ES2338459T3 - Exploracion de alto redimiento de poblaciones mutagenizadas. - Google Patents

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Abstract

Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada, que comprende las etapas de: (a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población; (b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a); (c) amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN; (d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación; (e) opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca; (f) determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento; (g) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos; (h) explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana; (i) diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada; (j) amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c); (k) identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación; (l) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.

Description

Exploración de alto rendimiento de poblaciones mutagenizadas.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención, en los campos de la biología molecular y la genética, se refiere a estrategias mejoradas para identificar mutaciones en poblaciones, basándose en el uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. La invención proporciona además kits que pueden aplicarse en los métodos.
Descripción de la técnica anterior
Las poblaciones que portan mutaciones, o bien inducidas o bien que se producen de manera natural, se usan en la investigación genómica moderna para identificar genes que afectan a rasgos de importancia mediante enfoques de genética inversa. Esto es aplicable en particular a plantas y cultivos de importancia agronómica, aunque tales poblaciones también son útiles para otros organismos tales como levaduras, bacterias, etc. También pueden usarse otros organismos, tales como animales, aves, mamíferos, etc., aunque estas poblaciones son normalmente más engorrosas de obtener o controlar. No obstante, se observa que la invención descrita en el presente documento es de una naturaleza muy general, y puede aplicarse también a tales organismos. Altschuler et al. (Nature 2000, 407, 513-516) dan a conocer un método para analizar SNP en el que se mezclan y analizan diferentes muestras.
Las poblaciones mutagenizadas representan herramientas complementarias para el descubrimiento de genes, puesto que tales mutaciones se usan comúnmente para explorar genes conocidos para detectar mutaciones de pérdida de función o evaluar cambios en el fenotipo en organismos con el gen mutado. La etapa limitativa de la velocidad es el trabajo de exploración asociado con la identificación de, respectivamente, organismos que portan una mutación en el gen de interés. Más adelante, se describen en más detalle los principios de tales poblaciones y los métodos de exploración y se presentan métodos de exploración más eficaces que aumentan el valor de estas herramientas para el descubrimiento de genes.
Una tecnología que usa poblaciones mutagenizadas conocida como TILLING (detección de lesiones locales inducidas en genomas) ("Targeted Induced Local Lesions in Genomes") (McCallum et al., Nat. Biotechnol 2000, 18, 455-457, McCallum et al., Plant Physiology, 2000,123, 439-442: Till et al. Genome Research 2003, 13, 524-530 Wienholds et al, Methods in Cell Biology 2004, 70, 69-90) se basa en la introducción al azar de grandes números de mutaciones (la mayoría de las veces sustituciones de nucleótidos) en el genoma mediante tratamiento con metanosulfonato de etilo (EMS) o mediante radiación ionizante (bombardeo con neutrones rápidos) (Li et al. The Plant Journal, 2001, 27, 235-42). Cada planta de la población porta varios cientos (o miles) de mutaciones, algunas de las cuales afectan al desarrollo normal, a la morfología o confieren de otro modo un fenotipo debido a pérdida de función (desactivación, reducción) de uno o múltiples genes o sus secuencias reguladoras. Una población TILLING contiene generalmente un número suficiente de plantas para cubrir todos los genes con múltiples mutaciones independientes (5-20 por gen). Una población de plantas mutagenizada usada en TILLING consiste por tanto habitualmente en 3000-10.000 plantas y puede usarse de dos modos:
Genética inversa
La "genética inversa" es el modo más común de usar poblaciones TILLING. Se identifica un gen de interés, por ejemplo, obteniendo el perfil de transcritos o mediante un enfoque de gen candidato, y la pregunta que ha de responderse es si este gen afecta a un rasgo fenotípico particular de interés. Por tanto, el desafío es identificar una (o varias) plantas con mutaciones de pérdida de función en este gen. Esto se realiza comúnmente en un proceso de exploración de múltiples etapas, que comprende normalmente las siguientes etapas:
1.
Se aísla ADN genómico de un gran número de plantas M2 (reunidas) (por ejemplo, 3072) de la población TILLING.
2.
Se ensamblan conjuntos de cantidades iguales de ADN de desde 8 hasta 32 plantas por conjunto, dependiendo el nivel de reunión de la sensibilidad del sistema de exploración con CEL I (véase más adelante). Esto da como resultado un total de 96 a 384 muestras de ADN reunidas en el caso de 3072 plantas.
3.
Se usan cebadores de PCR marcados para amplificar partes del gen de todos los ADN reunidos. Se usan fragmentos de PCR solapantes para cubrir todo el gen (por ejemplo, se amplifican fragmentos de PCR de 3 * 600 pb a partir de un gen de 1500 pb).
4.
Se preparan heterodúplex de los productos de PCR obtenidos a partir de las muestras de ADN reunidas y se incuban con CEL I u otra enzima que reconoce y corta apareamientos erróneos de secuencia de un único nucleótido (por ejemplo, nucleasa Mung Bean, nucleasa S1, Surveyor etc.) y las muestras tratadas se resuelven en un gel desnaturalizante (secuenciación) o mediante electroforesis capilar.
5.
Se identifican conjuntos que contienen una planta que porta una mutación en el gen observando las bandas de productos de digestión que resultan del tratamiento con CEL I.
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Para identificar la planta que porta la mutación, se repiten las PCR en ADN individuales de las plantas en los conjuntos positivos, seguido por secuenciación de Sanger bidireccional.
Las plantas que albergan una mutación se hacen crecer y se cruzan de manera lejana con el tipo natural para establecer una relación causal entre la mutación y el cambio observado en el fenotipo.
La ventaja de la exploración con CEL I (etapas 3-5 anteriores) es que la preexploración de las muestras reunidas ahorra costes con respecto a la secuenciación de todas las plantas individualmente mediante secuenciación de Sanger.
Sin embargo, una limitación de la exploración con CEL I es que no todas las mutaciones identificadas afectan a la función del gen (por ejemplo, sustituciones silenciosas) y esto no se sabe hasta que se secuencian los productos de PCR de plantas individuales en un conjunto positivo. No obstante, el método de exploración mediada por CEL I ahorra costes en comparación con la secuenciación de productos de PCR de todas las plantas por separado.
Otra limitación es que la exploración con CEL I implica la ejecución de geles y puntuación, un proceso relativamente engorroso que requiere la confirmación de mutaciones de la segunda hebra puesto que los patrones de gel no siempre están bien definidos.
Una tercera desventaja es que la exploración con CEL I es relativamente insensible a la detección de mutaciones en los extremos terminales del producto de PCR, lo que puede conducir a que algunas mutaciones no se detecten. Desventajas adicionales de CEL I son que se ha encontrado que la enzima es extremadamente sensible a las condiciones de reacción tales como las concentraciones de sal. Esto hace que la enzima pueda usarse sólo en un número limitado de tampones, dificultando de ese modo el uso amplio de CEL I. Otra desventaja práctica asociada con la aplicación de CEL I es que la enzima no es fiable en el corte de todos los heterodúplex con apareamientos erróneos.
Finalmente, la exploración con CEL I no puede distinguir mutaciones sustitutivas (que son las más prevalentes) de mutaciones no sustitutivas, provocando que se lleve a cabo una gran cantidad de trabajo de exploración en conjuntos positivos sin producir mutaciones interesantes.
Genética directa
Se hacen crecer plantas de la población mutagenizada y se fenotipan para determinar rasgos de interés. Entonces, las plantas con un fenotipo interesante se cruzan con una planta de tipo natural para cruzar de manera lejana mutaciones que no están ligadas al fenotipo de interés. Finalmente, el gen mutado responsable del fenotipo de interés se identifica mediante clonación posicional (usando marcadores genéticos), análoga al mapeo de QTL en poblaciones de mapeo genético convencionales (F2, RILO etc.). Aunque teóricamente es posible, las poblaciones mutagenizadas no se usan comúnmente de este modo.
La presente invención se realizó en parte para mejorar las estrategias existentes para la exploración de poblaciones mutagenizadas. Es un objeto de la invención proporcionar métodos eficaces para explorar grandes poblaciones para determinar la presencia de mutaciones y para mejorar la evaluación eficaz de las mutaciones para determinar el impacto sobre la función génica, es decir, para reducir la cantidad de esfuerzo consumido en la exploración de mutaciones que no conducen a funciones génicas alteradas. Los presentes métodos se diseñaron para evitar el uso de la enzima CEL I o sus equivalentes.
