ES2338587T3

ES2338587T3 - Sistema de prueba para detectar salmonela.

Info

Publication number: ES2338587T3
Application number: ES06775810T
Authority: ES
Inventors: Christoph Von Eichel-Streiber; Harald Klein
Original assignee: tgcBIOMICS GmbH
Current assignee: tgcBIOMICS GmbH
Priority date: 2005-08-07
Filing date: 2006-08-04
Publication date: 2010-05-10
Anticipated expiration: 2026-08-04
Also published as: EP1913394B1; ATE456051T1; EP1913394A1; DE102005037796A1; DE502006005985D1; WO2007016912A1

Abstract

Sistema de prueba para la detección de infecciones por salmonela existentes actualmente y/o en el pasado en una muestra, caracterizado porque el sistema de prueba comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con la proteína SipC de salmonela y que se produce (a) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2790 con el código de laboratorio I5B2, o (b) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2789 con el código de laboratorio V1H7.

Description

Sistema de prueba para detectar salmonela.

La invención se refiere a un sistema de prueba para detectar infecciones por salmonela en una muestra.

Las salmonelas son bacterias con forma de bastoncillo gram-negativas móviles. La diferencia taxonómica de las salmonelas se realiza mediante su antígeno de cuerpo (O) y flagelo (H) según el esquema de Kauffmann-White (una tabla de antígenos diagnóstica) y resulta en un sistema de clasificación en el que las salmonelas se declaran de serovariedades y se caracterizan y clasifican por una serofórmula. De las más 2400 serovariedades de salmonela conocidas hasta la fecha, en la práctica hasta la fecha sólo de veinte a treinta tienen importancia como patógenos de enfermedades epidemiológicas. A éstos pertenecen los patógenos del tifus (S. typhi) y paratifus (S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C) y un gran número de patógenos de enteritis, las denominadas "salmonelas de enteritis". Mientras que la salmonela del tifus y del paratifus causa infecciones generales generalizadas graves, es decir, infecciones de todo el cuerpo, la infección por salmonela de enteritis se limita generalmente localmente al intestino.

Las salmonelosis del ser humano son la mayoría de las veces enfermedades debidas a los alimentos. La infección se realiza generalmente por el consumo de alimentos infectados o contaminados, por lo que el contagio a los seres humanos sólo se realiza raramente por el contacto directo con animales que excretan la salmonela. Un contagio directo o indirecto de ser humano a ser humano puede realizarse como infección hospitalaria en personas especialmente predispuestas o en condiciones higiénicamente desfavorables.

Las fuentes de infección primarias son especialmente los alimentos procedentes de aves, ganado bovino y cerdo, incluso enfermando los animales en los casos más raros.

Por lo tanto, la detección de patógenos o anticuerpos no sólo tiene importancia decisiva en la medicina, sino también en la veterinaria y en industrias alimentarias. La dosis de infección para los seres humanos adultos se encuentra en 10^{4} a 10^{6} gérmenes. El tiempo de incubación asciende a 5-72 h y depende de la cantidad de dosis de infección.

En el caso de una infección por salmonela de enteritis, la denominada salmonelosis de enteritis, la infección se manifiesta inicialmente con diarrea, náuseas o vómitos y fiebre moderada. Los síntomas duran generalmente sólo algunas horas o días. Sin embargo, en el caso

\hbox{de pacientes debilitados,
esta enfermedad también puede  llevar a la muerte.}

La excreción de los gérmenes de la salmonela de enteritis dura como media de tres a seis semanas, pero en lactantes también durante meses.

En el caso de pacientes con antecedentes hereditarios, la salmonela puede desencadenar como enfermedad secundaria una artritis reactiva 2-6 semanas después de la infección enterítica que en casos raros adopta una forma progresiva crónica. Como en este momento la mayoría de las veces no puede detectarse o criarse ningún patógeno más, los procedimientos serológicos para la detección de una infección por salmonela transcurrida en los últimos tiempos (= existente en el pasado) tienen una gran importancia (aglutinación de Widal; véase más adelante).

