ES2339951T3 - Compuestos unidos a un calixareno que se unen a factores de crecimiento. - Google Patents
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Abstract
Compuesto que se une a un factor de crecimiento según la estructura calixarénica (I): **(Ver fórmula)** en la que cada R1 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** en la que cada R2 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**
Description
Compuestos unidos a un calixareno que se unen a
factores de crecimiento.
La capacidad de los tumores para crecer más allá
de unos pocos milímetros cúbicos en volumen depende de la formación
de nuevos vasos sanguíneos en el microentorno de los tumores
(Ferrara, N. Nat Rev Cáncer, 2002, 2:795-803;
Kerbel, R.S. Carcinogenesis, 2000, 21:505-15;
Carmeliet, P. y Jain, R.K. Nature, 2000, 407:249-57;
Yancopoulos, G.D. et al. Nature, 2000,
407:242-8). Este proceso angiogénico es disparado
por varios factores de crecimiento claves que son segregados por el
tumor. Los factores de crecimiento no sólo se unen a sus receptores
en células endoteliales y estimulan su proliferación iniciando la
formación de nuevos vasos sanguíneos, sino también se unen a
receptores en células accesorias tales como pericitos que mantienen
la integridad de los vasos (Ferrara, N. Nat Rev Cáncer, 2002,
2:795-803; Kerbel, R.S. Carcinogenesis, 2000,
21:505-15; Carmeliet, P. y Jain, R.K. Nature, 2000,
407:249-57; Yancopoulos, G.D. et al. Nature,
2000, 407:242-8; Helmlinger, G., et al. Nat
Med, 1997, 3:177-82; Holash, J. et al.
Science, 1999, 284:1994-8). Entre los factores de
crecimiento más estudiados están el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF). Varios estudios han demostrado la participación de estos dos
factores de crecimiento en el proceso angiogénico, desempeñando el
VEGF un papel clave principalmente en la iniciación de la formación
de nuevos vasos sanguíneos, y estando el PDGF implicado en el
mantenimiento de estos vasos (Bergers, G. et al. J Clin
Invest, 2003, 111:1287-95; Dvorak, H.F. J Clin
Oncol, 2002, 20:4368-80; Ferrara, N. Curr Top
Microbiol Immunol, 1999, 237:1-30; Dvorak, H.F.
et al. Curr Top Microbiol Immunol, 1999,
237:97-132; Eriksson, U. y Alitalo, K. Curr Top
Microbiol Immunol, 1999, 237:41-57).
Esta observación ha alentado un interés en
diseñar estrategias para suprimir las funciones de VEGF y PDGF, con
el objetivo final de inhibir la angiogénesis y privar de alimento a
los tumores. Los enfoques que se han tomado se basaron en
seleccionar como dianas las etapas bioquímicas implicadas en el
mecanismo de acción de estos factores de crecimiento. Aquellos
incluyen inhibir la unión de VEGF y PDGF a sus receptores
respectivos usando anticuerpos contra los factores de crecimiento.
Uno de estos, AVASTINA, que selecciona como diana a VEGF, ha sido
aprobado recientemente para uso clínico en pacientes con cáncer
colorrectal metastásico (Zhang, W. et al. Angiogenesis, 2002,
5:35-44; Ferrara, N. Semin Oncol, 2002,
29:10-4). Otro enfoque ha implicado el desarrollo de
inhibidores de las actividades de tirosina cinasas de los receptores
de PDGF y VEGF, dando como resultado la supresión de las rutas de
transducción de señales aguas abajo disparadas por estos factores de
crecimiento (Kerbel, R.S. Carcinogenesis, 2000,
21:505-15; Jain, R.K. Semin Oncol, 2002,
29:3-9; Morin, M.J. Oncogene, 2000,
19:6574-83; Miao, R.Q. et al. Blood, 2002,
100:3245-52; Laird, A.D. et al. Cáncer Res,
2000, 60:4152-60; Wedge, S.R. et al. Cáncer
Res, 2000, 60:970-5). La mayoría de estos agentes
imitan la estructura de ATP, y algunos son potentes agentes
antitumorales que actualmente están en ensayos clínicos. Sin
embargo, todavía ninguno ha sido aprobado por la FDA.
La aprobación por la FDA de AVASTINA
(bevacizumab), que incrementa en 5 meses la supervivencia media de
pacientes con cáncer colorrectal metastásico, valida adicionalmente
la selección como diana de procesos angiogénicos como una estrategia
para tratar cáncer (Ferrara, N. Semin Oncol, 2002,
29:10-4). Sin embargo, es necesario hacer mucho más
para explotar completamente este enfoque. Por ejemplo, en otros
ensayos clínicos, AVASTINA no pudo prolongar las vidas de pacientes
con cáncer de mama metastásico. Una posible explicación para esta
actividad inconsistente es que el cáncer de mama metastásico
avanzado puede burlar la terapia angiogénica
anti-VEGF por medio de otros factores de
crecimiento. De hecho, el apoyo para esta sugerencia procede de
estudios preclínicos que muestran que el cáncer de mama temprano
segrega principalmente VEGF, mientras que el cáncer de mama avanzado
segrega factores de crecimiento adicionales (Relf, M. et al.
Cáncer Res, 1997, 57:963-9). Además, en un modelo de
cáncer pancreático de animal, SU5416, un inhibidor de tirosina
cinasa del receptor de VEGF, suprime el desarrollo temprano, pero no
tardío, de tumores pancreáticos. De forma más importante en el mismo
modelo, el tratamiento con SU6668 (que inhibe tirosina cinasas tanto
de receptores de VEGF como de PDGF) indujo la regresión de tumor
pancreático avanzado en la etapa tardía de desarrollo (Bergers, G.
et al. J Clin Invest, 2003, 111: 1287-95),
sugiriendo que el fracaso de la terapia anti-VEGF
puede ser debido a su capacidad para inhibir sólo el inicio pero no
el mantenimiento de los vasos sanguíneos. Otro apoyo para esta
sugerencia procede de un estudio muy reciente en el que AVASTINA
inhibió la formación de nuevos vasos sanguíneos, pero fue ineficaz
inhibiendo los ya consolidados, en un modelo de animal en el que se
transplantaron células de neuroblastoma en riñones de ratón (Huang,
J. et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:
7785-90). Tomado en conjunto, la presente
comprensión del proceso de angiogénesis sugiere que la selección
simultáneamente como dianas de factores de crecimiento que inician
(es decir, VEGF) así como aquellos que mantienen (es
decir, PDGF) los vasos sanguíneos puede ser un enfoque más
eficaz para la terapia contra el cáncer que la selección de sólo un
factor de crecimiento.
Un objetivo de la presente invención consiste en
diseñar una familia de compuestos que se unen a VEGF y/o PDGF e
inhiben la unión de estos factores de crecimiento a sus receptores
de las superficies celulares respectivos. Por ejemplo, se encontró
que el compuesto GFB204, es un inhibidor potente y selectivo de la
estimulación de VEGF y PDGF de su fosforilación y señalización
(Erk1/2, Akt y STAT3) de tirosina cinasas receptoras. Este agente
farmacológico también inhibió potentemente la migración de células
endoteliales y la formación de redes capilares in vitro, así
como la formación de vasos sanguíneos in vivo y el
crecimiento de tumores humanos en xenoinjertos de ratones
atímicos.
