ES2337684T3 - Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de (a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en una procarboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, siendo el péptido señal la secuencia N-terminal de la pre-proteína, e insertándose opcionalmente entre la cola de histidinas y el péptido señal o entre la cola de histidinas y la carboxipeptidasa B de rata una secuencia espaciadora; (b) transformar un organismo microbiano huésped con el vector; (c) cultivar el organismo microbiano huésped en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, expresando el organismo microbiano huésped la pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina al medio de cultivo; (d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada al medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unir la cola de histidinas, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, inmovilizándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina; (e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, escindiéndose así proteolíticamente la porción pro-carboxipeptidasa B y liberándose la proteína con actividad carboxipeptidasa B a la fase líquida, mientras la porción propéptido con colas de histidina está inmovilizada; (f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que está inmovilizada la porción propéptido con colas de histidina; y (g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).

Description

Carboxipeptidasa B recombinante y su purificación.

La presente invención pertenece al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención pertenece a la producción y posterior procesamiento de un precursor enzimáticamente inactivo de una proteína con actividad carboxipeptidasa B. Un aspecto de la invención pertenece a la activación y purificación concomitante de la proteína con actividad carboxipeptidasa B.

Las carboxipeptidasas son enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos C-terminal. La familia de la carboxipeptidasa incluye metalo-, serina, y cisteína carboxipeptidasas. De acuerdo con su especificidad de sustrato, estas enzimas se denominan carboxipeptidasa A (escindiendo residuos alifáticos) o carboxipeptidasa B (escindiendo residuos amino básicos). La carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2) es una enzima que cataliza la hidrólisis de los aminoácidos básicos, Lisina, Arginina, y Ornitina a partir de la posición C-terminal en los polipéptidos:

Peptidil-L-Lisina(aminoácido -L-básico) + H_{2}O \rightarrow Péptido + L-Lisina(aminoácido -L-básico)

El precursor de la carboxipeptidasa B es un zimógeno o proenzima en el páncreas de la mayoría de vertebrados (revisado por Folk J. Carboxypeptidase B, en: The Enzymes 3, P. Boyer, Academic Press, NY, 57, 1971). La carboxipeptidasa B puede funcionar en la posterior degradación de productos provenientes de la digestión con tripsina, para los que son muy específicos, como la carboxipeptidasa A es específica para los productos de quimiotripsina. La carboxipeptidasa B también posee una actividad esterasa que está relacionada con el contenido metálico de la enzima (Folk, J., y Gladner, J.: Biochim Biophys Acta (1961) 48, 139-47; Zisapel, N. y Sokolovsky, M, Eur J Biochem (1975) 54, 541-7).

Un "zimógeno" o una "proenzima" es el precursor inactivo de una enzima. En otras palabras, un zimógeno o una proenzima es el precursor inactivo de una proteína con actividad enzimática como una proteína con actividad carboxipeptidasa B. Muchas proteínas con actividad enzimática se sintetizan como dichos precursores inactivos y se activan posteriormente mediante escisión de uno a varios enlaces péptidos específicos. La activación de enzimas y otras proteínas mediante proteólisis especifica ocurre frecuentemente en los sistemas biológicos. Por ejemplo: (a) La proteína fibrosa de colágeno que está presente en la piel y huesos deriva del procolágeno que es un precursor soluble, (b) Algunas proteínas de hormonas se sintetizan como precursores inactivos. Por ejemplo, la insulina deriva de la proinsulina mediante eliminación proteolítica de un péptido. (c) Las enzimas digestiva que hidrolizan proteínas se sintetizan y secretan como zimógenos en el estómago y el páncreas. La carboxipeptidasa B pertenece a este grupo, (d) La coagulación de la sangre está mediada mediante una cascada de activaciones proteolíticas que aseguran una respuesta rápida y amplificada al trauma.

In vivo el zimógeno de la carboxipeptidasa B, es decir, la "pro-carboxipeptidasa B", se traduce en las células pancreáticas como una pre-proteína denominada "pre-pro-carboxipeptidasa B".

La pre-pro-carboxipeptidasa B comprende en su N-terminal un péptido señal. La secuencia de aminoácidos de la pre-pro-carboxipeptidasa B describe el producto traduccional primario. El péptido señal dirige al polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B hacia la ruta de secreción de la célula pancreática. Durante el proceso de secreción el péptido líder se escinde proteolíticamente, convirtiendo así la pre-pro-carboxipeptidasa B en la pro-carboxipeptidasa B.

La pro-carboxipeptidasa B está desprovista de actividad enzimática. La activación in vivo normalmente tiene lugar en el intestino delgado. La tripsina rompe la pro-carboxipeptidasa B, generando así un propéptido enzimáticamente inactivo y la enzima carboxipeptidasa B proteolíticamente activa.

Como ejemplo para la pre-pro-carboxipeptidasa, el Id. de Sec. Nº: 1 describe la secuencia de aminoácidos de la pre-pro-carboxipeptidasa B de rata como se publicó en Clauser E. et al., J. Biol. Chem. 1988, Vol. 263, 17837-45. De acuerdo con esto, los primeros 13 aminoácidos del polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B representan el péptido señal y los siguientes 95 aminoácidos constituyen el propéptido. El producto de activación, es decir, la enzima carboxipeptidasa B de rata activa contiene 307 aminoácidos con un peso molecular calculado de 35.228 Da.

Al utilizar tripsina, la pro-carboxipeptidasa B puede también activarse in vitro para formar la carboxipeptidasa B. La conformación del propéptido y la porción de enzima han demostrado mediante métodos analíticos como las electroforesis en gel de SDS así como HPLC de fase reversa de Ventura et al. J. Biol. Chem. (1999) 274(28), 19925-33.

Los experimentos de activación in vitro bajo varias condiciones han demostrado que mientras una enzima carboxipeptidasa B proteolíticamente activa se genera fácilmente, bajo condiciones no desnaturalizantes, el propéptido permanece unido de forma no covalente a un gran número de moléculas de carboxipeptidasa B. Esto se puede ver cuando las condiciones desnaturalizantes se aplican al complejo de propéptido y enzima. Así, los métodos de purificación no desnaturalizantes y en particular la cromatografía de intercambio de aniones no proporcionan ni de cerca medios suficientes para separar el propéptido unido de forma no co-valente de la enzima carboxipeptidasa B.

Debido a su gran especificidad para los aminoácidos básicos en C-terminal, se ha encontrado un amplio uso para la carboxipeptidasa B, por ejemplo en el análisis de final de grupo para la determinación de secuencias. No obstante, es de mayor importancia económica la aplicación industrial que implica el procesamiento proteolítico. En particular, la carboxipeptidasa B se utiliza en los procesos de producción que conducen a la insulina para su uso médico y que involucran la escisión proteolítica de la pro-insulina.

Respecto a la insulina como producto medico, surge un problema concreto a favor del propéptido de la carboxipeptidasa B que no está covalentemente unido a la enzima carboxipeptidasa B. En dichos procesos de producción de insulina, tras la escisión proteolítica de la pro-insulina, el fragmento de insulina se purifica bajo condiciones desnaturalizantes. Como consecuencia, es posible que el propéptido de la carboxipeptidasa B se copurifique con la insulina. En tal caso, la separación del propéptido de la carboxipeptidasa B de la molécula de insulina puede ser un proceso laborioso que al mismo tiempo disminuya probablemente la proporción final de insulina purificada.

La carboxipeptidasa B purificada disponible comercialmente a partir de páncreas porcino puede que no esté totalmente libre de otras actividades proteolíticas. Además, como es el caso para la mayoría de productos derivados de animales, la carboxipeptidasa B porcina puede contener agentes infecciosos como virus, priones, u otros componentes biológicamente activos con potencial deletéreo para la salud humana. Por lo tanto, es deseable obtener carboxipeptidasa B a partir de una fuente alternativa. Además, es deseable que la carboxipeptidasa B de la fuente alternativa esté sustancialmente libre de propéptido.

Se conoce en la materia que la carboxipeptidasa B puede producirse de forma recombinante en organismos huésped transformados (por ejemplo Ventura et al. J. Biol. Chem. (1999) 274(28), 19925-33) y purificarla a partir de ellos.

WO 01/51624 describe la expresión recombinante de pro-carboxipeptidasa B porcina en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Tras la activación del zimógeno a través de la escisión tríptica, un primer paso de purificación incluye la cromatografía hidrofóbica. Tras la adición del inhibidor de la tripsina de semilla de soja, la enzima activada se purifica posteriormente utilizando cromatografía con Q-sepharose. El método de purificación de WO 01/51624 involucra pasos múltiples y existe una pérdida concomitante de producto de carboxipeptidasa B. Además, existe la necesidad de separar el inhibidor de la tripsina de semilla de soja así como el propéptido de la carboxipeptidasa B del
producto.

DE 19 915 938 describe la expresión recombinante de una pro-carboxipeptidasa B humana con colas de histidina en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. El producto se purifica utilizando cromatografía de afinidad y mediante la cola de Histidina. Posteriormente, la pro-carboxipeptidasa B se activa utilizando tripsina y la reacción de activación finaliza mediante la adición de inhibidor de tripsina de semilla de soja. Mediante la filtración a través de una membrana que excluye partículas por encima de un peso molecular de alrededor de 30.000 Da, la carboxipeptidasa B se separa de la tripsina, el propéptido, el inhibidor así como otros fragmentos que se generaron durante el curso del proceso de purificación. No obstante, como el peso molecular de la enzima carboxipeptidasa B es de alrededor de 37.000 Da, se esperan pérdidas debido al paso de filtración, dependiendo del tamaño de distribución de los poros en el filtro utilizado. Además, al realizar el paso de activación en el zimógeno disuelto, existe la necesidad de separar además el propéptido de la enzima carboxipeptidasa B.

En WO 96/23064 se describe la expresión recombinante de la pro-carboxipeptidasa B de rata en E. coli. Se producen cuerpos de inclusión de pro-carboxipeptidasa B insoluble. El zimógeno se renaturaliza y posteriormente se purifica. El paso de activación se realiza sobre el zimógeno disuelto y existe la necesidad de separar de nuevo el propéptido de la enzima carboxipeptidasa B. Debido a los pasos de desnaturalización/renaturalización, el rendimiento de la enzima carboxipeptidasa B obtenible utilizando este método es comparablemente bajo.

Hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, no se conoce un método específico para separar la carboxi-peptidasa B activada de la forma no activada.

