ES2339765T3 - Cepas de mva recombinantes como vacunas potenciales contra la malaria por p. falciparum. - Google Patents

Abstract

Vacuna que comprende a) un virus MVA recombinante, que comprende un fragmento o fragmentos del ácido nucleico que codifica la proteína MSP-1 de Plasmodium falciparum; y b) un vehículo farmacológicamente aceptable, en donde el fragmento de MSP-1 o los fragmentos de MSP-1 codificado(s) por el ácido nucleico se elige(n) exclusivamente de: - p42; - p42 y p38; - p83, p30, p42 y p38.

Description

Cepas de MVA recombinantes como vacunas potenciales contra la malaria por P. falciparum.

Introducción

Aquí se describen la producción de virus vaccinia recombinantes de la cepa MVA (virus vaccinia Ankara modificado) para la producción recombinante del antígeno de la malaria gp190/MSP-1 completo del agente patógeno de la malaria Plasmodium falciparum así como dominios naturales individuales y partes de los mismos. Además la invención se refiere al uso de MVA recombinantes, que llevan la secuencia sintética de ADN del antígeno de la malaria así como partes de la misma integradas en el genoma vírico, como vacuna para la inmunización contra la malaria.

La malaria se cuenta entre las enfermedades infecciosas más graves del mundo. Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) cada año se registran de 400 a 900 millones de episodios de la enfermedad. Según informaciones de la Iniciativa Multilateral contra la Malaria (MIM) cada año mueren entre 700.000 y 2,7 millones de personas por la infección (MIM, 2001). Además en 99 países el 40% de la población mundial está expuesta a riesgo de malaria. La enfermedad está causada por protozoos unicelulares del género Plasmodium del filo Apicomplexa. Hay cuatro especies que infectan a los seres humanos: Plasmodium malarieae, responsable de la fiebre cuartana, Plasmodium vivax y Plasmodium ovale, que causan ambos la fiebre terciana y finalmente Plasmodium falciparum, el agente patógeno de la malaria tropical y responsable después de todo de casi todas las infecciones mortales.

Actualmente su propagación aumenta de nuevo. Esto es debido sobre todo al desarrollo de una intensa resistencia del agente patógeno de la malaria, que es favorecida debido a que los medicamentos utilizados en la terapia son además recomendados y empleados para la profilaxis. Junto a la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos la investigación se concentra en el desarrollo de vacunas, que en el curso de las infecciones de malaria inducen mecanismos de inmunidad en seres humanos, que muestran una capacidad de resistencia aumentada contra los Plasmodium, como se muestra en el desarrollo de distintos tipos de inmunidad en seres humanos en las regiones epidémicas de malaria.

MSP-1 como vacuna potencial

MSP-1, la proteína principal de la superficie de los merozoítos, la forma invasora de la fase sanguínea del agente patógeno de la malaria, es una proteína de 190-220 kDa. Esta proteína se procesa más tarde durante el desarrollo de los merozoítos en fragmentos proteicos más pequeños, que hasta la invasión de eritrocitos por el parásito se encuentran como complejos anclados mediante un anclaje de glicosilfosfatidil-inositol sobre la superficie del merozoíto y se pueden aislar.

Las secuencias de las proteínas MSP-1 de distintas cepas de P. falciparum pertenecen a dos grupos, que se nombran según dos aislados representativos K1 y MAD20. En conjunto la proteína consta de varias regiones muy conservadas, de regiones dimorfas de las que se puede adjuntar respectivamente una de las dos y de dos bloques oligomorfos relativamente pequeños en la parte N-terminal de la proteína (Fig. 1, Tanabe et al., 1987).

La inmunización de ratones con la proteína purificada del parasito P. yoelii protegió a los animales de la en caso contrario infección mortal (Holder y Freeman, 1981). También la transferencia de anticuerpos monoclonales contra MSP-1 de P. yoelii proporcionó protección en un modelo de ratón (Majarian et al., 1984).

Además de los estudios en ratones también se inmunizaron monos Saimiri y Aotus con MSP-1 nativa purificada por inmunoafinidad. En estos experimentos la proteína obtenida de P. falciparum protegió de forma parcial (Perrin et al., 1984) o total (Siddiqui et al., 1987) contra la posterior infección con el parásito.

