcarbodiimida (DEC) (17 mg, 0,09 mmol, 1,2 equiv.), 1-hidroxi-7-azabenzotriazolo (HOAt) (12 mg, 0,09 mmol, 1,2 equiv.), trietilamina (0,025 ml, 0,18 mmol, 2,5 equiv.), y sal de hidrocloruro de 2-amino-4,5-dimetiltiazol (14,8 mg, 0,09 mmol, 1,2 equiv.). La disolución de la reacción se calentó a 80ºC durante 18 horas. Después la reacción se concentró a vacío. La mezcla de producto se purificó por cromatografía ultrarrápida (acetato de etilo en hexano al 20%) para dar 19,8 mg (70%) del Ejemplo 1. CL/EM (m/z 375, (M+H)^{+}).
De una forma similar, se prepararon los Ejemplos 2-51 por acoplamiento de los ácidos adecuados (14, 14R, 14S, 14a, 14aR, 14aS, 14b, 14bR, 14bS) preparados como se describe en la Preparación 14 y las aminas adecuadas. Las preparaciones de las aminas no disponibles en el comercio se describen en la sección de preparaciones precedente de este documento. Todos los ejemplos en las tablas son racémicos salvo que se especifique lo contrario. En los ejemplos en la tabla en los que predomina un enantiómero o es el único componente, se designan R o S.
11
(Continuación)
13 
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(Continuación)
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Ejemplo 2 Ensayo de unión al Sitio I
Con el fin de medir la unión de los compuestos al Sitio I en el receptor de glucocorticoides, se usó un kit disponible en el comercio (kit de ensayo de competición del receptor de glucocorticoides, Panvera Co., Madison, WI). Brevemente, se mezcló un lisato celular que contenía el receptor de glucocorticoides humano de longitud entera expresado de forma recombinante con un glucocorticoide con marcador fluorescente (FITC-dexametasona 4 nM) más o menos molécula de ensayo. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se midió la polarización de fluorescencia (FP) de las muestras. La FP de una mezcla del receptor, sonda de fluorescencia (es decir, FITC-dexametasona) y dexametasona 1 mM representaba la fluorescencia base o 100% de inhibición, mientras que la FP de la mezcla sin dexametasona se consideró que era 100% de unión. Después se comparó el porcentaje de inhibición de las moléculas de ensayo con la muestra con dexametasona 1 mM y se expresó como el % de actividad de unión relativa, siendo 100% la dexametasona y no inhibición 0%. Las moléculas de ensayo se analizaron en el intervalo de concentración de 0,1 nM a
40 \muM.
Los ensayos de unión al sitio I para cualquier NHR se realizaron de forma similar a la anterior. Se usa un lisato celular adecuado o NHR purificado como fuente del NHR. La sonda fluorescente y el competidor no marcado son adecuados para el NHR específico, es decir, son ligados para el NHR específico.
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Ejemplo 3 Ensayo de transrepresión celular
Para medir la capacidad de las moléculas de ensayo para inhibir la actividad de transcripción inducida por AP-1, los autores de la invención usaron una célula A549 que se había transfectado establemente con un plásmido que contenía 7 x sitios de unión al ADN de AP-1 (plásmido pAP-1-Luc, Stratagene Co., La Jolla, Ca), seguido del gen para la luceiferasa. Las células se activaron con 10 ng/ml de ácido forbol-mirístico (PMA) más o menos moléculas de ensayo durante 7 horas. Después de 7 horas, se añadió un reactivo de luciferasa para medir la actividad enzimática de la luciferasa en la célula. Después de 10 minutos de incubación del reactivo de la luciferasa con células, se midió la luminisencia en un contador de luminiscencia TopCount. La represión de la actividad de AP-1 se calculó como la disminución en porcentaje de la señal inducida por el PMA solo. Las moléculas de ensayo se analizaron en el intervalo de concentración de 0,1 nM a 40 \muM. Las CI50 se determinaron usando procedimientos de ajuste de curva patrón tales como el ajuste de Excel (Microsoft Co.). Una CI50 es la concentración de molécula de ensayo que produce un 50% de represión de la transcripción, es decir un 50% de reducción de la actividad de AP-1.
También se pueden usar otros indicadores y líneas celulares en un ensayo de transrepresión celular. Se realiza un ensayo similar en el que se mide la actividad de NF-\kappaB. Se usa un plásmido que contiene sitios de unión al ADN de NF-\kappaB, tal como pNF-\kappaB-Luc (Stratagene, LaJolla CA), y PMA u otro estímulo tal como TNF-\alpha o lipopolisacárido, para activar la ruta de NF-\kappaB. Se pueden usar ensayos de NF-\kappaB similares a los descritos por Yamamoto K., y col., J. Biol. Chem. 29 Dic 1995; 270(52): 31315-20.
Los ensayos de transrepresión celular descritos antes se pueden usar para medir la transrepresión por cualquier NHR. Un experto en la materia entenderá que los ensayos pueden requerir la adición de componentes, tales como un estímulo (p. ej., PMA, lipopilisacárido, TNF-\alpha, etc.) que inducirá la transcripción mediada por AP-1 o NF-\kappaB. Además, la transrepresión mediada por AR se puede medir por el ensayo descrito por Palvimo JJ, y col. J. Biol. Chem. 27 Sep 1996; 271(39): 24151-6, y la transrepresión mediada por PR se puede medir por el ensayo descrito por E., y col. J. Biol. Chem. 15 Mar 1996; 271(11):6217-24
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Ejemplo 4 Ensayo de transcripción celular
Con el fin de medir la capacidad de los compuestos para inducir la unión del ADN y la activación de la transcripción en células, se llevó a cabo el siguiente ensayo. Se transfectó establemente una línea celular HeLa con un gen que expresaba una proteína de fusión que consistía en el dominio del unión al ADN de GAL4 unido al dominio de unión al ligando de GR. También se transfectó a estas células un sitio de unión al ADN para GAL4 (5 repeticiones de un sitio de unión de GAL4 de 17 bases) unido al indicador globina beta en frente del gen luciferasa. Véase, Eisenmann, G., Cheynel, y Gronemeyer, H. (1995), Quand les cellules scintillent, Biofutur (Le Technoscope), 151:8. Las células se incubaron durante 20 horas con dexametasona o con molécula de ensayo. Después de 20 horas se midió el nivel de actividad de la luciferasa usando un sistema de ensayo de luciferasa Steady Glo (Promega Co., Madison, WI). La inducción de la actividad de luciferasa con dexametasona 100 nM se consideró 100% de activación. La actividad de las moléculas de ensayo se midió como un porcentaje de la unión del ADN inducida por dexametasona (transactivación). Las CE50 se calcularon usando procedimientos de ajuste de curva patrón tal como el ajuste de Excel (Microsoft Co., Redmond, WA). Una CE50 es la concentración de molécula necesaria para producir un 50% de estimulación de la transcripción.
