ES2339683T3 - Diagnostico y tratamiento de canceres de celulas mieloides y linfoides. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para su uso en el diagnóstico de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo en un mamífero, en la que la composición se administra al mamífero, y la detección de la unión de la composición en el mamífero indica la presencia de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo en el mamífero.
Description
Diagnóstico y tratamiento de cánceres de células
mieloides y linfoides.
La invención se refiere al tratamiento de
trastornos mieloproliferativos y linfoproliferativos con una
clorotoxina o sus derivados.
Las células sanguíneas, en general, se
clasifican como linfoides (por ejemplo, linfocitos, etc.) o
mieloides (por ejemplo, granulocitos, monocitos, eritrocitos y
plaquetas). Por consiguiente, las malignidades hematológicas se
clasifican como trastornos linfoproliferativos o
mieloproliferativos. Cada uno de estos trastornos se clasifica
operativamente como agudo o crónico, dependiendo de la proporción de
células precursoras inmaduras (blastos) en la médula ósea. En el
linaje mieloide, la presencia de más del 30% de blastos en la médula
ósea define la leucemia mieloide aguda. Un trastorno mieloide que
no es la leucemia mieloide aguda se denomina síndrome
mielodisplásico o una enfermedad mieloproliferativa crónica
basándose, respectivamente, en la presencia o la ausencia de
displasia morfológica de tres linajes, que implica principalmente a
los eritrocitos. Las enfermedades mieloproliferativas crónicas
incluyen la leucemia mielógena crónica (CML), la trombocitopenia
esencial, la policitemia vera y la metaplasia mieloide agnogénica.
A veces un trastorno mieloide crónico no puede clasificarse como
síndrome mielodisplásico ni como enfermedad mieloproliferativa
crónica. Los ejemplos incluyen CML atípica y leucemia neutrófila
crónica.
Como grupo, las enfermedades mieloproliferativas
crónicas están interrelacionadas porque el proceso clonal se
origina al nivel de las células progenitoras mieloides y, de forma
secundaria, puede producir fibrosis de la médula o sufrir una
transformación leucémica. Entre las enfermedades mieloproliferativas
crónicas, sólo la CML se ha caracterizado biológicamente por la
presencia de una translocación genética recíproca entre los
cromosomas nueve y veintidós. Una anomalía genética coherente
similar no se ha asociado con las otras enfermedades
mieloproliferativas crónicas, y el diagnóstico clínico se basa en la
presencia o en la ausencia de ciertas características clínicas y de
laboratorio. Se requiere un aumento en la masa de eritrocitos para
el diagnóstico de la policitemia vera. De manera similar, la
presencia de una fibrosis sustancial de la médula ósea no asociada
con la CML ni con la policitemia vera es la característica de la
metaplasia mieloide agnogénica. El diagnóstico de la trombocitemia
esencial es de exclusión, representando una trombocitosis clonal que
no puede clasificarse como metaplasia mieloide agnogénica,
policitemia vera, síndrome mielodisplásico ni CML.
Los trastornos linfoproliferativos pueden
dividirse en dos categorías principales: el linfoma no hodgkiniano
que incluye más de veinte entidades discretas (véase la tabla 1), y
el linfoma hodgkiniano que se localiza en los nódulos linfáticos.
En la actualidad, se emplea la inmunohistoquímica para diferenciar
los linfomas hodgkinianos y no hodgkinianos. En la mayoría de los
casos de la enfermedad de Hodgkin, en las biopsias se descubre una
célula concreta denominada célula de Reed-Sternberg.
Esta célula no se encuentra habitualmente en otros linfomas, así
que éstos se denominan linfomas no hodgkinianos. Los linfomas no
hodgkinianos (NHL) son un grupo de malignidades linfoides con una
patología y una historia natural diversas. Este diversidad se
ilustra por los diferentes subtipos histológicos y las
clasificaciones de los NHL que han aparecido a través de los años.
Con el avance rápido que se ha producido en nuestra comprensión de
la biología de los linfomas han aparecido nuevos sistemas de
clasificación que describen mejor este grupo de enfermedades.
Linfoma/leucemia linfoblástica de precursores de
células B
Neoplasmas de células B maduras
- Linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica de células B
- Leucemia prolinfocítica de células B
- Linfoma linfoplasmacítico
- Linfoma de células B de la zona marginal esplénica
- Leucemia de células pilosas
- Linfoma de células B de la zona marginal extranodal
- Linfoma de células del manto
- Linfoma folicular
- Linfoma de la zona marginal nodal
- Linfoma de células B grandes difuso
- Linfoma de Burkitt
- Plasmacitoma
- Mieloma de células plasmáticas
- Leucemia prolinfocítica de células T
- Leucemia linfocítica de células T grandes granulares
- Leucemia de células NK
- Linfoma de células NK/T extranodal
- Micosis fungoides
- Linfoma de células grandes anaplásico cutáneo primario
- Linfoma de células T de tipo panniculitis subcutáneo
- Linfoma de células T intestinal de tipo enteropático
- Linfoma de células T gamma-delta hepatoesplénico
- Linfoma de células T angioinmunoblástico
- Linfoma de células T periféricas
- Linfoma de células grandes anaplásico
- Linfoma de células T adultas
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque se han producido avances significativos
en el tratamiento del linfoma no hodgkiniano en las últimas dos
décadas aún debe desarrollarse un régimen curativo para pacientes
con linfomas de células B y T. Además, una remisión duradera en
pacientes tratados con diversos regímenes para linfomas de grado
intermedio y alto refractarios es relativamente rara (Klimo (1988),
Chemotherapy for aggressive non-Hodgkin's lymphomas,
en DeVita et al. (eds.), Cancer: Principles and Practice of
Oncology, Lippincott, 1-12). Intentos recientes que
emplean la quimioterapia supraletal combinada con radioterapia,
seguido de un transplante de médula ósea, han producido una tasa de
supervivencia exenta de enfermedad a largo plazo de aproximadamente
20% (Applebaum et al. (1987), J. Clin. Oncol., 5,
1340-1341). Sin embargo, la mayoría de los pacientes
tratados de esta manera mueren de linfoma o de complicaciones
relacionadas con el tratamiento. Por tanto, son necesarias nuevas
estrategias para el tratamiento de los linfomas no hodgkinianos.
Estas estrategias deberían tener como objetivo la maximización del
efecto terapéutico acoplado con la minimización de la toxicidad.
Una estrategia implica el uso de anticuerpos
monoclonales que reconocen antígenos asociados a tumores como un
medio para dirigir fármacos o radioisótopos hacia células tumorales.
Esta estrategia es particularmente atractiva en el caso de los
linfomas no hodgkinianos, puesto que las células tumorales de estos
linfomas muestran una diversidad de antígenos restringidos a los
tumores sobre su superficie celular que pueden estar disponibles
para el transporte dirigido (McMichael (1987), Leukocyte Typing III,
Oxford University Press, 302-363 y
432-469). De todas las malignidades que se han
tratado con anticuerpos monoclonales hasta la fecha, los linfomas
han producido los resultados más espectaculares. Sin embargo, la
mayoría de las respuestas tumorales han sido incompletas y de
duración relativamente corta. Debido a estos resultados limitados,
existe la necesidad de dirigir agentes que no sean anticuerpos, que
sean útiles para la detección y el tratamiento de los linfomas.
\vskip1.000000\baselineskip
La clorotoxina es una proteína de treinta y seis
aminoácidos derivada en la naturaleza del veneno del escorpión
Leiurus quinquestriatus (DeBin et al. (1993), Am. J.
Physiol., 264: C361-369). Se han desarrollado
composiciones (véanse las patentes de EEUU 5.905.027 y 6.429.187) y
métodos (véanse la patentes de EEUU 6.028.174 y 6.319.891, y el
documento WO 03/101474) para diagnosticar y tratar tumores
neuroectodérmicos (por ejemplo, gliomas y meningiomas) y el cáncer
de próstata, basados en la capacidad de la clorotoxina para unirse a
células tumorales de origen neuroectodérmico (Soroceanu et
al. (1998), Cancer Res., 58, 4871-4879; Ullrich
et al. (1996), Neuroreport, 7, 1020-1024;
Ullrich et al. (1996), Am. J. Physiol., 270,
C1511-C1521). El diagnóstico de los tumores
neuroectodérmicos se realiza mediante la identificación de la
clorotoxina marcada unida a las células tumorales, mientras que el
tratamiento de los tumores neuroectodérmicos se realiza dirigiendo
agentes citotóxicos vinculados con la clorotoxina hacia los tumores.