Una purificación del material nativo de Plasmodium es realmente costosa y no permite la producción a gran escala. Por lo tanto la investigación en vacunas se concentra en el desarrollo de vacunas recombinantes.

De esta manera se inmunizaron con éxito ratones con MSP-1-19 purificada de E. coli o Saccharomyces cerevisiae (Daly y Long, 1993; Ling et al., 1994; Tian et al., 1996; Hirunpetcharat et al., 1997), así como con Mycobacterium bovis que llevan MSP-1-19 (Matsumoto et al., 1999). De forma alternativa a la inmunización con proteínas nativas o recombinantes también se usó como vacuna el ADN codificante de MSP-1-19 y protegió a los ratones inmunizados de la infección con P. chabaudi (Wunderlich et al., 2000).

Las inmunizaciones de monos con MSP-1-19 y MSP-1-42 recombinantes de P. falciparum proporcionó protección parcial (Kumar et al., 1995; Egan et al., 2000; Chang et al., 1996; Stowers et al., 2001). La interpretación de los experimentos de inmunización en monos solo es realmente posible de forma limitada, ya que no se da un análisis estadístico de los resultados debido al pequeño número de animales de experimentación.

En estudios en fase I y II con fragmentos de MSP-1 como vacuna también se ha mostrado su inmunogenicidad en seres humanos. Se trata de p19 de P. falciparum fusionada a un epítopo de célula T auxiliar de la toxina del tétanos (Keitel et al., 1999) y los bloques 3 y 4 de MSP-1 (Saul et al., 1999; Genton et al., 2000).

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Algunos estudios epidemiológicos en regiones endémicas mostraron una correlación en adultos entre los títulos de anticuerpo contra MSP-1 y la inmunidad contra la malaria (Tolle et al., 1993; Riley et al., 1992; Riley et al., 1993).

Estas investigaciones junto con los estudios de inmunización en animales demuestran que MSP-1 se trata de un candidato muy prometedor para el desarrollo de una vacuna contra la malaria.

En general estos estudios se pueden diferenciar en dos planteamientos, o bien se usa material purificado de parásitos o material producido en sistemas heterólogos.

Tanto para investigaciones sobre la función como para el uso como vacuna, las proteína se deben producir con buen rendimiento, alta calidad y de forma reproducible. Si bien se puede purificar MSP-1 de parásitos, realmente esto solo es posible a pequeña escala con grandes gastos y por lo tanto la producción de MSP-1 según los criterios mencionados no es realizable de este modo.

Los virus vaccinia pertenecen al género Orthopoxvirus en la subfamilia de los Chordopoxvirinae. Se trata respecto a los virus de la viruela de virus complejos, que con un genoma de ADN bicatenario de aprox. 200 kb y un tamaño de 250 x 350 nm pertenecen a los mayores virus conocidos. Constan de un virión en forma de ortoedro que está rodeado de una envuelta de membrana. En la célula huésped tiene lugar la replicación y generación del virus de la viruela exclusivamente en el citoplasma (para una revisión: Moss et al., 1996). Los virus vaccinia tienen un espectro de células huésped muy amplio, infectan casi todas las células que provienen tanto de seres humanos como de animales. En 1953 Anton Mayr aisló y purificó la cepa de dermovaccinia del corioalantoides vaccinia Ankara (CVA). Este virus se multiplicó mediante el pase continuo en fibroblastos embrionarios de pollo y de ahí se produjo un virus atenuado, que ya no muestra virulencia en animales y seres humanos (Stickl et al., 1974). A pesar de ello se pudo seguir usando el virus para la inmunoprofilaxis contra las enfermedades ocasionadas por los Orthopoxvirus en seres humanos y animales (Stickl et al., 1974). Este virus se nombró virus vaccinia Ankara modificado (MVA) de acuerdo con su lugar de origen.