Según la ley de protección contra enfermedades infecciosas, la sospecha de o la enfermedad de gastroenteritis infecciosa aguda está sujeta bajo ciertas circunstancias a comunicación obligatoria, al igual que cualquier detección de salmonela. Además, en Alemania y otros países de la UE distintas disposiciones legales se ocupan de las medidas para el combate de la salmonela (por ejemplo: decreto sobre la salmonela en ganado bovino, decreto sobre la salmonela en pollos, distintas disposiciones de la legislación en materia de piensos y alimentos). Además, en el marco de los controles internos industriales se han establecido distintos programas de monitorización de la salmonela.

El centro de gravedad del diagnóstico del laboratorio clínico de la salmonelosis está en el cultivo de gérmenes de muestras de excrementos y su clasificación como casos sospechosos de salmonela con ayuda de sueros de búsqueda de salmonela omni o polivalentes. Generalmente, un diagnóstico de sospecha tal sólo puede hacerse aproximadamente de uno a dos días después de la recepción de la muestra en el laboratorio de diagnóstico. Para afirmar con certeza que existe una infección por salmonela, normalmente se necesitan otros 2-3 días. En este tiempo se caracterizan bioquímicamente (serie variada) y serológicamente clones individuales sospechosos. Para la diferenciación serológica se investigan los antígenos O y H en forma de una aglutinación en portaobjetos (esquema de Kaufmann-White). Para esto, inicialmente se usan sueros de prueba de salmonela polivalentes para a continuación determinar la fórmula de antígenos exacta con antisueros O o H monovalentes. Por tanto, para la detección definitiva de una infección por salmonela generalmente se necesitan en total 3-5 días. Especialmente en el caso de salmonelosis que fueron causadas por alimentos contaminados, el largo espacio de tiempo hasta el diagnóstico representa un gran problema porque entretanto pueden infectarse más personas. Por tanto, en el caso de una sospecha por salmonela es importante localizar la fuente de infección y así evitar la posterior propagación. Al mismo tiempo se aíslan adicionalmente los pacientes para evitar el contagio de la

\hbox{infección. Para el éxito de esta medida  es de gran
importancia una opinión de diagnóstico temprana.}

La detección serológica de anticuerpos contra salmonela desempeña una gran función en forma de sistemas de ELISA, sobre todo en la veterinaria y la industria alimentaria. Así, por ejemplo, en Alemania como también en los países limítrofes actualmente se determina sobre todo el estado de los anticuerpos de salmonela (predominantemente inmunoglobulina anti-LPS) de poblaciones animales. La detección se realiza a partir de/en jugo de carne o sangre. No obstante, este procedimiento presenta limitaciones ya que no todas las serovariedades de salmonela patógenas pueden detectarse eficazmente.

Por el contrario, en la medicina, especialmente en infecciones por salmonela tifosa, se utiliza la llamada prueba de aglutinación de Widal como complemento a la detección bacteriológica de patógenos. A este respecto, el suero del paciente se mezcla con suspensiones de salmonela hervidas (aglutinación del antígeno O) o formalinizadas (aglutinación del antígeno H) y se investigan para una aglutinación de las bacterias. En este caso es desventajoso, por una parte, el hecho de que no todas las infecciones van acompañadas de la formación de un título de antígeno anti-O, por otra parte, el hecho de que los anticuerpos contra los antígenos H puedan persistir durante años después de la infección. Por el contrario, los títulos contra los antígenos O descienden de nuevo la mayoría de las veces después de algunas semanas. Por lo tanto, no puede diferenciarse de forma fiable entre una infección aguda o ya superada.

En condiciones de cultivo in vitro, la salmonela emite al medio circundante distintas proteínas. Una de estas proteínas es la proteína SipC.

La secuencia de nucleótidos del gen de SipC es conocida y está a disposición para el experto mediante los bancos de datos de genes (por ejemplo, nº de registro: U25631 o X82670).

Por el documento WO 03/000935 se conoce el uso de cebadores de PCR y sondas de hibridación de FRET contra el gen de SipC para detectar salmonela. En este documento no se aborda la utilización de la proteína SicC para el mismo fin, especialmente la utilización de anticuerpos contra la proteína SipC.