Sumario de la invención
Los presentes inventores encontraron que usando estrategias de secuenciación de alto rendimiento, se lograban los objetivos mencionados anteriormente, y podían explorarse de manera eficaz poblaciones mutagenizadas, tales como poblaciones TILLING, poblaciones en las que se han introducido mutaciones usando oligonucleótidos que dañan el ADN o mutagénicos (sintéticos) o, es decir mediante intercambio de nucleótidos dirigido ("Targeted Nucleotide Exchange") (TNE) o mediante mutagénesis de región dirigida ("Region Targeted Mutagenesis") (RTM), o poblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural tales como polimorfismos de nucleótido único ("Single nucleotide polymorphisms") (SNP), pequeñas inserciones y deleciones, y variaciones en el número de repeticiones de microsatélites, para determinar la presencia de mutaciones de interés.
Definiciones
En la siguiente descripción y los ejemplos, se usan varios términos. Para proporcionar una comprensión clara y sistemática de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que va a darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos científicos y técnicos usados tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica a la que pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan como referencia al presente documento en su totalidad.
"TILLING" o "detección de lesiones locales inducidas en genomas" ("Targeting induced local lesions in genomes") es una estrategia de genética inversa general que proporciona una serie alélica de mutaciones inducidas (puntuales) mediante mutagénesis química o física al azar en combinación con exploración basada en PCR para identificar mutaciones puntuales en una región de interés. En la exploración TILLING, se amplifican regiones de interés mediante PCR. Se forman heterodúplex entre fragmentos de tipo natural y fragmentos que albergan una mutación inducida mediante la desnaturalización y rehibridación de productos de PCR. Estos heterodúplex se escinden mediante CEL I y los productos escindidos se resuelven. Puede aumentarse el rendimiento mediante reunión. Tras el descubrimiento de productos de PCR que albergan diferencias de secuencia en un conjunto, los productos de PCR incluidos en el conjunto se exploran de nuevo comúnmente mediante secuenciación de Sanger de productos de PCR individuales, identificando de ese modo la planta mutante y la diferencia de secuencia exacta en el gen mutado.
"Población mutagenizada" se refiere a una población de organismos (habitualmente plantas, aunque pueden usarse otros organismos, incluyendo animales tales como Drosophila y ratones para crear poblaciones mutagenizadas; Schimenti et al., 1998, Genome Research 8:698-710) que se han sometido a mutagénesis (química o física) para producir una biblioteca de mutantes. Las poblaciones TILLING pueden variar ampliamente en tamaño, y para ciertos fines, pueden usarse poblaciones TILLING parciales que contienen el 90, 80 70, 60, 50, 40, 30 o incluso sólo el 20% de la población original. Como alternativa a poblaciones mutagenizadas, pueden usarse poblaciones en las que la población no está mutagenizada sino que comprende subpoblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural tales como polimorfismos de nucleótido único (SNP), pequeñas inserciones y deleciones, y variaciones en el número de repeticiones de microsatélites. Estas poblaciones son particularmente ventajosas cuando no están fácilmente accesibles poblaciones mutagenizadas (seres humanos) o donde ya están disponibles grandes germoplasmas. Véase por ejemplo Comai et al., The Plant Journal, 2004, 37, 778-786. Una población de este tipo puede usarse en combinación con un "ADN de referencia".
"Intercambio de nucleótidos dirigido" o "TNE". El intercambio de nucleótidos dirigido (TNE) es un procedimiento mediante el cual un oligonucleótido sintético, complementario parcialmente a un sitio en un cromosoma o un gen episomal dirige la inversión de un único nucleótido en un sitio específico. El TNE se ha descrito usando una amplia variedad de oligonucleótidos y dianas. Algunos de los oligonucleótidos notificados son quimeras de ARN/ADN, que contienen modificaciones terminales para conferir resistencia a nucleasas.
"Mutagénesis de región dirigida" o "RTM". La mutagénesis de región dirigida es un procedimiento mediante el que se crean artificialmente roturas de la doble hebra en un sitio diana predefinido en el ADN genómico, dando como resultado la reparación de la rotura mediante uno de diversos mecanismos de reparación celular disponibles, conduciendo la mayoría de las veces a mutaciones en el sitio de la rotura. Pueden crearse roturas de la doble hebra mediante la introducción en el núcleo celular de nucleasas de dedos de zinc (por ejemplo, véase Lloyd et al., 2005), meganucleasas tales como I-Sce1 (Epinat et al., 2003), u oligonucleótidos que forman triples hélices acoplados a grupos químicos mutagénicos. (Havre et al., 1993).
"Ácido nucleico": Un ácido nucleico, tal como se usa en el presente documento, puede incluir cualquier polímero u oligómero de nucleótidos con bases de purina y pirimidina, preferiblemente citosina, timina (o uracilo), adenina y guanina, respectivamente (véase Lehninger, Principles of Biochemistry, en 793-800 (Worth Pub. 1982)). Se incluye cualquier componente de desoxirribonucleótido, ribonucleótido o ácido nucleico peptídico, y cualquier variante química de los mismos, tales como aquéllas con formas metiladas, hidroximetiladas o glicosiladas de estas bases, y similares. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en su composición, y pueden aislarse de fuentes que se producen de manera natural o pueden producirse de manera artificial o sintética. Un ácido nucleico puede ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y puede existir de manera permanente o transitoria en forma mono o bicatenaria, incluyendo homodúplex, heterodúplex y estados híbridos.
"Etiquetado" se refiere a la adición de una etiqueta o un marcador a un ácido nucleico con el fin de distinguirlo de un segundo ácido nucleico o adicional. El etiquetado puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de un identificador de secuencia durante la amplificación usando cebadores etiquetados o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica. Un identificador de secuencia de este tipo puede ser una secuencia de bases única de longitud variable pero definida usada únicamente para identificar una muestra de ácido nucleico específica. Ejemplos típicos son secuencias ZIP. Usando una etiqueta de este tipo, puede determinarse el origen de una muestra tras el procesamiento adicional. En el caso de combinar productos procesados que se originan a partir de diferentes muestras de ácido nucleico, las diferentes muestras de ácido nucleico se identifican generalmente usando diferentes etiquetas.
"Biblioteca etiquetada" se refiere a una biblioteca de ácidos nucleicos etiquetados.
"Secuenciación" se refiere a determinar el orden de nucleótidos (secuencias de bases) en una muestra de ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN.
"Alinear y alineación" significan la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos basándose en la presencia de tramos cortos o largos de nucleótidos similares o idénticos. Se conocen en la técnica varios métodos para la alineación de secuencias de nucleótidos, tal como se explicará adicionalmente más adelante. Algunas veces, los términos "ensamblaje" o "agrupamiento" se usan como sinónimos.
"Exploración de alto rendimiento" (HTS) es un método de experimentación científica especialmente relevante en los campos de la biología y la química. A través de una combinación de robótica moderna y otros instrumentos de laboratorio especializados, la HTS permite a un investigador explorar eficazmente grandes números de muestras de manera simultánea (o prácticamente de manera simultánea).
"Cebadores" se refiere en general a hebras de ADN que pueden cebar la síntesis de ADN. La ADN polimerasa no puede sintetizar ADN de novo sin cebadores: sólo puede extender una hebra de ADN existente en una reacción en la que se usa la hebra complementaria como molde para dirigir el orden de nucleótidos que van a ensamblarse. Las moléculas de oligonucleótido sintéticas que se usan en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se denominan en el presente documento cebadores.
"Cebadores con afinidad aumentada" son cebadores con nucleótidos modificados tales como PNA o LNA, lo que aumenta su estabilidad térmica y permite la amplificación específica de alelo basándose en diferencias de secuencia de un único nucleótido. Con el fin de lograr esto, se incluyen a menudo uno o varios nucleótidos modificados, preferiblemente en el extremo 3' del cebador.
"Amplificación del ADN" se usa normalmente para indicar la síntesis in vitro de moléculas de ADN bicatenario usando PCR. Se indica que existen otros métodos de amplificación y también pueden usarse en la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Representación esquemática de secuencias agrupadas que resultan de la secuenciación aleatoria de un gen para identificar mutaciones inducidas por EMS. Las mutaciones están coloreadas más claras, los errores de secuencias más oscuros. Se espera que se observen errores de secuencia aleatoriamente y lo más a menudo tan sólo una vez.