La presente invención expande esta área de terapéutica
proporcionando una composición para tratar trastornos
mieloproliferativos y linfoproliferativos basándose en el
descubrimiento de que la clorotoxina y sus derivados se unen a
células de cáncer mieloides y linfoides.
La invención incluye un método para detectar la
presencia de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo
en un mamífero que comprende (a) poner en contacto una muestra
biológica aislada a partir del mamífero, con una composición que
comprende la clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la
secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), y (b) detectar la
presencia de unión de la composición a la muestra, en el que la
presencia de unión indica la presencia de un trastorno
linfoproliferativo o mieloproliferativo en el mamífero.
La invención también incluye una composición que
comprende una clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la
secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8) para su uso en el
diagnóstico de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo
en un mamífero, en la que la composición se administra al mamífero,
y la detección de la unión de la composición en el mamífero indica
la presencia de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo
en el mamífero.
La invención incluye una composición que
comprende una clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la
secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para su uso en el
tratamiento de un trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo
en un mamífero, en la que la clorotoxina o su fragmento está unido a
un agente citotóxico. En algunas realizaciones, el mamífero es un
ser humano.
La invención incluye el uso de una composición
que comprende una clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que
tiene la secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para la
fabricación de un medicamento para tratar un trastorno
linfoproliferativo o mieloproliferativo en un mamífero, en la que la
clorotoxina o su fragmento está unido a un agente citotóxico.
Los trastornos linfoproliferativos pueden ser un
linfoma no hodgkiniano, e incluyen casos en los que el linfoma no
hodgkiniano es un neoplasma de células B, y el neoplasma de células
B es un linfoma/leucemia linfoblástica de precursores de células B
o un neoplasma de células B maduras. Los ejemplos de neoplasmas de
células B maduras incluidos en los métodos de la invención
incluyen, pero no se limitan a linfoma linfocítico pequeño/leucemia
linfocítica crónica de células B, leucemia prolinfocítica de células
B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de la zona
marginal esplénica, leucemia de células pilosas, linfoma de células
B de la zona marginal extranodal, linfoma de células del manto,
linfoma folicular, linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de
células B grandes difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, y
mieloma de células plasmáticas.
El linfoma no hodgkiniano puede ser un neoplasma
de células T. Los ejemplos de neoplasmas de células T incluyen,
pero no se limitan a leucemia prolinfocítica de células T, leucemia
linfocítica de células T grandes granulares, leucemia de células
NK, linfoma de células NK/T extranodal, micosis fungoides, linfoma
de células grandes anaplásico cutáneo primario, linfoma de células
T de tipo panniculitis subcutáneo, linfoma de células T intestinal
de tipo enteropático, linfoma de células T
gamma-delta hepatoesplénico, linfoma de células T
angioinmunoblástico, linfoma de células T periféricas, linfoma de
células grandes anaplásico, y linfoma de células T adultas.
El trastorno mieloproliferativo puede
seleccionarse del grupo que consiste en policitemia vera (PV),
trombocitemia esencial (ET), metaplasia mieloide agnogénica (AMM),
también denominada mielofibrosis idiopática (IMF), y leucemia
mielógena crónica (CML).
Cuando la invención se refiere al diagnóstico,
la clorotoxina o su derivado puede estar unido a un segundo
polipéptido. El segundo polipéptido puede comprender un dominio de
unión que se une específicamente a un epitopo expresado sólo por
una célula de cáncer mieloide o linfoide, y puede ser un anticuerpo
o su fragmento y/o un dominio de estabilización que evite la
degradación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de dominios de
estabilización incluyen, pero no se limitan a polihistidina y
albúmina de suero humana. Cuando la invención se refiere al
tratamiento, la clorotoxina o su derivado está unida a un agente
citotóxico. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no
se limitan a gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas,
proteína antivírica de la hierba carmín, toxina de la difteria y
proteínas del complemento. En la invención, la clorotoxina o su
derivado puede estar marcado, y el marcador puede ser ^{131}I. La
cantidad de clorotoxina administrada en la invención puede
comprender entre aproximadamente 0,01 \mug/kg de peso corporal
hasta aproximadamente 2,0 mg/kg de peso corporal.
La figura 1 muestra los resultados de un
análisis FACS de células de cáncer linfoides (linfocitos B (Raji) y
linfoblastos B (Daudi) del linfoma de Burkitt) tratadas con
clorotoxina o con un fragmento peptídico de clorotoxina previamente
identificado como el dominio de unión (péptido 21 (SEQ ID NO:10) y
péptido 8 (SEQ ID NO:8)).
La figura 2 muestra los resultados de un
análisis FACS de células de cáncer linfoides (linfoblastos T
(Molt-4) de la leucemia linfoblástica aguda)
tratadas con clorotoxina o con un fragmento peptídico de clorotoxina
previamente identificado como el dominio de unión (péptido 21 (SEQ
ID NO:10) y péptido 8 (SEQ ID NO:8)).
La figura 3 muestra los resultados de
experimentos que demuestran los efectos sinérgicos dependientes de
la dosis de la clorotoxina en combinación con doxorrubicina sobre
la proliferación de células Raji.
La figura 4 muestra los resultados de
experimentos que demuestran los efectos sinérgicos dependientes de
la dosis de la clorotoxina en combinación con doxorrubicina sobre
la proliferación de células Daudi.
Se ha determinado que la clorotoxina y su
fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos KGRGKSY se une
específica y selectivamente a células de cáncer mieloides y
linfoides. Por tanto, la presente invención incluye el diagnóstico
y el tratamiento de enfermedades mieloproliferativas y
linfoproliferativas poniendo en contacto la célula de cáncer
mieloide o linfoide con una cantidad eficaz de clorotoxina o su
fragmento.
La inhibición o la detención de la proliferación
celular asociada con una enfermedad mieloproliferativa o
linfoproliferativa puede servir para potenciar las defensas
naturales dentro del sujeto. Por ejemplo, la detención o la
inhibición del crecimiento de las células del cáncer potencia la
capacidad del sistema inmunológico para organizar una respuesta más
eficaz frente al cáncer.
Tal como se emplea en la presente, la expresión
"enfermedad mieloproliferativa", a menos que se indique lo
contrario, se refiere a un crecimiento de células mieloides que es
independiente de los mecanismos reguladores normales. Esto incluye
el crecimiento y/o la proliferación anómalos de células mieloides en
estados benignos y malignos de enfermedades neoplásicas. La
inhibición del crecimiento celular anómalo puede producirse a través
de una diversidad de mecanismos que incluyen, pero no se limitan a
la muerte celular, la apoptosis, la detención de la mitosis, la
inhibición de la división celular, la transcripción, la traducción,
la transducción, etc. Los ejemplos de enfermedades
mieloproliferativas incluyen, pero no se limitan a policitemia vera
(PV), trombocitemia esencial (ET), metaplasia mieloide agnogénica
(AMM), también denominada mielofibrosis idiopática (IMF), y
leucemia mielógena crónica (CML).
Tal como se emplea en la presente, la expresión
"enfermedad linfoproliferativa", a menos que se indique lo
contrario, se refiere a un crecimiento de células linfoides que es
independiente de los mecanismos reguladores normales. Esto incluye
el crecimiento y/o la proliferación anómalos de células linfoides en
estados benignos y malignos de enfermedades neoplásicas. La
inhibición del crecimiento celular anómalo puede producirse a través
de una diversidad de mecanismos que incluyen, pero no se limitan a
la muerte celular, la apoptosis, la detención de la mitosis, la
inhibición de la división celular, la transcripción, la traducción,
la transducción, etc.
En una realización, el trastorno
linfoproliferativo es un linfoma no hodgkiniano. En otra
realización, el linfoma no hodgkiniano es un neoplasma de células B
seleccionado de linfoma/leucemia linfoblástica de precursores de
células B o un neoplasma de células B maduras. Los neoplasmas de
células B maduras incluyen, pero no se limitan a linfoma
linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica de células B,
leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico,
linfoma de células B de la zona marginal esplénica, leucemia de
células pilosas, linfoma de células B de la zona marginal
extranodal, linfoma de células del manto, linfoma folicular,
linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de células B grandes
difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, y mieloma de células
plasmáticas.