Examinado desde la genética molecular el virus ha perdido durante los más de 570 pases en fibroblastos embrionarios de pollo 31 kb de la secuencia de ADN de su genoma, principalmente en forma de seis grandes deleciones, entre ellas al menos dos genes, que determinan el espectro de células huésped y por lo tanto la capacidad de replicación del virus (Meyer et al., 1991). La construcción de partículas víricas infecciosas en una infección por MVA en la mayoría de las células procedentes de mamíferos, incluidas las células de seres humanos, se bloquea primeramente muy tarde en el ciclo infeccioso, en el paso de ensamblaje de los viriones, es decir, los genes víricos bajo el control de promotores tanto para la transcripción temprana como para la intermedia y la tardía también se pueden expresar en células no permisivas. Esto diferencia al MVA de otros poxvirus atenuados y deficientes en replicación, como por ejemplo, el virus vaccinia NYVAC o el virus de la viruela del canario ALVAC, cuya infección en la mayoría de las células de mamíferos se interrumpe ya antes de la replicación del ADN vírico (Tartaglia et al., 1992; Sutter y Moss, 1992).

Para el desarrollo de vacunas contra la malaria se usaron diferentes virus vaccinia recombinantes, entre ellos se usaron virus competentes para la replicación del tipo Western Reserve y Copenhague y virus atenuados del tipo NYVAC, ALVAC o COPAC (Kaslow et al., 1991; Etlinger y Altenburger, 1991; Aidoo et al., 1997; Allsopp et al., 1996).

En relación con el virus vaccinia atenuado MVA se han descrito únicamente virus recombinantes que llevan como antígeno de la malaria CSP del parásito de roedores Plasmodium berghei (Schneider et al., 1998; Plabanski et al., 1998; Degano et al., 1999; Gilbert et al. 1999).

Además se han descrito virus vaccinia recombinantes que contienen una secuencia que codifica MSP-1. Los autores de una publicación exponen que han integrado la secuencia codificante de MSP-1 nativa en el genoma del virus de tipo Western Reserve, pero no apoyan esta afirmación de forma experimental (ningún análisis de restricción, PCR, análisis de transferencia Northern o transferencia Southern, etc.). Una inmunización de monos Saimiri con este virus recombinante no produjo la formación de anticuerpos específicos para MSP-1 y además se mantuvo también sin influencia medible en la respuesta inmune humoral contra MSP-1 tras una infección con P. falciparum (Pye et al., 1991).

En otra publicación se describe el vector NYVAC-Pf7 que expresa entre otros msp-1 de P. falciparum. Los sueros de dos de los seis monos Rhesus inmunizados no muestran en el análisis de inmunotransferencia ninguna de las señales reconocibles en la publicación contra MSP-1 nativa. Las señales de otros tres animales reconocen únicamente partes del complejo proteico y solo el suero de un animal inmunizado reconoce un espectro de bandas más amplio. No se realizaron análisis cuantitativos para anticuerpos específicos contra MSP-1 mediante ELISA (Tine et al., 1996).

En ensayos en seres humanos en fase I/IIa con NYVAC-Pf7 no se ha demostrado ni una respuesta inmune celular contra MSP-1 ni una respuesta inmune humoral medible mediante ELISA (Ockenhouse et al., 1998).

Por el contrario, Tine y col. (1996) identifican MSP-1 intacta en el análisis por inmunotransferencia, en donde parece contradictorio, que MSP-1 se transporta fuera de la célula por medio de secuencias señal de P. falciparum (véanse las publicaciones de Moran y Caras, 1994, Yang et al., 1997).

El objeto de la presente invención, por lo tanto, es preparar un virus vaccinia recombinante, que sea capaz de,

-

contener secuencias de ADN que codifican MSP-1 de P. falciparum o partes de las mismas integradas de forma estable,

-

expresar esas secuencias de forma estable y reproducible y de este modo

-

producir proteína MSP-1 de forma secretada o anclada a la superficie, para

-

inmunizar un huésped y por tanto

-

ocasionar una respuesta inmune celular y humoral.

El objeto de la presente invención se soluciona mediante la preparación de una vacuna, que comprende

a)

un virus MVA recombinante, que comprende un fragmento o fragmentos del ácido nucleico que codifica la proteína MSP-1 de Plasmodium falciparum; y

b)

un vehículo farmacológicamente aceptable,

en donde el fragmento de MSP-1 o los fragmentos de MSP-1 codificado(s) por el ácido nucleico se elige(n) exclusivamente de:

\bullet

p42;

\bullet

p42 y p38;

\bullet

p83, p30, p42 y p38.