Otro objetivo adicional de la presente invención
consiste en proporcionar composiciones farmacéuticas de la familia
de compuestos citada anteriormente. También se explican métodos para
administrar los mismos.
La Figura 1 muestra estructuras de GFB204 de la
presente invención, que tienen grupos de ácido isoftálico acíclicos
unidos a un armazón orgánico no peptídico, así como
GFB-111.
Las Figuras 2A-2C muestran que
GFB204 inhibe la unión de ^{125}I-VEGF y
^{125}I-PDGF pero no de
^{125}I-EGF a sus receptores en fibroblastos de
ratón. Se incubaron células Flk-1/NIH 3T3, NIH 3T3 y
EGFR/NIH 3T3 con ^{125}I-VEGF,
^{125}I-PDGF y ^{125}I-EGF
(50.000 cpm/pocillo) respectivamente, junto con concentraciones
crecientes de GFB204. Las células se incubaron a 4ºC durante 0,5
horas, después se lavaron tres veces con PBS y tres veces con tampón
de lisis antes de determinar los recuentos de ^{125}I como se
describe en Materiales y Métodos. Se usó un exceso de VEGF, PDGF, y
EGF fríos para obtener niveles de unión no específica. Las Figuras
2A-2C muestran la unión específica (% de control)
para PDGFR, Flk-1, y EGFR, respectivamente.
Las Figuras 2D y 2E ilustran que
GFB-204 se une a PDGF y VEGF como se indica mediante
el factor de crecimiento triptófano cuando se añaden cantidades
crecientes de GFB204 a PDGF y VEGF, respectivamente. La
fluorescencia se monitorizó mediante excitación a 295 nm y 228 nm,
respectivamente, y emisión a 334 nm.
Las Figuras 3A y 3B muestran el efecto de GFB204
sobre la fosforilación de Erk1, Erk2, Akt, y STAT3 estimulada por el
factor de crecimiento. GFB204 inhibe la estimulación por VEGF y PDGF
de la fosforilación de tirosina de Flk-1 y la
fosforilación de Erk1/Erk2 (Figura 3A). Se trataron células NIH 3T3
o células Flk-1/NIH 3T3 con cantidades crecientes
de GFB204 durante 5 minutos antes de la estimulación con PDGFBB (10
ng/ml) o VEGF (50 ng/ml), respectivamente, durante 10 minutos. Las
células se lisaron entonces y se procesaron para la transferencia
Western mediante SDS-PAGE con un anticuerpo
específico para fosfotirosina-Flk-1
o antifosfotirosina para la fosforilación de tirosina de PDGFR o
fosfo-Erk1/2. GFB204 afecta a la fosforilación de
Erk1, Erk2, Akt, y STAT3 estimulada por el factor de crecimiento
(Figura 3B). Células NIH 3T3, Flk-1/NIH 3T3,
IGF-1R/NIH 3T3 o EGFR/NIH 3T3 se trataron con GFB204
(10 \muM) antes de la estimulación con PDGF (NIH 3T3), VEGF
(Flk-1/NIH 3T3), EGF (EGFR/NIH 3T3), bFGF (NIH 3T3)
o IGF-I (IGF-1R/NIH 3T3). Las
células se recogieron entonces y se procesaron para la transferencia
Western mediante SDS-PAGE con anticuerpos
específicos para fosfo-Erk1/2,
fosfo-Akt y fosfo-STAT3.
Las Figuras 4A-4C muestran los
efectos de GFB204 sobre la angiogénesis in vitro. GFB204
inhibe la formación de redes capilares de una manera de respuesta
frente a la dosis (Figura 4C). Se sembraron sobre Matrigel células
endoteliales de arteria cerebral central humana (5 x 10^{4}), y
las células se incubaron con VEGF en presencia (Figura 4B) o
ausencia (Figura 4A) de GFB204, como se describe en Materiales y
Métodos.
Las Figuras 5A-5C ilustran que
GFB204 inhibe potentemente in vitro la migración de células
endoteliales de cerebro humano dependiente de VEGF. La migración de
células endoteliales de cerebro humano adultas se evaluó usando un
ensayo de cámara de Boyden modificado, como se describe en
Materiales y Métodos. Se añadió control de vehículo (Figura 5A) o
GFB204 (Figura 5B) a medio que contiene 2% de FBS en la cámara
exterior, y se determinó tras una incubación de 18 horas (Figura 5C)
el número de células que migraron a la cámara inferior que contiene
VEGF.
La Figura 6 ilustra que GFB204 inhibe el
crecimiento de xenoinjertos A-549 en ratones
atímicos (Figura 6). Se implantaron células A-549 en
los flancos de ratones atímicos y, cuando los tumores alcanzaron un
tamaño medio de alrededor de 100 mm^{3}, los ratones se
seleccionaron al azar y se trataron con vehículo (\ding{117}) o
con GFB204 a 1 mg/kg (\ding{110}) y 5 mg/kg (\medbullet), y los
tamaños de los tumores se midieron como se describe en Materiales y
Métodos. Los tumores se procesaron dos horas tras la última
inyección i.p. para la tinción inmunohistoquímica IHC de CD31, como
se describe en Materiales y Métodos.
Las Figuras 7A-7B ilustran la
tinción IHC de CD31 como se describe en Materiales y Métodos para
tumores procesados dos horas después de la última inyección i.p.
para un control (Figura 7A) y GFB204 (Figura 7B). La cuantificación
de la densidad de los microvasos (400X) se determinó como se
describe en Materiales y Métodos. SE, error estándar. Recuento de
los microvasos de las Figuras 7A y 7B; Fig. 7A = 11,3 \pm 1,9;
Fig. 7B = 2,6 \pm 0,9.
Células NIH 3T3 que sobreexpresan
Flk-1/KDR (Flk-1NIH 3T3) o células
NIH 3T3, privadas de alimento, se pretrataron con GFB durante 5
minutos antes de la estimulación con VEGF (50 ng/ml) o
PDGF-BB (10 ng/ml) durante 10 min., respectivamente.
Las células se cosecharon entonces y se lisaron, y las proteínas de
los lisados se separaron mediante SDS-PAGE y se
transfirieron a nitrocelulosa. Las membranas se inmunotransfirieron
entonces con anticuerpo
anti-fosfo-VEGFR2 (Cell Signaling
Technologies, Beverly, MA) para Flk-1 activado, o
con anticuerpo anti-fosfo-tirosina
(4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) para PDGFR activado.
La fosfotirosina Flk-1 y PDGFR se cuantificaron
usando un densitómetro formador de imágenes modelo
GS-700 de Bio-Rad
(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hércules, CA)
(Blaskovich, M.A. et al. Nat Biotechnol, 2000,
18:1065-70).
Células NIH 3T3 (PDGF-BB, bFGF),
células NIH 3T3 que sobreexpresan EGFR (EGFR/NIH 3T3, EGF),
Flk-1 (Flk-1/NIH 3T3, VEGF), e
IGF-1R NIH 3T3 (IGF-1R/NTH 3T3,
IGF-1), privadas de alimento, se pretrataron con la
concentración indicada de GFB204 durante 5 minutos antes de la
estimulación durante 10 minutos con PDGF-BB (10
ng/ml), EGF (100 ng/ml), bFGF (50 ng/ml), VEGF (50 ng/ml) e
IGF-1 (50 ng/ml). Los lisados celulares se hicieron
correr sobre geles de SDS-PAGE, después se
transfirieron a nitrocelulosa y se realizó una transferencia Western
con anti-Erk1/Erk2 fosforilado (Cell Signaling
Technologies), anti-Akt fosforilado o
anti-STAT3 fosforilado, como se describió
previamente (Blaskovich, M.A. et al. Cáncer Res, 2003,
63:1270-9).