La invención también incluye el tratamiento de
un linfoma no hodgkiniano que es un neoplasma de células T. Los
ejemplos de neoplasmas de células T incluyen, pero no se limitan a
leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica de
células T grandes granulares, leucemia de células NK, linfoma de
células NK/T extranodal, micosis fungoides, linfoma de células
grandes anaplásico cutáneo primario, linfoma de células T de tipo
panniculitis subcutáneo, linfoma de células T intestinal de tipo
enteropático, linfoma de células T gamma-delta
hepatoesplénico, linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma
de células T periféricas, linfoma de células grandes anaplásico, y
linfoma de células T adultas.
En una realización de la invención, la
enfermedad mieloproliferativa o linfoproliferativa es un cáncer. Tal
como se emplea en la presente, el término "cáncer", a menos
que se indique lo contrario, se refiere a enfermedades que se
caracterizan por un crecimiento y/o una proliferación celular
anómalos e incontrolados. Los tipos de cáncer en los que las
composiciones son útiles incluyen, pero no se limitan a cánceres
asociados con la transformación de células germinales mieloides y/o
linfoides.
Tal como se emplea en la presente, el término
"clorotoxina", a menos que se indique lo contrario, se refiere
a un polipéptido de treinta y seis aminoácidos, de longitud
completa, derivado en la naturaleza del veneno del escorpión
Leiurus quinquestriatus (DeBin et al. (1993), Am. J.
Physiol., 264, C361-369), que comprende la
secuencia de aminoácidos de la clorotoxina nativa como se indica en
SEQ ID NO:1. El término "clorotoxina" incluye polipéptidos que
comprenden SEQ ID NO:1 que se han producido de forma sintético o
recombinante, como los descritos en la patente de EEUU
6.319.891.
Tal como se emplea en la presente, la expresión
"subunidad de clorotoxina" o "subunidad de la clorotoxina"
se refiere a un péptido que comprende menos de treinta y seis
aminoácidos contiguos de la clorotoxina y que es capaz de unirse
específicamente a células de cáncer.
La clorotoxina y sus derivados peptídicos pueden
prepararse utilizando métodos de síntesis peptídica en fase sólida
(o en fase de disolución) convencionales, como se conoce en la
técnica. Además, los ácidos nucleicos que codifican estos péptidos
pueden sintetizarse utilizando instrumentos para la síntesis de
oligonucleótidos disponibles en el mercado, y pueden producirse de
modo recombinante utilizando sistemas de producción recombinantes
convencionales. La producción utilizando una síntesis peptídica en
fase sólida es necesaria si se van a incluir aminoácidos no
codificados por un gen.
Los fragmentos de la clorotoxina útiles en la
invención comprenden la secuencia de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID
NO:8), que se corresponde con los restos aminoácidos 23 a 29 de SEQ
ID NO:1.
En la presente se describen las correspondientes
toxinas polipeptídicas de otras especies de escorpiones, también
denominadas de modo general en la presente derivados de clorotoxina,
que muestran una actividad similar o relacionada con la
clorotoxina.
Tal como se emplea en la presente, la expresión
"toxina de escorpión relacionada" se refiere a cualquiera de
las toxinas o los péptidos relacionados, como los descritos en la
tabla 1, que muestran una coincidencia de secuencia de aminoácidos
y/o de nucleótidos con la clorotoxina. Los ejemplos de toxinas de
escorpión relacionadas incluyen, pero no se limitan a la
neurotoxina CT de Mesobuthus martensii (GenBank nº de
registro AAD47373), la neurotoxina BmK 41-2 de
Buthus martensii karsch (GenBank nº de registro A59356), la
neurotoxina Bm12-b de Buthus martensii
(GenBank nº de registro AAK16444), la toxina probable LQH 8/6 de
Leiurus quinquestriatus hebraeu (GenBank nº de registro
P55966), la toxina pequeña de Mesobuthus tamulus sindicus
(GenBank nº de registro P15229).
La homología o coincidencia de secuencia al
nivel de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos se determina
mediante un análisis BLAST ("Basic Local Alignment Search
Tool", herramienta de búsqueda de alineaciones básicas)
utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn,
blastx, tblastn y tblastx (Altschul et al. (1997), Nucleic
Acids Res., 25, 3389-3402, y Karlin et al.
(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268),
que se adaptan para la búsqueda de similitudes de secuencia. La
estrategia empleada por el programa BLAST consiste en considerar
primero segmentos similares, con huecos (no contiguos) y sin huecos
(contiguos), entre una secuencia problema y una secuencia de la
base de datos, después evaluar la significancia estadística de
todos los apareamientos que se identifican y, por último, resumir
sólo los apareamientos que cumplen un umbral preseleccionado de
significancia. Para un análisis de las cuestiones básicas para la
búsqueda de similitudes en bases de datos de secuencias, véase
Altschul et al. (1994), Nature Genetics, 6,
119-129. Los parámetros de búsqueda para
histogramas, descripciones, alineamientos, expectativas (es decir,
el umbral de significancia estadística para indicar apareamientos
con secuencias de la base de datos), límite de exclusión, matrices
y filtros (baja complejidad) se encuentran en los ajustes por
defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp,
balstx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et
al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
10915-10919), recomendada para secuencias problema
con una longitud de más de ochenta y cinco nucleótidos.
Para blastn, la matriz de puntuación se ajusta
mediante las proporciones de M (es decir, la puntuación de premio
por un par de restos apareados) a N (es decir, la puntuación de
penalización por restos no apareados), en los que los valores por
defecto para M y N son +5 y -4, respectivamente. Se ajustan cuatro
parámetros de blastn como sigue: Q = 10 (penalización de creación
de hueco); R = 10 (penalización de extensión de hueco); guiño = 1
(genera impactos de palabra en cada posición de guiño a lo largo de
la secuencia problema); y ancho de hueco = 16 (ajusta el ancho de
la ventana dentro de la cual se generan los alineamientos con
huecos). Los ajustes de los parámetros equivalentes en blastp son Q
= 9; R = 2; guiño = 1; y ancho de hueco = 32. Una comparación
Bestfit entre las secuencias, disponible en el paquete GCG, versión
10.0, emplea los parámetros de ADN GAP = 50 (penalización de
creación de hueco) y LEN = 3 (penalización de extensión de hueco), y
los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP
= 8 y LEN = 2.
\vskip1.000000\baselineskip
No debe considerarse que las proteínas de fusión
ni las extensiones C-terminales o
N-terminales en la secuencia peptídica afecten a la
homología. Los ejemplos de dichas extensiones incluyen, pero no se
limitan a las siguientes secuencias:
HHHHHHMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR
(SEQ ID NO:2),
YMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR
(SEQ ID NO:3),
YSYMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGTGKCYGPQCLCR
(SEQ ID NO:4).
\vskip1.000000\baselineskip
Los variantes peptídicos contemplados también
incluyen, pero no se limitan a las siguientes secuencias:
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCFGPQCLR (SEQ ID
NO:5),
RCKPCFTTDPQMSKKCADCCGGKGKGKCYGPQCLC (SEQ ID
NO:6),
RCSPCFTTDQQMTKKCYDCCGGKGKGKCYGPQCICAPY (SEQ ID
NO:7).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención puede utilizarse in vivo,
normalmente en mamíferos, como seres humanos, ovejas, caballos,
ganado vacuno, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in
vitro. La invención es particularmente útil para el tratamiento
de sujetos humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además el uso de una
proteína de clorotoxina recombinante o su fragmento, para el
tratamiento de trastornos mieloproliferativos o linfoproliferativos.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la clorotoxina o su
fragmento pueden utilizarse para producir de modo recombinante este
polipéptido. Estas moléculas de ácidos nucleicos pueden estar en
una forma aislada, o pueden estar unidas operablemente a elementos
de control de la expresión o a secuencias de vectores. Las células
hospedantes pueden contener los vectores mediante transformación,
transfección, electroporación o cualquier otro medio reconocido en
la técnica para introducir un ácido nucleico en una célula.
Tal como se emplea en la presente, un
"replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo,
plásmido, cromosoma, virus) que actúa como una unidad autónoma de
replicación del ADN in vivo (es decir, capaz de replicarse
bajo su propio control).
Tal como se emplea en la presente, un
"vector" es un replicón, como un plásmido, un fago o un
cósmido, al cual puede estar unido otro segmento de ácido nucleico
(por ejemplo, ADN) para provocar la replicación del segmento unido.
Los vectores de la invención incluyen vectores víricos.
