ES2339618T3 - Anticuerpos monoclonales humanizados que protegen contra la enfermedad inducida por la toxina shiga. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 1 (Stxl) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2), en donde el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44.
Description
Anticuerpos monoclonales humanizados que
protegen contra la enfermedad inducida por la toxina shiga.
Los solicitantes describen una familia de
proteínas bacterianas de unidades múltiples que se asocian con la
colitis hemorrágica y la secuela que amenaza la vida, síndrome
urémico hemolítico. Estas proteínas, definidas como miembros de la
"familia de toxina Shiga", se han utilizado en el aislamiento e
identificación de anticuerpos monoclonales de murino. Los
solicitantes describen además, la construcción de anticuerpos
monoclonales humanizados que incorporan las regiones variables de
ratón. Los solicitantes también describen anticuerpos para toxinas
Shiga o toxoides, tanto monoclonales como policlonales, y su uso en
el tratamiento, diagnóstico, y prevención de la enfermedad y de las
infecciones provocadas por E. coli patogénico. Se describe la
preparación de anticuerpos monoclonales humanizados para proteínas
de la familia de toxina Shiga.
Se asocian Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en inglés) con brotes
transmitidos por alimentos con diarrea con sangre o "colitis
hemorrágica" (HC, por sus siglas en inglés) y el síndrome urémico
hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés). (Spika, J. y col., J.
Pediatr., 109:287-297 (1986); Remis, R. Ann.
Intern. Med., 101:624-626 (1984); Riley, L. y col.,
N. Engl. J. Med., 308:681-685 (1983)). La infección
EHEC puede ser mortal y posee una amenaza importante para los
jóvenes y los ancianos, quienes son los que más probabilidad tienen
de desarrollar serias complicaciones de infecciones EHEC. Diversos
brotes y casos esporádicos de HC y HUS han ocurrido durante los
últimos años, con el brote más grande de E.U.A. en 1993. En tal
brote, más de 500 casos de HC y HUS se localizaron en hamburguesas
contaminadas de una caja sorpresa de un restaurante de comida
rápida. (Centers for Disease Control and Prevention, Morbid.
Mortal Weekly Rep., 42:258 (1993)). En julio de 1996, un brote
más grande de EHEC en Japón resultó en más de 10,000 individuos
infectados y 8 muertes. Muchos niños japoneses requirieron
hospitalización.
Primordialmente, HC y HUS se transmiten por la
ingestión de comida contaminada, particularmente productos de carne
de vacuno no totalmente cocinada, tal como hamburguesas. (Doyle y
col., J. Appl. Environ. Microbiol. 53:2394 (1987); Samadpour y
col., J. App. Environ. Microbiol. 60: 1038 (1994)). Con la
prevalencia de EHEC en ganado y la naturaleza subjetiva de
diferenciar entre hamburguesas parcial y totalmente cocinadas, una
parada en un restaurante de comida rápida o una parrillada familiar
puede resultar en tragedia.
HC y HUS parecen estar mediados por la toxina
producida por EHEC y Shigella dysenteriae (para una
revisión, ver, O'Brien and Holmes, Microbiol. Rev.,
51:206-220 (1987)). Estas bacterias producen una
familia de citotoxinas estrechamente relacionadas que
colectivamente se llamarán "toxinas Shiga" para el propósito de
esta solicitud. Las toxinas Shiga (alternativamente,
"verotoxinas") tienen actividad citotóxica, y enterotóxica
(Strockbine, N. y col., Infect. Immun., 53:
135-140 (1986)).
Con base en la exhibición de la reactividad no
cruzada inmunológica, las toxinas Shiga se han dividido en dos
grupos. (Strockbine y col., supra). Estos grupos se han
designado toxina Shiga tipo 1 (Stx1, por sus siglas en inglés) y
toxina Shiga tipo 2 (Stx2, por sus siglas en inglés). El grupo Stx1
contiene la toxina Stx1 de prototipo de EHEC así como la toxina
Shiga de Shigella dysenteriae tipo 1. En años recientes,
otros tipos de toxinas se han descubierto y considerado ser
miembros del grupo Stx2. Estas son Stx2e, Stx2c, y Stx2d. (Lindgren
y col., Infection and Immunology, 61:3832 (1993); Schmitt, C.
y col., Infect. Immun., 59: 1065-1073 (1991);
Marques, L. y col., FEMS Lett., 44: 33-38
(1987)).
Para los propósitos de esta solicitud el término
"toxina Shiga" abarca toxina Shiga y cualquiera de las demás
toxinas en el grupo Stx1 o Stx2 o sus variantes. La abreviatura
"Stx" se referirá a la proteína de toxina por sí misma.
A pesar de este conocimiento sobre los
resultados de la exposición a estas toxinas, actualmente no existe
cura o vacuna conocida para HC o HUS. Los antibióticos incluso hacer
que las complicaciones severas empeoren al incrementar la toxina
liberada de las bacterias. De esta manera, existe una necesidad de
un compuesto para prevenir o tratar las complicaciones de EHEC
producidas por la toxina Shiga. Tal compuesto puede usarse para
tratar pacientes infectados y disminuir los efectos sistémicos de la
toxina en el SNC, sangre y riñones. Además, si la toxina puede
neutralizarse, los antibióticos pueden administrarse de manera
segura para exterminar las bacterias en el tracto GI. Tal compuesto
también puede ser utilizado para prevenir complicaciones
infecciosas, al tratar individuos que están expuestos o con alto
riesgo, antes de que adquieran la infección EHEC. Tales individuos
deben incluir niños en guardería o ancianos en asilos para ancianos,
en los que se ha detectado un caso de diarrea EHEC. Estos
individuos tienen mayor riesgo de desarrollar diversas
complicaciones y la propagación de EHEC en estos ambientes no es
inusual.
El conocimiento de la reactividad cruzada
inmunológica de las toxinas Shiga ofrece una perspectiva tentadora
para enfoques farmacológicos del tratamiento de EHEC. Actualmente,
no existen agentes profilácticos o terapéuticos conocidos
disponibles para esta enfermedad. En consecuencia, existe una
necesidad en la técnica de proporcionar anticuerpos monoclonales
que puedan enlazar a las toxinas Shiga que sean capaces de prevenir
o disminuir los efectos devastadores de estas toxinas. También
existe en la técnica una necesidad de datos acerca del sitio de
enlace de tales anticuerpos, de manera que otros anticuerpos con
capacidades similares puedan ser identificados y
aislados.
aislados.
Los anticuerpos monoclonales contra las toxinas
tipo Shiga se han descrito en Strockbine y col., Infection and
Immunity, 1985, 50: 695-7010 y en Perera, y
col., J. Clinical Microbiol., 1988, 26:
2127-2131. Strockbine et al describe que el
uso del anticuerpo 13C4 neutraliza la letalidad para ratones
inducida con toxina tipo Shiga de E. coli H30. Strockbine y
col., además muestra el uso del 13C4 para la detección de colonias
bacterianas que producen altos niveles de toxinas tipo Shiga.
Perera y col., describen la producción de cinco anticuerpos
monoclonales de ratón (incluyendo el anticuerpo 11E10) que son
capaces de neutralizar la citotoxicidad de la toxina II tipo Shiga.
WO9820903, publicada el 22 de mayo de 1998 describe métodos
terapéuticos para el tratamiento del síndrome urémico hemolítico,
al administrar de anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales
quiméricos y anticuerpos policlonales monoespecíficos específicos
para toxina tipo Shiga.
Existe una necesidad relacionada en la técnica
de anticuerpos monoclonales de humano/ratón humanizados y otros
quiméricos. En estudios bien publicados, los pacientes a los que se
han administrado anticuerpos monoclonales anti-TNF
de murino (factor de necrosis del tumor) desarrollan respuestas de
anticuerpo anti-murino al anticuerpo administrado.
(Ver, por ejemplo, Exley A. R., y col., Lancet 335:
1275-1277 (1990)). Este tipo de respuesta inmune
para el régimen de tratamiento, comúnmente referido como la
respuesta HAMA (para anticuerpos anti-ratón
humanos), disminuye la efectividad del tratamiento y puede incluso
hacer que el tratamiento sea completamente ineficaz. Los
anticuerpos monoclonales de humano/ratón humanizados o quiméricos
han demostrado disminuir significativamente la respuesta HAMA e
incrementar la efectividad terapéutica. (LoBuglio et art., P.N.A.S.
86: 4220-4224 (Junio de 1989)). Los métodos para los
anticuerpos humanizados comprenden el intercambio de regiones
constantes (ver por ejemplo Lobuglio et al, supra) o
injerto CDR (EP0239400).
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo
1 (Stx1) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a
la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2), en la que el primer
anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana
y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de
inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en
la que el segundo anticuerpo comprende una región constante de
inmunoglobulina humana y las regiones variables de cadena ligera y
cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID
NOs: 42 y 44.
La presente invención se refiere además a una
composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en la que la
región variable del segundo anticuerpo comprende la región variable
del anticuerpo 11E10 de murino con No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y
la región variable del primer anticuerpo comprende la región
variable del anticuerpo 13C4 de murino con No. de Acceso al ATCC CKL
1794.
