ES2339043T3 - Procedimiento para separar variantes de rotavirus y vacuna de rotavirus atenuado vivo. - Google Patents
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Abstract
Un rotavirus reordenante que comprende al menos un antígeno o al menos un segmento o parte de un segmento de la variante de rotavirus denominada P43 y depositada en la ECACC con el número de acceso 99089301, la descendencia del rotavirus y derivados inmunológicamente activos del mismo y materiales obtenidos a partir de los mismos, y en el que dicha variante se define por una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.
Description
Procedimiento para separar variantes de
rotavirus y vacuna de rotavirus atenuado vivo.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de vacuna, a procedimientos para prepararlas y a su
uso en terapia. En particular, la presente invención se refiere a
nuevas formulaciones de vacunas de rotavirus.
La diarrea infecciosa aguda es una causa
destacada de enfermedad y muerte en muchas áreas del mundo. En los
países en desarrollo el impacto de la enfermedad diarreica es
asombroso. En Asia, África y Latinoamérica se ha estimado que hay
entre 3 y 4 billones de casos de diarrea cada año y de estos casos
aproximadamente de 5 a 10 millones ocasionan la muerte (Walsh, J.
A. y col.: N. Engl. J. Med., 301: 967-974
(1979)).
Los rotavirus se han reconocido como una de las
causas más importantes de diarrea severa en lactantes y en niños
pequeños (Estes, M. K. Rotaviruses and Their Replication in Fields
Virology, Tercera Edición, editado por Fields y col., Raven
Publishers, Philadelphia, 1996). Se estima que la enfermedad por
rotavirus es responsable de más de un millón de muertes al año. La
mayoría de las veces, la enfermedad inducida por rotavirus afecta a
niños con edades comprendidas entre 6 y 24 meses y la prevalencia
máxima de la enfermedad generalmente se produce durante los meses
más fríos en los climas templados y en todo el año en las áreas
tropicales. Los rotavirus típicamente se transmiten de una persona
a otra por vía fecal-oral con un periodo de
incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. A
diferencia de la infección en el grupo de edad de 6 meses a 24
meses, los recién nacidos generalmente son asintomáticos o tienen
sólo la enfermedad leve. A diferencia de la enfermedad severa
encontrada normalmente en niños pequeños, la mayoría de los adultos
están protegidos como resultado de una infección previa por
rotavirus, de manera que la mayoría de las infecciones en adultos
son leves o asintomáticas (Offit, P. A. y col. Comp. Ther.,
8(8): 21-26, 1982).
Los rotavirus generalmente son esféricos y su
nombre se debe a su estructura de cápsida de doble cubierta externa
e interna característica. Típicamente, la estructura de cápsida de
doble cubierta de un rotavirus rodea a una cubierta de proteína
interna o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un rotavirus
se compone de 11 segmentos de ARN bicatenario que codifica al menos
11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales
denominadas VP4 y VP7 están dispuestas en el exterior de la
estructura de la cápsida de doble cubierta. La cápsida interna del
rotavirus presenta una proteína, que es la proteína del rotavirus
denominada VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas
rotavirales particulares en la inducción de la respuesta inmune que
sigue a la infección por rotavirus aún no está clara. Sin embargo,
la proteína VP6 determina el antígeno del grupo y subgrupo, y las
proteínas VP4 y VP7 son determinantes de la especificidad de
serotipo.
La proteína VP7 es una glicoproteína con un peso
molecular (PM) de 38.000 (34.000 cuando no está glicosilada), que
es el producto de traducción del segmento genómico 7, 8 ó 9,
dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación del
anticuerpo neutralizante principal después de la infección por
rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada con un
peso molecular (PM) de aproximadamente 88.000 que es el producto de
traducción del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula
anticuerpos neutralizantes después de la infección por rota-
virus.
virus.
Como las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas
virales contra las cuales se dirigen los anticuerpos neutralizantes,
se cree que son los candidatos principales para el desarrollo de
vacunas de rotavirus, produciendo protección contra la enfermedad
por rotavirus.
La infección natural por rotavirus durante las
primeras fases de la infancia se sabe que induce inmunidad
protectora.
Por lo tanto, es muy deseable una vacuna de
rotavirus atenuado vivo. Preferentemente, ésta debería ser una
vacuna oral, ya que ésta es la vía natural de infección del
virus.
Las primeras fases del desarrollo de la vacuna
para prevenir infecciones por rotavirus empezaron en la década de
los 70 después de descubrimiento del virus. Inicialmente se
estudiaron cepas atenuadas de animales y humanos y tuvieron
resultados mixtos o decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se
han centrado en reordenantes humano-animal que han
sido más satisfactorios.
Una cepa de rotavirus conocida como
89-12 se ha descrito por Ward; véase la Patente de
Estados Unidos Número 5.474.773 y Bernstein, D. L. y col, Vaccine,
16 (4), 381-387, 1998. La cepa 89-12
se aisló a partir de una muestra de heces recogida de un niño de 14
meses con enfermedad natural por rotavirus en 1988. De acuerdo con
la Patente de Estados Unidos Número 5.474.773, el rotavirus humano
HRV 89-12 después se adaptó al cultivo por 2 pases
en células primarias de Riñón de Mono Verde Africano (AGMK) y 4
pases en células MA-104 como se describe por Ward
en J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984. Después
se purificó en placa 3 veces en células MA-104
(hasta el pase 9) y se cultivo después de 2 pases adicionales en
estas células. Se realizó un pase adicional (pase 12) para la
deposición en la ATCC con en número de acceso ATCC VR 2272. La cepa
depositada se conoce como 89-12C2.
Más adelante se hace referencia al documento de
1998 en Vaccine de Bernstein y col como el documento Vaccine
(1998). El documento describe la seguridad e inmunogenicidad de un
candidato de vacuna viva de rotavirus humano administrada por vía
oral. Esta vacuna se obtuvo a partir de la cepa
89-12, atenuada por pases sin purificación en
placas 26 veces en células AGMK primarias y otras 7 veces en una
línea celular AGMK establecida (33 pases en total).
En lo sucesivo, en la presente memoria se hará
referencia al material mencionado anteriormente que se ha sometido
a pases en serie 26 veces como P26 y al material que se ha sometido
a pases en serie 33 veces como P33. En general, se hará referencia
al rotavirus obtenido por pases 89-12 n veces como
Pn.
En los ejemplos que se proporcionan más adelante
el material P33 se sometió a pases 5 veces más en células Vero. Se
hace referencia a este material como P38.
Los aislados de P26 y P33 descritos en el
documento Vaccine (1998) no se depositaron en una colección de
cultivos, ni se analizaron para establecer su caracterización
genética.
Ahora se ha descubierto que la población de P26
descrita en la bibliografía comprende una mezcla de variantes. Esto
se ha establecido por caracterización genética como se describe más
adelante en la presente memoria (véanse los ejemplos). Por lo
tanto, P26 no es una población constante fiable para pases
adicionales, en particular para la producción de lotes de vacuna.
De forma similar, P33 comprende una mezcla de variantes y no es
constante de forma fiable para la producción de lotes de
vacuna.
Se ha descubierto que el material P26 es una
mezcla de al menos tres variantes génicas de VP4. De manera similar,
P33 y P38 son una mezcla de dos variantes. Estas variantes parecen
ser antigénicamente diferentes, en términos de epítopes de
neutralización, a la cepa 89-12C2 depositada en la
ATCC cuando se evalúan los títulos de anticuerpos neutralizantes de
sueros procedentes de lactantes vacunados con P33 contra estas
variantes. Esto se ilustra en la Figura 3.
