ES2340137T3 - Procedimiento de identificacion de estados preneoplasicos y/o neoplasticos en mamiferos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende: detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 y P2X7 de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y comparar el perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

Description

Procedimiento de identificación de estados preneoplásicos y/o neoplásicos en mamíferos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de estados preneoplásicos y/o neoplásicos en mamíferos y, en particular, a un procedimiento para identificar células preneoplásicas y neoplásicas en tejidos y fluidos corporales, basándose en la expresión diferencial de receptores purinérgicos en estas células.

Antecedentes

Cuando se diagnostica el cáncer, se tienen en cuenta características celulares en las muestras de biopsia tales como el grado de variabilidad del tamaño y la forma de las células cancerosas, la proporción de células en división activa y la invasión de estructuras vecinas. Son tinciones histológicas usadas comúnmente la hematoxilina (tinción primaria) y la eosina (contratinción) que marcan de forma diferencial los elementos subcelulares. Otros procedimientos de diagnóstico emplean anticuerpos contra moléculas de diagnóstico particulares dentro de (por medio de epítopos intracelulares) o en la superficie de células o tejidos (por medio de epítopos extracelulares) que pueden hacerse visibles para su análisis microscópico, por ejemplo, antígeno carcinoembrionario (CEA). Algunos ejemplos específicos se analizan a continuación.

Cáncer de próstata

La incidencia de cáncer de próstata en el mundo occidental está aumentando a una velocidad alarmante, habiéndose más que duplicado en los últimos cinco años. Tiene mayor incidencia que cualquier neoplasia, siendo sólo segunda al cáncer pulmonar como la causa más común de muerte por cáncer en hombres en todo el mundo, y es la causa principal de muerte en Australia [1]. La hiperplasia prostática benigna (BPH) es común en hombres mayores de 50 años y es un precursor posible de la neoplasia intraepitelial prostática (PIN), de por sí una precursora del cáncer de próstata. Los estudios postmortem indican que el 70% de los hombres tienen células malignas en su próstata cuando llegan a los 80 años [2]. Esta enfermedad se caracteriza por una variación racial sorprendente y es más prevalente en afroamericanos, intermedia en caucásicos, ligeramente menor en latinos y menos prevalente en asiáticos. No obstante, en este último grupo es la forma de neoplasia que está aumentando más rápidamente. Hasta recientemente, no estaba claro si estas diferencias se debían a la variación genética racial o a la dieta. Los estudios han demostrado ahora que la dieta es un factor de influencia principal [3].

Diagnóstico y tratamiento actual del cáncer de próstata

A pesar de la gravedad de esta afección, los procedimientos de diagnóstico son escasos e imprecisos. Los procedimientos actuales para evaluar el pronóstico tales como el examen rectal digital (DRE), ultrasonidos, niveles de fosfatasa ácida prostática, supresión androgénica, densidad del antígeno prostático específico (PSA), velocidad del PSA, intervalos de referencia específicos por edad del PSA y clasificación histopatológica de Gleason, pueden no proporcionar una información predictiva fiable respecto al desenlace clínico del cáncer de próstata [4]. Por ejemplo, los estudios han demostrado que el DRE da como resultado una tasa de falsos negativos del 36,9% [5]. El PSA es una serina proteasa de 33 kDa que está asociada con varios tejidos aparte de la próstata [6], está regulada positivamente por andrógenos, glucocorticoides y progestágenos y se piensa que está implicada en la regulación de factores de crecimiento. Desgraciadamente, los niveles séricos de PSA tienen una incidencia de diagnósticos falsos negativos del 23% y de diagnósticos falsos positivos del 36,7% [6]. Incluso se ha sugerido que más de la mitad de los nuevos casos detectados por exploración son de hecho falsos positivos [7]. Los intentos por mejorar los procedimientos de exploración mediante la introducción de ensayos adicionales tales como densidad, velocidad e intervalos de referencia específicos por edad del PSA han sido equívocos. Un estudio ha demostrado que la aplicación de un intervalo de referencia del PSA específico por edad que aumenta el límite superior del PSA normal hasta 4,5 ng/ml da como resultado la falta de detección de un número sustancial de cánceres clínicamente significativos [8]. Dada esta incertidumbre, con frecuencia se realiza una biopsia de próstata para confirmar el tumor maligno, pero este ensayo también tiene una incidencia de diagnósticos falsos negativos altamente insatisfactoria del 23% [9].

La elección de tratamiento depende en gran medida de la determinación de la fase clínica basándose en el análisis microscópico de secciones de tejido [10]. Esta técnica depende del juicio y de una experiencia considerable en relacionar el aspecto histológico con el desenlace clínico. Desgraciadamente, es bien sabido que el tejido del cáncer de próstata es muy heterogéneo y puede pasarse por alto fácilmente una característica de diagnóstico vital en la sección que se está examinando. Para complicar más la situación, no se han realizado ensayos aleatorizados y controlados para examinar los resultados de la cirugía y la radioterapia [2]. Las elecciones de tratamiento incluyen prostatectomía radical, terapia de radiación, supresión androgénica y "vigilancia activa". Una respuesta definitiva a la cuestión de la "vigilancia activa" frente a la intervención radical espera a la finalización del ensayo de intervención frente a observación en el cáncer de próstata [11]. Las consecuencias de estas decisiones para el paciente son importantes. Por ejemplo, la prostatectomía radical da como resultado a menudo incontinencia, impotencia, constricción del cuello de la vejiga y depresión [12]. Claramente, se necesitan con urgencia marcadores mejorados que diferencien de forma fiable entre hiperplasia prostática benigna (BPH), neoplasia intraepitelial prostática (PIN), hiperplasia adenomatosa atípica (AAH) y cáncer de próstata.

El papel de receptores P2X en el cáncer

Los neurotransmisores tales como la noradrenalina y acetilcolina actúan, no sólo en la sinapsis y la unión neuromuscular, sino también sobre receptores celulares específicos de transmisores en una amplia diversidad de tejidos y órganos. Estos receptores son canales transmembrana tipo poro que introducen iones en la célula. El trifosfato de adenosina (ATP), más conocido como la moneda molecular de los depósitos de energía intracelulares, se propuso por primera vez como neurotransmisor periférico basándose en su capacidad para contraer el músculo liso [13]. El ATP actúa de la misma forma que otros neurotransmisores y puede activar tanto los receptores tisulares acoplados a proteína G (relativamente lentos) (P2Y) como los canales iónicos purinérgicos dependientes de ligando (rápidos) (P2X1-7) caracterizados más recientemente, y también puede actuar como cotransmisor. A pesar de su descubrimiento relativamente reciente, es probable que el sistema transmisor purinérgico se desarrollase muy pronto en la evolución [14].