Por el documento Weinrauch y col. "Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria" (Nature 2002, 417, 6884, 91-4) y Hayward y col. "Direct nucleation and bunbdling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella" (EMBO J. 1999, 18, 18, 4926-34) se describe el uso de un anticuerpo policlonal contra la proteína SipC para su detección en inmunotransferencia.

Sin embargo, los anticuerpos policlonales descritos no son monoespecíficos para salmonela y, por tanto, no son adecuados para una detección específica de salmonela como se necesita sobre todo en el diagnóstico humano y el ensayo de alimentos.

En el documento WO 97/18225 A se describe la secuencia de nucleótidos de los genes de Ssp (=Sip) SipA, SipB, SipC y SipD y la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por ellos SspA, SspB, SspC y SspD. Se facilita la información general que las proteínas Ssp (=Sip) pueden utilizarse para la preparación de anticuerpos y que aquellos anticuerpos pueden usarse como agente terapéutico o diagnóstico. No se da a conocer más información como, por ejemplo, cuál de estas proteínas Ssp es prioritariamente adecuada para la obtención de anticuerpos. No obstante, los autores indican explícitamente que en el sobrenadante de cultivos de tipo natural de salmonela está presente un gran número de proteínas y que las proteínas Ssp/Sip presentan una fuerte homología con las proteínas secretadas por Shigella flexneri IpaA, IpaB, IpaC y IpaD.

Como consecuencia de la presente invención se encontró de manera sorprendente (1.) que en el caso de la proteína SipC se trata de una molécula muy conservada, es decir, las secuencias de aminoácidos de las distintas serovariedades de salmonela sólo presentan pequeñas diferencias, y (2.) que la salmonela ya forma desde muy pronto las proteínas del sistema de secreción de tipo III.

Sin embargo, aunque en los documentos Eichelberg y col. (Infection and Immunity, 2000, tomo 68, nº 5, 2735-2743), Collazo y col. (Molecular Microbiology 1997, tomo 24, nº 4, 747-756) y Watson y col. (Infection and Immunity, 1998, tomo 66, nº 4, 1432-1438) se menciona respectivamente un anticuerpo monoclonal contra SipC, ninguno de estos documentos contiene la información (por ejemplo, dónde está depositado, cómo se generó, qué especificidad presenta y cómo de sensible reacciona) que haga posible al experto adquirir o recuperar los anticuerpos anti- SipC mencionados. Para los expertos, estos anticuerpos anti-SipC mencionados en los documentos no pueden recuperarse, no puede adquirirse y, por tanto, prácticamente no están disponibles.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal contra una proteína Sip de salmonela que permita una detección rápida (de pocas horas de duración y no varios días), sensible (que también considere pequeñas cantidades) y específica (libre de reacciones cruzadas o por lo menos con pocas) de infecciones por salmonela y, por tanto, proporcione un sistema de detección para salmonela que dé una respuesta afirmativa o negativa rápida y fiable a la pregunta de si en una muestra determinada está actualmente presente o estuvo presente en el pasado una infección por salmonela.

Una solución del objetivo mencionado consiste en proporcionar un sistema de prueba para detectar infecciones por salmonela existentes actualmente y/o en el pasado en una muestra, caracterizado porque el sistema de prueba comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con la proteína SipC de salmonela y que se produce (a) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2790 con el código de laboratorio I5B2, o (b) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2789 con el código de laboratorio V1H7.

En la aplicación diagnóstica, el sistema de prueba aquí propuesto tiene sobre todo la ventaja que, debido a los anticuerpos monoclonales específicos, reconoce las salmonelas más distintas independientemente del tipo de serovariedad respectivo y, por lo tanto, hace posible una detección de salmonela que abarca serovariedades.

Esto no es posible con los procedimientos convencionales porque estos procedimientos se basan en la detección de antígenos O y H que pueden aparecer en las serovariedades de salmonela individuales con alta variabilidad y en las combinaciones más diferentes. Otra ventaja de este sistema de prueba según la invención consiste en que la detección de salmonela ya puede realizarse algunas horas después de la infección por salmonela o después de la aparición de los primeros síntomas, y concretamente con un resultado fiable, de manera que ya muy pronto pueden tomarse medidas para contener la salmonela.