Además, se ha descubierto que cuando el material
P33 se administra a lactantes, se replican y excretan dos variantes
identificadas. De 100 lactantes vacunados, sólo 2 mostraron signos
de gastroenteritis debida a infección por rotavirus, mientras que
se infectó el 20% de un grupo de placebo. Estos hallazgos sugieren
que las variantes identificadas están asociadas con protección
frente a la enfermedad por rotavirus.
La presente invención proporciona un
procedimiento para separar variantes de rotavirus y una vacuna de
rotavirus atenuado vivo mejorada derivada de una cepa de rotavirus
humana clonada (homogénea).
Por consiguiente, de acuerdo con un primer
aspecto, la presente invención proporciona una población de
rotavirus atenuado (aislado), caracterizada por el hecho de que
comprende una sola variante o sustancialmente una sola variante,
estando dicha variante definida por la secuencia de nucleótidos que
codifica al menos una de las proteínas virales principales
denominadas VP4 y VP7.
Preferentemente, la población de rotavirus de
acuerdo con la invención es una variante clonada.
Por una población que comprende una sola
variante, o sustancialmente una sola variante, se entiende una
población de rotavirus que no contiene más de un 10%, y
preferentemente menos de un 5% y aún más preferentemente menos de
un 1% de una variante o variantes diferentes. Las poblaciones de
virus pueden purificarse hasta la homogeneidad o hasta una
homogeneidad sustancial por medio del pase sobre tipos celulares
adecuados o realizando una serie de una o más etapas de
clonación.
Una ventaja de la invención es que una población
que comprende una sola variante es más adecuada para la formulación
de un lote de vacuna constante. Las variantes particulares definidas
por secuencias de nucleótidos que codifican la proteína viral
principal también pueden asociarse con mayor eficacia en la
prevención de la infección por rotavirus.
En un aspecto preferido, la variante individual
o sustancialmente individual en la población de rotavirus de la
invención es una variante en la que el gen de VP4 comprende una
secuencia de nucleótidos que comprende al menos una de las
siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base
adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición
501 desde el codón de iniciación.
En otro aspecto, la variante individual o
sustancialmente individual en la población de la invención es una
variante en la que el gen de VP7 comprende una secuencia de
nucleótidos que comprende al menos una de las siguientes: una
timina (T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 o
una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
Preferentemente, en la posición 897 hay una adenina (A).
En un aspecto preferido, la variante individual
en la población de acuerdo con la invención tiene una adenina (A)
en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501
desde el codón de iniciación en la secuencia del gen de VP4.
En otro aspecto preferido, la variante
individual en la población de acuerdo con la invención tiene una
timina (T) en la posición 605 y una adenina/guanina (A/G) en la
posición 897 desde el codón de iniciación en la secuencia de VP7.
Más preferentemente, en la secuencia de VP7 hay una adenina (A) en
la posición 897.
En un aspecto particularmente preferido, la
variante individual en la población de acuerdo con la invención
tiene una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T)
en la posición 501 desde el codón de iniciación en la secuencia del
gen de VP4, y una timina (T) en la posición 605 y una
adenina/guanina (A/G) en la posición 897 desde el codón de
iniciación en la secuencia de VP7. Más preferentemente, en la
secuencia de VP7 hay una adenina (A) en la posición 897.
En otro aspecto, la variante individual
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
VP4, siendo la secuencia de nucleótidos como se muestra en la
Figura 1, y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína VP7, siendo la secuencia de nucleótidos como se muestra en
la Figura 2.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para producir una población de rotavirus que comprende
una variante sustancialmente individual, comprendiendo el
procedimiento:
- someter a pases una preparación de rotavirus sobre un tipo celular adecuado;
- opcionalmente seleccionar el cultivo homogéneo usando las etapas de:
- a) dilución límite; o
- b) aislamiento de placas individuales; y
- comprobar la presencia de una variante sustancialmente individual realizando una determinación de secuencia de una región apropiada de la secuencia del gen de VP4 y/o VP7.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la secuencia
convenientemente puede realizarse por una técnica de hibridación
cuantitativa o semicuantitativa tal como hibridación por
transferencia en ranura o hibridación en placa.
Preferentemente, la variante seleccionada es una
variante que se replica y excreta cuando la preparación de
rotavirus de partida se administra a un sujeto humano, en particular
un niño.
La población de virus clonada resultante
obtenida por el procedimiento de acuerdo con la invención puede
amplificarse por pases adicionales sobre una línea celular
adecuada.
Los tipos celulares adecuados para el pase de la
población de rotavirus en el procedimiento anterior incluyen
células de riñón de mono verde africano (AGMK), que pueden ser
líneas celulares establecidas o células AGMK primarias. Las líneas
celulares AGMK adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares
Vero (ATCC CCL-81),
DBS-FRhL-2 (ATCC
CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) y
CV-1 (ATCC CCL-70). También son
adecuadas líneas celulares MA-104 (mono rhesus) y
MRC-5 (humana-ATCC
CCL-171). Las células Vero son particularmente
preferidas para fines de amplificación. El pase en células Vero
proporciona un alto rendimiento de virus.
Las técnicas para comprobar si hay una sola
variante en una población de virus resultante del procedimiento y
para determinar la naturaleza de esa única variante implican
procedimientos de secuenciación o hibridación convencionales
conocidos en la técnica y se describen más adelante.
En un aspecto preferido, el procedimiento de la
invención se realiza usando un rotavirus apropiado, particularmente
un rotavirus que tiene las características de la cepa
89-12 o de un derivado sometido a pases del
mismo.
Una población variante individual
particularmente preferida es P43, que se obtuvo a partir de P33 (un
rotavirus humano aislado sometido a 33 pases en cultivo sobre tipos
celulares apropiados) por una serie de etapas de clonación de
dilución terminal seguidas del pase del material clonado sobre
células Vero para la amplificación.
Una población de P43 se depositó en la Colección
Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC), Vaccine Research
and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre
for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury,
Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido, el 13 de agosto de 1999 con el
número de depósito 99081301, según los términos de Tratado de
Budapest.
Aunque esta disponibilidad pública indicada es
el procedimiento más sencillo para obtener el rotavirus humano P43,
no es totalmente imposible o improbable que puedan producirse
retrovirus similares y sustancialmente idénticos desde el punto de
vista funcional por estos u otros procedimientos en vista de las
enseñanzas de la presente invención. Estos rotavirus
sustancialmente idénticos desde el punto de vista funcional se
consideran biológicamente equivalentes al rotavirus humano P43 de
la presente invención y por lo tanto están dentro del alcance
general de la presente invención. Por lo tanto, se entenderá que la
invención incluye poblaciones de rotavirus que tienen las
características de la variante P43 como se describe en la presente
memoria.
También se entenderá que la invención incluye
materiales obtenidos a partir del P43 ECACC 99081301 depositado
sometiéndolo a un procesamiento adicional, tal como propagándolo por
pases adicionales, clonación u otros procedimientos usando el virus
vivo o modificando P43 de cualquier manera incluyendo técnicas de
ingeniería genética o técnicas de reordenantes. Estas etapas y
técnicas son bien conocidas en este campo.
Los materiales obtenidos a partir del P43
depositado que se incluyen en la invención incluyen proteína y
material genético. Son de un interés particular los rotavirus
reordenantes que comprenden al menos un antígeno o al menos un
segmento de P43, por ejemplo reordenantes que comprenden una cepa
virulenta de rotavirus en la que uno o parte de uno de los 11
segmentos de genoma se ha reemplazado por el segmento de genoma o
parte del mismo de P43. Específicamente, un rotavirus reordenante
en el que el segmento o segmento parcial que codifica NSP4 es un
segmento o segmento parcial de P43, puede tener propiedades útiles.
