ES2338164T3 - Compuestos para la inhibicion de la apoptosis. - Google Patents
Compuestos para la inhibicion de la apoptosis. Download PDFInfo
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Abstract
Compuesto de fórmula general I, **(Ver fórmula)** sus estereoisómeros y mezclas de los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo, en la que: R1representa alquilo (C1-C5), alquenilo (C2-C5), -(CH2)1-3-NHCO-alquilo (C1-C3), -(CH2)1-3-CONRaRb, -(CH2)0-3-Cic (3-6), -(CH2)0-3-Hetcic (5-6), -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), -(CH2)1-3-Hetar (5-10), -(CH2)2-CH(fenilo)2, -(CH2)2-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH2)2-CH[Hetar (5-6)]2; R2 representa -(CH2)0-3-Cic (3-6), -(CH2)0-3-Hetcic (5-6), -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), -(CH2)1-3-Hetar (5-10), -(CH2)2-CH(fenilo)2, -(CH2)2-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH2)2-CH[Hetar (5-6)]2; R3 representa -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), o -(CH2)1-3-Hetar (5-6); alquilo (C1-C5) y -alquenilo (C2-C5) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de -O-alquilo (C1-C2), -S-alquilo (C1-C2), -NH2, -NH-alquilo (C1-C2) y -N[alquilo (C1-C2)]2; alquilo (C1-C3) puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; Ra y Rb representan independientemente -H o -alquilo (C1-C3) Cic (3-6) representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros; Hetcic (5-6) representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N; Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3 y -OH; Hetar (5-6) y Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos, respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N; fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar (5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3, -OH, -O-alquilo (C1-C3), -CO-alquilo (C1-C3), -alquil (C1-C5)-NRaRb, -NRaRb y -SO2NH2; con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
Description
Compuestos para la inhibición de la
apoptosis.
La presente invención se refiere a compuestos
que actúan como inhibidores de la apoptosis, así como a
procedimientos para su preparación, a composiciones farmacéuticas
que los contienen y a su uso en medicina.
La apoptosis es un proceso biológico interesante
debido a su importancia en una amplia variedad de sistemas
biológicos, incluyendo el recambio celular normal, el sistema
inmunitario y el desarrollo embrionario y su asociación con
diferentes enfermedades. Una apoptosis inapropiada participa en
muchas patologías humanas, incluyendo enfermedades
neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la
enfermedad de Huntington, isquemia, trastornos autoinmunitarios y
varias formas de cáncer (Reed J.C., Trends Mol. Med. 2001, 7:
314-319).
Diversos estímulos apoptóticos, incluyendo la
activación de los receptores de muerte de la superficie celular,
agentes anticancerígenos, irradiación, carencia de factores de
supervivencia e isquemia (revisado en Strasser A. et al.,
Annu. Rev. Biochem. 2000, 69: 217-245) inducen
cascadas de señalización que activan todas una familia de cisteína
aspartil-proteasas denominadas caspasas. Estas
proteasas ejecutan el proceso apoptótico.
Algunas señales apoptóticas activan la ruta
intrínseca o mediada por mitocondrias que utiliza caspasa 9 como su
iniciador. La formación del complejo macromolecular denominado
apoptosoma es un acontecimiento clave en esta ruta.
El apoptosoma es un complejo multiproteico de
holoenzima formado por Apaf-1 (factor de activación
de proteasas apoptóticas) activado por el citocromo c, dATP y
procaspasa 9 (Li P. et al., Cell 1997, 91:
479-489; Acehan D et al., Mol. Cell 2002, 9:
423-432; Rodríguez J. et al., Genes Dev.
1999, 13: 3179-3184; Srinivasula S.M. et
al., Mol. Cell 1998, 1: 949-957). En este
complejo macromolecular, se activa la caspasa 9 asociada al
apoptosoma y entonces, a su vez, se activan caspasas efectoras. Para
identificar moléculas que podrían mejorar la apoptosis asociada a
enfermedad, los esfuerzos para el descubrimiento de fármacos han
tenido como objetivo inicialmente la actividad caspasa, y por
tanto, se buscaron inhibidores o activadores enzimáticos
específicos (Scott C.W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.
2003, 304: 433-440; García-Calvo M,
J. Biol. Chem. 1998, 273: 32608-32613), en lugar de
moduladores en la ruta/cascada de activación superior.
No obstante, las interacciones
proteína-proteína en un nivel superior a la
activación de caspasas también pueden ser puntos de intervención
relevantes para el desarrollo de moduladores de las rutas de
apoptosis. En particular, datos recientes proponen la formación del
apoptosoma como una diana interesante para el desarrollo de
moduladores apoptóticos.
Por tanto, existe un interés por hallar
moléculas que inhiben la activación de la apoptosis mediada por el
apoptosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto de la presente invención se refiere a
la provisión de nuevos compuestos de fórmula general I,
sus estereoisómeros y mezclas de
los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y
sales de adición farmacéuticamente aceptables del
mismo,
en la que:
- R1
- representa alquilo (C_{1}-C_{5}), alquenilo (C_{2}-C_{5}), -(CH_{2})_{1-3}-NHCO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb, -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
- R2
- representa -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
- R3
- representa -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), o -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6);
alquilo (C_{1}-C_{5}) y
-alquenilo (C_{2}-C_{5}) pueden estar
opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados
de -O-alquilo (C_{1}-C_{2}),
-S-alquilo (C_{1}-C_{2}),
-NH_{2}, -NH-alquilo
(C_{1}-C_{2}) y -N[alquilo
(C_{1}-C_{2})]_{2};
alquilo (C_{1}-C_{3}) puede
estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
Ra y Rb representan independientemente -H o
-alquilo (C_{1}-C_{3})
Cic (3-6) representa un radical
de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a
6 miembros;
Hetcic (5-6) representa un
radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente
insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos
heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente
sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno,
-CF_{3} y -OH;
Hetar (5-6) y Hetar
(5-10) representan un radical con C o N de un anillo
de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos,
respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos
seleccionados independientemente de O, S y N;
fenilo, 1-naftilo,
2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar
(5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con
uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3}, -OH,
-O-alquilo (C_{1}-C_{3}),
-CO-alquilo (C_{1}-C_{3}),
-alquil (C_{1}-C_{5})-NRaRb,
-NRaRb y -SO_{2}NH_{2};
con la condición de que R2 no representa
2-(4-fluorofenil)etilo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un compuesto que es un conjugado de fármaco que comprende un
radical de fórmula II
sus estereoisómeros y mezclas de
los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente
aceptables del mismo, conjugado a un polímero de poli(ácido
glutámico), en los que R1, R2 y R3 tiene los significados definidos
para el compuesto de fórmula I, sin la condición de R2; cada R4
representa independientemente una cadena lateral de cualquiera de
los 20 aminoácidos que se producen de manera natural, y n es 0,1, 2
ó
3.