Según la invención, la expresión "virus basado en MVA" significa un virus derivado de MVA, que presenta una o más mutaciones en regiones no esenciales del genoma vírico. Las regiones esenciales del virus MVA son por ello todas las partes del genoma del virus MVA que son necesarias para el mantenimiento de la expresión génica vírica y la capacidad de multiplicación del virus MVA, aquí se cuentan por ejemplo las secuencias génicas que codifican para las subunidades de la ARN polimerasa vírica o la ADN polimerasa vírica. Preferiblemente el virus basado en MVA es el virus MVA.

El sistema vaccinia NYVAC-Pf7 conocido del estado de la técnica se basa en el virus básico NYVAC, que proviene originalmente de la cepa de virus vaccinia Copenhague y que se atenuó a través de las deleciones dirigidas de 18 marcos abiertos de lectura. Sin embargo, la replicación del ADN de NYVAC está bloqueada en células de mamíferos (Tartaglia et al., 1992), mientras que en el caso de MVA el ensamblaje del virus está interrumpido. Esto tiene la ventaja, de que al contrario que en NYVAC en MVA la expresión génica tardía tiene lugar, lo que se puede usar para la expresión de genes recombinantes. MVA puede por eso tanto inducir preferiblemente durante la fase temprana de la transcripción una respuesta de células T citotóxicas como estimular la rama humoral de la respuesta inmune a través de la alta expresión de proteínas durante la fase tardía.

MVA, que ya durante la campaña de vacunación contra la viruela se empleó extensamente, se considera como un virus de vacunación muy seguro para los seres humanos (Stickl et al., 1974).

Según la invención, un virus MVA recombinante que comprende al menos un ácido nucleico que codifican un fragmento o fragmentos de la proteína MSP-1 de P. falciparum.

La secuencia de aminoácidos de MSP-1 está disponible de bases de datos accesibles. 3D7 (aislado MAD20): CAA84556; FCB-1 (aislado K1): CAB36903. Ambas de la base de datos de los NIH (http://www.ncbi.nim.nih.gov).

Especialmente preferido es el ácido nucleico que codifica el fragmento de MSP-1 o fragmentos de MSP-1, un ácido nucleico que tiene disminuido su contenido en AT como se describe en DE 19640817 A1. En especial es preferido un ácido nucleico que deriva de la secuencia MSP-1 de P. falciparum y en el que una gran parte de los codones de Plasmodium se cambian de modo que la frecuencia de codones del gen sintético corresponda a los humanos sin que por ello cambie la secuencia de aminoácidos.

Según una forma de realización preferida la proteína MSP-1 es la MSP-1 del aislado 3D7, la proteína MSP-1 que de aquí en adelante se denomina "MSP-1D". De forma alternativa la proteína MSP-1 puede ser de la cepa FCB1, que de aquí en adelante se denomina "MSP-1F". La proteína MSP-1 comprende los fragmentos indicados de estas dos formas de MSP-1. Aquí están comprendidos p42; p42 y p38; y p83, p30, p42 y p38. En particular es preferida la combinación p83 y p30, así como p38 y p42. La posición de los fragmentos se muestra en la figura 1. Además, también está comprendido el fragmento p42 de ambas formas de MSP-1.

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En una forma de realización preferida el virus contenido en la vacuna comprende un promotor adecuado para la expresión, en donde la secuencia codificante de msp-1 está bajo el control del promotor. El promotor puede ser un promotor de MVA, pudiendo ser el promotor un promotor génico temprano, intermedio o tardío o una combinación de los mismos. No obstante también están comprendidos promotores que no son de MVA, que son adecuados para la expresión en el sistema de expresión usado. Aquí se pueden usar tanto promotores constitutivos como inducibles. Para la producción de proteína a gran escala se puede usar un promotor fuerte del virus vaccinia, como el promotor sintético tardío o temprano/tardío o el sistema de polimerasa híbrido vaccinia/T7; para la inducción de respuesta de células T citotóxicas restringidas a MHC de clase I in vivo se puede usar preferiblemente un promotor natural temprano o el tándem temprano/tardío; además se puede usar el sistema represor/operador lac de E. coli o el sistema híbrido vaccinia/T7 para la iniciación de la expresión génica; (Methods in Molecular Biology, Volumen 62, Editor Rocky S. Tuan, Humana Press, Broder y Earl, página 176, con identificación posterior).

