ES2339752T3 - Metodo para inducir una respuesta inmune selectivamente suprimida. - Google Patents

Abstract

Método para tratar una cantidad extracorpórea de sangre de un donante de médula ósea o de células troncales, siendo dicho método ejecutado con vistas a suprimir selectivamente la respuesta inmunológica de dicho futuro donante antes de trasplantar la médula ósea o las células troncales de dicho donante al futuro receptor, comprendiendo dicho método los pasos de (a) tratar una cantidad extracorpórea de sangre del donante para inducir al menos uno de los miembros del grupo que consta de la apoptosis o la necrosis de las células T que están presentes en la cantidad extracorpórea de sangre, estando dichas células T presentes en dicha cantidad extracorpórea de sangre como una respuesta inmunológica de dicho donante a la piel sacada de cada uno de los progenitores biológicos del futuro receptor y aloinjertada al donante de dicha médula ósea o de dichas células troncales; (b) tratar la cantidad extracorpórea de sangre del donante haciendo que la sangre fluya a través de un aparato que tiene conductos de plástico; (c) incubar la cantidad extracorpórea de sangre.

Description

Método para inducir una respuesta inmune selectivamente suprimida.

Ámbito de la invención

La presente invención está dirigida a los métodos que reducen la probabilidad de enfermedad de injerto contra huésped en los receptores de trasplantes de médula ósea/células troncales, y que implican el procedimiento de Transinmunización que es llevado a cabo en el donante y redunda en que se hace al donante tolerante a toda la gama de antígenos de histocompatibilidad que pueden caracterizar a los tejidos del receptor.

Antecedentes de la invención

A fin de incrementar la seguridad y la eficacia de los trasplantes de tejidos u órganos o de determinar y permitir una mejorada valoración de la inmunoterapia anticáncer, pueden ponerse aloinjertos de piel en un futuro receptor de trasplante de órgano, donde los aloinjertos de piel inducen una simulación del rechazo inmune del trasplante de órgano planificado que normalmente se produce cuando los individuos reciben órganos o tejidos trasplantados, tales como médula ósea o células troncales, de individuos genéticamente diferentes. Este rechazo simulado en la piel, seguido de un proceso al que aquí se denomina Transinmunización, permite que el sistema inmune del receptor quede entrenado para aceptar tejido del futuro donante. Cuando células dendríticas con carga tumoral, que simulan células tumorales antigénicas, son introducidas en la dermis del paciente de cáncer para inducir respuestas locales de las células T antitumorales, esto permite la determinación y la valoración terapéutica del nivel de inmunidad antitumoral inducida por la Transinmunización.

En la situación del trasplante, se usa piel aloinjertada en conjunción con un procedimiento al que se denomina Transinmunización para prolongar la supervivencia en los receptores de órganos o tejidos trasplantados tales como médula ósea, células troncales o piel donados por individuos genéticamente distintos. La Transinmunización es un proceso con el cual se induce a los monocitos de la sangre a diferenciarse en células dendríticas, y las células dentríticas inducidas pueden ser luego cargadas con antígenos tisulares. En ciertas circunstancias en las cuales los antígenos son distintivos de cánceres, las células dendríticas cargadas pueden ser usadas para "vacunar" o inmunizar al paciente contra las células de cáncer. En otras situaciones en las cuales el paciente es el futuro receptor de un órgano trasplantado, las células dendríticas cargadas pueden ser usadas para suprimir las reacciones inmunológicas que de otro modo serían capaces de ocasionar un rechazo del órgano trasplantado.

Las células dendríticas fagocitan las células T antiinjerto de un potencial receptor de un trasplante. Estas células T antiinjerto son inducidas en el futuro receptor del trasplante como resultado de un aloinjerto de piel del potencial donante del trasplante. Puesto que la piel aloinjertada contiene los mismos antígenos de trasplante que tipifican al potencial órgano trasplantado, las células T antiinjerto inducidas por el pequeño aloinjerto de piel son precisamente las que serían inducidas de manera natural por el propio trasplante de órgano. Las células dendríticas, cargadas con antígenos de las células T antiinjerto, son infundidas en el potencial receptor del trasplante, conduciendo a una respuesta inmunológica que suprime la actividad de las células T antiinjerto. Esta respuesta inmunológica a los clones de las células T inducidas puede reducir la capacidad de las células T antiinjerto en el receptor del trasplante de órgano para atacar y dañar al órgano trasplantado. Debido a su pequeño tamaño y a lo sencillo que es su trasplante, antes del trasplante del futuro órgano de mayor tamaño pueden ponerse adicionales aloinjertos de piel para determinar cuándo el paciente ha sido correctamente preparado para recibir el futuro órgano. Cuando el pequeño aloinjerto de piel trasplantado es inmunológicamente tolerado (no es objeto de un rechazo agudo) por el futuro receptor del órgano, el paciente habrá sido eficazmente preparado para recibir el trasplante de órgano planificado.

Para acrecentar la tolerancia inmunológica del receptor al órgano trasplantado, pueden aportarse células apoptóticas o necróticas del donante a las células dendríticas inmaduras del receptor. Las células dendríticas inmaduras, que presentan en su superficie antígenos distintivos de los tejidos del donante, son capaces de suprimir la actividad de todos los clones de células T antialoinjerto. Por consiguiente, el aportar células (como p. ej. leucocitos o células cultivadas de cualquier tipo) del donante a las células dendríticas inmaduras del receptor y luego reinfundir esas células dendríticas inmaduras cargadas de antígenos puede contribuir en gran medida a la tolerancia inmunológica del aloinjerto. Esta variante de la Transinmunización puede usarse independientemente del método de carga con células T anteriormente descrito o bien en conjunción con el mismo.

El trasplante de órganos, tejidos o células de una persona genéticamente distinta (donante) a otra (receptor) es obstaculizado por el rechazo inmunológico del receptor a los órganos o células donados. Se entiende que este fenómeno de rechazo implica a mecanismos tanto celulares como humorales, que son respectivamente mediados por células T y anticuerpos. El sistema inmune del receptor apunta a los antígenos de histocompatibilidad distintivos en las células trasplantadas. Excepto en casos raros, los antígenos de histocompatibilidad del donante no coincidirán exactamente con los antígenos de histocompatibilidad del receptor, y el sistema inmune del receptor ataca a los órganos o células del donante incompatible.