Por tanto, los compuestos de fórmula II
comprenden diferentes restos: un radical de fórmula I, que forma un
enlace amida a una cadena peptídica de n
L-aminoácidos y un derivado de amida de
L-lisina, en el que el N de su cadena lateral está
unido al polímero de poli(ácido glutámico).
En las definiciones previas, las expresiones
alquilo (C_{1}-C_{3}) y alquilo
(C_{1}-C_{5}) representan cadenas
hidrocarbonadas saturadas lineales o ramificadas que contienen desde
uno hasta tres y desde uno hasta cinco átomos de carbono,
respectivamente. Los ejemplos de alquilo
(C_{1}-C_{3}) incluyen, pero no se limitan a,
metilo, etilo, propilo, isopropilo. Los ejemplos de alquilo
(C_{1}-C_{5}) incluyen adicionalmente y sin
limitación butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, 1-pentilo,
1-metilbutilo, 2-metilbutilo,
3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo,
1,2-dimetilpropilo y
2,2-dimetilpropilo.
La expresión alquenilo
(C_{2}-C_{5}) representa una cadena carbonada
lineal o ramificada insaturada, que contiene desde dos hasta cinco
átomos de carbono y uno o más dobles enlaces, por ejemplo, etenilo,
1-propenilo, 2-propenilo,
1-butenilo, 2-butenilo,
3-butenilo y 1,3-butadienilo,
1-pentenilo, 2-pentenilo,
3-pentenilo, 4-pentenilo,
1-metil-2-butenilo,
2-metil-3-butenilo,
3-metil-1-butenilo,
1,1-dimetil-2-propenilo
y
1,2-dimetil-1-propenilo.
Los grupos alquilo
(C_{1}-C_{3}), alquilo
(C_{1}-C_{5}) y alquenilo
(C_{2}-C_{5}) pueden estar opcionalmente
sustituidos según la descripción, siempre que sea apropiado desde un
punto de vista químico.
La expresión Cic (3-6)
representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o
parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros. Tal como se mencionó
anteriormente, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más
sustituyentes, que pueden situarse en cualquier posición disponible
del anillo. Los ejemplos de Cic (3-6) incluyen, sin
limitación, radicales de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano,
ciclohexano, 1-ciclobuteno,
2-ciclobuteno, 1-ciclopenteno,
2-ciclopenteno, 1-ciclohexeno,
2-ciclohexeno y 3-ciclohexeno.
La expresión Hetcic (5-6)
representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico de 5 a 6
miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene uno o dos
heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N, que
puede estar sustituido según la descripción en cualquier posición
disponible del anillo. Los ejemplos de Hetcic (5-6)
incluyen, sin limitación, radicales de dihidrofurano, pirrolina,
pirazolina, imidazolidina, isotiazolidina, isoxazolidina,
oxazolidina, pirazolidina, pirrolidina, tiazolidina, dioxano,
morfolina, piperazina, piperidina, pirano, tetrahidropirano,
oxazina, oxazolina, pirrolina, tiazolina, pirazolina, imidazolina,
isoxazolina e isotiazolina.
Las expresiones Hetar (5-6) y
Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un
anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos,
respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos
seleccionados independientemente de O, S y N, que puede estar
sustituido según la descripción en cualquier posición disponible
del anillo. Los ejemplos de Hetar (5-6) incluyen,
sin limitación, radicales de pirrol, furano, tiofeno, imidazol,
isoxazol, isotiazol, oxazol, 1,2,4-oxadiazol,
1,2,4-tiadiazol, 1,3,4-oxadiazol,
1,3,4-tiadiazol, 1,2,3-triazol,
1,2,4-triazol, piridina, pirimidina, piridazina y
pirazina. Los ejemplos de Hetar (5-10) incluyen
además, sin limitación, radicales de bencimidazol, benzofurano,
benzotiazol, benzotiofeno, imidazopirazina, imidazopiridazina,
imidazopiridina, imidazopirimidina, indazol, indol, isoindol,
isoquinolina, pirazolopirazina, pirazolopiridina,
pirazolopirimidina, purina, quinazolina, quinolina y
quinoxalina.
La expresión "opcionalmente sustituido con uno
o más" significa que un grupo puede estar o bien no sustituido o
bien sustituido con uno o más, preferiblemente con 1, 2, 3 ó 4
sustituyentes, siempre que este grupo tenga 1, 2, 3 ó 4 posiciones
susceptibles de sustituirse.
En toda la descripción y las reivindicaciones,
el término "comprenden" y variaciones del término, tales como
"que comprenden", no pretenden excluir otros aditivos,
componentes, elementos o etapas.
Tal como se usa en ellas, la expresión
"tratamiento" incluye tratamiento, prevención y control de tal
estado. La expresión "farmacéuticamente aceptable" tal como se
usa en el presente documento se refiere a aquellos compuestos,
composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance
del criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los
tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad,
irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación,
acorde con una razón riesgo/beneficio razonable.
En una realización particular de la invención,
R1 representa alquilo (C_{1}-C_{5}),
-(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb,
-(CH_{2})_{0-3}-Cic
(3-6);
-(CH_{2})_{0-3}-Hetcic
(5-6);
-(CH_{2})_{1-3}-Hetar
(5-10),
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo,
-(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo)
o
-(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo),
todos ellos opcionalmente sustituidos.
En una realización particular de la invención,
R1 representa
-(CH_{2})_{0-3}-Hetcic
(5-6),
-(CH_{2})_{1-3}-Hetar
(5-10),
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo) o -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), todos ellos opcionalmente sustituidos.
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo) o -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), todos ellos opcionalmente sustituidos.
En otra realización, R1 representa
-(CH_{2})_{2}-fenilo opcionalmente
sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno.
En otra realización, R1 representa
2,4-diclorofenilo.
En otra realización, R2 representa
-(CH_{2})_{1-3}-arilo
opcionalmente sustituido, o
-(CH_{2})_{2}-CH(Ph)_{2}
opcionalmente sustituido, con la condición de que R2 no representa
2-(4-fluorofenil)etilo. En otra realización,
R2 representa 3,3-difenilpropilo, con la condición
de que R2 no representa
2-(4-fluorofenil)etilo.
En otra realización, R3 representa
-(CH_{2})_{1-3}-Hetar
(5-6) o
-(CH_{2})_{2}-fenilo, ambos opcionalmente
sustituidos. En otra realización, R3 representa
-(CH_{2})_{2}-fenilo opcionalmente
sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno.
En otra realización, R3 representa
2,4-diclorofenilo.
En otra realización, R2 representa
3,3-difenilpropilo y R1 y R3 representan ambos
2,4-diclorofenilo.
Otra realización de la presente invención, se
refiere a un compuesto que es un conjugado de fármaco que comprende
un compuesto de fórmula II conjugado a un polímero de poli(ácido
glutámico) tal como se definió previamente, en el que dicho
polímero tiene un peso molecular de desde 20 hasta 60 kDa.