Figura 2: Representación esquemática de la secuenciación etiquetada agrupada que resulta de una región génica de 100 pb amplificada con cebadores de PCR con etiqueta de 4 pb de una biblioteca agrupada 3-D. Las mutaciones están coloreadas más claras, los errores de secuencia más oscuros. Se conocen las ID de plantas para mutaciones identificadas mediante 3 etiquetas (1, 2, 3) y (4, 5, 6) pero no las identificadas mediante menos de 2 etiquetas (7, 8). Se espera que se observen errores de secuencia aleatoriamente y tan sólo una vez.
Figura 3: Ilustración del sistema de cebadores de PCR largos y cortos para su uso en el etiquetado de secuencias.
Figura 4. Estimación en gel de agarosa del rendimiento de amplificación por PCR de la amplificación del exón 1 de eIF4E para cada uno de los 28 conjuntos 3D.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a un método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada que comprende las etapas de:
(a)
Aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro en la población;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) de los conjuntos de ADN;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;
(f)
determinar la secuencia de nucleótidos de los productos y/o fragmentos usando secuenciación de alto rendimiento;
(g)
identificar mutaciones agrupando (alineando) las secuencias de los fragmentos;
(h)
explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;
(i)
diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;
(j)
amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);
(k)
identificar el/los miembro(s) que porta(n) la mutación;
(l)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
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El aislamiento del ADN se logra generalmente usando métodos comunes en la técnica tales como la recogida de tejido de un miembro de la población, la extracción de ADN (por ejemplo usando el kit de ADN rápido Q-Biogene), la cuantificación y la normalización para obtener cantidades iguales de ADN por muestra. Como ejemplo, la presente invención se ilustra basándose en una población TILLING de 3072 plantas y un gen de 1500 pb.
La reunión del ADN aislado puede lograrse por ejemplo usando un esquema de reunión tridimensional (Vandenbussche et al., 2003, The Plant Cell, 15: 2680-93). La reunión se logra preferiblemente usando cantidades iguales de ADN. El esquema de reunión 3D puede comprender 15x15x14, dando como resultado 44 conjuntos (15+15+14) que contienen 3072/14 = 219 ó 3072/15 = 205 muestras de ADN diferentes por conjunto. Pueden usarse otros esquemas de reunión.
La etapa de reunión sirve normalmente para identificar la planta que contiene una mutación observada tras una ronda de exploración por PCR. La reunión del ADN sirve además para normalizar los ADN antes de la amplificación por PCR para proporcionar una representación más igual en las bibliotecas para la secuenciación. La ventaja adicional de la reunión del ADN es que no todas las secuencias han de determinarse por separado, sino que los conjuntos permiten la identificación rápida de las secuencias de interés, en particular cuando se usan bibliotecas etiquetadas. Esto facilita la exploración de poblaciones grandes o complejas en particular.
La amplificación de la secuencia diana con un par de cebadores opcionalmente marcados de los conjuntos puede lograrse usando un juego de cebadores que se han diseñado para amplificar el gen de interés. Tal como se establece, los cebadores pueden marcarse para visualizar el producto de amplificación del gen de interés.
Los productos de amplificación se reúnen, preferiblemente en cantidades iguales o normalizadas, para crear de ese modo una biblioteca de productos de amplificación. A modo de ejemplo, la complejidad de la biblioteca será de 3072 plantas X secuencia génica de 1500 pb = secuencia de 4,6 Mb.
Los productos de amplificación de la biblioteca pueden fragmentarse aleatoriamente antes de la secuenciación de los fragmentos en el caso de que la longitud del producto de PCR supere la longitud promedio de las trazas de secuencia. La fragmentación puede lograrse mediante técnicas físicas, es decir, cizalladura, sonicación u otros métodos de fragmentación al azar. En la etapa (f), se determina al menos parte, pero preferiblemente toda la secuencia de nucleótidos de al menos parte de, pero preferiblemente todos los fragmentos contenidos en las bibliotecas. En ciertas realizaciones, la etapa de fragmentación es opcional. Por ejemplo, cuando la longitud de lectura de la técnica de secuenciación y la longitud de los fragmentos de PCR son aproximadamente las mismas, no hay necesidad de fragmentación. También en el caso de productos de PCR más grandes, esto puede no ser necesario si es aceptable que sólo parte del producto de PCR se secuencie por ejemplo en el caso de un producto de PCR de 1500 pb y una longitud de lectura de 400 (desde cada lado) a 700 pb permanezca sin secuenciar.
La secuenciación puede realizarse en principio por cualquier medio conocido en la técnica, tal como el método de terminación de cadena didesoxi (secuenciación de Sanger), aunque éste se prefiere menos dado el gran número de secuencias que han de determinarse. Sin embargo, se prefiere y es más ventajoso que la secuenciación se realice usando métodos de secuenciación de alto rendimiento, tales como los métodos dados a conocer en los documentos WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos en nombre de 454 Life Sciences), por Seo et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93, y tecnologías de Helios, Solexa, US Genomics, etcétera, que se incorporan al presente documento como referencia. Lo más preferido es que la secuenciación se realice usando el aparato y/o método dado a conocer en los documentos WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos en nombre de 454 Life Sciences). La tecnología descrita permite la secuenciación de 40 millones de bases en una única ejecución y es 100 veces más rápida y barata que la tecnología de la competencia. La tecnología de secuenciación consiste en líneas generales en 5 etapas: 1) fragmentación de ADN y ligación de un adaptador específico para crear una biblioteca de ADN monocatenario (ADNss); 2) hibridación del ADNss con perlas, emulsificación de las perlas en microrreactores de agua en aceite y realizar PCR en emulsión para amplificar las moléculas de ADNss individuales en las perlas; 3) selección de/enriquecimiento para perlas que contienen moléculas de ADNss amplificadas en su superficie 4) deposición de perlas que portan ADN en una PicoTiterPlate®; y 5) secuenciación simultánea en al menos 100.000 pocillos mediante la generación de una señal de luz de pirofosfato. El método se explicará en más detalle a continuación.
En una realización preferida, la secuenciación comprende las etapas de:
(a)
hibridar fragmentos adaptados con perlas, hibridándose un único fragmento adaptado con cada perla;
(b)
emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una única perla;
(c)
cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una única perla; y generar una señal de pirofosfato.
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En la primera etapa (a), se ligan adaptadores de secuenciación a fragmentos dentro de la biblioteca. El adaptador de secuenciación incluye al menos una región "clave" para la hibridación con una perla, una región de cebador de secuenciación y una región de cebador de PCR. Por tanto, se obtienen fragmentos adaptados.
En una segunda etapa, se hibridan fragmentos adaptados con perlas, hibridándose cada perla con un único fragmento adaptado. Al conjunto de fragmentos adaptados, se le añaden perlas en exceso como para garantizar la hibridación de un único fragmento adaptado por perla para la mayoría de las perlas (distribución de Poisson).
En una siguiente etapa, las perlas se emulsionan en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una única perla. Están presentes reactivos de PCR en los microrreactores de agua en aceite permitiendo que tenga lugar una reacción de PCR dentro de los microrreactores. Posteriormente, los microrreactores se rompen y las perlas que comprenden ADN (perlas positivas para ADN) se enriquecen.
En una siguiente etapa, las perlas se cargan en pocillos, comprendiendo cada pocillo una única perla. Los pocillos son preferiblemente parte de una placa PicoTiter^{TM} que permite la secuenciación simultánea de una gran cantidad de fragmentos.
Tras la adición de perlas que portan enzimas, la secuencia de los fragmentos se determina usando pirosecuenciación. En etapas sucesivas, la placa PicoTiter^{TM} y las perlas así como las perlas con enzimas en las mismas se someten a diferentes desoxirribonucleótidos en presencia de reactivos de secuenciación convencionales, y tras la incorporación de un desoxirribonucleótido se genera una señal de luz que se registra. La incorporación del nucleótido correcto generará una señal de pirosecuenciación que puede detectarse.
La pirosecuenciación se conoce por sí misma en la técnica y se describe entre otros en www.biotagebio.com; www.pyrosequencing.com/section technology. La tecnología se aplica además en por ejemplo los documentos WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos en nombre de 454 Life Sciences).