También se usó un segundo ensayo que medía la capacidad de los compuestos para inducir la expresión del ARNm de la tirosina aminotransferasa en células del hígado, para determinar la capacidad de los compuestos para inducir la unión del ADN. En estos experimentos, se trató una línea celular HTC con dexametasona o moléculas de ensayo durante 20 horas, seguido de extracción del ARNm y análisis por RT-PCR. Otra vez, se consideró que la inducción de la dexametasona (100 nM) era 100%. Las moléculas de ensayo se analizaron en el intervalo de concentración de 0,1 nM a 40 \muM.
La transcripción celular transactivada por cualquier NHR se puede medir usando un ensayo similar al descrito antes para GR. Es decir, el NHR (de longitud entera o el dominio de unión al ligando) de interés se sobreexpresa en una línea celular adecuada tal como COS. Un plásmido que contiene el elemento de unión al ADN específico para el NHR unido a un promotor y unido secuencia arriba de un gen indicador (p. ej., luciferasa), se cotransfecta con el NHR. También se podría usar un dominio de unión al ligando de NHR quimérico unido a GAL4, u otro factor de transcripción, para medir la transactivación mediada por la unión del ligando al NHR. En este caso, el elemento de unión al ADN sería específico para la pareja de fusión del NHR. Se usa una hormona nuclear adecuada para la comparación con la molécula de ensayo. La línea celular se trata con la molécula de ensayo y se mide la actividad del gen indicador.
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Ejemplo 5 Actividad de unión a GR, actividad inhibidora de AP-1 y actividad de transactivación de mezclas racémicas
Cada una de las 27 mezclas racémicas descritas en el Ejemplo 1 se ensayó en el ensayo de unión al Sitio I de GR, el ensayo de transrepresión celular, y el ensayo de transcripción celular. Los resultados se dan a continuación en la Tabla II, en el Ejemplo 10. La unión al Sitio I de GR de los compuestos estaba en el intervalo de 20,0-99,1% de inhibición con concentración 10 \muM. La inhibición de AP-1 en el ensayo de transrepresión celular estaba en el intervalo de 0,8-82,9% con concentración 10 \muM. Se determinaron para algunos compuestos las CE50 para la unión del ADN en la transcripción celular, y eran mayores que 40 \muM para todos salvo uno.
La CE50 para la inducción por la dexametasona del ARNm de la tirosina aminotransferasa en la línea celular HTC es aproximadamente 50 nM. Se analizaron dos mezclas racémicas del Ejemplo 1, en el ensayo del ARN de la tirosina aminotransferasa y tenían CE50 mayor que 40 \muM.
Ejemplo 6 Separación enantiomérica de 12 racematos
Se separaron 12 compuestos que se habían sintetizado originalmente como mezclas racémicas, en parejas de enantiómeros y se determinó la identidad enantiómera de cada miembro de la pareja usando técnicas estándar conocidas en la materia. Estos 24 enantiómeros están entre los compuestos del Ejemplo 1.
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Ejemplo 7 Actividad de unión a GR, actividad inhibidora de AP-1 y actividad de transactivación de 24 enantiómeros
Se ensayo cada uno de los 24 enantiómeros en el ensayo de transcripción celular. Todos salvo uno de los 24 enantiómeros se ensayaron en el ensayo de transrepresión celular. La mayoría de los 24 enantiómeros se ensayaron en el ensayo de unión al sitio I de GR. Se ensayaron dos enantiómeros (una pareja) en el ensayo de ARNm de la tirosina aminotransferasa.
Las CE50 para la unión del ADN en el ensayo de transcripción celular eran mayores de 40 \muM para todos salvo 3 de los 12 enantiómeros S, y para todos salvo 2 de los 12 enantiómeros R. Para 10 de los enantiómeros S, las CE50 para la unión del ADN en el ensayo de transcripción celular eran mayores que 40 \muM para todos salvo uno. Para 10 de los enantiómeros R, las CE50 para la unión del ADN en el ensayo de transcripción celular eran mayores que 40 \muM para todos. Las CI50 para la inhibición de AP-1 en el ensayo de transrepresión celular estaban en el intervalo de 15 nM a 11 \muM para los 12 enantiómeros S, siendo el intervalo para 11 de los enantiómeros S de 15 nM a 275 nM. Las CI50 para la inhibición de AP-1 en el ensayo de transrepresión celular estaban en el intervalo de 33 nM a 11 \muM para 10 de los enantiómeros S, siendo el intervalo para 9 de esos enantiómeros S de 33 nM a 275 nM. Las CI50 para la inhibición de AP-1 en el ensayo de transrepresión celular estaban en el intervalo de 222 nM a 40 \muM para 12 de los enantiómeros R, siendo el intervalo para 10 de esos enantiómeros R de 650 nM a 40 \muM. La inhibición de la unión al Sitio I de GR con 10 \muM estaba en el intervalo de 6,1% a 41% para los enantiómeros S y de 51,8 a 99% para los enantiómeros R, siendo el intervalo de 51,8% a 97,9% para 10 de los enantiómeros R. Ambos enantiómeros de la pareja ensayada tenían CE50 mayores que 40 \muM en el ensayo de ARNm de la tirosina aminotransferasa.