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Otra realización, de la invención se refiere a
un compuesto de fórmula III que es un conjugado de
polímero-fármaco
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en la que R1, R2, R3 y R4 tiene los
significados descritos en la fórmula general II y la proporción de y
con respecto a x es del 25-30% al
75-70% en
peso.
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En otra realización, en un compuesto de fórmula
III n representa 0. En otra realización, n representa 2 y R4
representa una cadena lateral de glicina. En otra realización, n
representa 3 y R4 representa una cadena lateral de glicina, una
cadena lateral de arginina y una cadena lateral de fenilalanina. En
otra realización, n representa 3 y R4 representa una cadena lateral
de valina, una cadena lateral de arginina y una cadena lateral de
fenilalanina.
En el conjugado de
polímero-fármaco, el poli(ácido glutámico) puede ser
poli(ácido L-glutámico), poli(ácido
D-glutámico) o poli(ácido
DL-glutámico). En una realización de la invención,
el poli(ácido glutámico) es poli(ácido
L-glutámico).
Además, todas las posibles combinaciones de las
realizaciones mencionadas anteriormente también forman parte de
esta invención.
Los compuestos de fórmula I comprenden al menos
un centro quiral. La presente invención incluye tanto los
compuestos racémicos como los compuestos enantioméricos de fórmula
I, es decir, compuestos en los que la configuración del carbono
quiral unido a R1 es (S) y compuestos en los que la
configuración del carbono quiral unido a R1 es (R) tal como
se muestra a continuación.
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Los compuestos de fórmula II comprenden al menos
dos centros quirales. La presente invención también incluye tanto
mezclas de estereoisómeros como los estereoisómeros aislados de
fórmula II.
Los compuestos de la presente invención pueden
contener uno o más átomos de nitrógeno básicos y, por tanto, pueden
formar sales con ácidos, que también forman parte de esta invención.
Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre
otros, sales de adición con ácidos inorgánicos tales como ácido
clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, perclórico,
sulfúrico y fosfórico, así como sales de adición de ácidos orgánicos
tales como ácido acético, metanosulfónico,
trifluorometanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico,
p-toluenosulfónico, benzoico, canforsulfónico,
mandélico, oxálico, succínico, fumárico, tartárico y maleico.
Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden contener
uno o más protones ácidos y, por tanto, pueden formar sales con
bases, que también forman parte de esta invención. Los ejemplos de
estas sales incluyen sales con cationes metálicos, tales como por
ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalinotérreo o
un ion de aluminio; o puede coordinarse con una base orgánica o
inorgánica. Una base orgánica aceptable incluye entre otros
dietilamina y trietilamina. Una base inorgánica aceptable incluye
hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio,
carbonato de sodio e hidróxido de sodio. Puede haber más de un
catión o anión dependiendo del número de funciones con carga y de
la valencia de los cationes y aniones.
Las sales derivadas de bases orgánicas no
tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas
primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo
aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas
cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como
arginina, betaína, cafeína, colina,
N,N-dibenciletilendiamina, dietilamina,
2-dietilaminoetanol,
2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina,
N-
etilmorfolina, etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares.
etilmorfolina, etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares.
No existe limitación del tipo de sal que puede
usarse, siempre que éstas sean farmacéuticamente aceptables cuando
se usan para fines terapéuticos. Las sales pueden sintetizarse a
partir del compuesto original que contiene un resto ácido o básico
mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, pueden
prepararse sales de este tipo haciendo reaccionar las formas de
base o ácido libre de estos compuestos con una cantidad
estequiométrica de la base o ácido apropiados en agua o en un
disolvente orgánico, tal como éter, acetato de etilo, etanol,
isopropanol o acetonitrilo o en una mezcla de ambos. Los compuestos
de fórmula I o fórmula III y sus sales difieren en algunas
propiedades físicas pero son equivalentes para los fines de la
presente invención.
Algunos de los compuestos de fórmula I o fórmula
III de la presente invención pueden existir en formas no solvatadas
así como solvatadas tales como, por ejemplo, hidratos. La presente
invención engloba todas las formas de este tipo mencionadas
anteriormente que son farmacéuticamente activas.
Algunos de los compuestos de fórmula general I
pueden presentar polimorfismo, englobando la presente invención
todas las posibles formas polimórficas, y mezclas de las mismas.
Pueden prepararse diversos polimorfos mediante cristalización en
diferentes condiciones o calentando y fundiendo el compuesto seguido
por enfriamiento gradual o rápido. Puede determinarse la presencia
de polimorfos mediante espectroscopía de RMN de sólidos,
espectroscopía IR, calorimetría diferencial de barrido, difracción
de rayos X de polvo u otras técnicas de este tipo.
Los compuestos de fórmula I de la presente
invención comprenden al menos un centro quiral. Adicionalmente,
pueden tener centros quirales adicionales. La presente invención
incluye cada uno de los posibles estereoisómeros y mezclas de los
mismos, particularmente mezclas racémicas de los mismos. Puede
prepararse un enantiómero individual mediante cualquiera de los
procedimientos usados comúnmente, por ejemplo, mediante separación
cromatográfica de la mezcla racémica con una fase quiral
estacionaria, mediante resolución de la mezcla racémica mediante
técnicas de cristalización fraccionada de las sales diastereoméricas
de los mismos, mediante síntesis quiral, mediante resolución
enzimática o mediante biotransformación. Esta resolución puede
llevarse a cabo con cualquier producto intermedio sintético quiral
o con productos de fórmula general I. Alternativamente, puede
obtenerse cualquier enantiómero de un compuesto de la fórmula
general I mediante síntesis enantioespecífica usando materiales de
partida ópticamente puros o reactivos de configuración conocida.
Los compuestos de fórmula I o fórmula III pueden
existir como varios diastereoisómeros, y pueden separarse mediante
técnicas convencionales tales como cromatografía o cristalización
fraccionada. Algunos compuestos de la presente invención pueden
presentar isómeros cis/trans. La presente invención incluye cada uno
de los isómeros geométricos y sus mezclas. La presente invención
cubre todos los isómeros y mezclas de los mismos (por ejemplo,
mezclas racémicas) ya se obtengan mediante síntesis y también
mediante el mezclado físico de los mismos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de los compuestos novedosos
citados anteriormente, sus formas tautoméricas, sus
estereoisómeros, sus polimorfos o sus sales y solvatos
farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la presente invención pueden
sintetizarse usando los métodos descritos a continuación, así como
mediante otros procedimientos conocidos en el campo de la síntesis
orgánica. Los métodos preferidos incluyen, pero no se limitan a,
los procedimientos generales mostrados en los esquemas adjuntos. A
menos que se establezca lo contrario, los grupos R1, R2, R3, R4, n,
x e y tienen el significado descrito en fórmulas generales I, II y
III.
