ES2340073T3 - Vectores basados en virus de inmunodeficiencia bovina (vib). - Google Patents

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Abstract

Virión que comprende un ARN de vector VIB producido por la expresión de una construcción de ADN de vector VIB mínimo, comprendiendo dicha construcción de vector: - un promotor operativamente vinculado a una primera región VIB R; - un elemento VIB U5 vinculado a dicha primera región VIB R; - una secuencia de empaquetado VIB; - un transgen, y - un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región VIB R; en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector.

Description

Vectores basados en virus de inmunodeficiencia bovina (VIB).
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere generalmente a la utilización de virus recombinantes como vectores, y más específicamente a construcciones de vector basadas en el virus de la inmunodeficiencia bovina recombinante (VIB) capaz de expresar una proteína deseada en las células objetivo.
El uso de vectores virales recombinantes en una variedad de aplicaciones que incluye, por ejemplo, la terapia génica requiere que el virus no sea capaz de replicarse en las células objetivo para evitar la posibilidad una proliferación de virus o celular incontrolable. Además de la seguridad, el sistema de virus vector recombinante debe ser eficiente y preciso.
Los retrovirus se han utilizado como vectores para mediar en la transferencia de genes en las células eucariotas. Los retrovirus son virus de ARN que incluyen las subfamilias lentivirus, spumavirus y oncovirus. Estos virus se pueden replicar e integrar en un genoma de la célula huésped a través de un ADN intermediario, generalmente llamado provirus.
Los vectores virales son generalmente construidos de tal manera que la mayoría de los genes virales se suprimirá y se sustituirá por un gen de interés. Con más frecuencia el gen de interés se transcribe bajo el control de las secuencias reguladoras virales dentro de la repetición terminal larga (LTR). Por otra parte, el gen de interés puede materializarse, bajo la regulación de su propio promotor interno. Los genes que han sido suprimidas del vector son generalmente proporcionados por una o varias construcciones auxiliares o de empaquetado en una línea celular de empaquetado (Bender et al., J. Virol. 61:1639-1649 (1987) y Miller et al. Biotechniques, 7:980-990 (1989)). Véase también Markowitz et al., J. Virol. 62:1120-1124 (1988) donde las porciones complementarias de la construcción auxiliar fueron divididas en dos construcciones separadas. La línea celular empaquetada puede ser transfectada con el vector retroviral, produciendo vectores de ARN que se empaquetan en las partículas del virus. Estas partículas liberadas del virus son de replicación defectuosa y pueden ser utilizadas para entregar el vector retroviral portador de un gen heterólogo de interés a las células objetivo.
Para aumentar la seguridad, la eficiencia y la exactitud de los sistemas de vectores recombinantes, se han construido diversos sistemas recombinantes mejorados. Un tipo de mejora incluye hacer líneas celulares de empaquetado más seguras que se generan por las eliminaciones en la repetición de terminal largo 3' (LTR). Otras mejoras incluyen el aumento de la gama de huéspedes mediante la sustitución de un gen env viral con la de otro gen env viral, creando así una línea de producción híbrida que genera virus auxiliares pseudotipados. Más concretamente, al HIV se ha dado una gama extendida de la célula huésped mediante pseudotipado con los virus no relacionados VSV y VHS (Zhu et al., J. SIDA, 3:215-219 (1990) y Naldini et al., Science, 272:263-267, (1996)). Otras mejoras han sido hechas mediante el uso de un mínimo de regiones de codificación virales en el vector. Además, la mayoría de líneas celulares de empaquetado que se utilizan actualmente han sido transfectadas con plásmidos separados, cada uno conteniendo una de las secuencias de codificación necesarias para que sean necesarios eventos múltiples antes de que se pueda producir la recombinación de virus de replicación competente. WO99/15621 se refiere a los vectores lentivirus no primates, particularmente vectores basados en FIV.
A diferencia de los vectores derivados de oncovirus, los lentivirus pueden infectar a células que no se dividen. Esta propiedad es especialmente útil para la terapia génica in vivo.
El VIB por lo general no infecta a las células humanas y, por tanto, el uso de la columna vertebral genómica VIB en los vectores de la presente invención supera las dificultades de las líneas anteriores de empaquetado de la célula y dispone, además, otras ventajas relacionadas para la construcción de un vector mejorado.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un virión que comprende un ARN de un vector VIB producido por la expresión de una construcción mínima de ADN vector de VIB, comprendiendo dicha construcción de vector:
-
un promotor operativamente vinculado a una primera región de VIB R;
-
un elemento VIB U5 vinculado a dicha primera región VIB R;
-
una secuencia de empaquetado VIB;
-
un transgen, y
-
un elemento VIB U3 unido a una segunda región VIB R;
en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector.
Una o más secuencias en el elemento U3 pueden ser mutadas o suprimidas con el fin de disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de todos los genes siguientes y el elemento U3 que opcionalmente contiene además una secuencia que mejora la poliadenilación.
El transgen puede estar operativamente vinculado a un promotor interno, tal como un promotor de CMV, un promotor PGK, o un promotor de la MND.
El virión puede comprender un tracto de polipurina 3', situado inmediatamente antes (es decir, 5') del elemento la U3 3'.
El virión puede comprender además una zona polipurina central (cPPT) y/o un elemento de transporte del ARN, tal como un elemento de respuesta VIB rev (RRE) o un elemento de transporte constitutivo (CTE).
En el virión de la invención cualquier codón de inicio en la secuencia de empaquetado puede ser eliminado por supresión o mutación.
También se prevé que el uso del virión de la invención para la transducción de una célula de mamífero in vitro.
También se proporcionará, cuando dicho transgen del virión codifica una proteína terapéutica, el virión para su uso en el tratamiento de un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona un sistema para la producción de un virión, comprendiendo dicho sistema:
a) una construcción de ADN que codifica el ARN vector VIB de cualquiera de la invención;
b) una construcción de empaquetado VIB que comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol;
c) una construcción de una expresión que codifica una proteína de superficie viral.
En dicho sistema de la proteína de superficie viral puede ser una proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G).
Se describe a continuación una construcción de vector de combinación VIB que comprende un segmento de ADN de un genoma VIB, donde el segmento de ADN cuenta con un gen gag, un gen pol, un segmento del gen env y una secuencia de empaquetado VIB para empaquetar ARN VIB en los viriones, un promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado al promotor donde el transgen se inserta en el segmento del gen env. En una modalidad preferida, una parte del gen interior env es suprimida, y el transgen se inserta en el vacío creado por la eliminación. En realizaciones adicionales, el segmento de ADN puede incluir uno o más de los siguientes genes vif, vpw, vpy, rev, y tat, en particular tat y rev.
Se describe a continuación un vector VIB que comprende un segmento de ADN de un genoma VIB, una secuencia de empaquetado para empaquetar el ARN en los viriones; un primer promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado a un segundo promotor. En una realización preferida, la secuencia de empaquetado es una secuencia de empaquetado VIB y el promotor es un promotor LTR o un promotor citomegalovirus (CMV). En una realización preferida adicional, el segmento de ADN también comprende una porción de un gen gag. En otra realización, el vector incluye un elemento de respuesta rev (RRE).
Se describe a continuación una construcción de empaquetado VIB que comprende un fragmento de la secuencia de ADN VIB que incluye al menos un gen gag o pol de VIB, y un promotor operativamente vinculado al fragmento de ADN VIB. Preferiblemente, una secuencia de poliadenilación está situada a continuación del fragmento de ADN VIB. En una realización adicional, la construcción de empaquetado incluye un sitio interno de unión de ribosomas (IRES) y, preferentemente, incluye un intrón heterólogo.
Se describe a continuación un sistema de tres vectores que incluye: (1) una construcción vector VIB incluyendo un segmento de ADN de un genoma VIB, una secuencia de envases para empaquetar el ARN en los viriones, un promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado a un segundo promotor, (2) una construcción de vector de empaquetado VIB incluyendo un fragmento de secuencia de ADN VIB que incluya al menos un gen gag o pol del VIB; un promotor operativamente vinculado al fragmento de ADN VIB, y una secuencia de poliadenilación situada a continuación del fragmento de ADN VIB, y (3) un vector de expresión, incluido un gen que codifica una proteína de superficie viral. En una realización, la proteína de superficie viral es una glicoproteína de cubierta (VSV)-G del virus de la estomatitis vesicular. En una segunda realización, el segmento de ADN de la construcción del vector VIB incluye una porción de un gen VIB gag. En realizaciones adicionales, la construcción del vector VIB incluye uno o más genes VIB seleccionados del grupo consistente en gag, vif, vpw, vpy, tat, rev, y env.
Se describe a continuación un procedimiento para transferir un gen de interés a una célula de mamífero obtenida mediante la transfección de una célula huésped eucariota con el sistema de tres vectores que se reivindica y revela en este documento; el cultivo de la célula huésped transfectada, recogida de los viriones producidos, y la administración de los viriones a una célula de mamífero para permitir la infección de las células de mamíferos y transferir el gen de interés. En una realización, la célula de mamífero se encuentra in vitro, y, en otra realización la célula de mamífero se encuentra in vivo.
Se describe a continuación un sistema de dos vectores, incluyendo una primera construcción de vector que comprende un segmento de ADN de un genoma VIB, en donde el segmento de ADN comprende genes gag y pol, una secuencia de empaquetado VIB para empaquetar VIB ARN en los viriones, un promotor operativamente vinculado al segmento de ADN, y un transgen operativamente vinculado al promotor, y un vector de expresión de proteína de superficie viral. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión glicoproteína de cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV)-G.
Se describe a continuación un procedimiento para transferir un gen de interés a una célula de mamífero mediante la transfección de una célula huésped eucariota con el sistema de dos vectores reivindicada y revelada en este documento; cultivo de la célula huésped transfectada y recogida de los viriones producidos, y la administración de los viriones a una célula de mamífero para permitir la infección de dicha célula y la transferencia del gen de interés.
Se describe a continuación un sistema de vectores basado en VIB mínimo. El sistema comprende una construcción de vector mínima, una construcción de empaque mínima, y una construcción de expresión de la proteína de superficie viral mínima. La construcción de vector mínima comprende un promotor ligado a una primera región VIB R, un elemento VIB U5 ligado a la primera región del VIB R, una secuencia de empaquetado, un transgen, y un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región del VIB R, en la que el promotor inicia la transcripción del vector. La construcción de empaquetado comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol. La construcción de expresión de proteína de superficie viral comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación de cubierta viral y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación.
Esta realización comprende además una célula de empaquetado. La célula de empaquetado comprende la construcción mínima de empaquetado y la construcción de expresión de proteína de superficie viral mínima.
La adición de la construcción de vector mínima resulta en una celda productora. La célula productora produce viriones que contienen el vector. Infectar una célula con los viriones resulta en la transferencia del transgen a la célula.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Ilustración esquemática del plásmido proviral VIB de tipo salvaje (pVIB) clon 127.
Figura 2: construcciones de empaquetado VIB: VIB de tipo salvaje, VIB impulsado por CMV, y tres construcciones de empaquetado (BH1-3) se representan por sus genes gag, pol, y env, los genes accesorios no se muestran. También están representados los donantes principales de empalme viral (MSD), un intrón quimérico pequeño (in), el elemento rev-respuesta HIV-1 (RRE), la ADNc puromicina N-acetil-transferasa vinculada a un sitio interno de entrada de ribosoma para el virus de la encefalomiocarditis (IRES-Puro), y la señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40 polyA).
Figura 3: vectores VIB y eficiencias de la transducción. Todos los vectores contienen el promotor CMV inmediato-temprano, que termina en la caja TATA, vinculada al LTR 5' VIB que se inicia inmediatamente después de la caja TATA. Las secuencias VIB terminan en el codón de inicio gag (BCCG y BCPG) o aproximadamente 510 bp en la región de codificación gag (todas los demás). Todos los vectores contienen el ADNc EGFP vinculado a un promotor heterólogo, "interno": CMV, PGK, o MND. Algunos vectores contienen una o más inserciones entre el segmento VIB 5' y el promotor interior; estas inserciones incluyen una vía polipurina central potencial VIB (cPPT), el segmento 5' del gen gag, la región de unión de andamiaje beta-interferón (SAR), y el elemento rev-respuesta VIB putativa (RRE). A continuación del eGFP cADN se encuentra VIB 3' LTR y aproximadamente 130 bp (BCCG y BCPG), 1,2 kb (BC2CG, BC2PG y BC2MG) o 80 bp (todos los demás) de las secuencias env adyacentes. Dos vectores (BC4MG y BC4MGppt) contienen 3' LTRs modificadas en que la mayoría de la región 3' U3 LTR se sustituye por el elemento potenciador de señal de poliadenilación tardía SV40 ("SINSV"). Sitios de inicio de transcripción y direcciones se indican con flechas. En la parte inferior se representan dos vectores de control HIV-1 utilizados en una serie de experimentos. A la derecha están las eficiencias de transducción de los vectores en las células 293T 3 días post-infección, el uso de construcciones de empaquetado BH2 y VSV-G, en una serie de experimentos. Las infecciones causadas por los experimentos número de 3-5 se llevan a cabo en presencia de un tampón adicional para retardar la elevación del pH durante la espinoculación. Como resultado, las eficiencias de transducción son elevadas.
Figura 4. Ilustración esquemática del sistema de transferencia genética basado en VIB consiste en la construcción de los empaquetados, esqueleto del vector, y la construcción de expresión VSV-G. CMV: promotor temprano CMV; cPPT: tracto polipurina central; RRE: elemento de respuesta Rev; MND: MND LTR; SIN: Auto-inactivados; SV40USE: elemento mejorador de poliadenilación ascendente SV40.
Figura 5: Un sistema vectorial VIB mínimo. La figura muestra una construcción de vector mínima, una construcción de empaquetado mínima, y una construcción de expresión proteína de superficie viral mínima.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, las técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, virología, inmunología y similares que se encuentran en la habilidad de un entendido en la materia. Estas técnicas se explican detalladamente en la literatura actual y se hace referencia específicamente a Sambrook, Fritsch y Maniatis eds., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Celis J. E. "Cell Biology, A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc. (1994) y Bahnson et al., J. of Virol. Methods, 54:131-143 (1995).
Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones, la forma singular "a", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Por ejemplo, una partícula de virión incluye una pluralidad de partículas de virión. Polinucleótidos o ácidos nucleicos de la invención pueden ser en forma de ARN o en forma de ADN, dicho ADN incluye el ADNc, ADN genómico o el ADN sintético.
El virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) se clasifica en la subfamilia retroviral lentivirus (Gonda et al., Nature, 330:388-391 (1987)). Los lentivirus son exógenos, retrovirus no oncogénicos e incluyen el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus de inmunodeficiencia simia (SIVs), virus visna y de neumonía progresiva de las ovejas, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2). VIB tiene reactividad cruzada inmunológica con HIV, SIV y EIAV. Estos virus suelen contener entre 8.000 y 10.000 nucleótidos en sus genomas abarca los genes gag, pol y env, así como secuencias (LTR) de repetición de terminal larga.
