ES2337694T3 - Toxina de adenilato ciclasa recombinante de bordetella que induce las respuestas de la celula t contra los antigenos tumorales. - Google Patents

Toxina de adenilato ciclasa recombinante de bordetella que induce las respuestas de la celula t contra los antigenos tumorales. Download PDF

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende una CyaA de Bordetella o un fragmento de esta, y un péptido que corresponde a un péptido correspondiente a un antígeno de melanoma o un epitope derivado de un antígeno de melanoma, en donde dicho péptido es un epitope HLA-A*0201 derivado de la tirosinasa que es la región 369-377 de la tirosinasa o YMDGTMSQV.

Description

Toxina de adenilato ciclasa recombinante de Bordetella que induce las respuestas de la célula T contra los antígenos tumorales.
La invención se relaciona con una toxina adenilato ciclasa recombinante de Bordetella que induce las respuestas de la célula T contra los antígenos tumorales.
Antecedentes de la invención
Esta invención se relaciona con las composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer.
En muchos modelos de tumores de animales, las células T juegan un papel importante en el rechazo del tumor. Una variedad de antígenos tumorales reconocidos por células T CD4+ o CD8+ reactivas al tumor, han sido identificados en ambos tumores humano y murino (1). Los linfocitos citotóxicos CD8+ (CTL) son de particular interés ya que estas células reconocen específicamente las células tumorales y las matan. Por lo tanto, un objetivo importante en inmunoterapia del cáncer es activar los CTL específicos del tumor.
El estudio de antígenos reconocidos por la células T CD8+ en melanoma humano ha identificado varios epitopes del tumor restringido por MHC que corresponden a péptidos no-mutados o mutados, derivados de diferentes proteínas propias (2). Varios de estos péptidos se derivan de proteínas de diferenciación no-mutadas tales como tirosinasa, Melan-A/Mart-1, y gp100. Estas proteínas se expresan específicamente en la mayoría de los melanocitos/melanomas, y de esta manera, los epitopes restringidos de HLA se presentan por la mayoría de las células de melanoma a partir de pacientes que expresan las moléculas de HLA relevantes. Por lo tanto, estos antígenos podrían ser los objetivos de las estrategias de inmunoterapia que se basan en la inmunización contra epitopes tumorales.
Otros antígenos expresados en las células tumorales también han sido descritos, por ejemplo, un péptido derivado de una secuencia de intrón del gen que codifica la N-acetilglucosaminil-transferasa V (GnT-V) (3). Este intrón se expresa específicamente en las células de melanoma y está presente en aproximadamente el 50% de las células de melanoma.
Varios protocolos de vacunación diseñados para inducir las respuestas CTL anti-tumor específicas contra estos epitopes, se han desarrollado, incluyendo protocolos que utilizan péptido libre en IFA (4), vectores virales recombinantes (5-7), o células dendríticas (8-11). La aplicación de estas estrategias para la vacunación humana sigue siendo limitada debido a la potencial toxicidad de los adyuvantes, sesgo hacia la respuesta contra el péptido epitópico derivado del vector, o porque son "que requieren mano de obra" (DC manipulado in vitro).
Previamente, los plásmidos recombinantes han sido utilizados para la expresión de adenilato ciclasa (cyaA) de Bordetella sp. y un ADN heterólogo insertado en un sito permisivo de CyaA. Estos plásmidos y las proteínas recombinantes resultantes han sido útiles para inducir respuestas inmunes. Las respuestas inmunes obtenidas han sido en los linfocitos T CD8+ con los complejos de histocompatibilidad principales de la clase I, así como en los linfocitos T CD4+ con los complejos de histocompatibilidad de la clase II principal. (Ver U.S. Patent Nos. 5,503,829, 5,679,784, y 5,935,580). Más específicamente, las proteínas recombinantes se pueden transferir a las células que expresan CD11b, tales como células dendríticas. (Ver European Patent Application EP1 188 446 A1, "Proteinaceous vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells", and WO/2122169 A2 "Vectors for Molecule Delivery to CD11 b Expressing Cells", corresponding to U.S. Patent Application 387,486, and European Patent Application No. 03291486.3, "Modified Bordetella Adenylate Cyclase Comprising or Lacking CD11b/CD18 Interaction Domain and Uses thereof"). Ver también, El-Azami-El-Idrissi, et al., 2003, Interaction of Bordetella pertussis Adenylate Cyclase with CD11b/CD18, J. Biol. Chem., vol. 278, pp. 38514-21.
Existe una necesidad en el oficio, para nuevos tratamientos antitumor que permiten la orientación específica a las células inmunes y las respuestas de la célula T. Estas nuevas estrategias deberían dar lugar a la amplificación específica de respuestas inmunes contra los antígenos tumorales.
Breve resumen de la invención
Esta invención ayuda al cumplimiento de las necesidades en el oficio, proporcionando las proteínas de CyaA recombinantes que inducen respuestas inmunes. Estas respuestas se pueden dirigir a los antígenos tumorales.
La invención proporciona métodos novedosos para el tratamiento del cáncer y una composición inmunogénica como se define en las reivindicaciones.
La aplicación proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende una adenilato ciclasa (CyaA) de Bordetella y un péptido que corresponde a un antígeno del tumor.
La aplicación revela un método para tratar un paciente con cáncer que comprende (1) la administración de una composición inmunogénica al paciente, en donde la composición inmunogénica comprende una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende una CyaA de Bordetella o un fragmento específico de esta, y un péptido que corresponde a un antígeno del tumor, y (2) inducir una respuesta inmune, tal como una respuesta de la célula T, en el paciente.
La aplicación describe un método para tratar un paciente con cáncer que comprende (1) la administración de una composición inmunogénica al paciente, en donde la composición inmunogénica comprende un vector que expresa una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende CyaA de Bordetella o un fragmento específico de esta, y un péptido que corresponde a un antígeno del tumor, y (2) inducir una respuesta de la célula T en el paciente.
La respuesta de la célula T es una respuesta CTL o una respuesta auxiliar T o un CTL y una respuesta auxiliar T.
De acuerdo con la invención, el tumor es un melanoma.
De acuerdo con la invención, el antígeno del tumor es un epitope HLA*0201.
En la invención se abarca la proteína recombinante CyaA-E5-Tyr.
En otra modalidad de la invención, la proteína recombinante comprende más de un antígeno del tumor. En una modalidad particular, al menos un antígeno del tumor es diferente del otro(s).
El antígeno del tumor se localiza en cualquier sitio permisivo de CyaA.
En una modalidad de la invención CyaA es del Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, o Bordetella bronchiseptica. En una modalidad preferida CyaA es del Bordetella pertussis.
La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende al menos un fragmento específico de la proteína adenilato ciclasa que se reconoce como un ligando en las células humanas y animales, y al menos un epitope como se define en las reivindicaciones. En la proteína recombinante de la composición inmunogénica CyaA y el antígeno tumoral puede ser tanto genéticamente fusionado como unido químicamente (WO 02/22169).
La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende CyaA de Bordetella, o un fragmento específico de esta, y un péptido que corresponde a un antígeno que comprende el epitope Tyr, como se define en las reivindicaciones. En una modalidad particular, dicha secuencia se incluye en el plásmido depositado en C.N.C.M., Paris, France, el 31 de Mayo, 2001 bajo el número de acceso I-2679.