Los rotavirus reordenantes y las técnicas para prepararlos son bien
conocidas (Foster, R. H. and Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus
Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2),
155-178, 1998).
Son materiales de un interés particular la
descendencia de P43 y derivados inmunológicamente activos de P43.
Derivados inmunológicamente activos significa materiales obtenidos a
partir o con el virus P43, particularmente antígenos del virus, que
pueden inducir una respuesta inmune que es reactiva contra rotavirus
cuando se inyectan en un animal huésped.
Para adaptar el rotavirus a una línea celular
apropiada, por ejemplo células Vero, puede ser necesario tratar el
virus para eliminar cualquier contaminante potencial tal como
cualquier agente adventicio que pueda estar presente y que de no
eliminarse produciría contaminación. En el caso de virus adventicios
sensibles a éter, esto puede hacerse por tratamiento con éter como
se describe más adelante en la presente memoria. La presente
invención también se refiere a la inclusión de dicho tratamiento con
éter como etapa opcional en el procedimiento global para obtener un
rotavirus atenuado vivo o una vacuna formulada con el mismo.
También se incluyen dentro del alcance de la
invención mezclas de P43 con otras variantes de rotavirus, por
ejemplo otras variantes clonadas, o con otros virus, en particular
otros virus atenuados. Estas mezclas son útiles en las vacunas de
la invención que se describen más adelante en la presente
memoria.
La presente invención también proporciona una
vacuna de rotavirus atenuado vivo que comprende una población de
sustancialmente una sola variante mezclada con un adyuvante adecuado
o un vehículo farmacéutico.
Preferentemente, la vacuna de rotavirus de
acuerdo con la invención es una vacuna de rotavirus monovalente que
contiene una sola cepa de rotavirus.
La presente invención es particularmente
ventajosa para proporcionar una vacuna de rotavirus vivo en la que
el rotavirus atenuado vivo es un rotavirus humano y no produce
intususcepción.
Los vehículos farmacéuticos adecuados para uso
en la vacuna de acuerdo con la invención incluyen los considerados
en la técnica adecuados para administración oral, especialmente para
lactantes. Estos vehículo incluyen, y sin limitación,
carbohidratos, polialcoholes, aminoácidos, hidróxido de aluminio,
hidróxido de magnesio, hidroxiapatita, talco, óxido de titanio,
hidróxido de hierro, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, gelatina,
peptona vegetal, xantano, carragenina, goma arábiga,
\beta-ciclodextrina.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una vacuna de rotavirus, por ejemplo
liofilizando el virus en presencia de estabilizadores adecuados o
mezclando el virus de acuerdo con la invención con un adyuvante o
vehículo farmacéutico adecuado.
También puede ser ventajoso formular el virus de
la invención en vehículos basado en lípidos tales como virosomas o
liposomas, en emulsiones de aceite en agua o con partículas de
soporte. Como alternativa o además, en la formulación pueden
incluirse inmunoestimulantes tales como los conocidos en la técnica
para vacunas orales. Estos inmunoestimulantes incluyen toxinas
bacterianas, particularmente toxina colérica (CT) en forma de
holotoxina (molécula entera) o la cadena B sólo (CTB) y la
enterotoxina termolábil de E. coli (LT). En los documentos
WO 96/06627, WO 93/13202 y US 5.182.109 se describen LT mutadas
(mLT) que tienen menos probabilidad de convertirse en su forma
activa que en la LT nativa.
Otros inmunoestimulantes que pueden incluirse
ventajosamente son derivados de saponina tales como QS21 y
monofosforil lípido A, en particular monofosforil lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL). En el documento WO 98/56415 se describen
saponinas purificadas como adyuvantes orales. Las saponinas y el
monofosforil lípido A pueden emplearse por separado o en
combinación (por ejemplo, documento WO 94/00153) y pueden formularse
en sistemas adyuvantes junto con otros agentes. El
3D-MPL es un adyuvante muy conocido fabricado por
Ribi Immunochem, Montana y su fabricación se describe en el
documento GB 2122204.
Puede encontrarse un análisis general de
vehículos y adyuvantes para inmunización oral en Vaccine Design,
The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell and Newman,
Plenum Press, New York, 1995.
La invención también proporciona un
procedimiento para vacunar seres humanos, especialmente lactantes,
por medio de la administración a un sujeto que lo necesita de una
cantidad eficaz de una composición de vacuna de acuerdo con la
invención. Preferentemente, la vacuna viva atenuada se administra
por administración oral.
En un aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención se formula con un antiácido para minimizar
la inactivación de la vacuna por el ácido del estómago. Los
componentes antiácido adecuados incluyen antiácidos orgánicos, por
ejemplo hidróxido de aluminio Al(OH)3 e hidróxido de
magnesio Mg(OH)2. Los antiácidos disponibles en el
mercado que son adecuados para uso en la invención incluyen Mylanta
(marca comercial) que contiene hidróxido de aluminio e hidróxido de
magnesio. Son insolubles en agua y se proporcionan en
suspensión.
El hidróxido de aluminio es un componente
particularmente preferido de una composición de vacuna de acuerdo
con la invención ya que puede proporcionar no sólo un efecto
antiácido, sino también un efecto adyuvante.
También son adecuados para uso como antiácidos
en la vacuna de la invención antiácidos orgánicos tales como sales
carboxilato de ácidos orgánicos. Un antiácido preferido en la
composición de vacuna de la invención contiene una sal carboxilato
de ácido orgánico, preferentemente una sal de ácido cítrico tal como
citrato sódico o citrato potásico.
Un antiácido particularmente preferido que puede
usarse en la composición de vacuna de la presente invención es la
sal inorgánica insoluble carbonato cálcico (CaCO_{3}). El
carbonato cálcico puede asociarse con el rotavirus y la actividad
del rotavirus se mantiene durante la asociación con el carbonato
cálcico.
Para prevenir la sedimentación del carbonato
cálcico durante la etapa de rellenado, preferentemente están
presentes en la formulación agentes viscosos.
Los agentes viscosos posibles que pueden usarse
incluyen excipientes seudoplásticos. Una solución seudoplástica se
define como una solución que tiene mayor viscosidad en reposo en
comparación con su viscosidad con agitación. Son excipientes de
este tipo polímeros naturales tales como goma arábiga, goma
tragacanto, agar-agar, alginatos, peptinas o
polímeros semisintéticos, por ejemplo: carboximetilcelulosa (Tyloses
C®), metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® y
MB®), hidroxipropilcelulosa (Klucels®) e hidroxipropilmetilcelulosa
(Methocels E® y K®, Viscontrans MPHC®). En general, estos
excipientes seudoplásticos se usan junto con agentes tixotrópicos.
Son agentes viscosos alternativos que pueden usarse excipientes
seudoplásticos con baja capacidad de fluidez. Estos polímeros, a
una concentración suficiente, dan lugar a una disposición
estructural de fluido que tiene como resultado una solución de alta
viscosidad que tiene baja capacidad de fluidez tras un periodo de
reposo. Necesita proporcionarse al sistema una cierta cantidad de
energía para permitir el flujo y la transferencia. Se necesitan
energías externas (agitación) para destruir temporalmente la
disposición estructural del fluido para obtener una solución
fluida. Son ejemplos de estos polímeros Carbopols® y goma
xantana.