Según una forma de realización preferida adicional el virus comprende además un marcador de selección. El marcador de selección es adecuado para la selección y/o cribado en una forma conocida. Los marcadores de selección adecuados comprenden por ejemplo, el sistema lacZ de E. coli, el sistema de selección que hace uso del gen de la xantina-guanina fosforribosil transferasa (XGPRT) de E. coli. Además se pueden usar métodos de selección que cambian la especificidad de célula huésped del virus (Staib et al., 2000). Se pueden usar marcadores de selección adicionales conocidos en el estado de la técnica.

Según una forma de realización preferida adicional el ácido nucleico está fusionado en el extremo 5' con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de péptido señal. Como se sabe del estado de la técnica, las secuencias señal y de anclaje de P. falciparum al expresarse en células de mamífero no son reconocidas o no se procesan correctamente (Moran y Caras, 1994; Burghaus et al., 1999; Yang et al., 1997).

El problema de la modulación selectiva de la compartimentación intracelular se resuelve mediante el uso de la secuencia señal de los "factores de aceleración de la degradación" (DAF) humanos (Fig. 2). Las secuencias adecuadas de péptido señal son específicas de eucariotas superiores. Ejemplos para tales secuencias señal junto a las de los factores de aceleración de la degradación son inmunoglobulinas o péptidos señal de diferentes factores de crecimiento y citoquinas (von Heijne, 1985). Según una forma de realización preferida la secuencia del péptido señal dirige la secreción de los productos génicos, por ejemplo citoquinas, anticuerpos, etc.

Además, son secuencias señal preferidas las que llevan a un anclaje por GPI del extremo C-terminal del producto génico en la superficie celular, como en los DAF humanos. De forma alternativa son preferidas secuencias de péptidos que dirigen la localización de unión a membrana del producto génico, como en el caso de las inmunoglobulinas de isotipo M o las proteínas G del virus de la estomatitis vesicular.

Según una forma de realización preferida adicional el virus puede contener además sitios adecuados donantes de ayuste o aceptores de ayuste, de modo que se forma el correspondiente ARN con ayuste que es adecuado para la traducción dentro el individuo tratado. El ácido nucleico puede contener además una secuencia que sea adecuada como sitio de unión a ribosomas.

Como vehículo farmacológicamente aceptable son adecuados todos los vehículos y diluyentes conocidos en el estado de la técnica. Siempre que se pretenda una vía de aplicación determinada, se puede elegir o cambiar el vehículo farmacológicamente aceptable de un modo conocido.

La vacuna se puede administrar por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intraperitoneal u oral. La vacuna se da para profilaxis y/o terapia contra la malaria en seres humanos y animales.

Según una forma de realización preferida la vacuna puede contener además MSP-1 y/o un fragmento de la misma especificado en la reivindicación 1 o bien una combinación de fragmentos de la misma especificada en la reivindicación 1. Especialmente preferida es la proteína MSP-1 producida de forma recombinante, en especial recombinante en E. coli. El ácido nucleico que codifica MSP-1 es preferiblemente tal que su contenido relativo de AT está disminuido. Especialmente preferido es tal ácido nucleico como se describe en DE-19640817 A1, en el que en especial los codones de Plasmodium falciparum se cambian por codones humanos, sin que por ello cambie la secuencia de amino-
ácidos.

Siempre que la vacuna comprenda tanto el virus recombinante como la MSP-1 o un fragmento de la misma, la vacuna puede estar en forma de kit. De esta manera es adecuada para la administración simultánea, secuencial o separada de ambos componentes de la vacuna.

Los ejemplos siguientes deben ilustrar la invención.

Figura 1

Estructura primaria de MSP-1 de las cepas de P. falciparum FCB-1 y MAD20

Las flechas por encima de la secuencia señalan los sitios de procesamiento de la proteína nativa (Holder et al., 1987), que corta MSP-1 en los fragmentos p83, p30, p38 y p42, que se anclan como complejo en la superficie del parásito. En el segundo paso del procesamiento p42 se divide en p33 y p19. Las flechas debajo de las representaciones señalan los sitios únicos de corte de endonucleasas de restricción de la secuencia de ADN sintético.