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Los compuestos de fórmula I pueden obtenerse
usando el siguiente método:
Método
A
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Según el método A, tras desprotección del grupo
fluorenilmetoxicarbonilo, se acila la amina de soporte sólido IV
con un agente acilante V, en el que X representa un grupo saliente,
por ejemplo, halógeno e Y representa -OH o halógeno. Cuando Y
representa halógeno, por ejemplo, cloruro de cloroacetilo, puede
llevarse a cabo la reacción en presencia de una base terciaria como
trietilamina. Cuando Y representa -OH, por ejemplo, ácido
bromoacético, puede llevarse a cabo la reacción en presencia de un
agente de acoplamiento adecuado, por ejemplo,
N,N'-diisopropilcarbodiimida. En ambos casos, puede
realizarse la reacción en un disolvente inerte que puede hinchar
correctamente la resina, tal como N,N'-dimetilformamida o
diclorometano y a temperatura ambiente o usando irradiación de
microondas, disminuyendo el tiempo de reacción. Entonces, se acopla
una amina VIa usando una amina terciaria como base. Puede llevarse
a cabo la reacción mediante calentamiento, por ejemplo, a 60ºC, o
mediante irradiación de MW.
Se hace reaccionar un ácido carboxílico VIII, en
el que PG representa un grupo protector, tal como alilo, con la
amina VII para producir la amida IX usando un agente de
acoplamiento, por ejemplo, la combinación de
N,N'-diisopropilcarbodiimida y
1-hidroxibenzotriazol. Luego, se introduce una amina
VIb mediante la reacción de Michael usando una base y un disolvente
tal como N,N'-dimetilformamida o dimetilsulfóxido para
obtener el producto intermedio X. Tras la repetición de la
acilación y la aminación de la misma manera en que se describió
para el producto intermedio VII, se obtiene XI. La desprotección
llevada a cabo usando PhSiH_{3} y
Pd(PPh_{3})_{4} en diclorometano como disolvente
(Tetrahedron Lett 1999, 40:2505-2508; Tetrahedron
Lett 1997, 38:7275-7278) o con KOH acuoso en
dioxano produce XII. Se fomenta la ciclación mediante la formación
de la amida usando reactivos de acoplamiento habituales para
procedimientos con enlaces peptídicos en fase sólida como la
combinación de hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tris-pirrolidinofosfonio
y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base
terciaria como N,N-diisopropiletilamina. Puede liberarse el
compuesto final I de la resina usando una mezcla de ácido
trifluoroacético, diclorometano y agua.
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Una estrategia alternativa para obtener un
compuesto de fórmula I supone la acilación de las aminas IV y X con
aminoácidos de fórmulas XIIIa y XIIIb, respectivamente (método
B).
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Método
B
Tal como será obvio para un experto en la
técnica, es posible combinar algunas etapas del método A con algunas
etapas del método B para obtener un compuesto de fórmula I.
Las aminas primarias de partida VIa, VIb y VIc
están disponibles comercialmente o pueden obtenerse mediante
métodos conocidos (March, Advanced Organic Chemistry, 1991, Ed. John
Wiley & Sons) o usando por ejemplo, el esquema descrito a
continuación.
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Esquema
1
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Puede obtenerse una amina mediante la reacción
de Mitsunobu partiendo de un alcohol y ftalimida potásica en
presencia de, por ejemplo, azodicarboxilato de dietilo (DEAD) y
trifenilfosfina en tetrahidrofurano como disolvente y escisión
adicional con hidrato de hidrazina (Mitsunobu, J. Am. Chem. Soc.
1972, 94, 679-680).
Pueden sintetizarse glicinas
N-sustituidas XIIIa y XIIIb mediante los métodos mostrados a
continuación, o bien mediante aminación reductora de la
correspondiente glicina con el aldehído adecuado (esquema 2) usando
agentes reductores tales como NaBH_{4}, NaBH_{3}CN o
NaBH(AcO)_{3}, o bien mediante sustitución
nucleófila de un éster con la amina adecuada E-NH2
(esquema 3).
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Esquema
2
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Esquema
3
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Los compuestos de fórmula II pueden obtenerse
usando reacciones análogas a las descritas anteriormente.
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Por tanto, con el fin de obtener el
correspondiente ácido carboxílico de fórmula I, es decir, un
compuesto de fórmula Ia, se usa la misma secuencia para la síntesis
de un compuesto de fórmula I (usando los métodos A y/o B), excepto
porque el soporte sólido de partida (IVa) tiene átomos de halógeno
reactivos en lugar de un grupo amino.
También se obtiene el péptido XVI que va a
unirse al compuesto usando reacciones habituales para la síntesis
de péptidos. Por tanto, se hace reaccionar en primer lugar la amina
de soporte sólido IV con una lisina protegida (XIVa) y
opcionalmente se hace reaccionar posteriormente con otro aminoácido
protegido (XIVb). Tras el acoplamiento, se elimina el grupo
protector. Puede repetirse esta secuencia hasta tres veces.
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Entonces se hace reaccionar el ácido carboxílico
Ia con la amina XVI y tras la desprotección, se obtiene el
compuesto IIa. El acoplamiento de amida entre IIa y el poli(ácido
glutámico) XVIIa (obtenido a partir de la correspondiente sal XVII)
produce el conjugado de fármaco III.
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Los compuestos de la presente invención son
inhibidores de apaf-1. Por tanto, son útiles para el
tratamiento o la prevención de un estado asociado con el exceso de
apoptosis.
En los adultos, las células posmitóticas, tales
como neuronas y células del músculo cardiaco rara vez se renuevan.
Así, su pérdida puede producir trastornos neurológicos y cardiacos.
Estas células experimentan muerte celular apoptótica en una
variedad de enfermedades degenerativas agudas y crónicas. De manera
similar, el choque séptico, la isquemia y la intoxicación pueden
producir una apoptosis masiva en múltiples órganos. Las infecciones
pueden producir un elevado recambio apoptótico de tipos celulares
específicos, por ejemplo, linfocitos en el SIDA o células de la
mucosa gástrica en la infección por Helicobacter pylori. Los
acontecimientos de apoptosis también son de gran importancia en
procedimientos para la reperfusión isquémica y de conservación en el
trasplante de órganos. Por tanto, estas enfermedades son candidatos
para la supresión terapéutica de la muerte celular.
Otras enfermedades o estados relacionados con la
apoptosis incluyen, sin limitación, accidente cerebrovascular,
traumatismos, lesión cerebral, lesión de la médula espinal,
meningitis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, esclerosis
múltiple, enfermedades relacionadas con priones, así como otras
enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, patologías
relacionadas con el alcohol y tratamiento de la alopecia.
Por tanto, la presente invención se refiere al
uso de estos compuestos para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o la prevención de las enfermedades o estados
mencionados anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de un compuesto de fórmula I, sin la condición de R2, o un
compuesto que es un conjugado de polímero-fármaco
tal como se definió previamente, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o
estado asociado con la apoptosis.