El gen "gag" es el 5'-gen mayoritario en genomas retrovirales y codifica proteínas estructurales que forman la partícula viral. Está traducido para dar una poliproteína precursora que posteriormente se rompe para dar de tres a cinco proteínas estructurales.
El gen "pol" codifica las enzimas necesarias para la ruptura de la poliproteína, la transcripción reversa y la integración del ADN proviral en los cromosomas.
El gen "env" codifica las proteínas de la cubierta. Como se utiliza en la presente comunicación, el gen env incluye no sólo secuencias de genes env naturales, sino también modificaciones al gen env, incluyendo las modificaciones que alteran la especificidad de objetivo de los retrovirus o genes env que se utilizan para generar retrovirus pseudotipado. Ver la publicación PCT WO 92/14829, publicada el 3 de septiembre 1992, titulado "Viral Particles Having Altered Host Range".
Los retrovirus comparten características del ciclo de replicación, incluidos el empaquetado de ARN viral en los viriones, infección de las células objetivo, producción de una copia de ADN del genoma de ARN por transcripción inversa del ARN transportado en el virión para formar un provirus de ADN, transporte del ADN al núcleo celular, integración del ADN proviral en el genoma de la célula objetivo, transcripción de ARNm a partir del ADN viral que es impulsado por un promotor dentro de la secuencia 5'LTR, traducción de proteínas gag, pol y env, formación y maduración de las partículas virales y el despojo los viriones envueltos en una única membrana a partir de la célula. La LTR contiene secuencias de acción cis importantes para la transcripción reversa, la integración, la transcripción y poliadenilación (Coffin J., J. Gen. Virology 42: 1-26 (1979)).
Los genomas de los lentivirus son complejos. Los mismos comparten los genes retrovirales mencionados anteriormente, gag, pol y env y además tienen un número de genes no estructurales/reguladores, incluyendo una "región central" (Braun et al., J. Virol. 61:4046-4054 (1987) y Chakrabarti et al., Nature, 328:543-547 (1987)).
El complemento de genes no estructurales/reguladores encontrado en los genomas de aislados de distintas especies difieren entre sí, especialmente en las secuencias env. La organización de genómica base de VIB se presenta en Garvey et al., Virology, 175:391-409 (1990) y Pat. Estados Unidos Nº 5.380.830. Además se revelan los procedimientos de obtención de ADN genómico VIB de células infectadas VIB. Los genes gag y pol se encuentran en distintos marcos y se superponen. Los genes pol y env están en el mismo marco de lectura y están separadas por la "región central". Hay cinco marcos de lectura abierta (ORFs) encontraron en la región central. Tres de ellos son similares en estructura a los exones de vpr, tat y rev del HIV y otros lentivirus. Los otros dos ORFs se encuentran en una posición en la región central análoga a vpr, vpx y vpu que codifican ORFs del HIV-1 y/o HIV-2. El nef ORF que se encuentra después de env en los genomas de otros lentivirus parece faltar en el VIB (Garvey et al., 1990 supra).
Un exón es un segmento de un gen. Se codifica para una parte específica de la proteína. Un gen es un segmento de ácido nucleico que interviene en la producción de una cadena polipeptídica e incluye las regiones anteriores y posteriores al segmento de la región de codificación del ADN.
El gen "tat" consiste en dos exones de codificación. El primero está contenido en la región central y el segundo en el extremo 3' de la secuencia de codificación env, pero en un marco de lectura diferente de los exones env y rev.
El gen "rev" también está compuesto por dos exones. El primero está situado cerca del extremo 3' de la región central y se superpone al extremo 5' de env. El segundo exón se encuentra en el extremo 3' del env pero en un marco de lectura diferente. El gen "rev" transporta ARNms virales que contienen intrones, incluyendo toda la longitud del ARN utilizado para la traducción gag-pol y envasado de virión al citoplasma sin empalme.
Las secuencias que codifican VIB y plásmidos que contienen genomas retrovirales adecuados para su uso en la preparación de las construcciones del vector de la invención puede obtenerse fácilmente dada la descripción que establece aquí o por los depositarios y bases de datos tales como la American Type Culture Collection (ATCC), por ejemplo, ATCC Accession No. 68092 y ATCC Accession No. 68093 y GENBANK. Varios clones VIB se revelan en Garvey et al., supra y en EE.UU. Pat. No. 5380830. Se hace especial referencia al VIB 127 y 106, teniendo ATCC Accession No. 68092 y 68093, respectivamente.
Se entenderá que para la secuencia de nucleótidos del genoma VIB, pueden existir variaciones naturales entre virus VIB individuales. Estas variaciones pueden resultar en supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más nucleótidos mientras que la función reivindicada del gen no se pierda. Las secuencias de ADN que codifican dichas variantes pueden ser creadas por procedimientos de clonación estándar o reacción en cadena de polimerasa (PCR) Patentes US 4.683.195 y 4.683.202.
La presente invención proporciona un segmento de ácido nucleico de un genoma VIB que se puede obtener de cualquier cepa o clon del VIB. En una realización, una construcción del vector VIB de la invención deberá incluir un número suficiente de nucleótidos correspondientes a los nucleótidos del genoma VIB para expresar uno o más genes VIB funcionales.
Una "construcción de vector combinación VIB" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos y que incluye una región 5' LTR que tiene una región de secuencia promotora que es capaz de iniciar la transcripción del VIB; genes VIB gag y pol operativamente relacionados con el promotor, un segmento de la región que codifica el env VIB, una secuencia de empaquetado VIB, y un transgen operativamente vinculado a un promotor e insertado en el segmento de la región de codificación env. Preferiblemente, el transgen está operativamente vinculado a un segundo promotor, que puede ser el mismo o diferente del promotor operativamente vinculado a los genes VIB gag y pol.
El gen VIB env que se encuentra en el VIB clon 127 es de aproximadamente 2.711 nucleótidos de largo y se inicia aproximadamente en el nucleótido 5415. En una modalidad preferida, un transgen se inserta en el interior de la región del gen env. Por ejemplo, el transgen puede ser insertado en el segmento de la región codificante env después de los segmentos 1 de exón de codificación tat y rev y antes de los segmentos 2 exón de codificación tat y rev. Preferiblemente, el transgen se inserta después del nucleótido 860 del segmento de codificación env que corresponde al polinucleótido 6275 VIB. En otra realización, una sección de la región de codificación env es eliminado. Preferiblemente, la sección eliminada es de la región interior del gen env y el transgen es insertado en el vacío creado por la eliminación. La sección eliminada de la región de codificación env puede ser tan corta como de 20 nucleótidos, pero puede ser tan larga como 1500 nucleótidos. Procedimientos de eliminación de una sección del gen env son bien conocidos por aquellos con conocimientos comunes en la técnica.
Una "construcción vector VIB" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos. La construcción del vector debe incluir una secuencia 5' (que comprende una región de promotor), que es capaz de iniciar la transcripción del VIB; un segmento de ADN de un genoma VIB, una secuencia de empaquetado de VIB u otros lentivirus o retrovirus, y un transgen operativamente vinculado a un segundo promotor. En consecuencia, en un aspecto la presente invención proporciona una construcción de vector VIB que comprende: un segmento de ADN de un genoma VIB, una secuencia de empaquetado para el empaquetado de ARN en los viriones, un primer promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado a un segundo promotor. En una modalidad preferida, la secuencia de empaquetado de la construcción vector VIB es una secuencia de empaquetado VIB.
Una porción de un gen gag VIB puede incorporarse en el segmento de ADN. El gen gag VIB es de aproximadamente 1431 nucleótidos. Preferiblemente, la porción del gen gag incluirá no más de aproximadamente 200 nucleótidos. El segmento de ADN puede comprender además un gen VIB seleccionado del grupo consistente en vif, vpw, vpy, tat rev, y env.
En otra realización preferida, el transgen está operativamente vinculado a un promotor CMV, un promotor PGK, o un promotor MND. La construcción de vector VIB puede constar además de uno o más de un elemento de respuesta rev (RRE), una región de unión de andamiaje interferón-beta (SAR), que preferentemente es de origen humano, y/o un tracto polipurina central, que preferentemente se localiza entre el segmento VIB 5' y el ("segundo") promotor interior. Así, en una realización preferida, el transgen operativamente vinculado a un segundo promotor se encuentra a continuación de RRE VIB putativo.
En otra realización preferida, la construcción vector VIB de la invención es un vector de auto-inactivación. En particular, una porción de la región U3 del 3' LTR de la construcción vector VIB puede ser eliminada o reemplazada por una secuencia heteróloga. Se prefiere la sustitución de una parte de la región U3 de 3' LTR por el elemento potenciador de señal de poliadenilación SV40 tardío.
En una realización particularmente preferida, la construcción vector VIB es un vector de auto-inactivación y además incluye un transgen que está operativamente vinculado a un promotor MND y comprende un RRE y un tracto polipurina central (cPPT) anterior al promotor MND.
Una "construcción de empaquetado VIB", también referido a veces como construcción ayudante, se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos en el que la secuencia de nucleótidos incluye por lo menos el gen gag o gen pol del VIB, un promotor operativamente vinculado a la secuencia de nucleótidos, y una secuencia de poliadenilación situada a continuación de la secuencia de nucleótidos que codifica los genes gag o pol. Preferiblemente, la secuencia de poliadenilación se deriva del virus simio 40 (SV40).
La construcción de vector VIB, la construcción del vector de combinación VIB, y la construcción de empaquetado VIB mencionadas anteriormente pueden incluir otros genes VIB, además de los genes específicos mencionados anteriormente. Otros genes incluyen genes pol, vif, vpw, vpy, tat, rev, y env. En particular, las construcciones VIB incluirían nucleótidos correspondientes a un gen rev VIB funcional. Sin embargo, las construcciones VIB pueden incluir un gen rev obtenido de un lentivirus diferente y en particular un gen rev HIV. Las construcciones VIB de la invención también pueden incluir un elemento de exportación nuclear, de preferencia un elemento de respuesta rev (RRE), preferentemente a continuación de la inserción del transgen. El RRE puede ser a partir de un lentivirus que no sea VIB. Preferiblemente, las construccines VIB también deberían incluir un número suficiente de nucleótidos correspondiente a un gen tat funcionales. La región 3' LTR del genoma VIB también puede incluirse como se describe a continuación.
En otra realización, la presente invención contempla un procedimiento para producir una línea celular de empaquetado que incluye transformar, de preferencia transfectar una línea celular establecida con la construcción vector combinación VIB o con una construcción de empaquetado VIB según lo divulgado anteriormente. Para las aplicaciones de la terapia génica, es necesario generar gran volumen de sobrenadantes que no se pueden preparar fácilmente mediante transfección transitoria. Por lo tanto las líneas celulares productoras podrán ser utilizadas para transferir genes de interés a una célula objetivo. Una línea celular productora se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas VIB recombinantes. La línea celular productora debe incluir una construcción VIB integrada según lo divulgado anteriormente. Un número de vectores VIB pueden estar recogidos en la partícula VIB recombinante, incluidas las construcciones VIB de la presente invención. Varios procedimientos son conocidos en la técnica para identificar las células de empaquetado retroviral capaces de producir partículas de vectores virales recombinantes. Estos procedimientos incluyen ELISA y Western Blot.
Ejemplos no limitativos de líneas de células de empaquetado incluyen PA12, PA317, FLYA13, PE501, PG13, CRIP, RD114, GP7C-tTA-G10, PPA-6, y PT67 (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986); Miller et al. Biotechniques 7:980 (1989); Danos et al. Proc. Natl. Acad. Sd. EE.UU. 85:6460 (1988); Pear et al., Proc. Natl. Acad. SCI. EE.UU. 90:8392 (1993) y Rigg et al. Virol. 218:290 (1996).
La invención proporciona una construcción vector mínima. La construcción de vector comprende un promotor ligado a una primera región VIB R, un elemento VIB U5 ligado a la primera región VIB R, una secuencia de empaquetado, un transgen, y un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región VIB R, en el que el promotor inicia la transcripción del ARN del vector. Preferiblemente, la secuencia de empaquetado es una secuencia de empaquetado VIB. Alternativamente, puede ser de otro lentivirus o retrovirus. Además, es preferible que codones de inicio cualesquiera en la secuencia de empaquetado se eliminen por la eliminación o mutación. También es preferible que el sitio del donante de empalme principal sea inactivado o eliminado. Estos cambios en la secuencia de empaquetado y los sitios de los donantes de empalme se realizan mediante las técnicas estándar.
En un aspecto particularmente preferido del vector mínimo, una o más secuencias en el elemento U3 son mutadas o suprimidas con el fin de disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de todos los genes a continuación. Esto prevé un vector de auto-inactivación. En tal situación, el transgen está operativamente vinculado a un promotor interno. Además, es preferible que el elemento U3 contenga además una secuencia que mejora la poliadenilación. Un ejemplo preferido es el elemento SV40 potenciador anterior de señal de poliadenilación tardía (Sehet, et al., Mol. Cell Biol., 12:5386-5393 (1992)).
El vector mínimo puede contener elementos adicionales. Uno de esos elementos es un cPPT. Preferiblemente, el cPPt es un cPPt VIB. El vector también puede incluir además un tracto 3' polipurina, que se encuentra inmediatamente anterior (es decir, 5') al elemento U3 3'.
Además, el vector puede comprender un elemento de transporte del ARN. Dicho elemento de transporte podrá ser un RRE lentiviral. Preferiblemente, el RRE lentiviral es un RRE VIB. Como alternativa, el elemento de transporte del ARN es un elemento constitutivo de transporte (CTE). Más preferentemente, el CTE es un Virus CTE de Mono Mason-Pfizer. Un CTE alternativo preferido es un Virus CTE de la Leucemia Aviar.
Se describe también a continuación una construcción de empaquetado mínima. La construcción cuenta con un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol. Preferentemente, la construcción de empaquetado contiene además un intrón heterólogo anterior (es decir, 5') de la secuencia de codificación gag/pol. Además, la construcción de empaquetado puede contener un elemento de transporte del ARN. Ese elemento puede ser un lentivirus RRE, de preferencia un RRE VIB, o puede ser un CTE como se describió anteriormente. La construcción de empaquetado puede contener de una secuencia de codificación Rev.
Un intrón heterólogo puede ser incluido en las construcciones, y en particular en las construcciones de empaquetado. Los intrones heterólogos son conocidos y ejemplos no limitativos incluyen el intrón gen beta-globina humano. Los intrones utilizados en las construcciones de la invención pueden ser obtenidos a partir del virus SV40 y el gen de la insulina humana. Preferiblemente, el intrón se encuentra antes de las secuencias de nucleótidos gag y pol).