Los excipientes tixotrópicos se convierten en
una estructura de gel tras un periodo de reposo, mientras que con
agitación forman una solución fluida. Son ejemplos de excipientes
tixotrópicos: Veegum® (silicato de
Magnesio-Aluminio) y Avicel RC® (aproximadamente un
89% de celulosa microcristalina y un 11% de Carboximetilcelulosa
Na).
La composición de vacuna de la presente
invención preferentemente comprende un agente viscoso seleccionado
entre goma xantana o almidón.
De esta manera, la composición de vacuna de la
presente invención preferentemente se formula con una combinación
de carbonato cálcico y goma xantana.
Otros componentes de una composición usada en la
invención convenientemente incluyen azúcares, por ejemplo sacarosa
y/o lactosa.
La composición de vacuna de acuerdo con la
invención puede contener otros componentes que incluyen, por ejemplo
saporíferos (particularmente para una vacuna oral) y agentes
bacteriostáticos.
Se prevén diferentes presentaciones de la
composición de vacuna de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, la vacuna se
administra como una formulación líquida. Preferentemente, la
formulación líquida se reconstituye antes de la administración a
partir de al menos los dos siguientes componentes:
- i)
- componente de virus
- ii)
- componente líquido.
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En esta realización, el componente de virus y el
componente líquido normalmente están presentes en recipientes
separados, que convenientemente pueden ser compartimentos separados
de un solo recipiente o recipientes separados que pueden estar
conectados de tal manera que la composición de vacuna fina se
reconstituya sin exponerla al aire.
Antes de la reconstitución, el virus puede estar
en una forma seca o en una forma líquida. Preferentemente, el
componente del virus está liofilizado. Un virus liofilizado es más
estable que un virus en solución acuosa. El virus liofilizado puede
reconstituirse convenientemente usando una composición líquida de
antiácido para producir una formulación de vacuna líquida. Como
alternativa, el virus liofilizado puede reconstituirse con agua o
solución acuosa, en cuyo caso la composición de virus liofilizado
preferentemente contiene un componente antiácido.
Preferentemente, la formulación de vacuna
comprende un componente de virus formulado con carbonato cálcico y
goma xantana en un compartimento o recipiente y se reconstituye con
agua o solución acuosa presente en el segundo compartimento o
recipiente.
En otra realización preferida, la composición de
vacuna es una formulación sólida, preferentemente una torta
liofilizada que es adecuada para su disolución inmediata cuando se
pone en la boca. Las formulaciones liofilizadas convenientemente
pueden proporcionarse en forma de comprimidos en un blíster
farmacéutico.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna de rotavirus en forma de un comprimido de disolución rápida
para administración oral.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición que comprende una cepa de rotavirus atenuado vivo, en
particular una cepa de rotavirus humano, donde la composición es un
sólido liofilizado capaz de disolverse inmediatamente cuando se
pone en la boca.
Preferentemente, el comprimido de disolución
rápida de acuerdo con la invención se disuelve en la boca del
sujeto de una manera suficientemente rápida para impedir que el
sujeto se trague el comprimido sin disolver. Esta estrategia es
particularmente ventajosa para vacunas de rotavirus pediátricas.
Preferentemente, el virus es un rotavirus humano
vivo atenuado que se formula con un antiácido inorgánico tal como
carbonato cálcico y un agente viscoso tal como goma xantana.
Otro aspecto de la presente invención es
proporcionar una formulación liofilizada en la que el componente
del virus es cualquier cepa de rotavirus que se formula con
carbonato cálcico y goma xantana. Las vacunas de la invención
pueden formularse y administrarse por técnicas conocidas, usando una
cantidad adecuada de virus vivo para proporcionar una protección
eficaz contra la infección por rotavirus sin los efectos secundarios
adversos significativos observados con las vacunas típicas. Una
cantidad adecuada de virus vivos normalmente estará comprendida
entre 10^{4} y 10^{7} uff por dosis. Una dosis típica de vacuna
puede comprender 10^{5}-10^{6} uff por dosis y
puede administrarse en varias dosis durante un periodo de tiempo,
por ejemplo en dos dosis administradas con un intervalo de 2 meses.
Sin embargo, pueden obtenerse beneficios al tener un régimen de más
de dos dosis, por ejemplo de 3 ó 4 dosis, particularmente en países
en desarrollo. El intervalo entre las dosis puede ser mayor o menor
de dos meses. Una cantidad óptima de virus vivo para un régimen de
una sola dosis o de múltiples dosis, y los momentos óptimos para
las dosis, pueden averiguarse por estudios convencionales que
implican la observación de los títulos de anticuerpo y otras
respuestas en los sujetos.
La vacuna de la invención también puede
comprender otros virus vivos adecuados para conseguir protección
frente a otras enfermedades, por ejemplo poliovirus. Como
alternativa, pueden administrarse otras vacunas de virus vivos
adecuadas para administración oral en una dosis separada pero en la
misma ocasión que la composición de vacuna de rotavirus de acuerdo
con la invención.
Se ensayaron sueros de doce lactantes de 4 a 6
meses de edad vacunados con el material P33 como se describe en el
documento Vaccine (1998) con respecto a la neutralización de P33,
P38, P43 y 89-12C2.
El intervalo de títulos de neutralización de
todos los sueros ensayados es similar para P33, P38 y P43. El
análisis estadístico no muestra ninguna diferencia significativa en
los títulos de neutralización globales contra los tres virus. Esto
sugiere que los epítopes de neutralización conformacionales y no
conformacionales de P33, P38 y P43 se reconocen igualmente bien por
los sueros anti-P33 de los lactantes vacunados con
P33. Esta observación sugiere indirectamente que los epítopes de
neutralización revelados en este ensayo in vitro no se
alteraron entre P33, P38 y P43.
Sin embargo, el intervalo de títulos de
neutralización de P89-12C2 difiere
significativamente de P33, P38 y P43. Esta observación sugiere que
los epítopes de neutralización conformacionales y no
conformacionales de P33, P38 y P43 no se reconocen igualmente bien
por los sueros anti-P33 de los lactantes vacunados
con P33. Esta observación sugiere indirectamente que los epítopes
de neutralización revelados en este ensayo in vitro se
alteraron entre 89-12 C2 y P33, P38 y P43.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se realizó la secuenciación de genes de VP4 y
VP7 procedentes del pase P26 (células AGMK primarias), pase P33
(línea celular AGMK establecida (en lugar de primaria)), pase P41 y
pase P43. La extracción de ARN total se sometió a transcripción
inversa y se amplificó por medio de PCR en un tubo/una etapa.
Los cebadores Rota 5bis y Rota 29bis
amplificaron el gen de VP4 entero y los cebadores Rota 1 y Rota 2bis
amplificaron el gen de VP7 entero. El material de PCR se ha
secuenciado usando diferentes cebadores (véase la Tabla 1).
La secuencia del pase P26 difería de la
secuencia del pase P33 en 3 bases (en las posiciones 501, 788 y 802
pb desde el codón de iniciación) en VP4 y en tres bases en VP7 (108,
605 y 897 pb desde el codón de iniciación).
Las exploraciones de la secuencia del pase P26
de VP4 y VP7 muestran en posiciones mutadas la presencia de la
secuencia del pase P33 como efecto de fondo. De esta manera puede
verse que el pase P26 es una mezcla de al menos 2 variantes.
Las exploraciones de la secuencia del pase P33
parecen homogéneas en VP4 y heterogéneas para VP7 (véase la Tabla
2).
El pase P38 (obtenido a partir del pase 33) se
sometió a 5 pases en células Vero y presentó la misma serie de
secuencias de VP4 y VP7 que el pase P33 (línea celular AGMK). Por lo
tanto no hubo ningún cambio importante en las poblaciones entre P33
y P38.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Las bases mostradas en negrita en la Tabla 2 son
los sitios de variación de secuencia específicos en VP4 y VP7.