También se describe un método para el
tratamiento o la prevención de un estado asociado con la inhibición
de la apoptosis que comprende administrar un compuesto de fórmula I,
sin la condición de R2, o un compuesto que es un conjugado de
polímero-fármaco tal como se definió previamente y
uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
También se decribe un método para el tratamiento
o la prevención de accidente cerebrovascular, traumatismos, lesión
cerebral, lesión de la médula espinal, meningitis, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington,
enfermedad de Kennedy, esclerosis múltiple, enfermedades
relacionadas con priones, isquemia miocárdica, así como otras
enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, trasplante de
órganos, patologías relacionadas con el alcohol y tratamiento de la
alopecia, que comprende administrar un compuesto de fórmula I, sin
la condición de R2, o un compuesto que es un conjugado de
polímero-fármaco tal como se definió previamente y
uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención proporciona además
composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula
I o un compuesto que es un conjugado de
polímero-fármaco tal como se definió previamente,
una sal o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto
con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, o bien en
dosis únicas o bien múltiples. Los ejemplos de los excipientes
mencionados a continuación se facilitan únicamente a modo de
ilustración y no han de considerarse como limitantes del alcance de
la invención.
Los compuestos de la presente invención pueden
administrarse en forma de cualquier formulación farmacéutica. La
formulación farmacéutica dependerá de la naturaleza del compuesto
activo y su vía de administración. Puede usarse cualquier vía de
administración, por ejemplo, tal como administración oral, bucal,
pulmonar, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular
e intravenosa), transdérmica, ocular (oftálmica), por inhalación,
intranasal, ótica, transmucosa, con implante o rectal. Sin embargo,
se prefieren la administración oral, tópica o parenteral.
Las composiciones sólidas para la administración
oral incluyen entre otros comprimidos, granulados y cápsulas de
gelatina dura, formuladas tanto como formulaciones de liberación
inmediata como de liberación modificada.
Alternativamente, los compuestos de la presente
invención pueden incorporarse en preparaciones líquidas orales
tales como emulsiones, disoluciones, dispersiones, suspensiones,
jarabes, elixires o en forma de cápsulas de gelatina blanda. Pueden
contener diluyentes inertes usados comúnmente, tales como agua
purificada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles
(macrogoles) y propilenglicol. Las composiciones auxiliares también
pueden contener coadyuvantes tales como agentes humectantes, de
suspensión, edulcorantes, aromatizantes, conservantes, tampones,
agentes quelantes y antioxidantes.
Las preparaciones inyectables para la
administración parenteral comprenden disoluciones, suspensiones o
emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos y pueden
contener coadyuvantes, tales como agentes de suspensión,
estabilización o tonicidad o agentes dispersantes.
El compuesto también puede formularse para su
aplicación tópica. Las formulaciones incluyen cremas, lociones,
geles, polvos, disoluciones, preparaciones de champú, pasta oral,
preparaciones de colutorio y parches, en los que se disuelve o
dispersa el compuesto en excipientes adecuados.
En una realización de la invención, la
composición farmacéutica está en forma de nanoesferas,
micropartículas y nanopartículas.
Puede variar la dosificación eficaz de principio
activo dependiendo del compuesto particular administrado, la vía de
administración, la naturaleza y gravedad de la enfermedad que va a
tratarse, así como la edad, el estado general y el peso corporal
del paciente, entre otros factores. Un ejemplo representativo de un
intervalo de dosificación adecuado es desde aproximadamente 0,001
hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, que pueden
administrarse como una dosis única o dosis divididas. Sin embargo,
la dosificación administrada se dejará generalmente a criterio del
médico.
El ensayo de MTT mide la proliferación celular
así como la reducción de la viabilidad celular cuando
acontecimientos metabólicos conducen a apoptosis o necrosis.
También puede usarse para evaluar la tasa de supervivencia de una
línea celular dada cuando se incuba en presencia de compuestos
xenobióticos. La reducción de sales de tetrazolio se acepta como
una manera fiable de analizar la proliferación celular. El MTT de
tetrazolio amarillo (bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio)
se reduce por células metabólicamente activas y da como resultado
la formación intracelular de formazán púrpura que puede medirse
espectrofotométricamente tras la solubilización con DMSO.
Se usó el ensayo de MTT en esta invención para
evaluar la toxicidad de los compuestos a diferentes concentraciones.
Para analizar su posible alteración de la viabilidad celular, se
añadieron los compuestos a las líneas celulares
Saos-2 y U937 a diferentes concentraciones y se
incubaron a diferentes tiempos. Se expresan los resultados mediante
la viabilidad celular en porcentaje.
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También se usó el ensayo de MTT para evaluar la
recuperación celular mediante la adición de compuestos en líneas
celulares con inducción de apoptosis. Para la línea celular
Saos-2, se llevó a cabo la inducción de apoptosis
mediante la adición de doxiciclina 2 \muM; en el caso de U937,
HeLa, U2-OS, se indujo apoptosis mediante
doxorubicina 0,25 \muM, 1,5 \muM, 2 \muM, respectivamente. Se
expresan los resultados como el % de viabilidad celular
considerando que la adición de doxiciclina y doxorubicina induce un
100% de muerte celular y un 0% de recuperación celular en
Saos-2 y HeLa, U2-OS o U937,
respectivamente.
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Se analizó la inhibición de caspasa dependiente
del tiempo inducida por los compuestos descritos en esta invención.
Se hicieron crecer líneas celulares en presencia o ausencia de los
compuestos (50 \muM) a diferentes tiempos. Se sometió a ensayo la
actividad caspasa usando extractos de células Saos-2
o U937 y Ac-DEVD-afc
(N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-afc
(7-amino-4-trifluorometilcumarina))
como sustrato (20 \muM). Se monitorizó de manera continua la
actividad caspasa mediante la liberación de afc fluorescente usando
un fluorímetro Cytofluor 4000 (excitación a 400 nm; emisión a 508
nm) durante 1 hora. Se expresó el efecto de los compuestos sobre la
actividad caspasa como el porcentaje de inhibición en la señal de
fluorescencia de las células tratadas frente a las células no
tratadas (control).
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Se evaluó la actividad de los compuestos con
respecto a su diana específica dentro de la maquinaria apoptótica.
La oligomerización de Apaf-1 es un acontecimiento
molecular que conduce a la activación de la formación del
apoptosoma, que termina en la inducción de apoptosis. Se realizaron
estos experimentos en ensayos celulares y libres de células.
Para los ensayos libres de células, se
prepararon extractos citoplasmáticos de Hek-293 tal
como se describió anteriormente (Malet et al, 2005) y se
llevó a cabo una división de extracto de células completas. De
manera concomitante, se purificó Apaf-1 recombinante
según Malet et al, 2005. Se incubó la fracción FT (que
contenía caspasa 3 y 9 pero que carecía de Apaf-1),
con Apaf-1 recombinante en presencia de diferentes
concentraciones de los compuestos (véase la figura 1). Se analizó la
actividad de los compuestos mediante la inhibición de la actividad
caspasa (véase anteriormente).
Para los ensayos celulares, se trataron células
Saos-2 y U937 con un activador del apoptosoma
(Nguyen y Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003,
100:7533-7538), que induce específicamente la
oligomerización de Apaf-1. Después, se añadieron
los compuestos a las células (50 \muM) y se incubaron durante 24 ó
48 horas. Se analizó la capacidad de los compuestos de inhibir la
apoptosis inducida por Apaf-1 mediante la inhibición
de la actividad caspasa (véase anteriormente).