En realizaciones adicionales, las construcciones de la invención pueden incluir un sitio de unión de ribosomas interno (IRES), que permite la traducción de un segundo gen, de preferencia un gen heterólogo. El gen heterólogo puede ser un gen marcador o un gen que codifica una proteína de interés como se describe adicionalmente a continuación.
Un requisito para la expresión de un gen VIB o transgen es un promotor adecuado operativamente vinculado a la secuencia de ácido nucleico de codificación. El término "operativamente vinculado" se refiere a una disposición de elementos donde los componentes son configurados con el fin de realizar su función normal o esperada. El promotor u otros elementos de control no necesitan ser contiguos a la secuencia de codificación. Es posible que haya residuos que intervienen entre un promotor o elementos de control y la región de codificación, siempre que la relación funcional se mantenga.
Con respecto a las construcciones que figuran aquí, la elección del promotor está dentro de la habilidad de un entendido en la materia y se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota, o viral capaz de dirigir la transcripción de genes en una célula objetivo o huésped transformada con una construcción según la invención. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, promotor inducible, promotor sintético o promotor híbrido. Más de un promotor puede ser colocado en las construcciones de la invención. Preferentemente, los genes VIB estarán operativamente vinculados a un promotor y la inserción del transgen estarán operativamente vinculados a un segundo promotor. Ejemplos de promotores útiles en las construcciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, promotor fago lambda (PL); promotor temprano SV40; un promotor del virus del herpes simple (VHS); un promotor citomegalovirus (CMV), tal como el promotor temprano inmediato CMV humano; sistema promotor de trans-activador de la respuesta controlado por tetraciclina (tet); promotor de repetición terminal largo (LTR), como un LTR MoMLV o un LTR HIV, el promotor de la región U3 de virus del Sarcoma Murino de Moloney; promotor Granzima A; secuencias reguladoras del gen metalotionina; promotor CD34; promotor CD8; promotor timidina quinasa (TK); promotor Parovirus B19; promotor PGK; promotores de glucocorticoides; promotores de proteína de choque térmico (HSP), como promotores HSP65 y HSP70; promotores de inmunoglobulina; promotor MMTV; promotor (RSV) del virus del sarcoma de Rous; promotor lac; promotores CaMV 35S; y promotor nopline sintetasa. Numerosos promotores están disponibles a partir de fuentes comerciales, como Stratagene (La Jolla, CA).
Los promotores preferidos incluyen la región del promotor de LTRs, tal como el promotor LTR 5' del HIV o del VIB. Promotores adicionalmente preferidos incluyen promotores CMV y promotores PGK. Especialmente preferido es el promotor MND. Otras diferentes secuencias de control también pueden ser incorporadas a las construcciones de la invención, por ejemplo, regiones potenciadoras y de andamiaje de unión (SARs). Especialmente preferida es la región de unión de andamiaje derivada de interferón-beta humano. Secuencias potenciadoras particulares pueden ser fácilmente determinadas por aquellos con conocimientos comunes en la técnica.
Una "secuencia de empaquetado" se define como secuencias necesarias para empaquetar ARN retroviral en los viriones. Las secuencias de empaquetado se encuentran generalmente en la región entre el donantes principal de empalme 5' y el codón de iniciación del gen gag. Si bien se prefiere una secuencia de empaquetado derivada VIB, los vectores según la invención pueden incluir secuencias de empaquetado correspondientes a otros retrovirus, en particular los lentivirus, y más en particular correspondientes al HIV-1, HIV-2 o SIV. Las secuencias de empaquetado pueden incluir hasta 1.000 nucleótidos o sólo 50 nucleótidos. El tamaño de una región de secuencia de empaquetado puede ser determinado por aquellos con conocimientos comunes en la técnica.
Como se indica anteriormente, una o varias construcciones según la invención pueden también incluir una señal de poliadenilación (polyA) que se coloca 3' de la secuencia de codificación. La cola polyA puede ser de cualquier tamaño suficiente para promover la estabilidad en el citoplasma. El polyA puede derivarse de un lentivirus como VIB, HIV y SIV. Sin embargo, la secuencia de polyA también puede derivarse de otros virus, tal como el poli SV40.
Además de la región del promotor, las repeticiones terminales largas (LTR) de los retrovirus contienen elementos cis-actuadores que son importantes para la transcripción reversa, integración, transcripción y poliadenilación, y uno o más de estos elementos pueden ser incorporados a las construcciones de la invención. Preferentemente, las construcciones comprenden nucleótidos correspondientes a un número suficiente de nucleótidos de un LTR VIB en el extremo 5' para resultar en un LTR funcional. Las construcciones también pueden incluir una región 3'LTR. La LTR proviral del VIB 127 es de 589 polinucleótidos. La LTR se compone de elementos U3, R y U5. (Patente US 5.380.830).
La invención también abarca sistemas de dos y tres vectores como la construcción vector VIB, la construcción vector combinación VIB, y la construcción de empaquetado VIB. En una realización, el sistema de tres vectores comprenderá la construcción del vector VIB y la construcción del vector de empaquetado VIB definido anteriormente y además una tercera construcción. La tercera construcción es una construcción vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de la superficie viral de un virus diferente. La proteína de la superficie viral puede ser cualquier otra proteína de la cubierta vírica, incluida la glicoproteína de la cubierta del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), proteína env MoMLV o cubiertas derivadas del virus de la leucemia de Gibbon Ape (GaLV), Rhabdoviride (Rabia, Mokola, Lyssa), Alfavirus (virus del río Ross, Sindbis), Paramyvovirus (Sendal) Filovirus (Ebola, Marburg), retrovirus (MLV, 10A1, Xeno) Arenavirus (LCMV), virus de parainfluenza. En una realización preferida la proteína de superficie es una VSV-G. (Bums et al., PNAS, 90:8033-8037 (1993) y Yee et al., PNAS 91:9564-9568 (1994)). Véase también la patente US 5.817.491, publicada el 6 de octubre 1998, la divulgación de los cuales se incorpora a la presente mediante referencia en su totalidad.
Un sistema de dos vectores puede incluir la construcción vector combinación VIB según la invención y el vector de expresión de la proteína de superficie según lo divulgado anteriormente. En una realización preferida la construcción vector de proteína de superficie es un vector de expresión glicoproteína de cubierta (VSV-G) del virus de la estomatitis vesicular.
El título de preparaciones de virus VSV-G-pseudotipado VIB se puede aumentar mediante centrifugación del virus. Preparaciones de virus VIB VSV-G-pseudotipados no concentradas pueden poseer un título de aproximadamente 5x10^{5} unidades infecciosas (UI) por ml en la línea celular epitelial del riñón humano 293T. Con la concentración del virus, el título se puede elevar de manera significativa.
En general, el título de los vectores de la invención se puede aumentar, primero, recogiendo las partículas del virus a través de centrifugación del medio que contiene virus, segundo, eliminando el sobrenadante, y tercero, suspendiendo las partículas del virus en un pequeño volumen de medio fresco. Por ejemplo, concentrando el virus 10 veces mediante la suspensión del virus recogido en un volumen de líquido 10 veces más pequeño que el volumen original antes de la centrifugación, resultando en aumentos de 3-10-veces en la eficiencia de transducción. El experto en la técnica podrá apreciar fácilmente, una mayor concentración del virus resultará en aumentos aún mayores en la eficiencia de transducción.
Las construcciones basadas en VIB según la invención utilizadas solas o en combinación pueden ser utilizadas para transformar virtualmente cualquier línea celular o célula huésped. Se prefieren las células huésped eucariotas. La transformación puede ser por transfección o transducción. La transfección es la transformación de las células objetivo o huésped con genomas ADN aislados. Se hace referencia a Kriegler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freman & Company NY (1990). Procedimientos de transducción incluyen co-cultivo directo de células con las células productoras (Bregni et al., Blood 80:1418-1422 (1992) o cultivando con sobrenadante viral solo o con factores de crecimiento adecuados (Xu et al., Exp. Hemat., 22:223-230 (1994). También se hace referencia a los equipos disponibles comercialmente, tales como equipo CalPhos, (Clontech Inc. de Palo Alto, CA) y el equipo Profection, (Promega, Madison WI.) Véase Kotani et al., Human Gene Ther. 5:19-28 (1994) y Forstell et al., J. Virol. Methods 60:171-178 (1996) para los procedimientos de espinoculación.
Una vez que una línea celular es transfectada o transducida con las construcciones de la invención, los genes se expresarán y nuevos viriones serán hechos por la célula. Como resultado, los viriones pueden ser recogidos y utilizados para infectar una célula objetivo, transfiriendo el gen o genes de interés en el vector a la célula objetivo.
Preferentemente, las células son células de mamífero; más preferiblemente, son células de primates, en especial células humanas. Algunos ejemplos incluyen células embrionarias de riñón (293T), células EREp de conejo, Cf2Th (ATCC Nº CRL 1430), CHO; SW480, CV-1, la línea celular humana T CEMSS, Jurkat, la MDCK y línea celular de perro D17, HT1090, LINA, WES y línea celular murina NIH3T3. Una línea de células o cultivo celular denota células eucariotas cultivadas o mantenidas in vitro. Se entiende que los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (ya sea morfológicamente, genotípicamente o fentotípicamente) a la célula progenitora.
En una realización particularmente preferida de la invención, las construcciones mínimas vector y de empaquetado se utilizan para hacer que las células de empaquetado y células productoras. La célula de empaquetado comprende la construcción de empaquetado de la invención y una construcción de expresión de la proteína viral de superficie mínima. La construcción de este último comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación de la cubierta viral y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación. La construcción puede comprender además un intrón heterólogo entre el promotor y la secuencia de codificación. La cubierta viral es cualquiera de las anteriormente aquí descritas. Preferentemente, es la cubierta del virus VSV-G.
La célula de empaquetado está transfectada con la construcción del vector mínima para hacer una célula productora. La célula productora comprende: (i) una secuencia de codificación gag/pol VIB, (ii) una secuencia de codificación de cubierta viral, y (iii) una construcción de vector que comprende un promotor ligado a una primera región VIB R, un elemento VIB U5 vinculado a la primera región VIB R, una secuencia de empaquetado, un transgen, y un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región R VIB. La célula productora se cultiva y produce viriones que contienen el vector mínimo de la invención. Este vector mínimo es la versión del ARN de la construcción de vector mínima y no contiene el promotor vinculado a la primera región VIB R. Preferiblemente, el vector de ARN comprende además un promotor interno, tal como se describe aquí, operativamente vinculado al transgen. Más preferentemente, dicho vector es un vector SIN, como se describió aquí. Los viriones se utilizan para infectar las células objetivo deseadas, transfiriendo así el transgen a la célula objetivo.
Un número de las células objetivo, incluidas las líneas celulares y células primarias de origen humano y no humano, es infectado con éxito con los vectores de la invención. Estos incluyen la línea celular D-17 del osteosarcoma de perro, la línea celular musculares lisas A-10 de rata, la línea celular neuronal MN9D del ratón, la línea celular endotelial HUVEC del ser humano, células endoteliales primarias de rata, linfocitos primarios humanos y células madre hematopoyéticas primarias humanas. Estos dos últimos tipos de células están compuestas en su mayoría de células que no se dividen. En consecuencia, los vectores de la presente invención son particularmente útiles para infectar células humanas primarias que no se dividen. Por ejemplo, los vectores de la invención pueden infectar la línea celular HUVEC después que las células han sido irradiadas con rayos gamma hasta el punto de que se ha derogado la proliferación de las células. Después de esta irradiación gamma, los resultados son similares a aquellos de antes de la irradiación gamma.
Las células objetivo o huésped preferentes son las células de mamíferos, de preferencia células de primates, y más preferiblemente células humanas. Las células humanas de preferencia incluyen las células hematopoyéticas. Las células hematopoyéticas abarcan las células madre hematopoyéticas, eritrocitos, neutrófilos, monocitos, plaquetas, mastocitos, eosinófilos, basófilos, linfocitos B y T. Las células madre hematopoyéticas y las células T son especialmente preferidas.
Antes de transfección o transducción, las células hematopoyéticas pueden ser aisladas y seleccionadas. Los procedimientos de aislamiento y selección de células son bien conocidos en la materia (patentes US 5.061.620; 5.677.136 y 5.750.397). Por ejemplo se utilizan células seleccionadas CD34^{+}Thy-1^{+}Lin^{-} ya sea de la médula ósea de adultos (ABM) o sangre periférica movilizada (MPB). CD34^{+}Thy-1^{+}Lin^{-} son altamente enriquecidas en las células madre hematopoyéticas y pueden ser aisladas de ABM y MPB por citometría de flujo (patente US 5.061.620).
La presente invención se refiere también a un procedimiento de transferencia de un gen de interés a una célula de mamífero que comprende: transfectar una célula huésped eucariota con el sistema de dos o tres vectores como se reveló anteriormente; cultivar la célula huésped transfectada, recoger los viriones producidos, y administrar los viriones recogidos a una célula de mamífero para permitir la infección de las células de mamíferos y por lo tanto transfiriendo el gen de interés.
Como se indicó anteriormente, se conocen procedimientos de transfección las células huésped y se hace referencia adicional a Graham and van der Eb, Virology 52:456-467, 1973.
Los procedimientos de cultivo de células transfectadas y transducidas son bien conocidos y se hace referencia a Freshney, R.I. "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques", Wiley-_Liss Inc. (1994). Varios medios de cultivo están comercialmente disponibles y los ejemplos no limitativos incluyen DMEM, IMDM, -X- vivo 15 y RPMI-1640. Las formulaciones pueden ser suplementadas con una variedad de diferentes nutrientes y factores de crecimiento. Para el cultivo de células madre hematopoyéticas CD34^{+} o células progenitoras, citocinas son preferentemente combinadas en los medios. Estas citocinas incluyen pero no se limitan a la IL-6, TPO, SCF, IL-3 y LIF. Los procedimientos de administración de las células son bien conocidos, y estos procedimientos incluyen la administración a pacientes humanos para la terapia génica.
Procedimientos de recolección de viriones producidos por las células transfectadas se describen, por ejemplo, en Rigg et al., Virology 218:290-295. Los viriones, que incluyen las construcciones basadas VIB de la presente invención, pueden ser administrados in vivo o in vitro a las células de los mamíferos. Además, es preferible que el virión incluya un gen terapéutico heterólogo según lo divulgado aquí. Los viriones producidos según la invención mediante el uso de construcciones de base VIB son partículas recombinantes o viriones. Una "partícula VIB recombinante o virión" se refiere a una partícula de virus que contiene un ARN vector de base VIB según la invención. En algunos casos, la construcción vector VIB puede estar contenida en una partícula derivada de otros virus distintos de VIB, por ejemplo otros retrovirus y particularmente otros lentivirus.