Actualmente existen 7 subtipos de receptor P2X genéticamente diferentes. Están tan ampliamente distribuidos como los receptores de los sistemas colinérgico y adrenérgico y se encuentran en la mayoría de las células de mamífero [14]. Estos receptores constituyen una nueva clase de canales de respuesta rápida, unidos a membrana, dependientes de ligando, permeables al calcio, selectivos de cationes que se activan por el ATP extracelular de las terminaciones nerviosas o una fuente tisular local [15-18]. Son predominantemente permeables a iones de calcio pero también admiten otros cationes, tales como potasio y sodio, mediando de este modo la despolarización [19]. Por ejemplo, en el epitelio pulmonar, los canales P2X estimulan la regulación positiva del canal de Cl^{-}, la secreción de K^{+} e inhiben la absorción de Na^{+} (21). El ATP puede estimular tanto la síntesis de ADN como la proliferación celular por medio de la regulación positiva de los receptores P2X [14]. Esta función está ligada a la estimulación de la fosfolipasa C y a la liberación de calcio iónico de depósitos intracelulares sensibles a fosfato de inositol, así como a otras rutas de transducción de señales. Estas acciones se potencian por la acción sinérgica del ATP con factores de crecimiento polipeptídicos [20]. El flujo de entrada de calcio a través de los receptores P2X también desencadena la secreción de otros neurotransmisores, sirve como señal para la activación de canales de potasio dependientes de calcio, inactiva otros tipos de canales de calcio, regula la recuperación endocítica de membranas de vesículas sinápticas, aumenta la síntesis de neurotransmisores, regula las reservas de vesículas sinápticas disponibles para la secreción y desencadena varias formas de plasticidad sináptica. La diversidad de respuestas a una sola estimulación de receptores P2X sugiere que existen muchas rutas activadas por calcio [21].

El ATP extracelular, que actúa por medio de los receptores purinérgicos, también tiene un efecto anticanceroso directo sobre células de cáncer de mama humano, células de carcinoma de próstata, células de adenocarcinoma humano y líneas celulares de fibroblastos. Los linfocitos T citotóxicos y las células asesinas naturales (NK) liberan ATP cuando atacan células tumorales [22]. Sólo se inhibe el crecimiento de células transformadas por inducción de bloqueo en fase S, apoptosis, permeabilidad aumentada a nucleótidos, fosfatos de azúcares, iones y sinergia con otros agentes anticancerosos. Ninguno de estos efectos se observa en células no transformadas [14].

Curiosamente, se sabe que las células tumorales contienen niveles excepcionalmente altos de ATP [23]. Tanto la adenosina como el ATP aumentan el flujo sanguíneo intratumoral por estimulación de la síntesis de óxido nítrico del endotelio, induciendo de este modo una vasodilatación potente [24]. En este caso, el ATP actúa a través de receptores P2Y (26). La liberación de óxido nítrico también está ligada a la función del receptor P2X. Por ejemplo, el 90% de la actividad óxido nítrico sintasa que se encuentra en el miometrio de ovejas no gestantes es dependiente de canales iónicos de calcio [25].

Las proteínas de adhesión epitelial también desempeñan un papel principal en la propagación del cáncer [26]. En la cicatrización de heridas, las señales de lesión celular se propagan por medio de receptores P2X extracelulares y uniones intercelulares comunicantes, estimulando la propagación de ondas inducida por ión calcio [27]. Los iones calcio intracelulares ingresados por los canales P2X desencadenan el transporte de orgánulos unidos a membrana a lo largo de microtúbulos, la remodelación de la ECM y la regulación positiva de la molécula de adhesión E-cadherina [28]. Las células mioepiteliales que se encuentran en los ácinos epiteliales prostáticos ejercen efectos paracrinos importantes sobre células de carcinoma tanto in situ como in vitro. Las células cancerosas también se ven afectadas por una alta expresión de moléculas de ECM, inhibidores de proteasas e inhibidor angiogénico [29]. Durante la invasión metastásica, el flujo de entrada de calcio extracelular activa metaloproteinasas asociadas con la membrana que facilita la penetración tisular por células invasoras. El activador de la plasminógeno uroquinasa también se ha implicado claramente en la progresión de varios tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama y de próstata [30].

Las técnicas actuales para la determinación de la fase y el diagnóstico del cáncer deben mejorarse para proporcionar resultados más fiables usando una tecnología relativamente sencilla. También sería ventajoso tener un procedimiento de diagnóstico susceptible de automatización.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de identificación de células preneoplásicas y/o neoplásicas que supere o mejore sustancialmente al menos algunas de las deficiencias de la técnica anterior, o que proporcione una alternativa útil.

El documento AU 6418498 describe genes humanos que están bajo la regulación transcripcional por el gen supresor de tumores p53.

Gröschel-Stewart U. et al., Cell Tissue Res., Vol. 296 (1999), páginas 599-605, describe la localización de receptores P2X5 y P2X7 por inmunohistoquímica en epitelios escamosos estratificados de rata.

Vulchanova L., et al., Neuropharmacology, Vol. 36, N° 9, (1997-09), páginas 1229-1242, describe un estudio inmunohistoquímico de las subunidades de receptores P2X2 y P2X3 en neuronas sensitivas de rata y mono y en sus terminaciones centrales.

Hansen MA, et al., J. Neurocytology, Vol. 27, N° 7 (1998), páginas 529-539, describe la distribución de grupos de receptores P(2X1) individuales en células musculares lisas en relación con varicosidades nerviosas en la vejiga urinaria de rata.

Virgilio Di F. et al., Drug Development Research, Vol. 45, N° 3/4 (1998-11) páginas 207-213, describe el papel fundamental de un receptor P2X7 purinérgico en la inflamación y la inmunomodulación.

El documento WO 97/41222 describe variantes de corte y empalme del receptor P2X4 humano.

El documento WO 95/33048 describe receptores P2X.

El sistema nervioso purinérgico funciona en paralelo a los sistemas nerviosos adrenérgico y colinérgico mejor conocidos pero de acción más lenta. Como ellos, funciona en el cerebro, la sinapsis, la unión neuromuscular, el sistema nervioso periférico y el músculo liso. La sustancia transmisora que activa estos canales de receptores de cationes dependientes de ligando de acción rápida es el ATP, que actúa desencadenando receptores purinérgicos en tejidos, dando como resultado una diversidad de respuestas metabólicas incluyendo un flujo de entrada de iones en la célula.