Tal como se emplea en la presente, un "ácido
nucleico" se refiere a la forma polimérica de ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina y/o citosina) en su
forma monocatenaria o en una hélice bicatenaria. Esta expresión se
refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y
no se limita a ninguna forma terciaria particular. Por tanto, este
término incluyen ARN o ADN monocatenario, ADN bicatenario que se
encuentra en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de
restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En el análisis de la
estructura de moléculas de ADN bicatenario concretas, en la presente
las secuencias pueden describirse según la convención normal de
ofrecer la secuencia sólo en la dirección 5' a 3' a lo largo de la
hebra no transcrita del ADN (por ejemplo, la hebra que tiene una
secuencia homóloga al ARNm).
Una "secuencia codificadora" del ácido
nucleico es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se
traduce en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el
control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la
secuencia codificadora se determinan por un codón de inicio en el
extremo terminal 5' (amino) y un codón de fin de la traducción en
el extremo terminal 3' (carboxi). Una señal de poliadenilación y una
secuencia de fin de la transcripción estarán normalmente
localizadas 3' con respecto a la secuencia codificadora.
Las secuencias de control de la transcripción y
de la traducción son secuencias reguladoras del ADN, como
promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores
y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia
codificadora en una célula hospedante.
Tal como se emplea en la presente, una
"secuencia promotora" es una región reguladora del ADN capaz de
unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción
de una secuencia codificadora cadena abajo (en dirección 3'). Para
objetivos de definición en la presente invención, la secuencia del
promotor está unida (globalmente) en su extremo terminal 3' por el
sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (en
dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos
necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por
encima del fondo. Dentro de la secuencia del promotor se encontrará
un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión
a proteínas responsables de la unión de ARN polimerasa. Los
promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contienen cajas
"TATA" y cajas "CAT".
Una secuencia codificadora está "bajo el
control" de secuencias de control de la transcripción y de la
traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia codificadora en ARNm, que entonces se traduce en la
proteína codificada por la secuencia codificadora.
Puede incluirse una "secuencia señal" antes
de la secuencia codificadora o puede utilizarse una secuencia de
péptido señal de una toxina de escorpión. Esta secuencia codifica un
péptido señal, N-terminal con respecto al
polipéptido, que se comunica con la célula hospedante para dirigir
al polipéptido hacia la superficie celular o para segregar el
polipéptido hacia el medio. Este péptido señal es cortado por la
célula hospedante antes de que la proteína abandone la célula.
Pueden encontrarse secuencias señal asociadas con una diversidad de
proteínas nativas en procariotas y eucariotas. Por ejemplo, el
factor alfa, una proteína nativa de levaduras, se segrega desde las
levaduras, y su secuencia señal puede unirse a proteínas heterólogas
para ser segregadas hacia el medio (véase la patente de EEUU
4.546.082). Además, se ha descubierto que el factor alfa y sus
análogos segregan proteínas heterólogas en una diversidad de
levaduras, como Saccharomyces y Kluyveromyces
(documento EP 88312306.9; publicación EP 0324274; y documento EP
0301669). Un ejemplo para su uso en células de mamífero es la señal
tPA utilizada para expresar la cadena ligera del factor VIIIc.
Una célula ha sido "transformada" por un
ácido nucleico exógeno o heterólogo cuando dicho ácido nucleico se
ha introducido dentro de la célula. El ácido nucleico transformante
puede o no integrarse (unirse covalentemente) en el ADN cromosómico
que forma el genoma de la célula. En procariotas, por ejemplo, el
ácido nucleico transformante puede mantenerse sobre un elemento
episómico, como un plásmido o un vector vírico. Con respecto a
células eucariotas, una célula transformada de modo estable es
aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un
cromosoma, de forma que es heredado por las células hijas a través
de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la
capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o
clones formados por una población de células hijas que contienen el
ácido nucleico transformante.
Tal como se emplea en la presente, una "línea
celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un
crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. Tal
como se emplea en la presente, las secuencias de ácidos nucleicos
muestran una "coincidencia sustancial" cuando al menos
aproximadamente 85% (preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%) de los
nucleótidos están apareados a lo largo de la longitud definida de
las secuencias de nucleótidos. Las secuencias que son
sustancialmente idénticas pueden identificarse con un experimento
de hibridación Southern, por ejemplo bajo condiciones rigurosas
según se definen para este sistema particular. La definición de las
condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la
técnica.
Una región "heteróloga" de la construcción
del ácido nucleico es un segmento identificable de un ácido nucleico
dentro de una molécula de ácido nucleico mayor que no se encuentra
en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por tanto,
cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen
normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN
genómico del mamífero en el genoma del organismo de origen. Otro
ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es una construcción
en la que la secuencia codificadora misma no se encuentra en la
naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia codificadora
genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen
codones diferentes del gen nativo).
Se emplean vectores para simplificar la
manipulación de los ácidos nucleicos que codifican la clorotoxina y
los polipéptidos derivados de la clorotoxina, para la preparación de
grandes cantidades de ácidos nucleicos para su posterior
procesamiento (vectores de clonación) o para la expresión de los
polipéptidos (vectores de expresión). Los vectores comprenden
plásmidos, virus (incluidos fagos), y fragmentos de ADN integrado
(es decir, fragmentos que están integrados en el genoma del
hospedante mediante recombinación). No es necesario que los
vectores de clonación contengan secuencias de control de la
expresión. Sin embargo, las secuencias de control en un vector de
expresión incluyen secuencias de control de la transcripción y de la
traducción, como un promotor de la transcripción, una secuencia que
codifica sitios de unión a ribosomas adecuados, y secuencias que
controlan el fin de la transcripción y de la traducción. El vector
de expresión preferiblemente debería incluir un gen de selección
para facilitar la expresión estable del gen de la clorotoxina y/o
para identificar células transformadas. Sin embargo, el gen de
selección para mantener la expresión puede ser suministrado por un
vector diferente en sistemas de cotransformación que emplean células
hospedantes eucariotas.
Los vectores adecuados en general contendrán
secuencias de replicones (orígenes de la replicación, para su uso
en vectores no integrativos) y de control que se derivan de una
especie compatible con el hospedante de expresión previsto. La
expresión vector "replicable", tal como se emplea en la
presente, pretende incluir vectores que contengan estos replicones,
así como vectores que son replicados mediante la integración en el
genoma del hospedante. Las células hospedantes transformadas son
células que se han transformado o transfectado con vectores que
contienen un ácido nucleico que codifica la clorotoxina o un
polipéptido derivado de la clorotoxina. Los polipéptidos expresados
pueden segregarse hacia el sobrenadante del cultivo, bajo el control
de señales de procesamiento adecuadas en el péptido expresado (por
ejemplo, secuencias señal homólogas o heterólogas).
Los vectores de expresión para las células
hospedantes normalmente contienen un origen de la replicación, un
promotor colocado cadena arriba de la secuencia codificadora de la
clorotoxina o del polipéptido derivado de la clorotoxina, junto con
un sitio de unión a ribosomas, un sitio de poliadenilación, y una
secuencia de fin de la transcripción. Los expertos en la técnica
apreciarán que ciertas de estas secuencias no son necesarias para
la expresión en ciertos hospedantes. Un vector de expresión para ser
utilizado con microbios sólo necesita contener un origen de la
replicación reconocido por el hospedante, un promotor que actúe en
el hospedante, y un gen de selección.
Los promotores que se emplean habitualmente se
derivan de polioma, virus del papiloma bovino, CMV (citomegalovirus
murino o humano), virus del sarcoma de Rouse, adenovirus, y virus de
simio 40 (SV40). También pueden utilizarse otras secuencias de
control (por ejemplo, secuencias de terminadores, poliA,
potenciadores o de amplificación).
Se construye un vector de expresión de modo que
la secuencia codificadora de la clorotoxina o del polipéptido
derivado de la clorotoxina se localice en el vector con las
secuencias reguladoras apropiadas, siendo la colocación y la
orientación de la secuencia codificadora con respecto a las
secuencias de control de tal forma que la secuencia codificadora se
transcribe y se traduce bajo el "control" de las secuencias de
control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de
ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia
codificadora). Las secuencias de control pueden estar acopladas a
la secuencia codificadora antes de la inserción en un vector, como
los vectores de clonación descritos anteriormente. Como alternativa,
la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector
de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de
restricción apropiado. Si la célula hospedante seleccionada es una
célula de mamífero, las secuencias de control pueden ser
heterólogas u homólogas con la secuencia codificadora de la
clorotoxina o del polipéptido derivado de la clorotoxina, y la
secuencia codificadora puede ser ADN genómico que contiene intrones
o ADNc.