Estos datos muestran claramente que los enantiómeros S eran inhibidores más potentes de la actividad de AP-1 con respecto a los enantiómeros R. En contraste, los enantiómeros R eran inhibidores más potentes de la unión de la dexametasona a GR comparado con los enantiómeros S.
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Ejemplo 8 Disociación de 24 compuestos enantiómeros
Se calculó la disociación de los 24 enantiómeros dividiendo la CE50 del ensayo de transcripción celular entre la CI50 del ensayo de transrepresión celular. La constante de disociación para los enantiómeros R estaba en el intervalo de 62,5 a 1,0. El valor de la disociación para los enantiómeros S estaba en el intervalo de 1000 a 0,91, estando el valor de la disociación para 11 de los enantiómeros S en el intervalo de 1000 a 137, y el valor de la disociación para algunos de los enantiómeros S en el intervalo de 1000 a 167.
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Ejemplo 9 Modelo por homología de GR
El modelo por homología de GR del dominio de unión al ligando (LBD) se construyó usando metodología conocida. Específicamente, la secuencia humana (QRHUGA obtenida de la base de datos internacional de secuencias de proteínas, pir.georgetown. edu/pirwww), restos 523-777 (SEQ ID NO: 1), que comprende el LBD, se alineó con la secuencia de PR humana (LBD restos 682-932) (SEQ ID NO: 2) disponible como estructura de rayos X (1A28.pdb obtenida de RCSB, the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, www.rcsb.org/pdb) usando el módulo de modelado de InsightII (Versión 2000, MSI/Accelrys).
21 
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Las coordenadas del modelo por homología del LBD de GR resultante se proporcionan en la Tabla 1, que por conveniencia se encuentra al final de esta memoria descriptiva bajo el encabezamiento del Ejemplo 21.
Ejemplo 10 Identificación del Sitio II
El sitio de unión al ligando clásico, es decir, el Sitio I, se define por el espacio inmediato que rodea a la progesterona en 1A28.pdb, se puede definir además por los restos de aminoácidos en contacto con la progesterona, y es bien conocido en la materia. Los restos del Sito I de GR análogos se identificaron como los próximos a una versión modelada de la dexametasona en el modelo por homología de GR. Los restos del sitio I de GR en contacto con la dexametasona (como se encuentra en el modelo por homología de GR) son M560, L563, N564, L566, G567, Q570, M601, M604, A605, L608, R611, F623, M639, Q642, M646, L732, Y735, C736, T739 y E748. La presente invención se basa en el descubrimiento de un sitio de unión alternativo, conocido en el presente documento como Sitio II, presente en una serie de NHR (receptores nucleares de hormonas), en particular en GR, que interacciona con moduladores moléculas pequeñas. En el caso de GR, una unión de ligando al Sitio II da como resultado una señalización de transrepresión dentro de las células (inhibición de AP-1 o NF-\kappaB). En el presente documento se define la posición del Sitio II, para una serie de NHR relacionados y específicamente para el GR en la Figura 2. Los restos del Sitio II de GR incluyen los siguientes (usando la numeración de GR): E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667.
La identificación del Sitio II está apoyada por la complementaridad tridimensional de la forma y las características funcionales entre el sitio y los ligandos que tienen actividad de transrepresión in vivo. Un ejemplo de dicha complementaridad se muestra en la Figura 3, en la que el enantiómero S del Compuesto 15 se acopló manualmente en el modelo por homología de GR del Sitio II.
Los restos del Sitio I y Sitio II se definieron como los que son capaces de contacto de tipo van der Waals con un ligando contenido por esos restos. Usando la dexametasona para el Sitio I (unida de una forma similar a la descrita para la progesterona en el Sitio I de PR) y el Compuesto 15 para el Sitio II (acoplado manualmente como se muestra en la Figura 3), se listaron todos los restos que eran capaces de tener un contacto de van der Waals, como restos del sitio. También se incluyeron los restos que no estaban inmediatamente en contacto con el ligando, pero eran capaces de dicho contacto si el espacio entre el ligando y el residuo estaba ocupado por un fragmento de molécula pequeña.
Además, se encontró que los cálculos de las energías de unión para una serie de 27 ligandos del Sitio II relacionados, que están entre los compuestos descritos en el Ejemplo 1, se correlacionaba con lo observado en las actividades de transrepresión in vivo, proporcionando una prueba adicional de la función crítica de la unión al Sitio II en la producción de un efecto de transrepresión in vivo. Los datos de correlación se muestran en la Tabla II (a continuación) y Figura 5, y las estructuras se muestran en la Figura 4. Aunque los datos reflejan las actividades de los racematos, cada molécula individual se modeló como el enantiómero S para propósitos de coherencia. Estos 27 compuestos mostraron un % de inhibición con 10 \muM en el ensayo de transrepresión celular en el intervalo de 0,8 a 82,9. La CE50 en el ensayo de transcripción celular era mayor que 40 \muM para 26 de los compuestos, y era mayor que 10 \muM para el compuesto restante.
Las energías de unión se calcularon usando Flo (Colin McMartin, Thistlesoft, High Meadow, 603 Colebrook Road, Colebrook, CT 06021), software de modelado molecular que usa el campo de fuerza de la mecánica molecular Amber para lograr el mejor ajuste entre el ligando y el sitio de unión de la proteína. Se deja que tanto el ligando como los restos del Sitio II en contacto con el ligando sufran minimización de energía y optimización geométrica. El resultado de estas operaciones proporciona una orientación de la unión óptima y una serie de energías de interacción calculadas. La correlación entre la inhibición de AP-1 observada (porcentaje a 10 uM) y las energías de unión, se basa en las interacciones de contacto de no enlace calculadas entre el ligando y los restos de la proteína. Este tipo de cálculo en general refleja el grado con el cual el ligando se conforma a la forma del sitio de unión.