El problema a resolver mediante la presente invención es, por lo tanto, proporcionar un método alternativo para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B a partir de un zimógeno, en el que se evita la unión no covalente del propéptido a la proteína con actividad carboxi-peptidasa B. Otro problema a resolver mediante la presente invención es proporcionar un método alternativo para separar la proteína con actividad carboxipeptidasa B del pro-péptido y del zimógeno residual tras el paso de activación. Otro problema a resolver mediante la presente invención es proporcionar un método alternativo para separar bajo condiciones no desnaturalizantes la proteína con actividad carboxipeptidasa B del propéptido y del zimógeno residual, tras el paso de activación.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en la pro-carboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal a una cola de Histidina y a un péptido señal, en el que opcionalmente entre la cola de histidina y el péptido señal o entre la cola de histidina y la pro-carboxipeptidasa B de rata se inserta una secuencia espaciadora; (b) transformar un organismo huésped microbiano con el vector; (c) cultivar el organismo huésped microbiano en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, en el que el organismo huésped microbiano expresa la preproteína y secreta la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina en el medio de cultivo; (d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada en el medio de cultivo del paso (c) sobre una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unirse a la cola de histidina, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina se inmoviliza; (e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, que escinde así de forma proteolítica la porción de pro-carboxipeptidasa B y liberando la proteína con actividad carboxipeptidasa B en la fase líquida, en la que la porción de propéptido con colas de histidina está inmovilizada; (f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que la porción de propéptido con colas de histidina está inmovilizada en la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados; y (g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).

Ciertos términos se utilizan con un sentido particular, o se definen por primera vez, en esta descripción de la presente invención. Con el propósito de la presente invención, los siguientes términos se definen mediante sus definiciones aceptadas en la materia, cuando éstas existen, excepto cuando estas definiciones entran en conflicto total o parcial con las definiciones establecidas más adelante. En caso de conflicto en la definición, el significado de los términos se definen primero en las definiciones establecidas más adelante.

La identificación de aminoácidos utiliza la abreviaturas de tres letras así como el alfabeto de letra única de los aminoácidos, es decir, Asp D ácido aspártico, Ile I Isoleucina, Thr T Treonina, Leu L Leucina, Ser S Serina, Tyr Y Tirosina, Glu E ácido glutámico, Phe F Fenilalanina, Pro P Prolina, His H Histidina, Gly G Glicina, Lys K Lisina, Ala A Alanina, Arg R Arginina, Cys C Cisteína, Trp W Triptófano, Val V Valina, Gln Q Glutamina, Met M Metionina, Asn N Asparagina. Un aminoácido en una posición particular en una secuencia de aminoácidos viene dada por su abreviatura de tres letras y un número. A modo de ejemplo, en referencia a la secuencia de aminoácidos de la pre-pro carboxipeptidasa B nativa de rata de Id. de Sec. Nº: 1, "His14" denota el residuo de Histidina en la posición 14 de aminoácidos.

El término "que comprende" se utiliza en la descripción de la invención y en las reivindicaciones y significa "que incluye, pero no necesariamente se limita a".

El término "pre-proteína" se refiere a un producto de traducción primaria que comprende en su extremo N-terminal un péptido señal. En el contexto de la presente invención la "pre-proteína" es el precursor del zimógeno o pro-enzima, es decir, la pro-carboxipeptidasa B. La pro-enzima resulta del procesamiento postraduccional de la pre-proteína.

Un "péptido señal" es una secuencia señal de aminoácidos escindible presente en la forma de pre-proteína de una proteína secretable. Las proteínas transportadas a través de la membrana celular, es decir "secretadas", normalmente poseen una secuencia N-terminal rica en aminoácidos hidrofóbicos de alrededor de 15 a 30 aminoácidos de longitud. Algunas veces durante el proceso del paso a través de la membrana, la secuencia señal se escinde mediante una peptidasa señal (Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (eds), Molecular Biology of the Cell, cuarta edición, 2002, Garland Science Publishing). Muchas fuentes de péptido señal son conocidas por los expertos en la materia y pueden incluir, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del péptido señal del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae y similares. En general, el N-terminal de la pre-proteína de esencialmente cualquier proteína secretada es una fuente potencial de un péptido señal adecuado para utilizar en la presente invención. Un péptido señal puede también estar bipartido que comprende dos péptidos señal que dirigen la pre-proteína a un primer y a un segundo compartimiento celular. Los péptidos señal bipartidos se escinde secuencialmente durante el curso de la ruta de secreción. Un ejemplo preferible de esto es el pre-propéptido del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae (Waters et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6209-14). Otro ejemplo más preferible es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la posición 1 a la posición 255 en el Id. de Sec. Nº: 3.

Las pre-proteínas con una péptido señal N-terminal de secreción están dirigidos para entrar en la "ruta de secreción". La ruta de secreción comprende los procesos de procesamiento post-traduccional y finalmente resulta en la secreción de la procarboxipeptidasa B. En el presente documento se entiende que las proteínas secretadas mediante la cepa de levadura metilotrófica han pasado a través de la ruta de secreción.

El término "procesamiento post-traduccional" denota los pasos de modificación a los que se somete una pre-proteína, para crear una proteína en un compartimiento celular o extracelular. En el contexto de la presente invención, el procesamiento post-traduccional de la pre-pro-carboxipeptidasa B resulta en la pro-carboxipeptidasa B secretada.

La escisión enzimática proteolítica de la pro-carboxipeptidasa B, por ejemplo mediante tripsina, se refiere como "activación". Los expertos en la materia conocen bien que los eventos moleculares que conducen a la activación dependen del procesamiento proteolítico. La tripsina escinde la pro-carboxipeptidasa B, generando así un "pro-péptido" o "porción de propéptido" enzimáticamente inactivo y una "porción de enzima" proteolíticamente activa, es decir, la carboxipeptidasa B. A modo de ejemplo, la porción de enzima de la pro-carboxipeptidasa B de rata, es decir, la "porción de pro-carboxipeptidasa B" del polipéptido de procarboxipeptidasa B de rata es el polipéptido dado por la secuencia de aminoácidos desde la posición 191 a la posición 497 en el Id. de Sec. Nº: 4.

El propéptido de una pro-carboxipeptidasa B normalmente comprende alrededor de 95 aminoácidos. También se conoce que la escisión proteolítica de la pro-carboxipeptidasa B por la tripsina no solo activa la carboxipeptidasa B sino que también puede formar fragmentos trípticos de carboxi-peptidasa B.

Una "levadura metilotrófica" se define como una levadura que es capaz de utilizar metanol como su fuente de carbono. El término también comprende cepas de laboratorio de la misma. En el caso que una cepa de levadura metilotrófica sea auxotrófica y debido a su necesidad de ser suplementada con una sustancia auxiliar que contiene carbono, por ejemplo Histidina en el caso de una cepa de levadura metilotrófica incapaz de sintetizar este aminoácido en una cantidad suficiente, esta sustancia auxiliar se refiere a un nutriente pero no a una fuente de carbono.

Un "vector" se define como DNA que puede comprender, es decir llevar y mantener el fragmento de DNA de la invención, que incluye, por ejemplo, fagos y plásmidos. Estos términos se entienden por los expertos en la materia de la ingeniería genética. El término "casete de expresión" denota una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína, unida de forma operativa a un promotor y a un terminador. Para los vectores que contienen un casete de expresión, los términos "vectores" y "vectores de expresión" son sinónimos.

"Transformación" significa introducir DNA en un organismo de forma que el DNA es replicable, tanto como un elemento extracromosómico como mediante integración cromosómica.

El término "episoma" significa una unidad de material genético compuesto de una serie de genes que algunas veces poseen una existencia independiente en una célula huésped y otras veces se integra en un cromosoma de la célula, replicándose a sí mismo junto con el cromosoma. Un ejemplo de episoma es el vector de la Figura 1.

El término "expresión" y el verbo "expresar" significan trascripción de secuencias de DNA y/o la traducción del mRNA transcrito en un organismo huésped que resulta en una pre-proteína, es decir no incluye el procesamiento post-traduccional.

Una secuencia de nucleótidos "codifica" un péptido o proteína cuando al menos una porción de la secuencia de nucleótidos, o su complementario, puede traducirse directamente para proporcionar la secuencia de aminoácidos del péptido o proteína, o cundo la secuencia de nucleótidos aislada puede utilizarse, sola o como parte de un vector de expresión, para expresar el péptido o proteína in vitro, en una célula procariota huésped, o en una célula eucariota huésped.

Toda secuencia de nucleótidos se escribe en la dirección desde el extremo 5' (representa al primero) hacia el extremo 3' también referido como de 5' a 3'.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos reguladora que estimula la transcripción. Estos términos se entienden por los expertos en la materia de la ingeniería genética. Como un promotor, un "elemento promotor" estimula la trascripción pero constituye un sub-fragmento de una secuencia promotora más larga.

El término "unido de forma operativa" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un vector único de forma que la función de uno se vea afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está ligado de forma operativa con una secuencia codificante, es decir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o una pre-proteína, cuando es capaz de afectar la expresión de esta secuencia codificante, es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor.

Un "enlace peptídico" es un enlace covalente entre dos aminoácidos en que el grupo amino alfa de un aminoácido está unido al grupo carboxilo alfa del otro aminoácido.

Descripción detallada de la invención

Una primera realización de la invención es un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en la pro-carboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal a la cola de histidina y un péptido señal, en el que opcionalmente entre la cola de histidina y el péptido señal o entre la cola de histidina y la pro-carboxipeptidasa B de rata se inserta una secuencia espaciadora; (b) transformar un organismo huésped microbiano con el vector; (c) cultivar el organismo huésped microbiano en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, en el que el organismo huésped microbiano expresa la preproteína y secreta la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina en el medio de cultivo; (d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B secretada con colas de histidina en el medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaces de unirse a la cola de histidina, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en el que la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina está inmovilizado; (e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, que escinde así de forma proteolítica la porción de pro-carboxipeptidasa B y liberando la proteína con actividad carboxipeptidasa B en la fase líquida, en la que la porción de propéptido con colas de histidina está inmovilizada; (f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que la porción de propéptido con colas de histidina está inmovilizada en la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados; y (g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).