Pueden utilizarse cultivos de células de
eucariotas superiores para expresar las proteínas de la presente
invención, tanto células de vertebrados como de invertebrados,
incluyendo insectos, y los procedimientos para su propagación son
conocidos.
Otros vectores de expresión son aquellos que se
emplean en sistemas eucariotas. Un ejemplo de un sistema de
expresión eucariota es aquel que emplea virus de vaccinia, que es
muy conocido en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO
86/07593). Los vectores de expresión de levaduras son conocidos en
la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU 4.446.235 y
4.430.428). Otro sistema de expresión es el vector pHSI, que
transforma a células de ovario de hámster chino (véase el documento
WO 87/02062). El tejido de mamífero puede cotransformarse con un
ADN que codifique un marcador seleccionable, como la dihidrofolato
reductasa (DHFR) o la timidina quinasa, y un ADN que codifica la
clorotoxina o un polipéptido derivado de la clorotoxina. Si se
emplea el gen DHFR de tipo salvaje es preferible seleccionar una
célula hospedante que sea deficiente en DHFR, permitiendo con ello
el uso de la secuencia codificadora de DHFR como marcador para una
transfección satisfactoria en medio hgt, que carece de hipoxantina,
glicina y timidina.
Dependiendo del sistema de expresión y del
hospedante seleccionados, la clorotoxina o el polipéptido derivado
de la clorotoxina se producen cultivando las células hospedantes
transformadas por una construcción de ADN exógena o heteróloga,
como un vector de expresión descrito anteriormente, bajo condiciones
en las que se expresa el polipéptido. Entonces la clorotoxina o el
polipéptido derivado de la clorotoxina se aisla de las células
hospedantes y se purifica. Si el sistema de expresión segrega la
proteína o el péptido hacia el medio de crecimiento, la proteína
puede purificarse directamente a partir del medio exento de células.
La selección del las condiciones de crecimiento apropiadas y de los
métodos de recuperación brutos iniciales está dentro del
conocimiento de los expertos en la técnica.
Cuando se ha preparado o aislado una secuencia
codificadora de una clorotoxina o de un polipéptido de un fragmento
de la clorotoxina de la invención, puede clonarse en cualquier
vector apropiado y, por tanto, mantenerse en una composición de
células que está sustancialmente exenta de células que no contienen
ninguna secuencia codificadora de la clorotoxina. Como se describió
anteriormente, los expertos en la técnica conocen numerosos vectores
de clonación.
Las composiciones farmacéuticas en la presente
invención pueden administrarse por vía parenteral, subcutánea,
intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal,
intracraneal, transdérmica o bucal. Por ejemplo, un agente puede
administrarse de modo local a un tumor mediante microinfusión. Como
alternativa, o al mismo tiempo, la administración puede realizarse
por vía oral. La dosificación administrada dependerá de la edad, la
salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si
existe, la frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto
deseado.
Puesto que las necesidades de los individuos
varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades
eficaces de cada componente está dentro de la técnica. Las
dosificaciones de la clorotoxina y/o sus fragmentos de la presente
invención de forma típica comprenden de aproximadamente 1,0 ng/kg de
peso corporal a aproximadamente 0,13 mg/kg de peso corporal. En una
realización, las dosificaciones de la clorotoxina y/o sus fragmentos
comprenden de aproximadamente 1,0 ng/kg de peso corporal a
aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. En una realización
preferida, las dosificaciones para la administración sistémica
comprenden de aproximadamente 0,01 \mug/kg de peso corporal a
aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. En otra realización, la
dosificación de la clorotoxia y/o sus fragmentos comprende menos de
aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones más
preferidas para la administración sistémica comprenden de
aproximadamente 0,1 \mug/kg de peso corporal a aproximadamente
0,05 mg/kg de peso corporal. En otra realización preferida, la
dosificación de la clorotoxina y/o sus fragmentos comprende menos
de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones
más preferidas para la administración sistémica comprenden entre
aproximadamente 1,0 \mug/kg de peso corporal a aproximadamente
0,01 mg/kg de peso corporal. En otras realizaciones, la cantidad de
clorotoxina y/o sus fragmentos administrada es una cantidad eficaz
para lograr que la concentración de la clorotoxina y/o sus
fragmentos en el suero sea una concentración de aproximadamente
20,0, 10,0, 5,0, 2,50, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,156, 0,078, 0,039,
0,020, 0,010, 0,005, 0,003, 0,0015, 0,0008, 0,0003 ó 0,0001 nM. Las
dosificaciones preferidas para la administración directa a un sitio
mediante microinfusión comprenden de 1 ng/kg de peso corporal a 1
mg/kg de peso corporal.
Además de la clorotoxina y/o sus fragmentos, las
composiciones de la presente invención pueden contener vehículos
farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares
que faciliten el procesamiento de los compuestos activos para
producir preparaciones que puedan utilizarse farmacéuticamente para
ser administradas al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas
para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de
los compuestos activos en una forma soluble en agua, por ejemplo,
sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones
de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas
apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados
incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de sésamo o ésteres de
ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o
triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosas pueden
contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión e
incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y
dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener
estabilizantes. También pueden utilizarse liposomas para encapsular
el agente para la administración hacia la célula.
La formulación farmacéutica para la
administración sistémica según la invención puede formularse para la
administración entérica, parenteral o tópica. En efecto, estos tres
tipos de formulaciones pueden utilizarse simultáneamente para
lograr la administración sistémica del ingrediente activo.
Como se mencionó anteriormente, puede emplearse
la administración tópica. Puede utilizarse cualquier formulación
tópica habitual, como una disolución, una suspensión, un gel, un
ungüento o un bálsamo y similares. La preparación de estas
formulaciones tópicas se describen en la técnica de las
formulaciones farmacéuticas como se ejemplifica, por ejemplo, en
Gennaro et al. (1995), Remington's Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing. Para la aplicación tópica, las composiciones
también pueden administrarse como un polvo o un pulverizado, en
particular en forma de aerosol. En algunas realizaciones, las
composiciones de esta invención pueden administrarse mediante
inhalación. Para la terapia con inhalación, los ingredientes
activos pueden estar en una disolución útil para la administración
mediante inhaladores dosimétricos o en una forma adecuada para un
inhalador de polvo seco. En otra realización, las composiciones son
adecuadas para la administración mediante lavado bronquial.
Las formulaciones adecuadas para la
administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda,
píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos revestidos, elixires,
suspensiones, jarabes o inhalaciones y sus formas de liberación
controlada.
Tal como se emplea en la presente, la expresión
"clorotoxina o su fragmento" también incluye sus sales
farmacéuticamente aceptables, solvatos, hidratos, clatratos,
polimorfos y profármacos. Según la invención, las estructuras
químicas mostradas en la presente y, por tanto, los polipéptidos
útiles en la invención, incluyen todos los correspondientes
enantiómeros y estereoisómeros, es decir, la forma
estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura,
enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) y las mezclas
enantioméricas y estereoisoméricas. Las mezclas enantioméricas y
estereoisoméricas pueden resolverse en sus enantiómeros o
estereoisómeros componentes mediante métodos muy conocidos, como
cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta
resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un
complejo de sal quiral, o cristalización del compuesto en un
disolvente quiral.
Los enantiómeros y los estereoisómeros también
pueden obtenerse a partir de intermedios, reactivos y catalizadores
estereomérica o enantioméricamente puros mediante métodos sintéticos
asimétricos muy conocidos.