Las mutaciones se identifican mediante la agrupación de los fragmentos secuenciados en la biblioteca amplificada. La identificación de las mutaciones se logra alineando las secuencias determinadas de los fragmentos de las bibliotecas. La mayoría de las secuencias son de tipo natural (no mutadas) aunque también se observan las mutaciones inducidas y errores de secuenciación ocasionales. A medida que se secuencian las bibliotecas de amplificación con redundancia de múltiples veces (normalmente, redundante de aproximadamente 4 a 5 veces), múltiples observaciones del mismo cambio de secuencia es indicativo de una mutación en vez de un error de secuenciación. Véase la figura 1.
El agrupamiento proporciona alineaciones de los fragmentos en la biblioteca amplificada. De este modo, para cada producto de PCR de la biblioteca, se genera un agrupamiento a partir de los fragmentos secuenciados, es decir, se constituye un contigo de los fragmentos, a partir de la alineación de la secuencia de los diversos fragmentos obtenidos a partir de la fragmentación en la etapa (e).
Se conocen bien en la técnica métodos de alineación de secuencias para fines de comparación. Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; Higgins y Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. Altschul et al. (1994) Nature Genet. 6:119-29 presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología.
La herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI ("Basic Local Alignment Search Tool") (BLAST) (Altschul et al., 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Información Biológica ("National Center for Biological Information") (NCBI, Bethesda, Md.) y en Internet, para su uso junto con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede entrar en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov
BLAST/>. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en
<http://www.ncbi.n1m.nih.gov/BLASTlblast_help.html>.
En el análisis de poblaciones mutagenizadas, tras haberse identificado las mutaciones, se evalúan las mutaciones identificadas para detectar una función modificada del gen asociado, por ejemplo la introducción de un codón de terminación. Esta evaluación se realiza sobre la propia secuencia, por ejemplo mediante traducción de seis marcos. Una vez que se han identificado mutaciones interesantes, las mutaciones se investigan adicionalmente para identificar el miembro asociado de la población.
Para cada mutación que se ha clasificado como mutación interesante, se diseña un cebador específico de alelo que selecciona como diana la mutación de interés. Por tanto, el cebador específico de alelo se usa entonces en combinación con uno de los cebadores usados en la amplificación de las muestras de ADN reunidas (o bien el cebador inverso o bien el directo). Uno de los o ambos cebadores pueden estar marcados. El juego de cebadores se usa para amplificar los conjuntos de ADN. Los conjuntos positivos se identifican y la planta mutante se identifica. En el esquema de reunión 3D mencionado anteriormente, la PCR específica de alelo con el juego de cebadores para seleccionar las placas de muestras de ADN reunidas 3D da como resultado la identificación de 3 conjuntos positivos (uno en cada dimensión), lo que especifica la ubicación en la biblioteca de la planta mutante.
En ciertas realizaciones; los cebadores específicos de alelo comprenden nucleótidos alternativos tales como ácidos nucleicos cerrados (LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA) para aumentar su especificidad. Tales ácidos nucleicos se conocen ampliamente en la técnica y están comercialmente disponibles de una variedad de proveedores.
La confirmación de la mutación se logra mediante la amplificación de la secuencia diana a partir de la planta mutante identificada. Esta amplificación se realiza con los cebadores de la etapa (c). La secuencia de nucleótidos del producto amplificado se determina y mediante comparación con la secuencia consenso, la mutación se identifica. La secuenciación se realiza preferiblemente mediante secuenciación de Sanger.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada que comprende las etapas de:
(a)
aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro en la populación;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar una parte o un segmento de la secuencia diana con un par de cebadores etiquetados (opcionalmente marcados) de los conjuntos de ADN, preferiblemente en el que al menos uno de los cebadores comprende una sección específica de gen, una etiqueta y un sitio de unión a cebador de secuencia;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
determinar la secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación usando secuenciación de alto rendimiento;
(f)
identificar mutaciones agrupando (alineando) las secuencias de los fragmentos;
(g)
identificar el/los miembro(s) que tiene(n) la mutación usando las etiquetas;
(h)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (g) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
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El aislamiento del ADN genómico de los miembros de la población mutagenizada y la reunión del ADN aislado puede llevarse a cabo esencialmente tal como se describió anteriormente.
Una parte o un segmento de la secuencia diana se amplifica usando un par de cebadores etiquetados que pueden estar marcados. Preferiblemente, para cada conjunto de cada dimensión, se usa un cebador diferente. En la ilustración anterior, esto significa que se prefieren 44 cebadores directos y 44 inversos. Preferiblemente, cada uno de los cebadores directo e inverso comprende
(i)
un sitio de unión a cebador de secuencia que puede usarse en la siguiente etapa de secuenciación,
(ii)
una etiqueta que sirve para unir el cebador (y el producto de amplificación resultante) al miembro original de la población, y
(iii)
una secuencia específica de gen que puede hibridarse con la secuencia diana de interés (es decir, el gen).
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En una realización típica, el cebador tiene el siguiente orden:
5'-sitio de unión a cebador de secuencia- - -etiqueta- - -secuencia de cebador de PCR específica de gen-3'
La longitud del sitio de unión a cebador de secuencia y la secuencia de cebador de PCR específica de gen son aquéllas que sean convencionales en el uso de PCR común, es decir, independientemente de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 pb con una preferencia por de desde 15 hasta 25 pb. Preferiblemente, la parte o el segmento de la secuencia que se amplifica corresponde a una longitud que puede secuenciarse en una ejecución usando las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento descritas más adelante. En ciertas realizaciones, la parte o el segmento tiene una longitud de entre aproximadamente 50 pb y aproximadamente 500 pb, preferiblemente desde aproximadamente 75 pb hasta aproximadamente 300 pb y más preferiblemente entre aproximadamente 90 pb y aproximadamente 250 pb. Tal como se indicó anteriormente, esta longitud puede variar con la tecnología de secuenciación empleada incluyendo las que han de desarrollarse aún.
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Usando cebadores (directos y/o inversos) que contienen una secuencia de etiqueta que es única para cada uno de los cebadores que representan todas las dimensiones del conjunto, el origen de planta específico de cada secuencia de etiqueta se conoce a medida que el cebador de secuencia se híbrida en el sentido de 5' de la etiqueta y como consecuencia, la secuencia de etiqueta está presente en cada producto de amplificación. En ciertas realizaciones, tanto los cebadores directos como inversos están etiquetados. En otras realizaciones, sólo uno de los cebadores directos o inversos está etiquetado. La elección entre una o dos etiquetas depende las circunstancias y depende de la longitud de lectura de la reacción de secuenciación de alto rendimiento y/o la necesidad de validación independiente. En el caso de, por ejemplo, un producto de PCR de 100 pb que se secuencia unidireccionalmente, sólo se necesita una etiqueta. En el caso de un producto de PCR de 200 pb y una longitud de lectura de 100 pb, el doble etiquetado es útil en combinación con secuenciación bidireccional dado que mejora la eficacia 2 veces. Proporciona además la posibilidad de validación independiente en la misma etapa. Cuando se secuencia un producto de PCR de 100 pb bidireccionalmente con dos cebadores etiquetados, todas las trazas, independientemente de la orientación, proporcionarán información sobre la mutación. Por tanto, ambos cebadores proporcionan "información de ubicación" sobre qué planta contiene qué mutación.
La etiqueta puede tener cualquier número de nucleótidos, aunque preferiblemente contiene 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos. Con 4 nucleótidos permutados, son posibles 256 etiquetas, mientras que 3 nucleótidos permutados proporcionan 64 etiquetas diferentes. En la ilustración usada, las etiquetas difieren preferiblemente en >1 base, de modo que las etiquetas preferidas tienen 4 pb de longitud. La amplificación usando estos cebadores da como resultado una biblioteca de productos de amplificación etiquetados.
En ciertas realizaciones, puede usarse un sistema de etiquetas en el que el proceso de amplificación incluye
(1)
un cebador de PCR largo que comprende (a) una sección constante en 5' unida a (b) una sección de etiqueta degenerada (NNNN) unida a (c) una sección específica de gen en 3' y
(2)
un cebador de PCR corto en amplificaciones posteriores que consiste en (a) la sección constante en 5' unida a (b) una sección de etiqueta no degenerada en 3' (es decir, una selección entre NNNN).
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La sección de etiqueta no degenerada puede ser única para cada muestra, por ejemplo, ACTG para la muestra 1, AATC para la muestra 2, etc. El cebador corto se híbrida con un subconjunto del cebador largo. La sección constante del cebador puede usarse como cebador de secuencia. Véase la figura 3.