Como se utiliza aquí, el gen de interés generalmente referido como un transgén es un gen heterólogo, por ejemplo, un gen marcador. La elección de un gen marcador se encuentra dentro de la habilidad de aquellos entendidos en la técnica, y ejemplos no limitativos incluyen, marcadores resistentes a los medicamentos, como el gen (Neo') que codifica la neomicina fosfotransferasa; el gen HSV-tk, dando lugar a células sensibles a los agentes como el aciclovir y ganciclovir, receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR); proteína verde fluorescente mejorada (eGFP); proteína fluorescente amarilla mejorada; gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen bacteriano hisD; CD24 murino (HSA); CD8a murino (lyt); genes bacterianos que confieren resistencia a puromicina, fleomicina o beta-glactosidasa (por ejemplo, el gen lacZ), y un gen glutamina sintetasa (GS). En una modalidad preferida el gen marcador es eGFP. El gen marcador está preferentemente bajo el control de un promotor separado que permitirá la identificación de las células objetivo que contiene el gen marcador.
Una amplia variedad de secuencias de nucleótidos que generalmente se conocen como transgenes pueden ser transportadas por una construcción de base VIB de la presente invención, además o alternativamente en ausencia de un gen marcador. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos deben ser de tamaño suficiente para permitir la producción de partículas virales viables. Una lista no exhaustiva de esos transgenes (genes heterólogos) incluye secuencias que codifican proteínas, antígenos, ribozimas, así como secuencias antisentido.
La proteína puede ser una proteína terapéutica o una proteína estructural. Además la proteína puede ser la proteína entera o sólo el fragmento funcionalmente activo de la misma. La proteína puede incluir, por ejemplo, uno que regula la diferenciación celular o un gen terapéutico capaz de compensar una deficiencia en un paciente que se deriva de un gen endógeno defectuoso. El gen terapéutico puede ser uno que antagoniza la producción o función de un agente infeccioso, antagoniza los procesos patológicos, mejora la composición genética de un anfitrión o facilita el
injerto.
Ejemplos específicos de genes terapéuticos o secuencias de genes son unos efectivos en el tratamiento de la deficiencia de adenosina deaminasa (ADA), anemia de células falciformes, la deficiencia de la recombinasa, deficiencia de gen regulador recombinasa, HIV como un gen REV antisentido o transdominante, o gen portador de timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-tk). El gen terapéutico puede ser un gen no humanos, por ejemplo, un gen de la levadura (Seo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:9167(1998)).
Las secuencias de nucleótidos de los transgenes se puede obtener de distintas bases de datos como GENBANK y de fuentes comerciales, como Advanced Biotechnologies (MD). Además las secuencias de cADN que codifican para la secuencia heteróloga se pueden obtener a partir de células que expresan o contienen la secuencia mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, utilizando por ejemplo PCR.
Además, el gen de interés se puede seleccionar a partir de las secuencias de ADN de codificación de los genes del factor de necrosis tumoral, como el TNF-\alpha; genes que codifican interferones, como interferón-\alpha, interferón-\beta, e interferón-\gamma, genes que codifican interleucinas como IL-1, IL-1\beta, e interleucinas 2 a 14, en particular, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10, genes que codifican GM-CSF o G-CSF, genes que codifican adenosina deaminasa o ADA; genes que codifican factores de crecimiento celulares, tales como linfocinas, que son factores de crecimiento para los linfocitos, genes que codifican CD4 soluble, Factor VIII, Favor IX; receptores de células T, el receptor de LDL, ApoE, ApoC, ApoAl y otros genes implicados en el transporte y el metabolismo del colesterol, el gen antitripsina alfa-1, el gen transcarbamilasa ornitina, el gen CFTR, el gen de la insulina, el gen NDI-1, marcadores selectivos negativos o genes "suicidas", tales como genes timidina quinasa, como el gen timidina quinasa del virus del Herpes simple, el gen timidina quinasa del virus citomegalovirus, y el gen timidina quinasa del virus de la varicela-zoster; receptores Fc para los dominios de unión al antígeno de los anticuerpos, y secuencias antisentido que inhiben la replicación viral. Las secuencias antisentido se diseñan para unir transcripciones de ARN e impedir así la síntesis celular de una proteína en particular o evitar la utilización de esa secuencia de ARN por la célula.
Para los pacientes humanos, un gen terapéutico en general, será de origen humano, aunque pueden ser utilizados los genes de especies estrechamente relacionadas que muestran homología alta y función biológicamente similar o equivalente en los seres humanos si el gen no produce una reacción inmune adversa en el receptor. Una cantidad terapéutica activa de una secuencia de ácido nucleico o un gen terapéutico es una cantidad eficaz en dosis y durante un período de tiempo necesario para alcanzar el resultado deseado. Esta cantidad puede variar dependiendo de diversos factores incluyendo pero no limitado al sexo, la edad, el peso de un sujeto, y similares.
Procedimientos conocidos en la técnica pueden utilizarse para ensayar la expresión de un transgen en la célula objetivo. Estos procedimientos incluyen selección de citometría de flujo, detección de proteínas por análisis de Western blot, uso de PCR (Patentes Estados Unidos Nos. 4.683.195 y 4.683.202), selección de nucleótidos por northern o southern blots, e inmunoensayos enzimáticos, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual de Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Procedimientos
Ejemplo 1.1
Construcción de plásmidos
Los vectores son generados difiriendo en (i) la cantidad de secuencias gag y env (BC vs.. prefijo BC2); (ii) la expresión eGFP de conducción del promotor interno: CMV (sufijo CG) vs. PGK (promotor fosfoglicerato quinasa (1); sufijo PG) vs. MND (promotor del virus del sarcoma proliferativo mieloide (Robbins, P.B., X.J. Yu, D.M. Skelton, K.A. Pepper, R.M. Wasserman, L. Zhu, y D. B. Kohn. 1997. J Virol. 71:9466-9474); Sufijo MG), (iii) la colocación de eGFP dentro del vector (es decir, segmentos adicionales antes o a continuación del RRE VIB putativo; BC2 vs. BC3 prefijo), y (iv) segmentos adicionales insertados a continuación de la señal de empaquetamiento VIB putativa (sufijos gag, ppt, sar). Además, dos vectores contienen una modificación 3' LTR en el que una gran parte de U3 (incluyendo la caja TATA) se sustituye por un segmento pequeño del virus SV40 que contiene el elemento potenciador anterior a la señal de poliadenilación tardía (USE; Schek, N. C. Cooke, y J. C. Alwine. 1992. Mol Biol Cell. 12:5386-5393; BC3 vs. BC4 prefijo).
Todas las endonucleasas de restricción se compran a Roche Molecular Biochemicals (Indianápolis, IN). El pVIB plásmido, que contiene clon 127 proviral VIB (Garvey, K.J., M.S. Oberste, J.E. Elser, M.J. Braun, y M.A. Gonda. 1990. Virology. 175:391-409), se obtiene de los Institutos Nacionales de Salud.
El plásmido pCl se obtiene de Promega (Madison, WI). Plásmido pCIGL contiene la glicoproteína del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) cADN (Bums, J.C., T. Friedmann, W. Driever, M. Burrascano y J.K. Yee. 1993. Proc Natl Acad Sci. U S A. 90:8033-8037, Yee, J.K., A. Miyanohara, P. Laporte, K. Bouic, J.C. Bums y T. Friedmann. 1994. Proc Natl Acad Sd U S A. 91:9564-9568) en el polienlace pCl, a continuación del promotor inmediato-temprano (CMV) del
citomegalovirus humano e intrón quimérico y anterior a la señal de poliadenilación tardía del virus simio 40 (SV40).
El plásmido pCrev, que contiene el HIV-1 rev ADNc bajo control del promotor CMV, se ha descrito anteriormente (Malim, M. H., J. Hauber, R. Fenrick, y B. R. Cullen. 1988. Nature. 335:181-183).
El plásmido pBH1 se genera mediante la inserción secuencial de dos segmentos de pVIB en el polienlace pCl usando técnicas estándar: un fragmento de 5,5 kb SmaI-XbaI que contiene los genes gag, pol, vif, vpw, y vpy, así como los primeros exones de codificación de los genes tat y rev, y un fragmento de 1,3 kb Dralll-Pvull que contiene el elemento rev-respuesta putativo (RRE) y los segundos exones de codificación de los genes tat y rev.
Los plásmidos pBH2 y pBH3 se construyen de la misma manera, pero el intrón quimérico se elimina; además, el fragmento pBH2 5' VIB también contiene el 3' 70 bp del líder, incluyendo el sitio principal de empalme del donante.
Los plásmidos pBH1 y pBH3 también se modifican mediante la inserción de (1) un fragmento de aprox. 500 bp de HIV-1 que contiene la RRE, (2) un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (Jang, S. K., M. V. Davies, R. J. Kaufman, y E. Wimmer. 1989. J Virol. 63:1651-1660), y (3) la puromicina N-acetiltransferasa ADNc (Vara, J.A., A. Portela, J. Ortín, y A. Jiménez. 1986. Nuc Acids Res. 14:4617-4624).
El plásmido pBBB es generado por la digestión del plásmido pVIB con BfrI y BgIII para eliminar la mayoría de la región codificante e insertar en el espacio un polienlace corto creado por recocido de oligonucleótidos BB5 (5'-TTAAGATTTAAATACGCGTGCGGCCGCA-3') y BB3 (5'GATCTGCGGCCGCACGCGTATTTAAATC-3').
La construcción de empaquetado BH2 y una construcción de empaquetado HIV-1 (la construcción de empaquetado HIV comienza con el promotor CMV, seguido por un intrón heterólogo, el donante de empalme principal HIV, toda la región de codificación del HIV a excepción de las supresiones en vpu, env y nef, luego el HIV-1 RRE y, finalmente, el sitio de poliadenilación de SV40, véase también Douglas, J., W.-Y. Lin, M. Panis, y G. Veres. Human Gene Therapy, "Efficient HIV-_based vector transduction of unstimulated human CD34+ cells in the SCID-_hu Thy/Liv model of human T cell lymphopoiesis".) son cada uno modificado por la inserción de dos oligonucleótidos hemaglutinina (HA) inmediatamente anteriores al codón de parada de gag y supresión de la mayoría de la región codificante pol como sigue. Primero, un pequeño fragmento que contiene el codón de parada gag de cada construcción de empaquetado (fragmento 290 bp Apal-Accl de VIB, fragmento 360 bp de Apal-BstXI de HIV-1) está ligado a Apal/EcoRV digerido pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla CA). A continuación, cada subclon se somete a amplificación revertida por PCR utilizando los iniciadores que contienen las etiquetas de HA:HHAS 5'-TATCCATACGATGTTCCAGATTATGCTTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAG-3' y HHAA 5'-AG
CATAATCTGGAACATCGTATGGATATTGTGACGAGGGGTCGCTG-3' para el HIV-1 y BHAS 5'-TATCCATAC
GATGTTCCAGATTATGCTTAGACAAACAGCCTTTTATAAAG-3' y BHAA 5'-AGCATAATCTGGAACATCGTA
TGGATAATCTAATATAAGAGGGGGTGC-3' para VIB. Cada producto de la PCR es circulariza, a continuación, el fragmento gag modificado se extirpa con Apal/SmaI y se liga a la construcción de los padres de empaquetado eliminado entre el sitio de Apal en gag y el extremo 3' de pol (Asp718 para HIV-1, Nsil para VIB).
El potenciador/promotor inmediato-temprano de CMV se utiliza para reemplazar el promotor VIB en LTR 5' en los plásmidos pVIB pBBB de la siguiente manera. Primero, la región CMV anterior a la caja TATA es sometida a amplificación por PCR con iniciadores CB5 (5'-CGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3') y CMVVIB3 (5'-AGATATGGTTTATATAGACCTCCCACCGTACA-3') mientras que la región VIB a continuación de la caja TATA es sometida a PCR de amplificación con iniciadores CMVVIB5 (5'-GGGAGGTCTATATAAACCA
TATCTTCACTCTGT-3') y Bgag3 (5'-GCCGTTTCTGTACTCTCTGGT-3'). Segundo, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a la amplificación con iniciadores CB5 y Bgag3. El producto final se digiere con XmaCI y se liga a plásmidos pVIB y pBBB previamente digeridod con NruI y XmaCI, generando plásmidos pVIBC y pBBBC.
El plásmido pVIBC se digiere con SmaI y AfIIII para eliminar la mayor parte de la región codificante y despuntada ligado al final de un segmento de ADN que contiene ya sea el promotor CMV o el promotor fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK) (Adra, C. N., P. H. Boer y M. W. McBurney. 1987. Gene. 60:65-74) vinculados a la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) cADN (Promega, Madison WI), generando plásmidos pBCCG (también llamados pVIBC-SACG) y pBCPG (también llamados pVIBC-SAPG), respectivamente.
El plásmido pVIBC también es digerido con Bfrl y BgIII para eliminar un segmento más pequeño de la región codificante y, a continuación ligado despuntado al final a la CMV-EGFP y cassettes PGK-eGFP, así como un segmento de ADN que contiene eGFP vinculado con el promotor del virus del sarcoma mieloide proliferativo (MND) (Robbins, P. B., X. J. Yu, D. M. Skelton, K. A. Pepper, R. M. Wasserman, L. Zhu, y D. B. Kohn. 1997. J Virol. 71:9466-9474), generando plásmidos pBC2CG (también llamados pVIBC-BBCG), pBC2PG (también llamados pVIBC-BBPG), y pBC2MG, respectivamente.
El plásmido PBBBC se digiere con Munl y Hpal para eliminar las secuencias VIB entre el RRE putativo y LTR 3', luego se liga a MND-eGFP y cassettes PGK-eGFP para generar plásmidos pBC3MG y pBC3PG, respectivamente. El cassette CMV-eGFP también se inserta en el sitio de BstEII del plásmido pVIB para generar pBCG.
El plásmido PBC3MG se digiere con BfrI y BgIII para eliminar el polienlace corto y, a continuación (1) se liga a un fragmento de \sim500 bp BgIII del gen pol pVIB (que contiene el tracto polipurina central putativo) para producir plásmido pBC3MGppt, (2) se liga a un fragmento \sim1 kb Bfrl de pVIB (que contiene el extremo 5' del gen gag VIB) para producir plásmido pBC3MGgag, o (3) se liga a un fragmento de \sim800 bp que contiene la región de unión de andamiaje de interferón-\beta humano (SAR; Agarwal, M., Austin T. W., F. Morel, J. Chen, E. Bohnlein, y I. Plavec. 1998. 72:3720-3728) para producir plásmido pBC3MGsar.
El plásmido pBC3MGgag es linearizado con BfrI y se liga a los fragmentos SAR y CPPt para producir plásmidos pBC3MGgagSAR y pBC3MGgagppt, respectivamente.