Cuando se construye un vector que se va a utilizar para la transformación de una cepa de huésped microbiano, por ejemplo una cepa de levadura metilotrófica, algunas técnicas de clonación molecular pueden requerir la adición de un enlazante o secuencia espaciadora para una secuencia de nucleótidos que codifica un elemento funcional de la pre-proteína. Una secuencia espaciadora puede también generarse, por ejemplo cuando un fragmento de DNA que comprende la secuencia codificante de un elemento funcional de la pre-proteína se escinde de un vector de clonaje utilizando una endonucleasa de restricción que genera un fragmento que es mayor que la secuencia codificante. Otras razones por las que la secuencia enlazante o espaciadora de nucleótidos puede aparecer son posibles. La secuencia de nucleótidos que codifica los elementos funcionales de la pre-proteína respecto a esto codifica (a) el péptido señal, (b) la cola de histidina y (c) la porción de pro-carboxipeptidasa B. Así, respecto a la presencia de dicha secuencia enlazante de nucleótidos, puede insertarse aminoácidos adicionales, es decir una "secuencia espaciadora", en las uniones de dos elementos funcionales cualquiera de la pre-proteína. Un ejemplo de esto es la secuencia espaciadora que consiste en un residuo de Serina y un residuo de Alanina en las posiciones de aminoácido 86 y 87 en el Id. de Sec. Nº: 3 e Id. de Sec. Nº: 4. Son preferibles en la pre-proteína de la invención las secuencias espaciadoras que consisten en no más de cuatro residuos de aminoácidos. Más preferibles son las secuencias espaciadoras que consisten en ds residuos de aminoácido. La inserción de una secuencia enlazante de nucleótidos que codifica una secuencia espaciadora es "opcional" en el sentido que dicha inserción puede facilitar la unión de la secuencia de nucleótidos separada que codifica dos elementos funcionales, para formar una secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína o un precursor de la
misma.

Una cola de histidina es una secuencia de aminoácidos que contiene preferiblemente 6 histidinas consecutivas. Como las histidinas representan la porción esencial, existen otros aminoácidos adicionales comprendidos en la porción de cola de histidina. De forma importante, la cola de histidina utilizada en la presente invención no añade otro sitio de escisión de tripsina relevante a la proteína secretada. Así, el sitio de escisión de tripsina del zimógeno retiene el sitio de escisión preferible bajo las condiciones aplicadas durante la activación en columna de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada. Tras la activación en columna de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada, el propéptido permanece unido a la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados mediante la cola de histidina.

La purificación de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada se facilita mediante la cromatografía por afinidad a metales inmovilizados. Este método es una método ampliamente utilizado para purificar proteínas recombinantes que contienen una cola corta de afinidad que consiste en residuos de histidina (cola de Histidina). La cromatografía por afinidad a metales inmovilizados (descrita en Porath, J. et al., Nature 258 (1975) 598-599) está basada en la interacción entre un metal iónico de transición (Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+) inmovilizado sobre una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados y cadenas laterales de aminoácido específicos. La histidina es el aminoácido que presenta la interacción más fuerte con las matrices de iones metálicos inmovilizados, como grupos donadores de electrones en el anillo imidazol de la histidina forman fácilmente puentes de coordinación con el metal de transición inmovilizado. Los péptidos que contienen secuencias de residuos de histidina consecutivos se retienen de forma eficiente en la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados. Tras el lavado del material de la matriz, los péptidos que contienen las secuencias de histidina como la cola de histidina pueden eluirse fácilmente ajustando a un pH bajo (acídico) el tampón de columna o mediante la adición de imidazol libre.

El método para purificar proteínas con residuos de histidina se describió por primer vez en Hochuli, E. et al., J. Chromatogr. 411 (1987) 177-184. El documento describe un adsorbente de ácido nitrilotriacético (NTA) para la cromatografía de afinidad por los quelatos metálicos. La resina de NTA forma un quelato cuadridentado y es especialmente adecuado para iones metálicos con números de coordinación de seis, ya que dos valencias permanecen para la unión reversible de biopolímeros. Se ha purificado con éxito la dihidrofolato reductasa con una cola de Histidina con matrices Ni2+ -NTA como se describe en Hochuli, E. et al., Bio/Technology 6 (1988) 1321-1325. La eficiencia de purificación de este sistema depende de la longitud de la cola de histidina y el sistema de solvente. Mientras que el sistema trabaja eficientemente con proteínas con colas de His6 bajo condiciones desnaturalizantes, las proteínas con colas de His3 se purificaron eficientemente bajo condiciones fisiológicas. No obstante, las proteínas con colas de His6 pueden unirse a matrices Ni2+ -NTA bajo condiciones no desnaturalizantes en tampones bajos o altos en sal. Tras la unión, la proteína diana puede eluirse mediante un gradiente de imidazol desde 0,8 a 250 mM. Puede utilizarse un lavado con una concentración baja de imidazol (por ejemplo 0,8 mM) para reducir la unión inespecífica de proteínas huésped con histidinas.

En la presente invención, el paso de inmovilización se realiza preferiblemente en presencia de imidazol. Bajo estas condiciones, la unión inespecífica de otras proteínas que contienen histidina se ha visto reducida. Las concentraciones preferibles de imidazol respecto a esto están en el rango entre 0,01 mM y 1 mM.

Otro material que ha sido desarrollado para purificar proteínas con colas de histidina es TALON. Consiste en un carboxilmetilaspartato Co2+- (Co2+-CMA), que está acoplado a una resina en soporte sólido. TALON se ha descrito por presentar menos unión inespecífica de proteína que la resina de Ni2+-NTA, lo que resulta en una mayor pureza del producto de elución (Chaga, G. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (1999) 19-24; Chaga, G. et al., J. Chromatogr. A 864 (1999) 257-256).

Las colas de histidina se sitúan normalmente en cualquiera de los extremos N- o C-terminal de las proteínas recombinantes. La situación óptima de la cola es específica de cada proteína. La purificación utilizando colas de histidina se lleva a cabo con éxito utilizando una serie de sistemas de expresión que incluye a bacterias (Chen, B.P. y Hai, T., Gene 139(1994) 73-75; Rank, K.B. et al., Protein Expr. Purif. 22 (2001) 258-266), levaduras (Borsing, L. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240 (1997) 586-590; Kaslow, D.C. y Shiloach, J., Bio/Technology 12 (1994) 494-499), células de mamífero (Janknecht, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8972-8976; Janknecht, R. y Nordheim, A., Gene 121 (1992) 321-324), y células de insectos infectadas con baculovirus (Kuusinen, A. et al., Eur. J. Biochem. 233 (1995) 720-726; Schmidt, M. et al. Protein Expr. Purif. 12 (1998) 323-330). Más de 100 estructuras de proteínas con colas de histidina se han depositado en bases de datos de proteínas. Las proteínas con una cola de histidina pueden variar ligeramente en su mosaicidad y difracción al compararlas con la proteína nativa (Hakansson, K. et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 56 (2000) 924-926). En principio, no puede excluirse que la cola de histidina pueda interferir con la actividad de proteína (Wu, J. y Filutowicz, M., Acta Biochim. Pol. 46 (1999) 591-599), aunque el tamaño relativamente pequeño y la carga de la cola de histidina aseguran que la actividad de la proteína se vea raramente afectada. Si se mueve la cola de histidina al extremo opuesto (Halliwell, C.M. et al., Anal Biochem. 295 (2001) 257-261) o se lleva a cabo la purificación bajo condiciones desnaturalizantes, a menudo se resuelve este problema.

La pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada en el medio de cultivo se inmoviliza en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unirse a la cola de histidina. Por ejemplo, la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina puede adsorberse en los iones metálicos inmovilizados en una resina quelante de metales. Como se ha descrito antes, dichas resinas son bien conocidas por los expertos en la materia. Una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados preferible es material de cromatografía que está recubierto con níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). Respecto a esto, el experto en la materia conoce las PE 0 253 303, PE 0 282 042, y PE 1 069 131. Qiagen comercializa el sistema de purificación QIAexpress que puede utilizarse para el paso de inmovilización. La misma empresa proporciona un vector de expresión (pQE) que puede utilizarse para producir polipéptidos de fusión con colas de histidina. Respecto a esto, el experto en la materia también conoce la US 5.284.933 y US 5.310.663.

La purificación de la proteína con un centro de metal puede requerir métodos especialmente adaptados para la purificación debido a que el metal puede ser absorbido por el NTA. La purificación bajo condiciones anaeróbicas pueden también requerir métodos especialmente adaptados para la purificación debido a que el Ni2+-NTA se reduce. Sin embargo, la purificación de pre-proteínas con una cola de histidina es uno de los métodos más comúnmente utilizados.

La carboxipeptidasa B contiene Zn2+ como cofactor. Por esta razón, en lugar de utilizar Ni2+-NTA como matriz para la purificación cromatográfica, es preferible una matriz de afinidad quelante de metal cargada con Zn2+. Por lo tanto se evita cualquier sustitución accidental y no deseada del cofactor Zn2+ por Ni2+.

Una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados aún más preferible está, por lo tanto, cargada con adsorbente quelante de Zn2+- StreamlineTM (Amersham Biosciences) (es decir con iones Zn2+ inmovilizados en ella). Los adsorbentes StreamlineTM están basados en agarosa. La estructura macroporosa de las matrices de agarosa altamente entrecruzadas combina buena capacidad de unión para grandes moléculas, como proteínas, con gran estabilidad química y mecánica. La gran estabilidad mecánica es una propiedad importante de una matriz a utilizar en cromatografía de lecho expandido para reducir los efectos de desgaste cuando las partículas se mueven libremente en el lecho expandido. Las partículas hechas sólo de material orgánico poseen una densidad limitada y necesitarán tener unos diámetros muy largos para la gran velocidad de sedimentación necesaria. Dichos diámetros de partículas grandes resultan en grandes longitudes de ruta difusional, que provoca una considerable resistencia a la transferencia de masa, contrarrestando la productividad. Los adsorbentes StreamlineTM están por lo tanto basados en una partícula compuesta que contiene un material central inerte que es más denso que los materiales orgánicos. Dichas partículas pueden diseñarse de tal forma que su velocidad de sedimentación es alta también a un tamaño de partícula razonable.

La adsorción en lecho expandido es una operación de un único paso en el que las proteínas deseadas se purifican a partir de un particulado bruto que contiene materia prima sin la necesidad de separar por clarificación, concentración y purificación inicial. La expansión del lecho adsorbente crea una distancia entre las partículas adsorbentes, es decir aumento de nulidad (fracción de volumen nulo) en el lecho, que facilita el pase de células, restos celulares y otras partículas durante la aplicación del material bruto a la columna.