La Tabla II, a continuación, da los datos de correlación calculados para los análogos del Compuesto 15, usando puntuaciones de energía de contacto Flo (Ecnt) después del acoplamiento manual de cada análogo en el Sitio II de GR (software de modelado Flo, Colin McMartin, ThistleSoft). Los valores de % de AP-1 se determinaron con una concentración de inhibidor 10 \muM. El ensayo de unión a GR se realizó como se describe en el Ejemplo 2. El ensayo de unión de ADN se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4. El ensayo de inhibición de AP-1 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3.
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TABLA II
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Hay una serie de ejemplos publicados en los que las energías de interacción de las estructuras acopladas se correlacionaban con la actividad observada; uno de dichos ejemplos se usó en AutoDock (Sybyl, Tripos, St. Louis, MO) en la evaluación de 27 inhibidores de proteasa del VIH-1 (Huang, y col., J. Med. Chem. 45, 333, 2002). Las energías de interacción entre el sitio activo de la proteasa del VIH-1 y una serie de ligandos, se calcularon usando un campo de fuerzas MM2X y se encontró que se correlacionaban con las actividades observadas (Holloway y Wai, en Computer-Aided Molecular Design, ACS Symposium Series 589, ACS, Washington, DC 1995). Se tuvo en cuenta la contribución de la solvatación a las energías de unión de las estructuras acopladas y se proporcionaron los medios para predecir con más precisión las actividades biológicas (Takamatsu y Itai, Proteins: Structure, Function, and Genetics, 33:62-73, 1998).
La correlación de la estructura con la actividad es un criterio fundamental para indicar los aspectos de la estructura más relevantes para la actividad. Cuando se lleva a cabo la correlación con ligandos solos, se puede demostrar cuales son las propiedades/características de los ligandos importantes para la actividad. Cuando se hace con un sitio de unión de la proteína que actúa como una restricción, la correlación proporciona pruebas de que algunas características del sitio de unión tridimensional son importantes. Por lo tanto, cuando existe una correlación entre los datos de inhibición de AP-1 y las energías de unión calculadas para una serie de moléculas, esto proporciona una certeza razonable de que el modelo del sitio de unión está de acuerdo con los datos de inhibición observados. Por lo tanto, el diseño de moléculas que tienen complementaridad de las características con las del sitio de unión, debería conducir al diseño eficaz basado en estructura de nuevos ligandos que tienen la actividad biológica deseada, en este caso, inhibición de AP-1.
Una publicación reciente (Bledsoe, y col., Cell, publicación en línea de Cell Press, 1 de julio, 2002; DOI:10.1016/
50092867402008176) describe la cristalización y elucidación estructural de rayos X satisfactoria del LBD del receptor de glucocorticoides como el dímero. Se encontró que se producía la alteración de la estructura de dímero tras la mutación de restos seleccionados en la interfase de dimerización. Estos mutantes carecían de actividad de transactivación y retenían la actividad de transrepresión. Es interesante que la interfase de dimerización y la apertura del Sitio II comparten la misma superficie exterior (dos restos situados en el borde del Sitio II, en particular Q615 y P625, están entre los varios identificados por los autores como críticos para la formación del dímero). Esta observación está de acuerdo con la importancia propuesta para el Sitio II en la modulación de la actividad de esteroide disociado.
Ejemplo 11 Ensayo de transrepresión celular tanto con un compuesto disociado del Sitio II como con dexametasona
El ensayo de transrepresión celular se llevó a cabo determinando la CI50 para la transrepresión para la dexametasona en presencia o ausencia de uno de los compuestos (un enantiómero S) del Ejemplo 1. Este enantiómero S se denomina en lo sucesivo Compuesto A. En ausencia de Compuesto A, la dexametasona dio una CI50 de 3,4 nM con un porcentaje de inhibición máximo de 75%, mientras que en presencia de 800 nM del compuesto, la CI50 disminuyó a 1,2 nM con 100% de inhibición. Esto mostró que hay un efecto aditivo en la adición del compuesto con dexametasona.
Ejemplo 12 Ensayo de transcripción celular tanto con un compuesto disociado del Sitio II como con dexametasona
Para la transactivación, el compuesto usado en el Ejemplo 11, el Compuesto A, era un antagonista de la actividad de la dexametasona. Aquí, se determinó una CE50 en el ensayo de transcripción celular para la dexametasona en presencia o ausencia del compuesto. En ausencia, la CE50 era 3,4 nM, con 100% de estimulación, mientras que en presencia del compuesto, la CE50 se desplazó a 8,5 nM con 47% de estimulación.