En modalidades particulares de las composiciones
farmacéuticas descritas arriba, el primero o segundo anticuerpo
comprende una región constante humana seleccionada del grupo
constituido por IgG, IgA, e IgM.
En otras modalidades particulares de las
composiciones farmacéuticas descritas arriba, la región constante
humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG.
Aún en otras modalidades particulares de las
composiciones farmacéuticas descritas arriba, la región constante
humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es
IgGI-kappa.
Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas
descritas arriba, comprenden además un portador o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere además al uso
de una composición que comprende de un primer anticuerpo monoclonal
humanizado, que enlaza a la proteína Stx1 y un segundo anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza a la proteína Stx2, en la que el
primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina
humana y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de
inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en
la que el segundo anticuerpo comprende una región constante de
inmunoglobulina humana y las regiones variables de cadena ligera y
cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID
NOs: 42 y 42 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o prevención de una infección que resulta en síndrome
de uremia hemolítica provocado por Escherichia coli
Enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina
Shiga.
La presente invención también se refiere al uso
de una composición que comprende un primer anticuerpo monoclonal
humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal
humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en la que la región
variable del segundo anticuerpo comprende la región variable del
anticuerpo 11E10 de murino con el No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y
la región variable del primer anticuerpo comprende la región
variable del anticuerpo 13C4 de murino con el No. de Acceso al ATCC
CKL 1794 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o
prevención de una infección que resulta en síndrome de uremia
hemolítico provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u
otras bacterias que producen la toxina Shiga.
En modalidades particulares el primero o segundo
anticuerpo comprende una región constante humana seleccionada del
grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.
En otras modalidades particulares la región
constante humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG,
preferiblemente IgGI-kappa.
Para satisfacer estas necesidades en la técnica,
los solicitantes proporcionan anticuerpos monoclonales de ratón
humanizados para toxina 1 Shiga y toxina 2 Shiga, y además indican
la región variable asociada a la neutralización de la toxina Shiga,
así como las regiones que determinan la complementariedad específica
(CDRs, por sus siglas en inglés) de los anticuerpos monoclonales
humanos de región variable, derivados de los anticuerpos
monoclonales de ratón 13C4 y 11E10, los cuales son específicamente
reactivos con Stx1 y Stx2, respectivamente.
Los dibujos acompañantes se incluyen para
proporcionar un mejor entendimiento de la invención. Ilustran la
invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los
principios de la invención.
Algunas de las siguientes modalidades han sido
incluidas únicamente para que sirvan de referencia solamente y no
caen bajo el alcance de las reivindicaciones.
La figura 1 proporciona una representación
esquemática de la estrategia de clonación general que se utiliza
para clonar los fragmentos del gen de región variable, tanto de los
anticuerpos 11E10 como 13C4.
La figura 2 enlista las secuencias de
oligonucleótidos usadas para la amplificación PCR de las regiones
variables del anticuerpo 13C4.
La figura 3 menciona las secuencias de consenso
de ADN y aminoácidos para las regiones variables, tanto de las
cadenas pesadas como de las ligeras del anticuerpo 13C4. La
secuencia de consenso de ADN se determinó usando reacciones de
secuencia terminadora de pigmento fluorescente automatizadas de los
cADN amplificados analizados, con un instrumento procesado por
secuencia ABI 373. Los CDR se identificaron de acuerdo a la
nomenclatura de Kabat y Wu (Kabat, y col. (1991), Sequences of
Proteins of Immunological Interest, Vol. I, 5ª edición, U.S.
Department of Health and Human Services) y se ubican como sigue:
La figura 4 ilustra la estrategia para la
construcción del vector de expresión mamífero tKMC249A que contiene
las regiones variables del anticuerpo 13C4.
La figura 5 enlista los oligonucleótidos
utilizados para la amplificación PCR de las regiones variables del
anticuerpo 11E10.
La figura 6 menciona las secuencias de consenso
de ADN y aminoácidos para las regiones variables, tanto de las
cadenas pesadas como de las ligeras del anticuerpo 11E10. La
secuencia de consenso de ADN se determinó usando reacciones de
secuencia terminadoras de pigmento fluorescentes de los cADN
amplificados, analizados con un instrumento procesado por secuencia
ABI 373. Los CDR se identificaron de acuerdo con la nomenclatura de
Kabat y Wu (Kabat y Wu; supra) y se ubican como sigue:
La figura 7 ilustra la estrategia para la
construcción del vector de expresión mamífero pACE4 que contiene las
regiones variables del anticuerpo 11E10.
La figura 8 muestra la producción ELISA del
anticuerpo 13C4 anti-Stx1 y demuestra que la línea
célula H13C4 produce un anticuerpo que consiste de dominios
constantes IgG y kappa humanos.
La figura 9 muestra la actividad ELISA de enlace
de toxina 13C4 anti-Stx1 y demuestra que el
anticuerpo producido por la línea celular H13C4 enlaza a la toxina
Stx1.
La figura 10 muestra la producción ELISA del
anticuerpo 11E10 anti-Stx2 y demuestra que la línea
celular H11E10 produce un anticuerpo que consiste de dominios
constantes IgG y kappa humanos.
La figura 11 muestra la actividad ELISA de
enlace de toxina 11E10 anti-Stx2 y demuestra que el
anticuerpo producido por la línea celular H11E10 enlaza a la toxina
Stx2.
La figura 12 ilustra la estrategia para la
construcción del pCDNA3mut.LCPL.LCVK plásmido.
La figura 13 ilustra la estrategia para la
construcción del pCDNA3mut.HCPL.HCV2B plásmido.
La figura 14 ilustra la estrategia para la
construcción de los pSUN9 y pSUN9:kappa plásmidos.
La figura 15 ilustra la estrategia para la
construcción de los PSUN10 y pSUN10:IgG1 plásmidos.
La figura 16 ilustra la estrategia para la
construcción del pJRS311 plásmido.
La figura 17 ilustra la estrategia para la
construcción del pJRS315 plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los solicitantes describen anticuerpos
monoclonales humanizados que enlazan a las proteínas de toxina
Shiga, y el uso de tales anticuerpos en el tratamiento o prevención
de enfermedades inducidas por toxina Shiga. Los anticuerpos son
estructuras proteínicas hechas de dos cadenas pesadas y dos ligeras.
Las cinco clases diferentes de anticuerpos de vertebrado superiores
IgM, IgD, IgG, IgA e IgE se distinguen por sus cadenas pesadas (mu,
delta, gamma, alfa y épsilon, respectivamente). Cada clase tiene
subclases adicionales; IgG, por ejemplo, pueden ser IgG1, IgG2,
IgG3 o IgG4, en las que la cadena pesada es gamma 1, gamma 2, gamma
3 o gamma 4, respectivamente. El par de cadenas ligeras en estas
clases o subclases pueden ser ya sea kappa o lambda.
Los anticuerpos se dividen además en una región
constante y una región variable. Para las cadenas pesadas así como
para las ligeras, los extremos de terminal carboxi hacen la región
de secuencia constante, mientras que los extremos de terminal amino
contienen la región de secuencia variable. Dentro de estas regiones
variables se encuentran las regiones complementarias determinantes
(CDRs) que son primariamente responsables del enlace del antígeno
observado, característico de los anticuerpos.
Anticuerpos monoclonales "humanizados"
significa anticuerpos monoclonales originalmente de una fuente no
humana a la que se han sustituido los componentes. En particular,
los anticuerpos monoclonales humanizados comprenden regiones
variables que se derivan de fuentes no humanas y regiones constantes
que se derivan de fuente humanas.
Como se establece arriba, las proteínas de
toxina Shiga (Stx) se refieren a la familia de proteínas bacterianas
de unidades múltiples producidas por EHEC y Shigella
dysenteriae que se asocian con brotes de enfermedades inducidas
por toxina Shiga. Las proteínas de toxinas Shiga son supuestas
abarcar Stx de Shigella dysenteriae tipo 1 y Stx tipo 1 y
tipo 2, y toxinas variantes tipo 2 de E. coli.
Las enfermedades inducidas por la toxina Shiga
de los humanos incluyen diarrea con sangre, colitis hemorrágica,
síndrome urémico hemolítico, y púrpura trombocitopénico
trombótico.
Los solicitantes describen además anticuerpos
monoclonales humanizados que tienen la misma especificidad de
enlace que al menos dos anticuerpos monoclonales murinos bien
caracterizados. Estos dos anticuerpos monoclonales se desarrollaron
en el laboratorio del Dr. Alison O'Brien como se establecen en
Strockbien, N. A. y col., Infection and Immunity, 1985, 50:
695-700 y Perera, L. P. y col., J. Clinical
Microbiol., 1988, 26: 2127-2131, han sido
depositados en el ATCC como se establece a continuación.