La biblioteca comprende preferiblemente cantidades iguales de productos de PCR de todos los conjuntos amplificados. En el ejemplo ilustrativo, la biblioteca contiene 3072 plantas x 100 pb = secuencia 307 de kb que va a determinarse.
Los productos de PCR de la biblioteca se someten a un procedimiento de secuenciación tal como se dio a conocer anteriormente. En particular, los productos de PCR se unen a perlas usando el sitio de unión a cebador de secuencia que corresponde a la secuencia unida a la perla. Por tanto, la presente realización no requiere fragmentación ni ligación de adaptadores. En su lugar, en esta realización, los adaptadores se han introducido antes por medio del diseño del cebador de PCR. Esto mejora la fiabilidad del método. Tras la hibridación con las perlas, se realiza la secuenciación tal como se describió anteriormente, es decir, (1) emulsificación de las perlas en microrreactores de agua en aceite, (2) PCR en emulsión para amplificar las moléculas de ADNss individuales en las perlas; (3) selección de/enriquecimiento para perlas que contienen moléculas de ADNss amplificadas en su superficie, (4) transferencia de las perlas que portan ADN a una PicoTiterPlate®; y (5) secuenciación simultánea en 100.000 pocillos mediante un método que genera una señal de luz de pirofosfato. El rendimiento típico es de aproximadamente 200.000 secuencias de 100-200 pb, representando una cobertura de 66 veces de todos los productos de PCR de la biblioteca.
El agrupamiento y la alineación se realizan esencialmente tal como se describió anteriormente. La planta individual que contiene la mutación puede identificarse usando las etiquetas. En los ejemplos, la combinación de las 3 etiquetas indica los conjuntos positivos y por consiguiente las coordenadas de la planta individual en los conjuntos.
La confirmación de la mutación volviendo a secuenciar el producto de PCR de la muestra mutante identificada es tal como se describió anteriormente.
Pueden usarse diversas estrategias de reunión con la presente invención, ejemplos de las cuales son la reunión multidimensional (incluyendo reunión 3D) o reunión en columna, fila o placa.
Se describen métodos de secuenciación de alto rendimiento que pueden usarse en el presente documento, por ejemplo, en Shendure et al., Science 309:1728-32. Los ejemplos incluyen secuenciación microelectroforética, secuenciación por hibridación/secuenciación mediante hibridación (SBH), secuenciación cíclica en matrices sobre moléculas amplificadas, secuenciación cíclica en matrices sobre moléculas individuales, métodos no cíclicos, de molécula individual, en tiempo real, tales como, secuenciación con polimerasa, secuenciación con exonucleasa o secuenciación por nanoporos.
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Para obtener resultados óptimos, los productos amplificados o fragmentos deben secuenciarse con suficiente redundancia. La redundancia permite la distinción entre un error de secuenciación y una mutación posible genuina. En ciertas realizaciones, la redundancia de la secuenciación es preferiblemente de al menos 4, más preferiblemente de al menos 5, pero, tal como puede observarse a partir de los ejemplos, las redundancias de más de 10, preferiblemente de más de 25 o incluso de más de 50 se consideran ventajosas, aunque no esenciales para esta invención.
Las ventajas de los métodos de la presente invención residen entre otros en el hecho de que las mutaciones pueden evaluarse in silico para determinar su impacto sobre la función génica, lo que significa que se hace una selección para detectar mutaciones activas. Puede hacerse una selección en contra de mutaciones que confieren sólo sustituciones silenciosas, haciendo de ese modo que el proceso global sea más económico y eficaz. Esto es una ventaja particular con respecto a la tecnología TILLING basada en CEL I conocida porque la mayoría de las mutaciones de CEL I son transiciones de C/G a T/A, de las cuales sólo el 5% crean comúnmente codones de terminación (Colbert et al. 2001). La gran mayoría son mutaciones sustitutivas de reducido interés. Un reconocimiento eficaz de miembros en una población con mutaciones de codón de terminación economiza el proceso y obvia la necesidad de exploración adicional de miembros individuales de conjuntos positivos.
Todas las mutaciones pueden encontrarse con igual probabilidad, independientemente de su posición en el producto de PCR, en particular cuando se selecciona la secuencia diana completa.
El método evita además el uso de la digestión con CEL I, la formación de heterodúplex y la puntuación en gel engorrosa. Por tanto, la invención no es sensible a las limitaciones de la reunión asociadas con la tecnología de CEL I.
La invención se refiere además a kits que pueden contener uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en: uno o más cebadores (marcados) para un gen particular, o cebadores específicos de rasgo, mutación o alelo. Los kits pueden contener además perlas, cebadores de secuenciación, software, descripciones de las estrategias de reunión y otros componentes que se conocen para kits per se. En ciertas realizaciones, se proporcionan kits que están dedicados a encontrar mutaciones específicas, por ejemplo mutaciones relacionadas con enfermedades.
La invención se ilustra ahora en el presente documento a continuación.
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Ejemplos
La exploración de una población TILLING puede promoverse usando métodos de secuenciación de alto rendimiento novedosos, tales como el de 454 Life Sciences (Margulies et al., 2005) o la secuenciación "polony" (Shendure et al., 2005). Con el estado actual de la técnica, la tecnología de 454 Life Sciences produce una secuencia de aproximadamente 20 Mb en una única ejecución de secuenciación. Las longitudes de lectura son de aproximadamente 100 pb por lectura. Suponiendo la exploración de una población que consiste en 3072 plantas para detectar mutaciones en un gen de 1500 pb (tal como se describió en la referencia citada anteriormente en el capítulo 2), se prevén dos enfoques y se describen en más detalle a continuación.
(1)
Un enfoque en el que se investiga todo el gen de 1500 pb para detectar la presencia de mutaciones inducidas por EMS; y
(1)
un enfoque en el que se investiga uno o varios tramos de 100 pb para detectar la presencia de mutaciones inducidas por EMS.
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Ejemplo I Exploración de toda la región de 1500 pb
Se aísla el ADN genómico de 3072 plantas de la población TILLING. Se establece un esquema de reunión 3-D de iguales cantidades de ADN por planta (por ejemplo, 15 x 15 x 14), dando como resultado 44 conjuntos (15+15+14 = 44) que contienen 3072/14= 219 ó 3072/15 = 205 muestras de ADN diferentes (Vandenbussche et al., citado anteriormente).
Esta etapa de reunión sirve para permitir la identificación de una planta que contiene una mutación observada tras una ronda de exploración por PCR (etapa 8). La reunión de los ADN genómicos sirve además para normalizar los ADN antes de la amplificación por PCR para aumentar la probabilidad de que todos los ADN estén representados equitativamente en la biblioteca de secuencias.
Se amplifica el gen de 1500 pb a partir de las muestras de ADN reunidas usando 1 par de cebadores de PCR no marcados.
Se reúnen cantidades iguales de productos de PCR de todos los pocillos con conjuntos para crear una biblioteca de productos de PCR reunidos (complejidad 3072 plantas x 1500 pb = secuencia de 4,6 Mb).
Se somete a secuenciación aleatoria la biblioteca de productos de PCR reunidos usando tecnologías convencionales (tales como las proporcionadas por 454 Life Sciences) en las que se fragmentan aleatoriamente los productos de PCR, se amplifican en perlas individuales y se secuencian sobre la perla. El rendimiento es de aproximadamente 200.000 secuencias de 100 pb, representando una cobertura de 4 a 5 veces de todos los productos de PCR de la biblioteca).
Se agrupan todas las secuencias. La mayoría de las secuencias son de tipo natural aunque también se observan mutaciones inducidas por EMS (y errores de secuencia). Puesto que los productos de PCR se secuencian con una redundancia de 4-5 veces, observaciones múltiples del mismo cambio de secuencia son indicativas de una mutación en vez de un error de secuenciación (figura 1).
Se evalúan las mutaciones para determinar su impacto sobre la función génica tal como la introducción de un codón de terminación.
Se diseña un cebador específico de alelo que selecciona como diana una mutación de interés (con ácido nucleico cerrado en 3'; LNA; o ácido nucleico peptídico; PNA) que va a usarse en combinación con o bien el cebador directo o bien el inverso en la etapa 3 para explorar la placa de muestras de ADN reunidas 3-D. La PCR específica de alelo dará como resultado tres conjuntos positivos (uno de cada dimensión), lo que especifica la ubicación en la biblioteca de la planta mutante.