Con respecto al rechazo mediado inmunológicamente, los más potentes de los antígenos de histocompatibilidad son los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) que son conocidos como los antígenos de los leucocitos humanos HLA-A, HLA-B y HLA-C. A pesar de haber sido originalmente definidos por su presencia en las membranas celulares de los leucocitos humanos, hace mucho tiempo que se ha reconocido que dichos antígenos están presentes en virtualmente todas las células nucleadas del cuerpo humano. Puesto que cada persona recibe genes que codifican un conjunto de los antígenos de cada progenitor, las células humanas típicamente expresan seis antígenos HLA mayores. Además de los antígenos mayores de histocompatibilidad, hay varios antígenos menores de histocompatibilidad.

Al proceder a trasplantar tejidos o células, es deseable igualar en la máxima medida posible los antígenos de histocompatibilidad del donante y del receptor. La mejor coincidencia inmunológica entre donante y receptor es la que se da entre los gemelos idénticos, puesto que los mismos comparten los mismos seis antígenos HLA mayores. Por añadidura, los gemelos idénticos también comparten los mismos antígenos menores de histocompatibilidad, y por consiguiente los órganos o células trasplantados de un gemelo idéntico al otro son tolerados inmunológicamente. En la situación mucho más común en la cual el donante y el receptor no son genéticamente idénticos, regularmente se da un cierto nivel de rechazo inmunológico del tejido trasplantado. Para minimizar este rechazo y permitir la supervivencia del tejido injertado, se hacen rutinariamente esfuerzos para hallar la mejor coincidencia entre donante y receptor. Si no está disponible un gemelo idéntico, la siguiente mejor elección es típicamente un hermano no idéntico del receptor que comparta los mismos seis antígenos HLA mayores, la cual es una situación que se da por término medio en uno de cada cuatro hermanos. Tal coincidencia de seis de seis HLA entre hermanos es preferible a una coincidencia de seis de seis entre individuos no emparentados, porque los hermanos coincidentes también más probablemente compartirán al menos algunos antígenos menores de histocompatibilidad heredados de sus progenitores comunes. Sin embargo, debido al hecho de no ser hermanos idénticos, hay una alta probabilidad de cierta diferencia en los antígenos menores de histocompatibilidad, y el donante y el receptor serán casi con certeza lo suficientemente distintos en términos de los antígenos celulares como para que se produzca un cierto nivel de rechazo a continuación de un trasplante de tejido de un hermano a otro.

Las reacciones adversas que siguen al trasplante de un órgano o tejido de un individuo genéticamente distinto a otro pueden ser profundamente peligrosas. La reacción adversa primaria es el rechazo inmunológico del órgano o tejido trasplantado. Si el órgano es sustentador de la vida, tal como un corazón, hígado o pulmón, la destrucción de ese órgano puede conducir directamente a la muerte del paciente. En otras circunstancias, tales como el rechazo de riñones o células de los islotes pancreáticos productores de insulina, la calidad de vida del receptor puede verse devastada por el rechazo del tejido. A fin de prevenir o limitar el rechazo, los pacientes típicamente reciben una combinación de fármacos inmunosupresores, los cuales introducen sus propios efectos secundarios importantes. Estos fármacos son de ordinario globalmente inmunosupresores, incrementando con ello en gran medida la susceptibilidad del receptor a serias infecciones, a menudo ocasionadas por organismos contra los cuales un sistema inmune no comprometido se defendería con facilidad. Los fármacos inmunosupresores individuales tienen cada uno su propio conjunto de otros efectos adversos, especialmente cuando son usados a razón de las dosificaciones que son necesarias para inhibir el rechazo de los órganos trasplantados. Por ejemplo, las altas dosis de prednisona precipitan la diabetes mellitus y la hipertensión, ocasionando simultáneamente una desmineralización de los huesos de soporte. Otro fármaco inmunosupresor comúnmente usado, que es la ciclosporina A, tiene importantes efectos tóxicos en el riñón. Los tratamientos globalmente inmunosupresores también incrementan la susceptibilidad de los receptores de trasplantes a padecer infecciones oportunistas, contra las cuales los individuos normales tienen fuertes defensas.

Estos efectos adversos han estimulado la búsqueda de terapias que puedan suprimir más selectivamente el rechazo del tejido trasplantado, dejando al mismo tiempo intacto al resto del sistema inmune y no lesionando otros órganos importantes. Un enfoque especialmente prometedor ha sido el uso de un dispositivo de Fotoféresis convencional para administrar la inmunoterapia a la que aquí se denomina "Transinmunización" para prevenir o revertir el rechazo de los órganos trasplantados. En dependencia de las circunstancias, el impacto terapéutico de la Transinmunización puede ser acrecentado realizando a continuación del paso de Fotoféresis convencional una fase de incubación durante la noche antes de devolver las células tratadas al paciente. La Transinmunización puede ser llevada a cabo usando un aparato de Fotoféresis, si bien la Transinmunización puede también ser llevada a cabo sin el uso de un aparato de Fotoféresis, usando otra metodología.

Una prueba controlada que comparaba la Fotoféresis convencional más inmunosupresión convencional con la inmunosupresión convencional en solitario en la prevención del rechazo de corazones trasplantados fue recientemente publicada por Barr et al., Photopheresis for the prevention of rejection in cardiac transplantation, New England Journal of Medicine, Vol. 339, Nº 4, 1744-51, 10 diciembre 1998. Ese estudio reveló que la adición de Fotoféresis al régimen inmunosupresor convencional muy significativamente y en condiciones de seguridad reducía el número de episodios de rechazo, disminuyendo con ello marcadamente la necesidad de una peligrosa elevación de los niveles de fármacos inmunosupresores convencionales tóxicos. Análogamente, en Greinix et al., Successful use of extracorporeal photochemotherapy in the treatment of severe acute and chronic graft-versus-host disease, Blood, Vol. 92, Nº 9, 3098-3104, 1998, y en Greinix et al., Extracorporeal photochemotherapy in the treatment of severe steroid-refractory acute graft-versus-host disease, Blood; a pilot study, Vol. 96, Nº 7, 2426-31, 2000, los autores describen pruebas que revelaron que la Fotoféresis fue particularmente eficaz revertiendo los efectos adversos (conocidos como enfermedad de injerto contra huésped o GVHD) que siguen al trasplante de médula ósea o de células troncales.