Abreviaturas: PS = péptido señal, AG = anclaje por GPI

Figura 2

Expresión de msp1d-38/42 en células HeLa infectadas con MVA recombinante

Se infectaron células HeLa con rMVA-msp1d/38+42S o rMVA-msp1d/38+42A y a continuación se fijaron. La segunda y cuarta filas muestran respectivamente células que después de la fijación se permeabilizaron con Triton X-100, mientras que la membrana de las células en las filas uno y tres se mantuvieron intactas. Las células así tratadas se incubaron con mAc 5.2, que reconoce un epítopo conformacional específico de MSP-1 en la región C-terminal del fragmento p19 de MSP-1 y un suero policlonal, que reconoce la proteína del RE Sec61beta (marcador anti-RE), como anticuerpo primario, éstas se marcaron por tinción mediante IgG anti-ratón conjugada con Cy3 (reconoce mAc 5.2) o IgG anti-conejo conjugada a FITC (reconoce anti-Sec61beta) y a continuación se analizaron en el microscopio confocal. Cuando las células se infectaron con rMVA-msp1d/38+42S o rMVA-msp1d/38+42A y se permeabilizaron, la señal para MSP-1D-38/42 (mAc 5.2) puede colocalizar con el marcador de RE. Cuando por el contrario las células permanecieron intactas, MSP-1D-38/42 se reconoce sólo en el caso de infección con rMVA-msp1d/38+42A en la superficie de las células infectadas. El marcador de RE actúa aquí como control para la integridad de la membrana celular.

Abreviaturas: RE = retículo endoplásmico; mAc = anticuerpo monoclonal.

Figura 3

Detección de MSP-1D-42 y MSP-1D-38/42 en células HeLa infectadas con MVA recombinante por medio de inmunotransferencia

A Se infectaron células HeLa con rMVA-msp1d/42S, rMVA-msp1d/42A, rMVA-msp1d/38+42S o rMVA-msp1d/
38+42A y se incubaron durante la noche. Se separaron muestras del sobrenadante y la fracción celular mediante electroforesis en gel de SDS en condiciones no reductoras, se transfirieron a una membrana de PVDF y se probaron con mAc 5.2 como primer anticuerpo. Solo se pudieron detectar las quimeras de la secuencia señal de DAF y el fragmento correspondiente de MSP-1D en los sobrenadantes de las células infectadas, mientras que la expresión intracelular dio una señal en todas las células infectadas con MVA recombinante.

Figura 4

Desarrollo de la respuesta inmune humoral después de tres inmunizaciones con rMVA-mps1d/42S o rMVA-mps1d/42A y una inmunización con MSP-1D-HX42 de E. coli

En A se muestra el análisis de la respuesta inmune humoral mediante ELISA con MSP-1D-HX42 producida de forma recombinante y purificada de E. coli como antígeno. Las curvas muestran el desarrollo de anticuerpos específicos de p42, medidos a la DO_{405} = 1. Los ratones se inmunizaron respectivamente en un intervalo de tres semanas con 10^{6} UI (primera inmunización, al mismo tiempo que la extracción de sangre S0) ó 10^{8} UI (1ª y 2ª dosis de recuerdo, al mismo tiempo que S1 y S2) de rMVA-msp1d/42S. Además los ratones se inyectaron por vía subcutánea después de cuatro semanas más cada uno con 5 \mug de MSP-1D-HX42 de E. coli en adyuvante incompleto de Freund (una semana después de la extracción de sangre S3). S0 a S5 muestran los tiempos de la extracción de sangre, en donde se extrajo sangre de S0 a S3 a intervalos de tres semanas respectivamente, la extracción de S4 y S5 tuvo lugar respectivamente a intervalos de cuatro semanas. Las flechas marcan los tiempos de las inmunizaciones. La estrella marca la cuarta inmunización con de MSP-1D-HX42 de E. coli.

B muestra el mismo análisis para la inmunización con rMVA-msp1d/42A.