Ejemplo 13 Solapamiento del Sitio II de diferentes NHR y cálculos de la DT
Los alineamientos de consenso se llevaron a cabo usando ICM (Molsoft LLC, La Jolla, CA) entre el LBD de GR humano y otros LBD de NHR. La figura 2 muestra el alineamiento, indicando con sombreado los restos del Sitio II en cada NHR, es decir, los restos correspondientes a los restos del Sitio II de GR. Los puntos son espaciadores y no representan aminoácidos. Los números se refieren al primer resto en cada línea, son específicos para cada NHR y se basan en el NHR de longitud entera. Para los NHR listados a continuación, con excepción de GR y MR, los datos estructurales se obtuvieron de las referencias de RCSB listadas a continuación, y se usó el sistema de numeración de las referencias de RCSB. Para los GR y MR, los datos estructurales se obtuvieron por modelado por homología usando las siguientes referencias bibliográficas, y se usó el sistema de numeración de estas referencias bibliográficas. Las referencias de RCSB (entre paréntesis) y las referencias bibliográficas para los diferentes NHR, son las siguientes:
RXRalfa (11bd) Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 375 pág. 377 (1995); PPARgamma (2prg) Nolte, R. T., Wisely, G. B., Westin, S., Cobb, J. E., Lambert, M. H., Kurokawa, R., Rosenfeld, M. G., Willson, T. M., Glass, C. K., Milburn, M. V. Nature 395 pág. 137 (1998); RARgamma (21bd) Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P., Gronemeyer, H., Moras, D. Nature 378 pág. 681 (1995); PR (1a28) Williams, S. P., Sigler, P. B. Nature 393 pág. 392 (1998); VitDR (1db1) Rochel, N., Wurtz, J. M., Mitschler, A., Klaholz, B., Moras, D. Mol. Cell 5 pág. 173 (2000); AR (1e3g) Matias, P. M., Donner, P., Coelho, R., Thomaz, M., Peixoto, C., Macedo, S., Otto, N., Joschko, S., Scholz, P., Wegg, A., Basler, S., Schafer, M., Egner, U., Carrondo, M. A. J. Biol. Chem. 275 pág. 26164 (2000); ERalfa (1a52) Tanenbaum, D. M., Wang, Y., Williams, S. P., Sigler, P. B. Proc Natl. Acad. Sci. USA 95 pp. 5998 (1998); ERbeta (112j) Shiau, A. K., Barstad, D., Radek, J. T., Meyers, M. J., Nettles, K. W., Katzenellenbogen, B. S., Katzenellenbogen, J. A., Agard, D. A., Greene, G. L. Nat. Struct. Biol. 9 pág. 359 (2002); TRbeta (1bsx) Wagner, R. L., Darimont, B. D., Apriletti, J. W., Stallcup, M. R., Kushner, P. J., Baxter, J. D., Fletterick, R. J., Yamamoto, K. R. Genes Dev. 12 pág. 3343 (1998). Los datos estructurales de MR y GR se obtuvieron por modelado por homología con PR usando las secuencias de las siguientes referencias: GR, número de acceso PIR QRHUGA, Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641; MR, número de acceso PIR A29613, Arriza, J.L.; Weinberger, C., Cerelli, G., Glaser, T.M., Handelin, B.L., Housman, D.E., Evans, R.M., Science (1987) 237: 268-275.
Se entiende que la figura 2 simplemente ilustra la invención y no se pretende que sea limitante de ninguna forma. Por consiguiente, se entiende que los correspondientes restos de aminoácidos de otros receptores nucleares tales como otros receptores de estrógenos, receptores tiroideos, receptores retinoides, receptores de glucocorticoides, receptores de progestina, receptores de mineralocorticoides, receptores de andrógenos, receptores de peroxisoma y receptores de vitamina D, también se pueden usar en los procedimientos de la invención.
Las coordenadas de estructura del Sitio II de los NHR de la figura 2 se dan en la Tabla III, situada bajo el encabezamiento del Ejemplo 22.
Usando los datos estructurales descritos antes para diferentes LBD de NHR, se realizaron operaciones de ajuste rígido entre el modelo por homología del LBD de GR y los siguientes NHR estrechamente relacionados: LBD del receptor de progesterona, LBD del receptor de andrógenos, LBD del receptor alfa de estrógenos y LBD del receptor beta de estrógenos. Las operaciones de ajuste dieron desviaciones típicas del Sitio II en comparaciones de los átomos de la cadena principal de 0,57-0,71 \ring{A}. Las operaciones de ajuste se llevaron a cabo usando la opción Match en Insigth 11. Los átomos de la cadena principal del Sitio II de GR se compararon con los de los siguientes 4 NHR: receptor de progesterona (DT = 0,57 \ring{A}, receptor de andrógenos (DT = 0,71 \ring{A}), receptor alfa de estrógenos (DT = 0,69 \ring{A}) y receptor beta de estrógenos (DT = 0,52 \ring{A}).
Ejemplo 14 Alineamiento de secuencias del Sitio II de GR de diferentes especies
Se prepararon los alineamientos de secuencia del GR humano y del GR de diferentes especies no humanas. Los alineamientos de secuencia se realizaron usando el programa LOOK (Versión 3.5.2 Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). El alineamiento se muestra en la figura 6. La secuencia para cada GR empieza en el resto 1. Los alineamientos se hicieron basándose en la identidad de secuencia por pares. Los restos del Sitio II están sombreados. Las secuencias de GR se obtuvieron de las siguientes fuentes: ardilla (Saimiri boliviensis boliviensis) (GenBank U87951) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); GR de cerdo (GenBank AF141371) Gutscher, M., Eder, S., Mueller, M. y Claus, R. enviado a GenBank (08-APR-1999) Institut fuer Tierhaltung und Tierzuechtung (470), FG Tierhaltung und Leistungsphysiologie, Universitaet Hohenheim, Garbenstr. 17, Stuttgart 70599, Alemania; cobaya (GenBank L13196) Keightley, M.C. y Fuller, P. J. Mol. Endocrinol. 8 (4), 431-439 (1994); mono tití (GenBank U87953) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); mono Ma'z (GenBank U87952) Reynolds, P.D., Pittler, S.J. y Scammell, J.G. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (2), 465-472 (1997); rata (GenBank M14053) Miesfeld, R., Rusconi, S., Godowski, P.J., Maler, B.A., Okret, S., Wikstrom, A.C., Gustafsson, J.A. y Yamamoto, K.R. Cell 46 (3), 389-399 (1986); ratón (GenBank X04435) Danielsen, M., Northrop, J.P. y Ringold, G.M. EMBO J. 5 (10), 2513-2522 (1986); ser humano (Protein Information Resource QRHUGA) Hollenberg, S.M., Weinberger, C., Ong, E.S., Cerelli, G., Oro, A., Leba, R., Thompson, E.B., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M., Nature (1985) 318: 635-641.