Otra modalidad de la invención, es un vector que expresa una proteína recombinante que comprende la CyaA de Bordetella, o un fragmento específico de esta, y un péptido que corresponde a un antígeno que comprende el epitope Tyr, como se define en las reivindicaciones. En una modalidad particular, dicho vector ha sido depositado en C.N.C.M., Paris, France, el 31 de Mayo, 2001, bajo el número de acceso I-2679.
La invención además abarca una célula huésped, que expresa una proteína recombinante que comprende la CyaA de Bordetella, o un fragmento específico de esta, y un péptido que corresponde a un antígeno que comprende el epitope Tyr, como se define en las reivindicaciones. En una modalidad particular, la célula huésped expresa el vector que ha sido depositado en C.N.C.M., Paris, France, el 31 de Mayo, 2001, bajo el número de acceso I-2679.
Descripción de los dibujos
Esta invención será descrita con referencia a los dibujos en los cuales:
Figura 1 representa la inducción in vivo de las respuestas CTL por CyaA recombinante que lleva epitopes de melanoma restringidos HLA*0201. Los ratones-HHD recibieron inyecciones i.p. en los días 0, 21 y 42 de ya sea 50 \mug de toxina CyaA control (\bullet, s) o toxinas recombinantes CyaA que llevan epitopes de melanoma (\blacksquare, h) (A, CyaA-Tyr; B, CyaA-GnT-V) en la presencia de 1 mg de alumbre. Siete días después de la última inyección, células del bazo de ratones inmunes se estimularon in vitro con el péptido para cebado pTyr (A), o pGnT-V (B) en la presencia de células del bazo singénicas irradiadas. La actividad citotóxica de estas células efectoras se midió en las células diana RMA-S-HHD marcadas con ^{51}Cr, pulsadas con el respectivo péptido (\bullet, \blacksquare) o incubadas con medio solo (s, h). Los datos representan valores medios de duplicados (SD < 10%). Los cuadrantes representan el número de ratones positivos contra el número de ratones probados, y las curvas representan valores media t SD, de los ratones con respuesta por grupo de los tres experimentos.
Figura 2 representa la inducción de respuestas CTL específicos al melanoma por CyaA recombinante que lleva epitopes de melanoma utilizando diferentes rutas de inmunización. Paneles A y B: ratones HHD se inmunizaron i.p. dos veces en los días 0 y 21 con 50 \mug de CyaA del tipo salvaje (\bullet, s) o CyaA-Tyr recombinante (\blacksquare, h) en la presencia (A) o en la ausencia de 1 mg de alumbre (B). Paneles C y E: ratones HHD se inmunizaron por una inyección i.v. con 50 \mug de CyaA control del tipo salvaje (\bullet, s) o CyaA-Tyr recombinante (\blacksquare, h) (C) o CyaA-GnT-V recombinante (\blacksquare, h) (E) en la ausencia de un adyuvante. Paneles D y F: ratones HHD se inmunizaron por una inyección i.v. con 50 \mug de CyaA-E5 destoxificada control (\bullet, s) o CyaA-E5-Tyr destoxificada recombinante (\blacksquare, h) (D) o CyaA-E5-GnTV recombinante (\blacksquare, h) (F) en la ausencia de adyuvante. Siete días después de la última inyección, las células del bazo de los ratones inmunes se estimularon in vitro con péptidos para cebado en la presencia de células del bazo singénicas irradiadas. La actividad citotóxica se midió en células diana RMA-S-HHD marcadas con ^{51}Cr, pulsadas con el péptido para cebado (\bullet, \blacksquare) o incubadas con medio solo (s, h). Los resultados muestran datos acumulativos de 2-4 experimentos. Los cuadrantes representan el número de ratones positivos contra el número de ratones probados, y las curvas representan valores medios \pm SD de ratones con respuesta por grupo. Los resultados obtenidos después de la inmunización con CyaA tóxica y destoxificada no son estadísticamente diferentes utilizando una prueba t.
Figura 3 demuestra que la inmunización de ratones con CyaA-Tyr induce una duradera actividad de CTL de memoria específica. Los ratones HHD se inmunizaron i.p. dos veces en los días 0 y 21 con 50 \mug de CyaA del tipo salvaje (\bullet, s) o CyaA-Tyr recombinante (\blacksquare, h) en la presencia de 1 mg de alumbre. Tres meses (A) o cinco meses (B) después de la última inyección, los bazos se retiraron y la actividad de CTL específica se midió después de la estimulación in vitro como se describe en la Figura 1 sobre células diana RMAS-HHD marcadas con ^{51}Cr, pulsadas con el péptido pTyr (\bullet, \blacksquare) o incubadas con medio solo (s, h). Los cuadrantes representan el número de ratones positivos contra el número de ratones probados. Las curvas representan valores medios \pm SD de ratones con respuesta por grupo de un experimento.
Figura 4 representa la estimulación de clones de CTL específicos humanos mediante células (DC) dendríticas humanas incubadas con CyaA-E5-Tyr recombinante o CyaA-E5-GnT-V. Debido a la citotoxicidad de CyaA, solamente CyaA recombinante destoxificada se probó in vitro. DC HLA*0201+ inmaduras derivadas de monocitos humanos se incubaron con CyaA-E5 (s), CyaA-E5-Tyr recombinante (\bullet) (A), CyaA-E5-GnT-V (\bullet) (B) o con el péptido antigénico pertinente (m), y se utilizaron como APC (Células Que presentan Antígenos) para estimular el clon CTL anti-tirosinasa IVS-B (A) o clon CTL anti-GnT-V CMU 579 6/3 (B). La secreción de IFN-\gamma por los clones CTL se evaluó mediante un ELISA. Los resultados se expresaron como la concentración media de IFN-\gamma liberado en los sobrenadantes de pozos duplicados y son representativos de tres experimentos independientes. Los errores estándar de la media se indican.
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Descripción detallada de las modalidades preferidas
Un nuevo enfoque para la activación de CTL, recientemente se ha desarrollado basándose en las toxinas bacterianas capaces de entregar epitopes antigénicos a través de la membrana celular plasmática en el citosol, cuando sea apropiado el tratamiento y la interacción con moléculas MHC- clase I puede ocurrir. La toxina adenilato ciclasa (CyaA) de Bordetella pertussis (Glasser, P., et al. 1988 Bordetella pertussis adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J. Exp. Clin. Med., 13 Supp.: 239) tiene la capacidad de entregar su dominio catalítico en el citosol de las células eucariotas (12). La entrega de un epitope de la célula T CD8+ insertado en el dominio catalítico de CyaA da lugar al tratamiento intracelular y la presentación del epitope por moléculas MHC-clase I en la superficie de células que presentan antígeno (13). Por otra parte, CyaA específicamente se une a la integrina \alpha_{M}\beta_{2} (CD11b/CD18) (14), y de esta manera, los objetivos de la subpoblación CD11b+ DC, que de manera muy eficiente induce las respuestas inmunes primarias (15). Por lo tanto, la inmunización de ratones con una toxina CyaA recombinante que lleva un epitope viral conduce a la inducción de fuertes respuestas de CTL y a una protección total contra un desafío viral letal (16).
Por otra parte, las toxinas de CyaA, que llevan un único epitope de CTL también pueden estimular la inmunidad antitumor terapéutica y protectora eficiente en ratones (17). Es importante destacar que los toxoides de CyaA genéticamente destoxificada, retienen la propiedad para inducir inmunidad antitumoral y antiviral protectora (17, 18). De tal manera, la CyaA parece ser un vector de no-replicación seguro y eficiente, para inducir respuestas inmunes específicas en ratones. Sin embargo, en el punto de vista de la elaboración de inmunoterapia del cáncer utilizando CyaA, es de particular importancia demostrar que los epitopes tumorales humanos insertados en CyaA se procesan eficientemente y se presentan en asociación con moléculas MHC humanas.