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N.B. En un segundo clon de los 3 clones que se
desarrollaron hasta el nivel de lote de producción, el nucleótido
en la posición de 897 pb de VP7 es G en lugar de A como en el clon
seleccionado de P43. Esto produce una metionina en lugar de una
isoleucina en la secuencia de aminoácidos. Se excretaron variantes
correspondientes tanto al clon de P43 seleccionado como al clon en
el que hay una G en VP7 en 897 pb desde el codón de iniciación, en
las heces de lactantes que se habían vacunado con el material
P33.
En la Tabla 3.1, cuando hay dos bases
alternativas en una posición particular, la primera de las dos
representa la base que aparece en una población principal y la
segunda es la base que aparece en una población minoritaria. Las
poblaciones de variantes principal y minoritaria se juzgan por la
intensidad de la señal en la secuenciación.
La Tabla 3.2 muestra los cambios de aminoácidos
debidos a las diferencias de nucleótidos entres las variantes.
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El cambio en poblaciones entre pases P26 a P33
en células AGMK se ha confirmado adicionalmente por hibridación por
transferencia en ranura. Los fragmentos génicos de VP4 y VP7
generados por RT/PCR se hibridaron con sondas oligonucleotídicas
específicas para cada variante (véase la Tabla 3.1 y 3.2). A
diferencia de P26 que hibridaba con Rota 16, Rota, 35 y Rota 36 y
no con Rota 15, el fragmento de PCR de VP4 del material P33, en las
posiciones 788 y 802 hibridaba únicamente con Rota 16 y no con Rota
15 o Rota 35 o Rota 36. Estos resultados establecieron la presencia
de al menos 3 variantes en P26 (véase la Tabla 4).
Para el fragmento de PCR de VP7 del material
P33, la posición 897 hibridaba con Rota 41 y Rota 42. Estos
resultados establecieron la presencia de al menos dos variantes en
el material P33.
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Para aislar componentes de P33 como una
población de virus homogénea, se realizaron tres diluciones de punto
final de P33/AGMK en células Vero y el virus resultante se usó para
infectar células Vero.
Se seleccionaron pocillos positivos usando dos
criterios: crecimiento demostrado por el mayor número de focos
detectados en los pocillos y la mayoría de los pocillos positivos
aislados en las placas, como se hace clásicamente. Después de 3
pases de dilución final en placas de microtitulación de 96 pocillos,
se amplificaron 10 pocillos positivos sucesivamente en células Vero
y se evaluaron con respecto a su rendimiento.
Basándose en el rendimiento, se crearon tres
clones para el nivel de pase de lote de producción.
El inmunorreconocimiento por anticuerpos
policlonales mostró ser similar entre los tres clones y entre los
clones y P33. La homogeneidad de los clones se evaluó por
hibridación por transferencia en ranura. La selección final de un
solo clon se basó en el rendimiento y en la secuencia.
El clon seleccionado se amplificó por pases
sucesivos en células Vero para generar una siembra maestra, una
siembra de trabajo y finalmente lotes de producción.
El clon seleccionado se caracterizó
genéticamente a diferentes niveles de pase por secuenciación de VP4
y VP7 (identidad) y por hibridación por transferencia en ranura
específica del VP4 y VP7 (homogeneidad) de los materiales
amplificados por PCR. Las secuencias de los genes de VP4 y VP7 del
material P43 se proporcionan en las Figuras 1 y 2 respectivamente y
son idénticas a P41.
La homogeneidad del clon seleccionado se evaluó
por hibridación selectiva usando sondas oligonucleotídicas que
discriminan cambios de nucleótidos en regiones de VP4 y/o VP7 para
cada variante identificada durante la secuenciación de P26/AGMK
primaria (véase la Tabla 4).
El fragmento de VP4 hibridó con Rota 16 y no con
Rota 15, Rota 35 o Rota 36.
El fragmento de VP7 hibridó con Rota 41 y no con
Rota 42.
Estos resultados confirmaron que P43 es una
población homogénea.
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Se añadió éter a P33 (AGMK desarrolladas) a una
concentración final del 20% durante 1 hora. Después el éter se
eliminó burbujeando con N2 durante 35 minutos. No se observó ningún
impacto sobre el título de P33.
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Los lotes de producción descritos anteriormente
se formulan para administración oral a lactantes por medio del
siguiente procedimiento.
Se usan técnicas convencionales para preparar
dosis de virus. La masa viral purificada congelada se descongela y
se diluye con composición de medio apropiada, en este caso medio de
Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral
convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. El virus
diluido después se diluye adicionalmente con estabilizador de
liofilización (4% de sacarosa, 8% de dextrano, 6% de sorbitol, 4%
de aminoácidos) hasta el título viral diana, en este caso 10^{5,6}
uff/dosis. Se transfieren asépticamente alícuotas de 0,5 ml de
composición de virus estabilizada a viales de 3 ml. Cada vial
después se cierra parcialmente con un tapón de goma, la muestra se
liofiliza al vacío, el vial después se cierra completamente y se
corruga una tapa de aluminio en su sitio alrededor del vial para
mantener el tapón en su sitio.
Para su uso, el virus se reconstituye usando uno
de los siguientes reconstituyentes antiácidos:
Se disuelve citrato sódico en agua, se
esteriliza por filtración y se transfiere asépticamente a
recipientes de reconstituyente en cantidades de 1,5 ml a una
concentración de 544 mg de Na_{3}Citrato.2H_{2}O para una dosis
de 1,5 ml. Los recipientes de reconstituyente pueden ser, por
ejemplo, viales de 3 ml o viales de 4 ml, o jeringas de 2 ml, o
cápsulas comprimibles de plástico blando para administración oral.
Como alternativa para mantener los componentes estériles en
condiciones estériles, el recipiente final puede esterilizarse en
autoclave.
Una suspensión aséptica de hidróxido de aluminio
(Mylanta-marca comercial) se diluye asépticamente en
agua estéril, y se transfiere asépticamente a recipientes de
reconstituyente (por ejemplo jeringas de 2 ml o cápsulas
comprimibles de plástico blando) en cantidades de 2 ml, conteniendo
cada uno 48 mg de Al(OH)_{3}. Una alternativa al
uso de componentes estériles en condiciones estériles es someter a
irradiación \gamma la suspensión de hidróxido de aluminio
(preferentemente en una etapa diluida).
Se incluyen ingredientes convencionales para
impedir que la suspensión sedimente. Estos ingredientes
convencionales incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio,
carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa
microcristalina y polímeros de silicona. También pueden incluirse
agentes bacteriostáticos, por ejemplo butilparabeno, propilparabeno
u otros agentes bacteriostáticos convencionales usados en
alimentación, y saporíferos.