Se ha desarrollado una serie única de anticuerpos altamente específicos capaces de diferenciar entre los dominios extracelulares de cada uno de los subtipos de receptor purinérgico P2X. Estos receptores se visualizan fácilmente usando procedimientos inmunocitoquímicos y están presentes en una diversidad de patrones de expresión tales como marcaje de superficie celular, tubular y puntiforme. Se ha demostrado sorprendentemente que la expresión de receptores P2X es característica de fases precancerosas y cancerosas y también de tejidos de mamíferos jóvenes frente a mamíferos de edad avanzada. Estos cambios se acompañan de diferencias marcadas en factores de crecimiento, de la matriz extracelular, metabólicos y de inervación, así como de aumentos en el calcio iónico subepitelial y los microtúbulos. Por lo tanto, la invención proporciona una nueva herramienta con la que diagnosticar afecciones precancerosas (tales como hiperplasia), determinar la fase del cáncer e investigar la fisiología y la etiología básica de la carcinogénesis.

De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento (como se define en las reivindicaciones) para determinar la fase y/o diagnosticar estados preneoplásicos y/o neoplásicos en un mamífero, que comprende la detección del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X de células y/o tejidos de dicho mamífero y la comparación del perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento (como se define en las reivindicaciones) para determinar la etiología de la carcinogénesis en un mamífero, que comprende la detección del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X de células y/o tejidos del mamífero y la comparación del perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

De acuerdo con un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro para diagnosticar el cáncer de próstata en un sujeto, como se define en las reivindicaciones, que comprende detectar el perfil de expresión del receptor purinérgico P2X_{7} en células y/o tejido de próstata del sujeto usando un anticuerpo contra P2X_{7}, en el que un aumento en la intensidad del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X en las células y/o tejido de próstata en comparación con el perfil de expresión de células y/o tejido de próstata de una próstata que tiene hiperplasia prostática benigna es diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata.

De acuerdo con una realización, la presente invención proporciona un procedimiento (como se define en las reivindicaciones) para diagnosticar el cáncer de mama en un sujeto, que comprende detectar el perfil de expresión de receptores purinérgicos P2X_{2} o P2X_{3} en células y/o tejidos de mama del sujeto usando un anticuerpo contra P2X_{2} o P2X_{3}, respectivamente, en el que una disminución en la intensidad del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X en las células y/o tejido de mama de la mama de un sujeto normal es diagnóstica de la presencia de cáncer de mama.

De acuerdo con un quinto aspecto, la invención proporciona el uso de un reactivo de anticuerpo contra receptor purinérgico P2X para determinar la fase y/o diagnosticar un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, como se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con un sexto aspecto, la invención proporciona el uso (como se define en las reivindicaciones) de un reactivo de anticuerpo contra receptor purinérgico P2X para determinar la etiología de la carcinogénesis en un sujeto mamífero.

La solicitud describe una célula o muestra de tejido de mamífero aislada formando un complejo con un reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X.

De acuerdo con un séptimo aspecto, la invención proporciona un kit para diagnosticar un estado preneoplásico y/o neoplásico en un mamífero, que comprende medios para detectar el perfil de expresión del receptor purinérgico P2X en una muestra que comprende células y/o tejido del mamífero y medios para la comparación del nivel de expresión con un nivel de expresión predeterminado, como se define en las reivindicaciones.

La solicitud describe un reactivo de anticuerpo específico para un receptor purinérgico P2X, donde el reactivo es capaz de diferenciar entre células y/o tejidos preneoplásicos o neoplásicos y células y/o tejidos normales.

La solicitud describe un reactivo de anticuerpo específico para un receptor purinérgico P2X cuando se usa para diferenciar entre células y/o tejidos preneoplásicos o neoplásicos y células y/o tejidos normales.

La solicitud describe un reactivo de anticuerpo específico para un receptor purinérgico P2X cuando se usa para diferenciar entre receptores P2X funcionales y no funcionales en células y/o tejidos.

Preferiblemente, el mamífero es un ser humano, aunque será evidente para el destinatario experto que el procedimiento puede aplicarse a cualquier mamífero. Preferiblemente las células son tejido y/o células de próstata o tejido y/o células de mama. Las células pueden obtenerse por biopsia pero también pueden obtenerse a partir de un fluido corporal o, en el caso de tejido y/o células de próstata, a partir de exudado de examen rectal digital o de semen.

Preferiblemente el reactivo de anticuerpo comprende un antisuero policlonal. Preferiblemente, el reactivo de anticuerpo P2X es específico para los receptores P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} o P2X_{7}, más preferiblemente los receptores P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} o P2X_{7}. Será evidente para los expertos en la materia que el reactivo de anticuerpo puede ser una serie de anticuerpos que pueden ser policlonales o monoclonales. También será evidente para los expertos en la materia que la serie de anticuerpos contra el receptor P2X puede comprender cualquier combinación de los subtipos de receptor P2X y, en particular, la combinación de P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} y P2X_{7}.

Preferiblemente, la detección del perfil de expresión del receptor P2X es por medios inmunohistoquímicos. Será evidente para el destinatario experto que los receptores P2X pueden detectarse por otros medios incluyendo ELISA, RIA o técnicas inmunológicas similares dependiendo de la fuente de la célula o muestra de tejido y de los reactivos disponibles. Preferiblemente, los receptores P2X se detectan mediante un ensayo colorimétrico. También será evidente para los expertos en la materia que las técnicas de transferencia de Western y la detección de ARNm de receptor purinérgico P2X pueden ser útiles en la determinación del perfil de expresión del receptor P2X.

En el contexto de la presente invención, la expresión "células preneoplásicas" comprende células que son hiperplásicas o hipertróficas.

En el contexto de la presente invención, la expresión "serie de anticuerpos" comprende anticuerpos policlonales que contienen varios anticuerpos diferentes específicos para los mismos antígenos o antígenos diferentes y que son capaces de diferenciar específicamente entre cada uno de los subtipos de receptor P2X. Cuando los anticuerpos son monoclonales, la expresión "serie de anticuerpos" también comprende un panel de anticuerpos capaz de diferenciar específicamente entre cada uno de los subtipos de receptor P2X.

En el contexto de la presente invención, la detección de un "perfil de expresión" comprende la detección de un patrón o intensidad de expresión.

A menos que el contexto requiera claramente otra cosa, por toda la descripción y las reivindicaciones las palabras "comprende", "que comprende" y similares deben interpretarse en un sentido inclusivo, a diferencia de un sentido exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de "incluyendo, pero sin limitación".

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un ejemplo del nivel de marcaje P2X_{1} en una muestra de biopsia tomada de una próstata humana normal (izquierda) y de un paciente con cáncer de próstata avanzado (derecha).

La Figura 2 muestra una comparación de epitelio de próstata (E) de una rata joven (12 semanas) (izquierda) y tejido de una rata de edad avanzada (18 meses; derecha). El tejido de edad avanzada muestra una hiperplasia marcada.