En una modalidad de la invención, se construyó una CyaA recombinante que lleva un epitope de melanoma restringido HLA*0201 derivado de la tirosinasa como se define en las reivindicaciones. La potencia de esta CyaA recombinante para inducir in vivo respuestas CTL restringidas HLA*0201 contra los epitopes insertados y la capacidad de entregar estos epitopes a las células humanas que presentan antígenos se demuestra en los Ejemplos a continuación.
Se descubrió que la CyaA de Bordetella pertussis es capaz de entregar los epitopes de la célula T CD8+ en el citosol de las células dendríticas CD11b+ a partir de su interacción específica con la integrina \alpha_{M}\beta_{2} (CD11b/CD18). Esta entrega dá lugar al tratamiento intracelular ya la presentación por moléculas MHC-clase I de los epitopes de la célula T CD8+ insertados en CyaA. De hecho, las toxinas de CyaA que llevan un único epitope de CTL pueden inducir la inmunidad antitumor terapéutica y protectora eficiente en ratones.
Además se descubrió que estas proteínas de CyaA recombinantes inducen fuertes respuestas de CTL anti-melanoma en ratones transgénicos HLA*0201, aún después de una única inmunización intravenosa sin adyuvante. Las respuestas son de larga duración, se detectan hasta cinco meses después de la última inyección.
Por último, se descubrió que las células dendríticas humanas, tratadas con la CyaA recombinante, procesan y eficientemente presentan epitopes de melanoma con los clones de CTL humanos. Las proteínas de CyaA recombinantes de la invención demostraron que los epitopes tumorales insertados en CyaA se procesan eficientemente y se presentan en asociación con moléculas MHC humanas. Por lo tanto, CyaA es capaz de activar el CTL antitumoral en humanos, y es un factor novedoso para la inmunoterapia del cáncer.
Como se utiliza aquí, el término "composición inmunogénica" se relaciona con una composición que conduce a una respuesta inmunológica y que se asocia con tratamientos terapéuticos, tales como tratamientos contra el cáncer.
Como se utiliza aquí, los términos "CyaA de Bordetella" o "adenilato ciclasa de Bordetella" abarca la CyaA o un fragmento de esta, ya sea modificado o no. Las modificaciones pueden incluir la deleción de algunos aminoácidos internos. Por ejemplo, CyaA puede no tener actividad catalítica, pero el enlace específico con el receptor CD11b/CD18 y el proceso de translocación del dominio catalítico no se afectan. El término "Bordetella" se refiere a la proteína adenilato ciclasa de un patógeno de la especie Bordetella. Dicho patógeno puede ser Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, o Bordetella bronchiseptica.
Como se utiliza aquí, el término "antígeno" o "epitope" se refiere a un péptido incluyendo una proteína que puede inducir una respuesta inmune. El término "heterólogo" se refiere a la naturaleza del antígeno unido a la proteína CyaA, que incluye una respuesta inmune diferente de aquella de la proteína CyaA. Un antígeno o epitope heterólogo se puede fusionar a CyaA o unir químicamente a CyaA, por ejemplo.
Como se utiliza aquí, el término "inmunógeno" se refiere a una característica de una proteína como ser capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero, particularmente en un humano. El término "respuesta inmune" se refiere a muchos efectos que se causan por células del sistema inmune, tales como, por ejemplo, una respuesta CTL y/o una respuesta auxiliar T, y en el contexto de la invención incluye, pero no se limita a, activación de linfocitos citotóxicos de tumor específico. Como se utiliza aquí, el término "inmunoterapia" se refiere a una terapia para una enfermedad que depende de una respuesta inmune.
Además de la proteína recombinante o el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención puede incluir adyuvantes y excipientes para permitir un aumento y modulación en la respuesta inmune. Estos adyuvantes son diversos en la naturaleza. Pueden comprender, por ejemplo, liposomas, fases oleosas, por ejemplo, los adyuvantes del tipo Freund, que generalmente se utilizan en la forma de una emulsión con una fase acuosa, o, más comúnmente, puede comprender sales inorgánicas insolubles en agua. Estas sales inorgánicas pueden comprender, por ejemplo, hidróxido de aluminio, sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio, o cloruro de calcio. El hidróxido de aluminio (Al(OH)_{3}) es el adyuvante más comúnmente utilizado.
La invención también abarca las proteínas recombinantes que comprenden CyaA de Bordetella, o un fragmento específico de esta, y el péptido pTyr (YMDGTMSQV). Dicho péptido puede comprender secuencias flanqueadoras extendidas. El péptido pTyr corresponde al epitope restringido HLA*0201 del melanoma de la región 369-377 de tirosinasa. Tener en cuenta que los aminoácidos 369-377 de tirosinasa humana son YMNGTMSQV. Sin embargo, el residuo Asn en la posición 371 (N) de la tirosinasa es desaminado naturalmente a Asp (D) de este epitope en la célula viva ya que el epitope verdadero reconocido por los clones de CTL in vivo son la reconocida secuencia YMDGTMSQV.
Por otra parte, un epitope con una secuencia flanqueadora extendida del aminoácido 360-385 de Tirosinasa humana es SSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPI (con N371 convertido a D).
En una modalidad preferida de la invención la proteína recombinante es CyaA-Tyr. El término "CyaA-Tyr" significa una proteína de fusión que comprende el epitope del melanoma de la tirosinasa de HLA*0201, que se puede preparar como se describe en el Ejemplo 1, y CyaA de Bordetella pertussis. El término "CyaA-E5-Tyr" se refiere a la proteína CyaA-Tyr en la cual la actividad catalítica de CyaA ha sido genéticamente inactivada. Ver, por ejemplo, el Ejemplo 1.
En incluso otra modalidad de la invención, la proteína recombinante entre CyaA y pTyr se modifica a partir de la estructura de CyaA-Tyr o CyaA-E5-Tyr. La modificación de estas modalidades puede incluir la adición de regiones flanqueadoras, que son secuencias de aminoácidos que rodean los péptidos que comprenden la proteína recombinante, y se describieron anteriormente. Estas secuencias flanqueadoras pueden potenciar el procedimiento. Las secuencias flanqueadoras también pueden ser secuencias que no rodean naturalmente el antígeno pero que específicamente potencian el procedimiento del antígeno mediante células que previenen el antígeno.
En aún otra modalidad, las proteínas recombinantes se pueden modificar incluyendo múltiples epitopes heterólogos idénticos. Por ejemplo, el epitope Tyr, como se describe anteriormente, u otros epitopes de melanoma.
En otras modalidades de la invención, la proteína recombinante puede incluir al menos un fragmento específico de la proteína adenilato ciclasa, tales como, pero no se limitan a, CyaA la región 373-1706 o la región 1166-1281 que se reconocen como un ligando en las células humanas y animales, tales como, células dendríticas, y al menos un epitope específico para un antígeno del cáncer, tal como, pero no se limita a pTyr.
En otra modalidad de la invención, la proteína recombinante pueden incluir epitopes múltiples de uno o más antígenos tumorales.