Por "misma especificidad de enlace" se
entiende un nivel de enlace suficientemente detectable en un ensayo
de enlace estándar para distinguir entre el enlace de toxina y el
enlace de respaldo no específico, como se ejemplifica mediante los
controles apropiados (por ejemplo, ver Figura 9 y Figura 11).
Aquellos con experiencia ordinaria en la técnica ya pueden probar
fácilmente los niveles de enlace utilizando habilidades y técnicas
de rutina.
En otra modalidad preferida, los anticuerpos
humanizados se caracterizan por sus características estructurales.
En un aspecto de esta modalidad, la región constante es una región
constante humana y la región variable se deriva de un roedor,
preferiblemente un ratón. Aunque no se limite a estas, las cuatro
regiones variables establecidas en la especificación,
particularmente en la Figura 3 y Figura 6, son preferidas. Por
supuesto, tales regiones variables pueden incluir modificaciones
(esto es, eliminaciones, adiciones, y sustituciones) que no
disminuyen apreciablemente el enlace característico asociado con las
regiones variables ejemplificadas.
Aún en otra modalidad, se emplean los CDR de la
región variable. Como se anota arriba, los CDR se ubican en las
regiones variables tanto de las cadenas ligeras como de las pesadas
y son responsables del enlace del antígeno. En vista de la
capacidad disponible de aquellos en esta técnica para determinar las
regiones CDR, la presente descripción no se limita a los CDR
específicamente establecidos. Ciertamente, los vectores creados por
los solicitantes y descritos en mayor detalle a continuación son
suficientes para uso con cualquiera de los CDR de anticuerpos no
humanos, para las toxinas Shiga.
Por ejemplo el anticuerpo monoclonal humanizado
deriva sus regiones constantes de IgGI-kappa y sus
regiones variables de todas o parte de las secuencias, como se
establecen en las Figuras 3 y 6. Los vectores de expresión que se
codifican para estos anticuerpos humanizados monoclonales, y las
células hospederas que se han transformado con tales vectores de
expresión, se describen en los Ejemplos. Finalmente, la invención
comprende composiciones farmacéuticas, como se reivindican y
describen en el "Sumario de la invención". Estas composiciones
farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes y
portadores conocidos en la técnica, tales como soluciones salinas y
de sacarosa apropiadas para la aplicación a pacientes. Como se usa
en la presente, "pacientes" se refiere a cualquier mamífero
sensible, tal como perros, caballos, ratones, etc., pero se prefiere
particularmente a humanos.
Los métodos de tratamiento implican la
administración de una cantidad terapéuticamente efectiva, así como
una cantidad profilácticamente efectiva, del anticuerpo monoclonal
humanizado. Como aquellos en la técnica reconocerían que, una
cantidad terapéuticamente efectiva es una dosis que alivia el edema,
trombocitopenia, y uremia asociado con HUS mediado por EHEC. De
manera similar, una cantidad profilácticamente efectiva es una
dosis que previene a los individuos expuestos de desarrollar estos
síntomas.
Los siguientes ejemplos ilustran modalidades
específicas de la invención. Algunos de estos se han incluido
únicamente a modo de referencia y no caen bajo el alcance de las
reivindicaciones.
Los siguientes ejemplos 1-3 se
refieren al anticuerpo 13C4 anti-Stx1 y su
contraparte H13C4 humanizada.
La célula de hibridoma que produce el anticuerpo
"13C4" (anti-Stx1) se depositó el 2 de
diciembre de 1987, en el American Type Culture Collection,
Rockville, MD bajo el No. de Acceso CRL 1794, y puede ser obtenido
del ATCC, o, como aquí, del Dr. Alison O'Brien (por ejemplo de la
preparación de hibridoma, ver Strockbine, N. A. y col.,
Infection and Immunity, 50: 695-700 (1985)).
Un vial de células se descongeló y se volvió a suspender en medio
completo IMDM (Mediatech) complementado con FBS al 10% (Irvine).
El ARN total se aisló de 1x10^{7} células
"13C4" usando el kit de aislamiento de ARN Midi (Qiagen),
siguiendo el procedimiento del fabricante. El ARN se disolvió en
Tris 10 mM, EDTA 0.1 mM (pH 8.4) que contiene 0.03 U/\mug de
inhibidor de RNasa cebado (5'-3') a una
concentración final de 0.25 \mug/\mul.
La figura 1 muestra la estrategia para clonar
los fragmentos del gen de región variable y la figura 2 enlista los
cebadores de oligonucleótido usados. El ARN total "13C4" (2
\mug) se convirtió a cADN al usar transcriptasa inversa
superscript 11-MMLV (Life Technologies) y kappa de
ratón (oKA57, SEQ ID NO: 57) y cebadura específica CH1 de ratón
(JS300, SEQ ID NO:6), de acuerdo con los procedimientos del
fabricante. Los primeros productos de la síntesis de cADN de hebra
se purificaron más adelante, utilizando un dispositivo concentrador
de membrana (Amicon Centricon 30 o Millipore UltraFree 15). Del
cADN recuperado, 3 \mul se usó como ADN de plantilla para PCR.
Las reacciones de amplificación PCR típicas (100 \mul) que
contienen ADN de plantilla, 50 pmoles de los cebadores apropiados
(JSS9, JSS10, JSS11, JSS12, JS153 y JSS154-SEQ ID
NO: 9-12 para cadenas ligeras; JSS1, JSS2, JSS3,
JSS4, JSS8 y Aka-143SEQ ID NO: 1-5 y
SEQ ID NO: 15 para cadenas pesadas), 2.5 unidades de polimerasa
ExTaq (PanVera), solución amortiguadora de reacción 1x ExTaq, dNTP
200 \muM, y MgCl_{2} 2 mM. Cada una de las plantillas se
desnaturalizó por una incubación inicial a 96ºC durante 1 min. Los
productos de cadena pesada se amplificaron por 40 ó 50 ciclos
térmicos de 59 hasta 72ºC durante 30 seg, 72ºC durante 30 seg,
luego 96ºC durante 1 min. y una etapa de extensión final a 72ºC
durante 5 min. Los productos de cadena ligera se amplificaron por 6
ciclos térmicos de 46, 48 o 54ºC durante 30 seg, 72ºC durante 30
seg, luego 96ºC durante 1 min, seguido por 35 ciclos de etapa de
60ºC durante 1 min, luego 96ºC durante 1 min. y una etapa de
extensión final a 72ºC durante 5 min. Los productos PCR de las
reacciones exitosas se purificaron utilizando el sistema de
purificación PCR Wizard (Promega) de acuerdo con el procedimiento
del fabricante.
Los productos PCR de cadena ligera y cadena
pesada (aproximadamente 400 pb) se clonaron después en un vector
bacteriano para la determinación de la secuencia de ADN. Las
ligaduras de los fragmentos PCR se llevaron a cabo en el vector
clonado estilo T/A pCR2.1 (Invitrogen), siguiendo los procedimientos
del fabricante y utilizando 1:1, 3:1 y 5:1 relaciones molares de
inserto a vector. Una mitad de cada una de las reacciones de
ligadura se usó para transformar células Blue XL1 competentes.
Los clones de plásmido de cadena pesada que
contienen insertos de ADN se identificaron usando digestiones de
enzima de restricción de diagnóstico con EcoRI (New England
Biolabs). Entonces se determinaron las secuencias de ADN de
plásmidos (tKMC217B) que contienen insertos del tamaño apropiado
(400 pb). La secuencia de ADN de consenso final de las regiones
variables de cadena pesada se muestra en la figura 3.
Los productos PCR de cadena ligera se
identificaron diferentemente. La línea celular de hibridoma que
expresa el anticuerpo "13C4" se hizo al fusionar esplenocitos
de ratón con la línea celular de mieloma SP2/0. La línea celular
SP2/0 transcribe un pseudogen para la cadena ligera kappa. El
transcripto de pseudogen, cuando se convierte a cADN por
RT-PCR, contiene un sitio de restricción AflIII. Los
clones candidatos de cadena ligera (tKMC226 y 227) se digirieron
con AflIII (New England Biolabs), utilizando los procedimientos del
fabricante para identificar clones que contienen insertos del
tamaño apropiado (403 pb; el sitio AflIII no está presente en estos
productos). La secuencia de ADN de consenso final de las regiones
variables de cadena ligera se muestra en la figura 3 con los CDR
subrayados.
Las regiones variables de cadena ligera y pesada
se subclonaron a continuación en vectores de plásmido de expresión
mamíferos para la producción de moléculas de anticuerpo de
ratón/humanas quiméricas recombinantes. Los vectores tienen por
resultado la producción de moléculas de anticuerpo recombinante bajo
el control de promotores transcripcionales CMV. Las moléculas de
cadena pesada son constructos de cADN directos que fusionan la
secuencia de región variable directamente en el dominio constante
IgG1 humano. Las moléculas de cadena ligera, por otra parte, tienen
una región 3' de intrón kappa de ratón del fragmento que codifica la
región variable. Después del empalme, la región variable vuelve a
fusionarse a un exón de región constante kappa humano (Figura 4).