La Figura 3 muestra un ejemplo de marcaje de P2X_{1} en mama normal (derecha) y de la regulación negativa sustancial en tejido tumoral de mama (izquierda).

Las Figuras 4a, b, d y e muestran biopsias de núcleo de un hombre de 71 años de edad con PSA en aumento. Diagnóstico-BPH. La tinción con H y E (4a) muestra una hiperplasia leve en el epitelio apical (flecha) de los ácinos prostáticos (A). La Figura 4d es una micrografía de alta energía de esta área (flecha). El marcaje con anti-P2X en la misma área (4b) muestra el cese completo de la expresión de receptores P2X que es característica de la BPH (4b - flecha). La Figura 4e es una microfotografía de alta energía de esta área que muestra un cese completo de la expresión de P2X en el epitelio levemente hiperplásico (4e-flecha). La Figura 4c. Sección de biopsia de núcleo de un hombre de 69 años de edad. PSA desconocido. Este caso también se diagnosticó como BPH por tinción con H y E (no se muestra) pero presenta un marcaje de P2X distintivo de Fase 1, como se caracteriza por núcleos epiteliales prominentes (PEN) (4c-flecha). La Figura 4f es una micrografía de alta energía de estos núcleos densamente marcados (4f-flecha), como se muestra en la Figura 4c. Figuras 4a y 4 d, tinción con H y E. Figuras 4b, c, e y f, anti-P2X marcado con inmunoperoxidasa. Sin contratinción. La barra para las micrografías de baja energía (4a, b y c) es de 1 cm = 150 \mum. La barra para las micrografías de alta energía (4d, e y f) es de 1 cm = 40 \mum.

Las Figuras 5a-c muestran biopsias de núcleo (suministradas como 3 núcleos) de un hombre de 57 años de edad con PSA en aumento. Se diagnosticó que dos núcleos contenían áreas de BPH adyacentes a áreas de cáncer avanzado, puntuación de Gleason 8. La Figura 5a muestra un área de BPH sin marcadores de cáncer (5a-flecha) teñida con H y E. La Figura 5b es una sección seriada del mismo bloque marcado con anticuerpo contra P2X_{1}. El marcaje de P2X es característico de la Fase 2 de translocación. La presencia de estas características en tejido diagnosticado por tinción con H y E como BPH indica no sólo la presencia de un cambio preneoplásico, sino que esos cambios están más avanzados. La Figura 5c es una micrografía de alta energía de una sección seriada de los ácinos señalados con una flecha en la Figura 5b. Representa características de Fase 2, de la forma siguiente: continúa habiendo algunos PEN (N-punta de flecha) pero la mayor parte del marcaje es ahora puntiforme y citoplasmático (P-flecha). Experimentos anteriores han demostrado que cada punteado es un receptor P2X marcado individualmente o una zona de receptores localizada pequeña. Las membranas plasmáticas laterales están claramente marcadas (L-flecha) y existe marcaje en el epitelio apical (A-flecha).

Las Figuras 5d-f muestran una biopsia de núcleo (3 núcleos) de un hombre de 81 años de edad con un valor de PSA de 8,1. En este caso el diagnóstico era de adenocarcinoma infiltrante, puntuación de Gleason 6. La tinción con H y E (Figura 5d) mostraba áreas tanto de BPH como de cáncer invasivo (nucleolos prominentes, invasión de la membrana basal y arquitectura de los ácinos anormal). La Figura 5e muestra un aumento en el marcaje de P2X en el epitelio apical (flecha) pero una disminución general en la señal global. Una micrografía de alta energía (Figura 5f) muestra que estas características de marcaje P2X son típicas de la Fase 3 de translocación de P2X. El marcaje es menos intenso que el observado en la Fase 2 (Figura 5b), debido a una concentración de marcador en el epitelio apical. Los núcleos están desprovistos de marcador excepto por la membrana nuclear (N-flecha). El marcador es homogéneo más que puntiforme y se encuentra principalmente en el epitelio apical (A-flecha). A la finalización del proceso de translocación, el marcador de P2X se concentraba comúnmente en el epitelio apical, después de lo cual se dejaba de expresar (D). Figuras 5a y 5d, tinción con H y E. Figuras 5b, c, e y f, marcador de P2X con inmunoperoxidasa. Sin contratinción. La barra para las micrografías de baja energía (5a, b, d y e) es de 1 cm = 150 \mum. La barra para las micrografías de alta energía (5c y f) es de 1 cm = 40 \mum.

Las Figuras 6a-m muestran patrones de tinción en tejido de biopsia de cáncer de mama en comparación con tejido normal.

Descripción de la invención

Una realización preferida de la invención se describirá ahora a modo de ejemplo solamente y con referencia a las Figuras adjuntas.

Ejemplo 1 Procedimiento inmunohistoquímico

El método inmunohistoquímico usado en este estudio se adaptó del de Barclay [31], Se cortaron secciones con un grosor de 8 \mum a partir de tejido congelado sin fijar usando un criotomo Reichert Jung 2800 Frigocut. Las secciones se secaron al aire a temperatura ambiente durante 1 hora, se fijaron durante 12 horas en acetona a -20°C y se secaron al aire a temperatura ambiente durante 1 hora antes del marcaje con anticuerpos. Después, se incubaron a temperatura ambiente con uno de los anticuerpos de conejo o de cabra anti-P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} o P2X_{7}. Después del lavado, las secciones se incubaron entonces en el anticuerpo secundario; una dilución 1:30 de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP (Dako) durante 30 min para los primarios de conejo y de anticuerpo secundario de cabra anti-oveja conjugado con HRP (Dako) para los primarios de oveja. Los portaobjetos se aclararon de nuevo y se sumergieron después en tetraclorhidrato de diaminobenzidina al 15% (DAB-Sigma) durante 10 minutos. Las secciones se aclararon, se secaron al aire y se montaron en DPX (Merck). Los portaobjetos de control se incubaron en tampón diluyente durante la primera incubación y después se trataron de la misma forma que los portaobjetos experimentales. Los portaobjetos de control negativo se trataron de la misma forma que los portaobjetos experimentales excepto por que el anticuerpo primario se sustituyó con suero no inmune.