Unión de factores de crecimiento marcados con
^{125}I a sus receptores. El ensayo de unión de
^{125}I-VEGF, ^{125}I-PDGF y
^{125}I-EGF a sus receptores respectivos se llevó
a cabo como se describió previamente (Blaskovich, M.A. et al.
Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). De forma breve,
células Flk-1/NIH 3T3, células NIH 3T3 y células
EGFR/NIH 3T3 se incubaron con ^{125}I-VEGF,
^{125}I-PDGF y ^{125}I-EGF
(50.000 cpm/pocillo), respectivamente, y con cantidades crecientes
de GFB204. Las células se incubaron a 4ºC durante 0,5 horas, después
se lavaron tres veces con PBS y tres veces con 25 mM de Tris, pH
8,0, 1% de Triton-X-100, 10% de
glicerol, y 1% de SDS antes de determinar los recuentos de ^{125}I
en un contador gamma (Beckmann Inc.). Se usó un exceso de factores
de crecimiento fríos para obtener niveles de unión no
específica.
Formación de la red capilar. Se colocaron
200 \mul de Matrigel en cada pocillo de una placa de cultivo de 24
pocillos a 4ºC, y se dejó que polimerizaran mediante incubación a
37ºC como se describió previamente (Papadimitriou, E. et al.
Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282:306-13). Se
sembraron células endoteliales de arteria cerebral central humana (5
x 10^{4}) en el Matrigel en 1 ml de EBM que contiene VEGF (20
ng/ml). Las células se incubaron en presencia o ausencia de GFB204 a
las concentraciones indicadas en la leyenda de la figura. Cada
muestra se fotografió usando una lente de objetivo 10X, y se
cuantificó la longitud total de las estructuras del tubo en cada
fotografía usando el software Image Pro Plus (Media Cybernetic,
Inc., MD).
Ensayo de migración de células endoteliales
del cerebro humano. La migración de células endoteliales de
cerebro humano adultas se evaluó usando un ensayo de cámara de
Boyden modificada (BD BioCoat Matrigel Invasión Chamber)
(Papadimitriou, E. et al. Biochem Biophys Res Commun, 2001,
282:306-13). Las células se colocaron en placas a 4
x 10^{4} ml sobre una membrana de 8 \mum de tamaño de poros
revestida con una capa delgada de matriz de membrana de basamento
Matrigel. Se añadió GFB204 al medio en la cámara externa, y las
células se cultivaron durante 18 horas en condición dependiente de
VEGF en la cámara inferior (VEGF 20 ng/ml). Las células no invasoras
se eliminaron de la superficie superior con un tapón de algodón. Los
insertos membránicos se fijaron entonces con paraformaldehído al 4%
y se tiñeron con colorante de violeta de cristal. El número de
células que migró a la subsuperficie de los filtros se cuantificó
contando las células que migraron en los campos microscópicos
seleccionados al azar (10X). Las muestras se analizaron en busca de
diferencias significativas usando la prueba de la t de Student para
muestras
independientes.
independientes.
Actividad antitumoral en el modelo de
xenoinjerto de tumor de ratón atímico. Los ratones atímicos
(Charles River, Wilmington, MA) se mantuvieron según los
procedimientos y guías de Institutional Animal Care and Use
Committee (IACUC). Se cosecharon células A-549 y se
resuspendieron en PBS, después se inyectaron s.c. en los flancos
derecho e izquierdo (10 x 10^{6} células por flanco) de ratones
atímicos hembra de 8 semanas como se dio a conocer previamente (Sun,
J. et al. Cáncer Res, 1999, 59:4919-26).
Cuando los tumores alcanzaron alrededor de 100 mm^{3}, los
animales se dosificaron i.p. con 0,2 ml de disolución una vez al
día. Los animales del control recibieron un vehículo, mientras que
los animales tratados fueron inyectados con GFB204 (1 ó 5
mg/kg/día). Los volúmenes de los tumores se determinaron midiendo la
longitud (I) y la anchura (w), y calculando el volumen (V =
lw^{2}/2) como se describió previamente (Sun, J. et al.
Cáncer Res, 1999, 59:4919-26). La significancia
estadística entre los animales del control y los animales tratados
se evaluó usando la prueba de la t de Student.
Estudio IHC. En el día de la terminación
de los experimentos antitumorales, los tumores se extrajeron y se
fijaron durante 6 horas en formalina tamponada neutra al 10%. Tras
la fijación, las muestras tisulares se procesaron en bloques de
parafina. Se obtuvieron secciones tisulares (4 \mum de grosor) de
los parabloques, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E)
usando técnicas histológicas estándar. También secciones tisulares
se sometieron a inmunotinción para CD31 (BD Biosciences, San Diego,
CA) usando la técnica del complejo de
avidina-biotina-peroxidasa
(Blaskovich, M.A. et al. Nat Biotechnol, 2000,
18:1065-70). Se usó anticuerpo monoclonal de ratón a
una dilución 1:50, seguido de la recuperación del antígeno por
microondas (cuatro ciclos de 5 minutos cada uno en alto en tampón de
citrato
0,1 M).
0,1 M).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a compuestos
que se unen a factor de crecimiento. Más particularmente, la
presente invención se refiere a compuestos (tales como los mostrados
en la Tabla 1) que se unen a factores de crecimiento tales como VEGF
y/o PDGF, y son capaces de inhibir la unión de uno o más de estos
factores de crecimiento a sus receptores de la superficie celular
respectivos. La invención también se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden uno o más de estos compuestos, y a un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, la presente invención se refiere a
métodos para inhibir la unión de tales factores de crecimiento a
células poniendo en contacto uno o más compuestos de la invención (o
composiciones que comprenden uno o más de los compuestos) con las
células in vitro. En otros aspectos, la presente invención
incluye métodos para inhibir la fosforilación (por ejemplo,
fosforilación de Erk1, Erk2, Akt, y/o STAT3) estimulada por factores
de crecimiento; métodos para inhibir la angiogénesis; y métodos para
inhibir el crecimiento de cánceres y/o de tumores poniendo en
contacto uno o más compuestos o composiciones de la presente
invención con células diana in vitro.
En una realización específica, la presente
invención se refiere a un método útil para inhibir factores de
crecimiento para que no se unan a células, para inhibir la
fosforilación estimulada por factores de crecimiento, para inhibir
la angiogénesis, para inhibir el crecimiento de cánceres y de
tumores, o una combinación de los mismos, en el que el método
comprende poner en contacto por lo menos un compuesto que se une a
un factor de crecimiento, o una sal farmacéuticamente aceptable de
cualquiera de los compuestos que se unen a un factor de crecimiento,
con una célula in vitro, en el que los compuestos que se unen
a un factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos de
ácido isoftálico acíclicos unidos a un armazón orgánico no
peptídico; en el que cada uno de los compuestos que se unen a un
factor de crecimiento, o la sal farmacéuticamente aceptable de
cualquiera de los compuestos que se unen a un factor de crecimiento,
pueden o no ser portados en un vehículo farmacéuticamente aceptable,
excepto para el compuesto que tiene la estructura general:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada R1
es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y cada R2
es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todavía en otra forma de realización específica,
una composición farmacéutica de la presente invención es adecuada
para ser administrada localmente o sistémicamente a un paciente para
lograr la inhibición de la angiogénesis, la inhibición del
crecimiento tumoral, y/o la inhibición del cáncer.