Otra modalidad de la invención incluye sitios permisivos de CyaA que difieren de aquellos proporcionados en los Ejemplos. La porción antígeno de la proteína recombinante utilizada en las pruebas de la invención pueden ser localizadas en cualquier sitio permisivo de la proteína adenilato ciclasa CyaA WO 93/21324. Además, la invención abarca pruebas y composiciones inmunogénicas que utilizan solamente fragmentos de la adenilato ciclasa CyaA en la proteína recombinante (ver EPO 03/291486.3).
Como se utiliza aquí, el término "sito permisivo" se relaciona con un sitio dónde el péptido heterólogo se puede insertar sin afectar sustancialmente las propiedades funcionales deseadas de la toxina adenilato ciclasa, i.e. sin afectar los dominios necesarios para el enlace específico al receptor CD11b/CD18 y ventajosamente sin afectar el proceso de translocación del dominio catalítico.
Los sitios permisivos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis incluyen, pero no se limitan a, los residuos 137-138 (Val-Ala), residuos 224-225 (Arg-Ala), residuos 228-229 (Glu-Ala), residuos 235-236 (Arg-Glu), y residuos 317-318 (Ser-Ala) (ver Sebo et al., 1985). Los siguientes sitios permisivos adicionales también se incluyen en las modalidades de la invención: residuos 107-108 (Gly-His), residuos 132-133 (Met-Ala), residuos 232-233 (Gly-Leu), y 335-336 (Gly-Gln) y 336-337. (Ver en general, Glaser et al., 1988 Bordetella pertussis adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J. Exp. Clin. Med., 13 Suppl.: 239-52).
Como se utiliza aquí, los términos "región específica de la proteína adenilato ciclasa" o "fragmento de la adenilato ciclasa CyaA" se relaciona con un fragmento de dicha proteína, incluyendo la proteína en donde algunos aminoácidos que no están en las partes tumorales de la proteína han sido suprimidos, y las propiedades funcionales deseadas de la toxina adenilato ciclasa no se afectan sustancialmente, i.e. los dominios necesarios para el enlace específico con el receptor CD11b/CD18 y los procesos de translocación del dominio catalítico no se afectan.
Los términos "antígeno del tumor" o "antígeno del cáncer" se refieren a cualquier sustancia a partir de un tumor que provoca un respuesta inmune y reacciona específicamente con los anticuerpos o las células T. Dicha sustancia puede ser de cualquier origen, ya sea espontánea o a partir de un virus, que transforma las células para formar un tumor. Ejemplos de tales virus son HHV8, HCV, y HBV. El antígeno o epitope deben estar presentes en la superficie de la célula tumoral.
Como se utiliza aquí, el término "un péptido que corresponde a un antígeno" abarca un antígeno, un epitope, o un antígeno o un epitope flanqueado mediante regiones flanqueadoras que ocurren o no naturalmente, que específicamente potencian el procedimiento del antígeno por células que presentan el antígeno.
El término "epitope" se refiere a la secuencia del péptido mínima de un antígeno que puede inducir una respuesta inmune.
El término "péptido" se refiere a una serie de aminoácidos unida por enlaces amida, que comprende al menos 3 aminoácidos, y preferiblemente al menos 6 aminoácidos.
La composición inmunogénica de la invención puede ser utilizada en solución, por ejemplo, pero no se limitan a, en PBS, o con adyuvantes, por ejemplo, pero no se limitan a alumbre. La composición inmunogénica se puede administrar vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, o intradérmica. La composición inmunogénica se puede administrar en cantidades de 0.5-10 mg, preferiblemente 1-5 mg, 1.5-3 mg, o más preferiblemente 1.50 mg. Los efectos de estos tratamientos pueden ser monitoreados, mediante el análisis de los niveles de IFN-\gamma con ELISPOT, ELISA, o ensayos de activación de CTL, u otros inmunoensayos apropiados.
Las publicaciones ilustran el uso de adenilato ciclasa recombinante de Bordetella sp. para el diagnóstico e inmunomonitoreo, i.e., Vordermeier H. Martin et al (Infection and Immunity, November 2004, p. 6255-2261) and Schlecht G, et al (The Journal of Immunology 2004, p. 6089-6097).
La adenilato ciclasa de Bordetella sp. representa un nuevo sistema de entrega capaz de estimular específicamente los linfocitos T CD8+ que conduce a la inmunidad antitumoral y antiviral protectora en ratones (16, 17). CyaA es un poderoso vector de no-replicación para la inducción de inmunidad adaptativa y es útil en las vacunas. La demostración, de acuerdo con esta invención, de que los epitopes insertados pueden ser procesados y se presentan en asociación con las moléculas MHC humanas es un prerrequisito indispensable para el uso de este vector en humanos.
Mediante el uso de CyaA recombinante, en la cual los epitopes de melanoma humano que expresan la molécula clase 1 HLA*0201 humana se presentaron, respuestas de CTL específicas del melanoma fuertes y duraderas, podrían ser inducidas en ratones transgénicos HLA. Resultados similares se obtuvieron con CyaA recombinante destoxificada carente de actividad de adenilato ciclasa. CyaA representa un vector eficiente para inducir respuestas CTL específicas in vivo, porque más del 80% de los ratones HHD inmunizados respondieron al epitope de la tirosinasa insertado en CyaA después de una inyección i.v. sin adyuvante, mientras que solamente el 26% de los ratones HHD responden a este epitope después de una inyección de 100 \mug de péptido en la presencia de IFA (parcialmente en 26). Además, se observó sorprendentemente de acuerdo con esta invención que DC humana procesó eficientemente estas moléculas recombinantes para la presentación de los péptidos antigénicos a CTL humano. Sorprendentemente, la CyaA-Tyr recombinante fue mucho más eficiente que el péptido sintético en la entrega del epitope tirosinasa a DC.
Sistemas de entrega de antígeno alternativos basándose en virus recombinantes usualmente resultan en una eficiencia de la presentación in vitro que es menor que el péptido sintético. Los sorprendentes resultados a partir de los experimentos in vivo e in vitro de acuerdo con la invención dan énfasis al poder de CyaA como sistema de entrega, y muestran que las respuestas de CTL se pueden obtener en humanos después de la inmunización con CyaA recombinante y de esta manera, que la inmunoterapia eficiente se puede lograr con este vector. Sin embargo, las capacidades inmunógenas de las dos CyaA recombinantes probadas en este estudio fueron muy diferentes. De hecho, fuertes respuestas de CTL en ratones HHD fueron inducidas con solamente una inyección i.p. de CyaA-Tyr en la ausencia de adyuvante, mientras que tres inyecciones i.p. de CyaA-GnT-V, en la presencia de alumbre, se necesitaron para generar respuestas CTL específicas. La débil eficiencia de CyaA-GnT-V para entregar el epitope de melanoma GnT-V también se evidencio in vitro, dado que DC humana incubada con este vector estimularon pobremente un clon de CTL anti-GnT-V en comparación con CyaA-Tyr, que estimuló eficientemente un clon de CTL anti-tirosinasa específico.
Esta diferencia se puede explicar por el hecho que el péptido GnT-V injertado en CyaA-GnT-V se procesó pobremente, en comparación con el péptido de la tirosinasa insertada en CyaA-Tyr. De hecho, se sabe que las regiones flanqueadoras de un epitope dado influyen en la generación proteolítica del péptido maduro (27-29) y particularmente para los epitopes subdominantes y/o crípticos (30). Por lo tanto, se espera que la modificación del contexto molecular del epitope GnT-V en CyaA pueda potenciar la eficiencia del procedimiento de este epitope por APC. Por lo contrario, la secuencia flanqueante del epitope tirosinasa en CyaA-Tyr parece permitir su procedimiento eficiente.