Ejemplo 2 Producción de anticuerpo

Las secuencias de consenso de los receptores clonados de rata P2X_{1} [32], P2X_{2} [33], P2X_{3} [34], P2X_{4} de rata [35], P2X_{5} de rata [36], P2X_{6} de rata [36], P2X_{7} de rata [37], P2X_{7} humano [38], P2X_{1} humano [39], P2X_{3} humano [40], P2X_{4} humano [41] y P2X_{5} humano [42] se examinaron para determinar epítopos adecuados siguiendo la estrategia adoptada en Hansen et al. [15]. Los epítopos no homólogos correspondientes al segmento Lys199-Cys217 usado en el P2X_{1} de rata se utilizaron en el P2X_{3} de rata, el P2X_{6} de rata y el P2X_{7} de rata. Las variaciones se aplicaron al P2X_{4} de rata, que usaba la secuencia Ile235-Gly251 a la que estaba unido un resto Cys C-terminal para su entrecruzamiento con un dominio de toxina diftérica de 6 kDa. El epítopo de P2X_{2} se seleccionó de una región dentro del dominio C1 [15], Cys130-Gly153. El epítopo de P2X_{5} de rata se seleccionó de una región más próxima al segundo dominio transmembrana pero todavía extracelular (Lys314-Ile333 a la que se añadió una Cys C-terminal también para su conjugación). Aunque es en gran parte homólogo al P2X_{4} de rata, no se produjo el entrecruzamiento de P2X_{4} y P2X_{5}. Todos los anticuerpos contra secuencias de rata eran capaces de marcar los receptores humanos correspondientes. Se usó un epítopo separado para las secuencias de P2X_{1} y P2X_{7} humanos. Éste se tomó justo C-terminal al primer dominio transmembrana de Lys68-Val84 con una Cys N-terminal añadida para su conjugación por medio de un dominio de toxina diftérica, usando maleimidocaproil-N-hidroxisuccinimida. El epítopo para el anticuerpo contra P2X_{3} humano era la secuencia equivalente usada para rata, mientras que los epítopos para el P2X_{4} humano y el P2X_{5} humano eran Cys270-Asn287 y Cys272-Ser288, respectivamente. Todas las síntesis se llevaron a cabo usando química de t-BOC convencional en un sintetizador ABI [43]. Los conjugados de antígeno-péptido se suspendieron en agua a 5 mg/ml y se emulsionaron alícuotas por mezcla con adyuvante completo de Freund. Se inyectaron por vía intramuscular volúmenes de emulsión de 1 ml que contenían 2 mg de péptido, siguiéndose con la segunda, tercera, cuarta y quinta inmunización a intervalos de 2 semanas, usando adyuvante incompleto de Freund. Se obtuvieron extracciones finales de sangre por venopunción a las 10-12 semanas, después de que se estableciera que se habían obtenido títulos de anticuerpos adecuados en los conejos u ovejas usadas para cada epítopo. La sangre se incubó a 37°C durante 30 min y se almacenó a 4°C durante 15 h, después de lo cual se recogió el suero tras la centrifugación y se almacenó a -20°C en alícuotas pequeñas. Los sueros se ensayaron con un ensayo de ELISA para anticuerpos específicos para cada péptido [15]. El título de anticuerpos, definido como la inversa de la dilución de suero que daba como resultado una absorbancia de 1,0 por encima del fondo en el ensayo de ELISA, estaba en el intervalo de 75.000 \pm 4.000, en comparación con 225 \pm 25 para las muestras preinmunes.

La purificación por afinidad de cada uno de los anticuerpos contra el epítopo específico para ese anticuerpo daba como resultado un fondo reducido pero tendencias de marcaje idénticas.

Ejemplo 3 Especificidad de los anticuerpos

Se ha demostrado que cada uno de los antisueros de P2X usados posee distribuciones similares en muchos casos pero con distribuciones distintivamente diferentes en otros casos, indicando que los antisueros no carecen de especificidad. La especificidad se demostró mediante purificación por afinidad de los sueros contra los péptidos afines. Para verificar adicionalmente la especificidad de los anticuerpos, se añadieron anticuerpos individuales tales como el anticuerpo contra P2X_{1} a células transfectadas con el ADNc de P2X_{1} correspondiente en presencia y ausencia de una concentración 10 mM del epítopo de P2X_{1}. El inmunomarcaje y la formación de imágenes confocales de los ovocitos de Xenopus transfectados demostró que el P2X_{1} expresado se localiza, como se esperaba, dentro de la membrana celular y la presencia de una concentración 10 mM del péptido a fin como un control de la absorción dio como resultado el bloqueo de la tinción de P2X_{1} [18].

Se ha demostrado de forma similar la especificidad individual de todos los demás anticuerpos.

Ejemplo 4 Preparación de tejido para examen ultraestructural de la morfología

El tejido se procesó para su examen morfológico de la forma siguiente: se fijaron secciones de aproximadamente 3 mm x 3 mm de tamaño en glutaraldehído al 2,5% en tampón Tris 0,1 M pH 7,2 durante 1 hora. Después, se lavaron y se postfijaron en tetróxido de osmio acuoso al 2% durante 2 horas. Después de un lavado adicional, el tejido se deshidrató en una serie graduada de alcoholes y se embebió en resina Spurr. El endurecimiento se llevó a cabo a 50°C durante 18 horas. Después, se cortaron secciones de 100 nm con una cuchilla de diamante, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo de Reynolds de la forma habitual y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Phillips 400.

Ejemplo 5 Inmunocitoquímica ultraestructural

Se usó el método de Slater [44]. En resumen, se cortaron secciones finas (100 nm) y se recuperaron en rejillas de níquel de malla de 300. Después de la incubación en solución de bloqueo (BSA al 1% en PBS) durante 30 min, las secciones se colocaron en la superficie de una gota de la solución de bloqueo (con la adición de Tween 20 al 0,05%) que contenía anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP o anticuerpo secundario de cabra anti-oveja conjugado con HRP (diluido 1:100) durante 1 h a temperatura ambiente. Después, las rejillas se aclararon tres veces durante 10 min en PBS y se colocaron sobre gotas de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con oro de 10 nm (Nanoprobe) durante 1 h a temperatura ambiente. Después, las rejillas se lavaron dos veces con PBS, seguido de un lavado con agua destilada, durante 10 minutos cada uno, y después se colocaron en el vapor de tetróxido de osmio acuoso al 2% durante 1 minuto. Después, las secciones se tiñeron con una solución acuosa de acetato de uranilo durante 20 min, citrato de plomo durante 10 min, se aclararon dos veces durante 10 min en agua destilada y se examinaron con un microscopio electrónico Phillips 400 a 80 kV.

Ejemplo 6 Receptores de P2X en tejido canceroso humano

En un estudio de 4 casos normales y 6 casos de cáncer de próstata humano, los subtipos P2X_{1}, P2X_{3} y P2X_{4} estaban notablemente aumentados en el tejido de cáncer de próstata humano. No había en absoluto marcaje para estos subtipos en el tejido normal. Los patrones de marcaje para el P2X_{1} (Figura 1) en el tejido canceroso eran particularmente interesantes en el sentido de que había una mayor proporción de células epiteliales acinares marcadas con cada fase de la enfermedad de la próstata, sugiriendo una correlación directa entre la transformación neoplásica y el grado de marcaje acinar de P2X_{1}. El P2X_{5} también se aumentaba en algunas células de cáncer de próstata (no se muestran los resultados). Había muy poco o ningún marcaje para P2X_{5} en el tejido normal.