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Se usan técnicas convencionales para preparar
dosis de virus. La masa viral purificada congelada se descongela y
se diluye con una composición de medio apropiada, en este caso medio
de Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral
convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade
suspensión de hidróxido de aluminio para alcanzar una cantidad
final de 48 mg/dosis y la composición de virus se diluye con
estabilizador de liofilización (4% de sacarosa, 8% de dextrano, 6%
de sorbitol, 4% de aminoácidos) hasta el título viral deseado, en
este caso 10^{5,6} uff/dosis. Se transfieren asépticamente
alícuotas de 0,5 ml de composición de virus estabilizada a viales
de 3 ml. Después se realizan la liofilización y el cierre de los
viales como se ha descrito en la parte 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan técnicas convencionales para preparar
dosis de virus. Se descongela masa viral purificada congelada y se
diluye con una composición de medio apropiada, en este caso medio de
Eagle modificado por Dulbecco, hasta una concentración viral
convencional deseada, en este caso 10^{6,2} uff/ml. Se añade
suspensión de hidróxido de aluminio para alcanzar una cantidad
final de 48 mg/dosis y la composición de virus se diluye con
estabilizador de liofilización que puede ser sacarosa, dextrano o
aminoácidos al 4%, o gelatina, peptona vegetal o xantano hasta el
título viral diana de 10^{5,6} uff/dosis. Se emplea una operación
de rellenado aséptica para transferir dosis de 0,5 ml o
preferentemente menos a las cavidades del blister. La composición se
liofiliza y las cavidades del blíster se sellan por sellado
térmico.
térmico.
Opcionalmente se incluyen ingredientes
convencionales para impedir que la suspensión de hidróxido de
aluminio sedimente. Estos ingredientes convencionales incluyen, por
ejemplo, estearato de magnesio, carboximetilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina y polímeros de
silicona. También pueden incluirse saporíferos.
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Se formuló rotavirus P43 con sacarosa o con
lactosa como se muestra en la tabla anterior. La titulación viral
antes de la liofilización es el título viral en el líquido formulado
completo (que contiene sacarosa, dextrano, sorbitol y aminoácidos)
y sin la etapa de liofilización.
Son buenos resultados aquellos en los que se
consigue una reducción de <0,5 log en la etapa de liofilización
y una reducción <0,5 log durante la "1 semana a 37ºC"
(ensayo de estabilidad en condiciones aceleradas).
La precisión de la titulación viral es de
aproximadamente + o - 0,2 log.
Los resultados indican que puede usarse sacarosa
en lugar de lactosa.
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Los resultados demuestran que la adición de
arginina (que se sabe que mejora la estabilidad del virus durante
la liofilización y también proporciona un medio básico para
compensar la acidez del estómago) mantiene el título viral.
El sorbitol tiende a reducir la temperatura de
transición vítrea de la torta liofilizada en una medida demasiado
grande. Esto puede solucionarse por el uso de maltitol en lugar de
sorbitol como se ha demostrado anteriormente y se mantiene el
título viral.
\newpage
Este experimento demuestra que son posibles
varias formulaciones
Al(OH)_{3} se usa como
antiácido. Esto muestra que el rotavirus está asociado con la sal
inorgánica insoluble (Al(OH)_{3}) ya que se
centrifuga junto con el Al(OH)_{3} (reduce la
actividad viral en el sobrenadante).
Cuando el rotavirus se asocia con el
Al(OH)3, es posible liofilizar el conjunto (incluyendo
el Al(OH)_{3}). Después de la liofilización, es
posible recuperar el rotavirus disolviendo
Al(OH)_{3} en Citrato Sódico. Esta etapa no daña al
rotavirus y retiene su actividad después de esta etapa de
disolución.
El mecanismo de liberación del virus (por
disolución del vehículo) puede realizarse muy bien in vivo.
De hecho, por debajo de pH 6, el hidróxido de aluminio se vuelve
completamente soluble y por lo tanto se liberará rotavirus en el
estómago.
Al(OH)_{3} + 3 \
H^{+} \longrightarrow Al^{+++} \ (soluble \ en \ agua) + 3 \
H_{2}O
En el estómago, los iones Al^{+++} no se
absorben (J. J. Powell, R. Jugdaohsingh and R.P.H. Thompson, The
regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track,
Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58,
147-153).
En el intestino, debido al aumento del pH,
precipitan las formas insolubles de aluminio
(Al(OH)_{3} o AlPO_{4}) y se eliminan de la manera
natural.
No se sabe si el precipitado de
Al(OH)_{3} (o AlPO_{4}) recién formado podrá
reasociarse con el Rotavirus libre. Esto plantea la cuestión de la
infectividad de la propia asociación de
Al(OH)_{3}-Rotavirus.
También es posible la liberación del rotavirus
de la asociación de
Al(OH)_{3}-Rotavirus por otros
mecanismos. La lisina, por ejemplo, interfiere con la adsorción
viral en Al(OH)_{3}.
Otros aniones tales como borato, sulfato,
carbonato y fosfato se sabe que se adsorben específicamente sobre
hidróxido de aluminio, por lo que, teóricamente, sería posible
desplazar (por competición por el sitio de adsorción) el Rotavirus
de la asociación de
Al(OH)_{3}-Rotavirus.
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De esta manera, el Rotavirus puede liberarse de
la asociación de Rotavirus-Al(OH)3 y
el Rotavirus liberado sigue siendo activo.
Esta liberación puede realizarse disolviendo
Al(OH)_{3} (por HCl en el estómago o por
Na_{3}Citrato in vitro) o desplazando el Rotavirus por un
aminoácido básico (lisina).
\newpage
Se reconstituyó una sola dosis de Rotavirus
liofilizado con agua y se dividió en dos partes. La primera parte,
considerada como la referencia, recibió un volumen adicional de
agua. La segunda parte recibió 24 mg de Al(OH)_{3}
suspendidos en 0,240 ml de agua (titulaciones virales
preclínicas).
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Cuando está presente Al(OH)_{3},
el Rotavirus es activo y el valor de titulación viral es mayor en
comparación con la muestra de referencia.
Este experimento se repitió sin dividir la dosis
liofilizada y añadiendo 12 mg de Al(OH)_{3} o 24 mg
de Al(OH)_{3}.
Aquí la muestra de referencia fue la
reconstituida con tampón citrato-bicarbonato. De
esta manera, el título viral de nuevo es mayor en presencia de
Al(OH)_{3}.
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\newpage
Como en el ejemplo anterior, el Rotavirus se
asocia con las partículas de Al(OH)_{3}, ya que el
virus puede desecharse por centrifugación. DRVC003A46 es un
Rotavirus formulado liofilizado: (Sacarosa: 2%; Dextrano: 4%,
Sorbitol: 3%; Amino-ácidos: 2%).
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De acuerdo con la titulación viral realizada en
el sobrenadante, la cantidad de Al(OH)_{3} necesaria
para adsorber Rotavirus parece ser baja (empezando con una dosis
liofilizada 5,7 log que aumenta hasta la titulación viral):
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El tiempo necesario para adsorber Rotavirus en
Al(OH)_{3} parece ser corto:
Una dosis de Rotavirus liofilizado se
reconstituyó en presencia de 24 mg de Al(OH)_{3} y
se centrifugó después de 0, 15, 60 min y 24 horas. Los sedimentos
se resuspendieron en SDSAA antes de la titulación viral:
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Para evitar el aluminio en la vacuna, el
antiácido Al(OH)3 se reemplazó por otra sal inorgánica
insoluble: CaCO_{3} (carbonato cálcico).
Los fenómenos observados con CaCO_{3} son
paralelos a los descritos para Al(OH)_{3}:
- -
- Asociación de Rotavirus con la sal inorgánica;
- -
- Mantenimiento de la actividad de Rotavirus cuando se asocia con la sal inorgánica;
- -
- Posibilidad de liberación de Rotavirus de la asociación por disolución de la base inorgánica por un ácido;
- -
- Posibilidad de co-liofilización del antiácido y el Rotavirus.
\newpage
En un primer ensayo, se reconstituyó Rotavirus
liofilizado (título viral 5,7) con una suspensión de CaCO_{3} en
agua (50 mg en 1,5 ml) y después se centrifugó, y el título viral
del sobrenadante se comparó con el sedimento.
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Esto indica que más del 90% del Rotavirus está
asociado con CaCO_{3}.