El plásmido pBC3MGppt es linearizado con Bfrl y se liga al fragmento SAR para producir plásmidos
pBC3MGpptsar.
Los plásmidos pBC3MP y pBC3MPsar se generan a partir plásmidos pBC3MG y pBC3MGsar, respectivamente, por el reemplazo del ADNc eGFP con el ADNc puromicina N-acetiltransferasa (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortín, y A. Jiménez. 1986. Nuc Acids Res. 14:4617-4624).
Los plásmidos pBC4MG y pBC4MGppt, en los que el extremo LTR 3' contiene una eliminación grande en la región U3 y una inserción del elemento potenciador anterior de la señal de poliadenilación tardía de SV40 (USO; Schek, N., C. Cooke y J. C. Alwine. 1992. Mol Cell Biol. 12:5386-5393), se generan a partir plásmidos pBC3MG y pBC3MGppt, respectivamente, según se indica. Primero, la porción 5' de las regiones LTR y SV40 es sometida a amplificación por PCR con iniciadores GFP5 (5'-GAGGACGGCAACATCCTGG-3') y BSINSV3 (5'-AGCAA
TAGCATCACAAATTTCACAAATAAACACATATGGGAAGTCCGGGG-3'), mientras que la porción 3' es sometida a amplificación de PCR con iniciadores BSINSV5 (5'-GTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAATCTG
TACTTCAGCTCGTGTAG-3') y VIB3 (5'-TCGCCGACATCACCGATGG-3'). En segundo lugar, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a la amplificación con iniciadores GFP5 y VIB3. El producto final se digiere con SspBI y Sphl y se liga a plásmidos pBC3MG y pBC3MGppt previamente digeridos con SspBI y Sphl. Los plásmidos resultantes, pBC4MG y pBC4MGppt, contienen el USE SV40 40 bp en lugar de 332 bp de la región U3.
Para la evaluación relativa del sistema de transferencia de genes VIB, se utilizan los sistemas de transferencia de genes HIV-1 y MLV. La construcción y el uso de estos sistemas para este fin implican el uso de técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia.
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Ejemplo 1.2
Células Inmortalizadas
Las células se obtienen de las siguientes fuentes. Células 293T se obtienen de Gary Nolan (Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). Células CEMSS se obtienen a partir del AIDS Reagent Program (MD Rockville). Células A-10 y D-17 se obtienen de la colección American Tissue Type Collection (ATCC, Manassas VA). Células MN9D (Choi, H. K., L. A. Won, P. J. Kontur, D. N. Hammond, A. P. Fox, B. H. Wainer, P. C. Hoffmann, y A. Heller. 1991. Brain Res. 552:67-76) se obtienen de Rainer Ortmann (Novartis, Basilea, Suiza). Células epiteliales embrionarias de conejo (EREp) (Oberste, M. S., J. C. Williamson, J. D. Greenwood, K. Nagashima, T. D. Copeland, y M. A. Gonda. 1993. J Virol. 67:6395-6405) se obtienen de National Institutes of Health (MD Rockville).
Células HUVEC (20) y células primarias de aorta de rata (músculo liso) se obtienen a partir Clonetics (San Diego CA). Las células HUVEC se cultivan en medio basal EBM con el equipo de bala MGF que contiene 0,1% factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 2% suero fetal bovino (FCS), 0,4% extracto de cerebro bovino w/heparina, 0,1% GA-1000 (gentamicina, anfotericina B), y 0,1% hidrocortisona.
Células de aorta de rata se mantienen en medio EBM basal con el equipo de bala EGM-VM que contiene 0,1% hEGF, 5% FCS, 0,4% extracto de cerebro bovino w/hepann, 0,1% GA-1000, 0,1% de hidrocortisona, y se cultivan en matraces cultivos de tejidos Primario (Becton Dickinson Biosciences, San José CA).
Células CEMSS se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FCS. Todas las otras líneas celulares se cultivan en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FCS. 1,25x10^{5} células HUVEC se suspenden en 5 ml de medio y son irradiadas con 8000 rad de una fuente irradiadora ^{137}Cs (J. L. Shepherd, San Fernando CA), luego se trasladan a una placa de 6 pocillos y se incuba durante dos días para permitir la sincronización en la fase G2/M del ciclo celular.
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Ejemplo 1.3
La producción de virus
4,10 x 10^{6} células 293T se siembran en placas de 10 cm durante la noche y se transfectan al día siguiente con 20-30 \mug de ADN plasmídico por el procedimiento de fosfato cálcico (Clontech, Palo Alto, CA). Por lo general, se usan 20 \mug del vector, 10 \mug de la construcción de empaquetado, y 3 \mug del plásmido VSV-G. En el caso en que se requiere la proteína rev del HIV-1, se añaden 4 \mug de plásmido pCrev. 24-72 horas más tarde, las células o el medio que contienen el virus es recogido y analizado en una variedad de formas (véase más adelante). Para evaluar la eficiencia de la transfección, una porción de las células son analizadas para expresión de eGFP por citometría de flujo usando un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San José CA). Para medir la cantidad de virus vertida en el medio, el medio es limpiado de restos celulares por centrifugación a baja velocidad, y luego 10 \mul son lisados y se analiza la actividad RT utilizando un equipo comercial (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).
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Ejemplo 1.4
Análisis de los niveles de ARN: Ensayo Northern
Células transfectadas se lisan y ARN citoplásmico se prepara utilizando un equipo comercial (Qiagen, Valencia CA). Además, el medio que contiene el virus es recogido, sometido a centrifugación a baja velocidad para eliminar restos celulares, y luego sometido centrifugación de alta velocidad (50.000 x g durante 90 minutos a 4ºC) para recoger las partículas del virus. El gránulo viral es lisado y el ARN viral se prepara utilizando un equipo comercial (Qiagen, Valencia CA). Una cantidad fija de ARN citoplásmico (10 \mug) o de ARN viral (una tercera parte de la preparación del ARN, no cuantificado) se somete a electroforesis 1% gel de agarosa y se transfiere a un filtro de nylon (Bio-Rad, Hercules CA). El filtro se expone a 40x10^{6} cpm de un fragmento de ADN inciado al azar con ^{32}P-dCTP utilizando un equipo comercial (Ambion, Austin TX), luego se lava y se analiza para sonda de unión con un dispositivo de fosfoimagen (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA). Las sondas incluyen un fragmento gag VIB, un fragmento HIV-1 gag (ambos de tamaño -1 kb), un fragmento -330 bp de VIB U3, y un fragmento de -800 bp
eGFP.
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Ejemplo 1.5
Análisis de los niveles de proteína: análisis Western
Células transfectadas se lisan en hielo durante 1 hora en un tampón que contiene 1% NP-40, 150mM NaCl, 10mM Tris-Cl pH 7,4, 1 mM EDTA, y el inhibidor de la proteasa Pefabloc (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). El lisado se somete a centrifugación a 8.000 x g durante 20 minutos a 4ºC para eliminar el precipitado de proteínas y otros desechos. Alternativamente, el medio que contiene el virus es recogido, sometido a centrifugación breve para eliminar restos celulares, y luego sometido a alta velocidad de centrifugación (50.000 x g 90 minutos a 4ºC) para recoger las partículas del virus. El gránulo viral se lisa directamente en tampón de muestra de SDS-PAGE (Novex, San Diego CA). Una cantidad fija de células o lisado viral se somete a electroforesis en gel de acrilamida y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa. El filtro se expone a suero de conejo específico para la proteína Gag VIB (obtenido a partir de National Institutes of Health), a continuación, con anticuerpo Ig anti-conejo de cabra (HRP) conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed, South San Francisco CA), luego al sustrato HRP OPD (Sigma, St. Louis MO). Estándares de peso molecular pre-teñida (Bio-Rad, Hercules CA) se utilizan para determinar el peso molecular aproximado de las bandas VIB Gag. Para el Western blot del HIV, el filtro es expuesto a anticuerpo Gag anti-HIV biotinilado (Beckman Coulter, Fullteron CA) y luego a esteptavidina conjugada con HRP (Beckman Coulter, Fullteron CA) antes de la reacción OPD. Para el Western blot HA, el filtro es expuesto a un anticuerpo biotinilado anti-HA (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), luego a la HRP conjugado steptavidin antes de la reacción OPD. Para Western blot VSV-G, el filtro es expuesto a anticuerpo monoclonal anti-VSV-G de ratón (Sigma, St. Louis MO) y luego a un anticuerpo Ig anti-ratón HRP conjugado cabra (Zymed, South San Francisco CA) antes de la reacción OPD.
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Ejemplo 1.6
Análisis de transducción
Para transducir las células, el medio que contiene el virus es sometido a centrifugación breve para eliminar restos celulares, a continuación, se añade 1 ml a células frescas en tubos de polipropileno (5x10^{5} células CEMSS) o en placas de 6 pocillos (3-6 x 10^{5} células adherentes sembradas por pocillo el día anterior). Se añade sulfato de protamina (Sigma, St. Louis MO) a los pocillos a una concentración final de 8 \mug/ml y los tubos/placas son sometidos a centrifugación ("espinoculación") a 3000 rpm durante 2-3 horas a 32-37ºC. En experimentos posteriores, los tubos/pocillos también se complementan con 10 mM tampón HEPES antes de espinoculación para evitar que el pH del medio aumente mientras las células están en la centrífuga. Después de la espinoculación, los tubos y las placas son procesadas de diferentes maneras: se aspira el sobrenadante de los tubos, las células CEMSS se suspenden en medio fresco y se transfieren a las placas de 6 pocillos. Por el contrario, las placas espinoculadas son vueltas a colocar en la incubadora durante 30-60 minutos, luego se elimina el medio y se añade medio fresco a los pocillos. 2-3 días después de la espinoculación, una porción de las células se extraen de la placa y se analizan para expresión eGFP por citometría de flujo usando un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San José CA). Para los preparados que contengan los vectores pBC3MP y pBC3MPsar, células 293T son sometidas a espinoculación con diluciones seriadas del medio que contiene virus, y se añade medio fresco suplementado con 5 \mug/ml puromicina a las células 24 horas después de la espinoculación. 7-10 días después, se cuentan las colonias por visualización directa.
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Ejemplo 1.7
La infección de las células T primarias
Células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) se aíslan de sangre periférica completa de adultos por centrifugación Ficoll de gradiente de densidad, se enjuagan en una solución salina de tampón fosfato (PBS), y se suspenden en medio RPMI-1640 suplementado con FCS al 10%. Una parte de PBMC se activan mediante la adición de IL-2 (Peprotech, Rocky Hill NJ) al medio a una concentración final de 200 U/ml y se cultivan las células durante 3 días en placas de 12 pocillos (3x10 células por pocillo) con revestimiento previo de la siguiente manera: las placas se incubaron con 1 ug/ml de Fc Ig anti-ratón de cabra (Pierce, Rockford IL) durante 3 horas, luego se enjuagan con PBS, se incuban con una mezcla de 1 ug/ml anti-CD3 (OKT3) y 10 ng/ml anti-CD28 (BD Pharmingen, San Diego CA), anticuerpos monoclonales durante 1 hora y se enjuaga con el medio. 5x10^{5} PBMC activado o no estimulado se espinoculan con sobrenadante viral en tubos de polipropileno similares a las células CEMSS (véase más arriba); después de espinoculación, las células se enjuagan y suspenden en medio que contiene IL2 y se cultivan en placas de 24 pocillos con revestimiento previo con el anti-CD3 y anti-CD28 mAbs. Cuatro días y dos semanas más tarde, una porción de las células se extraen del pocillo y se analizan para expresión eGFP por citometría de flujo usando un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San José CA). Las células T son identificadas por las propiedades de dispersión de la luz y por la expresión de CD4 y CD8, usando APC-conjugado anti-CD4 y PerCP-conjugado anti-CD8 mAbs (Becton Dickinson Biosciences, San José CA).
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Ejemplo 1.8
Infección de Células Madres Hematopoyéticas (HSCs)
Células CD34^{+} humanas se aíslan de sangre periférica completa movilizada G-CSF de donantes normales usando Isolex 300SA (Baxter, IL). Las células (80-90% de pureza CD34^{+}) son repartidas en alícuotas (1 x 10^{7}) y congeladas en un medio compuesto de 45% medio de Eagle modificado Iscove (IMDM), 45% FCS y 10% DMSO. Antes de transducción, las células congeladas se descongelan primero en tampón 2% FCS, 1% HEPES y 10 U/ml heparina. Después de la descongelación, las células (5x10^{5}) son espinoculadas (véase más arriba) con sobrenadante viral en ausencia de citocinas o bien cultivadas durante 48 horas en medio que contiene citocinas (medio X-vivol5 (BioWhittaker, MD Walkersville), trombopoyetina (tpo) mimética (50 ng/ml; Novartis, Basilea, Switzerland), ligando fit3 (100 ng/ml), y ligando equipo c (100 ng/ml, ambos de Systemix, Palo Alto, CA)) y, a continuación espinoculadas con sobrenadante viral. Después de la infección, las células se cultivan en medios que contienen citocinas. Tres días o dos semanas más tarde, una porción de las células se tiñe con anticuerpo APC-conjugado anti-CD34 (Becton Dickinson Biosciences, San José CA) y se analiza para eGFP en las células CD34+ en un FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San José CA).
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Ejemplo 2 Transducción de Células Humanas con VIB
El genoma de tipo salvaje VIB se modifica mediante la inserción del gen marcador de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), produciendo de la construcción BCG (para más detalles ver la construcción del plásmido ejemplo 1). El gen eGFP se inserta en una posición de interior en el gen de la cubierta del virus a fin de no afectar la expresión viral rev o tat o la función del elemento rev-respuesta (RRE). La línea celular 293T del carcinoma de riñón humano es cotransfectada con construcción BCG y un plásmido que codifica la glicoproteína del virus de estomatitis vesicular (VSV-G), dos días después, el medio que contiene virus se recoge y se expone a nuevas células 293T. Además, el medio se añade a la línea celular EREp epitelial conejo embrionario, que apoya la replicación VIB de tipo salvaje (Oberste, M. S., J. C. Williamson, J. D. Greenwood, K Nagashima, T.D., Copeland, y M. A. Gonda. 1993. J Virol. 67:6395-6405). Tres días después, las células expuestas se analizan para expresión eGFP por citometría de flujo. Un subconjunto de las células 293T (aproximadamente 5%) expresan eGFP, lo que indica que el VIB puede llevar a cabo todas las funciones (incluyendo la transcripción reversa y la integración) necesarias para la transducción de las células humanas. Eficiencias similares de transducción se observan para la línea celular EREp.
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Ejemplo 3 Construcciones de Empaquetado VIB
Construcciones de empaquetado que contienen los genes virales se generan como se describió en el ejemplo 1 (Fig. 2) y se analizan para expresión gag mARN y producción de virus (Tabla 1) en el sistema de expresión transiente.