Ejemplo 7 Modulación de receptores P2X, factores de crecimiento, inervación y metabólicos y calcio iónico en ratas Wistar jóvenes frente a ratas de edad avanzada Receptores P2X y apoptosis

Los estudios que comparaban próstatas de cuatro ratas de 12 semanas de edad y cuatro ratas de 1,5 años de edad dieron como resultado la detección de un aumento marcado en la hiperplasia epitelial en las ratas de edad avanzada, que se parecía a la BPH en seres humanos (Figura 2). Como con el tejido canceroso humano, el anticuerpo contra receptor de tirosina quinasa A y los receptores P2X_{1}, P2X_{3} y P2X_{4} estaban regulados positivamente en el epitelio prostático de ratas de edad avanzada, en comparación con el de ratas jóvenes. Como se ha analizado anteriormente, esto indica un aumento en la fosforilación de proteínas (activación), la síntesis de ADN, la expresión intracelular de microtúbulos (transporte de orgánulos), la regulación positiva de receptores adyacentes para otros neurotransmisores, la proliferación celular y un flujo de entrada de iones (principalmente calcio iónico) en las células epiteliales, indicando apoptosis. También se observó un aumento en alfa (1B) (canal de calcio dependiente de voltaje) y una reducción en la hormona reguladora del calcio estaniocalcina en las próstatas de ratas de edad avanzada. Tanto el PDGF como el IGF-1 inhiben la apoptosis y estaban disminuidos en las ratas de edad avanzada [45]. Por lo tanto, la próstata de ratas de edad avanzada experimenta apoptosis y cambios en la expresión del receptor P2X similares al tejido de cáncer de próstata humano y, por lo tanto, puede usarse para investigar la etiología del cáncer de próstata.

Inervación, otros receptores y factores metabólicos

En las ratas de edad avanzada había un aumento de estructuras microtubulares en los tabiques fibromusculares subyacentes al epitelio prostático. Estas estructuras parecían similares en micrografías que representaban los receptores purinérgicos asociados con apoptosis P2X_{1}, P2X_{7}, calcio iónico y los factores de inervación VAMP, receptor muscarínico (M2), SV-2, SNAP-25, S100 y receptor de transferrina, estando todos regulados positivamente en las ratas de edad avanzada. Los canales de calcio dependientes de voltaje alfa (1B) y los receptores de tirosina quinasa A también estaban regulados positivamente en ratas de edad avanzada. La estaniocalcina estaba regulada negativamente, mientras que los receptores de canales de calcio apoptóticos P2X_{1} y P2X_{7} estaban regulados positivamente. Estos datos indican un aumento en el flujo de entrada de ión calcio, la tasa metabólica, el transporte de microtúbulos y la inervación del epitelio prostático en las ratas en edad avanzada y también sugieren que este modelo podría usarse para investigar el cáncer de próstata humano.

Ejemplo 8 Líneas celulares de cáncer de mama

En 6 líneas celulares de cáncer de mama suministradas como secciones congeladas, se marcaron los subtipos purinérgicos P2X_{1}, P2X_{3} y P2X_{4} usando las mismas técnicas empleadas en el marcaje de tejidos de próstata. El patrón de marcaje (Figura 3) parecía indicar que se trataba de los patrones de marcaje observados tanto en el tejido de cáncer de próstata humano (Figura 1) como en la próstata de la rata Wistar macho de edad avanzada (Figura 2).

Ejemplo 9 Diagnóstico de cáncer de próstata (Figuras 4a-f y 5a-f)

Las características de expresión de los canales de calcio de receptores purinérgicos (P2X_{1-7}) se examinaron en tejido de próstata normal y patológico de 65 casos que representaban cada fase de la enfermedad de la próstata: normal, BPH, preneoplásica y cancerosa (clasificación de Gleason 5-9). Se observaron características de translocación claras en los tejidos marcados con P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} y P2X_{7}. Después de un largo proceso de optimización y normalización de la producción de anticuerpos contra P2X y protocolos de marcaje, se desarrolló un protocolo normalizado. Una mezcla de subtipos P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} y P2X_{7} a una concentración de IgG 0,5 \mug/ml cada uno, diluida 1:100 con PBS, demostraba ser el mejor reactivo para poner de manifiesto las características de translocación descritas. El marcaje con P2X_{4}, P2X_{5} o P2X_{6} era de menor importancia. Usando este reactivo para marcar secciones tisulares de cada categoría de cáncer de próstata, se descubrió que existía una expresión y translocación secuencial del marcaje de P2X desde los núcleos hasta el citoplasma y las membranas plasmáticas laterales, expresándose en última instancia principalmente en el epitelio apical a medida que avanzaba el cáncer (Figuras 4f, 5c, 5f).

El marcaje de P2X dejaba de expresarse completamente en tejido de BPH (Figuras 4b, 4e). La translocación preneoplásica de P2X se producía en tres fases diferentes. La Fase 1 se caracterizaba por núcleos epiteliales marcados con P2X prominentes densos (PEN) sobre un fondo claro (Figuras 4c, 4f). La Fase 2 presentaba una falta de expresión progresiva de PEN y la aparición de un marcaje citoplasmático denso y notablemente puntiforme, marcaje de la membrana nuclear y de la membrana plasmática lateral y una señal creciente en el epitelio apical (Figuras 5b, 5c). La Fase 3 estaba representada por núcleos marcados solamente en la membrana nuclear (NO), sin señal citoplasmática, un marcaje homogéneo más que puntiforme y un marcaje denso en el epitelio apical (Figuras 5e, 5f).

En el presente estudio, el 56% de los casos que se habían diagnosticado como normales o BPH por tinción con hematoxilina y eosina (H y E), mostraban marcaje de P2X de Fase 1 o Fase 2. Los casos restantes, que variaban de puntuación de Gleason G5 a G9, tenían características de marcaje de P2X de Fase 2 ó 3. El marcaje de Fase 3 estaba siempre acompañado de las características histológicas del cáncer (Figura 5e). El tejido de BPH no neoplásico verdadero se distinguía fácilmente por la falta de expresión completa de todos los subtipos de P2X en el epitelio y en el estroma. Se propone que el tejido de biopsia que se ha diagnosticado histológicamente como normal pero que presenta características de marcaje de P2X puede estar en un proceso de transformación temprana (preneoplásica) a nivel metabólico. La demostración de las características de Fase 2 en tejido "normal" sugiere que el proceso preneoplásico está más avanzado en ese tejido. Las características de marcaje de P2X descritas son específicas de fase y uniformes por todo el área completa de células representativas de cada clasificación histológica. En los núcleos que contenían tanto áreas de BPH como de cáncer, el marcaje de P2X estaba claramente y uniformemente demarcado hacia BPH o uno de los patrones de marcaje del cáncer. Se propone que esta técnica puede usarse para excluir (y reevaluar) pacientes con afecciones prostáticas no neoplásicas de los que tienen cáncer temprano y también para identificar preneoplasias de evolución rápida que pueden llevar a un tumor maligno. Esta información puede permitir decisiones de tratamiento más tempranas y exactas.