Además, cuando el virus estaba asociado, era
posible realizar la titulación y recuperar las cantidades virales
originales.
Además, los títulos virales son ligeramente
mayores que los obtenidos sin CaCO_{3}.
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\newpage
Se reconstituyó Rotavirus liofilizado con una
suspensión de CaCO_{3} en agua (1,5 ml):
- 10 mg
- 50 mg
- 100 mg
y después se centrifugó, y se comparó el título
viral del sobrenadante con el sedimento.
De esta manera, claramente se asocia más
CaCO_{3} y más virus y se encuentra menos en el sobrenadante. Sin
embargo, no se recupera completamente toda la dosis (se espera un
total de 5,3 al menos o incluso 5,8 como se ha obtenido
anteriormente-véase anteriormente).
Usando 10 dosis de Rotavirus liofilizado
(DRVC003A46) y 50 mg de CaCO_{3}, se realizaron dos tipos de
titulación Baby Rossett-Rice:
En una titulación Rossett-Rice
clásica, el antiácido se mezcla con Rotavirus y se vierte HCl en
este medio.
En la titulación Baby
Rossett-Rice "inversa", la situación es la
inversa: se gotea antiácido en la reserva de HCl (como ocurre in
vivo).
\vskip1.000000\baselineskip
De esta manera, en este experimento in
vitro, el carbonato cálcico puede proteger aproximadamente un
20% del Rotavirus de la presencia de HCl, mientras que el hidróxido
de aluminio no puede.
\vskip1.000000\baselineskip
Ésta es la liofilización "todo en uno" del
Rotavirus y el antiácido (CaCO_{3}) conjuntamente en el mismo
vial. Para impedir la sedimentación de CaCO_{3} durante la etapa
de rellenado se necesitan agentes viscosos. Los ejemplos de estos
agentes viscosos incluyen goma xantana y almidón. La actividad del
Rotavirus se mantiene incluso en presencia de goma xantana y
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Las siguientes formulaciones demuestran el
concepto "lyoc". Es decir, la disolución rápida de la torta
liofilizada en la boca.
En el "concepto lyoc" pueden usarse tanto
xantano como almidón (manteniendo las propiedades de disolución
rápida de la torta liofilizada).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa una suspensión de CaCO_{3} en
agua como antiácido para Rotavirus existe el problema de que las
partículas de carbonato cálcico sedimentan rápidamente cuando se
ponen en agua, ya que el valor de densidad del polvo se aproxima a
2,6 y el tamaño medio de partículas es de 30 \mum
Esta sedimentación puede ralentizarse:
- 1
- aumentando la densidad del medio circundante
- 2
- aumentando la viscosidad del medio circundante
- 3
- reduciendo el tamaño de las partículas
- 4
- manteniendo las partículas separadas entre sí
Cuando la suspensión de
CaCO_{3}-Agua (cuando está puesta en la jeringa)
se pone en la torta liofilizada (que contiene un 2% de sacarosa, un
4% de dextrano; un 3% de sorbitol; y un 2% de aminoácidos) aumenta
la densidad del medio circundante, pero la velocidad de
sedimentación del CaCO_{3} no es muy diferente de la de la
suspensión de CaCO_{3}-Agua.
Una solución seudoplástica se define como una
solución que tiene una mayor viscosidad tras un periodo de reposo
en comparación con su viscosidad con agitación.
Son excipientes habituales de este tipo:
polímeros naturales, por ejemplo:
goma arábiga
goma tragacanto
agar-agar
alginatos
pectinas
\vskip1.000000\baselineskip
polímeros semisintéticos, por
ejemplo:
carboximetilcelulosa (Tyloses C®)
metilcelulosa (Methocels A®, Viscotrans MC®,
Tylose MH® y MB®)
hidroxipropilcelulosa (Klucels®)
hidroxipropilmetilcelulosa (Methocels E® y K®,
Viscontrans MPHC®)
\vskip1.000000\baselineskip
En general, estos excipientes seudoplásticos se
usan junto con agentes tixotrópicos.
Estos polímeros, a una concentración
suficiente, dan lugar a una disposición estructural de fluido
que da como resultado una solución de alta viscosidad que tiene
baja capacidad de fluidez después del reposo. Necesita
administrarse una cierta cantidad de energía al sistema para
permitir el flujo y la transferencia.
Se necesitan energías externas (agitación) para
destruir temporalmente la disposición estructural del fluido para
obtener una solución fluida.
Son ejemplos de estos polímeros Carbopols® y
goma xantana.
Con estos excipientes, después del reposo, se
obtiene una estructura de gel; mientras que con agitación se
obtiene una solución fluida.
Son ejemplos de excipientes tixotrópicos:
Veegum® (silicato de Magnesio-aluminio) y Avicel RC®
(aproximadamente un 89% de celulosa microcristalina y un 11% de
Caboximetilcelulosa Na).
Una reducción en el tamaño de las partículas de
CaCO_{3} produjo una reducción en la capacidad antiácida del
compuesto.
Este es el caso de Veegum® y Avicel®, poniéndose
partículas insolubles menores (aproximadamente 1 \mum) que las
partículas de CaCO_{3} entre partículas de CaCO_{3} para impedir
la agregación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes esquemas demuestran ejemplos de
posibles diseños de productos.
Cuando ya se tienen lotes clínicos de Rotavirus
en viales liofilizados, el antiácido puede ponerse en el líquido
reconstituyente contenido en la jeringa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En esta presentación del producto, la
sedimentación de CaCO_{3} debe estar bajo control no sólo durante
las etapas de rellenado, sino también durante la vida útil completa
del producto (al menos 2 años).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso se liofilizan conjuntamente el
Rotavirus, el CaCO_{3} y la goma Xantana en el blíster.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas DS-1, P y VA70 se
describen como cepas de referencia de rotavirus humanos para los
serotipos G2, G3 y G4 respectivamente en la página 1361 de
"Fields" Raven press 1990, segunda edición.
En este experimento se han liofilizado
diferentes cepas de rotavirus.
En todos los casos, se ha mantenido el título
viral durante la liofilización y se ha demostrado la estabilidad en
condiciones aceleradas (una semana 37ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un estudio de fase I para evaluar la
seguridad y reactogenicidad de una sola dosis oral de 10^{6,0}
uff de la vacuna de P43 en adultos sanos de 18 a 45 años de
edad.
El ensayo clínico era un ensayo doble ciego y
aleatorio. Se controló con placebo y era un estudio independiente.
El estudio se realizó en un solo centro en Bélgica.
Se inscribieron en total 33 sujetos, 11 en el
grupo de placebo y 22 en el grupo de vacuna, y todos completaron el
estudio. Todos los voluntarios eran caucásicos. Su edad media en el
momento de la vacunación era de 35,3 años, con un intervalo de 18 a
44 años, el ensayo empezó en enero y duró un poco más de un mes.
Se produjeron lotes clínicos de vacuna de P43,
se purificaron, se formularon y se liofilizaron de acuerdo con las
Buenas Prácticas de Fabricación. Los lotes se pusieron en
circulación por los departamentos de control de calidad y garantía
de calidad. Cada vial de vacuna contenía los siguientes
componentes:
Ingredientes activo:
- cepa P43
- Min. 10^{5,8} uff
\newpage
Excipientes estabilizadores:
- Sacarosa
- 9 mg
- Dextrano
- 18 mg
- Sorbitol
- 13,5 mg
- Aminoácidos
- 9 mg
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon y se pusieron en circulación
viales de placebo. Cada vial de placebo contenía los siguientes
componentes:
Excipientes estabilizadores:
- Sacarosa
- 9 mg
- Dextrano
- 18 mg
- Sorbitol
- 13,5 mg
- Aminoácidos
- 9 mg
\vskip1.000000\baselineskip
Como diluyente para reconstituir la vacuna y el
placebo se usó agua para inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
De aproximadamente 10 a 15 minutos antes de la
administración de al vacuna o el placebo, los sujetos de ambos
grupos recibieron 10 ml de Mylanta® por vía oral. Mylanta® es un
antiácido registrado. El antiácido aumenta el pH del estómago e
impide la inactivación del rotavirus durante su paso a través del
estómago.