La matriz de afinidad adsorbente por los quelatos metálicos particulados (como el StreamlineTM) se expande y se equilibra al aplicar un flujo líquido ascendente en la columna. Se forma entonces un lecho fluido estable cuando las partículas adsorbentes quedan suspendidas en equilibrio debido al equilibrio entre la velocidad de sedimentación de las partículas y la velocidad de flujo líquido ascendente. El adaptador de columna se posiciona en la parte superior de la columna durante esta fase. Se aplica material bruto, no clarificado, es decir medio de cultivo que contiene la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada y el organismo huésped microbiano, al lecho expandido con el mismo flujo ascendente que el utilizado durante la expansión y equilibrado. La pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina se inmoviliza de modo que se una la cola de histidina al adsorbente mientras que los restos celulares, las células, particulados y contaminantes pasen sin ningún impedimento. El material unido de forma débil, como las células residuales, restos celulares y otro tipo de material particulado, se elimina con lavados del lecho expandido utilizando un flujo líquido ascendente. Cuando el material débilmente retenido ha sido lavado del lecho, la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina capturada se activa mediante una escisión en columna con tripsina, mientras se mantiene el modo de flujo ascendente. La carboxi-peptidasa B se libera y puede lavarse de la columna. El flujo que pasa contiene la proteína diana, en mayor concentración, clarificada, parcialmente purificada, y lista para una posterior purificación mediante cromatografía de lecho empaquetado.

El uso preferible de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, es decir el adsorbente quelante StreamlineTM (Amersham Biosciences) y el ajuste, optimización y realización de la cromatografía de lecho expandido se detalla en profundidad en el manual de Pharmacia Biotech "expanded bed adsorption, principles and methods" (ISBN 91-630-5519-8). Las instrucciones generales para regenerar la columna también se describen allí.

Se puede utilizar un gran número de organismos huésped microbianos en la presente invención. El principal requisito es que el organismo huésped microbiano esté diseñado y cultivado de forma que secrete la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina en el medio de cultivo. En una realización preferible el organismo huésped microbiano en un organismo procariota. Respecto a esto, el experto en la materia conoce los sistemas bacterianos disponibles comercialmente para la expresión y secreción recombinante que están basados en bacterias como E. coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp. En una realización más preferible el organismo huésped microbiano es un organismo microbiano eucariota. Muy preferible es una especie de levadura. En una realización aún más preferible, el organismo microbiano es una cepa de levadura metilotrófica.

Así, en otra realización de la invención, la pro-carboxipeptidasa B de rata con colas de histidina se produce mediante métodos recombinantes utilizando levadura metilotrófica como un organismo huésped no animal. Las levaduras metilotróficas poseen las rutas bioquímicas necesarias para la utilización de metanol y se clasifican en cuatro géneros, basados en la morfología celular y características de crecimiento: Hansenula, Pichia, Candida, y Torulopsis. Los sistemas de huésped metilotróficos más altamente desarrollados utilizan Pichia pastoris (Komagataella pastoris) y Hansenula polymorpha (Pichia angusta).

La expresión de proteínas heterólogas en levaduras se describe en US 5.618.676, US 5.854.018, US 5.856.123, y US 5.919.651.

Las levaduras producen una serie de proteínas que se sintetizan intracelularmente pero poseen una función fuera de la célula. Estas proteínas extracelulares son referidas como proteínas secretadas. Inicialmente las proteínas secretadas se expresan dentro de la célula en forma de un precursor o una pre-proteína que contiene un péptido señal N-terminal que asegura la dirección efectiva del producto expresado en la ruta de secreción de la célula, a través de la membrana del retículo endoplasmático. El péptido señal se escinde generalmente del producto deseado durante la translocación. La escisión se efectúa proteolíticamente mediante una peptidasa señal. Una sub-secuencia particular de aminoácidos del péptido señal es reconocida y escindida por la peptidasa señal. Esta sub-secuencia es referida como el sitio de escisión de la peptidasa señal. Una vez dentro de la ruta de secreción, la proteína se transporta al aparato de Golgi. Desde el aparato de Golgi las proteínas se distribuyen a la membrana plasmática, los lisosomas y las vesículas secretoras.

Las proteínas secretadas se enfrentan a diferentes condiciones ambientales opuestas a las proteínas intracelulares. Parte de los procesos de la ruta de secreción es estabilizar la maduración de las proteínas extracelulares. Por lo tanto, las pre-proteínas que han pasado a través de la ruta de secreción de las levaduras sufren un procesamiento postraduccional específico. Por ejemplo, el procesamiento puede comprender la generación de puentes disulfuro para formar entrecruzamientos intramoleculares. Además, ciertos aminoácidos de la proteína pueden glicosilarse.

Se han sugerido varias aproximaciones para la expresión y secreción en levaduras de las proteínas heterólogas en levaduras. La PE 0 116 201 describe un proceso mediante el cual las proteínas heterólogas en levaduras se transforman mediante un vector de expresión portador de un DNA que codifica la proteína deseada, un péptido señal y un péptido que actúa como sitio de escisión de la peptidasa. Se prepara un cultivo del organismo transformado y se hace crecer, y se recupera la proteína del medio de cultivo. Para utilizar en las células de las levaduras se ha encontrado un péptido señal adecuado para ser el péptido señal de factor alfa de Saccharomyces cerevisiae (US 4.870.008).

Durante la secreción, la enzima KEX-2 de levadura es la peptidasa señal que reconoce una secuencia Lisina-Arginina como su sitio de escisión en la pre-proteína. La KEX-2 rompe en la unión de la secuencia de la proteína deseada. Como resultado, el producto génico deseado se libera y se libra de las porciones líder, es decir el péptido señal de la pre-proteína. La endoproteasa KEX-2 se caracterizó originariamente en la levadura Saccharomyces en la que procesa de forma específica el precursor del tipo de apareamiento de factor alfa y un factor asesino (Julius, D., et al., Cell 37 (1984) 1075-1089). Las especies de levaduras metilotróficas como Pichia pastoris comparten la proteasa de tipo KEX-2 (papel y función similar) con Saccharomyces cerevisiae (Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096).

Un ejemplo de especie de levadura metilotrófica bien establecida descrita como un huésped para niveles altos de expresión de proteínas recombinantes es Pichia pastoris (US 4.683.293, US 4.808.537, US 4.812.405, US 4.818.700, US 4.837.148, US 4.855.231, US 4.857.467, US 4.879.231, US 4.882.279, US 4.885.242, US 4.895.800, US 4.929.555, US 5.002.876, US 5.004.688, US 5.032.516, US 5.122.465, US 5.135.868, US 5.166.329, WO 00/56903). En ausencia de glucosa, Pichia pastoris utiliza metanol como fuente de carbono que a su vez es un distintivo de un organismo metilotrófico. El promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) proporcionado en el Id. de Sec. Nº: 5 controla la expresión de la alcohol oxidasa, que cataliza el primer paso en el metabolismo del metanol. Normalmente, el 30% de la proteína soluble total en las células inducidas con metanol es la alcohol oxidasa. Varios vectores de expresión de Pichia son portadores del promotor AOX1 y utilizan metanol para inducir altos niveles de expresión de las proteínas heterólogas deseadas. Las construcciones de expresión también se integran en el genoma de Pichia pastoris, creando un huésped transformado y genéticamente estable.

Utilizando un vector de expresión que codifica una pre-proteína heteróloga que comprende un péptido señal o un péptido señal con un sitio de escisión de peptidasa señal, y una proteína deseada, la cepa de levadura metilotrófica como las cepas de Pichia pastoris pueden manipularse para secretar el producto deseado en el medio de cultivo desde donde la proteína secretada puede purificarse. Puede ser ventajoso producir una secuencia de nucleótidos que codifique la pre-proteína que posea un uso de codón sustancialmente diferente.

Respecto al polipéptido de la pro-carboxipeptidasa B codificado, la secuencia de nucleótidos comprendida en el Id. de Sec. Nº: 3 es diferente de la secuencia de nucleótidos anteriormente publicada como Id. de Sec. Nº: 1 debido a la degeneración del código genético. La secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº: 3 desde la posición 286 a la posición 1497 codifica el mismo polipéptido que la secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº: 1 desde la posición 40 a la posición 1248. No obstante, el Id. de Sec. Nº: 3 incorpora dos intercambios de aminoácido, es decir Lys201Asn y Arg329Asp. Estos cambios de aminoácido también están documentados en WO 96/23064. El término "código degenerado" indica que en el código genético un aminoácido particular puede estar codificado por dos o más codones diferentes. La degeneración ocurre gracias al hecho que de los 64 tripletes de bases posibles, 3 se utilizan para codificar las señales de finalización, y las otras 61 codifican los 20 aminoácidos diferentes.

Así, se pueden seleccionar codones para aumentar la frecuencia en la que la expresión de la pre-proteína ocurre en un huésped de expresión particular de levadura de acuerdo con la frecuencia en que los codones particulares se utilizan en el huésped. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína, sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada, incluye la producción de transcritos de RNA que poseen propiedades más deseables, como una vida media superior, que los transcritos producidos desde la secuencia natural. La secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº: 3 es un ejemplo para una secuencia codificante que se ha optimizado de esta
manera.

Utilizando un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína que es competente para la expresión, es decir unida de forma operativa a un promotor o elemento promotor y a un terminador o elemento terminador, así como a las secuencias necesarias para una traducción eficiente, el organismo huésped se transforma con el vector y se seleccionan los transformantes. Los transformantes se analizan entonces respecto al rendimiento de la proteína recombinante secretada en el medio de cultivo. Los transformantes que secretan las mayores cantidades de proteína recombinante se seleccionan. Así, los transformantes que secretan las mayores cantidades de pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina se seleccionan.

Por una parte, el rendimiento de expresión es dependiente de la localización adecuada del producto deseado, es decir, dirigir la pre-proteína a la ruta de secreción de la levadura mediante el péptido señal. Un ejemplo para un péptido señal es el péptido señal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae codificado en el Id. de Sec. Nº : 3 desde la posición 1 a la posición 255. Por otro lado, el rendimiento de expresión puede aumentarse al aumentar la dosis del gen que codifica el producto deseado, es decir se amplifica el número de copias de la construcción de expresión en el organismo huésped. Una forma de lograr esto es mediante transformación múltiple de un vector de expresión que codifica el producto deseado. Otra vía es introducir el gen que codifica el producto deseado en el organismo huésped utilizando un primer y un segundo vector de expresión, en el que el segundo vector de expresión está basado en un marcador seleccionable que difiere del marcador seleccionable utilizado en el primer vector de expresión. El segundo vector de expresión que codifica el mismo producto deseado puede incluso introducirse cuando el organismo huésped ya es portador de múltiples copias de un primer vector de expresión (US 5.324.639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201; Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096).