Ejemplo 10 Diagnósticos de cáncer de mama

Los subtipos P2X_{2}, P2X_{3} y P2X_{7} están significativamente regulados negativamente en el tejido de biopsia de cáncer de mama en comparación con el normal. Los subtipos P2X_{1}, P2X_{4}, P2X_{5} y P2X_{6} no estaban marcados ni en tejido normal ni en el canceroso. El tejido se preincubó con peróxido de hidrógeno al 3% y suero de caballo al 5% para suprimir la actividad peroxidasa endógena. Se muestran ejemplos de los patrones de tinción en las Figuras 6a-m.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ejemplos específicos, los expertos en la materia apreciarán que la invención puede plasmarse en otras muchas formas.

Bibliografía

1. Lian FR, Bhuiyan M, Li YW, Wall N, Kraut M y Sarkar FH, 1998 Genistein-Induced G(2)-M Arrest, P21(Wafl) Upregulation, and Apoptosis in a Non-Small-Cell Lung Cancer Cell Line. Nutr. & Cancer. 31: 184-191.

2. Hoey J, 1998 Prostate cancer: progress and perplexity. CMAJ 159: 1-3.

3. Kolonel LN, Nomura AM, Hinds MW, Hirohata T, Hankin JH y Lee J, 1983 Role of diet in cancer incidence in Hawaii. Cancer Res. 43: 2397s-2402s.

4. Festuccia C, Vincentini C, di Pasquale AB, Aceto G, Zazzeroni F, Miano L y Bologna M, 1995 Plasminogen activator activities in short-term tissue cultures of benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma. Oncol. Res. 7: 131-138.

5. Saxena S, Mohanty NK y Jain AK, 1997 Screening of prostate cancer in males with prostatism. Ind. J. Pathol. Micro. 40: 441-450.

6. Diamandis EP y Yu H, 1997 Nonprostatic sources of prostate-specific antigen. Urol. Clin. Nth. Am. 24: 275-282.

7. Weyler J, 1999 Prostate cancer: screening or watchful waiting? Ann. Oncol. 9: 9-11.

8. Bassler TJ, Orozco R, Bassler IC, Odowd GJ y Stanley TA, 1998 Most Prostate Cancers Missed By Raising the Upper Limit of Normal Prostate-Specific Antigen For Men in Their Sixties Are Clinically Significant. Urol. 52: 1064-1069.

9. Rabbani F, Stroumbakis N, Kava BR, Cookson MS y Fair WR, 1998 Incidence and clinical significance of false-negative sextant prostate biopsies. J. Urol. 159: 1247-1250.

10. Gao X, Porter AT, Grignon DJ, Pontes JE y Honn KV, 1997 Diagnostic and prognostic markers for human prostate cancer. Prostate 31: 264-281.

11. Small EJ, 1997 Prostate cancer. Curr. Opin. Oncol. 9: 277-286.

12. Moul JW, Mooneyhan RM, Kao TC, McLeod DG y Cruess DF, 1998 Preoperative and Operative Factors to Predict Incontinence, Impotence and Stricture After Radical Prostatectomy. Prost. Can. & Prost. Dis. 1: 242-249.

13. Drury A y Szent-Gyorgyi A, 1929 The physiological activity of adenine compounds with special reference to their action upon the mammalian heart. J. Physiol. 68: 213-237.

14. Abbracchio M y Burnstock G, 1998 Purinergic signalling: pathophysiological roles. Jap. J. Pharmacol. 78: 113-145.

15. Hansen MA, Barden JA, Balcar VJ, Keay KA y Bennett MR, 1997 Structural motif and characteristics of the extracellular domain of P2X receptors. Biochem. Biophys. Res. Gomm. 236: 670-675.

16. Hansen MA, Balcar VJ, Barden JA y Bennett MR, 1998 The distribution of single P2X1-receptor clusters on smooth muscle in relation to nerve varicosities in the rat urinary bladder. J. Neurocytol. 27: 529-539.

17. Hansen M, Dutton J, Balcar V, Barden J y Bennett M, 1999 P2x (purinergic) receptor distributions in rat blood vessels. J. Auton. Nerv. Syst. 75: 147-155.

18. Dutton J, Hansen M, Balcar V, Barden J y Bennett MR, 1998 Development of P2X receptor clusters on smooth muscle cells in relation to nerve varicosities in the rat urinary bladder. J. Neurocytol. En prensa.

19. Filipovic DM, Adebanjo OA, Zaidi M y Reeves WB, 1998 Functional and molecular evidence for P2x receptors in Llc-Pkl Cells. Am. J. Physiol. 43: F1070-F1077.

20. Abbracchio M, 1996 P1 and P2 receptors in cell growth and differentiation. Drug. Dev. Res. 39: 393-406.

21. Augustine G, Betz H, Bommert K, Charlton M, DeBello W, Hans M y Swandulla D, Molecular pathways for presynaptic calcium signalling, in Molecular and Cellular Mechanisms of Neurotransmitter Release, L. Stjarne, et al, Editores. 1994, Raven Press: Nueva York. págs. 139-155.

22. Di Firgilio F, Pizzo P, Zanovello P, Bronte V y Collavo D, 1990 Extracellular ATP as a possible mediator of cell-mediated cytotoxicity. Immunol. Today 11: 274-277.

23. Siems W, Grune T, Schmidt H, Tikhonov Y y Pimenov A, 1993 Purine nucleotide levels in host tissues of Ehrlich ascities tumor-bearing mice in different growth phases of the tumor. Cancer Res. 53: 5143-5147.

24. Natori Y, Moriguchi M, Fujiwara S, Takeshita I, Fukui M, Iwaki T y Kanaide H, 1992 Effects of L-NMMA and L-NNA on the selective ATP-induced enhancement of intratumoral blood flow. J. Cereb. Blood Flow Metab. 12: 120-127.

25. Figueroa JP y Massmann GA, 1995 Estrogen increases nitric oxide synthase activity in the uterus of nonpregnant sheep. Am. J. Obstet. Gynecol. 173: 1539-1545.