Ha sido recientemente descifrado un mecanismo que está implicado en la eficacia de la Fotoféresis. El sistema de exposición ultravioleta en plástico plano, que es un componente del aparato de Fotoféresis, puede ocasionar la transformación de los monocitos de la sangre en células que presenten antígenos dendríticos (células dendríticas) como resultado de las fuerzas impuestas a los monocitos al fluir los mismos por sobre la superficie de plástico en un aparato de Fotoféresis convencional. Puesto que los beneficios terapéuticos que redundan del uso de estas células dendríticas son ocasionados por la transferencia de antígenos tisulares a células dendríticas capaces de producir la inmunización del paciente contra estos antígenos, la inmunoterapia se denomina aquí "Transinmunización". Por consiguiente, la Transinmunización es un tratamiento que, en una realización, puede ser llevado a cabo con un aparato de Fotoféresis. Como alternativa, el tratamiento de Transinmunización puede ser llevado a cabo usando cualquier otro dispositivo apropiado que tenga conductos de plástico que puedan inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas. Una diferencia importante entre la Transinmunización que aquí se describe y la Fotoféresis convencional es la constatación de que la mejor manera de aportar los necesarios antígenos tisulares a las nuevas células dendríticas es la de hacerlo mediante incubación ex vivo durante la noche, antes de devolver al paciente las células dendríticas antígenas cargadas.

En la Fotoféresis, un agente fotoactivable, tal como 8-metoxipsoraleno (8-MOP) es activado mediante exposición a radiación ultravioleta A (UVA) en la sangre puesta en circulación extracorpóreamente, haciendo que el 8-MOP forme fotoaductos con bases de pirimidina de proteínas citoplasmáticas con contenido de DNA y tirosina. Las secuelas clínicas positivas ocasionadas por la Fotoféresis resultan de la respuesta inmunológica del paciente a la sangre tratada reinfundida. La respuesta inmune resultante puede, en la mejor respuesta, conducir a la supresión o incluso a la eliminación selectiva del clon patogénico o de los clones patogénicos.

Como se ha manifestado anteriormente, más recientemente se ha descubierto que el paso de la sangre a través de la cámara de exposición ultravioleta de plástico del dispositivo de Fotoféresis puede estimular la conversión de los monocitos de la sangre en células dendríticas presentadoras de antígenos (DC) que son los más potentes iniciadores de las reacciones inmunes celulares. Los linfocitos lesionados causantes de enfermedad (ya sean leucocitos malignos circulantes o bien poblaciones expandidas de células T autorreactivas) pueden ser ingeridos por las DC de nueva formación, las cuales entonces procesan y presentan los antígenos distintivos de los leucocitos patogénicos a un sistema inmune responsivo. Las respuestas de las CD8 (y probablemente también de las CD4) a las células T que son ocasionadas o acrecentadas por este tratamiento pueden ser a menudo mantenidas por espacio de largos periodos de tiempo. El proceso ha sido usado para maximizar la ingestión de células T patogénicas apoptóticas por parte de las DC de nueva formación.

Además, es sabido que la incubación durante la noche a continuación de ECP favorece el desarrollo de DC presentadoras de antígenos (Véase Berger et al., "Induction of Human Tumor-Loaded Dendritic Cells", Int. J. Cancer: 91, 438-447-BK7 (2001)).

Estudios llevados a cabo en un modelo experimental de Fotoféresis convencional revelaron la capacidad de ese tratamiento para suprimir selectivamente el rechazo del tejido trasplantado. Específicamente, cuando se trasplantó piel de un ratón negro donante a un ratón blanco genéticamente distinto por completo, la piel trasplantada fue completamente rechazada en 14 días. Esto ya se preveía, puesto que los ratones donante y receptor se diferenciaban en cuanto a los antígenos de histocompatibilidad a un nivel equivalente a una discordancia de seis de seis en los humanos, y puesto que la piel es el órgano sólido más inmunogénico. A continuación del rechazo de la piel trasplantada, el ratón receptor fue sacrificado y se hizo con su bazo, que contenía clones marcadamente expandidos de las células T que ocasionaron el rechazo, así como monocitos tisulares, una suspensión de células individuales. Luego, en un sistema ideado para imitar la fotoféresis convencional, las células T en suspensión fueron expuestas en una cápsula de Petri a 8-MOP activado con UVA y fueron luego devueltas por vía intravenosa a un ratón genéticamente idéntico al receptor original, inmunizando con ello a este nuevo ratón contra los clones de las células T que estuvieron implicadas en el rechazo de la piel trasplantada.

Este nuevo ratón recibió entonces nuevos trasplantes de piel: uno de la misma cepa donante original y otro de una tercera cepa de ratón completamente no emparentada con cualquiera de las otras dos cepas. En lugar de ser rechazada en 14 días como antes, la piel trasplantada de la cepa donante original sobrevivió ahora manteniéndose intacta durante la totalidad de los 42 días del experimento. En contraste con ello, la piel simultáneamente trasplantada de la tercera cepa no emparentada fue rechazada en los 14 días. La supresión selectiva del rechazo del injerto de piel pudo ser transferida a otro conjunto de ratones genéticamente idénticos al receptor original, mediante transfusión de células T del receptor. Estos resultados demostraron que el modelo experimental de Fotoféresis condujo a la supresión específica del donante del rechazo de la piel trasplantada, y que esta supresión era mediada por las células T selectivamente supresivas inducidas por el procedimiento. Estos ensayos están descritos más en detalle en Yamane et al., Suppression of anti-skin-allograft response by photodamaged effector cells-the modulating effects of prednisone and cyclophophamide, Transplantation, Vol. 54, 119-124, Nº 1, julio 1992; Perez et al., Induction of a cell-transferable suppression of alloreactivity by photodamaged lymphocytes, Transplantation, Vol. 54, 896-903, Nº 5, noviembre 1992; y Perez et al., DNA associated with the cell membrane is involved in the inhibition of the skin rejection response induced by infusions of photodamaged alloreactive cells that mediate rejection of skin allograft, Photochemistry and Photobiology, Vol. 55, 839-849, Nº 6, 1992.