La secreción de la pro-carboxipeptidasa B dirige la proteína recombinante al espacio extracitoplásmico desde el que se difunde hacia el medio de cultivo. Así, en una realización preferible de la invención la levadura metilotrófica se cultiva en un cultivo líquido y secreta pro-carboxipeptidasa B en el medio de cultivo líquido, es decir el medio de cultivo líquido. Esto permite una separación muy eficiente de la biomasa de la levadura de la proteína recombinante utilizando, por ejemplo técnicas de cromatografía de lecho expandido. Como resultado, la pro-carboxipeptidasa B purificada de la levadura puede librarse de forma eficiente de otras actividades enzimáticas no deseadas.

Respecto al vector con el que, en una realización preferible, la cepa de levadura metilotrófica se transforma, el experto en la materia conoce perfectamente los vectores de expresión que permiten la construcción de polipéptidos de fusión que contienen la denominada "cola de histidina" o "cola de (poli)histidina". En la pre-proteína preferible de la presente invención, se fusiona una cola de histidina al extremo N-terminal del polipéptido de pro-carboxipeptidasa B. La cola de histidina en total comprende seis residuos consecutivos de histidina. El experto en la materia se dará cuenta respecto a esto que el aminoácido N-terminal del polipéptido de la procarboxipeptidasa B es también una histidina. Así, en la secuencia de nucleótidos anotada que codifica la pre-proteína existe un solapamiento de las secuencias codificantes fusionadas en el que el codón de la última histidina de la cola de histidina también representa la primera histidina de la porción pro-carboxipeptidasa B.

Tras la activación, es decir la escisión tríptica de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada, la porción de propéptido con cola de histidina permanece unido a la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados. La carboxipeptidasa B activada se libera y se separa en el paso (f) de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados. Así, se separa la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados de la fase líquida al mismo tiempo que se separa el propéptido de la enzima carboxipeptidasa B. Al utilizar este método se evita la unión no covalente del propéptido a la molécula de carboxipeptidasa B.

Es preferible que el vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en la pro-carboxipeptidasa B de rata que está fusionada en el extremo N-terminal a una cola de histidina (cola de histidina) y un péptido señal, en el que se puede insertar opcionalmente una secuencia espaciadora entre la cola de histidina y el péptido señal. Es más preferible que la secuencia de aminoácidos de la pro-carboxipeptidasa B de rata sea la secuencia de aminoácidos desde la posición 14 a la posición 415 en el Id. de Sec. Nº: 3. También es preferible que el péptido señal contenga un sitio de escisión de peptidasa señal que está localizado al lado de la cola de histidina o al lado de la secuencia espaciadora. Es muy preferible que la secuencia de aminoácidos de la pre-proteína expresada sea la secuencia de aminoácidos en el Id. de Sec. Nº: 4. Es aún más preferible que la secuencia de nucleótidos que codifica la pro-carboxipeptidasa B de rata sea la secuencia de nucleótidos desde la posición 286 a la posición 1497 en el Id. de Sec. Nº: 3. Es aún más preferible que la secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína sea la secuencia de nucleótidos en el Id. de Sec. Nº: 3. Es aún más preferible que la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína esté ligada de forma operativa a un promotor o elemento promotor.

Para permitir la trascripción de la secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína es preferible que la secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína esté ligada de forma operativa a un promotor o elemento promotor. Es muy preferible un promotor o elemento promotor de Pichia pastoris, incluso más preferible es el promotor AOX1 de Pichia pastoris que se proporciona en el Id. de Sec. Nº: 5. También es preferible que además la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína esté ligada de forma operativa con una secuencia terminador que dirige el final de la trascripción en la cepa de levadura metilotrófica. Es muy preferible un terminador de Pichia pastoris, incluso más preferible es el terminador AOX1 de Pichia pastoris.

Además es preferible que el vector sea un plásmido que pueda replicarse como un episoma en la cepa de levadura metilotrófica. Así, el plásmido preferible es una molécula de ácido nucleico circular que comprende un origen de replicación que dirige la replicación del episoma en la cepa de levadura metilotrófica. Además, el plásmido comprende un marcador que puede seleccionarse que se expresa en la cepa de levadura metilotrófica, de forma que el marcador que puede seleccionarse permite seleccionar la presencia del plásmido en la cepa de levadura metilotrófica. Un marcador que puede seleccionarse muy preferible es un gen de resistencia a la zeocina^{TM}, que es la forma nativa o una variante de ingeniería genética del gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt, D., et al., Nucleic acids Res. 18 (1990) 4009; Carmels, T., et al., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314). Otro marcador muy preferible que puede seleccionarse confiere resistencia frente a los antibióticos amino-glucósidos como la higromicina y G418 (Southern, P.J., y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982) 327-341). Un ejemplo de tal marcador que puede seleccionarse es un gen de la fosfotransferasa de aminoglucósidos.

Además es preferible que un cromosoma artificial que pueda replicarse en la cepa de levadura metilotrófica contenga el vector. Así, el cromosoma artificial preferible es una molécula de ácido nucleico lineal que comprende al menos un origen de replicación, un centrómero y telómeros terminales, de forma que controla la replicación, integridad y distribución mitótica/meiótica del cromosoma artificial en la cepa de levadura metilotrófica. Además, el vector que contiene el cromosoma artificial comprende un marcador que puede seleccionarse que se expresa en la cepa de levadura metilotrófica y que permite seleccionar la presencia del vector en el cromosoma artificial que se replica en la cepa de levadura metilotrófica. Un marcador que puede seleccionarse muy preferible es un gen de resistencia a la zeocina^{TM}, que está en forma nativa o es una variante artificial del gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus. Otro marcador que puede seleccionarse muy preferible confiere resistencia frente a los antibióticos aminoglucósidos como la higromicina y G418. Un ejemplo de tal marcador que puede seleccionarse es un gen de la fosfotransferasa de aminoglucósidos.

Es incluso más preferible que un cromosoma de la cepa de levadura metilotrófica contenga el vector. Es muy preferible que el vector posea una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia cromosómica, permitiendo así la integración del vector en al cromosoma huésped mediante recombinación específica de lugar. Respecto a esto, el locus AOX1 de Pichia pastoris es incluso más preferible como locus para la integración en el cromosoma huésped mediante recombinación específica de lugar. También es muy preferible que el vector comprenda un marcador que puede seleccionarse que se exprese en la cepa de levadura metilotrófica y que permita seleccionar la presencia del vector en la cepa de levadura metilotrófica. Un marcador que puede seleccionarse muy preferible es un gen de resistencia a la zeocina^{TM}, que está en forma nativa o es una variante artificial del gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus. Otro marcador que puede seleccionarse muy preferible confiere resistencia frente a los antibióticos aminoglucósidos como la Higromicina y G418. Un ejemplo de tal marcador que puede seleccionarse es un gen de la fosfotransferasa de aminoglucósidos.

El experto en la material estará al corriente del hecho de que el rendimiento de la pro-carboxipeptidasa B con cola de histidinas secretada que puede obtenerse del medio de cultivo, como el medio de cultivo líquido, puede aumentarse cuando el número de copias de la secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína aumenta. Así, el rendimiento de moléculas de pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretadas que pueden obtenerse a partir del medio de cultivo puede aumentarse si se aumenta el número de copias del vector en el genoma de la cepa de levadura metilotrófica. Por ejemplo, puede aumentarse el número de copias del vector sometiendo la cepa de levadura metilotrófica a repetidas transformaciones del vector y repetidas rondas de selección utilizando concentraciones del agente de selección frente al cual confiere resistencia el marcador selectivo que comprende el vector (US 5.324.639; Thill, G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), págs. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201).

El experto en la materia también es consciente del hecho que pueden realizarse repetidas transformaciones utilizando más de un vector. Por ejemplo, pueden realizarse repetidas transformaciones utilizando un primer y un segundo vector, codificando el primer y el segundo vector la misma pre-proteína, estando el primer y el segundo vector la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína ligada de forma operativa a un promotor o elemento promotor, expresándose la misma pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina, y confiriendo el primer y el segundo vector resistencia a un primer y un segundo marcador de selección.

Un ejemplo de un primer marcador de selección es el gen Sh ble, que es el gen de resistencia a zeocina^{TM} (Drocourt, D., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 4009; Carmels, T., et al., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314). La proteína codificada por el gen Sh ble se une a zeocina^{TM} de forma estequiométrica y con una elevada afinidad. La unión de la zeocina^{TM} inhibe su actividad tóxica, por lo que se seleccionan los transformantes que contienen el gen Sh ble. Un experto en la materia conocerá que al aumentar la concentración de zeocina^{TM} como agente de selección en el medio se selecciona un aumento en el número de copias del vector que expresa el gen Sh ble. Por lo tanto es ventajoso utilizar un vector con el gen Sh ble como marcador de selección para generar mediante transformación repetida transformantes múltiples de la cepa de levadura metilotrófica que contiene múltiples copias del vector. Además es ventajoso que las transformaciones se repitan y la selección de transformantes incluso más resistentes se repitan hasta que ya no se obtengan más aumentos en el nivel de resistencia a la zeocina^{TM} en la cepa de levadura metilotrófica transformada o ya no sea posible aumentar más la concentración de zeocina^{TM} en el medio de selección.

En el caso de utilizar un primer y un segundo vector, un ejemplo del segundo marcador de selección es la resistencia frente a antibióticos aminoglucósidos (Southern, P.J., y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982) 327-341) como G418. Así, un segundo vector de ejemplo expresa un gen de resistencia que confiere resistencia frente a G418. Por ejemplo, se conocen varias fosfotransferasas de aminoglucósidos que confieren resistencia a los antibióticos aminoglucósidos (van Treeck, U., et al., Antimicrob Agents Chemother. 19 (1981) 371-380; Beck, E., et al., Gene 19 (1982) 327-336). La enzima fosfotransferasa de aminoglucósidos I (APH-I) tiene la capacidad de inactivar el antibiótico G418 y es un marcador establecido que puede seleccionarse en levaduras (Chen, X.J., Fukuhara, H., Gene, Vol. 69 (1988) 181-192).

Así, con el propósito de aumentar más la dosis de la secuencia de nucleótidos que codifican la pre-proteína, el segundo vector se utiliza de forma ventajosa en nuevas rondas de transformación y selección, siendo en este caso un agente de selección preferible G418 y utilizándose para la transformación la cepa de levadura metilotrófica transformada con el primer vector.

Además es preferible que la cepa de levadura metilotrófica sea de la especie Hansenula, Pichia, Candida o Torulopsis. En una realización muy preferible de la invención, la cepa de levadura metilotrófica se selecciona de entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii y Torulopsis glabrata.