\newpage
El compuesto que se une a factores de
crecimiento de la presente invención tiene la estructura
general:
en la que cada R1 se selecciona
independientemente de entre los siguientes grupos
químicos:
y cada R2 se selecciona
independientemente de entre los siguientes grupos
químicos:
\vskip1.000000\baselineskip
En formas de realización específicas, el
compuesto de la presente invención se selecciona de entre el grupo
que consiste en GFB201, GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206,
GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211, GFB212, GFB213, GFB214,
GFB215, GFB216, GFB217, GFB218, y GFB219 (como se establece en
la
Tabla 1).
Tabla 1).
Los factores de crecimiento que son
seleccionados como dianas o sobre los que se actúan mediante los
compuestos de la presente invención pueden incluir factores de
crecimiento derivados de plaquetas, un factor de crecimiento
endotelial vascular, o ambos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición que comprende por lo menos un compuesto
de la invención, como se describe aquí, o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En
otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los
compuestos de la invención en la preparación de un medicamento para
uso en un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad
que comprende exceso de proliferación celular, exceso de
angiogénesis, un tumor, o una combinación de cualquiera de los
anteriores, en el que el método comprende administrar al paciente
una cantidad eficaz de un compuesto o composición de la invención.
En una realización específica, el tumor puede expresar cantidades
elevadas de un factor de crecimiento, tal como factor de crecimiento
derivado de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o
ambos. También niveles elevados de PDGF y VEGF podrían provenir del
microentorno del tumor debido a células endoteliales y vasos
angiogénicos.
Todavía en otra forma de realización específica,
la presente invención proporciona el uso de los compuestos de la
invención en la preparación de un medicamento para uso en un método
para tratar un paciente que tiene una enfermedad que comprende
exceso de proliferación celular, exceso de angiogénesis, un tumor, o
una combinación de cualquiera de los anteriores, en el que el método
comprende administrar una cantidad eficaz de una composición
farmacéutica, en el que la composición farmacéutica comprende por lo
menos un compuesto que se une a un factor de crecimiento, o una sal
farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los compuestos que se
unen a un factor de crecimiento, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable; o uno o más compuestos que se unen a un factor de
crecimiento, en el que los compuestos que se unen a un factor de
crecimiento comprenden una pluralidad de grupos de ácido isoftálico
acíclicos unidos a un armazón orgánico no peptídico excepto para el
compuesto que tiene la estructura general:
en la que cada R1
es:
y cada R2
es:
Las formulaciones (también denominadas aquí como
composiciones) incluyen aquellas adecuadas para la administración
oral o sistémica, tal como la administración oral, rectal, nasal,
tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal,
parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e
intradérmica) y pulmonar. Las formulaciones se pueden presentar
convenientemente en forma farmacéutica unitaria, y se pueden
preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica
de farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de asociar el
ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más
ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan
asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos
líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y
entonces, si es necesario, conformando el producto. Las
formulaciones de la presente invención adecuadas para administración
oral se pueden presentar como unidades discretas tales como
cápsulas, saquitos o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad
predeterminada del ingrediente activo; o como una emulsión líquida
de aceite en agua, una emulsión líquida de agua en aceite, o como un
suplemento en una disolución acuosa, por ejemplo un té. El
ingrediente activo también se puede presentar como un bolo,
electuario, o pasta.
Las formulaciones adecuadas para administración
tópica en la boca incluyen pastillas para chupar, que comprenden el
ingrediente activo en una base con sabor, habitualmente sacarosa y
goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente
activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa
y goma arábiga; y colutorios que comprenden el ingrediente activo en
un vehículo líquido adecuado.
Las composiciones farmacéuticas para
administración tópica según la presente invención se pueden formular
como un ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, disolución,
pasta, gel, pulverización, aerosol o aceite. Como alternativa, una
formulación puede comprender un parche o un vendaje tal como una
venda o esparadrapo impregnado con ingredientes activos, y
opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes.
Las formulaciones adecuadas para administración
tópica al ojo también incluyen colirios en los que el ingrediente
activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente
un disolvente acuoso para el agente.
\newpage
Las formulaciones para administración rectal se
pueden presentar como un supositorio con una base adecuada que
comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
La formulación adecuada para administración
vaginal se puede presentar como pesarios, tampones, cremas, geles,
pastas, espumas o formulaciones para pulverización que contienen,
además del agente, vehículos que son conocidos en la técnica como
apropiados.
Las formulaciones adecuadas para administración
nasal, en las que el vehículo es un sólido, incluyen un polvo basto
que tiene un tamaño de partículas, por ejemplo, en el intervalo de
20 a 500 micrómetros, que se administra de una manera en la que se
esnifa, es decir, mediante inhalación rápida a través del
conducto nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la
nariz. Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un
líquido para administración mediante nebulizador incluyen
disoluciones acuosas u oleosas del agente.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles isotónicas
acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con
la sangre del receptor al que se destina; y suspensiones estériles
acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y
agentes espesantes, liposomas u otros sistemas de micropartículas
que se diseñan para dirigir específicamente el compuesto a
componentes de la sangre o uno o más órganos. Las formulaciones se
pueden presentar en recipientes cerrados herméticamente de dosis
unitaria o de múltiples dosis, tales como, por ejemplo, ampollas y
viales, y se puede almacenar en una condición liofilizada,
requiriendo sólo la adición del vehículo líquido estéril, por
ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las
disoluciones o suspensiones para inyección extemporáneas se pueden
preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del
tipo descrito previamente.
Las formulaciones de dosificación unitaria
preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o, subdosis
diaria unitaria, como se explica aquí anteriormente, o una fracción
apropiada de la misma, de un agente. Se debería entender que, además
de los ingredientes mencionados particularmente antes, las
formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes
convencionales en la técnica considerando el tipo de formulación en
cuestión. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para
administración oral pueden incluir agentes adicionales tales como
edulcorantes, espesantes, y agentes saborizantes. También se
pretende que los agentes, composiciones y métodos de la presente
invención se combinen con otras composiciones y terapias
adecuadas.
Se conocen diversos sistemas de suministro, y se
pueden usar para administrar un compuesto de la invención, por
ejemplo, encapsulamiento en liposomas, micropartículas,
microcápsulas o endocitosis mediada por receptores. Los métodos de
suministro incluyen las vías intraarterial, intramuscular,
intravenosa, intranasal, y oral. En una realización específica, las
composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar
localmente al área que necesita tratamiento; tal administración
local se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local durante
cirugía, mediante inyección, o por medio de un catéter.
Las cantidades terapéuticas se pueden determinar
empíricamente, y variarán con la patología que se esté tratando, el
sujeto que se esté tratando, y la eficacia y toxicidad del agente.