El marcador seleccionable para el vector en células mamíferas es
fosfotransferasa de aminoglicósido (neo), usando el fármaco G418
(CellTech).
Para crear los vectores de expresión de cadena
ligera y pesada se requieren ligaduras del fragmento de ADN y
etapas de mutagénesis dirigidas al sitio. El resultado fue vectores
que expresan ambas cadenas de anticuerpo con transcripción
conducida por el promotor CMV. La resistencia de neomicina sirve
como marcador seleccionable dominante para la transfección de
células mamíferas. Además, estos vectores se han diseñado para
permitir la clonación conveniente de cualquier región variable de
cadena ligera como fragmento EcoRV/BstBI, cualquier región variable
de cadena pesada como un fragmento NruI/EcoRI, y cualquier dominio
constante de cadena pesada como un fragmento EcoRI/NotI. Estos
sitios de restricción se eligieron debido a que raramente ocurren
(si acaso algunas veces) en regiones variables de humano y ratón.
Existe un fragmento intrón de región/kappa J de ratón fusionado a
un exón kappa humano de manera que después del empalme
post-transcripcional se produce una cadena ligera
kappa quimérica humana de ratón. Finalmente, los vectores se
diseñaron para facilitar la escisión (BglII/NheI) de un casete de
expresión de anticuerpo completo de un vector para ligarse en un
segundo corte del vector con BamHI/NheI, creando un vector de
expresión con el aparato para ambas cadenas.
La estructura del vector fue el pCDNA3 plásmido
(Invitrogen). Este plásmido se cortó con HindIII/XhoI y un
fragmento de ADN de "poliligadura de cadena ligera" se insertó
para crear el pCDNA3.LCPL de "vector de cadena ligera" inicial
(ver figura 12). Esta ligadura contiene los sitios de restricción
HindIII, KpnI, CalI, PmlI, EcoRV, XmaI, BamHI y XhoI para facilitar
las etapas de clonación posteriores. Un fragmento de ADN SmaII/BcII
que contiene un líder de cadena ligera, fragmento genómico de cadena
ligera kappa anti-CKMB de ratón, y 3'UTR se clonó en
los sitios EcoRV/BamHI de pCDNA3.LCPL. El intrón kappa de ratón,
exón, y 3'UTR en este fragmento se derivó de LCPXK2, recibido del
Dr. Richard Near (Near, R. I. y col., 1990, Mol. Immunol.
27: 901-909). Después se realizó la mutagénesis
para eliminar un sitio NruI (209), MluI (229), y BstBI (2962) y para
introducir un NheI (1229) y un BamHI (1214) para crear el
pCDNA3.mut.LCPL.LCVK plásmido (ver figura 12).
Un segundo pCDNA3mut.HCPL de "vector de cadena
pesada" se construyó a partir del plásmido
pCDNA3mut.
LCPL.LCVK, al reemplazar la región de expresión de cadena ligera (HindIII/XhoI) por una "poliligadura de cadena pesada" que consiste de sitios de restricción HpaI, BspEI, EcoRV, KpnI, y XhoI. Este plásmido se digirió con EcorRV y KpnI. Un fragmento de ADN digerido SmaI/KpnI que contiene un líder de cadena pesada y un fragmento genómico de cadena pesada de ratón IgG2b anti-CKMB se ligó entonces en el plásmido digerido EcoRV/KpnI. Un fragmento de oligonucleótido KpnI/SalI que contiene una dirección ascendente 3'UTR y una NotI del sitio SalI se clonó posteriormente en el plásmido digerido KpnI/XhoI, (con genes inactivados del sitio XhoI), para crear el pCDNA3mut.HCPL.HCV2b plásmido (ver figura 13).
LCPL.LCVK, al reemplazar la región de expresión de cadena ligera (HindIII/XhoI) por una "poliligadura de cadena pesada" que consiste de sitios de restricción HpaI, BspEI, EcoRV, KpnI, y XhoI. Este plásmido se digirió con EcorRV y KpnI. Un fragmento de ADN digerido SmaI/KpnI que contiene un líder de cadena pesada y un fragmento genómico de cadena pesada de ratón IgG2b anti-CKMB se ligó entonces en el plásmido digerido EcoRV/KpnI. Un fragmento de oligonucleótido KpnI/SalI que contiene una dirección ascendente 3'UTR y una NotI del sitio SalI se clonó posteriormente en el plásmido digerido KpnI/XhoI, (con genes inactivados del sitio XhoI), para crear el pCDNA3mut.HCPL.HCV2b plásmido (ver figura 13).
Un dominio constante de cadena ligera kappa
humano se clonó entonces en pCDNA3mut.LCPL. LCVK como un fragmento
EcoNI/XhoI que genera el tKMC 180C2 plásmido. Un dominio constante
IgG1 humano se clonó en PSLTN 10 como un fragmento EcoRI/NotI,
creando el pJRS313 plásmido. Las regiones variables de 13C4 se
clonaron en estos dos vectores (como se describe arriba). Un
fragmento BglII/NheI del vector de cadena pesada humano tKMC229C se
clonó después en el BamHI/NheI de corte del vector de cadena ligera
humano tKMC231D para crear tKMC249A (ver figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos del gen de región variable se
volvieron a amplificar por PCR utilizando cebadores que adaptan los
fragmentos para la clonación en los vectores de expresión (ver
figura 2 y 4). El cebador frontal de cadena pesada (oKA143, SEQ ID
NO: 15) incluye una cola 5' que codifica la terminal C del líder de
cadena pesada y un sitio de restricción NruI para la clonación,
mientras que el cebador inverso de cadena pesada (oKA144, SEQ ID
NO: 14) agrega un sitio de restricción 3' EcoRI para la clonación.
El cebador frontal de cadena ligera (oKA145, SEQ ID NO: 16)
introduce un sitio de restricción EcoRV en la terminal N de la
región variable de cadena ligera para la clonación, mientras que el
cebador inverso de cadena ligera (oKA146, SEQ ID NO: 17) agrega una
secuencia de ADN 3' para la unión de empalme de exón kappa de región
unida seguida por un sitio de restricción BstBI para la
clonación.
Las reacciones PCR se realizaron con reactivos,
como se describen arriba y con plantillas de 1-2 ng
de plásmido digerido PvuI (New England Biolabs); cada una de estas
plantillas se desnaturalizó por una incubación inicial de un minuto
a 96ºC. Los productos de cadena pesada se amplificaron por 35 ciclos
térmicos de 55 ó 60ºC durante 30 seg, 72ºC durante 30 seg., luego
96ºC durante 1 min y una etapa de extensión final a 72ºC durante 5
min. Los productos de cadena ligera se amplificaron por 8 ciclos
térmicos de 55 ó 60ºC durante 30 seg, 72ºC durante 30 seg, luego
96ºC durante 1 min seguido por 30 ciclo9s de etapa de 60ºC durante 1
min, luego 96ºC durante 1 min, y una etapa de extensión final a
72ºC durante 5 min.
El producto PCR de cadena pesada 13C4
(aproximadamente 400 pb) se purificó utilizando columnas de
purificación PCR Qiaquick (Qiagen), como se describen en las
instrucciones del fabricante y posteriormente digeridas con NruI y
EcoRI (New England Biolabs). Los productos PCR digeridos se
purificaron utilizando el sistema de purificación PCR Wizard
(Promega) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se
ligaron en NruI/EcoRI digerido y pJRS313 purificado con gel,
resultando en tKMC229C plásmido (ver figura 4). La secuencia de ADN
de consenso final de la región variable de cadena pesada y el
empalme propio de los sitios de restricción se confirmaron en este
constructo.
El producto PCR de cadena ligera 13C4
(aproximadamente 350 pb) se purificó utilizando columnas de
purificación PCR Qiaquick (Qiagen), como se describe en las
instrucciones del fabricante y posteriormente se digirieron con
EcoRV y BstBI (New England Biolabs). Los productos PCR digeridos se
purificaron utilizando columnas de purificación PCR Qiaquick
(Qiagen) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se ligaron
en EcoRV/BstBI digerido y tKMC 180C2 purificado con gel (como se
describe arriba), resultando en tKMC231D plásmido (ver figura 4).
La secuencia de ADN de consenso final de la región variable de
cadena ligera y el empalme propio de los sitios de restricción se
confirmaron en este constructo.
\vskip1.000000\baselineskip
El tKMC249A plásmido se transfectó en células
NSO (Baxter International, Inc., Durante, CA) utilizando la
electroporación después de la linearización con PvuI (New England
Biolabs). Se mezclaron 40 microgramos del plásmido digerido con 1 x
107 células en un volumen total de 800 microlitros, en una cubeta de
0,4 centímetros y se sometieron a un pulso de 250 mA, 960 \muF.
Las células fueron retiradas de las placas después de 24 horas y
colocadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos, 6 placas
con 200 \muL/pozo, y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 10%.
Cuando las colonias aparecieron, se procesaron los sobrenadantes por
ensayo para la producción del anticuerpo "humanizado" y para la
capacidad del anticuerpo expresado de enlazar a Stx1.