Paradójicamente, cuando el experimento fue alterado de forma tal que la cepa donante se diferenciaba de la cepa receptora solamente en antígenos menores de histocompatibilidad, la piel trasplantada podía mantenerse intacta en el receptor por espacio de tan sólo 21 días. Éste era un espacio de tiempo más largo que el que se daba en los controles no tratados, pero solamente la mitad de largo que cuando se trasplantó piel de la cepa completamente no emparentada a receptores preparados. A pesar de ser ello desconcertante en aquel momento, parece ser que cuanto más fuerte es la reacción que se suprime, tanto más eficaz es la supresión. Esto es probablemente debido a la sensibilidad preferencial de las células T de alta afinidad, que son más fácilmente generadas por las reacciones inmunes potentes, para ser suprimidas directamente por las DC inmaduras producidas en el procedimiento de Fotoféresis experimental. De manera importante, este descubrimiento sugiere que el proceso de Transinmunización que se describe a continuación puede ser sumamente eficaz para prevenir el rechazo de órganos trasplantados cuando el donante y el receptor son discordantes en uno o varios antígenos HLA. En consecuencia, la Transinmunización puede hacer que aumente espectacularmente la cantera de donantes de tejido trasplantable.

A los pacientes de cáncer a menudo se les prepara para los trasplantes de médula ósea/células troncales de individuos genéticamente distintos haciendo que primeramente reciban grandes dosis de quimioterapia para alcanzar dos objetivos: la disminución de la carga tumoral y el debilitamiento del sistema inmune para que las células trasplantadas no sean rápidamente rechazadas. Este nivel de preparación es en sí mismo amenazador para la vida, puesto que la propia médula ósea del paciente de cáncer es destruida en gran medida por la quimioterapia preparativa. Si las células trasplantadas no toman y en última instancia reconstituyen la médula ósea del paciente, el paciente sucumbirá a las infecciones, la anemia, la hemorragia, etc. Cuando el trasplante de médula ósea/células troncales sí reconstituye con éxito el sistema inmune del paciente, ese sistema inmune es repoblado por las células del donante. Estas células del donante reconocen entonces al tejido del receptor como foráneo y atacan (rechazan) los propios órganos del receptor en un proceso llamado enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Los órganos que son más prominentemente atacados en esta GVHD resultante son la piel (que puede caerse), el hígado (que puede fallar) y el tracto intestinal (que puede dejar de funcionar correctamente y entrar en hemorragia). La reversión o supresión de la GVHD para salvar la vida es muy difícil con los tratamientos convencionales, que son habitualmente muy tóxicos.

Notablemente, en los últimos años ha llegado a quedar claro que un nivel controlable de GVHD puede ser de gran beneficio para el paciente de cáncer. Puesto que las células del donante reaccionan contra los antígenos de histocompatibilidad del receptor, y puesto que las células de cáncer residuales son también células del receptor que llevan los antígenos de histocompatibilidad del paciente, un cierto nivel de reacción de "injerto contra tumor" o GVTR comúnmente acompaña a los otros componentes indeseables de la GVHD. Aquellos pacientes de cáncer que sobreviven a la GVHD a continuación de trasplantes de médula ósea/células troncales parecen sobrevivir mejor a su cáncer, puesto que las recurrencias son menos frecuentes. Por consiguiente, existe una fina línea entre los efectos tóxicos de la GVHD y los beneficiosos de la GVTR. En una situación ideal, un tratamiento podría suprimir la GVHD dejando al mismo tiempo que subsistiese una GVTR parcial, dirigida a aquellos antígenos más débiles que distinguen a las células malignas de las células benignas del receptor. La posibilidad de que la Transinmunización pueda suprimir la GVHD dejando al mismo tiempo intacta a la GVTR, más débil, es plausible y requiere ser sometida a ensayo en los humanos, puesto que los experimentos indican que la Transinmunización puede suprimir más eficazmente las reacciones inmunes más fuertes, como se ha expuesto anteriormente.

Breve exposición de la invención

La presente invención aporta métodos para reducir la probabilidad de enfermedad de injerto contra huésped en los receptores de trasplantes de médula ósea/células troncales, y puede ser especialmente útil cuando el donante y el receptor son hermanos que comparten un conjunto de progenitores. En esta realización, el donante recibe trasplantes de piel de ambos progenitores del hermano, cuyas células expresan colectivamente todos los antígenos tisulares del receptor, incluyendo los no expresados por el donante hermano. Tras haber sido provocada en el donante una respuesta inmune a los injertos de piel parentales, se lleva a cabo en el donante el procedimiento de Transinmunización. El tratamiento da como resultado que se hace que el donante sea tolerante a toda la gama de antígenos de histocompatibilidad que pueden caracterizar los tejidos del receptor. Las células troncales de médula ósea del donante son entonces trasplantadas en combinación con las células T supresoras inducidas del donante para reducir la incidencia o severidad de la GVHD en el receptor.

Una de las ventajas de los métodos de la presente invención es la de que el uso de fármacos globalmente inmunosupresivos en los receptores de trasplantes puede ser reducido o eliminado, reduciéndose o eliminándose con ello los efectos adversos para la salud que van asociados a los fármacos inmunosupresivos. Otra ventaja de los métodos de la presente invención es la de que puede reducirse en gran medida la incidencia y severidad de la GVHD en los receptores de trasplantes de médula ósea/células troncales. Otras ventajas de los métodos de la presente invención quedarán claramente de manifiesto para los expertos en la materia a la luz de la descripción detallada de realizaciones preferidas que se da a continuación.

Descripción detallada

La presente invención es especialmente útil en el trasplante de médula ósea o de células troncales, al ser células T inmunológicamente supresoras inducidas en el donante y trasplantadas con médula ósea o células troncales del donante. En esta realización de la invención, el donante de médula ósea/células troncales recibe trasplantes de piel de cada uno de los dos progenitores del futuro receptor del trasplante de médula ósea/células troncales. Cuando es generada en el donante una respuesta inmunológica a los injertos de piel, una cantidad de la sangre del donante es sometida a Transinmunización como se ha descrito anteriormente. Debido al hecho de que las células de los dos progenitores producen y presentan todos los antígenos de histocompatibilidad que están presentes en el receptor, serán inducidas en el donante células T supresoras para toda la gama de antígenos tisulares de ambos progenitores. Si se desea, pueden llevarse a cabo repetidos injertos de piel de los progenitores del receptor hasta que se logre un aceptable nivel de supervivencia de la piel trasplantada.