De forma similar, las formulaciones farmacéuticas adecuadas y
métodos de administración de los agentes se pueden determinar
fácilmente por los expertos en la
técnica.
técnica.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar mediante cualquiera de una variedad de vías, tal como
oralmente, intranasalmente, parenteralmente, o mediante terapia por
inhalación, y pueden tomar forma de comprimidos, pastillas para
chupar, gránulos, cápsulas, tabletas, ampollas, supositorios, o
forma de aerosol. También pueden tomar la forma de suspensiones,
disoluciones, y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes
acuosos o no acuosos, jarabes, gránulos o polvos. Además de un
compuesto de la presente invención, las composiciones farmacéuticas
también pueden contener otros compuestos farmacéuticamente activos o
una pluralidad de compuestos de la
invención.
invención.
Idealmente, el agente se debería administrar
para lograr concentraciones pico del compuesto activo en sitios de
la enfermedad. Las concentraciones pico en los sitios de la
enfermedad se pueden lograr, por ejemplo, inyectando
intravenosamente el agente, opcionalmente en disolución salina, o
administrando oralmente, por ejemplo, un comprimido, cápsula o
jarabe que contiene el ingrediente activo.
Ventajosamente, las composiciones se pueden
administrar simultánea o secuencialmente con otros fármacos o
agentes biológicamente activos, tales como agentes anticáncer. Los
ejemplos incluyen antioxidantes, agentes depuradores de radicales
libres, péptidos, factores de crecimiento, antibióticos, agentes
bacteriostáticos, inmunosupresores, anticoagulantes, agentes
tamponantes, agentes antiinflamatorios, antipiréticos, aglutinantes
de liberación en el tiempo, anestésicos, esferoides y
corticosteroides.
Preferentemente, la administración se lleva a
cabo oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, intravenosamente,
intramuscularmente, intraperitonealmente, intraarterialmente,
transdérmicamente o vía una membrana mucosa.
El término "cáncer" quiere decir cualquier
neoplasia celular maligna cuyo único rasgo es la pérdida de
controles normales lo que da como resultado el crecimiento
desregulado, falta de diferenciación, y capacidad para invadir
tejidos locales y metastatizarse. El cáncer se puede desarrollar en
cualquier tejido de cualquier órgano, más específicamente, cáncer
pretende incluir, sin limitación, cáncer de próstata, leucemia,
cánceres dependientes de hormonas, cáncer de mama, cáncer de colon,
cáncer de pulmón, cáncer epidérmico, cáncer hepático, cáncer
esofágico, cáncer de estómago, cáncer del cerebro, y cáncer del
riñón.
Los términos "tratamiento", "tratar",
y similares, quieren decir obtener un efecto farmacológico y/o
fisiológico deseado, por ejemplo, inhibición del crecimiento
de células cancerosas, o inducción de apoptosis de una célula
cancerosa. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir
completa o parcialmente una enfermedad o sus síntomas, y/o puede ser
terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una
enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad.
"Tratamiento", como se usa aquí, abarca cualquier tratamiento
de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e
incluye: (a) prevenir que ocurra una enfermedad o afección (por
ejemplo prevenir el cáncer) en un individuo que puede estar
predispuesto a la enfermedad pero al que no se le ha diagnosticado
que la tiene; (b) inhibir la enfermedad (por ejemplo, detener
su desarrollo); o (c) aliviar la enfermedad (por ejemplo,
reducir los síntomas asociados con la enfermedad).
La expresión "actividad anticancerígena"
quiere decir una actividad que es capaz de inhibir sustancialmente,
ralentizar, interferir, suprimir, prevenir, retrasar y/o detener un
cáncer y/o una metástasis del mismo (tal como la iniciación, el
crecimiento, la diseminación, y/o su progresión de tal cáncer y/o
metástasis).
Los términos "administrar",
"administración", y "poner en contacto" quieren decir un
modo de suministro, incluyendo, sin limitación, oral, rectal,
parenteral, subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal,
intraarterial, transdérmicamente o vía una membrana mucosa. El más
preferido es el oral. La administración se puede llevar a cabo
localmente, en un sitio o sitios dianas, o sistémicamente. Un
experto en la técnica reconoce que formas adecuadas de formulación
oral incluyen un comprimido, una pastilla, una cápsula, una pastilla
para chupar, un polvo, un comprimido de liberación sostenida, un
líquido, una suspensión líquida, un gel, un jarabe, una lechada y
una suspensión. Por ejemplo, una dosis diaria se puede dividir en
una, dos o más dosis en una forma adecuada para ser administrada
una, dos o más veces durante un período de tiempo.
La expresión "terapéuticamente eficaz"
quiere decir una cantidad de un compuesto de la invención suficiente
para mejorar sustancialmente algún síntoma asociado con una
enfermedad o una afección médica. Por ejemplo, en el tratamiento de
cáncer, un compuesto que disminuyera, evitara, retrasara, suprimiera
o detuviera cualquier síntoma de la enfermedad seria
terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto no se requiere para curar una enfermedad, pero
proporcionará un tratamiento para una enfermedad, de forma que el
comienzo de la enfermedad se retrase, se vea impedido, o se evite, o
se mejoren los síntomas de la enfermedad, o la duración de la
enfermedad cambia o, por ejemplo, es menos grave, o la recuperación
se acelera en un individuo.
El término "independientemente" quiere
decir que cada uno de los cuatro sustituyentes R1 y cada uno de los
cuatro sustituyentes R2 de los compuestos que se unen a un factor de
crecimiento de la presente invención pueden cada uno ser el mismo
sustituyente, o pueden cada uno ser un sustituyente diferente.
Cuando los compuestos de la presente invención
se administran en terapias de combinación con otros agentes, se
pueden administrar secuencial o concurrentemente a un individuo.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticas según la presente
invención pueden estar comprendidas por una combinación de un
compuesto de la presente invención, como se describe aquí, y otro
agente terapéutico o profiláctico conocido en la técnica.
Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente
aceptables se pueden preparar a partir de ácidos inorgánicos y
orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y
ácido fosfórico. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen
ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico y ácidos grasos.
Las sales también se pueden formar con bases.
Tales sales incluyen sales derivadas de bases inorgánicas u
orgánicas, por ejemplo sales de metales alcalinos tales como sales
de magnesio o calcio, y sales de aminas orgánicas, tales como sales
de morfolina, piperidina, dimetilamina o dietilamina.
Como se usa aquí, la expresión "vehículo
farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los
disolventes (tales como tampones de disolución salina tamponada con
fosfato, agua, disolución salina), medios de dispersión,
revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y agentes que retrasan la absorción. El uso de tales
medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien
conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio
o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se
contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden
incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden
formular según métodos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles. Las formulaciones se describen en un
número de fuentes que son bien conocidas y fácilmente disponibles
para los expertos en la técnica. Por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Science (Martin EW (1995) Easton Pennsylvania, Mack
Publishing Company, 19ª edición) describe formulaciones que se
pueden usar en relación con la presente invención.
Como se usan aquí, los términos "individuo"
y "paciente" se usan de forma intercambiable para referirse a
cualquier especie vertebrada, tales como seres humanos y animales.