La mutación se confirma amplificando el gen de 1500 pb usando los cebadores de la etapa 3, seguido por secuenciación de Sanger (bidireccional).
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Ejemplo II Exploración de tramos de 100 pb
(100 pb es la longitud de lectura de una ejecución de secuencia 454).
Se aísla ADN genómico de 3072 plantas de la población TILLING. Se establece un esquema de reunión 3-D de cantidades iguales de ADN por planta (por ejemplo, 15 x 15 x 14), dando como resultado 44 conjuntos (15+15+14 = 44) que contienen 3072/14= 219 ó 3072/15 = 205 muestras de ADN diferentes (Vandenbussche et al., citado anteriormente).
Esta etapa de reunión sirve para permitir la identificación de la planta que contiene una mutación observada directamente de los datos de secuencia. La reunión de los ADN genómicos sirve además para normalizar los ADN antes de la amplificación por PCR para aumentar la probabilidad de que todos los ADN estén representados equitativamente de la biblioteca de secuencias.
Se amplifica una región de 100 pb (o 200 pb) del gen a partir de los conjuntos mediante PCR usando cebadores de PCR no marcados etiquetados. Esto requiere 44 cebadores directos y 44 cebadores inversos (uno de cada conjunto de cada dimensión) con la siguiente configuración:
5'-sitio de unión a cebador de secuencia- - -etiqueta de 4 pb- - -secuencia de cebador específico de gen-3'.
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Usando cebadores directos e inversos con cola de nucleótidos que contienen una etiqueta de secuencia de 4 pb que es diferente de los 44 cebadores que representan todas las dimensiones de conjuntos, el origen de planta específico de cada secuencia se conoce a medida que el cebador de secuencia se híbrida en el sentido de 5' de la etiqueta. Por tanto, la secuencia de etiqueta está presente en cada traza de secuencia. Una etiqueta de 4 pb permite 4^{4} = 256 etiquetas diferentes. Una etiqueta de 3 pb permite 64 secuencias de etiqueta diferentes, suficientes para distinguir 44 etiquetas, aunque se prefieren secuencias de etiqueta que difieran en más de 1 base.
Se reúnen iguales cantidades de productos de PCR de todos los pocillos con conjuntos para crear una biblioteca de productos de PCR reunidos (complejidad 3072 plantas x 100 pb = secuencia de 307 kb).
La biblioteca de productos de PCR reunidos se proporciona a 454 para secuenciar, es decir, se amplifican los productos de PCR y se secuencian sobre las perlas. El rendimiento es de aproximadamente 200.000 secuencias de 100 pb, representado una cobertura de 66 veces de todos los productos de PCR en la biblioteca.
Se agrupan todas las secuencias (de cualquier dirección); la mayoría de las secuencias son secuencias de tipo natural aunque también se observan mutaciones inducidas por EMS (y errores de secuencia). Puesto que se secuencian productos de PCR con una redundancia de 66 veces, observaciones múltiples del mismo cambio de secuencia son indicativas de una mutación en vez de un error de secuenciación (figura 1).
Se conocerán inmediatamente las coordenadas de la planta individual que contiene la mutación basándose en la combinación única de 3 secuencias de etiquetas que se producen en las trazas de secuencia que albergan la mutación (figura 2).
Se confirma la mutación amplificando el gen de 1500 pb usando los cebadores de la etapa 3, seguido por secuenciación de Sanger (bidireccional).
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Ejemplo III Identificación de mutaciones específicas en una biblioteca mutante de tomate Biblioteca mutante de tomate
Este ejemplo describe la exploración de una biblioteca mutante de tomate mediante secuenciación en paralelo masiva con el fin de identificar mutaciones puntuales en un locus específico (gen diana). La biblioteca mutante usada es una biblioteca isogénica del cultivar M82 de tomate determinado consanguíneo que consiste en 5075 familias de M2 derivadas de tratamientos de mutagénesis con EMS. Se almacenaron semillas de cada una de las 5075 familias de M2 a una HR del 10% y 7ºC. El origen y las características de la biblioteca se describen en Menda et al. (Plant J. 38: 861-872, 2004) y en una base de datos en http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/index.html.
Aislamiento del ADN
Se recogió material de hojas de 5 plantas individuales que se hicieron crecer en invernadero de cada una de las 3072 familias de M2 elegidas aleatoriamente de la biblioteca. Dado que cualquier mutación que se produzca en la biblioteca se segregará de manera mendeliana en la descendencia de M2, la reunión del material de hojas de 5 plantas M2 individuales redujo la probabilidad de pasar por alto cualquier mutación como consecuencia de la segregación hasta menos del 0,1%. Se aisló ADN genómico del material de hojas reunido usando un procedimiento con CTAB descrito por Stuart y Via (Biotechniques, 14: 748-750, 1993). Se diluyeron las muestras de ADN hasta una concentración de 100 ng/\mul en TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) y se almacenaron a -20ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Reunión 3D de las muestras de ADN
Se normalizaron las muestras de ADN aisladas a una concentración de 20 ng/\mul y posteriormente se reunieron 4 veces dando como resultado 768 muestras comprendidas en ocho placas de microtitulación de 96 pocillos. Posteriormente, se sometieron estas ocho placas de microtitulación a una estrategia de reunión 3D, dando como resultado 28 conjuntos de ADN. La estrategia de reunión 3D consistía en la reunión entre sí de todos los ADN de tres maneras diferentes, garantizando así que cada conjunto de 4 veces individual se produzca sólo una vez en un conjunto de coordenada X, sólo una vez en un conjunto de coordenada Y y sólo una vez en un conjunto de coordenada Z. Se ensamblaron conjuntos X reuniendo todas las muestras de ADN entre sí por columna de ocho pocillos (por ejemplo A1-H1) de las ocho placas de microtitulación, dando como resultado 12 conjuntos X. Por tanto, cada conjunto X contenía 8 (pocillos en una columna) \times 8 (placas) = 64 muestras de conjuntos de 4 veces, representando 256 familias de M2. Se ensamblaron conjuntos Y reuniendo todas las muestras de ADN entre sí por fila de doce pocillos (por ejemplo A1-A12) de las ocho placas de microtitulación, dando como resultado 8 conjuntos Y. Por tanto, cada conjunto Y contenía 12 (pocillos en una fila) \times 8 (placas) = 96 muestras de conjuntos de 4 veces, representando 384 familias de M2. Se ensamblaron conjuntos Z reuniendo todas las muestras de ADN entre sí a partir de una placa de microtitulación completa, dando como resultado 8 conjuntos Z. Por tanto, cada conjunto Z contenía 12 \times 8 = 96 muestras de conjuntos de 4 veces, representando 384 familias de M2.
Locus diana
El locus diana en este ejemplo era parte del gen del tomate para el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E). Se ha mostrado que este gen está implicado en la susceptibilidad a la infección de potyvirus en Arabidopsis (Duprat et al., Plant J. 32: 927-934, 2002), lechuga (Nicaise et al. Plant Physiol. 132: 1272-1282, 2003) y solanáceas (Ruffel et al., Plant J. 32: 1067-1075, 2002; Mol. Gen. Genomics 274: 346-353, 2005), y mutaciones específicas en este gen están asociadas con resistencia a potyvirus recesiva. La exploración de la mutación descrita en este ejemplo tenía como objetivo identificar mutaciones adicionales en el gen eIF4E del tomate como posibles fuentes de nueva resistencia a potyvirus. Para el eIF4E del tomate, sólo se conocía la secuencia de ADNc (números de registro de NCBI AY723733 y AY723734). Usando un enfoque de PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de ADNc, se amplificaron y secuenciaron fragmentos de la secuencia genómica del locus eIF4E del cultivar de tomate Moneyberg. Esto dio como resultado una secuencia de la mayor parte del locus genómico del eIF4E del tomate. El locus consistía en 4 exones y 3 intrones. Para la exploración de la mutación, se eligió el exón 1 del gen como secuencia diana.
SEQ ID 57: Secuencia del exón 1 de eIF4E del tomate Moneyberg:
1
Diseño de cebadores para la amplificación del locus diana
Se diseñaron cebadores para la amplificación por PCR del exón 1 de eIF4E del tomate. Se diseñaron los cebadores directos para que correspondiesen al codón de iniciación ATG del marco de lectura abierto del exón 1, estando en 5' respecto al ATG una secuencia de etiqueta de cuatro bases, proporcionando un identificador único para cada uno de los 28 conjuntos. En el extremo 5' lejano de los cebadores de PCR directos, se añadió una C en 5'. Se fosforilaron todos los cebadores en su extremo 5' para facilitar la ligación posterior de adaptadores. La secuencia y los nombres de los 28 cebadores directos se enumeran en la tabla 1. Las secuencias de etiqueta están subrayadas.