La producción del anticuerpo y los ensayos de
actividad para los transfectantes estables se realizaron como se
describe a continuación. Estos ensayos demuestran que la
transfección de células con este constructo plásmido puede tener
como resultado la producción de una línea celular estable que
produce una versión quimérica humanizada del anticuerpo de
hibridoma de ratón 13C4 (designado H13C4).
Se realizaron ensayos ELISA de producción de
anticuerpo en tiras de 8 pocillos de placas de microtitulación de
96 pocillos (Maxisorp F8; Nunc, Inc.) cubiertas a una dilución 1:500
con anticuerpo IgG anti-humano de cabra (Pierce o
Biodesign International), utilizando una solución amortiguadora de
cubierta Tris-Hcl, pH 8.5. Las placas se cubrieron
e incubaron durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron entonces
una vez con una solución amortiguadora de almacenamiento
precipitada (Tris-HCl/NaCl/NaN_{3} al 0.1%). Se
aplicaron entonces 50 microlitros de sobrenadante de cultivo a cada
pocillo que se ha llenado previamente con 50 microlitros de un
diluyente de muestra/conjugado
(Tris-HCl/NaCl/Gelatina/Tween-20).
Se permitió la incubación de las placas durante 30 hasta 60 minutos
en un girador a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces con una
solución de lavado (imidazol/NaCl/Tween-20). Se
diluyó un conjugado kappa-HRP
anti-humano de cabra (Southern Biotechnologies)
1:250 en el diluyente de muestra/conjugado y se agregó 100
microlitros a los pocillos. Las placas se incubaron en un girador
durante 30 hasta 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron 6
veces utilizando la solución amortiguadora de lavado, y luego se
incubaron con 100 \muL/pozo de sustrato de desarrollo ABTS
(Kirkgaard & Perry Laboratories) durante 8 minutos a
temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 100 \muL/pozo de
solución amortiguadora Quench diluida (Kirkgaard & Perry
Laboratories). Se determinó el valor de absorbancia a 4005 nm
utilizando un lector ELISA de placa microtitulada automatizado
(Ceres UV9OOHI, Bioteck, Winooski, Vermont). Los controles para el
ensayo ELISA fueron una proteína de mieloma IgG1K humana (Biodesign
International) y el sobrenadante colectado de las células NSO no
transfectadas. Este ensayo (ver Figura 8) demuestra que la
transfección de células con este constructo de plásmido resulta en
células que producen una molécula que contiene dominios tanto de
cadena pesada humana (IgG) como de cadena ligera (kappa).
Los sobrenadantes se evaluaron entonces por la
capacidad de los anticuerpos expresados de unirse a la proteína
Stx1 por ELISA. Los ensayos de actividad se realizaron en tiras de 8
pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorp F8;
Nunc, Inc.) cubiertas con aproximadamente 0.1 \mug/pozo de Stx1
purificado recibido de Alison O'Brien (u obtenido como se describe
en el Ejemplo 7). El recubrimiento de la placa y el procedimiento
ELISA se realizaron de la misma manera que el ensayo de anticuerpo
de arriba con la sustitución de TMB (Kirkgaard & Perry
Laboratories) para ABTS como un sustrato de desarrollo. El valor de
absorbancia a 450 nm se determinó utilizando un lector ELISA de
placa de microtitulación automatizado (Ceres UV900HI, Bioteck,
Winooski, Vermont). Como un control positivo, se usó el anticuerpo
monoclonal de ratón original 13C4, y se evaluó con un conjugado IgG
anti-ratón de cabra (Jackson Laboratories) a una
dilución 1:200. Este ensayo (ver Figura 9) demuestra que la
transfección de células con este constructo de plásmido resulta en
células que producen inmunoglobulina que se enlaza a Stx1. Ni el
IgG I K de ratón ni el de humano que carecen de la región variable
anti-Stx se unieron a la toxina.
Los siguientes ejemplos 4-7 se
refieren al anticuerpo de variante Stx2 y anti-Stx2
11E10 y su contraparte humanizada H11E10.
La línea de célula de hibridoma que produce el
anticuerpo "11E10" (Anti-Stx2) se depositó el 1
de agosto de 1990, en la American Type Culture Collection,
Rockville, MD bajo el No. de Acceso CRL 1907, y puede obtenerse de
la ATCC, o, como aquí, del Dr. Alison O'Brien (para detalles de la
preparación de hibridoma, ver Perera, L. P. y col., J. Clinical
Microbiol., 26: 2127-2131 (1988). Un vial de la
línea de célula se descongeló, lavó con medio libre de suero y
luego se volvió a suspender en medio completo IMDM (Mediatech)
complementado con FBS al 10% (Irvine).
Se aisló el ARN total de 1x10^{7} células
"11E10" usando el kit de aislado de ARN RNeasy (Qiagen),
siguiendo el procedimiento del fabricante. Se disolvió el ARN en
Tris 10 mM, EDTA 0.1 mM (pH 8.4) que contiene inhibidor de RNasa
Prime 0.03 U/\mug (5'-3') hasta una concentración
final de 0.63 \mug/\mul.
La Figura 1 muestra la estrategia para clonar
los fragmentos de gen de región variable y la Figura 5 enlista los
cebadores de oligonucleótido usados. El ARN total de "11E10"
(2.5 \mug) se convirtió al cADN utilizando Transcriptasa Inversa
11-MMLV Superscript (Life technologies) de acuerdo
con los procedimientos del fabricante. La cadena ligera de ratón
(JS153, JS154, SEQ ID NO: 11 y 12) y cadena pesada de ratón (JS300,
SEQ ID NO: 6) se usaron como cebadores específicos. Los productos
de síntesis de cADN de primera hebra se purificaron entonces
utilizando un dispositivo concentrador Centricon-30
(Amicon). De los 70 \mul de cADN recuperados, se usó 3.5 \mul
como ADN de plantilla para PCR. Las reacciones de amplificación PCR
típicas (100 \mul) contenían el ADN de plantilla, 50 pmoles de
los cebadores apropiados (JS153, JS154 y JS009, JS010, JS011, JS012,
SEQ ID NO: 7-12 para las cadenas ligeras, JS160,
JS161, JS162 y JS001, JS002, JS003, JS004, JS008, SEQ ID NO:
28-30, SEQ ID NO: 2-5 para cadenas
pesadas), 2.5 unidades de polimerasa ExTaq (Pan Vera), solución
amortiguadora de reacción 1x Ex Taq, dNTP 200 \muM, y MgCl_{2} 2
mM. La plantilla se desnaturalizó mediante una incubación inicial
de cinco minutos a 96ºC. Los procedimientos se amplificaron por 35
ciclos térmicos de 96ºC durante 1 min., 55ºC durante 30 seg., y 72ºC
durante 30 seg., seguido por 5 min. a 72ºC. Los productos PCR de
las reacciones exitosas se purificaron utilizando el sistema de
Purificación Wizard PCR (Promega) según el procedimiento del
fabricante.
Los productos PCR de cadena pesada
(aproximadamente 400 pb) y los productos PCR de cadena ligera
(aproximadamente 350 pb) se clonaron entonces en un vector
bacteriano para determinar la secuencia de ADN. Las ligaduras de
los fragmentos PCR se llevaron a cabo en el vector de clonación
estilo pCR2.1 T/A (Invitrogen) siguiendo los procedimientos del
fabricante, utilizando un inserto de 3:1 a la relación molar de
vector. Se usaron 2 \mul de las reacciones de ligadura para
transformar las células competentes IV\alphaF' (Invitrogen) según
el procedimiento del fabricante. Los clones de plásmido que
contienen insertos de ADN se identificaron usando digestiones de
enzima de restricción de diagnóstico, con EcoRI (New England
Biolabs). Se determinó entonces la secuencia de ADN de los
plásmidos que contienen los insertos de cadena pesada del tamaño
apropiado (400 pb). La secuencia de ADN de consenso final de la
región variable de cadena pesada de 11E10 se muestra en la figura 6
con las CDR subrayadas.
Los clones de plásmido de cadena ligera
necesitaban ser caracterizados adicionalmente debido a que la línea
de célula de hibridoma que expresa el anticuerpo "11E10" se
hizo fusionando esplenocitos de ratón con células mieloma SP20. La
línea de célula SP20 transcribe un pseudogen para la cadena ligera
kappa. El transcripto de pseudogen, cuando se convierte a cADN por
RT-PCR, contiene un sitio de restricción AflIII. Por
esta razón, los clones de plásmido para la región variable de
cadena ligera se digirieron con AflIII y aquellos productos que no
cortan se sometieron entonces a procesado por secuencia de ADN. La
secuencia de consenso final de la región variable de cadena ligera
se muestra en la Figura 6, con los CDR subrayados.