Preferentemente, el paciente es de una especie mamífera. La especie
mamífera que se beneficiará de los métodos descritos incluye, pero
no se limita a, gorilas, chimpancés, orangutanes, seres humanos,
monos; animales domesticados (por ejemplo, mascotas) tales
como perros, gatos, cobayas, hámsters, cerditos enanos, conejos, y
urones; animales de granja domesticados, tales como vacas, búfalos,
bisonte, caballos, burro, cerdo, ovejas, y cabras; animales exóticos
encontrados típicamente en zoológicos, tales como oso, leones,
tigres, panteras, elefantes, hipopótamos, rinocerontes, jirafas,
antílopes, oso perezoso, gacelas, cebras, ñues, perritos de la
pradera, koalas, canguro, zarigüeyas, mapaches, pandas, hienas,
focas, leones marinos, elefantes marinos, nutrias, marsopas,
delfines, y ballenas. Los pacientes animales humanos o no humanos
pueden variar en edad desde neonatos hasta ancianos.
Según otra forma de realización de la presente
invención, se proporciona el uso de compuestos de la invención en la
preparación de un medicamento para uso en un método para tratar
cáncer, que comprende administrar a un individuo una cantidad
terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la
presente invención.
Preferentemente, un cáncer a tratar según una
realización de la presente invención se selecciona de entre el grupo
que consiste en cáncer de próstata, leucemia, cánceres dependientes
de hormonas, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón,
cáncer epidérmico, cáncer hepático, cáncer esofágico, cáncer de
estómago, cáncer del cerebro, y cáncer del riñón.
\vskip1.000000\baselineskip
Este enfoque inicial para interrumpir
interacciones proteína-proteína biológicamente
significativas tales como aquellas que implican factores de
crecimiento con sus receptores consiste en diseñar moléculas que
contienen cuatro bucles peptídicos sintéticos unidos a un armazón de
calix[4]areno (Figura 1, reacción (a)) (Blaskovich,
M.A. et al. Nat Biotechnol, 2000,
18:1065-70). Los componentes del bucle peptídico se
basaron en un hexapéptido cíclico en el que dos restos se sustituyen
por el dipéptído mimético 3-aminometilbenzoato
modificado con un grupo 5-amino para proporcionar la
unión a la cavidad calixarénica. Este diseño permitió la síntesis de
una librería de derivados de calixareno que tienen diferentes
secuencias peptídicas en los bucles y grandes áreas superficiales
capaces de unirse a superficies de proteínas. Uno de los miembros de
la librería, GFB111, se unió a PDGF y bloqueó su unión a PDGFR en
concentraciones sub\muM, y selectivamente con relación a otros
factores de crecimiento (Blaskovich, M.A. et al. Nat
Biotechnol, 2000, 18:1065-70). Los cuatro bucles
peptídicos en GFB111 contenían restos negativos e hidrófobos en la
secuencia GDGY (Figura 1, reacción (a)), que concuerdan bien con los
aminoácidos positivos e hidrófobos en los bucles I, II y III del
PDGF homodimérico, que son críticos para la unión a PDGFR (Oefner,
C. et al. Embo J, 1992, 11:3921-6; Andersson,
M. et al. Growth Factors, 1995, 12:159-64).
GFB111 y compuestos similares se describen en la Solicitud publicada
U.S. nº 2003/0118589, presentada el 21 de marzo de 2001, y en la
Solicitud Publicada Internacional nº WO 01/70930, presentada el 21
de marzo de 2001. Para mejorar este diseño, se ha diseñado una
librería de segunda generación en la que, en lugar de los simples
bucles peptídicos, se unen al armazón de calix[4]areno
grupos de ácido isoftálico acíclicos funcionalizados con un amplio
intervalo de grupos ácidos e hidrófobos (R_{1}, y R_{2}; Figura
1, reacción (b); y Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar esta librería en busca de moléculas
capaces de evitar la unión de PDGF y VEGF a sus receptores, se
determinó en primer lugar su capacidad para interrumpir la
fosforilación de tirosina del receptor estimulada por PDGF y VEGF,
como se describe en Materiales y Métodos. De los 19 compuestos en la
librería, GFB204 se identificó (en el que R_{1} es un ácido
carboxílico y R_{2} es un éster bencílico) como un potente
inhibidor de la fosforilación de tirosina tanto de VEGFR como de
PDGFR (Tabla 1), con valores IC_{50} de 190 nM (PDGF) y 480 nM
(VEGF). Todos los miembros de la librería que tienen por lo menos
cuatro grupos carboxílicos, inhibieron la señalización de PDGF a
concentraciones bajas de \muM (IC_{50} \leq 6 \muM),
mientras que el único compuesto que carece de grupos ácidos (GFB217)
no tuvo una actividad significativa. El análisis de los datos en la
Tabla 1 reveló que todos los potentes inhibidores (que tienen
IC_{50} \leq 0,6 M) contienen R_{1} = COOH y R_{2} = éster
hidrófobo o amida. GFB211, en el que R_{2} = bencilamida, tiene
una actividad sólo ligeramente menor (IC_{50} = 1,34 \pm 0,32
\muM) que GFB204, mientras que GFB209 (R_{2} = éster metílico)
es menos potente (IC_{50} = 2,9 \pm 2,05 \muM). Estos datos
sugieren que la estructura de los sustituyentes hidrófobos no es
crucial para la inhibición de la señalización de PDGF, en tanto que
sean más grandes que un grupo metilo. Los compuestos que tienen
grupos aromáticos y alifáticos son igualmente activos, y las amidas
más estables tienen actividad similar a sus análogos de éster.
Por el contrario, los derivados de calixareno
que contienen sustituyentes aminoácidos (es decir, GFB202,
GFB203, GFB205, GFB206, GFB207 y GFB208), muestran en general menor
actividad (IC_{50} en el intervalo 1-6 \muM).
Esto puede ser debido a un cambio en la relación de grupos iónicos a
hidrófobos en el armazón (estos derivados tienen
8-16 ácidos carboxílicos y sólo 0-4
sustituyentes hidrófobos), o a una distancia no óptima entre ellos.
Además, la presencia de grupos ácidos en el espaciador isoftálico
parece ser más importante que la presencia de sustituyentes
hidrófobos: GFB201, GFB202, GFB203, y GFB206 carecen de grupos
hidrófobos en las posiciones R_{1} y R_{2} pero son más potentes
que GFB217, el cual no tiene grupos carboxilato. Posiblemente, los
propios grupos de ácido isoftálico proporcionan un área hidrófoba
que interacciona con las regiones hidrófobas del dominio de unión de
PDGF a los receptores.
Finalmente, es importante señalar que los
compuestos más activos en el estudio tienen exactamente un ácido
carboxílico y un grupo hidrófobo en los cuatro componentes
isoftálicos dentro del armazón, consistente con estudios previos que
condujeron a la identificación de GFB111 (Blaskovich, M.A. et
al. Nat Biotechnol, 2000, 18:1065-70). Los
estudios de relación estructura-actividad (SAR)
también revelaron que las características necesarias en esta serie
para la inhibición de la fosforilación de tirosina de
Flk-1 estimulada por VEGF son mucho más
restrictivas. De hecho, aparte de GFB204 (IC_{50} = 0,48 \pm
0,31 \muM), sólo otro compuesto potente, GFB213, inhibió la
fosforilación de tirosina de Flk-1 con un valor
IC_{50} de 0,85 \pm 0,44 \muM (Tabla 1). Los factores que
determinan la inhibición de la actividad con respecto a la
señalización de VEGF son difíciles de inferir a partir de los datos
en la Tabla 1.