En el sistema de prueba propuesto se trata preferiblemente de un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Con los anticuerpos monoclonales I5B2 (producidos a partir del cultivo de células de hibridoma DSM ACC2790) y V1H7 (producidos a partir del cultivo de células de hibridoma DSM ACC2789) descritos aquí por primera vez se ha logrado por primera vez establecer un ELISA que reacciona específicamente con salmonela y no muestra reacciones cruzadas con bacterias emparentadas con salmonela, especialmente no con shigela o E. coli enteropatógena.

Una solución del objetivo mencionado también consiste en proporcionar un sistema de prueba para detectar anticuerpos contra salmonela en una muestra que como reactivo comprende proteína SipC recombinantemente preparada o nativa aislada a partir de salmonela.

La ventaja de este sistema de prueba en comparación con la detección convencional de anticuerpos en la medicina mediante la aglutinación de Widal consiste, por una parte, en detectar inmunoglobulinas contra un antígeno de salmonela conservado que abarca serovariedades, concretamente la proteína SipC, y así conseguir un aumento en la sensibilidad de la prueba. Hay que añadir que el sistema de prueba, especialmente en la forma de realización como ELISA, proporciona resultados de medición objetivos y, por tanto, los resultados ya no son dependientes del ojo subjetivo del observador, como es el caso al leer la reacción de aglutinación. A diferencia de la reacción de Widal cuya realización puede durar hasta

\hbox{aproximadamente 18 h, un ELISA ya
proporciona el resultado  de la prueba después de algunas
horas.}

Adicionalmente, el sistema de prueba puede usarse para detectar un título de anti-SipC en carne, suero u otros fluidos corporales de animales útiles, así como en huevos. A modo de ejemplo es de mencionar aquí el uso del jugo de la carne de animales útiles como muestra. A este respecto, el jugo de la carne se obtiene con procedimientos conocidos y habituales para el experto y se investiga para anticuerpos anti-SipC, por ejemplo, en el ELISA con proteína SipC añadida como molécula captadora.

Como sistemas de prueba en el sentido de la presente invención se consideran especialmente procedimientos de ELISA, ELISA sándwich, transferencia de Western, aglutinación en látex, transferencia en línea y otros procedimientos conocidos para el experto.

La invención se explica más detalladamente a continuación mediante ejemplos de realización y figuras.

Las figuras muestran:

Fig. 1: Análisis de transferencia de Western de sobrenadantes de cultivo de distintas serovariedades de salmonela con el antisuero policlonal contra SipC. Las proteínas segregadas por las bacterias en el sobrenadante de cultivo se separaron después de la precipitación con TCA sobre un gel de SDS al 10% (Figura 1A) o al 12,5% (Figura 1B) y a continuación se transfirieron a membranas de PVDF. La detección inmunológica se realizó con el antisuero SipC policlonal (1:10000) y un anticuerpo anti-conejo marcado con fosfatasa alcalina (Dianova, 1:30000).

Los patrones de peso molecular se especifican respectivamente en la parte izquierda de la imagen.

Figura 1A: Carril 1 = Salmonella hadar, carril 2 = S. brandenburg, Carril 3 = S. goldcoast, carril 4 = S. senftenberg, carril 5 = S. virchow

Figura 1B: Carril 1 = S. typhimurium, carril 2 = S. enteritidis, carril 3 = S. infantis, carril 4 = S. bovis morbificans

Fig. 2: Bandas de transferencia de Western después de la reacción del antisuero policlonal SipC (A), del anticuerpo monoclonal I5B2 (B) y del anticuerpo monoclonal V1H7 (C) con la proteína SipC de salmonela recombinante (carril 2) y proteína IpaC recombinante de shigela (carril 1).

Fig. 3: Bandas de transferencia de Western después de la reacción de fragmentos parciales del antígeno SipC de salmonela con el anticuerpo monoclonal I5B2 (A) y V1H7 (B). En el carril 1 se representa la región del extremo C de SipC (aminoácidos 252-410) y en el carril 2 la región del extremo N de SipC (aminoácidos 1-200).

Fig. 4: Detección de la proteína SipC en diversos sobrenadantes de cultivo de salmonela mediante ELISA.