Los fragmentos de genes de región variable se
volvieron a amplificar por PCR usando cebadores que adaptan los
fragmentos para clonación en el vector de expresión (ver Figuras 5 y
7). El cebador frontal de cadena pesada (11E10HF, SEQ ID NO: 37)
incluye una cola 5' que codifica la terminal C de la cadena pesada
líder y un sitio de restricción NruI para clonación, mientras que
el cebador inverso de cadena pesada (11E10HB, SEQ ID NO: 38) agrega
un sitio de restricción 3'EcoRI para clonación. El cebador frontal
de cadena ligera (11E10LF, SEQ ID NO: 39) incluye una cola 5' que
codifica la terminal C de la cadena ligera líder y un sitio de
restricción EcoRV en la terminal N de la región variable de cadena
ligera para clonación, mientras el cebador inverso de cadena ligera
(11E10LB, SEQ ID NO: 40) agrega una secuencia 3'ADN para la unión
del cruce de empalme de exón de región kappa, seguido por un sitio
de restricción BstBI para clonación. Se realizaron las PCR como se
describe arriba excepto que, después de una incubación de 5 min., a
96ºC, los parámetros PCR fueron 30 ciclos térmicos de 96ºC durante
1 min., 62ºC durante 30 segundos., y 70ºC durante 30 seg., seguido
por 5 min. a 72ºC.
El producto PCR de región variable de cadena
pesada se subclonó entonces en un vector plásmido de expresión de
mamífero (pJRS315, producido como se establece a continuación, en el
Ejemplo 5) para producción de moléculas de anticuerpo ratón/humano
quiméricas recombinantes. El clon del vector resultante se designó
pACE1. Antes de que la región variable de cadena ligera pudiera
subclonarse en el vector de expresión de mamífero, se subclonó en
el vector de clonación estilo pCR2.1 T/A previamente descrito. El
plásmido resultante se designó pACELC y se digirió, con
BstBI/EcoRV, para cortar la región variable de cadena ligera. La
región variable se subclonó entonces en el vector de
re-expresión de mamífero que contiene la región
variable de cadena pesada "11E10" (pACE1). El clon del vector
de expresión final se designó pACE4. Este vector resulta en la
producción de moléculas de anticuerpo recombinante bajo el control
de los promotores de transcripción CMV. Las moléculas de cadena
pesada son constructos de cADN directos que fusionan la secuencia de
región variable directamente en el dominio constante IgG1. Las
moléculas de cadena ligera, por otro lado, tienen una región 3' de
intrón kappa de ratón del fragmento de codificación de región
variable. Después del empalme, la región variable se fusiona a un
exón de región constante kappa humano (ver Figura 7). El marcador
seleccionable para el vector en células de mamífero es neomicina
(G418).
Para la producción de pACE1, el producto PCR de
cadena pesada "1E10" (aproximadamente 400 pb) se digirió con
NruI y EcoRI (New England Biolabs) purificado, utilizando una
columna de Purificación PCR Qiaquick (Qiagen), como lo describe el
fabricante, y se liga en NruI/EcoRI digerido y pJRS315 purificado
por gel, lo que resulta en PACTE1 plásmido (ver Figura 7). El
producto PCR de cadena ligera "11E10" (aproximadamente 350 pb)
se clonó en el vector de clonación T/A según las instrucciones del
fabricante. El clon resultante, pACELC, se digirió con EcoRV y
BstBI (New England Biolabs) y el fragmento de cadena ligera se
purificó mediante gel. Este fragmento se ligó entonces en el
EcoRV/BstBI digerido y pACE1 purificado con gel, lo que resulta en
el plásmido pACE4 (ver Figura 7). La secuencia de las regiones
variables de cadena pesada y ligera fue verificada antes de la
transfección de célula de mamífero.
El plásmido pJRS315 es el plásmido de expresión
en el que se clonaron las regiones variables del anticuerpo 11E10.
Este plásmido es un derivado de un vector de expresión básico,
plásmido pSUN15, que no contiene información de codificación de
región variable de anticuerpo, pJRS315 se creó usando ligaduras de
fragmento de ADN y etapas de mutagénesis dirigida al sitio. El
resultado fue un vector que expresa ambas cadenas de anticuerpo con
transcripción del conductor de promotor CMV (ver Figura 17). La
resistencia de neomicina sirve como marcador seleccionable
dominante para la transfección de células de mamífero. Además, se ha
diseñado para permitir la clonación conveniente de cualquier región
variable de cadena ligera como un fragmento EcoRV/BstBI, cualquier
región variable de cadena pesada como un fragmento NruI/EcoRI, y
cualquier dominio constante de cadena pesada como un fragmento
EcoRI/NotI. Estos sitios de restricción se eligieron debido a que se
presentan raramente (si se da el caso) en regiones variables de
humano y ratón. Este es un fragmento de intron de región J/kappa de
ratón, fusionado a un exón kappa humano de manera que después del
empalme posterior a la transcripción, se produce una cadena ligera
kappa quimérica de ratón/humano.
La columna del vector fue el plásmido pCDNA3
(Invitrogen). Este plásmido se cortó con HindIII/Xhol y se insertó
un fragmento de ADN "poliligador de cadena ligera" para crear
el "vector de cadena ligera" de inicio. Este ligador contiene
los sitios de restricción HindIII, KpnI, ClaI, PmlI, EcoRV, XamI,
BamHI y XhoI para facilitar las etapas de clonación posteriores,
con el fin de crear el plamido pCDNA3.LCPL. Se clonó un fragmento de
ADN SmaI/BclI que contiene un fragmento genómico de cadena ligera
kappa anti-CKMB, líder de cadena ligera, y 3'UTR en
los sitios EcoRV/BamHI de pCDNA3.LCPL. El intrón kappa de ratón,
exón y 3'UTR en este fragmento se derivó de LCPXK2 recibido del Dr.
Richard Near (Near, R.I. y col., Mol. Immunol.
27:901-909, (1990)). Se realizó entonces la
mutagénesis para eliminar un NruI (209), MluI (229), y BstBI (2962)
y para introducir un sitio NheI (1229) y un BamHI (1214) para crear
pcDNA3mut.LCP.LCVK (ver Figura 12).
Se construyó un segundo "vector de cadena
pesada" del plásmido pcDNA3mut.LCPL.LCVK al reemplazar la región
de expresión de cadena ligera (HindIII/XhoI) por un "poliligador
de cadena pesada" que consiste de los sitios de restricción
HpaI, BspEI, EcoRV, KpnI, y XhoI. Este plásmido se digirió con
EcorRV y KpnI. Un fragmento de ADN digerido SmaI/KpnI que contiene
un líder de cadena pesada y un fragmento genómico de cadena pesada
de ratón anti-CKMB IgG2b se ligó entonces en el
plásmido digerido EcoRV/KpnI. El fragmento de oligonucleótido
KpnI/SalI que contiene un 3'UTR y un NotI cadena arriba del sitio
SalI se clonó posteriormente en el plásmido digerido KpnI/XhoI (que
inactiva el sitio XhoI), para crear el plásmido pCDNA3mut.HCPL.HCV2b
(ver Figura 13).
Desde este punto, se crearon dos vectores que no
tienen ninguna de las secuencias variables anti-CKMB
o de ADN de dominio constante. Esto se dio al cortar el plásmido
pcDNA3mut.LCPL.LCVK con EcoRV/XhoI e insertar un fragmento de
oligonucleótido ligador que contiene sitios EcoRV, BstBI, y XhoI
para crear pSLJN9 (ver Figura 14). De manera similar, el fragmento
anti-CKMB en pCDNA3mut.HCPL.HCV2b (NruI/NotI) se
reemplazó por un fragmento de oligonucleótido ligador que contiene
sitios NruI, EcoRI y NotI para crear PSUN10 (ver Figura 15). Se
clonó entonces un dominio constante de cadena ligera kappa humano
en pSUN9 como un fragmento BstBI/XhoI, y se clonó un dominio
constante IgG1 humano en pSUN10 como un fragmento EcoRI/NotI.
El fragmento BglII/NheI del vector de cadena
pesada humano se clonó entonces en el vector de cadena ligera
humano, cortado con BamHI/NheI, para crear pSUN15 (ver Figura
16).
El plásmido pJRS315 se construyó entonces usando
pSUN15 a través del siguiente proceso. Una región variable de
cadena pesada de otra línea de célula de hibridoma, no relacionada
(aproximadamente 400 pb), se digirió con NruI y EcoRI (New England
Biolabs), se purificó utilizando una columna de purificación
Qiaquick PCR (Qiagen), según lo descrito por el fabricante, y
ligado en NruI/EcoRI digerido y pSUN15 purificado en gel, lo que da
por resultado el plásmido pJRS311 (ver Figura 16).
En este punto, un fragmento de ADN BstBI/NotI
(New England Biolabs) que contiene un fragmento de intron
kappa-J kappa de ratón fusionado a un fragmento
exón kappa humano se digirió y purificó en gel a partir del vector
tKMC180C2. Este fragmento se ligó en la columna del pJRS311 digerido
con BstBI/NotI y purificado en gel, lo que resulta en el plásmido
pJRS315 (ver Figura 17).