TABLA 1 Producción de virus por construcciones VIB^{a}
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Una construcción, VIBC, es idéntica a la de tipo salvaje VIB a excepción de un reemplazo exacto de la región 5' LTR U3 con el promotor inmediato-temprano de citomegalovirus humano (CMV). La unión entre los 2 segmentos se encuentra en idénticas cajas TATA para maximizar las posibilidades de que el ARN viral contuviera el extremo 5' adecuado para la infección de las células objetivo. Las tres otras construcciones de empaquetado VIB contienen el promotor CMV vinculado con el líder VIB, cerca del gen gag, suprimiendo LTR 5' y el primer sitio de unión y - en el caso de construcciones BH1 y BH3 - el donante del empalme principal. La construcción BH1 contiene un intrón quimérico pequeño insertado entre los segmentos CMV y VIB. A continuación del gen pol, la construcción BH2 contiene todas las secuencias virales de codificación a excepción de una eliminación (aproximadamente 1 kb) del interior de env (que no se prevé que afecte la expresión tat y rev o la función RRE), construcciones blancas BH1 y BH3 contienen secuencias VIB que terminan aproximadamente 250 bp a continuación del gen pol. Dado que las construcciones BH1 y BH3 carecen del gen rev y del RRE, el HIV-1-RRE se inserta a continuación de las secuencias VIB y la proteína rev HIV-1 se proporciona in trans cuando las construcciones son caracterizadas. Además, estas dos construcciones contienen el ADNc puromicina N-acetiltransferasa (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortín, y A. Jiménez. 1986 Nuc Acids Res. 14:4617-4624) acoplado a un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV; Jang, S. K., M. V. Davies, R. J. Kaufman, y E. Wimmer. J Virol. 63:1651-1660), para líneas celulares seleccionadas de producción estable de la construcción de empaquetado.
El análisis de Northern de ARN citoplásmico de células transfectadas indica que las construcciones VIBC produjeron mayores niveles de estado estacionario de gag ARNm (816 cpm) que VIB de tipo salvaje (249 cpm) o construcción BCG (113 cpm), lo que sugiere que el promotor CMV es más activo que LTR VIB en las células 293T. Las construcciones de empaquetado BH1 (70 cpm) y BH3 (39 cpm) expresan niveles bajos de gag ARNm. Pero BH2 (861 cpm) expresa niveles altos comparables a la construcción VIBC. En comparación, una construcción de empaquetado derivada HIV-1 impulsada por CMV se estudió que expresa niveles más altos de gag ARNm (1120 cpm).
El ensayo de transcriptasa inversa (RT) (Tabla 1) y el análisis de Western blot del virus recogido de las células transfectadas indican que VIBC produce más partículas del virus que lo que hizo los tipos salvajes VIB, BH1 y BH3, pero mucho menos que BH2 o la construcción de empaquetado HIV-1. La baja cantidad de virus VIBC puede haberse debido a la toxicidad en las células transfectadas resultantes del alto nivel de expresión VIBC de la proteína de la cubierta VIB de tipo salvaje, al observarse efectos citopáticos y pequeños sincitios en el cultivo. El análisis por Western blot indica que tanto los preparados de virus VIBC y BH2 han sido sometidos a maduración, es decir, la poliproteína Gag está escindida casi en su totalidad.
El ensayo RT indica que la cantidad de virus producida por BH2 es similar a la producida por la construcción de empaquetado HIV-1. Para comprobar que las cantidades de virus son similares, estas dos construcciones de empaquetado son modificadas por la inserción de dos etiquetas hemaglutinina consecutivas (HA) justo anteriores al codón de parada gag. Las construcciones HA-etiquetadas, a las que, además, se ha suprimido la mayor parte del gen pol para bloquear la división de la poliproteína Gag, se introducen en las células 293T junto a las construcciones padres. El virus modificado se recoge dos días después y se compara con el virus progenitor con el ensayo Western blot utilizando anticuerpos específicos para la proteína Gag: ambas construcciones modificadas producen cantidades de virus similares a las construcciones parentales. Los virus modificados luego se normalizan por el ensayo de RT de las construcciones padres (649pg para HIV-1, BH2 para 205pg) y se analizaron para el contenido de etiqueta HA mediante el ensayo de Western blot. Las cantidades de poliproteína Gag HIV-1 HA-etiquetada y poliproteína Gag VIB HA-etiquetada son similares, lo que corrobora el ensayo RT: la construcción de empaquetado BH2 produce niveles de virus más o menos similares a la construcción de empaquetado HIV-1.
El análisis por Western blot también se realiza en preparados de virus BH2 y HIV-1 para evaluar la eficacia de la incorporación VSV-G. El virus se obtiene de las células 293T transfectadas con cada construcción de empaquetado y la construcción G-VSV, a continuación, se normaliza por el ensayo de RT y se somete a análisis por Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal específico para VSV-G. La cantidad de VSV-G detectada en muestras de BH2 y de HIV-1 es similar, indicando que VIB incorpora VSV-G tan eficientemente como el HIV-1.
Ejemplo 4 Vectores VIB
Se generan vectores derivados del VIB, como se describe en detalle en el ejemplo 1, que contiene el gen marcador eGFP y todos los elementos virales necesarios en cis para la transferencia a las células objetivo.
Primero, los dos vectores (BCCG y BCPG) que contiene el líder completo, pero no secuencias gag, y un mínimo de secuencias env (es decir, no RRE) se comparan con los vectores análogos (BC2CG y BC2PG) que contienen aproximadamente 500 bp de secuencias gag y 1,2 kb de secuencias env (incluyendo el RRE putativo). Los vectores de este última se generan porque los estudios anteriores con otros retrovirus han indicado que el extremo 5' del gen gag aumenta la magnitud de vector de encapsidación del ARN en las partículas del virus, ya sea por contener elementos de empaquetado o mediante la estabilización de elementos de empaquetado de una fase anterior (Bender, M. A., Palmer T. D., Gelinas R. E., y Miller A. D. 1987. J Virol. 61:1639-1646, Buchschacher, G. L., y A. T. Panganiban. 1992. J Virol. 66:2731-2739; Parolin, C. P., T. Dorfman, G. Palu, H. Gottlinger, y J. Sodroski. 1994. J Virol. 68:3888-3895). Además, los estudios con el HIV-1 han indicado que el gen gag contiene secuencias que bloquean la exportación de ARN desde el núcleo, y que el RRE elimina este bloque en presencia de la proteína rev (Malim, M. H., J. Hauber, S. Y. Le, J. V. Maizel, y B. R. Cullen. 1989. Nature. 338:254-257; Schwartz, S., B. Felber K., y Pavlakis G. N.. 1992. J Virol. 66:150-159). Los dos vectores que contienen el promotor interno PGK se analizan para la transducción en las células 293T, utilizando la construcción de empaquetado BH2 pseudotipado con VSV-G: BC2PG transduce 5% de las células, mientras que BCPG no transduce ninguna de las células (Fig. 3, Exp. # 1). Los cuatro vectores se evalúan para la expresión del ARN citoplasmático en las células 293T transfectadas y en viriones BH2 recogidos mediante el análisis de Northern blot. Cada uno de los vectores produce altos niveles de vectores de longitud completa de ARN en el citoplasma de las células transfectadas, pero sólo los ARNs de longitud completa BC2CG y BC2PG son encapsidados eficientemente por los viriones BH2. Por lo tanto, el extremo 5' del gen VIB gag es probable que contenga secuencias directa o indirectamente necesarias para la encapsidación del ARN viral. Es interesante, sin esas secuencias en el ARN de longitud completa BCPG y BCCG, los ARNm internamente iniciados son encapsidados, lo que sugiere que otros elementos de empaquetado residen en la porción 3' del genoma VIB (Berkowitz, R. D., J. Fisher, y S. P. Goff. 1996. Current Topics In Microbiology and Immunology. 214:177-218).
A continuación, el promotor PGK se compara con el promotor de MND en dos contextos, es decir, con el cassette de promotor-eGFP anterior (BC2PG y BC2MG) o posterior (BC3PG y BC3MG) de RRE VIB putativo. En las células 293T, este último contexto produce una eficiencia de transducción ligeramente más alta de que el primero (14% vs. 6% para los vectores PGK y 35% vs. 29% para los vectores MND), y en ambas ocasiones el promotor MND se comporta mejor que el promotor PGK (Fig. 3, Exp. # 2). Sin embargo, todos los vectores transducen sustancialmente menos células que lo hecho por un virus HIV-1 que contiene un vector PGK-eGFP análogo (75% de transducción).
Virus que contienen el vector óptimo, BC3MG, se produjeron entonces y se analizaron por su capacidad de ser concentrados por centrifugación, por su capacidad de transducir una línea de células linfoides, y por el cambio en la frecuencia de la expresión eGFP dos semanas después de la infección. Una parte de los viriones es recogida por centrifugación, suspendida en un volumen 100 veces menor que el volumen original y diluida ya sea 10 veces o 100 veces. Aunque el virus 1x exhibe bajas eficiencias de de transducción, la línea celular linfoide T de CEMSS es transducida de manera más eficiente (12%) que la células 293T (5%). Además, el virus 10x transduce un porcentaje 10 veces mayor de células 293T, y un porcentaje 4,5 veces mayor de células CEM. Por otra parte, el porcentaje de células eGFP+ disminuye aproximadamente 5 veces en dos semanas en la línea de 293T, y en mucha menor medida en la línea CEMSS. Infecciones posteriores con preparaciones de virus nuevos, no concentrados, indican que la reducción en el porcentaje de células 293T eGFP^{+} respecto al tiempo se correlaciona inversamente con el porcentaje inicial de células eGFP^{+}. Por ejemplo, las células 293T que son el 73% eGFP^{+} 2 días después de la infección se encontró que era el 43% eGFP^{+} 2 semanas después de la infección y el 28% eGFP^{+} 4 semanas post-infección.
Las eficiencias de transducción superiores exhibidas por los vectores BC3 en relación con los vectores BC2 puede deberse a una mayor estabilidad de la señal de empaquetado, debido a su posición más lejos de secuencias no virales, es decir, el promotor interno (Kaye, J. F., J. H. Richardson, y L. M. A. Lever. 1995. J Virol. 69:6588-6592). Segmentos virales adicionales, por lo tanto, insertan inmediatamente a continuación de la región gag en el vector BC3MG, incluyendo un segmento de aproximadamente 500 bp del gen pol, que contiene tractos polipurina que pueden funcionar de una manera análoga a la región de tracto central polipurina (cPPT) del HIV-1 (Chameau, P., M. Alizon y F. Clavel. 1992. J Virol. 66:2814-2820, Chameau, P., Mirambeau., R. G., P., S. Paulous, H. Buc, y F. Clavel. 1994. J Biol Mol. 241:651-662). Además, la porción 3' (aproximadamente 1 kb) del gen gag es insertado: este vector (BC3MGgag) contiene todo el gen gag a excepción de unos 200 bp en el dominio de la cápside. Los dos nuevos vectores se encuentra que transducen frecuencias ligeramente más altas de las células 293T (70% y 73%) que el vector parental BC3MG (55%) cuando se utiliza con BH2 y VSV-G (Fig. 3, Exp. # 3). En comparación, un virus HIV-1 que contiene un vector de MND-eGFP transduce 100% de las células.
La región de unión de andamiaje del \beta-interferón (SAR), que se ha demostrado que potencia la expresión del vector a partir del ADN proviral integrado (Agarwal, M., T. W. Austin, F. Morel, J. Chen, E. Bohnlein e I. Plavec 1998. Journal of Virology. 72:3720-3728), también se inserta inmediatamente a continuación de la señal de empaquetamiento. Este vector, BC3MGsar, transduce una frecuencia ligeramente superior de las células 293T que el vector BC3MGppt (71% vs. 60% en la Fig. 3, Exp. # 4). Además, se generan los vectores que contienen combinaciones a modo de de pares del segmento SAR, el segmento 3' gag, y el segmento CPPt; sin embargo, ninguno de estos vectores presentan una mayor eficiencia de transducción que los vectores que contienen sólo los segmentos individuales (Fig. 3, Exp. # 4).
Los vectores BC3MG y BC3MGppt se comparan con sus contrapartes del SIN, BC4MG y BC4MGppt. Estos vectores SIN se eliminan en el 322 bp interior de la región U3 del 3' LTR, conservando 55 bp en el extremo 5' y 7 bp en el extremo 3', y como resultado, se extraen la caja TATA y la mayoría de los elementos promotores. Los vectores eliminados en esta área se denominan "de auto-desactivación", o SIN, porque el vector integrado en la célula objetivo posee un 5' LTR incapaz de dirigir la transcripción (Miyoshi, H., U. Blomer, M. Takahashi, F. H. Gage, e I. M. Verma 1998. J Virol. 72:8150-8157, Zufferey, R., T. Dull, R. J. Mandel, A. Bukovsky, D. Quiroz, L. Naldini, y D. Trono. 1998. J Virol. 72:9873-9880). Este efecto no sólo aumenta la seguridad del vector, sino que en los casos en que la transcripción de LTR 5' interfiere con la transcripción del promotor interno del vector, la eliminación SIN también puede aumentar la expresión del transgen en la célula transducida. También ha sido previamente informado que la lectura a través de la transcripción se produce a partir de un provirus HIV-1 integrado (Dron, M., L. Hameau, L. Benboudjema, J. Guymarho, C. Cajean-Feroldi, C. Rizza PGodard, C. Jasmin, M. G. Tovey, y M. C. Lang. 1999. Arch Virol. 144:19-28), lo que sugiere que las transcripciones HIV-1 no siempre terminan en LTR 3'. Dado que este fenómeno también puede ocurrir en los vectores VIB, y podría disminuir el título del sistema de transferencia de genes (Carswell, S. y J. C. Alwine. 1989. Mol Biol Cell. 9:4248-4258), el elemento potenciador anterior de la señal tardía de poliadenilación de SV40 (USE; Schek, N., C. Cooke y J. C. Alwine. 1992. Mol Biol Cell, 12:5386-5393) se inserta en el vacío creado por la supresión del SIN. Los dos nuevos vectores (BC4MG y BC4MGppt) se analizan para la eficiencia de transducción con la construcción de empaquetado BH2 y VSV-G: BC4MG transduce 68% de las células 293T, mientras que BC4MGppt transduce 90% (Fig. 3, Exp. # 5). Sin embargo, dado que los vectores parentales, no SIN exhiben eficiencias de de transducción similares (68% y 84%, respectivamente), la eliminación de SIN y la inserción USO SV40 no aumentan sustancialmente el título del sistema de transferencia de genes
VIB.