Tras haber sido alcanzado un nivel aceptable de supervivencia de la piel trasplantada, se trasplanta al receptor una combinación de médula ósea/células troncales y células T supresoras inducidas del donante. Las células troncales del donante reconstituirán ampliamente el sistema inmune del receptor, y asimismo iniciarán una potencialmente beneficiosa reacción de injerto contra tumor. Las células T supresoras del donante inhibirán la indeseable enfermedad de injerto contra huésped. Al hacerse al donante más tolerante a los antígenos de histocompatibilidad del receptor antes del trasplante, se verá minimizada la probabilidad de GVHD, que constituye una amenaza para la vida, y puede ampliarse la cantera de donantes.

Cuando el donante de médula ósea/células troncales es un progenitor del futuro receptor, el método anteriormente descrito se modifica haciendo que el donante progenitor reciba un injerto de piel solamente del progenitor no donante, y llevando a cabo el tratamiento de Fotoféresis/Transinmunización como se ha descrito anteriormente. El injerto de piel del progenitor no donante sensibilizará al progenitor donante a los antígenos que el receptor pueda haber heredado del progenitor no donante, dando como resultado células T supresoras para toda la gama de antígenos de histocompatibilidad del receptor. Cuando ha sido concluido el procedimiento de Fotoféresis/Transinmunización en el progenitor donante, se trasplanta al receptor una combinación de médula ósea/células troncales y células T supresoras inducidas del progenitor donante.

La Transinmunización ha sido descrita en general anteriormente. En la forma en que se le usa en el método de la presente invención, el tratamiento de Transinmunización redunda en la inducción de células T en el paciente que son capaces de suprimir la respuesta inmunológica al órgano o tejido trasplantado. El proceso de Transinmunización se lleva a cabo obteniendo una cantidad extracorpórea de la sangre del sujeto, tratando la sangre para inducir la diferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras, induciendo la apoptosis o necrosis de las células T en la sangre, incubando la sangre por espacio de un periodo de tiempo suficiente para permitir a las células dentríticas fagocitar a las células T apoptóticas, y administrando las células dendríticas inmaduras cargadas con antígenos al sujeto. La apoptosis, es decir la muerte celular programada, conduce a la presentación en la superficie de la célula moribunda de moléculas de membrana para las cuales las células dendríticas inmaduras tienen receptores, facilitándose con ello la ingestión de las células moribundas (o de sus fragmentos) y el procesamiento de sus antígenos por parte de las células dendríticas. Hace poco se ha reconocido universalmente que los antígenos de las células que mueren por necrosis rutinaria (así como sus fragmentos) pueden también ser internalizados y procesados por las células dendríticas. En consecuencia, debe entenderse que los métodos que aquí se describen pueden ser ejecutados usando células a las que se haya hecho apoptóticas o necróticas.

Es a menudo ventajoso que las células dendríticas reintroducidas sigan siendo inmaduras, encontrándose en un estado en el cual preferencialmente inducen una supresión inmune, en lugar de respuestas inmunes antialoinjerto, las cuales pueden ser producidas por las células dendríticas maduras. Por consiguiente, pueden darse pasos para impedir que las células dendríticas maduren. Por ejemplo, es perfectamente sabido en el ramo que la exposición de las células dendríticas inmaduras a apropiadas dosis de irradiación y truncará la maduración de las células dendríticas, dejándolas al mismo tiempo que sigan siendo funcionales. Otros enfoques para mantener a las células dendríticas inmaduras, tales como la exposición a ciertas citoquinas (como p. ej. la IL-10), son también perfectamente conocidos y, cuando ello sea apropiado, podrían emplearse en sustitución de la irradiación \gamma.

Si se desea, pueden tomarse y tratarse dos o más partes alícuotas de la sangre del sujeto. Una primera parte alícuota se trata para inducir la diferenciación de los monocitos, mientras que una segunda parte alícuota se trata para inducir la apoptosis de las células T. Las partes alícuotas se combinan tras su tratamiento y se incuban juntamente por espacio de un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células dendríticas maduren y fagociten a las células T apoptóticas. Sin embargo, a menudo será posible inducir simultáneamente la maduración de monocitos a células dendríticas y la apoptosis de las células T antialoinjerto.

La diferenciación de los monocitos se inicia exponiendo a los monocitos contenidos en una cantidad extracorpórea de la sangre de un sujeto a perturbación física, y en particular a las fuerzas ejercidas en los monocitos por su adherencia y liberación secuencial a y de superficies de plástico al fluir los mismos a través de un estrecho conducto de plástico, tal como el estrecho conducto de plástico de un dispositivo de Fotoféresis convencional.

En una realización preferida de la invención, se prepara un concentrado de células blancas de la sangre según la práctica de leucaféresis estándar usando un aparato de leucaféresis/Fotoféresis del tipo de los que son perfectamente conocidos para los expertos en la materia. El concentrado de células blancas de la sangre incluye monocitos, linfocitos y algunas células rojas de la sangre y plaquetas. Durante la leucaféresis pueden típicamente recolectarse dos billones de células blancas de la sangre. Suponiendo que los monocitos representan de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 50% de la población de células blancas de la sangre total recolectada, están presentes en el concentrado de células blancas de la sangre de aproximadamente 40 millones a 1 billón de monocitos. El porcentaje medio de monocitos es de aproximadamente un 20%, con lo cual habrá en el concentrado de células blancas de la sangre recolectado mediante la leucaféresis comúnmente poco más o menos 400 millones de monocitos.

A continuación de la separación mediante leucaféresis, la diferenciación de los monocitos se induce bombeando el concentrado de células de la sangre a través de un dispositivo que tiene una pluralidad de conductos de plástico. Preferiblemente, los conductos de plástico tienen un diámetro de entre aproximadamente 0,5 mm y 5,0 mm. Con la máxima preferencia se usa un aparato de Fotoféresis convencional que tiene un diámetro de los conductos de 1 mm o menos. La configuración de conductos estrechos del aparato de Fotoféresis maximiza el área superficial de plástico a la cual se ve expuesto el concentrado de células de la sangre al fluir a través del aparato de Fotoféresis. Sin embargo, la invención no queda limitada a este respecto, y para inducir la diferenciación de los monocitos puede usarse cualquier dispositivo apropiado que tenga conductos de plástico.