Fig. 5: Detección de la proteína SipC en diversos sobrenadantes de cultivo de salmonela mediante transferencia de Western. M = marcador de peso molecular, 1 = sobrenadante de un cultivo de Salmonella brandenburg, 2 = sobrenadante de un cultivo de S. typhi, 3 = sobrenadante de un cultivo de S. typhimurium, 4 = sobrenadante de un cultivo de S. enteritidis, 5 = sobrenadante de un cultivo de S. infantis, 6 = sobrenadante de un cultivo de S. bovis morbificans, 7 = sobrenadante de un cultivo de S. paratyphi B, 8 = sobrenadante de un cultivo de S. virchow, 9 = sobrenadante de un cultivo de S. hadar, 10 = sobrenadante de un cultivo de S. goldcoast.

Fig. 6: Detección inmunológica en función del tiempo (ELISA) del antígeno de SipC en sobrenadantes de cultivo de Salmonella enteritidis y S. typhimurium. Control negativo = medio de cultivo; control positivo = 50 ng y 5 ng de SipC recombinante abs.

Fig. 7: Valoración de los sueros (después de la 1ª inmunización de refuerzo) de ratones inmunizados con proteína SipC recombinante; control negativo = suero preinmune reunido.

Todos los procedimientos mencionados en los siguientes ejemplos son conocidos para el experto y se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (2003).

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Ejemplo 1

Preparación de anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína SipC de salmonela (proteína SipC de salmonela)

A partir de la cepa de salmonela Salmonella enterica subsp. enterica serovariedad enteritidis se aisló ADN genómico bacteriano y el gen de SipC se amplificó y se clonó con ayuda de cebadores específicos de SipC.

Mediante un análisis de secuencias posterior y una comparación de bases de datos se proporcionó la confirmación de que en el caso del fragmento de ADN clonado se trataba del marco de lectura que codifica SipC. El peso molecular calculado de la proteína SipC derivada asciende a aproximadamente 42 kDa.

Después de reclonar en el vector de expresión pET30a (Novagen) - u otro vector de expresión adecuado -, el antígeno se preparó en fusión con una marca de histidina recombinantemente en E. coli y a continuación se purificó por cromatografía de afinidad.

La pureza del antígeno obtenido de esta manera era suficiente para utilizarlo para la inmunización de conejos y ratones.

Se inmunizaron básicamente varios ratones con el antígeno SipC de salmonela recombinante anteriormente descrito y a continuación se sometieron a dos inmunizaciones de refuerzo. Las células del bazo aisladas (linfocitos B productores de anticuerpos) de estos animales se fusionaron a continuación con células de mieloma (de una línea celular que crece ilimitadamente, pero ella misma ya no produce más anticuerpos) y los hibridomas obtenidos se seleccionaron y a continuación se clonaron. Entonces, los clones por separado se cribaron inmunológicamente para la producción de anticuerpos monoclonales específicos contra el antígeno SipC recombinante usado para la inmunización. En este cribado se obtuvieron los dos anticuerpos monoclonales ISB2 y V1H7 que se producen a partir de las células de los cultivos de células de hibridoma depositados en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número de depósito DSM ACC2790 (I5B2) y DSM ACC2789 (V1H7).

Para los experimentos comparativos se preparó un anticuerpo policlonal con el mismo antígeno SipC de salmonela recombinante anteriormente descrito. Para esto, en primer lugar se inmunizaron básicamente conejos con el antígeno y a continuación se sometieron a varias inmunizaciones de refuerzo. A partir de la sangre de los conejos se obtuvo finalmente un antisuero policlonal.

La especificidad de los anticuerpos monoclonales y policlonales obtenidos se probó en la transferencia de Western. La Figura 2 muestra bandas de transferencia de Western que se revelaron con el antisuero SipC policlonal anteriormente descrito (A), el anticuerpo monoclonal I5B2 (B) y el anticuerpo monoclonal V1H7 (C). Se representa respectivamente IpaC recombinante (carril 1), así como SipC recombinante (carril 2). En el caso del antígeno IpaC se trata de una proteína con homología de secuencias de la bacteria Shigella flexneri. A diferencia del antisuero policlonal, que también reacciona de forma cruzada con la proteína homóloga IpaC de shigela (Figura 2A), los anticuerpos monoclonales I5B2 y V1H7 son específicos para el antígeno de salmonela SipC (Fig. 2B y C).