Por otra parte, CyaA-Tyr es muy eficiente para activar la célula T CD8+ restringida HLA*0201 in vivo, porque una única inmunización intravenosa o dos inyecciones i.p. sin adyuvante fueron suficientes para generar fuertes respuestas CTL específicas. Esto se explica por el hecho que CyaA dirige específicamente CD11b+ DC, el más potente APC para inducir la respuesta primaria, como un resultado de su interacción con la integrina \alpha_{M}\beta_{2} expresado por estas células (14). De tal manera, CyaA tiene la propiedad excepcional de entregar específicamente los antígenos a la ruta de presentación clase I Ag citosólica de APC profesional.
Otras mejoras de la estrategia recombinante de CyaA también son posibles. En primer lugar, las inserciones múltiples de epitopes de la célula T CD8+ en la misma molécula recombinante ya se ha logrado con éxito. De hecho, la inmunización de ratones con CyaA recombinante que llevan tres diferentes epitopes, incluyendo un epitope LCMV, conduce a la inducción de respuestas de CTL específicas para cada uno de los tres epitopes, así como la protección contra un desafío LCMV letal (31). La CyaA destoxificada que lleva los epitopes múltiples de melanoma constituyen una buena alternativa para inducir respuestas de CTL multiespecíficas. Por otra parte, la inserción adicional de péptidos epitópicos de la célula T CD4+ también es posible. Aunque la implicación de las células T CD8+ en la erradicación de tumores establecidos se ha demostrado claramente (32), células auxiliares T, también pueden ser necesarias para inducir eficientes respuestas anti-tumorales (33-35). CyaA recombinante también puede entregar epitopes en la ruta del procedimiento MHC clase II (36) y es capaz de inducir, in vivo, ambas respuestas específicas de CTL y Th1 (37). Esta característica es de gran interés para las estrategias de vacunación dónde ambas clases de respuestas de la célula T tienen que ser inducidas, notablemente en el contexto de inmunoterapia del cáncer.
El plásmido pTRACE5-GnTV es un derivado del vector de expresión pTRACG que expresa los genes cyaC y cyaA de Bordetella pertussis bajo el control del promotor Pr del Fago A (pTRCAG también alberga un marcador genético de resistencia a la ampicilina y el represor A termosensible Cl^{857}). En pTRACE5-GnTV, el gen cyaA se modifica por la inserción de un dipéptido Leu-Gln entre los codones 188 y 189 CyaA de tipo salvaje (que resulta en la inactivación de la actividad de adenilato ciclasa) y por la inserción de una secuencia de ADN que codifica la siguiente secuencia del péptido PASVLPDV-FIRCGT insertada entre codones 224 y 240 de CyaA. El péptido subrayado (YLPDVFIRC) corresponde al derivado NA17-A del epitope de melanoma restringido HLA-A2 del gen V de la N-acetilglucosaminil-transferasa. (G.Dadaglio, et al. (2003) Recombinant adenylate cyclase of Bordetella pertussis induces CTL responses against HLA-A2-restricted melanoma epitope. Int. Immuno). El plásmido XL1/pTRACE5-GnTV se depositó en C.N.C.M. el 16 de Octubre, 2003, con número de acceso I-3111.
El plásmido pTRACE-5-Tyros369 es un derivado del vector de expresión pTRACG que expresa los genes cyaC y cyaA de Bordetella pertussis bajo el control del promotor Pr del fago \lambda (pTRCAG también alberga un marcador genético de resistencia a la ampicilina y el represor \lambda termosensible Cl^{857}). En pTRACE5-Tyros369, el gen cyaA se modifica por la inserción de un dipéptido Leu-Gin entre los codones 188 y 189 CyaA de tipo salvaje (que resulta en la inactivación de la actividad de adenilato ciclasa) y por la inserción de una secuencia de ADN que codifica la siguiente secuencia del péptido PASYMDGTMSQVGTRARLK insertada entre los codones 224 y 240 de CyaA. El péptido subrayado (YMDGTMSQV) corresponde a la secuencia de aminoácidos 369-377 de tirosinasa. El plásmido XL1/pTRACE5-Tyros369 se depositó en C.N.C.M. el 31 de Mayo, 2001, con número de acceso I-2679.
Las abreviaturas utilizadas son de la siguiente manera: CTL: linfocitos citotóxicos T; DC: células dendríticas; PBMC: células mononucleares de sangre periférica; CyaA: adenilato ciclasa de Bordetella sp; Tyr: tirosinasa; GnT-V: N-acetilglucosaminiltransferasa V; GM-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófago; IFN: interferón; i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenosa.
Esta invención será descrita con gran detalle en los siguientes Ejemplos.
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Ejemplo 1 Materiales y Métodos
Ratones. Los ratones HHD son ratones carentes dobles H-2D^{-/-}\beta2m^{-/-} que expresan el transgen HHD que comprende los dominios \alpha1 (H) y \alpha2 (H) de HLA*0201 unidos a la transmembrana \alpha3 y los dominios citoplásmicos de H-2Db (D), con el dominio \alpha1 unido a \beta2-microglobulina humana. Así, la molécula MHC de clase I sola expresada por los ratones HHD es la molécula HLA*0201 modificada (19). Los ratones HHD se criaron y albergaron en las instalaciones de animales del Institut Pasteur.
Péptidos. Los péptidos sintéticos pTyr (YMDGTMSQV) correspondientes al epitope restringido HLA*0201 del melanoma de la región 369-377 de la tirosinasa (20, 21) y pGnT-V (VLPDVFIRC) correspondiente al epitope restringido HLA*0201 NA17-A derivado de un intrón del gen V de la N-acetilglucosaminil-transferasa (3) se adquirieron de Neosystem (Strasbourg, France).
Construcción de las toxinas adenilato ciclasa recombinantes de Bordetella pertussis y toxoides que llevan epitopes de melanoma. La toxina CyaA recombinante, CyaA-Tyr, alberga una secuencia de polipéptidos de 14 aminoácidos de longitud (PASYMDGTMSQVGT, código de una letra por aminoácido) genéticamente insertada entre los residuos 224 y 225 de CyaA. Esta secuencia contiene una copia única del epitope de melanoma restringido HLA*0201 derivado de la tirosinasa (aminoácido 369-377, subrayado de la secuencia anterior). La toxina CyaA CyaA-GnT-V recombinante alberga un aminoácido de longitud 14 (PASVLPDVFIRCGT) insertado en la misma posición y contiene una copia única del epitope NA17-A de melanoma restringido HLA*0201 derivado del gen V de la N-acetilglucosaminil-transferasa (subrayado de la secuencia anterior).
Estas toxinas recombinantes fueron producidas en la cepa de E. coli BLR (Novagen), utilizando vectores de expresión que son derivados del plásmido pTRACG (22), modificados por la inserción entre los sitios de restricción NheI y KpnI de apropiados oligonucleótidos de doble cadena sintéticos, que codifican las secuencias del polipéptido indicado. La cepa de E. coli XL1-Blue (Stratagene) fue utilizada para todas las manipulaciones de ADN que se hicieron de acuerdo con protocolos estándar. Las proteínas recombinantes se purificaron a homogeneidad de los cuerpos de inclusión, mediante un procedimiento de dos etapas que incluye cromatografías DEAE-Sepharose y Phenyl-Sepharose, como se describe previamente (23).