Mientras que la invención no queda limitada a mecanismo particular alguno de diferenciación de los monocitos, se cree que los monocitos que están presentes en el concentrado de células de la sangre se ven atraídos a las paredes de los conductos de plástico del aparato de Fotoféresis, y que los monocitos se adhieren a las paredes de los conductos. El flujo del fluido a través de los conductos hace que les sean aplicadas a los monocitos adheridos fuerzas de cizallamiento que hacen que los monocitos adheridos transitoriamente y de manera incompleta se suelten de las paredes de los conductos de plástico. En consecuencia, al pasar los monocitos a través del aparato de Fotoféresis, los mismos pueden verse sometidos a numerosos episodios de adherencia y liberación transitoria a y de las paredes de los conductos de plástico. Estas fuerzas físicas envían señales de activación a través de la membrana celular de los monocitos, lo cual redunda en la inducción de la diferenciación de los monocitos en células dendríticas funcionales. La evidencia preliminar sugiere que la interacción de la glicoproteína \beta de los monocitos con la superficie de plástico puede contribuir a la entrada de los monocitos en la ruta maturacional hacia las células dendríticas. Por consiguiente, puede ser posible inducir la maduración de monocitos a células dendríticas mediante interacción directa con P-glicoproteína monocítica, sin el uso de un sistema de flujo en conductos de plástico.

El inducir a los monocitos a formar células dendríticas por el método del flujo con adherencia transitoria al plástico ofrece varias ventajas para el tratamiento relacionado con los trasplantes de órganos o tejidos. Debido al hecho de que todas las células dendríticas se forman a partir de los monocitos dentro de un periodo de tiempo muy corto, las células dendríticas son todas de aproximadamente la misma edad. Las células dendríticas fagocitarán a las células apoptóticas, tales como las células T apoptóticas, durante un definido periodo tempranamente en su ciclo de vida. Al crear células dendríticas con un perfil de edad relativamente estrecho, el método de la presente invención proporciona un acrecentado número de células dendríticas inmaduras capaces de fagocitar a las células T apoptóticas y presentar a continuación antígenos de esas células T. Debido al hecho de que las células dendríticas inmaduras son deficitarias en ciertas moléculas superficiales coestimuladoras, tales como las de la familia B7, dichas células envían señales supresivas a las células T antigenorresponsivas con las cuales desarrollan un contacto de célula con célula. Puesto que las células dendríticas producidas durante el procedimiento de Transinmunización son todas de la misma edad, este enfoque puede proporcionar una abundancia de células dendríticas inmaduras capaces de producir una supresión dominante de las de otro modo potentes reacciones inmunes que pueden ocasionar rechazo de órganos trasplantados.

Las células T contenidas en la cantidad extracorpórea de sangre pueden hacerse apoptóticas o necróticas por cualquier método de los que son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, la apoptosis puede ser inducida exponiendo a las células T a energía ultravioleta, irradiación con rayos X o irradiación y. Asimismo, el shock por calor, el shock por frío, la presión hidrostática o las soluciones hipotónicas pueden dañar letalmente a las células T o a otras células de maneras tales como la necrosis celular que conducen a su absorción y procesamiento por parte de las células dendríticas de manera análoga que puede también provocar los mismos fenómenos inmunes. Si se desea, pueden usarse combinaciones de estos métodos para hacer a las células T apoptóticas o necróticas.

Hay dos categorías de células apoptóticas o necróticas que pueden ser aportadas a las células dendríticas inmaduras para proporcionar antígenos que puedan contribuir a la inducción de inmunotolerancia a los aloinjertos. Estas dos fuentes de células pueden usarse independiente o sinérgicamente para producir la deseada tolerancia de los aloinjertos.

La primera categoría consta de aquellos clones de células T que son capaces de ocasionar el rechazo del trasplante de órgano. En la mayoría de las situaciones clínicas de rechazo de aloinjertos, hay implicados en el fenómeno de rechazo numerosos clones de células T que reconocen cada uno un distinto componente molecular de las células aloinjertadas. Células T representativas de cada uno de estos clones pueden hacerse apoptóticas o necróticas y pueden aportarse a las células dendríticas inmaduras para inducir la deseada tolerancia del aloinjerto. Los aloinjertos de piel, al simular la situación inmunológica que es típica del trasplante de órgano real, conduce a la expansión de los clones de células T antialoinjerto y proporciona con ello una fuente de tales células T para la supresión por Transinmunización de la inmunidad antialoinjerto.

Una segunda categoría de células apoptóticas o necróticas que pueden ser aportadas a las células dendríticas inmaduras es la de las células del donante del órgano. Son fuentes de células fácilmente accesibles las de los leucocitos de la sangre o células cultivadas (tales como linfocitos, queratinocitos u otras células). Estas células contendrán antígenos típicos de los órganos trasplantables del mismo donante individual. Si tales células se hacen apoptóticas o necróticas y se aportan a las células dendríticas inmaduras del receptor, antígenos típicos del donante serán presentados en la superficie de las células dendríticas. Debido al hecho de que las células dendríticas inmaduras son deficitarias en moléculas coestimuladoras, las mismas inactivarán directa o indirectamente (a través de redes inmunorreguladoras) a las células T antialoinjerto del receptor tras la reinfusión al receptor. Este enfoque tiene la ventaja de inactivar a todos los clones de las células T antialoinjerto.

Por consiguiente, estas dos categorías de células apoptóticas/necróticas pueden ser usadas independientemente, o bien con preferencia en tándem. Por ejemplo, a continuación del aloinjerto de piel, el aparato de Fotoféresis puede usarse para preparar células T antialoinjerto para cargarlas en células dendríticas inmaduras inducidas simultáneamente. Estas dos poblaciones celulares pueden ser cultivadas durante la noche para maximizar el contacto celular y la absorción de células T antialoinjerto apoptóticas por parte de las células dendríticas. Podrían añadirse a la incubación durante la noche leucocitos apoptóticos del donante (u otras células del donante), para que fuesen procesados por las mismas células dendríticas inmaduras. Luego las células dendríticas inmaduras doblemente cargadas podrían ser devueltas por vía intravenosa al paciente, para producir la máxima tolerancia inmunológica del aloinjerto. Esta tolerancia podría ser valorada usando un aloinjerto de piel de repetición del mismo donante.