La invención incluye la clorotoxina, sus
fragmentos o sus sales farmacéuticamente aceptables, solvatos,
hidratos, clatratos, polimorfos y profármacos, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "farmacéuticamente
aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del
gobierno federal o estatal, o listado en la farmacopea de EEUU u
otra farmacopea reconocida de modo general para su uso en animales,
y más en concreto en seres humanos. El término "vehículo" se
refiere a un diluyente, un adyuvante, un excipiente o un vehículo
con el que se administra un compuesto de la invención. Estos
vehículos farmacéuticos pueden ser, por ejemplo, líquidos, como agua
y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o
sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite
mineral, aceite de sésamo y similares. Los vehículos farmacéuticos
pueden ser disolución salina, metilcelulosa, goma arábiga,
gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea
y similares. Además pueden utilizarse agentes auxiliares,
estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Cuando se
administran a un paciente, las composiciones de la invención y los
vehículos farmacéuticamente aceptables son preferiblemente
estériles. El agua es un vehículo preferido cuando la composición de
la invención se administra por vía intravenosa. Las disoluciones
salinas y las disoluciones de dextrosa y glicerol acuosas también
pueden emplearse como vehículos líquidos, en particular para
disoluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados
también incluyen excipientes, como almidón, glucosa, lactosa,
sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice,
estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de
sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua,
etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea,
también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o
emulsionantes, o agentes tamponantes del pH.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "sal farmacéuticamente
aceptable" incluye, pero no se limita a sales de grupos ácidos o
básicos que pueden estar presentes en las composiciones. Los
polipéptidos incluidos en las presentes composiciones que son
básicos en la naturaleza son capaces de formar una amplia variedad
de sales con diversos ácidos inorgánicos y orgánicos. Los ácidos
que pueden utilizarse para preparar sales de adición de ácidos
farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos básicos son
aquellos que forman sales de adición de ácidos no tóxicas (es decir,
sales que contienen aniones farmacéuticamente aceptables)
incluyendo, pero sin limitarse a sales del ácido sulfúrico, cítrico,
maleico, acético, oxálico, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato,
nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato,
acetato, lactato, salicilato, citrato, citrato ácido, tartrato,
oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato,
maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato,
formiato, benzoato, glutamato, metansulfonato, etansulfonato,
bencensulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es
decir,
1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)).
Los polipéptidos incluidos en las composiciones utilizadas en los
métodos de la invención que son ácidas en la naturaleza son capaces
de formar sales básicas con diversos cationes farmacológicamente
aceptables. Los ejemplos de estas sales incluyen sales de metal
alcalino o de metal alcalinotérreo y, en particular, sales de
calcio, magnesio, sodio, litio, cinc, potasio y hierro.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "solvato farmacéuticamente
aceptable" significa un polipéptido de clorotoxina o su derivado
que además incluye una cantidad estequiométrica o no
estequiométrica de un disolvente unido mediante fuerzas
intermoleculares no covalentes. Los disolventes preferidos son
volátiles, no tóxicos y/o aceptables para la administración a seres
humanos en cantidades traza.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "hidrato farmacéuticamente
aceptable" significa un polipéptido de clorotoxina o su derivado
que además incluye una cantidad estequiométrica o no
estequiométrica de agua unida mediante fuerzas intermoleculares no
covalentes.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "clatrato farmacéuticamente
aceptable" significa un polipéptido de clorotoxina o su derivado
que está en forma de un látice cristalino que contiene espacios
(por ejemplo, canales) que tienen una molécula huésped (por ejemplo,
un disolvente o agua) atrapada en su interior.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "polimorfo farmacéuticamente
aceptable" significa un polipéptido de clorotoxina o su derivado
que existe en varias formas diferenciadas (por ejemplo, cristalina,
amorfa). La invención incluye todas estas formas. Los polimorfos
son, por definición, cristales de la misma molécula que tienen
diferentes propiedades físicas como resultado del orden de las
moléculas en el látice cristalino. Las diferencias en las
propiedades físicas que muestran los polimorfos afectan a
parámetros farmacéuticos como la estabilidad en la conservación, la
compresibilidad y la densidad (que es importante en la formulación
y la fabricación del producto), y las velocidades de disolución (que
es un factor importante para determinar la biodisponibilidad). Las
diferencias en la estabilidad pueden surgir de cambios en la
reactividad química (por ejemplo, una oxidación diferencial, de
manera que la forma de dosificación se decolora con más rapidez
cuando está formada por un polimorfo que cuando está formada por
otro polimorfo) o cambios mecánicos (por ejemplo, los comprimidos
se disgregan cuando se conservan a medida que un polimorfo
cinéticamente favorecido se convierte en un polimorfo más
termodinámicamente estable) o ambos (por ejemplo, los comprimidos
de un polimorfo son más susceptibles a la desintegración cuando la
humedad es alta). Como resultado de las diferencias de
solubilidad/disolución, en el caso extremo algunas transiciones
polimórficas pueden producir una falta de potencia o, en el otro
extremo, toxicidad. Además, las propiedades físicas del cristal
pueden ser importantes en el procesamiento: por ejemplo, un
polimorfo puede ser más proclive a formar solvatos o puede ser
difícil de filtrar y de eliminar sus impurezas mediante lavados (es
decir, la forma y la distribución del tamaño de las partículas
puede ser diferente entre un polimorfo con respecto a otro).
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "profármaco
farmacéuticamente aceptable" significa un derivado de un
compuesto que puede hidrolizarse, oxidarse o reaccionar de otro modo
bajo condiciones biológicas (in vitro o in vivo) para
proporcionar el compuesto. Los ejemplos de profármacos incluyen,
pero no se limitan a compuestos que comprenden restos
biohidrolizables, como análogos de amidas biohidrolizables, ésteres
biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos
biohidrolizables, ureidos biohidrolizables, y fosfatos
biohidrolizables. Otros ejemplos de profármacos incluyen compuestos
que comprenden oligonucleótidos, péptidos, lípidos, grupos
alifáticos y aromáticos, o restos NO, ONO, NO_{2} y ONO_{2}.
Los profármacos pueden prepararse de forma típica utilizando métodos
muy conocidos, como los descritos en Bungaard (19859, Design of
Prodrugs, Elselvier Press.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, las expresiones "amida
biohidrolizable", "éster biohidrolizable", "carbamato
biohidrolizable", "carbonato biohidrolizable", "ureido
biohidrolizable", o "fosfato biohidrolizable" significa una
amida, un éster, un carbamato, un carbonato, un ureido o un fosfato,
respectivamente, de un compuesto que: (1) no interfiere con la
actividad biológica del compuesto pero que puede conferir a ese
compuesto propiedades ventajosas in vivo, como captación,
duración de la acción, o aparición de la acción; o (2) es
biológicamente inactivo pero se convierte in vivo en el
compuesto biológicamente activo. Los ejemplos de ésteres
biohidrolizables incluyen, pero no se limitan a ésteres de alquilo
inferior, ésteres de aciloxialquilo inferior (como ésteres de
acetoxilmetilo, acetoxietilo, aminocarboniloximetilo,
pivaloiloximetilo y pivaloiloxietilo), ésteres de lactonilo (como
ésteres de ftalidilo y tioftalidilo), ésteres de
alcoxiaciloxialquilo inferior (como ésteres de
metoxicarboniloximetilo, etoxicarboniloxietilo e
isopropoxicarboniloxietilo), ésteres de alcoxialquilo, ésteres de
colina, y ésteres de acilaminoalquilo (como ésteres de
acetamidometilo). Los ejemplos de amidas biohidrolizables incluyen,
pero no se limitan a amidas de alquilo inferior, amidas de
aminoácidos, amidas de alcoxiacilo y amidas de
alquilaminoalquilcarbonilo. Los ejemplos de carbamatos
biohidrolizables incluyen, pero no se limitan a alquilaminas
inferiores, etilendiaminas sustituidas, aminoácidos,
hidroxialquilaminas, aminas heterocíclicas y heteroaromáticas, y
poliéteraminas.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "terapéuticamente eficaz"
se refiere a una cantidad de un polipéptido de la clorotoxina, o su
derivado o su sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato,
clatrato, polimorfo o profármaco, capaz de provocar una mejoría de
una enfermedad o trastorno, o al menos un síntoma discernible de
éstos. "Terapéuticamente eficaz" también se refiere a una
cantidad que produce una mejoría de al menos un parámetro físico
mensurable, no necesariamente discernible por el paciente. En otra
realización, la expresión "terapeúticamente eficaz" se refiere
a una cantidad que inhibe el avance de una enfermedad o trastorno,
de manera física (por ejemplo, la estabilización de un síntoma
discernible), fisiológica (por ejemplo, la estabilización de un
parámetro físico) o ambas. En otra realización, la expresión
"terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que produce
una aparición retrasada de una enfermedad o trastorno.