Se transfectó el plásmido pACE4 en células NSO
usando electroporación. Se linealizó el plásmido con digestión de
enzima de restricción PvuI. Se mezcló 40 \mug del ADN de plásmido
digerido con 70x10^{6} células en un volumen total de 400 \muL
y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante un
minuto. Se agregaron 10 \muL de DMSO (Sigma) hasta una
concentración final de 1.25%. La mezcla células/ADN/DMSO se
transfirió a una cubeta de 0,4 centímetros fría y se sometió a un
pulso de 250 voltios, 960 \muF. Las células se transfirieron a un
pocillo de una placa de seis pocillos que contiene 5 ml de medio no
selectivo complementado con DMSO (concentración final de 1.25%).
Después de 24 horas a 37ºC y CO_{2} al 10%, las células se
colocaron en placas de 96 pocillos. Cuando las colonias
aparecieron, los sobrenadantes fueron evaluados para la producción
de anticuerpo "humanizado" y para que el anticuerpo expresado
tenga la capacidad de unirse a la toxina Stx2.
La producción de anticuerpos y los ensayos de
actividad para los transfectantes estables se realizaron en tiras
de 8 pocillos de placas de 96 pocillos (Maxisorp F8; Nunc, Inc)
cubiertas con una dilución 1:500 de anticuerpo
anti-IgG
F(ab')_{2} anti-humano de cabra (Southern Biotechnology), usando una solución amortiguadora cubierta de bicarbonato, pH 8.5. Las placas se cubrieron con película sensible a la presión (Falcon, Becton Dickinson) e incuba durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron entonces una vez con solución de lavado (imidazol/NaCL/Tween-20 al 0.4%). Se aplicó entonces 100 \muL de sobrenadante de cultivo y se permitió la incubación durante 30 minutos en un girador de placa a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con una solución de lavado (imidazol/NaCl/Tween-20 al 0.4%). Se diluyó un conjugado kappa-HRP anti-humano de cabra (Southern Biotechnology) 1:800 en el diluyente muestra/conjugado y se agregó 100 \muL a las muestras, luego se incubó en el girador de placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron como arriba y luego se incubarón con 100 \muL por pocillo de sustrato de desarrollo ABTS (Kirkgaard & Perry Laboratories) y el valor de absorbancia a 405 nm, se determinó usando un lector de ELISA de placa de microtitulación automatizado (Ceres UV9OOHI, BioTek Instruments, Winooski, Vermont). Este ensayo (ver Figura 10) demuestra que la transfección de células con este constructo de plásmido tiene por resultado células que producen una molécula que contiene dominios tanto IgG como kappa humanos.
F(ab')_{2} anti-humano de cabra (Southern Biotechnology), usando una solución amortiguadora cubierta de bicarbonato, pH 8.5. Las placas se cubrieron con película sensible a la presión (Falcon, Becton Dickinson) e incuba durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron entonces una vez con solución de lavado (imidazol/NaCL/Tween-20 al 0.4%). Se aplicó entonces 100 \muL de sobrenadante de cultivo y se permitió la incubación durante 30 minutos en un girador de placa a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con una solución de lavado (imidazol/NaCl/Tween-20 al 0.4%). Se diluyó un conjugado kappa-HRP anti-humano de cabra (Southern Biotechnology) 1:800 en el diluyente muestra/conjugado y se agregó 100 \muL a las muestras, luego se incubó en el girador de placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron como arriba y luego se incubarón con 100 \muL por pocillo de sustrato de desarrollo ABTS (Kirkgaard & Perry Laboratories) y el valor de absorbancia a 405 nm, se determinó usando un lector de ELISA de placa de microtitulación automatizado (Ceres UV9OOHI, BioTek Instruments, Winooski, Vermont). Este ensayo (ver Figura 10) demuestra que la transfección de células con este constructo de plásmido tiene por resultado células que producen una molécula que contiene dominios tanto IgG como kappa humanos.
Los sobrenadantes se evaluaron entonces respecto
a la capacidad de los anticuerpos expresados para unirse a la
toxina EHEC Stx2. Se realizó el ensayo de actividad, como arriba,
usando placas cubiertas en 1 \mug/ml con toxina Stx2 (obtenida
como en el Ejemplo 7 del laboratorio del Dr. O'Brien) en una
solución amortiguadora cubierta de bicarbonato, pH 8.5. Este ensayo
demuestra que la transfección de células con este constructo de
plásmido puede resultar en la producción de una versión quimérica
humanizada del anticuerpo monoclonal de ratón 11E10, que une
efectivamente el tipo 2 de toxina Shiga (Figura 11).
En conjunto, estos ensayos demuestran que la
transfección de las células con este constructo de plásmido puede
resultar en la producción de una línea de célula estable que produce
una versión quimérica humanizada del anticuerpo de hibridoma de
ratón 11E10.
La eficacia de los anticuerpos humanizados para
toxina Shiga obtenida como se detalla en los Ejemplos 1 hasta 6 se
determinó al evaluar su capacidad para proteger células Vero de
toxina. Se realizaron ensayos de citotoxicidad esencialmente como
está descrito por Gentry and Dalrymple, J. Clin. Microbiol, 12:
361-366 (1980). Brevemente, se obtuvo la toxina de
cultivos de cepas K-12 de E. coli que
contienen ya sea el plásmido pLPSH3 (que codifica Stx; J. Infect.
Disease 164:344-352 (1991)) o pMJ 100 (que codifica
Stx2; Inf. And Immunity, 57: 3743-3750 (1989)). Se
rompieron las bacterias por lisis sónica y se clarificaron por
centrifugación. Los extractos se diluyeron en serie en medio de
cultivo de tejido (medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene
suero de becerro fetal al 10%, glutamina 0.8 mM, 500 U de
penicilina G por ml, y 500 mg de estreptomicina por ml). Se
agregaron 100 microlitros de diluciones de 10 pliegues de los
lisados a los pocillos de la placa de microtitulación que contienen
alrededor de 10^{4} células Vero en 100 \mul de medio. Las
células de cultivo de tejido se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5%
durante 48 horas y luego se fijaron y tiñeron con morado cristal. La
intensidad de color de las células fijas y teñidas se midió con un
lector Titertek a 620 nm. La incubación sin anticuerpo proporciona
una curva de toxicidad estándar para el Stx.
Los anticuerpos de ratón humanizados obtenidos
de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 1 hasta 6 se
probaron para neutralización de toxina. La neutralización de
actividad citotóxica se describe en mayor detalle en Schmitt y
col., Infect. And Immun., 59:1065-1073 (1991).
Brevemente, se incubaron los lisados con diluciones en serie de los
anticuerpos de ratón humanizados a 37ºC durante 2 horas. Se
agregaron entonces 100 microlitros de las muestras a células Vero
como se describe arriba.
El día cero, a unos grupos de cinco ratones
CD-1 se les inyectó intraperitonealmente (0.1 ml)
con anticuerpo H13C4 (\alpha-Stx 1B humanizado),
13C4 (\alpha-Stx1B de ratón), H11E10
(\alpha-Stx2A humanizado), o solución salina
amortiguada en fosfato (PBS). Estas inyecciones se repitieron el día
1. Se estimuló entonces a los ratones por inyección intravenosa con
toxina Stx1 cruda (obtenida como se describe en el Ejemplo 7) en
dosis de 1.7 x 10^{5} ó 1.7 x 10^{6} CD_{50}. Estas dosis de
toxina se eligieron siguiendo los experimentos preliminares con
cantidades variadas de toxinas. Los ratones se monitorizaron durante
21 días.
Los resultados (Tabla 2) muestran claramente que
los anticuerpos inyectados protegen a los ratones contra al menos
10 veces la dosis de toxina letal normal. Como control negativo, los
anticuerpos para Stx2 no protegen contra estimulación con toxina
Stx1, lo que indica que la protección fue específica para el par
toxina/anticuerpo, y no fue un utensilio del proceso de preparación
del anticuerpo.
Se usaron dos cepas diferentes de ratones y
bacterias en estos estudios para probar la eficacia contra tanto
Stx2 como contra la variante Stx2. Se estimularon ratones DBA/2J con
cepa EHEC 86-24 (0157:H7, Stx2^{+}) y se
estimularon ratones CD-1 con cepa B2F1 (O91:H21,
variante Stx2*). Aunque la cepa B2F1 de E. coli normalmente
es fatal para ambas series de ratones, la cepa 86-24
de E. coli es fatal para los ratones DBA/2J, mientras los
ratones CD-1 sobrevivirán a la infección con
86-24.
El día cero, se inyectó el anticuerpo H11E10
(\alpha-Stx2A humanizado) u 11E10
(\alpha-Stx2A de ratón) intraperitonealmente (0.1
ml) en grupos de cuatro o cinco ratones. Los grupos de control
incluyen ratones que han recibido anticuerpo 13C4
(\alpha-Stx1B de ratón), ratones que han recibido
fluido de ascitos 11E10 (\alpha-Stx2A de ratón),
o ratones que han recibido PBS en lugar de anticuerpo. A los ratones
se les dio estreptomicina (5g/L) en su agua de beber para reducir
la flora intestinal normal y se removió su alimento. Se hicieron
crecer derivados resistentes a la estreptomicina de las cepas
86-24 (0157:H7, Stx2^{+}) y B2F1 (091:H21,
Stx2-variante^{+}) durante la noche en caldo
L.