GFB204 se une tanto a PDGF como a VEGF. La
capacidad de GFB204 para unirse tanto a VEGF como a PDGF se demostró
mediante curvas de valoración mediante fluorescencia. Tanto VEGF
como PDGF contienen triptófanos que fluorescen a 334 nM cuando se
excitan a 294 nM. Las Figuras 2D y 2E muestran que concentraciones
crecientes de GFB-204 disminuyeron, de una manera
dependiente de la concentración, la capacidad de PDGF y VEGF para
fluorescer.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de GFB204 para inhibir la
fosforilación de tirosina del receptor estimulada por PDGF y VEGF
sugirió que GFB204 interrumpe la unión de ligando/receptor, la
dimerización del receptor o la actividad de tirosina cinasas
receptoras. Por lo tanto, se determinó si GFB204 inhibe la
interacción entre PDGF y VEGF y sus receptores respectivos pero no
otros factores de crecimiento. Para este fin, se evaluó la capacidad
de GFB204 para bloquear la unión de
[I-125]-PDGF,
[I-125J-VEGF y
[I-125]EGF a su receptor en células NIH 3T3
(PDGF), células NIH 3T3 que sobreexpresan Flk-1
(VEGF) humano y EGFR (EGF) humano, como se describe en Materiales y
Métodos. GFB204 inhibió eficazmente la unión de
[I-125]PDGF e
[I-125]-VEGF a sus receptores, con
valores IC_{50} de 154 +/-1,0 nM y 469 +/- 94 nM, respectivamente
(Figuras 2A-2C). Por el contrario, la unión de
[I-125]EGF a su receptor no se vio afectada
por GFB204 con concentraciones tan elevadas como 100 \muM. De este
modo, GFB204 es más selectivo para PDGF y VEGF con respecto a
EGF.
\vskip1.000000\baselineskip
Para documentar adicionalmente la selectividad
de GFB204 por PDGF y VEGF con respecto a otros factores de
crecimiento, se determinó la capacidad de GFB204 para bloquear la
estimulación por factores de crecimiento de las cinasas Erk1, Erk2 y
Akt, así como el transductor de señal y activador de la
transcripción STAT3. Para este fin, células NIH 3T3 (PDGF y bFGF) o
células NIH 3T3 que sobreexpresan Flk-1 (VEGF), EGFR
(EGF) o IGF-IR (IGF-1) se privaron
de alimento y se estimularon con el correspondiente factor de
crecimiento en presencia o ausencia de GFB204, y las células se
procesaron para la inmunotransferencia Western con
anti-fosfotirosina (PDGF y VEGF) y para
anti-fosfo-Erk1/2, Akt y STAT3
(PDGF, VEGF, EGF, bFGF e IGF-1), como se describe en
Materiales y Métodos. La Figura 3A muestra que, como se describe en
la Tabla 1, el tratamiento de células privadas de alimento con PDGF
o VEGF dio como resultado la potente estimulación de la
fosforilación de tirosina del receptor, y que el tratamiento con
GFB204 inhibió esta estimulación con valores IC_{50} de 190 nM y
480 nM, respectivamente. De forma similar, la estimulación por PDGF
y VEGF de Erk1 y Erk2 también se inhibió con valores IC_{50}
similares. Adicionalmente, esta inhibición fue selectiva por cuanto
GFB204 bloqueó la estimulación por PDGF y VEGF, pero tuvo poco
efecto sobre la estimulación por EGF, bFGF e IGF-1,
de la fosforilación de Erk1, Erk2, Akt y STAT3 (Figura 3B).
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de GFB204 para inhibir potente y
selectivamente la unión del ligando PDGF y VEGF al receptor y la
señalización subsiguiente alentó a determinar si este agente podría
inhibir la angiogénesis in vitro e in vivo e inhibir
subsiguientemente el crecimiento tumoral. En primer lugar, se
determinó si GFB204 podría inhibir la angiogénesis in vitro
evaluando su capacidad para suprimir la formación de redes capilares
endoteliales de cerebro humano inducida por VEGF, como se describe
en Materiales y Métodos. GFB204 fue altamente eficaz inhibiendo la
formación de redes capilares inducida por VEGF, con un valor
IC_{50} de 700 nM (Figura 4C). Después se determinó la capacidad
de GFB204 para inhibir la migración de células endoteliales de
cerebro humano como se describe en Materiales y Métodos. GFB204
inhibió la migración de células endoteliales inducida por VEGF a
través de poros de matrigel en la cámara inferior, con un valor
IC_{50} de 600 nM (Figura 4B).
La capacidad de GFB204 para inhibir la unión de
VEGF y PDGF a sus receptores y la señalización subsiguiente,
acoplado con su capacidad para inhibir la migración de células
endoteliales y la formación de redes capilares inducidas por VEGF,
sugirió que GFB204 puede inhibir la angiogénesis y la tumorigénesis
en animales completos. Por lo tanto, a continuación se evaluó si
GFB204 es capaz de suprimir el crecimiento tumoral y la angiogénesis
in vivo implantando subcutáneamente células
A-549 de cáncer de pulmón humano en ratones
atímicos. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 100
mm^{3}, los ratones se trataron con vehículo o GFB204, y 3 semanas
más tarde los tumores se retiraron y se procesaron para
inmunotinción con CD31 para determinar los efectos antiangiogénicos
de GFB204 como se describe en Materiales y Métodos. Los tumores de
los animales del control crecieron hasta un tamaño medio de 749
\pm111 mm^{3} (Figura 6). Por el contrario, los tumores de
animales tratados con GFB204 crecieron hasta un tamaño medio de sólo
650 \pm 114 mm^{3} (GFB204; 1 mg/kg), y 284 \pm 108 mm^{3}
(GFB204; 5 mg/kg), respectivamente. De este modo, el tratamiento con
GFB204 dio como resultado una inhibición estadísticamente
significativa (p < 0,05) del crecimiento tumoral a 5 mg/kg (73%),
pero no a 1 mg/kg (15%). Las secciones tumorales de animales
tratados con GFB204 muestran una inhibición significativa de la
tinción con CD31 (Figuras 5A-5C). La cuantificación
de los microvasos a un aumento de campo (400X) indicó que los
tumores de ratones tratados con vehículo contenían 11,3 \pm 1,9
microvasos, mientras que los de los ratones tratados con GFB204 (5
mg/kg) tuvieron sólo 2,6 \pm 0,9 microvasos. Tomados en conjunto,
los resultados demuestran claramente que GFB204 inhibe el
crecimiento tumoral y angiogénesis in vivo de xenoinjertos
A-549.
El estricto requisito y la dependencia
restrictiva del crecimiento tumoral con la angiogénesis ha alentado
a muchos investigadores a diseñar estrategias para la terapia contra
el cáncer interrumpiendo la angiogénesis, dando como resultado la
privación de nutrientes a las células del cáncer, y esencialmente la
muerte por falta de alimentos del tumor (Zhang, W. et al.