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TABLA 1 Identificación de cebadores directos, secuencias y conjuntos para la amplificación del exón 1
2
Se diseñaron los cebadores inversos para que correspondiesen a la posición de pares de bases 267 a 287 del exón 1 en la hebra no codificante. De nuevo, en 5' respecto a la parte de cebador se incluyó la misma serie de secuencias de etiqueta de cuatro bases, proporcionando un identificador para cada uno de los 28 conjuntos. En el extremo 5' lejano de los cebadores de PCR inversos, se incluyó una C en 5'. Se fosforilaron todos los cebadores en su extremo 5' para facilitar la ligación posterior de adaptadores. La secuencia y los nombres de los 28 cebadores inversos se enumeran en la tabla 2. Las etiquetas están subrayadas.
TABLA 2 Identificación de cebadores inversos, secuencias y conjuntos para la amplificación del exón 1
4
Amplificación del locus diana
Se amplificó el exón 1 del locus diana a partir de los ADN reunidos 3D usando los cebadores directos e inversos descritos anteriormente. Para cada reacción de PCR, se usaron un cebador directo y uno inverso con etiquetas idénticas. Para la amplificación del exón 1 a partir de cada uno de los 28 conjuntos 3D, se usó un juego diferente de cebadores directos e inversos.
Las condiciones de la reacción de amplificación por PCR para cada muestra eran tal como sigue:
\quad
25 \mul de ADN (= 50 ng); 5 \mul de mezcla de ARNasa; 10 \mul de tampón de PCR 5x Herculase; 0,6 \mul de los cuatro dNTP (20 mM); 1,25 \mul de cebador directo (50 ng/\mul); 1,25 \mul de cebador inverso (50 ng/\mul); 0,5 \mul de ADN polimerasa Herculase; 28,9 \mul de agua purificada milliQ. La mezcla de ARNasa consistía en 157,5 \mul de agua purificada milliQ + 17,5 \mul de ARNasa.
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Se realizaron las amplificaciones por PCR en un termociclador PE9600 con un bloque de oro o plata usando las siguientes condiciones: inicio en caliente de 2 minutos de 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 53ºC, 1 min. a 72ºC y una temperatura estacionaria final de 4ºC. Se comprobó la eficacia de la amplificación por PCR mediante el análisis de 10 \mul de productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. La figura 4 muestra la amplificación eficaz de los productos de PCR del exón 1 a partir de cada uno de los 28 conjuntos 3D en comparación con un intervalo de concentración de ADN lambda en el mismo gel.
Tras la amplificación, se mezclaron cantidades iguales de productos de PCR y se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN), según el manual QIAquick® Spin (página 18). En cada columna, se cargó un máximo de 100 \mul de producto. Se eluyeron los productos en Tris-EDTA 10 mM.
Preparación de la biblioteca de secuencias y secuenciación de alto rendimiento
Se sometieron productos de amplificación mezclados de los conjuntos 3D a secuenciación de alto rendimiento en un secuenciador GS20 usando la tecnología de secuenciación de 454 Life Sciences tal como se describe por Margulies et al. (Nature 437: 376-380, 2005, y suplementos en línea). Específicamente, se ligaron los productos de PCR a adaptadores para facilitar la amplificación por PCR en emulsión y la posterior secuenciación de los fragmentos tal como se describe por Margulies et al. Las secuencias de adaptadores 454, los cebadores de PCR en emulsión, los cebadores de secuencia y las condiciones de ejecución de las secuencias eran todos tal como se describe por Margulies et al. El orden lineal de elementos funcionales en un fragmento de PCR en emulsión amplificado en perlas de Sepharose en el procedimiento de secuenciación 454 era tal como sigue:
Adaptador de PCR 454 - adaptador de secuencia 454 - nucleótido C - etiqueta de 4 pb - secuencia 1 de cebador de amplificación diana - secuencia interna de fragmento diana - secuencia 2 de cebador de amplificación diana - etiqueta de 4 pb - nucleótido G - adaptador de secuencia 454 - adaptador de PCR 454 - perla de Sepharose.
Procesamiento de datos de la ejecución de la secuencia 454
Tras la lectura automática de nucleótidos con el software 454 para cada región de la placa de microtitulación, se produjo un archivo con las secuencias formateadas FASTA. Éstas estaban concatenadas en un archivo. Dentro de este archivo, se realizó una búsqueda con una expresión regular para un apareamiento del 100% del cebador directo precedido por 5 nucleótidos (C más una secuencia de etiqueta de cuatro pb). Se hizo lo mismo con el cebador inverso extendido con 5 nucleótidos (C más la secuencia de etiqueta). Se agruparon entonces todas las secuencias mediante su secuencia de etiqueta (identificadores de conjunto) en archivos separados. Se analizó cada archivo con la herramienta ssahaSNP y la secuencia de nucleótidos conocida del exón 1 como referencia. La herramienta ssahaSNP notificó aproximadamente todas las diferencias de secuencia de nucleótidos individuales y las "indels" (inserciones o deleciones de bases individuales como resultado de o bien mutagénesis o bien lectura automática de nucleótidos errónea) de las secuencias 454 frente al genoma de referencia. Estas estadísticas de diferencias de secuencia de nucleótidos individuales e indels se guardaron en una base de datos y se usaron para el análisis de la tasa de error y la identificación de mutaciones puntuales.
Tasa de error de la secuenciación 454
El número total de secuencias correctas obtenidas a partir del procesamiento de los datos para los 28 conjuntos combinados fue de 247.052. Se dividieron las secuencias en dos grupos, las que se alineaban con el cebador directo y la hebra codificante (extremo 5') del producto de PCR del exón 1 (128.594 = 52%), y las que se alineaban con el cebador inverso y la hebra complementaria del producto de PCR (118.458 = 48%). El número de secuencias obtenidas a partir de cada uno de los diferentes conjuntos y grupos de alineación oscilaba desde 69 hasta 7269. En promedio, cada una de las 3072 familias de M2 debe estar representada 80 veces en la colección total de secuencias, y cada alelo 40 veces.
\newpage
Dentro del grupo de alineación correspondiente al cebador directo, 1338 secuencias de 128.594 (1,2%) mostraron una o más diferencias de secuencia de nucleótidos individuales en relación con la secuencia de referencia de eIF4E a lo largo de un tramo de 63 bases de secuencia diana alineada. Para el grupo del cebador inverso, 743 secuencias de 118.458 (0,6%) mostraron una o más diferencias de secuencia de nucleótidos individuales en relación con la secuencia de referencia de eIF4E a lo largo de un tramo de 102 bases de secuencia diana alineada. Por tanto, la tasa de error de sustitución de bases individuales para ambos grupos de secuencias combinados es igual a un 0,84% para un tramo de 165 bases, o un 0,0051% por posición de base (0,5 errores por 10.000 bases). Esta tasa de error es similar a la notificada por Margulies et al. del 0,004% para errores de sustitución de lectura individual en secuencias de prueba, aunque mucho más baja que para la resecuenciación del genoma completo (0,68%).
Un análisis similar de la aparición de indels en ambos grupos de alineación reveló una incidencia de indels de 3883 (grupo del cebador directo) y 3829 (grupo del cebador inverso) en un total de 247.052 secuencias (es el 3,1% en un tramo de 165 pb). Por tanto, la tasa de aparición de indels es igual a un 0,01891% por posición de base (1,89 por 10.000 bases). La tasa de indels es significativamente superior que la tasa de error de sustitución de bases. Ambos tipos de errores de secuenciación combinados se producen en promedio a una frecuencia de 2,39 por 10.000 bases, o 0,024 por posición de base. Esta tasa de error es mucho más baja que la notificada por Margulies et al., y puede explicarse por la ausencia de tramos de homopolímero largos en la secuencia del exón 1 de eIF4e.