Para investigar si los anticuerpos monoclonales I5B2 y V1H7 están dirigidos contra distintos epítopes del antígeno SipC se prepararon recombinantemente fragmentos parciales del antígeno de salmonela y se detectaron en la transferencia de Western con los anticuerpos monoclonales. La Figura 3 muestra bandas de transferencia de Western correspondientemente reveladas representándose en el carril 1 un extracto total bacteriano que contiene la mitad del extremo C de SipC (aminoácidos 252-410) y en el carril 2 un extracto total bacteriano que contiene la región del extremo N de SipC (aminoácidos 1-200). Se muestra que los dos anticuerpos monoclonales están claramente dirigidos contra distintos epítopes de SipC ya que el Acm I5B2 (Figura 3A) reacciona con el fragmento de SipC del extremo C, por el contrario el Acm V1H7 (Figura 3B) reacciona con la mitad del extremo N de SipC.

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Ejemplo 2

Detección de diversas serovariedades de salmonela mediante antisuero policlonal contra proteína SipC de salmonela recombinantemente preparada

Se inocularon respectivamente 3 ml de medio LB ("LB"= caldo Luria) con una colonia de bacterias individuales de las cepas de salmonela listadas en la Tabla 1, columna 1,

\hbox{y se incubaron durante 16 horas a 37ºC con agitación 
suave.}

A continuación, las bacterias se separaron mediante centrifugación y el sobrenadante obtenido se precipitó en hielo con una concentración final del 10% de TCA.

Después de una etapa de lavado con acetona fría en hielo (-20ºC), el sedimento de proteínas se secó, se resuspendió en tampón de muestra de gel de SDS, se llevó a ebullición y se separó mediante electroforesis en gel en un gel de SDS al 12,5%.

La transferencia de las proteínas a una membrana de PVDF se realizó mediante transferencia semiseca. La membrana se reveló después de la saturación de todos los puntos de unión no específicos en primer lugar con el anticuerpo/antisuero SipC policlonal preparado según el ejemplo 1 (dilución 1:10.000) y a continuación se reveló con un anticuerpo secundario dirigido contra inmunoglobulina de conejo y marcado con fosfatasa alcalina.

La Figura 1 muestra el resultado de esta transferencia de Western: en todas las cepas de salmonela utilizadas puede detectarse una clara banda principal en el intervalo de peso molecular 42 kDa, es decir, en el intervalo de peso molecular calculado de la proteína SipC.

Esto significa que todas las cepas de salmonela mencionadas en la Tabla 1 forman la proteína SipC y se secreta en el sobrenadante. Adicionalmente, este experimento muestra que la proteína/gen SipC está altamente conservada de forma que abarca serovariedades.

La proteína SipC prueba estos sorprendentes conocimientos como especialmente adecuados para una detección inmunológica de salmonela que abarca serovariedades.

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Ejemplo 3

Detección inmunológica del antígeno SipC en sobrenadantes de cultivo de distintas cepas aisladas de salmonela clínicas mediante ELISA y transferencia de Western

Para la detección inmunológica del antígeno SipC a partir de sobrenadantes de cultivo se inocularon respectivamente 5 ml de medio LB con una colonia de bacterias y se incubaron durante la noche a 37ºC con agitación suave.

Las cepas de salmonela usadas a este respecto y caracterizadas según el esquema de Kauffmann-White se listan en la Tabla 2.

Los cultivos de bacterias se separaron por centrifugación a la siguiente mañana a 4000 x g (15 min, 4ºC), los sobrenadantes obtenidos se esterilizaron por filtración mediante una membrana de 0,22 \mum y a continuación se utilizaron en los ensayos diagnósticos (ELISA, transferencia de Western).