Las cepas de Pichia pastoris incluso más preferibles están depositadas en la American Type Culture Collection (ATCC) con los números de registro 201178, 201949, 204162, 204163, 204164, 204165, 204414, 204415, 204416, 204417, 20864, 28485, 34614, 60372, 66390, 66391, 66392, 66393, 66394, 66395, 76273, 76274 y 90925.

Incluso más preferible es la cepa de levadura metilotrófica de Pichia pastoris con el número de registro de la American Type Culture Collection 76273 o un derivado de la misma.

Las cepas de Hansenula polymorpha incluso más preferibles están depositadas en la American Type Culture Collection con los números de registro 14754, 200499, 200500, 200501, 200502, 200503, 200504, 200505, 200506, 200507, 200508, 200509, 200510, 200511, 200512, 200513, 200838, 200839, 201322, 204205, 22023, 26012, 34438, 36669, 38626, 44954, 44955, 46059, 48180, 58401, 62809, 64209, 66057, 76722, 76723, 76760, 90438, 96694, 96695, MYA-335, MYA-336, MYA-337, MYA-338, MYA-339 y MYA-340.

Las cepas de Candida boidinii incluso más preferibles están depositadas en la American Type Culture Collection con los números de registro 18810, 201209, 20432, 26175, 32195, 32929, 36351, 38256, 38257, 44637, 46498, 48180, 56294, 56507, 56897, 60364, 62807, 90439, 90441, 96315 y 96926.

Las cepas de Torulopsis glabrata incluso más preferibles están depositadas en la American Type Culture Collection con los números de registro 15126, 15545, 2001, 22019, 26512, 28226, 28290, 32312, 32554, 32936, 34147, 34449, 36909, 38326, 4135, 46433, 48435, 58561, 66032, 750 y 90030.

Otra realización de la invención es una cepa transformada de Pichia pastoris con un cromosoma que contiene un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en la pro-carboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal a una cola de histidinas y un péptido señal, ligado de forma operativa con el promotor AOX1 de Pichia pastoris de acuerdo con el Id. de Sec. Nº: 5 o un elemento promotor del mismo, siendo la secuencia de nucleótidos que codifica la preproteína la secuencia de nucleótidos del Id. de Sec. Nº: 3. También es preferible que el vector comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique una pre-proteína que consista en la pro-carboxipeptidasa B de rata fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, pudiendo estar opcionalmente insertada entre la cola de histidinas y el péptido señal una secuencia espaciadora.

Otra realización más de la invención es una proteína con actividad carboxipeptidasa B que está sustancialmente libre del propéptido de la carboxipeptidasa B, que puede obtenerse mediante el método de acuerdo con la invención. El término "sustancialmente libre" indica que el propéptido está por debajo de los niveles de detección utilizando métodos de detección de espectroscopía de masas. Un análisis de ejemplo se describe en el Ejemplo 8.

Como se indica en el Ejemplo 8, la proteína purificada con actividad carboxipeptidasa B predominantemente carece de una tirosina en C-terminal (Tyr497 en el Id. de Sec. Nº:4). Sólo una pequeña fracción de proteína purificada aún contiene este aminoácido. Por lo tanto, de acuerdo con la invención la proteína con actividad carboxipeptidasa B que está sustancialmente libre de propéptido de la carboxipeptidasa B posee la secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. Nº:4 desde la posición 191 a la posición 496.

El ejemplo 9 ilustra que tras el primer paso de purificación de acuerdo con el Ejemplo 7 las fracciones agrupadas recogidas contienen producto en cantidades casi idénticas de producto con y sin la tirosina en C-terminal. Durante el proceso los residuos de tirosina en C-terminal se eliminan progresivamente. Tras el segundo paso de purificación cromatográfica la especie proteica predominante carece de la tirosina en C-terminal casi completamente. Una posible explicación de ello pero que no se ha comprobado es que el organismo huésped utilizado para la expresión y secreción del producto produce una proteína con actividad carboxipeptidasa Y. Es conocido que la carboxipeptidasa Y de Saccharomyces cerevisiae es capaz de escindir aminoácidos en C-terminal con una especificidad amplia. Aunque se sabe que la carboxipeptidasa Y es una enzima vacuolar (Kato, M. et al. Eur. J. Biochem 270 (2003) 4587-4593), las células de levaduras lisadas podrían hacer qe aumente notablemente la actividad carboxipeptidasa Y en el medio de fermentación. Sin embargo, como la eliminación de la tirosina en C-terminal deja invariables las propiedades generales enzimáticas de la proteína con actividad carboxipeptidasa B y ya que no se eliminan más aminoácidos del extremo C-terminal, la inactivación o separación adicional de la hipotética actividad carboxipeptidasa Y no se considera necesaria.

Otra realización de la invención es la utilización de una proteína con actividad carboxipeptidasa B que está sustancialmente libre de propéptido de la carboxipeptidasa B de acuerdo con la invención, para la escisión proteolítica de un enlace peptídico. Es preferible que la escisión de un enlace peptídico se efectúe catalizando la hidrólisis de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina de la posición C-terminal en un polipéptido. Además es preferible que la secuencia de aminoácidos de la proteína con actividad carboxipeptidasa B posea la secuencia de aminoácidos de la posición 191 a la posición 496 del Id. de Sec. Nº: 4.

Es muy preferible la utilización de una proteína con actividad carboxipeptidasa B que está sustancialmente libre de propéptido de la carboxipeptidasa B de acuerdo con la invención y que se caracteriza por escindir un enlace peptídico de un precursor de la insulina. Estos procesos se han descrito, por ejemplo, en la PE 0 264 250 y PE 0 195 691. De acuerdo con ello, un precursor de la insulina se escinde proteolíticamente mediante tripsina y una proteína con actividad carboxipeptidasa B. Es incluso más preferible que la proteína con actividad carboxipeptidasa B catalice la escisión hidrolítica de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina de la posición C-terminal del producto de proteolisis tríptica del precursor de insulina.

Otra realización de la invención es una solución de reactivo que contiene una proteína con actividad carboxi-peptidasa B que está sustancialmente libre de propéptido de la carboxipeptidasa B, de acuerdo con la invención. Es preferible que la proteína con actividad carboxipeptidasa B en la solución de reactivo sea capaz de catalizar la escisión hidrolítica de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina de la posición C-terminal de un péptido o polipéptido. Es incluso más preferible que la secuencia de aminoácidos de la proteína con actividad carboxipeptidasa B en la solución de reactivo sea la secuencia de aminoácidos de la posición 191 a la posición 496 del Id. de Sec. Nº: 4. Una solución de reactivo que contiene una proteína con actividad carboxipeptidasa B normalmente es una solución acuosa que además contiene sales tamponadoras. Sin embargo, son posibles otros componentes y son bien conocidos para el experto en la materia. Un ejemplo de componentes adicional es la tripsina.

Los siguientes ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras se proporcionan para mejorar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se fija en las reivindicaciones. Se entenderá que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del espíritu de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1 Representación gráfica del vector pCPB-1. El vector contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una preproteína, que es una proteína de fusión que comprende el péptido señal del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae (indicado "factor-alfa-SS") y la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina. La secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína está bajo el control trascripcional del promotor AOX1 (indicado "Promotor AOX1") y el terminador AOX1 (indicado "AOX1-TT"). El vector confiere resistencia frente a la zeocina®.

Figura 2a Diagrama que representa un ejemplo del resultado de un análisis mediante espectrometría de masas de una preparación de carboxipeptidasa B de acuerdo con el Ejemplo 8. El eje x indica los valores m/z (m = masa iónica; z = carga iónica). Los asteriscos indican los picos que corresponden a los respectivos dímeros de carboxipeptidasa B.

Figura 2b Diagrama que representa un ejemplo del resultado de un análisis mediante espectrometría de masas de una preparación de carboxipeptidasa B de acuerdo con el Ejemplo 8. El eje x indica el peso molecular iónico en [Da].

Figura 3 La sección (a) muestra los hipotéticos valores m/z y los picos que corresponden al propéptido de la carboxipeptidasa B, también denominado el péptido de 12.132 Da. La sección (b) muestra el correspondiente recorte del espectro de acuerdo con la Figura 1a. Los ejes x de las secciones (a) y (b) están alineados y tienen una escala idéntica.

Figura 4 La sección (a) muestra los hipotéticos valores m/z y los picos que corresponden al propéptido de la carboxipeptidasa B, también denominado el péptido de 10.746 Da. La sección (b) muestra el correspondiente recorte del espectro de acuerdo con la Figura 1a. Los ejes x de las secciones (a) y (b) están alineados y tienen una escala idéntica.

Figura 5 Recorte de un espectro obtenido con la preparación de enzima de acuerdo con el Ejemplo 8.

Figura 6 Diagrama que representa el resultado del análisis de espectrometría de masas de una preparación de carboxipeptidasa B. El análisis se realizó sobre una muestra tomada tras la cromatografía de lecho expandido, como se explica en el Ejemplo 9. El eje x de la sección (a) indica los valores m/z (m = masa iónica; z = carga iónica). El eje x de la sección (b) indica el peso molecular del ion en [Da].

Figura 7 Diagrama que representa el resultado del análisis de espectrometría de masas de una preparación de carboxipeptidasa B. El análisis se realizó sobre una muestra tomada tras la Q-Sepharose ff^{TM}, como se explica en el Ejemplo 9. El eje x de la sección (a) indica los valores m/z (m = masa iónica; z = carga iónica). El eje x de la sección (b) indica el peso molecular del ion en [Da].

Figura 8 Diagrama que representa el resultado del análisis de espectrometría de masas de una preparación de carboxipeptidasa B. El análisis se realizó sobre el producto final del procedimiento de purificación, como se explica en el Ejemplo 9. El eje x de la sección (a) indica los valores m/z (m = masa iónica; z = carga iónica). El eje x de la sección (b) indica el peso molecular del ion en [Da].