Tal como se emplea en la presente y a menos que
se indique lo contrario, la expresión "profilácticamente
eficaz" se refiere a una cantidad de un polipéptido de la
clorotoxina, o su derivado o su sal farmacéuticamente aceptable,
solvato, hidrato, clatrato, polimorfo o profármaco, que provoca una
reducción del riesgo de adquirir una enfermedad o un trastorno
concretos. En una realización, las composiciones se administran como
una medida preventiva a un animal, preferiblemente un ser humano,
que tenga una predisposición genética a un trastorno descrito en la
presente. En otra realización de la invención, las composiciones se
administran como una medida preventiva a un paciente que tenga una
predisposición no genética a un trastorno descrito en la presente.
Por consiguiente, las composiciones de la invención pueden
utilizarse para la prevención de una enfermedad o trastorno y al
mismo tiempo tratar otro.
La invención también incluye el uso de la
clorotoxina y de fragmentos de la clorotoxina marcados
isotópicamente que tienen uno o más átomos reemplazados por un
átomo que tiene una masa atómica o un número másico diferente de la
masa atómica o del número másico que normalmente se encuentra en la
naturaleza, o uno o más de estos átomos están unidos a los
derivados de la clorotoxina. Los ejemplos de isótopos que pueden
incorporarse incluyen, pero no se limitan a isótopos del hidrógeno,
carbono, fósforo, yodo, renio, indio, itrio, tecnecio y lutecio (es
decir, que incluyen, pero no se limitan a ^{3}H, ^{14}C,
^{31}P, ^{32}P, ^{35}S, ^{131}I, ^{125}I, ^{123}I,
^{187}Re, ^{64}Cu, ^{111}In, ^{90}Y, ^{99m}Tc,
^{177}Lu), otros isótopos de estos elementos y otros isótopos
conocidos en la técnica. La clorotoxina, los fragmentos de la
clorotoxina, sus profármacos y las sales farmacéuticamente
aceptables marcados que contienen los isótopos mencionados
anteriormente y/u otros isótopos de otros átomos pueden utilizarse
para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades
mieloproliferativas o linfoproliferativas. Los isótopos tritio y
carbono-14 son particularmente preferidos por su
facilidad de preparación y su detectabilidad. Además, una
sustitución por isótopos más pesados, como el deuterio, puede
producir ciertas ventajas terapéuticas que surgen de su mayor
estabilidad metabólica, por ejemplo una mayor semivida in
vivo o unos requerimientos de dosificación menores y, por tanto,
pueden preferirse en algunas circunstancias.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando la presente invención se refiere al
tratamiento, un agente citotóxico se une a la clorotoxina. Los
ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a
gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína
antivírica de la hierba carmín, toxina de la difteria, proteínas del
complemento o cualquier otro agente conocido en la técnica que sea
capaz de matar una célula tras ponerse en contacto con dicha
célula.
Cuando la presente invención se refiere al
diagnóstico, la clorotoxina puede estar unida al menos a un segundo
polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido
incluye un dominio de unión que se une específicamente a un epitopo
expresado sólo sobre células mieloides y/o linfoides que muestran un
crecimiento anómalo (es decir, células de cáncer). Estos dominios
de unión tienen una secuencia de aminoácidos capaz de unirse o de
asociarse específicamente de otro modo con una célula mieloide y/o
linfoide que muestre un crecimiento anómalo (por ejemplo, células
de cáncer benigno y maligno). En algunas realizaciones, el dominio
de unión es un anticuerpo, mientras que en otras realizaciones es
un ligando que se une específicamente con un receptor expresado sólo
sobre estas células. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no
se limitan a anticuerpos que se unen específicamente a células B o
a células T. Los ejemplos de ligandos de receptores incluyen, pero
no se limitan a citoquinas y factores del crecimiento, incluyendo
el factor del crecimiento epidérmico.
El segundo polipéptido también puede incluir un
dominio de estabilización que aumente la semivida in vitro e
in vivo del polipéptido de fusión. Tal como se emplea en la
presente, la expresión "dominio de estabilización" se refiere
a una secuencia de aminoácidos capaz de extender la semivida in
vitro e in vivo de la cldorotoxina o de un derivado de
la clorotoxina cuando se compara con la clorotoxina sola. El dominio
de estabilización puede comprender proteínas humanas (por ejemplo,
de longitud completa o truncadas, proteínas solubles de fragmentos
extracelulares, etc.), como la albúmina de suero humana u otras
proteínas que estabilizan la semivida in vivo e in
vitro de la clorotoxina o de un derivado de la clorotoxina.
Estos dominios funcionales adicionales pueden actúar ellos mismos
como péptidos conectores, por ejemplo para unir un dominio de unión
a una célula de cáncer con la clorotoxina o con el derivado de la
clorotoxina. Como alternativa, pueden colocarse en otra parte de la
molécula de fusión (por ejemplo, en su extremo amino- o
carboxi-terminal). En realizaciones alternativas,
el dominio de estabilización es un resto químico (por ejemplo, PEG
(polietilenglicol) o un dextrano).
El término "fusionado" o la expresión
"polipéptido de fusión", tal como se emplean en la presente, se
refieren a polipéptidos en que: (i) un dominio funcional dado (es
decir, un dominio de unión a células de cáncer) está unido en su
extremo carboxi-terminal mediante un enlace
covalente al extremo amino-terminal de otro dominio
funcional (es decir, un componente de la albúmina del suero humana)
o a un péptido conector que en sí mismo está unido mediante un
enlace covalente con el extremo amino-terminal de la
clorotoxina o del derivado de la clorotoxina; o (ii) un dominio
funcional dado (es decir, un dominio de unión a la clorotoxina) está
unido en su extremo amino-terminal mediante un
enlace covalente al extremo carboxi-terminal de otro
dominio funcional (es decir, un componente de la albúmina del suero
humana) o a un péptido conector que en sí mismo está unido mediante
un enlace covalente con el extremo carboxi-terminal
de la clorotoxina o del derivado de la clorotoxina.
De forma similar, "condensado" cuando se
emplea en conexión con los intermedios de ácidos nucleicos significa
que el extremo 3'- o 5'-terminal de una secuencia
de nucleótidos que codifica un primer dominio funcional está unido
al respectivo extremo 3'- o 5'-terminal de una
secuencia de nucleótidos que codifica un segundo dominio funcional,
mediante un enlace covalente o de modo indirecto mediante un
conector peptídico que, en sí mismo, está unido covalentemente
preferiblemente en sus extremos terminales con el polinucleótido que
codifica el primer dominio funcional y, opcionalmente, un ácido
nucleico que codifica el segundo dominio funcional.
Los ejemplos de polipéptidos de fusión puede ser
representados por las siguientes fórmulas, pero no se limitan a
éstas:
- R1-L-R2
- (i)
- R2-L-R1
- (ii)
- R1-L-R2-L-R1
- (iii)
- R1-L-R1-L-R2
- (iv)
- R2-L-R1-L-R1
- (iv)
en las que R1 es la secuencia de aminoácidos de
un dominio que se une específicamente a una célula de cáncer
mieloide y/o linfoide o es un dominio de transporte, por ejemplo un
dominio que permite la entrada del polipéptido a través de la
barrera hematoencefálica, R2 es la secuencia de aminoácidos de un
dominio de estabilización (por ejemplo, albúmina de suero humana),
cada L es una clorotoxina o un derivado de la clorotoxina que está
unido mediante un enlace covalente a un extremo terminal de R1 y/o
R2, por lo cual los fragmentos de moléculas anteriores se leen de
manera direccional (es decir, la parte de la izquierda se
corresponde con el amino-terminal y la parte de la
derecha con el carboxi-terminal de la molécula).
\vskip1.000000\baselineskip
En la práctica del diagnóstico según esta
invención, la clorotoxina y/o sus derivados pueden utilizarse por
sí solos o en combinación con otros ingredientes inactivos. Como se
analizó anteriormente, la presente invención incluye composiciones
y métodos en los que un marcador está unido a la clorotoxina o su
derivado. Por tanto, la invención incluye la administración de la
clorotoxina marcada o su derivado marcado para el diagnóstico de
una enfermedad asociada con el crecimiento anómalo de células
mieloides o linfoides, incluyendo el cáncer.
La invención puede utilizarse in vivo,
normalmente en mamíferos, como seres humanos, ovejas, caballos,
cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro. La
invención es particularmente útil en el diagnóstico de sujetos
humanos.