Detección de una mutación en el locus diana
Puesto que el objetivo de esta exploración es la identificación de mutaciones puntuales inducidas por (EMS) (preferentemente mutaciones C\rightarrowT y G\rightarrowA), se descartaron todas las secuencias que representaban indels en comparación con la secuencia de referencia para fines de análisis en este ejemplo. La mayoría de las sustituciones de bases individuales se producían sólo una vez en cualquier conjunto 3D dado, algunas se producían 2 ó 3 veces, o pocas veces más a menudo. Dado que estas sustituciones de bases individuales se producen más o menos uniformemente en cada posición de la secuencia alineada, y a una frecuencia más o menos uniforme del 0,005% por base, se supuso que representaban errores de secuenciación, y no mutaciones específicas que existían en la biblioteca mutante. Sin embargo, en algunas posiciones de base específicas en la secuencia escaneada, se produce una incidencia mucho mayor de una diferencia de secuencia de bases individuales específica. Tales diferencias de secuencia de bases individuales revelan mutaciones en la biblioteca, cuando se cumplen los siguientes criterios:
1.
la diferencia de secuencia de bases individuales representa una mutación C\rightarrowT o G\rightarrowA mutación;
2.
la incidencia es superior a 20 por 10.000 lecturas de secuencias por conjunto 3D;
3.
la diferencia de secuencia de bases individuales se produce precisamente en uno y no más de un conjunto X, conjunto Y y conjunto Z.
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En este ejemplo, se encontró una mutación de este tipo en el grupo de alineamiento correspondiente al cebador inverso, en la posición de base 221 de la secuencia del exón 1 de eIF4E. Esta mutación, una mutación G\rightarrowA (correspondiente a una mutación C\rightarrowT en la hebra complementaria) se produjo en el conjunto X12 a una frecuencia de 70 por 10.000 secuencias, en el conjunto Y3 a una frecuencia de 33 por 10.000 y en el conjunto Z6 a 62 por 10.000 secuencias. Esta misma mutación en la misma posición no se produjo en ninguno de los otros conjuntos, incluso ni a las tasas de error de fondo.
La aparición única de esta mutación G221A únicamente en los tres conjuntos permitió la identificación del conjunto de ADN de 4 veces original, que representaba cuatro familias de M2. Se amplificó individualmente el ADN de cada una de estas familias de M2 con los cebadores 06F598 y 06F599 que son idénticos a los cebadores directos e inversos de las tablas 1 y 2, pero sin las etiquetas de secuencia de cinco bases en 5'. Se sometieron los productos de PCR amplificados a secuenciación de Sanger convencional. La secuencia del gen eIF4E en una de las cuatro familias (codificada como "24") reveló un pico doble en la posición 221, correspondiente a un solapamiento de G y A. Esto es indicativo de un conjunto de familia de M2 en el que la mitad de los alelos son de tipo natural y la otra mitad portan la mutación puntual G221A (figura 2). Las secuencias de las otras familias de M2 alrededor de la posición de base 221 eran según la referencia (tipo natural).
La mutación provoca una sustitución de arginina por glutamina. Se plantaron semillas de esta familia de M2 particular en el invernadero con el fin de seleccionar individuos mutantes homocigóticos, que se usarán para el fenotipado.
De una manera similar, se identificaron otras dos mutaciones puntuales en las lecturas de secuencia 454. Por tanto, una estimación de la densidad de mutación de la biblioteca mutante de tomate M82 es igual a 3 mutaciones por 165 pb de secuencia escaneada, o 18 mutaciones por 1000 bases en 3072 familias de M2. Esto corresponde a las densidades de mutación notificadas para Arabidopsis (Greene et al., Genetics 164: 731-740, 2003).
\newpage
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<130> P27926PC00
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<150> 60/721.528
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<151> 29-09-2005
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<160> 57
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 24
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24 
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcgatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgcatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctacgatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagcatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcagatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 24
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgtatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctcatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctgatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgacatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcaatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtcatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgatggc agcagctgaa atgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacagcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgacccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgtcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcacccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagctcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagtccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagtgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctacgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcagcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgacccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgtcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 49
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctctccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<213> artificial;
\vskip1.000000\baselineskip
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ctctgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
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<212> ADN
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26 
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26 
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<210> 57
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<211> 287
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<212> ADN
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<213> Lycopersicon esculentum 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
5 
\newpage
LISTADO DE SECUENCIAS 
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<110> Keygene NV
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<120> EXPLORACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO DE POBLACIONES MUTAGENIZADAS
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<130> P27926PC00
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<150> 60/721.528
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<151> 29-09-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 57
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<170> PatentIn versión 3.3
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\newpage
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24 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
24 
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<210> 21
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
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\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
24 
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\hfill
24 
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\hfill
24 
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24 
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24 
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24 
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\hfill
26 
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\hfill
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\hfill
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\hfill
26 
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\hfill
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\hfill
26 
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26 
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\hfill
26 
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\hfill
26 
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\hfill
26 
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
26 
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\hfill
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26 
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26 
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\hfill
26 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
26 
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<211> 26
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\hfill
26 
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
26 
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<212> ADN
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
26 
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
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\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 26
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<212> ADN
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\hfill
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\hfill
26 
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 26
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ctgtccccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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ctgtgcccca aaaattttca acagtg 
\hfill
26 
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<210> 57
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<211> 287
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<212> ADN
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<213> Lycopersicon esculentum 
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Exón 1 de eIF4E de tomate moneyberg
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<400> 57
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6

Claims (15)

1. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada, que comprende las etapas de:
(a)
aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;
(f)
determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento;
(g)
identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(h)
explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;
(i)
diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;
(j)
amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);
(k)
identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación;
(l)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada, que comprende las etapas de:
(a)
aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar parte de la secuencia diana con un par de cebadores etiquetados (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN, en el que al menos uno de los cebadores comprende preferiblemente una sección específica de gen, una etiqueta y un sitio de unión a cebador de secuencia;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
determinar la secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación usando secuenciación de alto rendimiento;
(f)
identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(g)
identificar el/los miembro(s) que tiene(n) la mutación usando las etiquetas;
(h)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (g) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la población mutagenizada se obtiene tratando el genoma con uno o más seleccionados del grupo que consiste en productos químicos que inducen mutación, radiación ionizante, intercambio de nucleótidos dirigido o mutagénesis de región dirigida.
4. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población que comprende subpoblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural, que comprende las etapas de:
\newpage
(a)
aislar ADN genómico de cada miembro de la población para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;
(f)
determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento;
(g)
identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(h)
explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;
(i)
diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;
(j)
amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);
(k)
identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación;
(l)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
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5. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población que comprende subpoblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural, que comprende las etapas de:
(a)
aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b)
reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c)
amplificar parte de la secuencia diana con un par de cebadores etiquetados (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN, en el que al menos uno de los cebadores comprende preferiblemente una sección específica de gen, una etiqueta y un sitio de unión a cebador de secuencia;
(d)
reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e)
determinar la secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación usando secuenciación de alto rendimiento;
(f)
identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(g)
identificar el/los miembro(s) que tiene(n) la mutación usando las etiquetas;
(h)
opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (g) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.
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6. Método según las reivindicaciones 1-5, en el que la reunión es una estrategia de reunión 3D.
7. Método según las reivindicaciones 1-6, en el que la secuenciación de alto rendimiento se realiza mediante síntesis, preferiblemente pirosecuenciación.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la secuenciación se realiza sobre un soporte sólido tal como una perla.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la secuenciación se basa en secuenciación de alto rendimiento, preferiblemente secuenciación mediante síntesis.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la secuenciación se realiza mediante síntesis, preferiblemente pirosecuenciación.
11. Método según la reivindicación 7, en el que la secuenciación comprende las etapas de: (i) ligar adaptadores de secuenciación a los fragmentos; (ii) hibridar dichos fragmentos ligados a adaptadores con perlas, hibridando cada perla con un único fragmento; (iii) emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite de manera que cada microrreactor contenga una única perla; (iv) realizar PCR en emulsión para amplificar fragmentos ligados a adaptadores en la superficie de las perlas (v) seleccionar/enriquecer perlas a las que están unidos dichos fragmentos ligados a adaptadores amplificados (vi) colocar las perlas en pocillos de manera que cada pocillo comprenda una única perla; y (vii) generar una señal de pirofosfato.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que los cebadores en las etapas (c) y/o la etapa (i) contienen nucleótidos con afinidad de unión mejorada.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde aproximadamente 80 hasta aproximadamente 400 pb.
14. Método según la reivindicación 13, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde aproximadamente 90 hasta aproximadamente 300 pb.
15. Método según la reivindicación 13, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde 100 hasta aproximadamente 200 pb.
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