A) Procedimiento de ELISA para la detección de SipC en sobrenadantes bacterianos de cultivo

Se recubrieron placas de ELISA con el anticuerpo monoclonal I5B2 descrito en el ejemplo 1 (1 \mug/pocillo) y después del bloqueo de los puntos de unión no específicos con una disolución de gelatina al 20% se pipetearon por pocillo respectivamente 150 \mul del sobrenadante de cultivo celular bacteriano obtenido. Como control positivo sirvió una cantidad definida de proteína SipC recombinante (5 ng/pocillo), como control negativo se utilizó medio nutritivo estéril, así como sobrenadante de cultivo igualmente tratado de otra especie de bacteria patógena del intestino (Escherichia coli, Yersinia enterocolitica). Las placas se incubaron durante 1 h a 37ºC y a continuación se lavaron con TBST (solución salina tamponada con Tris-Tween 20). Para la detección del antígeno unido se utilizó el antisuero SipC policlonal descrito en el ejemplo 1 después de la purificación de la proteína G (conc. 4 mg/ml) en una dilución de 1:50.000. Después de otra nueva etapa de lavado con TBST le siguió una incubación de una hora con un conjugado de anti-conejo marcado con fosfatasa alcalina que a continuación se eliminó mediante un nuevo lavado con TBST. El conjugado de anticuerpo específicamente unido se puso colorimétricamente de manifiesto mediante la adición y la posterior reacción catalizada por la fosfatasa alcalina acoplada al anticuerpo del sustrato fosfato de 4-nitrofenilo (disuelto en tampón de fosfatasa alcalina, 1 mg/ml) y la densidad óptica se determinó a 405 nm después de un tiempo de reacción de 30 minutos.

Como puede deducirse de la Figura 4, todos los sobrenadantes de cultivo de salmonela probados muestran una reacción positiva en el ELISA, por lo que la extinción de sobrenadantes igualmente tratados de otras bacterias patógenas del intestino bacterianas (E. coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri) se corresponde con la extinción del medio nutritivo estéril.

B) Procedimiento de transferencia de Western para la detección de SipC en sobrenadantes de cultivos de bacterias

Se separaron 15 \mul de los sobrenadantes de cultivos celulares bacterianos obtenidos sobre un gel de SDS al 10%-poliacrilamida y a continuación se transfirieron mediante el procedimiento de transferencia semiseca a una membrana de PVDF. Los puntos de unión no específicos se bloquearon con SBF al 3% (suero bovino fetal) en TBST. A continuación se realizó la incubación con el anticuerpo monoclonal específico de SipC I5B2 (350 \mug/ml después de la purificación de proteína G, diluida 1:100 en TBST). Después de tres etapas de lavado con TBST, la membrana se incubó durante otra hora con un conjugado anti-ratón de fosfatasa alcalina y luego se lavó varias veces con TBST. El revelado se realizó mediante la adición de sustrato en forma de BCIP (sal de p-toluidinio de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 50 mg/ml en dimetilformamida al 100%, 1:300 en tampón de fosfatasa alcalina) y NBT (50 mg/ml de nitroazul de tetrazolio en dimetilformamida al 70%, 1:150 en tampón de fosfatasa alcalina) durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Las señales de la transferencia de Western representada en la Figura 5 guardan una muy buena correlación con los datos de ELISA previamente expuestos. Todos los sobrenadantes de cultivo de salmonela también muestran aquí una reacción positiva con el anticuerpo monoclonal I5B2 en el intervalo de tamaño que cabe esperar de 42 kDa. Además, existe una buena correlación entre la intensidad de las señales de la transferencia de Western y las extinciones medidas en ELISA. Así, por ejemplo, el sobrenadante de S. paratyphi B muestra en ambos casos la mayor reactividad.

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Ejemplo 4

Detección inmunológica dependiente del tiempo del antígeno SipC en sobrenadantes de cultivo de Salmonella enteritidis y S. typhimurium

Como se muestra en el ejemplo 3, el ELISA de SipC representa un procedimiento de prueba altamente específico y sensible para detectar diferentes cepas de salmonela. Con el presente ejemplo 4 se muestra a modo de ejemplo que este ELISA de SipC presenta además la ventajosa propiedad que puede realizarse (aplicarse) desde muy pronto de una supuesta infección por salmonela porque la proteína SipC ya se forma desde muy pronto y puede detectarse eficazmente.