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Se realizaron mediciones de la polarización de
fluorescencia en un contador Victor2V 1420 Multilabel HTS. Se
valoró una disolución 60 nM de IIa.1 marcado con
5'-6'-carboxifluoresceína
(denominado CF-IIA.1; \lambdaexc=480 nm;
\lambdaem=535 nm) en tampón A (el volume de reacción total era de
200 \mul) con disoluciones de proteínas concentradas. Se
registraron los datos usando un software Wallac 1420 Workstation. Se
calcularon los valores de Kd usando un modelo de dos estados (véase
la figura 2).
Para caracterizar inicialmente el sitio de unión
de los peptoides al apoptosoma, se sintetizó un análogo fluorescente
de IIa.1 (CF-IIa.1). CF-IIa.1 se
unió al dominio CARD de Apaf-1, pero no al citocromo
c y otras proteínas control (Malet et al, 2005), con una
constante de disociación (Kd) de 60 nM tal como se determinó en un
ensayo de polarización de fluorescencia (figura 2). No obstante, se
contrastó el valor de la constante de unión con la concentración de
IIa.1 que se necesitaba para inhibir el 50% de la actividad caspasa
en los ensayos (CI_{50} \approx 30 \muM, figura 1). Una
supuesta explicación para conciliar estos datos es que el lisado de
reticulocitos usado para la traducción in vitro de la
procaspasa 9 contenía componentes que disminuían la concentración
eficaz de IIa.1.
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Se han usado las siguientes abreviaturas en los
ejemplos:
Boc: terc-butoxicarbonilo
DCM: diclorometano
DIC:
N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMF:
N,N'-dimetilformamida
eq.: equivalente molar
EtOAc: acetato de etilo
Fmoc: fluorenilmetoxicarbonilo
Glicina: G
HATU: hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HOBT: 1-hidroxibenzotriazol
Lisina: K
PGA: poli(ácido L-glutámico)
Fenilalanina: F
PyBOP: hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tris-pirrolidinofosfonio
R: Arginina
tr: tiempo de retención
TFA: ácido trifluoroacético
Valina:V
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La presente invención se ilustrará
adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se
facilitan únicamente a modo de ilustración y no han de
interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Se adquirió la resina de poliestireno AM RAM
(0,75 mmol/g) de Rapp Polymere GmbH (Alemania). Se adquirió la
resina de cloruro de 2-clorotritilo (1,4 mmol/g) de
Novabiochem. Se llevó a cabo una RP-HPLC
semipreparativa con un sistema Waters (Milford, MA, EE.UU.) usando
una columna X-Terra C_{18} (19 \times 25 cm, 5
\mum); eluyente: A = TFA al 0,1% en agua; B = TFA al 0,1% en
acetonitrilo, gradiente: 0 min. 20% de B - 20 min. 80% de B. Se
registraron los espectros de masas de alta resolución
(EMAR-FAB) en el Servicio de Espectrometría de
Masas de la Universidad de Santiago de Compostela (España).
La nomenclatura usada en este documento está
basada en AUTONOM (nomenclatura automática), un sistema
informatizado del Instituto Beilstein para la generación de la
nomenclatura sistemática de la IUPAC.
\newpage
Producto intermedio
VIII
A una disolución de 2 g de anhídrido maleico (20
mmol) en cloroformo, se añadieron 1,8 ml de alcohol alílico (26
mmol, 1,3 eq.). Se agitó la mezcla de reacción a 60ºC durante 50
min. con irradiación de microondas. Se trató la disolución
resultante con HCl 1 N y se extrajo con cloroformo. Se lavaron los
extractos orgánicos con salmuera y luego se secaron sobre sulfato
de magnesio anhidro y se filtraron. Se eliminó por destilación el
disolvente a presión reducida y se purificó el residuo obtenido
mediante cromatografía en columna para obtener el producto
intermedio VIII como un aceite (95% de pureza, 85% de
rendimiento).
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Compuestos de fórmula
I
Se trató la resina Rink-amida
con 3 ml de piperidina al 20% en DMF y se agitó la mezcla en un
reactor de microondas durante 2 min. a 60ºC. Se filtró la resina y
se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3
x 3 ml). Se trató la resina con una disolución de ácido bromoacético
(V, 275 mg, 5 eq.) y DIC (306 \mul, 5 eq.) en DMF (3 ml). Se
agitó la mezcla de reacción durante 2 min. a 60ºC en un reactor de
microondas. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la
resina una disolución de 2,4-diclorofenetilamina
(VIa, diclorofenetilamina (VIa, 300 \mul, 5 eq.) y trietilamina
(275 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y se agitó la suspensión durante
2 min. a 90ºC con activación de microondas. Se eliminó el
sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató
la resina con una disolución de éster monoalílico del ácido
(Z)-but-2-enodioico
(VIII, 310 mg, 5 eq.), HOBT (267 mg, 5 eq.) y DIC (306 \mul, 5
eq.) en DCM:DMF (2:1, 3 ml). Se agitó la mezcla de reacción a
temperatura ambiente durante 30 min., se filtró y se repitió la
reacción en las mismas condiciones. Se escurrió la resina y se lavó
con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3
ml). Después, se añadió a la resina una disolución de
3,3-difenilpropilamina (VIb, 418 mg, 5 eq.) y
trietilamina (275 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y se agitó la
suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se repitió la
reacción durante la noche a la misma temperatura. Se eliminó el
sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató
la resina con una disolución de ácido bromoacético (V, 275 mg, 5
eq.) y DIC (306 \mul, 5 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla de
reacción durante 2 min. a 60ºC en un reactor de microondas. Se
escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la resina una
disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 200
\mul, 5 eq.) y trietilamina (210 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y
se agitó la suspensión durante 2 min. a 90ºC con activación de
microondas. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y
se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3
x 3 ml). Después, se trató la resina con
tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (46 mg, 0,1
eq.) y fenilsilano (490 \mul, 10 eq.) en DCM anhidro durante 15
min. a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Se repitió
tres veces este procedimiento. Se eliminó el sobrenadante y se
escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Se fomentó la ciclación
mediante tratamiento con PyBOP (308 mg, 1,5 eq.), HOBT (80 mg, 1,5
eq.) y DIPEA (203 \mul, 3 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla
de reacción a temperatura ambiente durante 16 h y se filtró. Se
escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Finalmente, el tratamiento
de la resina con una mezcla de TFA/DCM/agua 60:40:2 liberó una
mezcla de reacción bruta que contenía el compuesto del título I.1,
que se filtró. Se eliminaron los disolventes del filtrado mediante
evaporación a presión reducida seguido por liofilización. Se
purificó el residuo obtenido mediante una RP-HPLC
semipreparativa usando un gradiente de acetonitrilo acuoso (42% de
acetonitrilo \rightarrow 80% de acetonitrilo, 35 min.) para dar 91
mg del producto deseado (30% de rendimiento, pureza
\geq 98%).