Sin más descripción, se cree que los expertos en
la técnica, utilizando la anterior descripción y los siguientes
ejemplos ilustrativos, pueden fabricar y utilizar los compuestos de
la presente invención y practicar los métodos reivindicados. Los
siguientes ejemplos de trabajo describen realizaciones de la
presente invención, y no deben considerarse limitantes de ninguna
manera del resto de la descripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron células Raji (Epstein et
al. (1966), J. Natl. Cancer Inst., 37, 547-559)
y Daudi (Klein et al. (1968), Cancer Res., 28,
1300-1310) no fijadas o fijadas con glutaraldehído
al 1%. La línea celular Raji (ATCC CCL-86) es una
línea celular de linfocitos B derivada de un linfoma de Burkitt de
un niño de once años de raza negra. La línea celular Daudi (ATCC
CCL-213) es una línea celular de linfoblastos B
derivada de un adolescente de dieciséis años de raza negra. Las
células se incubaron con clorotoxina o con el péptido del dominio
de unión designado (SEQ ID NO:8 ó 10), se lavaron y después se
incubaron con estreptavidina-fluoresceína
(strp-FL). Tras otro lavado, las células se
analizaron utilizando un analizador FACS y se determinó el
porcentaje de células con tinción positiva (figura 1). Los
controles incluyeron células no tratadas, células incubadas sólo
con estreptavidina-fluoresceína, y células incubadas
con péptido negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron células Molt-4
(Minowada et al. (1972), J. Natl. Cancer Inst., 49,
891-895) no fijadas o fijadas con glutaraldehído al
1%. La línea celular Molt-4 es una línea celular de
linfoblastos T derivada de un paciente en recaída. Las células se
incubaron con clorotoxina o con el péptido del dominio de unión
designado (SEQ ID NO:8 ó 10), se lavaron y después se incubaron con
estreptavidina-fluoresceína
(strp-FL). Tras otro lavado, las células se
analizaron utilizando un analizador FACS y se determinó el
porcentaje de células con tinción positiva (figura 2). Los
controles incluyeron células no tratadas, células incubadas sólo
con estreptavidina-fluoresceína, y células incubadas
con péptido negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se optimizó un método de cultivo de tejidos para
ensayar los efectos de la clorotoxina (TM-601) en
presencia o en ausencia de doxorrubicina en líneas celulares Raji
(figura 3) y Daudi (figura 4). Las células se cultivaron en placas
de cultivo de tejidos de microvaloración de 96 pocillos a una
densidad de aproximadamente 1000-2000 células por
pocillo, dependiendo de la línea celular específica. Se dejó que las
células se adhirieran durante 24 horas en un incubador de cultivos
celulares humidificado a 37ºC suministrado con dióxido de carbono al
5%. Para lograr una curva de dosis-respuesta para
cada fármaco en cada línea celular, las células se trataron con
concentraciones decrecientes de doxorrubicina durante dos a cinco
días. Tras el tratamiento, se cuantificó el efecto citotóxico de la
doxorrubicina utilizando el kit de recuento de
células-8 ("Cell Counting
Kit-8", CCK-8) (Dojindo Inc.)
según las instrucciones del fabricante. Brevemente, tras el periodo
de tratamiento con doxorrubicina, las células se incubaron con
reactivo CCK-8 y se incubaron a 37ºC durante una a
cuatro horas, dependiendo del tipo celular específico. Después de
la incubación, las placas se leyeron con un lector de microplacas a
una longitud de onda de 490 nm.
<110> Vernon, et al.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Diagnóstico y Tratamiento de
Cánceres de Células Mieloides y Linfoides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2006636-0079
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US2005/011523
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-04-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/559.433
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de la clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante de la clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante de la clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derivado de la clorotoxina: residuos
de aminoácidos 23-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo para derivados de la
clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa puede ser Asp o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> variante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Ala, Arg, Asn, Asp,
Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp,
Tyr, Val o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa puede ser Asn o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa puede ser Ser, Thr, o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa puede ser His, lys o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Chlorotoxin derivatives
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
hebraeus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derivado de la clorotoxina: residuos
de aminoácidos 8-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alfa péptido de clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante del alfa péptido de
clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de péptido de
clorotoxina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> derivado de la clorotoxina
STP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 8a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 8b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 8c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 21b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 21c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido 21d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencias del péptido
21a-A9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mesobuthus tamulus
sindicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Num. de Acceso a GenBank P15229,
toxina pequeña
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm34
Claims (20)
1. Una composición que comprende una clorotoxina
(SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos
KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para su uso en el diagnóstico de un trastorno
linfoproliferativo o mieloproliferativo en un mamífero, en la que
la composición se administra al mamífero, y la detección de la unión
de la composición en el mamífero indica la presencia de un
trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo en el
mamífero.
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que la clorotoxina o su fragmento está unido a un segundo
polipéptido.
3. La composición de la reivindicación 2, en la
que el segundo polipéptido es un anticuerpo o su fragmento que se
une específicamente con un epitopo expresado sólo por una célula de
cáncer mieloide o linfoide.
4. La composición de la reivindicación 2, en la
que el segundo polipéptido se selecciona del grupo que consiste en
polihistidina y albúmina de suero humana.
5. Una composición que comprende una clorotoxina
(SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos
KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para su uso en el tratamiento de un trastorno
linfoproliferativo o mieloproliferativo en un mamífero, en la que
la clorotoxina o su fragmento está unido a un agente citotóxico.
6. La composición de la reivindicación 5, en la
que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en
gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína
antivírica de la hierba carmín, toxina de la difteria y proteínas
del complemento.
7. La composición de la reivindicación 5 o de la
reivindicación 6, en la que el mamífero es un ser humano y en la
que la cantidad de clorotoxina administrable comprende entre 0,01
\mug/kg de peso corporal y 2,0 mg/kg de peso corporal.
8. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el trastorno
linfoproliferativo es un linfoma no hodgkiniano.
9. La composición de la reivindicación 8, en la
que el linfoma no hodgkiniano es un neoplasma de células B o un
neoplasma de células T.
10. La composición de la reivindicación 9, en la
que el neoplasma de células B es un linfoma/leucemia linfoblástica
de precursores de células B o un neoplasma de células B maduras.
11. La composición de la reivindicación 10, en
la que el neoplasma de células B maduras se selecciona del grupo
que consiste en linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica
crónica de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma
linfoplasmacítico, linfoma de células B de la zona marginal
esplénica, leucemia de células pilosas, linfoma de células B de la
zona marginal extranodal, linfoma de células del manto, linfoma
folicular, linfoma de la zona marginal nodal, linfoma de células B
grandes difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, y mieloma de
células plasmáticas.
12. La composición de la reivindicación 9, en la
que el neoplasma de células T se selecciona del grupo que consiste
en leucemia prolinfocítica de células T, leucemia linfocítica de
células T grandes granulares, leucemia de células NK, linfoma de
células NK/T extranodal, micosis fungoides, linfoma de células
grandes anaplásico cutáneo primario, linfoma de células T de tipo
panniculitis subcutáneo, linfoma de células T intestinal de tipo
enteropático, linfoma de células T gamma-delta
hepatoesplénico, linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma
de células T periféricas, linfoma de células grandes anaplásico, y
linfoma de células T adultas.
13. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el mamífero es un ser
humano.
14. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el trastorno
mieloproliferativo se selecciona del grupo que consiste en
policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (ET), metaplasia
mieloide agnogénica (AMM), también denominada mielofibrosis
idiopática (IMF), y leucemia mielógena crónica (CML).
15. La composición de la reivindicación 1, en la
que la clorotoxina o su fragmento están marcados.
16. La composición de la reivindicación 15, en
la que el marcador es ^{131}I.
17. Un método para detectar la presencia de un
trastorno linfoproliferativo o mieloproliferativo en un mamífero,
que comprende:
(a) poner en contacto una muestra biológica
aislada a partir del mamífero, con una composición que comprende
una clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la secuencia
de aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), y
(b) detectar la unión de la composición a la
muestra, en el que la unión indica la presencia de un trastorno
linfoproliferativo o mieloproliferativo en el mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
18. El método de la reivindicación 17,
modificado por las características de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, y 8 a 16.
19. El uso de una composición que comprende una
clorotoxina (SEQ ID NO:1) o su fragmento que tiene la secuencia de
aminoácidos KGRGKSY (SEQ ID NO:8), para la fabricación de un
medicamento para tratar un trastorno linfoproliferativo o
mieloproliferativo en un mamífero, en la que la clorotoxina o su
fragmento está unido a un agente citotóxico.
20. El uso de la reivindicación 19, modificado
por las características de una cualquiera de las reivindicaciones 6
a 14.
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