Para determinar el título del virus VIB con precisión, se elimina el ADNc eGFP de vectores BC3MG y BC3MGppt y se reemplaza con el cADN puromicina N-acetiltransferasa (Vara, J. A., A. Portela, J. Ortín, y A. Jiménez. 1988. Nuc Acids Res. 14:4617-4624), generando vectores BC3MP y BC3MPppt. Se hace lo mismo para el vector de HIV-1 que contiene el cassette MND-eGFP. Los tres virus se preparan en células 293T y diluciones seriadas se expuestas a nuevas células 293T; después de dos días, las células son tratadas con puromicina para matar las células no transducidas. Después de una semana en cultivo, el número de colonias que crecen en las placas se cuentan y se utilizan para calcular el título del virus original. El título del virus HIV es 1,2x10^{7} por ml, el título del virus BC3MP es 3x10^{5} por ml y el título BC3MPppt es 4,5x10^{5} por ml, casi 30 veces menor que el título del virus HIV.
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Ejemplo 5 Transducción de otras líneas celulares y de células que no se dividen
Virus VIB concentrado, preparado en células 293T con una construcción de empaquetado BH2, vector BC3MG, y VSV-G, se utiliza para la transducción de un panel de líneas celulares: D-17, una línea de osteosarcoma del perro: A-10, una línea de células musculares lisas de rata; HUVEC, una línea de células endoteliales humana, y MN9D, una línea de células neuronales de ratones. En cada una de estas líneas celulares, el virus VIB transdujo un gran porcentaje (63-88%) de las células, incluso dos semanas después de la infección. Además, células endoteliales primarias de rata son transducidas por el virus VIB, aunque no tan eficientemente como las líneas inmortalizadas (22%).
Para evaluar la capacidad del virus VIB para transducir células no se dividen, el virus VIB concentrado (10x) se ensaya para la transducción de las células HUVEC irradiadas y linfocitos de sangre periférica humana en reposo (PBL). La línea HUVEC se irradia dos días antes de la exposición al virus VIB, para sincronizar las células en la fase del ciclo celular G_{2}/M. Como era de esperar, una preparación de virus de la leucemia murina (MLV) se observa que transduce con facilidad las células sin tratar, pero no las células irradiadas. En contraste, tanto los virus VIB y HIV-1 transducen las células no tratadas e irradiadas con eficacia similar, indicando que cada lentivirus es capaz de transducir células que no se dividen de manera eficiente.
En PBLs humanos no estimulados, el virus VIB presenta una eficiencia de transducción similar al virus HIV-1 cuando las células se analizan cuatro días después de la infección, aunque la mayoría de las células transducidas VIB expresan muy bajos niveles de eGFP. Dos semanas después de la infección, sin embargo, estas células oscuras están prácticamente ausentes de la población. Como resultado, el porcentaje de células transducidas es bajo: 1% para el virus 10x y un 6% para el virus 40x. Sin embargo, el virus también presenta baja eficiencia de transducción en PBL pre-activado (es decir, en proliferación), ya que el virus 10x transduce sólo el 5% de las células. Por el contrario, virus HIV-1 10x transduce 81% de las células pre-activadas y el 44% de las células no estimuladas, mientras que el virus MLV 10x transduce 43% de las células pre-adivadas pero sólo 1% de las células sin estimular.
Por último, el virus VIB concentrado se utiliza para transducir células madre hematopoyéticas CD34^{+} periféricas movilizadas sin estimular (CMH), la mayoría de las cuales están en reposo (Knaan-Shanzer, F., D. Valerio, y V. W. Beusechem. 1996. Hum Gene Ther. 3:323-333 Uchida, N., D. He, A. Friera, M. Reitsma, D. Sasaki, B. Chen, y A. Tsukamoto. 1997. Blood. 89:465-472). La preparación de VIB 10x transduce 19% de HSCs tres días post-infección, mientras que el virus VIB 40x transduce al de las células. Curiosamente, casi todas las células transducidas con el virus VIB 10x expresan altos niveles de eGFP, y estas células no desaparecen cuando las células se analizaron 11 días después. Las células infectadas con el virus VIB 40x contienen dos poblaciones eGFP^{+}: una (18% de las células), que expresa muy bajos niveles de eGFP y una (13% de las células) que expresaron mayores niveles de eGFP. Ambos poblaciones presentaron una reducción de 6 veces en la frecuencia en los siguientes 11 días.
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Ejemplo 6 Sistema de Transferencia de Genes basado en VIB
Ejemplo 6.1
Abreviaturas
HIV: Virus de Inmunodeficiencia Humana
VIB: Virus de la Inmunodeficiencia Bovina
VSV-G: Glicoproteína G de Cubierta del Virus de la Estomatitis Vesicular
MLV: Virus de la Leucemia Murina
AAV: Virus Adeno-asociado
IU: Unidad de Infecciosas
HSkMC: Células Primarias del Músculo Esquelético Humano
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Ejemplo 6.2
Introducción
Varios vectores virales han sido explorados como vehículos para introducir genes terapéuticos para la terapia génica humana. Vectores basados en virus de la leucemia murina (MLV), adenovirus y virus adeno asociados (AAV) han sido ampliamente utilizados para tales fines. Sin embargo, todos estos sistemas de vectores tienen sus ventajas y desventajas. Los vectores basados en MLV han demostrado ser seguros para la terapia génica humana, sin embargo, sufren de una incapacidad para transducir células que no se dividen, que a menudo son los objetivos terapéuticos in vivo. Vectores de base adenovirus humano son capaces de transducir eficientemente una gran variedad de las células objetivo que no se dividen. Sin embargo, una fuerte reacción inmune del huésped y la expresión génica transitoria ha limitado las aplicaciones de los vectores adenovirus más utilizados. La baja capacidad de codificación de los vectores de base AAV disminuye la utilidad de estos vectores.
Recientemente, los sistemas basados en vectores lentivirus han sido ampliamente estudiados por su potencial uso como sistema de suministro de genes. Los vectores lentivirales puede transducir eficientemente tanto células que se dividen y las que no se dividen, e integrarse de manera estable en los cromosomas del huésped, lo que resulta en la expresión genética a largo plazo. El sistema de vectores, también ofrece tropismo amplio debido a su capacidad de pseudotipo con cubiertas virales heterólogas. Además, los vectores lentivirales potencialmente no plantean preocupación por la cuestión de la reacción inmune del huésped, debido al hecho que únicamente el transgen se expresa en las células objetivo. In vitro, se ha demostrado que vectores lentivirales pseudotipados VSV-G basados en virus de inmunodeficiencia humana (HIV) transducen una variedad de células que no se dividen, por ejemplo, macrófagos, neuronas, células hepáticas, células fotorreceptoras y las células madre hematopoyéticas. in vivo, los vectores lentivirales han demostrado que transducen neuronas de rata, lo que resulta en la expresión del transgen a largo plazo.
Para eludir las preocupaciones de seguridad relacionadas con los vectores lentivirus de base HIV, hemos desarrollado un sistema de vectores lentivirales basado en el Virus de Inmunodeficiencia Bovina (VIB). VIB no es un patógeno humano y no causa la enfermedad obvia en su huésped natural, el ganado. Hemos demostrado que 1) nuestro vector lentiviral VIB tiene un título de 1,2x10 u.i./ml, que es comparable con los sistemas basados en el HIV, 2) los vectores basados en VIB se pueden concentrar más de 150 veces con una etapa de ultra centrifugación, y 3) los vectores basados en VIB transducen eficientemente tanto células primarias de músculo esquelético humano que se dividen como que no se dividen.
Ejemplo 6.3
Procedimientos
Células. Células primarias de músculo esquelético humano, (hSkMC) fueron adquiridas a Clonetics (Clonetics, Walkersville, MD) y mantenidas y cultivadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Células 293T del riñón embrionarias humanas se cultivaron en medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM, BioWhittaker, Walkersville, MD), que contiene 10% de suero fetal bovino (medio completo DMEM) (FBS, laboratorios Hyclone, Logan, UT).
Sistema de transferencia de genes basados en VIB. El sistema de transferencia de genes basado en VIB contiene tres construcciones de plásmido: una construcción de empaquetado VIB para proporcionar la función auxiliar, la columna vertebral del vector lentiviral VIB que codifica un gen marcador, como eGFP, o un gen resistente a los fármacos, tales como el gen resistente a puromicina: y una construcción de expresión que codifica el gen de expresión de VSV-G. La columna vertebral del vector lentiviral VIB y la construcción de expresión VSV-G son esencialmente las mismas que las descritas anteriormente. BH2 Sin embargo, en la construcción de empaquetado VIB fue modificada. En concreto, se ha eliminado una secuencia de empaquetado putativa de 15 pb desde el sitio de empalme del principal donante (MSD) hasta el codón de inicio VIB gag, generando BH2\Delta\psi. Con el fin de eliminar la secuencia de empaquetado putativa, la región entre MSD y el codón de inicio gag fue sometida a amplificación por PCR con dos iniciadores PackageDel 5 (5'-CGACCCGGGCGGCCGCTTCG-3') y PackageDel 3 (5'-CTACTCACCTGTCCGGAGTC-3'). El producto PCR amplificado fue digerido con SmaI y se ligó al plásmido BH2 previamente digerido con SmaI dando lugar a BH2\Delta\psi.
Preparación del vector lentiviral VIB. Para generar el vector lentiviral VIB, el 85% células 293T confluentes en una placa de 10 cm se transfectaron con 15 \mug de plásmido de empaquetado (BH2\Delta\psi). 15 \mug del plásmido vector (VIBMNDeGFP o VIBMNDPuro), y 4,5 \mug plásmido que expresa VSV-G (pCMV.VSV-G) utilizando sistema de transfección basados en fosfato de casio. El sobrenadante del vector se cosechó 48 horas post-transfección y se filtró a través de un filtro de 0,45 \muM. El vector fue separado en alícuotas y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Para concentrar el vector lentiviral VIB, el sobrenadante del vector cosechado fue sometido a ultra centrifugación durante 90 minutos a 100.000 xg a 4ºC. El vector granulado se resuspendió en un pequeño volumen de medio DMEM y fueron almacenadas alícuotas a -80ºC hasta su uso.
Transducción. Las células objetivo fueron transducidas con vectores lentivirales durante cuatro horas en la presencia de 8 \mug/ml de sulfato de protamina (Sigma, St. Luis, MO). Las células se lavaron con medio de cultivo celular dos veces y se continuaron cultivando por 48 horas más. Las células transducidas se analizaron para determinar la expresión eGFP con FACScan.
Titulación del vector lentivirus VIB. Para titular vectores lentivirus basados en VIB, 5x10^{4} células 293T se sembraron en cada pocillo de una placa de seis el primer día. El segundo día, un vector lentivirus (5 \mul de no concentrado suplementado con 2 ml de medio DMEM completo) que codifica genes resistentes a puromicina fue utilizado para la transducción de las células en presencia de 8 \mug/ml de sulfato de protamina. En el tercer día, las células transducidas fueron tripsinizadas y 5% de las células transducidas de cada pocillo se sembraron en un recipiente de 6 cm con 5 ml de medio DMEM completo en presencia de 5 \mug/ml de puromicina (Sigma, San Luis, MO). Tres días después, se cambió el medio con medio de cultivo celular fresco con puromicina. El día siete post-transducción, el medio de cultivo celular fue aspirado y los clones resistentes a la puromicina se tiñeron con azul de Coomassie y se contaron.
Ensayo de la transcriptasa inversa. Aprovechando el hecho de que VIB RT presenta reacción cruzada con el HIV RT, cuantificamos VIB RT con un equipo de ensayo del HIV RT comprado a Roche.
Incorporación de BrdU. Para determinar si las células se dividían activamente cuando las células fueron transducidas, las células fueron marcadas con BrdU (equipo de etiquetado BrdU, comprados a Phamingen, San Diego, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 6.4
Resultados
Sistema de transferencia de genes basado en VIB. El sistema de transferencia genética basado en VIB consiste en la construcción de empaquetado VIB, construcción de vector VIB, y construcción de expresión VSV-G (Figura 4). Para generar el vector lentiviral VIB, las tres construcciones fueron co-transfectadas en células 293T, y el vector viral sobrenadante se cosechó 48 horas después de la transfección como se describe en Procedimientos.
Título de un vector lentivirus basado en VIB. Para determinar la titulación aproximada del vector lentivirus basado en VIB, plásmido BH2\Delta\psi (15 \mug), BMNDpuro (columna vertebral de vector lentivirus VIB con MND LTR promoviendo el gen de resistencia a la puromicina) (15 \mug) y pCMV.VSV-G (4.5 \mug) fueron cotransfectados en las células 293T como se describe en Procedimientos. Como control, se sustituyó BMNDpuro por BMNDeGFP (el gen que codifica resistencia a la puromicina en BMNDpuro se sustituyó por el gen de codificación de eGFP). Los vectores lentivirus VIB resultantes, gen de codificación de resistencia a la puromicina o eGFP, se utilizaron para transducir células 293T. Después de la selección puromicina, se contaron los clones resistentes puromicina. El vector alcanzó aproximadamente clones resistentes a la puromicina 1,2x10 por ml, lo que sugiere que el vector lentiviral VIB tiene un título de aproximadamente 1,2x10 i.u./ml. Estos clones fueron VIBMND puro específicos ya que no se encuentran clones resistentes a la puromicina en las células transducidas con VIBMNDeGFP.
Concentración vector lentiviral VIB. A fin de obtener un título superior al de los vectores lentivirales VIB, el vector sobrenadante fue sometido a ultra centrifugación. Se midió y comparó la actividad de los vectores RT antes y después de la concentración. Como se muestra en la Tabla 2, a partir de tres preparaciones de vectores independientes, la actividad RT aumentó en más de 150 veces.
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TABLA 2 La concentración de vectores lentivirus de base VIB. Tres preparaciones independientes de vector lentiviral VIB fueron sometidas a ultra centrifugación. La actividad transcriptasa inversa (RT) se midió antes y después de la concentración. Después de una ronda de ultra centrifugación, las actividades de RT se incrementaron en más de 150 veces para los tres preparados independientes con dos vectores VIB diferentes
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Transducción de células primarias del músculo esquelético que se dividen por un vector lentivirus VIB. 1x10^{5} células primarias del músculo esquelético humanas se sembraron en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Al día siguiente, las células fueron marcadas con BrdU o transducidas con BMNDeGFP (120 ng RT equivalentes para cada pocillo) durante 3 horas en presencia de sulfato de protamina como se describe en Procedimientos. Las células transducidas fueron analizadas para la incorporación de BrdU 16 horas después de la transducción o expresión de eGFP 48 horas después de la transducción con un citómetro de flujo. Las hSkSMC fueron transducidas eficientemente con vector lentivirus BMNDeGFP basado en VIB. Más del 56% de las células fueron positivas para expresión eGFP con una intensidad relativa media eGFP de más de 2300, lo que sugiere que el vector lentiviral basado en VIB puede transducir eficientemente las células primarias del músculo esquelético humano. Estas células se dividían activamente en el momento en que las células fueron transducidas según lo indicado por incorporación de BrdU activa por las células.