\geq 98%).
EMAR (M + H)^{+}: Calc. para
C_{39}H_{38}Cl_{4}N_{4}O_{4}, 767,1647; hallado,
767,1720.
\newpage
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
para el ejemplo I.1, pero usando diferentes aminas, se obtuvieron
los siguientes productos:
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Producto intermedio
Ia
Se trató la resina de cloruro de
2-clorotritilo (IVa, 700 mg, 0,98 mmol) con una
disolución de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5 eq.) y DIPEA (840
\mul, 5 eq.) en DCM (4 ml). Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante 1 h, se extinguió la reacción con metanol (550
\mul) y se prolongó la agitación durante 10 min. Se eliminó el
sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DCM (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió una
disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIa, 740
\mul, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF a la
resina y se agitó la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente.
Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con
DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml).
Después, se trató la resina con una disolución de éster monoalílico
del ácido
(Z)-but-2-enodioico
(VIII) (765 mg, 5 eq.), HOBT (662 mg, 5 eq.) y DIC (760 \mul, 5
eq.) en DCM:DMF 2:1 (4 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante
30 min. a temperatura ambiente, se filtró y se repitió en las mismas
condiciones. Después, se añadió a la resina una disolución de
3,3-difenilpropilamina (VIb, 1,0 g, 5 eq.) y DIPEA
(840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF y se agitó la suspensión durante
3 h a temperatura ambiente. Se repitió la reacción, se prolongó la
agitación hasta 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el
sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató
la resina con una disolución de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5
eq.) y DIC (760 \mul, 5 eq.) en DCM:DMF 2:1 (4 ml). Se agitó la
mezcla de reacción durante 30 min. a temperatura ambiente. Se
escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la resina una
disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 740
\mul, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF y se agitó
la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el
sobrenadante y se escurrió el residuo y lavó con DMF (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató
la resina con
tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (114 mg,
0,1 eq.) y fenilsilano (1,2 ml, 10 eq.) en DCM anhidro durante 15
min. a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Ésta etapa
sintética se llevó a cabo por triplicado. Se eliminó el sobrenadante
y se escurrió el residuo y lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se fomentó la ciclación
mediante tratamiento con PyBOP (765 mg, 1,5 eq.), HOBT (199 mg, 1,5
eq.) y DIPEA (505 \mul, 3 eq.) en DMF (4 ml). Se agitó la mezcla
a temperatura ambiente durante 48 h y se filtró. Se escurrió la
resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3
ml) y DCM (3 x 3 ml). Finalmente, el tratamiento de la resina con
una mezcla de TFA/DCM 5:95 liberó una mezcla de reacción bruta que
se filtró. Se eliminaron los disolventes del filtrado a presión
reducida seguido por liofilización para dar el compuesto Ia (460 mg,
61% de rendimiento, pureza \geq 55%) como un sólido incoloro.
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Productos intermedios
IIa
Se desprotegió la resina
Rink-amida (IV, 505 mg, 0,4 mmol) con 3 ml de
piperidina al 20% en DMF. Se agitó la mezcla en un reactor de
microondas durante 2 min. a 60ºC. Se filtró la resina y se lavó con
DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml).
Se unió
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH
(XIVa, 2 eq) a la resina usando HOBT (108 mg, 2 eq.) y DIC (125
\mul, 2 eq.). Se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura
ambiente. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml),
alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Tras la
eliminación del grupo Fmoc con 3 ml de piperidina al 20% en DMF (30
min.), se lavó la resina con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico
(3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). En caso necesario, se acoplaron los
otros aminoácidos (XIVb) en las mismas condiciones tal como se
describió anteriormente para producir el producto intermedio
XVI.
Al producto intermedio XVI hinchado con DMF, se
le añadió el ácido Ia (460 mg, 1,5 eq.) en presencia de HATU (228
mg, 1,5 eq.) y DIPEA (205 \mul, 3 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16 h y se filtró.
Se escurrió la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol
isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). El tratamiento de la
resina con una mezcla de TFA/DCM/agua/triisopropilsilano
80:20:2,5:2,5 permitió la liberación de una mezcla de reacción bruta
que contenía el compuesto IIa, que se filtró. Se eliminaron los
disolventes del filtrado a presión reducida, seguido por
liofilización. Se purificó el residuo obtenido mediante
RP-HPLC semipreparativa usando una mezcla en
gradiente de acetonitrilo acuoso.
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Compuestos de fórmula
III
A una disolución de sal de sodio de PGA (XVII,
0,1 g, 0,5 mmol) con un intervalo de peso molecular (M_{w}) de
17000-43000 Da en agua, se le añadió HCl 0,2 M,
hasta que se ajustó el pH de la reacción hasta 2,0. Se recogió el
precipitado, se dializó frente a agua y se liofilizó. Después se
disolvió el PGA en su forma protonada (XVIIa) en DMF seca (7,5 ml)
y se añadieron DIC (3 eq.) y HOBt (3 eq.) y se dejaron agitando
durante 15 min. Después, se añadió el producto intermedio IIa.1
(0,052 mmol (12% molar) 1 eq.) y se ajustó el pH hasta 8 con DIPEA
(1,5 ml). Se dejó avanzar la reacción a temperatura ambiente durante
36 h. La cromatografía en capa fina (CCF, sílice) mostró una
conversión completa de IIa.1 (R_{f} = 0,5) en el conjugado de
polímero (R_{f} = 0, MeOH:H_{2}O:AcOH = 85:10:5). Para detener
la reacción, se vertió la mezcla en CHCl_{3}. Se recogió el
precipitado resultante y se secó a vacío. Se obtuvo la sal de sodio
del conjugado de PGA-peptoide III.1 disolviendo el
producto en NaHCO_{3} 1,0 M. Esta disolución acuosa se dializó
frente a agua destilada (M_{W}CO de 6.000-8000
Da). La liofilización del dializado proporcionó el producto como un
polvo blanco. El contenido de peptoide total en el polímero tal
como se determinó mediante UV (\lambda = 282 nm) estaba en el
intervalo del 25-30% (p/p) (funcionalización del
10-12%), contenido de fármaco libre < 1% en peso
de fármaco total.
Se analizaron el peso molecular promedio (Mw),
la polidispersidad (Mw/Mn) y el comportamiento de III.1 y el
control XVII en la disolución mediante cromatografía de exclusión
por tamaños (SEC) y ultracentrifugación analítica (AUC). Ambas
técnicas mostraron a III.1 como una estructura conformacional más
compacta con un menor volumen hidrodinámico y un mayor coeficiente
de sedimentación (S) que XVII (tr = 12,5 min. y S = 3,5 \pm 0,4 s
frente a tr = 11,6 min. y S = 1,9 \pm 0,1 s para III.1 y XVII,
respectivamente). Se determinó el Mw mediante equilibrio de
sedimentación como de 26700 Da para XVII y 58600 Da para III.1, sin
embargo se determinaron Mw de 36000 Da (Mw/Mn = 1,8) y 38000 Da
(Mw/Mn = 1,5) para XVII y III.1, respectivamente, mediante CPG
usando patrones de
PEG.