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Ejemplo 1 Síntesis del gen que codifica la pre-proteína

Las técnicas de DNA se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^{a} edición, CSHL Press, 2001). Los reactivos para el trabajo molecular se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones de los suministradores.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un gen artificial de la pre-pro-carboxipeptidasa B de acuerdo con Id. de Sec. Nº: 3 se sintetizó de novo. Las porciones de la secuencia de nucleótidos se sintetizaron como 24 oligonucleótidos de DNA de cadena sencilla con una longitud entre 54 y 90 nucleótidos. Los oligonucleótidos de cadena sencilla representan una forma alternante de porciones solapantes de la cadena conductora y la cadena retardada de Id. de Sec. Nº: 3. Cada oligonucleótido se diseñó de forma que los extremos 5' y 3' se solapen con el oligonucleótido colindante. Como excepción, los oligonucleótidos que representan los extremos 5' y 3' de Id. de Sec. Nº: 3 sólo se solapan con los extremos 3' y 5' de los fragmentos colindantes, respectivamente. Las secuencias de los solapamientos se escogen de forma que se evite la hibridación inespecífica durante la reacción de hibridación. Los oligonucleótidos que representan los extremos 5' y 3' de Id. de Sec. Nº: 3 contienen de forma adicional secuencias enlazantes con sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción, para facilitar los siguientes pasos de clonaje molecular, como la inserción de la secuencia codificante artificial dentro de los vectores de expresión. Un sitio de restricción preferible para los oligonucleótidos que representan el extremo 5' de Id. de Sec. Nº: 3 es XhoI. Un sitio de restricción preferible para los oligonucleótidos que representan el extremo 3' de Id. de Sec. Nº: 3 es NotI.

Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con Id. de Sec. Nº: 3 se sintetizó secuencialmente mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). En principio, los dos primeros oligonucleótidos que representan porciones adyacentes y parcialmente solapadas de la cadena conductora y la retardada se añadieron a la mezcla de reacción de PCR. Tras varios ciclos de PCR, se obtuvo un fragmento contiguo de doble cadena que representa ambas porciones de la cadena conductora y la retardada. El fragmento de doble cadena se purificó opcionalmente, se mezcló con el oligonucleótido consecutivo adyacente y parcialmente solapado de cadena sencilla y se sometió a otra ronda de PCR.

Utilizando el procedimiento descrito antes, se sintetizaron de forma independiente tres fragmentos más grandes de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con Id. de Sec. Nº: 3. Cada fragmento puede estar presente en una mezcla de productos derivados. Por lo tanto, los fragmentos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa y se identificaron por su tamaño. Se escindieron los bloques de agarosa que contienen los fragmentos deseados y los fragmentos de DNA se aislaron utilizando el equipo de extracción en gel QiaQuick (Qiagen). También son posibles otros métodos de extracción.

De los tres fragmentos, el segundo fragmento en su extremo 5' posee una secuencia que se solapa con el extremo 3' del primer fragmento, y en el que el segundo fragmento en su extremo 3' posee una secuencia que se solapa con el extremo 5' del tercer fragmento. La secuencia completa de acuerdo con Id. de Sec. Nº: 3 se sintetizó de nuevo secuencialmente. Los tres fragmentos se unieron en una mezcla de reacción de PCR. Las temperaturas de hibridación se escogieron teniendo en cuenta la secuencia solapante con el punto de fusión más bajo. Se realizaron cinco ciclos de PCR, seguidos de la adición de un par adicional de cebadores complementarios al extremo 5' y al extremo 3' del producto de longitud completa deseado. Utilizando una temperatura de hibridación escogida respecto a la temperatura de hibridación del cebador recién añadido con la menor temperatura de fusión, se realizaron otros 25 ciclos de PCR y se obtuvo el fragmento de longitud completa que comprende la secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº: 3. El fragmento de longitud completa (es decir, la pre-proteína de longitud completa que codifica el DNA que incluye las secuencias enlazantes con sitios de escisión de endonucleasas de restricción) se insertó en un vector y se propagó en un organismo huésped transformado. Un organismo huésped preferible con el fin de propagación es E. coli.

La secuencia de nucleótidos del DNA de longitud completa que comprende la secuencia que codifica la pre-proteína de Id. de Sec. Nº: 4 se verificó mediante secuenciación. El producto final de longitud completa se amplificó mediante PCR.

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Ejemplo 2 Construcción de vectores, transformación y expresión

Para pasos adicionales respecto a la construcción de vectores de expresión, transformación y expresión de la pre-proteína y secreción de pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina en un medio de cultivo, se aplican los métodos sugeridos y descritos en los manuales de Invitrogen "Pichia Expression Kit" Versión M 011102 25-0043, "pPICZ A, B, y C" Versión D 110801 25-0148, "pPICZa A, B, y C" Versión E 010302 25-0150, y "pPIC9K" Versión E 030402 25-0106. También se hace referencia a otros vectores, cepas de levadura y medios mencionados. Los métodos básicos de biología molecular se aplican como se describe en Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, CSHL Press, 2001.

Como resultado, se obtienen varios vectores en los que cada uno comprende un casete de expresión capaz de expresar la pre-proteína de acuerdo con Id. de Sec. Nº: 4 en cepas de levadura metilotrófica. Una cepa de levadura preferible es una cepa de Pichia pastoris. Cada vector además comprende, entre otros elementos genéticos, un origen de replicación capaz de replicar el vector de forma autónoma en células de levadura metilotrófica. Además los vectores se diseñaron de forma que permiten la integración en el genoma de la célula huésped. Otro elemento genético en cada vector es otro casete de expresión que expresa un marcador de selección.

Se realizaron repeticiones de las transformaciones de la cepa huésped Pichia pastoris para aumentar el rendimiento de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada.

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Ejemplo 3 Cuantificación de proteínas

La cuantificación de la carboxipeptidasa B purificada de rata se realizó mediante la medición de la extinción a 280 nm utilizando cubetas de 1 cm de ancho. La concentración se determinó de acuerdo con la siguiente fórmula:

1

Ejemplo 4 Actividad de la proteína

La actividad de la carboxipeptidasa B se determinó utilizando hipuril-L-Arginina 1,5 M (Bachem G-2265) en Tris pH 7,8 100 mM a 25ºC y cubetas de 0,5 cm de ancho.

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Ejemplo 5 Análisis de HPLC

La activación de la carboxipeptidasa B a partir de pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina se monitorizó utilizando HPLC (cromatografía líquida de alta presión) y medios de separación por filtración en gel (Superdex 75 HR 10/30, Amersham Biosciences). El tampón de cromatografía fue de Tris 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,3 M. la tasa de flujo fue de 0,5 ml/min.

Los tiempos de retención de la carboxipeptidasa B y de la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina difieren sin ambigüedades (1,2 ml) facilitando su reconocimiento en los perfiles de elución.

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Ejemplo 6 Fermentación

Se siguieron los métodos generales de acuerdo con las descripciones en la literatura (Higgins, D.R., Cregg, J.M. (1998) Pichia Protocols. en: Methods in Molecular Biology Vol. 103, el documento entero pero en particular las págs. 107-120; Stratton, J., Chiruvolu, V., Meagher, M. (1998) High cell-density fermentation. en: Pichia Fermentation Guidelines, Invitrogen).

Se realizaron los pre-cultivos de la cepa de Pichia pastoris transformada capaz de expresar la pre-proteína de Id. de Sec. Nº: 4 a 30ºC en medio para levadura con base de nitrógeno sin aminoácidos (DIFCO). El pre-cultivo se utilizó para inocular un medio de fermentación. El medio de fermentación contiene minerales, es decir, H_{3}PO_{4}, CaSO_{4} x 2 H_{2}O, K_{2}SO_{4}, MgSO_{4} x 7 H_{2}O, KOH, NaOH, los elementos traza CuSO_{4} x 5 H_{2}O, KJ, MnSO_{4} x H_{2}O, Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, H_{3}BO_{4}, ZnCl_{2}, CoCl_{2} x 6 H_{2}O, y FeSO_{4} x 7 H_{2}O. El medio de fermentación también contiene biotina y glicerol. El pH se ajustó a pH 5,0 y se mantuvo a ese valor utilizando NH_{3} que al mismo tiempo sirvió como fuente de nitrógeno.

Cuando el glicerol como primera fuente de carbono se agota, se añade metanol, induciendo de esta manera la expresión de la pre-proteína dirigida por el promotor AOX1.

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Ejemplo 7 Purificación

La fracción de la masa líquida del caldo de fermentación se ajustó al 5-13% al añadir un tampón que contiene Tris pH 7,5 20 mM, NaCl 1M e imidazol 1 mM. El caldo de fermentación diluido se pasó a través de una columna con una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados. La matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados preferible fue quelante StreamlineTM cargado con Zn2+- (Amersham Biosciences). La carga de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados en la columna con pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina se realizó utilizando la técnica de cromatografía de lecho expandido. Bajo las condiciones descritas anteriormente, la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina en el caldo de fermentación diluido se une, es decir se adsorbe a la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados.

Tras el paso de unión, la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados en la columna (aún expandida) se lavó con un tampón de lavado que contenía Tris pH 7,5 20 mM, NaCl 1 M, e imidazol 1 mM. Se realizaron varios (al menos dos) pasos de lavado bajo condiciones que permiten a la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina permanecer unida a la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados. El primer paso de lavado se realizó utilizando el tampón de lavado que contiene adicionalmente un 11% [volumen/volumen] de glicerol. Cualquier paso de lavado adicional se realizó utilizando el tampón de lavado sin glicerol.

La activación de la carboxipeptidasa B se efectuó mediante la escisión es columna con tripsina. Tras el paso de lavado, se bombeó un tampón (Tris pH 7,5 20 mM, NaCl 1M e imidazol 1 mM) con tripsina (13-20 U/ml) a través de la columna, en la que el tampón que ha salido de la columna se recircula de nuevo en la columna. Tras 150-300 min., se retira el tampón que ahora contiene adicionalmente la carboxipeptidasa B activada. Se lava la columna (de dos a tres pasos de lavado) con un flujo ascendente utilizando tampón de lavado, en el que se recoge el flujo pasante. El tampón que ahora contiene adicionalmente la carboxipeptidasa B activada y el flujo pasante de los pasos de lavado se unifica. La actividad tríptica se detiene al añadir clorhidrato de benzamidinio a una concentración final de 1 mM.

El tampón que contiene carboxipeptidasa B activada y tripsina se filtró para eliminar las últimas trazas de biomasa residual. El tampón filtrado se sometió a diafiltración mediante filtración de flujo tangencial. Se utilizó un tampón de diálisis que contenía Tris pH 8,3 a una concentración de 60-100 mM, y otro que contiene clorhidrato de benzamidinio 1 mM, ZnCl_{2} 0,1 mM. La diafiltración resultó en un intercambio de tampón en el que estaba presente la carboxipeptidasa activada.

El posterior paso fue la cromatografía en Q-Sepharose ff^{TM}. El tampón en el que estaba presente la carboxipeptidasa activada se cargó en una columna que contenía Q-Sepharose ff^{TM}. Se aplicó un paso de lavado utilizando Tris pH 8,3 60-100 mM, clorhidrato de benzamidinio 1 mM, ZnCl_{2} 0,1 mM. Tras el paso de lavado, la columna se eluyó al aplicar un gradiente hasta NaCl 125 mM. Se recogieron las fracciones. Se unieron las fracciones que contienen carboxipeptidasa B.