Las toxinas recombinantes CyaA-Tyr y CyaA-GnT-V son activas enzimáticamente y por consiguiente citotóxicas. Los toxoides CyaA-E5-Tyr y CyaA-E5-GnT-V recombinantes son enzimáticamente inactivos, variantes destoxificadas de CyaA-Tyr y CyaA-GnT-V respectivamente. Son incapaces de sintetizar cAMP como resultado de una inserción dipéptido dentro de una región crítica del sitio catalítico (23). Los toxoides CyaA-E5-Tyr y CyaA-E5-GnT-V fueron producidos en E. coli, utilizando vectores de expresión que son derivados del plásmido pTRACE5: este plásmido se obtuvo por la inserción del hexanucleótido CTGCAG en un sitio EcoRV localizado en el par 5' de la secuencia de ADN de cyaA. Esto da lugar a una inserción en marco del dipéptido Leu-Gln entre Asp188 y Ile189 de CyaA (23). Los mismos oligonucleótidos de doble cadena sintéticos descritos anteriormente, se insertaron entre los sitios NheI y KpnI de pTRACE5 para crear los plásmidos pTRAC-E5-Tyr y pTRAC-E5-GnT-V. Los toxoides de CyaA-E5-Tyr recombinante y CyaA-E5-GnT-V se purificaron a homogeneidad como se describe (23).
Todas las toxinas recombinantes y los toxoides purificados fueron más del 90% de pureza como se discrimina por el análisis SDS-gel. Las concentraciones de toxina se determinaron espectrofotométricamente a partir de la absorción a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molecular de 142,000 M-1 cm^{-1}.
La síntesis de los oligonucleótidos y la secuenciación de ADN se llevaron a cabo mediante Genaxis (France). Los cultivos en fermentadores se llevaron a cabo en las instalaciones del Institut Pasteur, Service des Fermentations.
Inmunización de ratones. Ratones HHD hembras de seis a diez semanas de edad, se inmunizaron con dos o tres inyecciones i.p., en intervalos de 21 días, de 50 \mug de cualquiera CyaA o CyaA recombinante que llevan epitopes de melanoma en la presencia o en la ausencia de 1 mg de alumbre. En algunos experimentos, los ratones se inmunizaron con una inyección i.v. de 50 \mug de la CyaA recombinante en PBS. La CyaA-E5 destoxificada recombinante se utilizó en las mismas condiciones. Los bazos se retiraron quirúrgicamente siete días después de la última inyección, excepto para el
análisis de respuestas de larga duración, dónde los bazos se retiraron tres o cinco meses después de la última inyección.
Ensayo citotóxico In vitro . Las células del bazo a partir de los ratones inmunizados se estimularon in vitro con 10 \mug/ml de los péptidos pTyr o pGnT-V correspondientes al epitope para cebado en la presencia de células del bazo naive singénicas irradiadas en medio completo (medio RPMI 1640 que contiene dipéptido L-Alanyl-L-Glutemine suplementado con 10% de suero fetal bovino, 5 x 10^{-5} M 2-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 20 mM de Hepes) por cinco días. La actividad citotóxica de estas células efectoras se probó en un ensayo de liberación de ^{51}Cr 4-h en células de HHD transfectadas TAP^{-/-} RMA-S (RMA-S-HHD) cargadas con los péptidos relevantes como células diana. La etiqueta ^{51}Cr se realizó de la siguiente manera: un día antes de la prueba citotóxica, las células RMA-S-HHD se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en 7% de CO_{2}, se equilibraron con medio RPMI 1640 suplementado con 20 mM de Hepes. A continuación, las células se incubaron 3 h a temperatura ambiente con o sin 20 \mug/ml del péptido relevante, se lavan una vez y se radiomarcan con 100 \muCi de ^{51}Cr por 1 h a 37ºC.
Varios efectores de proporciones dirigidas se utilizaron y todos los ensayos se hicieron por duplicado. La radioactividad liberada en el sobrenadante de cada pozo se midió. El porcentaje de lisis específica se calculó como 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/ (liberación máxima - liberación espontánea). La liberación máxima se generó adicionando 10% de triton X-100 para las células diana y la liberación espontánea se obtuvo con las células diana incubadas en medio solo. Los ratones se consideraron que eran de respuesta cuando al menos 20% de lisis específica se observó en la relación E/T más alta. Los resultados se expresaron como valores promedio \pmSD de los ratones con respuesta por grupo. No se obtuvo actividad de CTL específica con los esplenocitos de los ratones inmunizados estimulados in vitro con péptidos irrelevantes.
Células dendríticas humanas. Las células dendríticas humanas se derivaron de monocitos adherentes de la siguiente manera: Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron a partir de capas leucocitarias obtenidas a partir del paciente LB2050 HLA*0201 hemocromatosis por centrifugación en tubos Leucosep (Greiner, Frickenhausen, Germany) previamente centrifugados 30 seg. a 2200 rpm con 15 ml de Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norway). Estos tubos se centrifugaron a 2200 rpm por 20 min a temperatura ambiente y la parte superior que contiene el plasma se descartó. La interfase que contiene la PBMC se cultivó y lavó al menos tres veces en solución reguladora de fosfato fría con EDTA 1 mM con el fin de eliminar las plaquetas remanentes. Las PBMC luego se dejaron adherir por 1 h en frascos de cultivo a una densidad de 2 x 10^{6} células/cm^{2} en RPMI 1640 suplementado con aminoácidos (L-arginina 116 \mug/ml, L-asparagina 36 \mug/ml, L-glutamina 216 \mug/ml), antibióticos, y 10% de suero fetal bovino (de ahora en adelante denominado como medio de cultivo). Las células no-adherentes se descartaron, las células adherentes se lavaron dos veces cuidadosamente con 20 ml de medio y se incubaron en medio de cultivo con 200 U/ml de IL-4 humano y 70 ng/ml de GM-CSF humano. El día dos y cuatro, se retiraron 5 ml del medio y se adicionaron 10 ml que contienen 700 ng de GM-CSF. IL-4 también se suplementó en 200 U/ml para el volumen total del frasco. Las células se utilizaron entre cinco y siete días.
Los clones CTL humanos. El clon CTL IVS-B se dirige contra el epitope restringido HLA*0201 Tyr (posiciones 369-377) de tirosinasa se describió previamente (24). El clon se estimuló semanalmente con 50 U/ml de IL-2 humano, células de melanoma MZ2-MEL transfectadas HLA*0201 irradiadas pulsadas con 2 mg/ml del péptido pTyr, y células LG2-EBV irradiadas como células alimentadoras. El clon de CTL CMU 579 6/3 específico para el epitope restringido HLA*0201 derivado de GnT-V se obtuvo a partir de la sangre de un donante saludable, siguiendo un método descrito recientemente (25). En resumen, las PBMC se estimularon por dos semanas con el péptido pGnT-V antigénico, IL-2, IL-4, e IL-7 humano. En el día 13, las PBMC se tiñeron con un tetramero HLA*0201 doblado con el péptido pGnT-V. Los linfocitos positivos del tetramero se clonaron utilizando citometría de flujo. Se estimularon por dos semanas con células B transformadas de EBV HLA*0201-positivo alogénicas irradiadas pulsadas con el péptido, PBL alogénico irradiado, IL-2, IL-4, y IL-7, y luego se mantuvieron por estimulación semanal con células tumorales alogénicas pulsadas con el péptido HLA*0201 irradiadas y células alogénicas EBV-B irradiadas. Ambos clones de CTL se conservaron en medio de Iscove suplementado con 10% de suero humano, aminoácidos, y antibióticos.