Angiogenesis, 2002, 5:35-44; Ferrara, N. Semin
Oncol, 2002, 29:10-4; Jain, R.K. Semin Oncol, 2002,
29:3-9; Morin, M.J. Oncogene, 2000,
19:6574-83; Miao, R.Q. et al. Blood, 2002,
100:3245-52; Laird, A.D. et al. Cáncer Res,
2000, 60:4152-60; Wedge, S.R. et al. Cáncer
Res, 2000, 60:970-5; Relf, M. et al. Cáncer
Res, 1997, 57:963-9; Huang, J. et al. Proc
Natl Acad Sci USA, 2003, 100:7785-90; Blaskovich,
M.A. et al. Nat Biotechnol, 2000,
18:1065-70). Aunque la selección de la angiogénesis
como diana como un enfoque para la terapia contra el cáncer se
sugirió hace décadas, sólo muy recientemente la FDA ha aprobado el
primer fármaco diseñado para seleccionar como diana una etapa en el
proceso complejo de la angiogénesis (Ferrara, N. Semin Oncol, 2002,
29:10-4). De hecho, AVASTINA, un anticuerpo
monoclonal anti-VEGF humanizado, ha mostrado
actividad frente a cáncer de colon metastásico. Aunque esencial para
proporcionar la prueba de concepto para la selección de la
angiogénesis como diana en seres humanos, este enfoque no se ha
explotado completamente. Una mejora que se busca es diseñar
estrategias que se dirijan simultáneamente contra diferentes etapas
en el proceso angiogénico (Bergers, G. et al. J Clin Invest,
2003, 111:1287-95; Relf, M. et al. Cáncer
Res, 1997, 57:963-9; Huang, J. et al. Proc
Natl Acad Sci USA, 2003, 100:7785-90). Se ha
desarrollado un nuevo agente farmacológico sintético que inhibe la
función tanto de VEGF como de PDGF, factores de crecimiento que se
ha mostrado que median la iniciación y mantenimiento de nuevos vasos
sanguíneos, respectivamente (Bergers, G. et al. J Clin
Invest, 2003, 111:1287-95; Dvorak, H.F. J Clin
Oncol, 2002, 20:4368-80; Ferrara, N. Curr Top
Microbiol Immunol, 1999, 237:1-30; Dvorak, H.F.
et al. Curr Top Microbiol Immunol, 1999,
237:97-132; Eriksson, U. y Alitalo, K. Curr Top
Microbiol Immunol, 1999, 237:41-57). Éste es el
primer informe de un agente que inhibe la unión tanto de VEGF como
de PDGF a sus receptores y suprime subsiguientemente la
fosforilación de tirosina y las rutas de señalización aguas abajo
(Erk, Akt y STAT3). GFB204 también bloqueó potentemente la capacidad
de las células endoteliales para migrar (IC_{50} = 600 nM), así
como su capacidad para formar capilares in vitro (IC_{50} =
700 nM). El tratamiento s.c. in vivo de ratones que poseen
tumores humanos condujo a la inhibición de la formación de vasos
sanguíneos alrededor de la masa tumoral, así como a la inhibición
del crecimiento del tumor. Aunque GFB204 inhibió potentemente la
unión tanto de VEGF como de PDGF a sus receptores
(200-500 nM), no fue un interruptor no específico de
toda la unión ligando/receptor, puesto que la unión de EGF a su
receptor no se vio afectada a dosis tan elevadas como 100 \muM. Un
apoyo adicional para la selectividad se proporcionó demostrando que
GFB204 inhibió la activación de Erk1, Erk2, Akt y STAT3 por PDGF y
VEGF, pero no por EGF, bFGF o IGF-1.
La identificación de derivados de
calix[4]areno capaces de bloquear la unión tanto de
VEGF como de PDGF a sus receptores es un enfoque completamente nuevo
para seleccionar como diana a la señalización de tirosina cinasas
receptoras. Aunque el anticuerpo anti-VEGF AVASTINA
también bloquea la unión de VEGF a su receptor (Zhang, W. et
al. Angiogenesis, 2002, 5:35-44; Ferrara, N.
Semin Oncol, 2002, 29:10-4), aparentemente no hay
ningún otro agente que bloquee la unión tanto de PDGF como de VEGF a
sus receptores. Además, la ventaja de GFB204 con respecto a AVASTINA
es que GFB204 es una molécula mucho más pequeña que se puede
sintetizar fácilmente a un bajo coste, a diferencia de los métodos
laboriosos y caros implicados en la generación de anticuerpos con
fines terapéuticos. Aunque antes de este documento no había
inhibidores duales de la unión de VEGF y PDGF a sus receptores, se
han obtenido inhibidores duales de tirosina cinasas receptoras de
VEGF y PDGF, y algunos están en ensayos clínicos (Kerbel, R.S.
Carcinogenesis, 2000, 21:505-15; Jain, R.K. Semin
Oncol, 2002, 29:3-9; Morin, M.J. Oncogene, 2000,
19:6574-83; Miao, R.Q. et al. Blood, 2002,
100:3245-52; Laird, A.D. et al. Cáncer Res,
2000, 60:4152-60; Wedge, S.R. et al. Cáncer
Res, 2000, 60:970-5).
Hay diferencias marcadas entre estos imitadores
de ATP y GFB204. Mientras que la diana para GFB204 es la interacción
ligando/receptor que se produce extracelularmente en la superficie
exterior de la célula, los imitadores de ATP seleccionan como diana
los dominios de tirosina cinasas de los receptores, que son
intracelulares. Por lo tanto, a diferencia de GFB204, los
inhibidores de cinasas deben entrar en las células para alcanzar su
diana. Además, la mayoría de los inhibidores de tirosina cinasas
seleccionan como diana el sitio de unión de ATP, cuyas variaciones
son ubicuas en las células. Por lo tanto, el resultado de tratar
pacientes con GFB204 puede ser muy diferente de aquél de tratar
pacientes con un imitador de ATP que selecciona como diana tirosina
cinasas receptoras tanto de PDGF como de VEGF. Ya se están
preparando estudios preclínicos avanzados para una aplicación de IND
para el ensayo de fase I de GFB204 en seres humanos.
Claims (9)
1. Compuesto que se une a un factor de
crecimiento según la estructura calixarénica (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada R1 se selecciona
independientemente de entre el grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
y
\newpage
en la que cada R2 se selecciona
independientemente de entre el grupo que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto que se une a factores de
crecimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto
selecciona como dianas a factores de crecimiento derivados de
plaquetas, factores de crecimiento endoteliales vasculares, o una
mezcla de los mismos.
\newpage
3. Compuesto que se une a un factor de
crecimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto es
un compuesto según la estructura (I), en la que:
cada R1 es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
\newpage
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
\newpage
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
\newpage
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
\newpage
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
cada R1
es
\newpage
y cada R2
es
cada R1
es
y cada R2
es
4. Compuesto que se une a un factor de
crecimiento según la reivindicación 3, en el que:
cada R1 es
y cada R2
es
5. Composición farmacéutica que comprende el
compuesto que se une a un factor de crecimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Compuesto que se une a un factor de
crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia.
7. Uso de un compuesto que se une a un factor de
crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad que comprende
exceso de proliferación celular, exceso de angiogénesis, un tumor,
cáncer, o una combinación de los mismos.
8. Método in vitro para inhibir la unión
de factores de crecimiento a las células, para inhibir la
fosforilación estimulada por factores de crecimiento, para inhibir
la angiogénesis, para inhibir el crecimiento de cánceres y de
tumores, o una combinación de los mismos, que comprende la etapa de:
poner en contacto el compuesto que se une a un factor de crecimiento
según la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente
aceptable.
9. Método in vitro según la
reivindicación 8, en el que se inhibe la fosforilación de Erk1,
Erk2, Akt, o STAT3.
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