Ejemplo 15 Ensayo de unión al Sitio II
Con el fin de medir la unión de una molécula de ensayo (es decir un ligando potencial) al Sitio II en GR, se prepara un ligando marcado conocido del Sitio II, tal como radiomarcado o con marcador fluorescente. Se pueden usar varios procedimientos para identificar un ligando del Sitio II que se puede usar como el ligando del Sitio II conocido. Todos implican analizar un modulador de GR para determinar si es un ligando del Sitio II. A continuación se dan 3 de dichos procedimientos.
El primer procedimiento implica hacer mutaciones en GR en el Sitio II. Estos mutantes del Sitio II se expresan en ensayos de transactivación y/o transrepresión para determinar si hay alguna alteración de la actividad de modulador. Se predice que aquellos aminoácidos que están cercanos al compuesto, si están mutados, deberían disminuir la actividad del modulador en el ensayo de transrepresión, mientras que no deberían tener efecto en la actividad de transactivación y/o transrepresión mediada por dexametasona. Este procedimiento se usa en el Ejemplo 16.
\newpage
Un segundo procedimiento es preparar un modulador con un resto que puede entrelazarse con GR, tal como el mesilato de dexametasona. Después del entrecruzamiento, el GR se hace digerir con proteasas y se analiza por espectrometría de masas. Se identifican el o los péptidos con un modulador unido covalentemente.
Un tercer procedimiento es cristalizar el GR con el modulador. La estructura del complejo cocristalino muestra definitivamente el modo en el que el modulador se une al GR.
Una vez identificado un ligando, se marca y se usa en el ensayo para medir la unión de una molécula de ensayo al Sitio II. La molécula de ensayo y el ligando marcado se incuban con un lisato celular o complejo purificado que contiene GR. La unión de los compuestos a GR se mide usando técnicas que son estándar en la materia tales como atenuación de la fluorescencia, polarización de fluorescencia, unión a filtro, ensayo de centelleo de proximidad, entre otros. La lectura, tal como de la polarización de fluorescencia, de una mezcla de receptor, ligando marcado y ligando no marcado 1 mM representa 100% de competición, mientras que la lectura de la mezcla sin ligando no marcado se considera que es 100% de unión. Después, se compara la competición en porcentaje de las moléculas de ensayo con la muestra con ligando no marcado 1 mM y se expresa como % con respecto a la actividad de unión, que es 100% con ligando no marcado y 0% sin competición. Las moléculas de ensayo se analizaron en el intervalo de concentración de 0,1 nM a 40 \muM.
Para confirmar la unión de una molécula de ensayo al Sitio II, se puede usar un GR que tiene mutaciones en el Sitio II. Se esperaría que un GR con mutaciones en el Sitio II tuviera una capacidad disminuida para ser modulado por un ligando del Sitio II. Se compara la modulación por la molécula de ensayo, es decir, la transrepresión y transactivación, entre el GR nativo y el GR mutante.
La unión al Sitio II también se puede confirmar demostrando que un esteroide que se sabe que se une al Sitio I, tal como la dexametasona, no compite por la unión de la molécula de ensayo al Sitio II.
Para determinar una CI50, se usa una concentración fija del ligando marcado y se realiza una valoración con una molécula de ensayo no marcada. Las moléculas de ensayo se analizan en el intervalo de concentración de 0,1 nM a
40 \muM.
Se puede preparar un ensayo de unión al Sitio II usando cualquier NHR en lugar de GR como se ha descrito antes. Se usaron los agentes de entrecruzamiento y los ligandos adecuados específicos para el NHR.
Ejemplo 16 Estudios de transactivación en mutantes dirigidos al Sitio de GR
Se hicieron diferentes mutaciones en el Sitio II del receptor de glucocorticoides humano. Se hicieron 2 mutaciones de la alanina 607 a valina o fenilalanina, que se predijo que bloqueaban la entrada de los ligandos del Sitio II en el bolsillo del Sitio II. La valina 543, que está en el interior del bolsillo del Sitio II, se mutó a fenilalanina, y se predijo que esta mutación alteraba la unión de los compuestos al Sitio II. También se hizo un mutante doble A607V/V543L. Estas mutaciones se hicieron usando un kit disponible en el comercio, el kit Stratagene Quick Change XL Site Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA).
Se transfectaron células COS con vectores de expresión para el tipo natural o los diferentes mutantes. Las células también se transfectaron con un indicador artificial, muy sensible, que consistía en dos elementos de respuesta de glucocorticoides secuencia arriba de los genes para la luciferasa, el indicador GRE2LUC, (sistema de ensayo de luciferasa Steady Glo PROMEGA, Madison, WI). Después de 24 horas, las células se trataron durante 24 horas adicionales con dexametasona (Dex), o ligandos del Sitio II. Al final del periodo de incubación, se midieron los niveles de luciferasa usando el sistema de ensayo de luciferasa Steady Glo PROMEGA (Promega, Madison, WI).
Los datos se muestran en la figura 8, en la que URL son unidades relativas de luz. La figura 8 muestra que en el GR natural, tanto la dexametasona como el Compuesto A pueden inducir la transactivación por el indicador GRE2LUC. Sin embargo, en los mutantes A607F, A607V y V543F, mientras que la dexametasona inducía la transactivación del indicador, el Compuesto A no lo hacía. El Compuesto A está indicado mediante la barra lisa, más oscura a la izquierda, en cada par de barras. La dexametasona está indicada por la barra rayada, más clara, a la derecha en cada par de barras. El control son células transfectadas con el vector de ADN solo (no GR) más el indicador GRE2LUC. Estos datos sugieren que el Compuesto A interacciona con los aminoácidos V543 y A607 en el Sitio II o las mutaciones previenen la interacción del Compuesto A con GR.
La actividad de transactivación del receptor de glucocorticoides es muy sensible a las mutaciones que pueden alterar la conformación del receptor. Como puede verse en la figura 8, algunas mutaciones puntuales potencian la capacidad de la dexametasona para inducir transactivación. Esto puede ocurrir debido, entre otras explicaciones, a un aumento de la capacidad de la dexametasona para unirse al GR o una mayor capacidad para reclutar coactivadores. El mutante doble producía una disminución de la capacidad de la dexametasona para inducir transactivación, quizás debido a un efecto mayor en la conformación de GR, y una menor capacidad para unirse a la dexametasona o reclutar coactivadores.