Para demostrar el desarrollo temporal de la expresión de SipC se procedió del siguiente modo: se inocularon 20 ml de medio LB con respectivamente una colonia de bacterias y se incubaron a 37ºC con agitación. Durante nueve horas se extrajo cada hora una muestra, se separó por centrifugación y el sobrenadante esterilizado por filtración se investigó con ayuda del procedimiento de ELISA descrito en el ejemplo 3(A) para la presencia de proteína SipC.

Los resultados de este experimento se representan en la Figura 6. De esta Figura 6 es evidente que la proteína SipC ya puede detectarse específicamente por primera vez en el sobrenadante cinco horas después del inicio del cultivo. Durante las cuatro horas siguientes, la cantidad de proteína SipC no sigue aumentando de forma medible.

Por tanto, las proteínas del sistema de secreción de tipo III ya se forman sorprendentemente desde muy pronto.

Debido a todo esto, los ELISA de SipC son extraordinariamente adecuados para la rápida detección de salmonela.

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Ejemplo 5

Detección inmunológica de anticuerpos de SipC en el ELISA

Para probar si es posible una detección de anticuerpos anti-SipC a partir de la sangre en animales infectados se investigó cómo de eficaz induce SipC la formación de anticuerpos.

Para esto se administró proteína SipC recombinante a tres ratones. A continuación se extrajo una pequeña cantidad de sangre de los ratones y posteriormente se valoró en un ELISA específico contra anticuerpos de SipC (véase la Figura 7). Para esto se añadió respectivamente 1 \mug de proteína SipC recombinante por pocillo a una placa de ELISA, a continuación se bloquearon los puntos de unión no específicos con una disolución de gelatina al 20% y finalmente se incubó con las etapas de dilución de sueros citadas en la Figura 7. La detección de anticuerpos específicamente unidos se realizó con ayuda de un conjugado anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina con el procedimiento usual para el experto. Después de la adición de fosfato de 4- nitrofenilo como sustrato para la fosfatasa alcalina acoplada al anticuerpo, mediante la reacción del sustrato se puso colorimétricamente de manifiesto el conjugado de anticuerpo específicamente unido y la densidad óptica se determinó a 405 nm después de un tiempo de reacción de 30 minutos (como medida de la cantidad de sustrato reaccionado o conjugado de anticuerpo
unido).

En la Figura 7 puede apreciarse que el suero de los tres ratones pudo diluirse a este respecto muy ampliamente (hasta aproximadamente 1:50.000). La intensidad de la respuesta inmunitaria contra la proteína era casi idéntica en los tres ratones.

Estos resultados muestran que en el caso de SipC se trata de una proteína altamente inmunógena (= proteína con alta antigenicidad) que produce en todos los animales infectados una clara respuesta inmunitaria, concretamente una respuesta de anticuerpos eficaz y específica contra la proteína SipC.

Con esto, con ayuda del ELISA para la detección de anticuerpos de SipC específicos es posible por primera vez la determinación del título de anti-SipC en suero de seres humanos o animales infectados. También puede realizarse la detección de anticuerpos anti-SipC en jugo de pescado de animales útiles. Por tanto, el ELISA para la detección de anticuerpos de SipC representa un procedimiento de prueba específico y eficaz para identificar infecciones por salmonela existentes o pasadas.

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TABLA 1 Lista de serovariedades de salmonela usadas en el ejemplo 2 y sus fórmulas de antígenos (esquema de Kauffmann-White)

1

TABLA 2 Lista de serovariedades de salmonela usadas en el ejemplo 4 y sus fórmulas de antígenos (esquema de Kauffmann-White)

2

Claims

1. Sistema de prueba para la detección de infecciones por salmonela existentes actualmente y/o en el pasado en una muestra, caracterizado porque el sistema de prueba comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con la proteína SipC de salmonela y que se produce (a) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2790 con el código de laboratorio I5B2, o (b) a partir de las células del cultivo de células de hibridoma depositado en la DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH, Alemania, el 1 de junio de 2006 con el número DSM ACC2789 con el código de laboratorio V1H7.

2. Sistema de prueba según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de prueba es un ELISA.