En una realización de la presente invención, a las células T que están presentes en la cantidad extracorpórea de la sangre del donante se las hace apoptóticas en el aparato de Fotoféresis al ser los monocitos inducidos a formar células dendríticas por las fuerzas físicas que experimentan al fluir a través de los estrechos conductos de plástico del aparato de Fotoféresis. Un agente fotoactivable capaz de inducir la apoptosis de las células T es añadido al concentrado de células de la sangre antes del paso a través del aparato de Fotoféresis, y el concentrado de células de la sangre es irradiado al pasar a través del aparato de Fotoféresis para hacer a las células T apoptóticas. Al hacerse a las células T apoptóticas en el aparato de Fotoféresis, estas células están inmediatamente disponibles para ser fagocitadas al diferenciarse los monocitos para formar células dendríticas.

En esta realización de la presente invención, se añade salina al concentrado de células blancas de la sangre antes de su paso a través del aparato de Fotoféresis para diluir la concentración de células rojas de la sangre hasta aproximadamente un 2% en volumen, permitiendo con ello una más eficaz penetración de la radiación activadora hasta las células T diana. El agente fotoactivable puede serle administrado al sujeto antes de obtener una cantidad de sangre del sujeto para la leucaféresis y la Fotoféresis. Como alternativa o bien adicionalmente, el agente fotoactivable puede ser añadido directamente a la corriente de sangre extracorpórea, típicamente inyectando el agente en la tubería que conduce al aparato de leucaféresis/Fotoféresis. Independientemente de cuándo y cómo se administre un agente en particular, las células T deben ser expuestas al agente fotoactivable por espacio de un periodo de tiempo suficiente para que el agente reaccione con los componentes celulares de las células de enfermedad.

Son ejemplos de agentes fotoactivables los miembros del grupo que consta de psoralenos, porfirinas, pirenos, ftalocianina, derivados retinoides, cortisona fotoactivada, anticuerpos fotoactivados específicamente reactivos con los monocitos, colorantes fotoactivables y anticuerpos monoclonales que hayan sido unidos a moléculas de porfirina.

Los psoralenos son una clase preferida de agentes fotoactivables adecuados para ser usados en el procedimiento de Fotoféresis. Los psoralenos son fácilmente absorbidos desde el tracto digestivo, alcanzando niveles máximos en la sangre y en otros tejidos en un espacio de tiempo de una a cuatro horas a continuación de la administración oral, y estos agentes son excretados casi enteramente en 24 horas. En consecuencia, los psoralenos son particularmente adecuados para la administración oral antes de obtener una cantidad extracorpórea de la sangre del sujeto. Las moléculas de psoralenos son inertes antes de la exposición a la irradiación y son activadas transitoriamente pasando a un estado excitado a continuación de la irradiación. Las moléculas de psoralenos transitoriamente activadas son capaces de formar fotoaductos con DNA celular, proteínas o lípidos, y de generar otras especies reactivas, tales como oxígeno singulete, que son capaces de modificar otros componentes celulares, como p. ej. la membrana celular y componentes citoplásmicos tales como proteínas y aminoácidos aromáticos.

Los psoralenos preferidos incluyen a los miembros del grupo que consta de 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 4' aminometil-4,5',8 trimetilpsoraleno (AMT), 5-metoxipsoraleno (5-MOP) y trimetilpsoraleno (TMP). El 8-MOP es el agente fotoactivable más preferido para ser usado con los métodos de la invención, y las condiciones para la administración oral de este psoraleno están descritas en la Patente U.S. Nº 5.147.289, cuya descripción queda incorporada a la presente por referencia.

La etapa de irradiación de la Fotoféresis es llevada a cabo pasando la fracción de monocitos/linfocitos a través de un dispositivo de exposición que puede estar contenido dentro del aparato de leucaféresis/Fotoféresis o bien puede estar físicamente separado del mismo. El dispositivo de exposición preferido incluye un conducto de plástico transparente que tiene un diámetro de aproximadamente 1 mm y está dispuesto entre fuentes de irradiación opuestas. Al pasar la fracción de monocitos/linfocitos a través del conducto, las células T nunca están separadas de las fuentes de irradiación por más de aproximadamente 0,5 mm de sangre. El mantener a las células T en tal estrecha proximidad a las fuentes de irradiación ha demostrado ser particularmente eficaz para asegurar la adecuada exposición de la fracción de linfocitos a la radiación activadora. En el caso en el que en calidad del agente fotoactivable se usa un psoraleno tal como el 8-MOP, las fuentes de irradiación emiten radiación ultravioleta A (UVA) en calidad de la radiación activadora. Para activar al psoraleno, los monocitos son típicamente expuestos a aproximadamente 1-2 julios/cm^{2} de UVA por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 minutos.

A continuación del tratamiento de la sangre para iniciar la diferenciación de los monocitos y para hacer a las células T de la sangre apoptóticas, el concentrado de células de la sangre tratado es secuestrado para incubación en presencia de células T apoptóticas obtenidas del futuro receptor del trasplante. El periodo de incubación permite que las células dendríticas que se forman y maduran en el concentrado de sangre estén en relativamente estrecha proximidad a las células T apoptóticas, siendo con ello incrementada la probabilidad de que las células T apoptóticas sean consumidas y procesadas por las células dendríticas. Como se ha descrito anteriormente, puede inducirse a las células T a experimentar apoptosis al ser el concentrado de sangre pasado a través del aparato de Fotoféresis. Sin embargo, la apoptosis de las células T bajo estas circunstancias típicamente no llega a ser evidente hasta haber transcurrido al menos doce horas desde el punto en el tiempo de la exposición ultravioleta. Puesto que la absorción de los leucocitos dañados por parte de las células dendríticas inmaduras se produce eficazmente tan sólo tras haber devenido evidente la apoptosis, óptimamente se incorpora una fase de incubación (antes de la devolución de las células al paciente) de al menos 12 horas para permitir una eficaz absorción celular por parte de las DC. Como alternativa, las células T pueden ser tratadas por separado para inducir la apoptosis y pueden ser añadidas al concentrado de sangre antes o después del paso del concentrado de sangre a través del dispositivo de Fotoféresis.