Ejemplo 17 Efecto de combinar Compuestos BMS del Sitio II con dexametasona o RU486 en la transcripción mediada por AP-1
Células A549 establemente transfectadas con un indicador AP-1 con un lector de luciferasa, como se describe en el Ejemplo 3, se trataron con diferentes concentraciones de compuestos. Como se muestra en la figura 9, se realizó una valoración de dexametasona en presencia o ausencia del Compuesto A (un enantiómero S) o compuesto B (el enantiómero R del Compuesto A). Como se ve en la figura 9, estos compuestos aumentaron el porcentaje de inhibición de AP-1 con respecto a la dexametasona sola, sugiriendo que hay un efecto aditivo entre estos compuestos del Sitio II y la dexametasona. En contraste, RU486 (Hofmann TG, Hehner SP, Bacher S, Droge W, Schmitz ML. FEBS Lett. 1998 Dec 28;441(3):441-6), que es un antagonista del Sitio I, que es el sitio de unión de la dexametasona, inhibe la capacidad de la dexametasona para reprimir la actividad de AP-1. Los datos considerados juntos demuestran que el Compuesto A y el Compuesto B actúan de una forma aditiva con los compuestos que interaccionan con el Sitio I, sugiriendo que actúan en un Sitio II alternativo.
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Ejemplo 18 Un ensayo de medición indirecta de la interacción de los ligandos del Sitio II con GR
Con el fin de medir la unión de los compuestos del Sitio II putativos a GR, se usó un kit de ensayo de competición del receptor de glucocorticoides (Panvera Co., Madison, WI) en una versión modificada del ensayo de polarización de fluorescencia de FITC-dexametasona descrito en el Ejemplo 2. En este ensayo, el Compuesto D se añadió con una concentración 200 nM, que da aproximadamente 50% de inhibición de la unión de FITC-dexametasona. El Compuesto D (un enantiómero R) es el Compuesto 50 del Ejemplo 1. El Compuesto D es un ligando del Sitio II que inhibe a través de FITC-dexametasona del Sitio II la unión a GR. A la mezcla de lisato celular que contenía el receptor de glucocorticoides, el Compuesto D y FITC-dexametasona, se añadieron diferentes ligandos del Sitio II competidores, que no inhibían la unión de la dexametasona, y se midió el cambio de la unión de FITC-dexametasona. Estos ligandos del Sitio II competidores, todos compuestos del Ejemplo 1 y todos enantiómeros S, eran: Compuesto A; Compuesto C, que es el S enantiómero del Compuesto D; y Compuesto E, otro S enantiómero más del Ejemplo 1. Si el compuesto competidor se une al Sitio II y desplaza al Compuesto D, entonces la FITC-dexametasona debería volver a unirse a GR. Como se muestra en la figura 10, los compuestos competidores son eficaces desplazando al Compuesto D y dejando que la FITC-dexametasona se vuelva a unir a GR. Por lo tanto, este ensayo puede medir la unión relativa de los compuestos al Sitio II en GR.
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Ejemplo 19 Los ligandos del Sitio II actúan de una forma dependiente de GR para reprimir la transcipción dirigida por AP-1
Con el fin de determinar si los ligandos del Sitio II actúan a través de GR, se transfectaron células COS que no expresan GR, con un indicador de luciferasa-AP-1 (plásmido pAP-1-Luc, Stratagene, La Jolla, CA) más o menos una construcción de expresión para GR humano de longitud entera. Se midió la actividad de AP-1 a través de la actividad del indicador luciferasa como se indica en el Ejemplo 3. Cuando no había GR presente, ni la dexametasona 1 \muM ni el Compuesto A 40 \muM inhibían significativamente la actividad de AP-1. Sin embargo, cuando se transfectó la célula con GR, tanto la dexametasona como el Compuesto A suprimieron la actividad de AP-1. Estos resultados se muestran en las figuras 11a y 11b, en las que el eje Y son las unidades relativas de luz (URL). Estos datos muestran que ambos ligandos actúan de una forma dependiente de GR.
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Ejemplo 20 Provisión de las coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR y cálculos de la DT
Las coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR se obtuvieron de la descripción del documento WO 03/015692 A2, 27 de febrero, 2003, Apolito y col. y se proporcionan en la Tabla IV bajo el encabezamiento del Ejemplo 23. Apolito describe las coordenadas de estructura de rayos X del LBD de GR, pero no describe la existencia o identidad del Sitio II.
Las coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR se obtuvieron de la descripción de Kauppi y col., en Journal of Biological Chemistry Online, JBC Papers, pendiente de publicación con DOI: 10.1074/jbc.M212711200, 9 de abril, 2003, fichero RCSB: 1nhz.pdb (LBD de GR unido a un antagonista, RU 486) y se proporcionan en la Tabla V bajo el encabezamiento del Ejemplo 24. Kauppi describe las coordenadas de estructura de rayos X del LBD de GR, pero no describe la existencia o identidad del Sitio II.
Las coordenadas del Sitio II de GR del modelo por homología de la Tabla I se compararon con las coordenadas del Sitio II disponibles de las descripciones de los documentos WO 03/015692 A2, 27 de febrero, 2003 Apolito, y col. y las publicadas por Kauppi y col., en Journal of Biological Chemistry Online, JBC Papers, pendiente de publicación como DOI:10.1074/jbc.M212711200, 9 de abril, 2003, fichero RCSB: 1nhz.pdb (LBD de GR unido a un antagonista, RU 486). Cuando se compararon los átomos de la cadena principal de los restos del Sitio II del modelo por homología, es decir, E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de acuerdo con la Tabla I, se obtuvieron desviaciones típicas (DT) de 0,92 y 1,02 \ring{A} entre el modelo por homología de los restos del Sitio II de la Tabla I y los restos del Sitio II de Apolito, y entre el modelo por homología del Sitio II de la Tabla I y los restos del Sitio II de Kauppi, respectivamente. En ambos casos, primero se superpusieron los restos del Sitio II usando la opción de superposición de estructuras en el software de modelado ICM (Versión 3.0.017, Molsoft. LLC). El uso del programa rmslig en el programa de modelado molecular Flo (Colin McMartin, Thistlesoft), proporcionó los cálculos de las DT de la cadena principal. Estas observaciones destacan la similitud de la estructura del modelo por homología del Sitio II con las estructuras cristalinas reales.