Figura 5

Desarrollo de la respuesta inmune humoral después de inmunizaciones con rMVA-mps1d/S o rMVA-mps1d/83+30/ 38+42A en combinación con una inmunización con MSP-1D de E. coli

Se determinó la respuesta inmune humoral por medio de un ELISA con el uso de MSP-1D producida de forma recombinante purificada de E. coli como antígeno. Como en la figura 4, las curvas muestran el desarrollo de anticuerpos específicos de p42, medidos a la DO_{405} = 1. Los ratones se inmunizaron respectivamente en un intervalo de tres semanas (en la figura señalados mediante flechas). Las estrategias de inmunización de los grupos adjuntos están compuestas como sigue:

Grupo 1: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/S (día 21), 5 ratones

Grupo 2: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/A (día 21), 5 ratones

Grupo 3: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/S (día 21), 20 \mug de MSP-1D (día 42), 10 ratones

Grupo 4: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/S (día 21), 10^{8} de UI rMVA-msp1d/S (día 42), 10 ratones

Grupo 5: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/83+30/38+42A (día 21), 20 \mug de MSP-1D (día 42), 9 ratones

Grupo 6: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/83+30/38+42A (día 21), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/83+
30/38+42A (día 42), 10 ratones

Grupo 7: 20 \mug de MSP-1D (día 0), 10^{8} UI de rMVA-msp1d/A (día 21), 20 \mug de MSP-1D (día 42), 5 ratones.

A continuación los virus recombinantes que llevan a la producción de MSP-1 en forma anclada en su superficie se señalan con una "A" y aquellos para la secreción de MSP-1 con una "S".

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TABLA 1 Lista completa de las construcciones víricas producidas en el marco de la invención

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La producción de MSP-1 o los fragmentos y la localización de las proteínas en las células infectadas se detectó por medio de microscopía confocal y se muestra ejemplarmente para la infección de células HeLa con rMVA-msp1d/38+42S y rMVA-msp1d/38+42A (Fig. 2).

La secreción de todas las variantes de MSP-1 de células infectadas con MVA recombinante se detectó mediante análisis de inmunotransferencia de sobrenadantes celulares y aquí se muestra ejemplarmente para rMVA-msp1d/42S y rMVA-msp1d/38+42S (Fig. 3).

Posteriormente se investigaron los MVA recombinantes en ensayos de inmunización en ratones para su efecto inmunógeno en relación a la respuesta inmune humoral. Para ello se determinaron títulos altos de anticuerpos contra la proteína del parásito inducidos para msp-1 recombinante de MVA mediante ELISA. El título del anticuerpo específico para p42 y el diferente potencial de inmunización observado mediante proteínas ancladas a la superficie producidas por MVA recombinante o secretadas se muestra ejemplarmente para la inmunización con rMVA-msp1d/42S y rMVA-msp1d/42A (Fig. 4).

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Claims (12)

1. Vacuna que comprende

a)

un virus MVA recombinante, que comprende un fragmento o fragmentos del ácido nucleico que codifica la proteína MSP-1 de Plasmodium falciparum; y

b)

un vehículo farmacológicamente aceptable,

en donde el fragmento de MSP-1 o los fragmentos de MSP-1 codificado(s) por el ácido nucleico se elige(n) exclusivamente de:

\bullet

p42;

\bullet

p42 y p38;

\bullet

p83, p30, p42 y p38.

2. Vacuna según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína MSP-1 es la proteína MSP-1 del aislado 3D7 o la proteína MSP-1 de la cepa FCB1.

3. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada en que el ácido nucleico que codifica MSP-1 tiene un contenido en AT reducido comparado con la secuencia salvaje.

4. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que el ácido nucleico está bajo el control de un promotor.

5. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada en que el ácido nucleico está fusionado en el extremo 5' con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de un péptido señal.

6. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia del péptido señal dirige la secreción del producto génico.

7. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia del péptido señal dirige la localización estable a la membrana del producto génico.

8. Vacuna según la reivindicación 5, caracterizada en que la secuencia señal dirige el anclaje por GPI del producto génico.

9. Vacuna según la reivindicación 8, caracterizada en que la vacuna contiene además como componente c) MSP-1 y/o un fragmento de la misma especificado en la reivindicación 1 o una combinación de fragmentos de la misma especificados en la reivindicación 1.

10. Vacuna según la reivindicación 9, caracterizada en que los componentes a) y c) se pueden administrar de forma simultánea, secuencial o por separado.

11. Uso de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción de un medicamento para la profilaxis o terapia de la malaria.

12. Uso de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y de MSP-1 y/o un fragmento de la misma especificado en la reivindicación 1 o una combinación de fragmentos de la misma especificados en la reivindicación 1 para la producción de un medicamento para la profilaxis o terapia de la malaria.