El día siguiente (día 1) los ratones recibieron
una segunda inyección de anticuerpo de prueba, anticuerpo de
control, o PBS. Los ratones se alimentaron inmediatamente con
10^{10} CFU de 86-24 que se había peletizado y
vuelto a suspender en sacarosa al 20% o 10^{3} CFU de B2F1 que se
ha diluido en serie en sacarosa al 20%. Se devolvió el alimento a
la jaula y se vigiló a los ratones durante 21 días. (CFU=Unidades
que Forman la Colonia).
Como se muestra en la Tabla 3, la inmunización
de los ratones con los anticuerpos anti-Stx2, ya sea
de murino o humanizados, resulta en la protección completa de una
dosis oral letal de EHEC. La inmunización con anticuerpo 13C4 de
ratón, preparado de la misma manera pero inmunoreactivo con la
toxina StxI en lugar de la toxina Stx2 no protegió a los ratones de
la estimulación con 86-24, un resultado que indica
la inmunoespecificidad de la respuesta.
Se ilustran resultados similares en la Tabla 4,
donde los ratones CD-1 más resistentes se
alimentaron con la cepa E. coli B2F1 que produce la toxina
variante Stx2. Sin tratamiento con anticuerpo, la mortalidad fue
total, pero los anticuerpos tanto humanizados como de ratón protegen
contra la variante Stx2 en una manera dependiente de la dosis.
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Los solicitantes describen además una variedad
de métodos para tratar, aminorar, o prevenir las enfermedades y
efectos asociados con la exposición a toxina Shiga. Se han obtenido
respuestas clínicas positivas en humanos con anticuerpos
monoclonales, y alguien experto en la técnica sabría como emplear
los anticuerpos monoclonales humanizados anti-Stx
en humanos, (ver Fagerberg y col., Cancer Research,
55:1824-27 (1995); Eur. J. Cancer,
2:261-267 (1995). La dosificación precisa del
anticuerpo de toxina anti-Shiga humanizado
administrado a un paciente para el tratamiento de estas
enfermedades variará de acuerdo con factores apreciados por el
médico típico. Estos factores incluyen (pero no se limita a),
talla, edad, salud general, la extensión de la infección, y otros
medicamentos administrados al paciente. El desarrollo de un régimen
de tratamiento preciso requerirá la optimización a través de
procedimientos médicos de rutina, bien conocidos por aquellos en las
técnicas médicas. Los ejemplos de grupos de pacientes potenciales
incluirían (pero no se limita a) niños pequeños con diarrea
sangrante pero sin glóbulos blancos en las heces, pacientes con
indicaciones de HUS, pacientes con pruebas de muestra de heces
positivas para toxina Shiga, grupos de hermanos o de una guardería
en contacto con un caso (como una medida preventiva pasiva), y
cualquier paciente con diarrea (no necesariamente sangrante) que
haya estado en contacto con un caso identificado. Se contemplaría
una dosificación típica de alrededor de 5 mg/kg de peso corporal de
13C4 humanizado combinado con alrededor de 10 mg/kg de peso corporal
de 11E10 humanizado. Esta formulación combinada podría
administrarse al paciente dos veces para asegurar su efectividad.
La inclusión de ambos tipos de anticuerpos humanizados en conjunto
proporciona seguridad de que el paciente estará protegido contra
todos los tipos de toxina Shiga descritos en la presente.
<110> HENRY JACKSON FOUNDATION FOR THE
ADVANCEMEKT OF MILITARY MEDICINE
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<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANIZADOS
QUE PROTEGEN CONTRA LA ENFERMEDAD INDUCIDA POR TOXINA SHIGA
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<130> 04995.0032-00304
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<140>
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<141>
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<160> 44
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipatt tea ggc cca gcc ggc cat ggc cga rgt rma gct ksa kga gwc
\hfill45
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<210> 2
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<210> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcataggcg gccgcactag tagcmcgttt katytccarc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgcacctccag atgttaactg ctc
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipcttgatcgcg acagctacag gtgtccactc ccaggtgcag ctgcaggag
\hfill49
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<210> 15
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipggtatggaat tctgaggaga ctgtgagagt ggtgcc
\hfill36
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<210> 16
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipggttctgata tcgtgatgtc ccagtctcac aaattc
\hfill36
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipgacatattcg aaaagtgtac ttacgttca gctccagact gg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
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<212> ADN
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<213> Shigella dysenteriae
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<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Shigella dysenteriae
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Shigella dysenteriae
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
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<210> 22
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<211> 45
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipatttcaggcc cagccggcca tggccgargt rmagctksak gagwc
\hfill45
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<210> 23
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<211> 45
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcaggcc cagccggcca tggccgargt ycarctkcar caryc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcaggcc cagccggcca tggcccaggt gaagctksts gartc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcaggcc cagccggcca tggccgavgt gmwgctkgtg gagwc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcaggcc cagccggcca tggcccaggt bcarctkmar sartc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaartavccc ttgaccaggc
\hfill20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipgctgccaccg ccacctgmrg agacdgtgas tgarg
\hfill35
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskipgctgccaccg ccacctgmrg agacdgtgas mgtrg
\hfill35
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<210> 30
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hfill35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipggaggcggcg gttctgacat tgtgmtgwcm carte
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hfill35
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<210> 33
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<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipggaggcggcg gttctgayat ymagatgacm cagwc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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\hfill35
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<210> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
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<400> 35
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\hfill40
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcataggcg gccgcactag tagcmcgttt katytccarc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatactcgc gacagctaca ggtgtccact ccgaagtcca actgcaacag cc
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaatgaat tctgcggaga cggtgagagt ggtc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaaatgata tcgtgctgtc acaatctcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatcgtccg aaaagtgtac ttacgtttca gttccagctt ggtcc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
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<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
Claims (14)
1. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende un primer anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo
1 (Stxl) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a
la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2), en donde el primer
anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana
y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada
de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y
en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de
inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena
ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en
las SEQ ID NOs: 42 y 44.
2. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende un primer anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo
monoclonal humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en donde la
región variable del segundo anticuerpo comprende la región variable
del anticuerpo 11E10 de murino con No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y
la región variable del primer anticuerpo comprende la región
variable del anticuerpo 13C4 de murino con No. de Acceso al ATCC
CKL 1794.
3. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el primero o
segundo anticuerpo comprenden una región constante humana
seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.
4. La composición farmacéutica según la
reivindicación 3, caracterizada porque la región constante
humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG.
5. La composición farmacéutica según la
reivindicación 3, caracterizada porque la región constante
humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es
IgG1-kappa.
6. La composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada porque
además comprende un portador o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
7. El uso de una composición que comprende un
primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína
Stxl y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la
proteína Stx2, en donde el primer anticuerpo comprende una región
constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones
variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como
se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo
anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana
y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada
de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44 en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención
de una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico
provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras
bacterias que producen la toxina Shiga.
8. El uso de una composición que comprende un
primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un
segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza al antígeno
Stx2, en donde la región variable del segundo anticuerpo comprende
la región variable del anticuerpo 11E10 de murino con el No. de
Acceso al ATCC CRL 1907 y la región variable del primer anticuerpo
comprende la región variable del anticuerpo 13C4 de murino con el
No. de Acceso al ATCC CKL 1794 en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o prevención de una infección que resulta en
síndrome de uremia hemolítico provocado por Escherichia coli
enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina
Shiga.
9. El uso según la reivindicación 7 u 8, en
donde el primero o segundo anticuerpo comprende una región constante
humana seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.
10. El uso según la reivindicación 9, en donde
la región constante humana del primero o segundo anticuerpo
monoclonal es IgG, preferiblemente IgG1-kappa.
11. Una composición caracterizada porque
comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a
la proteína Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que
enlaza a la proteína Stx2, en donde el primer anticuerpo comprende
una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las
regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de
inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en
donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de
inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena
ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las
SEQ ID NOs: 42 y 44 para el tratamiento o prevención de una
infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico provocado
por Escherichia coli enterohemorrágica u otras bacterias que
producen la toxina Shiga.
12. Una composición caracterizada porque
comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a
Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza al
antígeno Stx2, en donde la región variable del segundo anticuerpo
comprende la región variable del anticuerpo 11E10 de murino con No.
de Acceso al ATCC CRL 1907 y la región variable del primer
anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 13C4 de
murino con No. de Acceso al ATCC CKL 1794, para tratar o prevenir
una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico
provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras
bacterias que producen la toxina Shiga.
13. La composición farmacéutica según la
reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque el primero o
segundo anticuerpo comprende una región constante humana
seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.
14. La composición farmacéutica según la
reivindicación 13, caracterizada porque la región constante
humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG,
preferiblemente IgGI-kappa.
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