Para la incubación de las células puede utilizarse una bolsa de sangre estándar, como es típico en la Fotoféresis. Sin embargo, se ha comprobado que es particularmente ventajoso usar una bolsa de sangre del tipo que no exuda considerables cantidades de plastificante y que es suficientemente poroso como para permitir el intercambio de gases, y particularmente de CO_{2} y de O_{2}. Tales bolsas son suministradas, por ejemplo, por la división Fenwall de la Baxter Healthcare Corp., bajo el nombre de Amicus^{MF} Apheresis Kit. Se describen también varias bolsas de sangre exentas de plastificante en las Patentes U.S. Núms. 5.686.768 y 5.167.657.

El concentrado de células de la sangre y las células T apoptóticas se incuban por espacio de un periodo de tiempo suficiente para maximizar el número de células dendríticas presentadoras de antígenos funcionales en la población celular incubada. La incubación se lleva a cabo bajo condiciones que son conocidas para los expertos en la materia. Se describe un ejemplo de protocolo de incubación en la Solicitud de Patente U.S. que tiene el Nº de Depósito 10/066.021, todo el contenido de la cual queda incorporado a la presente por referencia. Típicamente, el concentrado de células de la sangre tratadas y las células T se incuban por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 6 a aproximadamente 48 horas, extendiéndose el tiempo de incubación preferido a lo largo de un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas. Tratando los monocitos de la manera que se ha descrito anteriormente y luego incubando la población celular tratada, puede obtenerse un gran número de células dendríticas presentadoras de antígenos funcionales. Se ha comprobado que es particularmente ventajoso añadir un medio de cultivo tamponado a la bolsa de sangre y una o varias citoquinas, tales como GM-CSF e IL-4, durante el periodo de incubación.

Como le resultará evidente al experto en la materia, el método de la presente invención puede ser usado en combinación con fármacos inmunosupresivos como pueda ser apropiado. La necesidad de fármacos inmunosupresivos o la dosificación de los mismos puede verse reducida o eliminada como resultado del tratamiento, reduciéndose con ello la susceptibilidad del receptor a padecer de infección o enfermedad o de otros efectos adversos asociados al uso de los fármacos inmunosupresivos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5147289 A [0043]

\bullet US 5167657 A [0046]

\bullet US 5686768 A [0046]

\bullet US 066021 A [0047].

Literatura no de patentes que se cita en la descripción

\bulletBarr et al. Photopheresis for the prevention of rejection in cardiac transplantation. New England Journal of Medicine, 10 December 1998, vol. 339 (4), 1744-51 [0011]

\bulletGreinix et al. Successful use of extracorporeal pho-tochemotherapy in the treatment of severe acute and chronic graft-versus-host disease. Blood, 1998, vol. 92 (9), 3098-3104 [0011]

\bulletGreinix et al. Extracorporeal photochemotherapy in the treatment of severe steroid-refractory acute graft-versus-host disease: a pilot study. Blood, 2000, vol. 96 (7), 2426-31 [0011]

\bulletBerger et al. Induction of Human Tumor-Loaded Oendritic Cells. Int. J. Cancer, 2001, vol. 91, 438-447BK7 [0015]

\bulletYamane et al. Suppression of anti-skin-allograft response by photodamaged effector cells-the modulating effects of prednisone and cyclophophamide. Transplantation, July 1992, vol. 54 (1), 119-124 [0017]

\bulletPerez et al. Induction of a cell-transferaPle suppression of alloreactivity by photodamaged lymphocytes. Transplantation, November 1992, vol. 54 (5), 896-903 [0017]

\bulletPerez et al. DNA associated with the cell membrane is involved in the inhibition of the skin rejection response induced by infusions of photodamaged alloreactlve cells that mediate rejection of skin allograft. Photochemistry and Photobiology, 1992, vol. 55 (6), 839-849 [0017].

Claims (9)

1. Método para tratar una cantidad extracorpórea de sangre de un donante de médula ósea o de células troncales, siendo dicho método ejecutado con vistas a suprimir selectivamente la respuesta inmunológica de dicho futuro donante antes de trasplantar la médula ósea o las células troncales de dicho donante al futuro receptor,

comprendiendo dicho método los pasos de

(a) tratar una cantidad extracorpórea de sangre del donante para inducir al menos uno de los miembros del grupo que consta de la apoptosis o la necrosis de las células T que están presentes en la cantidad extracorpórea de sangre, estando dichas células T presentes en dicha cantidad extracorpórea de sangre como una respuesta inmunológica de dicho donante a la piel sacada de cada uno de los progenitores biológicos del futuro receptor y aloinjertada al donante de dicha médula ósea o de dichas células troncales;

(b) tratar la cantidad extracorpórea de sangre del donante haciendo que la sangre fluya a través de un aparato que tiene conductos de plástico;

(c) incubar la cantidad extracorpórea de sangre.

2. El método de la reivindicación 1, donde la apoptosis de las células T que están presentes en la cantidad extracorpórea de sangre es inducida añadiendo un agente fotoactivable capaz de inducir la apoptosis en las células T a la cantidad extracorpórea de sangre, e irradiando la cantidad extracorpórea de sangre.

3. El método de la reivindicación 2, donde el agente fotoactivable es 8-MOP.

4. El método de la reivindicación 3, donde la apoptosis o necrosis de las células T que están presentes en la cantidad extracorpórea de sangre es inducida tratando la sangre usando un tratamiento seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de shock por calor, radiación ultravioleta, shock por frío, irradiación con rayos X, irradiación gamma, presión hidrostática y soluciones hipotónicas.

5. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad extracorpórea de sangre es incubada por espacio de un periodo de tiempo de 6 a 48 horas.

6. El método de la reivindicación 5, donde la cantidad extracorpórea de sangre es incubada por espacio de un periodo de tiempo de 12 a 24 horas.

7. El método de la reivindicación 1, donde antes del paso (a) el método comprende adicionalmente el paso de:

separar los monocitos y las células T de la cantidad extracorpórea de sangre del donante sometiendo a la sangre a un proceso de leucaféresis.

8. El método de la reivindicación 2, donde los pasos de irradiar la cantidad extracorpórea de sangre y de tratar la cantidad extracorpórea de sangre haciendo que la sangre fluya a través de un aparato que tiene conductos de plástico son llevados a cabo en un aparato de Fotoféresis.

9. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad extracorpórea de sangre es tratada haciendo que la sangre fluya a través de un aparato que tiene conductos de plástico de un diámetro de 1 mm o menos.