PEG.
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Se preparó una disolución madre de IIa en MeOH
(1 mg/ml). Para obtener una curva de calibrado, se diluyeron
muestras usando MeOH para proporcionar un intervalo de concentración
de 0-1 mg/ml. Se determinó la carga de fármaco
total de los conjugados midiendo la densidad óptica a 272 nm y 281
nm en H_{2}O. Se usó PGA en H_{2}O como blanco, en el mismo
intervalo de concentración (0-5 mg/ml) que el
conjugado III analizado. El coeficiente de extinción hallado para
IIa a 281 nm en MeOH a TA fue \varepsilon = 713 l mol^{-1}
cm^{-1}.
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Se prepararon disoluciones acuosas de III.1 (1
mg/ml) y se añadió una alícuota (100 \mul) a un tubo de
polipropileno y se enrasó hasta 1 ml con agua. Se ajustó el pH de
las muestras hasta 8 con tampón formiato de amonio (100 \mul, 1
M, pH 8,5) y después se añadió CHCl_{3} (5 ml). Se extrajeron
después las muestras meticulosamente mediante agitación con vórtex
(3 x 10 s). Se eliminó cuidadosamente la fase acuosa superior y se
evaporó el disolvente bajo N_{2}. Se disolvió el residuo seco en
200 \mul de acetonitrilo de calidad para HPLC. Se llevó a cabo el
mismo procedimiento en paralelo para el compuesto original IIa.1
(usando 200 \mul de una disolución madre acuosa de 1 mg/ml). La
adición de 1 ml de acetonitrilo para redisolver el producto dio una
disolución madre de 200 \mug/ml a partir de la que se preparó un
intervalo de concentraciones (de 2 a 100 \mug/ml). Se determinó
la cantidad libre de fármaco en los conjugados mediante HPLC usando
una columna Lichrospher® C18 (150 x 3,9 mm). La velocidad de flujo
era de 1 ml/min usando un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1%
acuoso (desde un 20 hasta un 100% de acetonitrilo en 20 min). El
tiempo de retención fue tr = 14,3 min. para IIa.1 (\lambda = 220
nm).
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Siguiendo este procedimiento como para III.1, se
obtuvieron los siguientes ejemplos:
\newpage
Figura 1: Ensayo de inhibición de caspasa libre
de células usando la fracción citoplasmática FT de
Hek-293 incubada con Apaf-1
recombinante en presencia de diferentes concentraciones del
compuesto IIa.1.
Figura 2: Análisis de la interacción CARD/IIa.1.
Se valoró una disolución 240 nM de CF-IIa.1 en
tampón PBS con concentraciones crecientes de
CARD-Apaf y se midió la polarización de
fluorescencia a 30ºC. Se registraron los datos (media, d.e.; n=3)
en unidades de milipolarización (mP).
Claims (11)
1. Compuesto de fórmula general I,
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sus estereoisómeros y mezclas de
los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y
sales de adición farmacéuticamente aceptables del
mismo,
en la que:
- R1
- representa alquilo (C_{1}-C_{5}), alquenilo (C_{2}-C_{5}), -(CH_{2})_{1-3}-NHCO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb, -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
- R2
- representa -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
- R3
- representa -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), o -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6);
alquilo (C_{1}-C_{5}) y
-alquenilo (C_{2}-C_{5}) pueden estar
opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados
de -O-alquilo (C_{1}-C_{2}),
-S-alquilo (C_{1}-C_{2}),
-NH_{2}, -NH-alquilo
(C_{1}-C_{2}) y -N[alquilo
(C_{1}-C_{2})]_{2};
alquilo (C_{1}-C_{3}) puede
estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
Ra y Rb representan independientemente -H o
-alquilo (C_{1}-C_{3})
Cic (3-6) representa un radical
de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a
6 miembros;
Hetcic (5-6) representa un
radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente
insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos
heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente
sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno,
-CF_{3} y -OH;
Hetar (5-6) y Hetar
(5-10) representan un radical con C o N de un anillo
de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos,
respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos
seleccionados independientemente de O, S y N;
fenilo, 1-naftilo,
2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar
(5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con
uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3}, -OH,
-O-alquilo (C_{1}-C_{3}),
-CO-alquilo (C_{1}-C_{3}),
-alquil (C_{1}-C_{5})-NRaRb,
-NRaRb y -SO_{2}NH_{2};
con la condición de que R2 no representa
2-(4-fluorofenil)etilo.
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2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que R1 representa
-(CH_{2})_{0-3}-Hetcic
(5-6),
-(CH_{2})_{1-3}-Hetar
(5-10),
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo,
-(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo)
o
-(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo),
todos ellos opcionalmente sustituidos.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en
el que R2 representa
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo,
-(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo),
-(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo) o -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, todos ellos opcionalmente sustituidos, con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
-(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo) o -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, todos ellos opcionalmente sustituidos, con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que R3 representa
-(CH_{2})_{1-3}-Hetar
(5-6) o
-(CH_{2})_{2}-fenilo, ambos opcionalmente
sustituidos.
5. Compuesto que es un conjugado de fármaco que
comprende un radical de fórmula II
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\vskip1.000000\baselineskip
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sus estereoisómeros y mezclas de
los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente
aceptables del mismo, conjugado a un polímero de poli(ácido
glutámico), en el que R1, R2 y R3 tiene los significados según se
definen en la reivindicación 1, sin la condición de R2; cada R4
representa independientemente una cadena lateral de cualquiera de
los 20 aminoácidos que se producen de manera natural y n es 0,1, 2 ó
3.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Compuesto de fórmula III que es un conjugado
de fármaco según la reivindicación 2,
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\vskip1.000000\baselineskip
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en el que la proporción de y con
respecto a x es del 25-30% al 75-70%
en
peso.
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7. Compuesto según la reivindicación 5 ó 6, en
el que el poli(ácido glutámico) es poli(ácido
L-glutámico); n representa 2 y R4 representa una
cadena lateral de glicina.
8. Uso de compuesto de fórmula I según la
reivindicación 1, sin la condición de R2, o un compuesto según la
reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de un estado asociado con la inhibición
de la apoptosis.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el
estado se selecciona de accidente cerebrovascular, traumatismos,
lesión cerebral, lesión de la médula espinal, meningitis, enfermedad
de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington,
enfermedad de Kennedy, esclerosis múltiple, enfermedades
relacionadas con priones, isquemia miocárdica, así como otras
enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, trasplante de
órganos, patologías relacionadas con el alcohol o tratamiento de la
alopecia.
10. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I según la reivindicación
1 o un compuesto según la reivindicación 5, una sal o solvato
farmacéuticamente aceptables de los mismos, y uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 10, en forma de nanoesferas, micropartículas y
nanopartículas.
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