Transducción de células primarias del músculo esquelético que no se dividen por un vector lentivirus VIB. Para detener el ciclo celular, hSkSMC fueron irradiadas con rayos gamma-irradiados de 3500 rads. 2x10^{5} células irradiadas se sembraron en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Al día siguiente, las células fueron marcadas con BrdU o transducidas con BMNOeGFP (120 ng RT equivalentes para cada pocillo) durante 3 horas en presencia de sulfato de protamina como se describe en Procedimientos. Las células transducidas fueron analizadas para la incorporación de BrdU 16 horas después de la transducción o expresión de eGFP 48 horas después de la transducción con un citómetro de flujo. La hSkSMC que no se dividen fueron transducidas eficientemente con vectores lentivirus BMNDeGFP basados en VIB. Más de 59% de las células fueron positivas para expresión eGFP con una intensidad relativa media eGFP de más de 1500, lo que sugiere que vectores lentivirales basados en VIB pueden transducir eficientemente las células primarias del músculo esquelético que no se dividen. Se confirmó que estas células no se dividían en el momento en que las células fueron transducidas como lo demuestra la falta de incorporación de BrdU.
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Ejemplo 6.5
Discusión
Vectores de base lentivirus se han convertido en una tecnología prometedora de transferencia genética para la terapia génica humana. Los vectores lentivirales son capaces de transducir eficientemente tanto las células que se dividen y las que no se dividen in vitro e in vivo, dando lugar a la expresión del transgen a largo plazo. La expresión del gen terapéutico sostenida a largo plazo es necesaria para ciertas aplicaciones donde la expresión del gen de larga vida se necesita para lograr un efecto terapéutico. Estas incluyen enfermedades como las enfermedades neuronales, trastornos metabólicos, y algunas enfermedades oculares. La mayoría de estas enfermedades no tienen tratamiento eficaz.
Aunque se ha documentado una variedad de sistemas de transferencia de genes basados en lentivirus, el sistema más eficaz ha sido el basado en HIV. La seguridad es de vital importancia para la terapia génica basada en vectores virales. Para evitar los problemas de seguridad potenciales relacionados con el HIV lentivirus vectores base, hemos desarrollado un sistema de transferencia de genes basado en VIB. A nuestro leal saber y entender, VIB no es un patógeno humano y no causa ninguna enfermedad evidente en su huésped natural.
El VIB no ha sido intensamente estudiado. Por ejemplo, la señal de empaquetado no había sido identificada. Como consecuencia, en algunas construcciones anteriores, tanto las transcripciones de envasado y del vectores se empacaron en partículas de vectores, lo que resulta en el título menor de vectores lentivirus VIB. En este ejemplo, hemos eliminado una secuencia de empaquetado putativo la región desde el MSD al codón inicio gag. Encontramos que esta secuencia es parte de la señal de empaquetado de VIB (datos no mostrados). También hemos encontrado que la secuencia anterior de MSD y los primeros 200 pb de gag contienen los elementos adicionales para empaquetar de manera eficiente la transcripción VIB.
Hemos determinado que el título aproximado de nuestro actual vector lentivirus VIB utilizando un vector de codificación del marcador de selección resistente a puromicina. El título de vectores VIB logrado se aproxima a 1,2x10^{8} unidades infecciosas por ml, que es comparable con el vectores lentivirus de base HIV. También hemos determinado que vectores lentivirus VIB pseudotipado VSV-G se pueden concentrar a un título superior, con una simple etapa de ultra centrifugación.
También hemos confirmado que nuestro vector lentiviral basado en VIB de hecho es capaz de integrarse en el cromosoma celular, dando como resultado la expresión del gen sostenida a largo plazo como lo indica el análisis de Southern blot y el paso continuo de células humanas transducidas VIB.
Las células del músculo esquelético constituyen objetivos ideales para la terapia génica humana especialmente para proteínas terapéuticas secretoras ya que es fácil de administrar un agente por vía intramuscular. En este estudio, hemos transducido tanto células primarias del músculo esquelético que se dividen como que no se dividen. Encontramos que nuestros vectores lentivirus basados en VIB no concentrados transducen eficientemente estas células.
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Ejemplo 6.6
Resumen
Sistemas de transferencia de genes basados en lentivirales representan una prometedora tecnología de entrega de genes debido a su capacidad para transducir eficientemente una variedad de células objetivo que no se dividen in vitro e in vivo. La incorporación en el cromosoma celular resulta en la expresión del transgen a largo plazo. Además, la expresión de genes mediada por vectores lentivirus no requiere la síntesis de novo de proteínas virales, lo que reduce la eliminación potencial de las células objetivo por el sistema inmune del huésped. Sin embargo, los sistemas de lentivirus con los resultados más prometedores hasta la fecha son los que se basan en el HIV. El HIV es el agente causal del SIDA. Varios sistemas de transferencia de genes basados en lentivirus animales se han desarrollado. Aunque estos sistemas ofrecen alternativas a los vectores basados en el HIV, el título y la eficiencia de transducción desde vectores lentivirus animales son más bajos en comparación con el vector basado en HIV. En este ejemplo, se describe un sistema basado en vectores lentivirus VIB mejorado, que logró un título de 1x10 u.i./ml (unidades infecciosas por ml) (no concentrado) y que se puede concentrar más de 150 veces. Vectores lentivirales basados en VIB transducen eficientemente tanto células del músculo esquelético que se dividen y que no se dividen. Nuestros datos indican que el vector lentiviral basado en VIB podrá establecer un sistema de transferencia de genes excelente para la terapia génica humana.
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Ejemplo 7 Generación de un sistema de vectores lentivirales basado en VIB mínimo
Un sistema de vectores lentivirus basado en VIB mínimo deseado se compone de una construcción de vector mínima, una construcción de empaque mínima, y una construcción de vector de expresión proteína de superficie viral.
Ejemplo 7.1
Construcción de Vector mínima
Un vector mínimo basado en VIB (designado BC4MG.min) contiene una modificación del VIB 5' LTR, sitio de empalme de los donantes principal mutado, secuencia de empaquetado, secuencia gag mínima, cPPT, un transgen operativamente vinculado a un promotor interno, CTE (elemento constitutivo de transporte de virus de mono Mason-Pfizer), PPT 3',y 3' LTR con modificaciones. Véase la Figura 5. En concreto, el promotor CMV inmediato-temprano, que termina en la caja TATA está relacionado con el VIB 5' LTR, comenzando inmediatamente después de caja TATA. Las secuencias VIB terminan en 200 pb en una región de codificación gag. Todos los vectores contienen un gen reportero o transgen cADN vinculados a un promotor heterólogo, interno: CMV, PGK, o MND. A continuación del transgen cADN se encuentra VIB 3' LTR y 80 pb de secuencias env adyacentes que contienen un 3' PPT. Una cPPT putativa se inserta antes del promotor interno y una o varias copias de la CTE se insertan a continuación del transgen. La LTR 3' contiene una gran deleción en la región U3 y una inserción de un elemento potenciador anterior de señal de poliadenilación tardía de SV40 como se describe en el Ejemplo 1.
El vector mínimo de base VIB se genera sobre la base de BC4MGppt con las siguientes modificaciones: (i) la eliminación adicional de secuencia gag de 200 pb, (ii) la mutación del codón de inicio ATG gag, (iii) la mutación del sitio do-
nante de empalme principal (MSD), y (iv) la sustitución del elemento rev-respuesta VIB putativo (RRE) con un CTE.
Para facilitar la manipulación de plásmidos, la BC4MGppt se digiere con BspMI, y el fragmento de 4743 pb resultante que contiene la secuencia completa del vector se clona en pBluescript previamente digerido con HincII, dando lugar a BS4MGppt.
Para hacer una supresión adicional sobre la secuencia gag, BS4MGppt se digiere con EcoNI y Bqlll, el resultado es un fragmento 7287 pb autoligado para hacer el plásmido BS4MGppt.\Deltagag. El vector resultante contiene sólo una secuencia de 200 pb VIB gag.
Para mutar el sitio donante de empalme principal, el plásmido BS4MGppt.\Deltagag de la región anterior del promotor CMV a la región de MSD es amplificada PCR co iniciadores MSD5 (5'-GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGG
CATCCCG-3') y MSD3 (5'-GGGGAAAACACGCAACTTCTCTCCTGTCCGGAG-3'). El producto amplificado se digiere con SpeI y SmaII y ligado en el fragmento resultante de 6373 bp BS4MGppt.\Deltagag previamente digerido con SpeI y SmaII. El plásmido resultante se denomina BS4MGppt\DeltaMSD.
Para hacer una mutación en el codón de inicio gag, el plásmido BS4MGppt\DeltaMSD anterior a la región del promotor CMV a la región gag es amplificado PCR con los iniciadores gag5 (5'-TCTAGAACTAGTGGATCCCCC-3') y gag3 (5'-CTCTTCAACCCGGGGAAAAC-3'). El producto amplificado se digiere con Spel y SmaII y ligado en el fragmento resultante de 6373 bp BS4MGppt.\Deltagag previamente digerido con Spel y SmaII. El plásmido resultante se designa BS4MGppt.\DeltagagATG.
Para sustituir el elemento rev-respuesta VIB putativo (VIBRRE) con CTE, una secuencia de CTE se inserta en el sitio del plásmido SspBI BS4MGppt.\DeltagagATG y seguido de la eliminación completa de VIBRRE. Para insertar el CTE, el Virus de Mono Mason-Pfizer CTE (MPMV CTE) es amplificado PCR con los iniciadores CTE5'(5'-TGATCTGTA
CAAGTAAGCTAGCACCTCCCCTGTGAG-3') y CTE3'(5'-CCTTTTGTACAGTCGACATGCATGACACATCCC-3'). El producto amplificado se digiere con SspBI y se liga en BS4MGppt.\Delta gagATG digerido con SspBI. El plásmido resultante se denomina BS4MGpptCTE.\DeltagagATG. Para extraer VIBRRE, primero, lo anterior a VIBRRE es sometido a amplificación por PCR con iniciadores RRE1 (5'-GTTGGCGCCCAACGTGGGGCTCGAGTAAGAGAG-3') y RRE2 (5'-TAAGTGACCTATTTCTTCAGTGGTGTGTGT-3'), mientras que lo que está a continuación de VIBRRE es sometido a amplificación de PCR con las cartillas RRE3 (5'-ATAGGTCACTTATATGGGAATGAAAGACCC-3') y RRE4 (5'-AACTGCTGAGGGCGGGACCGCATCTGG-3'). En segundo lugar, los dos productos amplificados se mezclan y se someten a la amplificación por PCR con iniciadores RRE1 y RRE4. El producto final se digiere con KasL y BbvCI y se liga a plásmido BS4MGpptCTE.\DeltagagATG previamente digerido con Kasl y BbvCI, generando una construcción vector basado en VIB mínimo, BS4MG.min
Ejemplo 7.2
Construcción de Empaquetado mínima
Una construcción de empaque mínima contiene secuencias codificadoras VIB gag y pol vinculadas a una o varias copias de un CTE. Véase la Figura 5.
Para generar la construcción de empaquetado mínima, primero, CTE es amplificado PCR con dos iniciadores CTE1 (5'-CGGGGTACCACCTCCCCTGTGAGCTAG-3') y CTE2 (TGCTCTAGAGACACATCCCTCGGAGGC-3'). El
producto amplificado se digiere con Kpnl y Xbal y se liga a un plásmido pCI previamente digerido con XbaI y KpnI, generando pCI.CTE. En segundo lugar, secuencia de codificación VIB gag y pol es amplificada PCR con dos iniciadores GAG5 (5'-CCGCTCGAGATGAAGAGAAGGGAGTTAGAA-3') y POL3 (5'-CCGCTCGAGTCACGAACTCCCATCTTGGAT-3'). El producto amplificado se digiere con XhoI y se liga a pCI.CTE previamente digerido con XhoI, generando una construcción de empaquetado basada en VIB mínima, VIBGPCTE.
Ejemplo 7.3
Construcción de vector de expresión
El sistema de vector lentiviral de base VIB mínimo contiene además una tercera construcción, una construcción de vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína de la cubierta viral a partir de un virus diferente. La proteína de la superficie viral puede ser cualquier otra proteína de la cubierta vírica incluyendo la glicoproteína de la cubierta del virus estomatitis vesicular (VSV-G) y otros. Véase la Figura 5.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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<160> 30
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<170> Patentes versión 3.0
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<210> 1
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> sitio de restricción polienlace
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<220>
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<221> característica misc
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<222> (1)..(28)
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<223> sitio de restricción polienlace
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> sitio de restricción polienlace
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(28)
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<223> sitio de restricción polienlace
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 50
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> iniciador PCR
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<220>
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<221> enlace_iniciador
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<222> (1)..(50)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(46)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(50)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(48)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210>8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(50)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> enlace_iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210>30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia bovina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm32

Claims (14)

1. Virión que comprende un ARN de vector VIB producido por la expresión de una construcción de ADN de vector VIB mínimo, comprendiendo dicha construcción de vector:
-
un promotor operativamente vinculado a una primera región VIB R;
-
un elemento VIB U5 vinculado a dicha primera región VIB R;
-
una secuencia de empaquetado VIB;
-
un transgen, y
-
un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región VIB R;
en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Virión según la reivindicación 1, en el que una o más secuencias en el elemento U3 están mutadas o eliminadas para disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de todos los genes posteriores.
3. Virión según la reivindicación 2, en el que dicho elemento U3 también contiene una secuencia que mejora la poliadenilación.
4. Virión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el transgen está operativamente vinculado a un promotor interno.
5. Virión según la reivindicación 4, en el que el promotor interno es un promotor CMV, un promotor PGK, o un promotor MND.
6. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un tracto de polipurina 3', situado inmediatamente antes (es decir, 5') del elemento U3 3'.
7. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un tracto de polipurina central (cPPT).
8. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende elementos de transporte de ARN.
9. Virión según la reivindicación 8, en el que el elemento de transporte de ARN es un elemento de respuesta rev VIB (RRE) o un elemento de transporte constitutivo (CTE).
10. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cualquiera de los codones de inicio en la secuencia de empaquetado se elimina por eliminación o mutación.
11. Utilización del virión según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la transducción de una célula de mamífero in vitro.
12. Virión según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el transgen codifica una proteína terapéutica, para su utilización en el tratamiento de un ser humano.
13. Sistema para la producción de un virión, comprendiendo dicho sistema:
a) una construcción de ADN que codifica el ARN de vector VIB según cualquiera de las reivindicaciones 1-10;
b) una construcción de empaquetado VIB que comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol;
c) una construcción de expresión que codifica una proteína de superficie viral.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Sistema según la reivindicación 13, en el que la proteína de superficie viral es una proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G).
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