Para preparar la vacuna, se reconstituyeron dos
viales de P43 liofilizado que contenían 10^{5,8} uff por vial con
1,5 ml de agua para inyección como diluyente. Esto consiguió un
título viral calculado de 10^{6,1} uff por dosis. La vacuna
reconstituida se administró inmediatamente como una sola dosis
oral.
Para preparar el placebo, se reconstituyeron dos
viales de placebo liofilizado con 1,5 ml de agua para inyección y
se administraron por vía oral como una sola dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplican los siguientes criterios de seguridad
y reactogenicidad:
Los síntomas generales solicitados fueron
fiebre, diarrea, vómitos, náuseas, dolor abdominal y pérdida de
apetito. Se registraron durante los ocho días siguientes a la
administración.
Los síntomas no solicitados se registraron
durante los 30 días posteriores a la administración.
Los acontecimientos adversos graves se
registraron durante todo el periodo de estudio.
Las muestras de diarrea se recogieron durante
los ochos días posteriores a la administración.
Los resultados fueron:
ausencia de síntomas solicitados, ausencia de
síntomas no solicitados y ausencia de acontecimientos adversos
graves durante los periodos de observación respectivos.
No se notificaron casos de diarrea.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna P43 de SB Biologicals era segura con
respecto al placebo cuando se administraba por vía oral en un
diseño doble ciego como una sola dosis de 10^{6,1} uff a
voluntarios adultos sanos con edades comprendidas entre los 18 y
los 44 años.
<110> GlaxosmithKline Biologicals S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B45194 Div1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1009
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttagctcc ttttaatgta tggta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcacatcg aacaattcta atctaag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagtactca aatcaatgat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttgatttt tctgtcgatc cac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcttcgcc attttataga ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcggacc atttataacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcttcact catttataga ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcagacc atttataacc tag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipggagtagtat atgaaagtac aaataatag
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattatttg tactttcata tactactcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgatacagt ataagagagc acaag
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcattaact tgtgctctct tatactg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgtatatgtag actattggga tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcccaata gtctacatat ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaactccg gcaaaatgca acg
\hfill23
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<210> 21
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipcgttgcattt tgccggagtt aca
\hfill23
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<210> 22
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaagacaag atttagagcg cca
\hfill23
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<210> 23
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskiptggcgctcta aatcttgtct tac
\hfill23
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<210> 24
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskipcttgatgctg atgaagcagc atctg
\hfill25
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<210> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskipcagatgctgc ttcatcagca tcaag
\hfill25
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<210> 26
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> oligonucleótido
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<400> 26
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\hskip-.1em\dddseqskipcgatcatatc gaatattaaa ggatg
\hfill25
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<210> 27
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 27
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\hskip-.1em\dddseqskipcatcctttaa tattcgatat gatcg
\hfill25
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<210> 28
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgttcaca caatttacat tgtag
\hfill25
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<223> oligonucleótido
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskipagtattttat actatagtag attatattaa tc
\hfill32
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<210> 30
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<211> 32
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 30
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\hskip-.1em\dddseqskipagtattttat actatggtag attatattaa tc
\hfill32
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<210> 31
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccccatta tactgcattc ctttc
\hfill25
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<210> 32
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<212> ADN
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<220>
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskipatccctatta tactgcattt ctttc
\hfill25
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<210> 33
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<211> 25
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<400> 33
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\hskip-.1em\dddseqskipatccccatta tactgcattt ctttc
\hfill25
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<223> oligonucleótido
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<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccctatta tactgcattc ctttc
\hfill25
Claims (27)
1. Un rotavirus reordenante que comprende al
menos un antígeno o al menos un segmento o parte de un segmento de
la variante de rotavirus denominada P43 y depositada en la ECACC con
el número de acceso 99089301, la descendencia del rotavirus y
derivados inmunológicamente activos del mismo y materiales obtenidos
a partir de los mismos, y en el que dicha variante se define por
una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una de las
proteínas virales principales denominadas VP4 y VP7.
2. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la variante sustancialmente individual
es una variante en la que el gen de VP4 comprende una secuencia de
nucleótidos que comprende al menos una de las siguientes: una base
adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición
802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de
iniciación.
3. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el gen de VP4 comprende una secuencia
de nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones
788 y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón
de iniciación.
4. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la variante
sustancialmente individual es una variante en la que el gen de VP7
comprende una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una
de las siguientes: una timina (T) en la posición 605, una adenina
(A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde
el codón de iniciación.
5. Un rotavirus reordenante de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que el gen de VP7 comprende una secuencia
de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una
adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de
iniciación.
6. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una
de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el gen de VP4 comprende
una secuencia de nucleótidos que comprende una adenina (A) en las
posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el
codón de iniciación; y el gen de VP7 comprende una secuencia de
nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una
adenina (A) en la posición 897 desde el codón de iniciación.
7. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP4 en el que la
secuencia de nucleótidos es como se muestra en la Figura 1, y/o una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP7 en la que la
secuencia de nucleótidos es como se muestra en la Figura 2.
8. Un rotavirus reordenante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el segmento o
segmento parcial que codifica NSP4 es un segmento o un segmento
parcial de P43.
9. Una composición de vacuna que comprende un
rotavirus reordenante de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 mezclado con un vehículo o adyuvante
farmacéutico adecuado.
10. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 9, adaptada para administración oral.
11. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que el rotavirus reordenante se formula
con una composición de antiácido.
12. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que la composición de antiácido comprende
un antiácido orgánico.
13. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 12, en la que el antiácido es citrato sódico.
14. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que la composición de antiácido comprende
un antiácido inorgánico.
15. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que el antiácido es hidróxido de
aluminio.
16. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que el antiácido es carbonato cálcico.
17. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 16, que comprende además un agente viscoso.
18. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 17, en la que el agente viscoso es goma xantana.
19. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16-16, en la que
el rotavirus reordenante se formula con carbonato cálcico y goma
xantana y se reconstituye con solución acuosa.
20. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en la que el rotavirus
reordenante se formula con la composición de antiácido y se
liofiliza en un blíster.
21. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en la que el virus está
en forma liofilizada.
22. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 21, en la que el rotavirus reordenante y la
composición de antiácido están presentes en recipientes separados
para formulación como una composición de vacuna líquida antes de la
administración.
23. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 21, en la que el rotavirus reordenante y la
composición de antiácido están presentes en el mismo recipiente para
la formulación como una composición de vacunan liofilizada a
reconstituir con una solución acuosa antes de la administración.
24. Un procedimiento de fabricación de una
vacuna de rotavirus que comprende mezclar un rotavirus reordenante
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con un
antiácido y un agente viscoso.
25. Un procedimiento para fabricar una vacuna de
rotavirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23
que comprende mezclar un rotavirus reordenante con un vehiculo o
adyuvante farmacéutico adecuado.
26. Uso de un rotavirus reordenante en la
preparación de una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 23 para la prevención de la infección por
rotavirus en un sujeto humano.
27. Una formulación de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 23 para uso en medicina.
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