Ensayo de estimulación In vitro de clones de CTL humanos. Para el ensayo de estimulación, 10,000 células dendríticas inmaduras se sembraron en microplacas de fondo en U en 25 \mul de X-Vivo 10 medio (Whittaker Bioprodutcs, Walkersville, USA). 25 \mul de preparaciones de CyaA diluidas en X-Vivo 10 medio a diferentes concentraciones se adicionaron a los pozos. Después de 30 min de incubación, los clones de CTL correspondientes se incubaron con estas células (75 ml de X-vivo medio que contiene el clon de CTL 10^{4} antitirosinasa IVS-B o clon de CTL 10^{4} anti-GnT-V CMU 579 6/3) y IL-2 (a una concetración final de 25 U/ml). Los sobrenadantes se recolectaron después de 20 h y su contenido de IFN-\gamma se determinó por ELISA (Biosource International, Camarillo, CA). Para controlar la capacidad de DC incubadas con los diferentes toxoides recombinantes destoxificados para estimular los clones de CTL, se cargaron exogenosamente con los péptidos antigénicos relevantes, se incubaron con los clones de CTL relevantes y la producción de IFN-\gamma se evalúo de manera similar (los datos no se muestran).
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Ejemplo 2 Inducción de las respuestas de CTL específicas al melanoma por inmunización de ratones transgénicos HHD con CyaA recombinante que llevan epitopes HLA*0201 de melanoma restringidos
Para determinar si la toxina CyaA es capaz de inducir respuestas de CTL específicas contra antígenos tumorales humanos, dos CyaA recombinantes que llevan epitopes HLA*0201 restringidos de melanoma humano se construyeron. La primera CyaA recombinante expresa el epitope 369-377 a partir del antígeno de la tirosinasa (CyaA-Tyr) y la segunda expresa el epitope NA17-A derivado de un intrón de la N-acetilglucosaminil-transferasa V (CyaA-GnT-V). La capacidad de CyaA recombinante para inducir respuestas de CTL contra estos dos epitopes in vivo, se evalúo en ratones HHD, que son transgénicas para la molécula HLA*0201 MHC clase I humana y se ha demostrado que desarrollan respuestas CTL restringidas de HLA*0201, contra péptidos tumorales (26). Ratones HHD se inmunizaron, mediante 3 inyecciones i.p. de 50 \mug de CyaA recombinante con alumbre. Después de la estimulación in vitro de esplenocitos con el péptido correspondiente, las respuestas de CTL se probaron en un ensayo de liberación de cromo, utilizando como objetivo células RMA-S-HHD pulsadas con el péptido, que expresan el mismo transgen como los ratones HHD. Como se muestra en la Figura 1, ambas toxinas recombinantes que llevan cualquiera de los epitopes Tyr o GnT-V inducen fuertes respuestas CTL contra las células diana cargadas con el péptido relevante. Estas respuestas CTL fueron antígeno-específico, ya que solo las células diana sensibilizadas del péptido se mataron y la actividad de CTL no se detectó en las células diana cargadas con péptidos irrelevantes (los datos no se muestran). Como era de esperar, no se observaron significantes respuestas de CTL en ratones inmunizados con la CyaA del tipo salvaje demostrando que la inducción de las respuestas de CTL específicas requeridas in vivo cebado por el epitope insertado en CyaA recombinante.
La inducción de respuestas de CTL por CyaA-Tyr luego se analizó utilizando diferentes protocolos de inmunización con o sin alumbre como adyuvante. Como se ilustra en las Figuras 2A y B, dos inyecciones i.p. de CyaA-Tyr fueron suficientes para inducir las respuestas de CTL específicas contra el epitope tirosinasa, incluso en la ausencia de alumbre. La inducción de fuertes respuestas de CTL específicas también se observó después de una única inyección de 50 \mug de CyaA-Tyr sin adyuvante utilizando la ruta i.v. (Figura 2C). Como era de esperar, estas respuestas de CTL se observaron solamente cuando se utilizan células diana pulsadas con el péptido y esplenocitos a partir de ratones inmunizados con la CyaA-Tyr recombinante, demostrando la especificidad de las respuestas. Estos resultados demostraron la alta eficiencia de CyaA-Tyr para inducir respuestas CTL específicas contra el epitope del melanoma de la tirosinasa. Sin embargo, utilizando condiciones similares de inmunización (2 o 1 inyecciones i.p. con o sin alumbre), no se observó respuesta CTL específica con la toxina CyaA-GnT-V recombinante, indicando que esta toxina es menos eficiente para generar respuesta específica de CTL, que la CyaA-Tyr (los datos no se muestran). Sin embargo, por la ruta intravenosa, una inyección de CyaA-GnT-V fue suficiente para inducir una fuerte respuesta CTL (Figura 2E).
Por último, las respuestas CTL inducidas por mutantes genéticamente destoxificados de CyaA que llevan epitopes Tirosinasa o GnTV que son carentes de actividad de adenilato ciclasa después de la inserción de un dipéptido en el sitio catalítico fueron analizados. Ratones HHD inmunizados con estas moléculas destoxificadas desarrollaron respuestas de CTL específicas contra ambos epitopes tirosinasa y GnTV (Figuras 2D, 2F), que fueron comparables a las respuestas de ratones inmunizados con las formas tóxicas de CyaA que llevan el correspondiente epitope. Estos resultados indican que la inducción de CTL HLA*0201-restringida es independiente de la actividad catalítica como se demostró claramente para un epitope viral a partir de LCMV en ratones BALB/C (18).
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Ejemplo 3 CyaA-Tyr recombinante induce respuestas de CTL de memoria de larga duración
Para analizar la persistencia de las respuestas de CTL inducidas por la CyaA recombinante que lleva epitope de melanoma, los ratones HHD recibieron dos inyecciones i.p. de 50 \mug de CyaA-Tyr en la presencia de alumbre. Tres y cinco meses después de la última inyección, los esplenocitos de los ratones inmunizados se estimularon in vitro durante cinco días con el péptido pTyr y luego, su actividad citolítica se probó contra células diana RMA-S-HHD pulsadas con el péptido. Como se ilustra en la Figura 3, CyaA-Tyr indujo una duradera respuesta específica de CTL porque la actividad específica citotóxica podría ser detectada en todos los ratones, tres meses después de la última inyección, e incluso después de cinco meses en un animal.
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Ejemplo 4 Péptidos restringidos de HLA*0201 insertados en CyaA se procesaron y se presentan por HLA*0201+ DC humana
La inducción in vivo de respuestas de CTL específicas por CyaA recombinante indica que los epitopes insertados se procesan eficientemente y se presentan por APC murine. Sin embargo, es importante demostrar que APC humanas también son capaces de procesar y presentar estos epitopes HLA*0201 restringidos insertados en CyaA. Puesto que DC son la APC más importante para inducir respuestas primarias de la célula T, la capacidad de HLA*0201+ DC incubado con la CyaA recombinante para estimular clones de CTL humanos específicos para los epitopes insertados en la CyaA recombinante se determinó. Para estos experimentos, DC humanas se generaron in vitro a partir de las HLA*0201+ PBMC adherentes en la presencia de GM-CSF y IL-4. El incremento de las dosis de CyaA-E5-Tyr, CyaA-E5-GnT-V o CyaA-E5 control luego se adicionaron y la presentación de los péptidos antigénicos se evaluó mediante la medición de la capacidad de las DC tratadas para estimular el CTL relevante en un ensayo de producción de IFN-\gamma.