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Ejemplo 8 Espectrometría de masas de carboxipeptidasa B purificada

La carboxipeptidasa B se purificó de acuerdo con el Ejemplo 7. Antes de la espectrometría de masas la preparación de enzima se desaló utilizando un dispositivo de micro HPLC (ABI-120A) equipado con un muestreador automático (Gilson 234). La columna utilizada fue Vydac protein C4 cartridge (núm. de catálogo de Vydac 214GD51) junto con la funda apropiada. Se cargó en la columna una alícuota de la preparación de enzima que contiene 50 \mug-100 \mug de proteína y se eluyó utilizando un gradiente de tampón de elución A (3.5% de HCOOH de calidad "pro análisis" [ácido fórmico] en agua de calidad para HPLC [Baker]) y tampón B (80% acetonitrilo de calidad para HPLC, 5% HCOOH de calidad para HPLC en agua de calidad para HPLC [Baker]). Se aplicó el gradiente eluyendo durante los primeros 5 min. con 5% de tampón B, 95% de Tampón A y luego 3 minutos más con 100% de tampón B. Durante la HPLC la temperatura de la columna se mantuvo a 35ºC. La enzima se detectó a una longitud de onda de 280 nm. Se encontró que la enzima ese eluyó entre t_{5 \ min} y t_{8 \ min}. El pico de proteína se recogió (desde 30 mAU-40 mAU; pico máximo >800 mAU).

La espectrometría de masas se realizó en un Q-Tof 2^{TM} (Waters Micromass, Manchester, UK) equipado con una interfície de nanopulverización. El dispositivo fue capaz de seleccionar iones de péptido o proteína con una m/z de 200-2000 e iones de proteína con una m/z de 800-2000. Los capilares de pulverización eran de Proxeon ("Mediano", Núm. de catálogo ES 387). Se tomaron mediciones utilizando parámetros variables respecto al voltaje capilar, voltaje en cono, y perfiles de EM. Los parámetros se ajustaron para cada muestra a analizar respecto al rango de medición. Se utilizó para el análisis el programa MassLynx 4.0^{TM} con el paquete MaxEnt 1^{TM} (Waters). Al utilizar el procesamiento de Máxima Entropía aplicada a los datos de espectrometría de masas, MaxEnt 1^{TM} ayuda a potenciar el espectro complejo permitiendo la deconvolución de espectro solapante cargado de forma múltiple producido por el análisis de mezclas de proteína. Las masas indicadas por debajo de 10.000 Da son monoisotópicas, las masas indicadas como igual o por encima de 10.000 Da son masas medias.

Gracias a la espectrometría de masas se ha encontrado que la preparación de enzima, es decir, la carboxipeptidasa B purificada da lugar a esencialmente tres picos de masa diferentes: (1) el pico principal [denominado A en la Figura 2b] que corresponde a una masa (media) de 35.015 Da que indica la carboxipeptidasa B carente de la tirosina C-terminal; (2) también se encontró un pico menor que corresponde a una masa de alrededor de 70.026 Da (no mostrado) y que indica el dímero de carboxipeptidasa B que carece de la tirosina C-terminal; (3) un pico menor que corresponde a una masa de alrededor de 35.176 Da que indica la carboxi-peptidasa B incluyendo la tirosina C-terminal.

En teoría, los picos que corresponden al propéptido con colas de histidina refleja los 12.132 Da del péptido de 105 aminoácidos generado de la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 4 mediante (a) la escisión de la peptidasa señal KEX-2 entre la Arg85 y la Ser86 y (b) la escisión de la tripsina entre la Arg190 y la Ala191. También pueden postularse los fragmentos del propéptido con colas de histidina. Estos incluyen el péptido de 10.746 Da que comprende la secuencia desde la Ser86 a la Arg178 y el péptido de 1.404 Da que comprende la secuencia desde la Asn179 a la Arg190. Las secciones "(a)" de las Figuras 3 y 4 indican los picos hipotéticos que uno puede esperar si los péptidos de 12.132 Da y 10.746 Da están presentes en la preparación de enzima. Las secciones "(b)" representan recortes aumentados del espectro como el mostrado en la Figura 2a. Se puede observar que en las posiciones de los picos hipotéticos no se detecta nada en el espectro de la preparación de enzima. Además, la Figura 5 muestra un recorte de un espectro obtenido de la preparación de enzima. El péptido hipotético de 1.404 Da se esperaba que diera lugar a picos con una m/z = 702, 8 ([M+2H]2+) y m/z = 468, 9 ([M+3H]3+). No obstante, no existen picos visibles que indiquen la presencia del propéptido.

Además, se determinó la secuencia de aminoácido N-terminal del polipéptido que corresponde con el pico principal. Se encontró que los 15 aminoácidos en N-terminal eran "ASGHSYTKYNNWETI". Estos son los mismos que los aminoácidos 191 a 205 de Id. de Sec. Nº: 4, es decir, representan el N-terminal de la enzima carboxipeptidasa B activada.

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Ejemplo 9 Eliminación de la tirosina en C-terminal

La carboxipeptidasa B se purificó de acuerdo con el Ejemplo 7. Se tomó una muestra de las fracciones que contienen carboxipeptidasa B agrupadas y de las soluciones de lavado. Se realizó una espectrometría de masas de acuerdo con el Ejemplo 8. Los resultados se muestran en la Figura 6. La Figura 7 ilustra los resultados de una muestra tras la cromatografía en Q-sepharose ff^{TM} y la Figura 8 ilustra el producto final. Queda claro que al inicio alrededor de un 50% o más de la carboxipeptidasa B contiene la tirosina en C-terminal. Tras la segunda cromatografía la especie proteica predominante ya carece de la tirosina en C-terminal. Sin embargo, la degradación en C-terminal quedó restringida a la tirosina en C-terminal.

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<120> Carboxipeptidasa B recombinante y su purificación

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<130> 22225

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 1248

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<212> DNA

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<213> Rattus norvegicus

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<223> Carboxipeptidasa B1 (Cpbl) de Rattus norvegicus, secuencia que codifica la pre-pro-enzima de acuerdo con Clauser, E. et al (1988) J. Biol. Chem. 263 (33), 17837-17845

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1248)

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<223> Secuencia codificante que incluye el codón de parada

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<220>

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<221> Péptido señal

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<222> (1)..(39)

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<223> Porción que codifica para el péptido señal

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (40)..(1248)

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<223> Porción que codifica la pro-carboxipeptidasa B (zimógeno)

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (325)..(1248)

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<223> Fragmento que codifica la carboxipeptidasa B activa

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<400> 1

2

3

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<210> 2

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<211> 415

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 2

4

5

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<210> 3

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<211> 1497

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial que codifica el polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B, optimizado para su expresión en levadura metilotrófica.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1497)

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<223> Secuencia codificante que incluye los codones de parada.

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<220>

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<221> Péptido señal

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<222> (1)..(255)

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<223> Secuencia que codifica una secuencia del péptido señal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae que contiene una secuencia señal de escisión de peptidasa.

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (256)..(261)

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<223> Secuencia que codifica un espaciador.

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (262)..(288)

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<223> Secuencia que codifica la cola de histidinas RGSHHHHHH.

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (286)..(570)

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<223> Secuencia que codifica el propéptido de la carboxi-peptidasa B de rata; el primer codón también forma parte de la cola de histidinas. La secuencia incorpora los cambios de aminoácido Lys14Asn y Arg142Asp documentados en la WO 96/23064.

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<220>

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<221> Característica miscelánea

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<222> (571)..(1497)

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<223> Secuencia que codifica la porción enzima de la carboxipeptidasa B de rata

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<400> 3

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6

7

8

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<210> 4

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<211> 497

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial que codifica el polipéptido de la pre-pro-carboxipeptidasa B, optimizada para su expresión en levadura metilotrófica.

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<400> 4

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9

10

11

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<210> 5

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<211> 938

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<212> DNA

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<213> Pichia pastoris

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<220>

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<221> promotor

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<222> (1)..(938)

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<223> Promotor AOX de Pichia pastoris

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<400> 5

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12

13

Claims (7)

1. Un método para producir una proteína con actividad carboxipeptidasa B, que comprende los pasos de

(a) proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una pre-proteína que consiste en una procarboxipeptidasa B de rata que está fusionada en N-terminal con una cola de histidinas y un péptido señal, siendo el péptido señal la secuencia N-terminal de la pre-proteína, e insertándose opcionalmente entre la cola de histidinas y el péptido señal o entre la cola de histidinas y la carboxipeptidasa B de rata una secuencia espaciadora;

(b) transformar un organismo microbiano huésped con el vector;

(c) cultivar el organismo microbiano huésped en un medio de cultivo que contiene nutrientes y una fuente de carbono, expresando el organismo microbiano huésped la pre-proteína y secretándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina al medio de cultivo;

(d) inmovilizar la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina secretada al medio de cultivo del paso (c) en una matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados capaz de unir la cola de histidinas, y lavar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, inmovilizándose la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina;

(e) incubar la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados con la pro-carboxipeptidasa B con colas de histidina inmovilizada del paso (d) en un tampón que contiene tripsina, escindiéndose así proteolíticamente la porción pro-carboxipeptidasa B y liberándose la proteína con actividad carboxipeptidasa B a la fase líquida, mientras la porción propéptido con colas de histidina está inmovilizada;

(f) separar la fase líquida que contiene la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la matriz de afinidad por los quelatos metálicos particulados, en la que está inmovilizada la porción propéptido con colas de histidina; y

(g) purificar la proteína con actividad carboxipeptidasa B de la fase líquida del paso (f).

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2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que la cepa microbiana huésped es una cepa de levadura metilotrófica.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza por que la secuencia de aminoácidos de la pro-carboxipeptidasa B de rata es la secuencia de aminoácidos desde la posición 14 a la posición 415 del Id. de Sec. Nº: 3.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por que el péptido señal contiene una secuencia señal de escisión de una peptidasa que está localizada adyacente a la cola de histidinas o adyacente a la secuencia espaciadora.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por que la secuencia de aminoácidos de la pre-proteína expresada es la secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. Nº: 4.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza por que la secuencia de nucleótidos que codifica la pro-carboxipeptidasa B de rata es la secuencia de nucleótidos desde la posición 286 a la posición 1.497 del Id. de Sec. Nº: 3.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza por que la secuencia de nucleótidos que codifica la pre-proteína es la secuencia de nucleótidos del Id. de Sec. Nº: 3.