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Ejemplo 21 Coordenadas de estructura del LBD de GR, Tabla I
A continuación se da la Tabla I, que da las coordenadas de estructura tridimensionales del modelo por homología del LBD de GR. El formato usado se basa en el usado habitualmente en el RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, formato de fichero pdb), y los campos listados de izquierda a derecha se definen como sigue: nombre registrado, número de serie del átomo, nombre del átomo, nombre del resto, identificador de la cadena, número de secuencia del resto, coordenadas ortogonales para x en Angstroms, coordenadas ortogonales para y en Angstroms, coordenadas ortogonales para z en Angstroms, ocupación y factor temperatura.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA I Coordenadas del modelo por homología de GR
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Ejemplo 22 Coordenadas de estructura del Sitio II en diferentes NHR, Tabla III
A continuación se da la Tabla III, que da las coordenadas de estructura para el sitio II de diferentes NHR, basadas en los alineamientos de consenso de la figura 2. El formato usado se basa en el usado habitualmente en el RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, formato de fichero pdb), y los campos listados de izquierda a derecha se definen como sigue: nombre registrado, número de serie del átomo, nombre del átomo, nombre del resto, identificador de la cadena, número de secuencia del resto, coordenadas ortogonales para x en Angstroms, coordenadas ortogonales para y en Angstroms, coordenadas ortogonales para z en Angstroms, ocupación y factor temperatura.
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TABLA III
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Ejemplo 23 Coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR, Tabla IV
A continuación se da la Tabla IV, que da las coordenadas de estructura de rayos X para el Sitio II de GR, obtenidas a partir de la descripción del documento WO 03/015692 A2, 27 de febrero, 2003, Apolito, y col. El formato usado se basa en el usado habitualmente en el RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, formato de fichero pdb), y los campos listados de izquierda a derecha se definen como sigue: nombre registrado, número de serie del átomo, nombre del átomo, nombre del resto, identificador de la cadena, número de secuencia del resto, coordenadas ortogonales para x en Angstroms, coordenadas ortogonales para y en Angstroms, coordenadas ortogonales para z en Angstroms, ocupación y factor temperatura.
TABLA IV
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Ejemplo 24 Coordenadas de estructura de rayos X del Sitio II de GR, Tabla V
A continuación se da la Tabla V, que da las coordenadas de estructura de rayos X para el Sitio II de GR, obtenidas a partir de la descripción de Kauppi y col., en the Journal of Biological Chemistry Online, JBC Papers, pendiente de publicación como doi:10.1074/jbc.M212711200, 9 de abril, 2003, fichero RCSB: 1nhz.pdb (LBD de GR unido a un antagonista, RU 486). El formato usado se basa en el usado habitualmente en el RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, formato de fichero pdb), y los campos listados de izquierda a derecha se definen como sigue: nombre registrado, número de serie del átomo, nombre del átomo, nombre del resto, identificador de la cadena, número de secuencia del resto, coordenadas ortogonales para x en Angstroms, coordenadas ortogonales para y en Angstroms, coordenadas ortogonales para z en Angstroms, ocupación y factor temperatura.
TABLA V
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Claims (8)

1. Un procedimiento para evaluar el potencial de una entidad química para unirse a un Sitio II de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:
(a) acoplar una entidad química en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I, Tabla IV o Tabla V;
(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha entidad química y dicho Sitio II de GR; y
(c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.
2. Un procedimiento de diseño de un ligando de un Sitio II de GR que comprende:
(a) modelar un Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla 1;
(b) basándose en dicho modelado, diseñar una entidad química que tenga complementaridad de las características estructurales y químicas con dicho Sitio II de GR; y
(c) seleccionar la entidad química en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la entidad química como un modulador.
3. Un procedimiento para identificar un modulador de un receptor de glucocorticoides (GR), que comprende:
(a) acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II de GR es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;
(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre dicha molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y
(c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo de modulación del GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador, en el que dicho modulador de dicho GR induce transrepresión.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, que además comprende uno o más de los siguientes:
(a) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio II de GR; y
(b) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo que caracteriza la unión al Sitio I de GR.
5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que el modulador de GR es un compuesto disociado.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el modulador del GR antagoniza un modulador que induce transactivación.
7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el Sito II de GR está compuestos de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2.
8. Un procedimiento para identificar un ligando de un Sitio II de GR, que comprende:
(a) acoplar una molécula de ensayo en la cavidad circunscrita por dicho Sitio II de GR, en el que dicho Sitio II es una estructura definida por las coordenadas de estructura que describen los átomos de la cadena principal de los restos conservados que tienen una desviación típica no superior a 2,0 \ring{A} en relación a los átomos de la cadena principal de los restos conservados descritos por las coordenadas de estructura de los aminoácidos E537-V543, L566, G567, Q570-W577, S599-A607, W610, R611, R614, Q615, P625, Y663, L664 y K667 de GR como se representa en la Figura 2 de acuerdo con la Tabla I;
(b) analizar la complementaridad de las características estructurales y químicas entre la molécula de ensayo y dicho Sitio II de GR; y
(c) seleccionar la molécula de ensayo en un ensayo in vitro que caracteriza la unión a dicho Sitio II de GR, identificando así la molécula de ensayo como un modulador.
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