Como se muestra en la Figura 4A, DC humanas incubadas con CyaA-E5-Tyr indujeron una alta producción de IFN-\gamma por el clon de CTL específico de la tirosinasa, indicando que el epitope tirosinasa se procesa eficientemente y se presenta en asociación con las moléculas de HLA*0201. La especificidad de esta identificación se confirmó por la falta de estimulación de dos clones irrelevantes de CTL (los datos no se muestran) y por la falta de estimulación del clon específico de la tirosinasa por DC tratadas con el toxoide CyaA-E5 control (Figura 4A). La presentación del epitope tirosinasa fue proporcional a la dosis de CyaA-Tyr hasta 30 nM. En estas condiciones, dosis más altas que parecían ser tóxicas para las DC, como se indica por la baja identificación de las DC tratadas y por su disminución de la capacidad de presentar el péptido sintético cargado de forma hexógena (los datos no se muestran).
Con el fin de evaluar la relativa eficiencia de presentación del antígeno utilizando CyaA como sistema de entrega una curva de titulación del péptido de la tirosinasa sintética, que fue pulsada en DC similares, también se realizó. Como se muestra en la Figura 4A, la CyaA-Tyr fue hasta 100 veces más eficiente que el péptido sintético para inducir la presentación del epitope por DC.
Las DC humanas incubadas con CyaA-E5-GnT-V indujeron una débil pero reproducible producción de IFN-\gamma por el clon de CTL específico GnTV, en comparación con las DC incubadas con el péptido pGnT-V (Figura 4B). Este resultado indica que DC humanas son capaces de presentar el epitope GnT-V insertado en CyaA, aunque con una eficiencia moderada.
En resumen, estos resultados demostraron claramente la capacidad de las DC humanas para el proceso y presentar epitopes humanos insertados en CyaA.
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Ejemplo comparativo 5
Construcciones de la toxina CyaA que no inducen una respuesta
CyaA-Mel 21, que comprende el epitope gp100-280, e incluye la secuencia YLEPGTVTA insertada, formó el antígeno del tumor asociado al melanoma GP 100, no incluye una respuesta CTL. Del mismo modo, CyaA-CEA 13, que comprende el epitope CEA 571-579, y tiene la secuencia YLSGANLNL insertada a partir del Antígeno Carcinoma Embrionario, no induce una respuesta CTL. Ninguna de estas toxinas induce una respuesta CTL específica para los epitopes insertados en el ratón HHD. Por otra parte, algunas células dendríticas humanas no pueden presentar el epitope CyaA-Mel 21 insertado (epitope gp100-280) para un clon de CTL humano. Por lo tanto, esta toxina probablemente también es ineficaz en humanos. Estas dos toxinas, CyaA-Mel21 y CyaA-CEA13, son idénticas a CyaA-Tyr y CyaA-GnTV, pero se diferencian solamente en las secuencias insertadas. Por lo tanto, solamente los epitopes son diferentes, y así la respuesta a CyaA-Tyr y CyaA-GNTV son específicas al epitope.
Por último, la toxina Cya-Mage, que comprende el epitope Mage A10/A2 con la secuencia GLYDGMEHL insertada a partir de la proteína del melanoma Mage 10, induce una muy buena respuesta CTL en el ratón HHD, pero es ineficaz en humanos mediante el protocolo descrito anteriormente. Por lo tanto, una respuesta positiva en el ratón no es siempre indicativa de una respuesta positiva en humanos. En general, las respuestas humanas son específicas al epitope y la especie.
Referencias
Las siguientes referencias se citan en este documento. La divulgación completa de cada referencia es válida y se incorpora por referencia en este documento.
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<110> INSTITUT PASTEUR
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INSERM 
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LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH 
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CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE 
\hfill
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<120> TOXINA CICLASA ADENILATO RECOMBINANTE DE BORDETELLA INDUCE LAS RESPUESTAS DE LA CÉLULA T CONTRA LOS ANTÍGENOS TUMORALES
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<130> B6216A-AD/CAL
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<140> Desconocida
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<141> 2004-11-19
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<150> US 60/523,632
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<151> 2003-11-21
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<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido
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<400> 1
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\hskip1cm1 
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<211> 9
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido
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<400> 11
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Claims (22)

1. Una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende una CyaA de Bordetella o un fragmento de esta, y un péptido que corresponde a un péptido correspondiente a un antígeno de melanoma o un epitope derivado de un antígeno de melanoma, en donde dicho péptido es un epitope HLA-A*0201 derivado de la tirosinasa que es la región 369-377 de la tirosinasa o YMDGTMSQV.
2. La composición inmunogénica como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la CyaA de Bordetella, o fragmento de esta, y el péptido son genéticamente fusionados o unidos químicamente juntos.
3. La composición inmunogénica como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en donde la CyaA de Bordetella es desintoxicada o carece de actividad catalítica.
4. La composición inmunogénica como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante es:
- una proteína recombinante que comprende CyaA de Bordetella o un fragmento específico de esta, carente de la actividad catalítica, y el péptido de secuencia YMDGTMSQV (pTyr), o
- una proteína de fusión que comprende CyaA de Bordetella pertussis y un péptido que corresponde a un antígeno que comprende el epitope Tyr y que se codifica por la secuencia incluida en el plásmido depositado en la CMCM bajo el número I-2679.
5. La composición inmunogénica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína recombinante comprende más de un péptido.
6. La composición inmunogénica como se reivindica en la reivindicación 5 en donde los péptidos son iguales o al menos uno es diferente del otro(s).
7. La composición inmunogénica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde dicho péptido se localiza en cualquier sito permisivo de CyaA.
8. La composición inmunogénica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicho péptido incluye las regiones Blanqueadoras.
9. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el péptido es: SSMHNALHIYMDG
TMSQVQGSANDPI.
10. La composición inmunogénica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la composición se utiliza como una inmunoterapia.
11. La composición inmunogénica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 10, en donde la CyaA de Bordetella es del B. pertussis, B. parapertussis, o B. bronchiseptica.
12. Una composición inmunogénica que comprende un vector, en donde dicho vector expresa una proteína recombinante como se define en la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende una CyaA de Bordetella o un fragmento de esta, y un péptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
14. Un vector que expresa una proteína recombinante, en donde la proteína recombinante comprende la CyaA Bordetella o un fragmento de esta, y un péptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
15. El plásmido depositado en C.N.C.M., bajo el número de acceso I-2679.
16. Una composición inmunogénica que comprende un vector que expresa una proteína recombinante, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para utilizar en el tratamiento de un paciente con cáncer, para inducir una respuesta de la célula T en dicho paciente.
17. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 superficial en la célula tumoral, para utilizar en el tratamiento de un paciente con cáncer, para inducir una respuesta de la célula T en dicho paciente.
18. Una composición inmunogénica de acuerdo con reivindicación 16 o 17, en donde la respuesta de la célula T, es una respuesta CTL.
19. Uso de una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de un fármaco para el tratamiento del cáncer.
20. Uso de una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho cáncer es un melanoma.
21. Una composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para el tratamiento del cáncer.
22. Una composición inmunogénica de acuerdo con reivindicación 21, en donde dicho cáncer es un melanoma.
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