26. Rabbani SA y Xing RH, 1998 Role of urokinase (uPA) and its receptor (uPAR) in invasion and metastasis of hormone-dependent malignancies. Int. J. Oncol. 12: 911-920.

27. Ciccarelli R, Di Iorio P, Ballerini P, Ambrosini G, Giuliani P, Tibone G y Caciagli F, 1994 Effects of exogenous ATP and related analogues on the proliferation rate of dissociated primary cultures of rat astrocytes. J. Neurosci. Res. 39: 556-566.

28. Potter SW, Gaza G y Morris JE, 1996 Estradiol induces E-cadherin degradation in mouse uterine epithelium during the estrous cycle and early pregnancy. J. Cell. Physiol. 169: 1-14.

29. Kedeshian P, Sternlicht MD, Nguyen M, Shao ZM y Barsky SH, 1998 Humatrix, a Novel Myoepithelial Matrical Gel With Unique Biochemical and Biological Properties. Cancer Lett. 123: 215-226.

30. Dethlefsen SM, Raab G, Moses MA, Adam RM, Klagsbrun M y Freeman MR, 1998 Extracellular calcium influx stimulates metalloproteinase cleavage and secretion of heparin-binding EGF-like growth factor independently of protein kinase C. J. Cell. Biochem. 69: 143-153.

31. Barclay A, 1981 The localisation of populations of lymphocytes defined by monoclonal antibodies in rat lymphoid tissues. Immunology 42: 593-600.

32. Valera S, Hussy N, Evans RJ, Adami N, North RA, Surprenant A y Buell G, 1994 A new class of ligand-gated ion channel defined by P2x receptor for extracellular ATP [see comments]. Nature 371: 516-519.

33. Brake AJ, Wagenbach MJ y Julius D, 1994 New structural motif for ligand-gated ion channels defined by an ionotropic ATP receptor. Nature 371: 519-523.

34. Lewis C, Neidhart S, Holy C, North RA, Buell G y Surprenant A, 1995 Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons [see comments]. Nature 377: 432-435.

35. Buell G, Collo G y Rassendren F, 1996 P2X receptors: an emerging channel family. Eur. J. Neurosci. 8:
2221-2228.

36. Collo G, North RA, Kawashima E, Merlo-Pich E, Neidhart S, Surprenant A y Buell G, 1996 Cloning OF P2X5 and P2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. J. Neurosci. 16: 2495-2507.

37. Surprenant A, Rassendren F, Kawashima E, North RA y Buell GS, 735-738, 1996 The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science 272: 735-738.

38. Rassendren F, Buell GN, Virginio C, Collo G, North RA y Surprenant A, 1997 The permeabilizing ATP receptor, P2X7. Cloning and expression of a human cDNA. J. Biol. Chem, 272: 5482-5486.

39. Longhurst PA, Schwegel T, Folander K y Swanson R, 1996 The human P2x1 receptor: molecular cloning, tissue distribution, and localization to chromosome 17. Biochim. Biophys. Acta 1308: 185-188.

40. Garcia-Guzman M, Stuhmer W and Soto F, 1997 Molecular characterization and pharmacological properties of the human P2X3 purinoceptor Brain Res. Mol. Brain Res. 47, 59-66.

41. Garcia-Guzman M, Soto F, Gomez-Hernandez JM, Lund PE y Stuhmer W, 1997 Characterization of recombinant human P2X4 receptor reveals pharmacological differences to the rat homologue. Mol. Pharmacol. 51,
109-118.

42. Le KT, Paquet M, Nouel D, Babinski K y Seguela P, 1997 Primary structure and expression of a naturally truncated human P2X ATP receptor subunit from brain and immune system FEBS Lett. 418,195-199.

43. Barden JA, Cuthbertson RM, Jia-Zhen W, Moseley JM y Kemp BE, 1997 Solution structure of parathyroid hormone related protein (residues 1-34) containing an Ala substituted for an Ile in position 15 (PTHrP[Ala15]-(1-34)). J. Biol. Chem. 272: 29572-29578.

44. Slater M, Patava J, Kingham K y Mason RS, 1994 Modulation of growth factor incorporation into the extracellular matrix of human osteoblast-like cells in vitro by 17\beta estradiol. Am. J. Physiol. 267: E990-E1001.

45. Kiess W y Gallaher B, 1998 Hormonal control of programmed cell death/apoptosis. Eur. J. Endocrinol. 138: 482-491.

Claims (29)

1. Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende:

detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} y P2X_{7} de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y

comparar el perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

2. Procedimiento in vitro para determinar la etiología de la carcinogénesis en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende:

detectar un perfil de expresión de uno o más receptores P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} y P2X_{7} de células y/o tejidos de dicho sujeto, donde el perfil de expresión del receptor se detecta mediante un reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X y

comparar el perfil con perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células son células de próstata.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células son células de mama.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el estado preneoplásico y/o neoplásico es una afección de la próstata.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el estado preneoplásico y/o neoplásico es una afección de la mama.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X está en forma de antisuero policlonal.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X está en forma de antisuero monoclonal.

9. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es específico para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} o P2X_{7}.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es específico para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} o P2X_{7}.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es una serie de anticuerpos policlonales.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X es una serie de anticuerpos monoclonales.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o con la reivindicación 12, en el que la serie de anticuerpos de receptor P2X comprende una combinación de anticuerpos específicos para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} y P2X_{7}.

14. Procedimiento in vitro de determinación de la fase y/o diagnóstico de un estado preneoplásico y/o neoplásico en un sujeto mamífero, preferiblemente en un ser humano, que comprende el uso de una célula o muestra de tejido de mamífero aislada de dicho sujeto formando un complejo con un reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X específico para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} o P2X_{7} para detectar un perfil de expresión del receptor purinérgico P2X de células y/o tejido de dicho sujeto y la comparación del perfil con un perfil de expresión predeterminado de células y/o tejidos normales.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero policlonal.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero monoclonal.

17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que el reactivo de anticuerpo específico de receptor purinérgico P2X es específico para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} o P2X_{7}.

18. Kit para diagnosticar un estado preneoplásico y/o neoplásico en un mamífero que comprende medios para la detección del perfil de expresión del receptor purinérgico P2X en una muestra que comprende células y/o tejido del mamífero y medios para la comparación del nivel de expresión con un nivel de expresión predeterminado, en el que el medio de detección comprende un reactivo de anticuerpo específico para dos o más receptores purinérgicos P2X seleccionados del grupo que consiste en P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3}, P2X_{4}, P2X_{5}, P2X_{6} y P2X_{7}.

19. Kit de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero policlonal.

20. Kit de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el reactivo de anticuerpo de receptor purinérgico P2X comprende un antisuero monoclonal.

21. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que el reactivo de anticuerpo es específico para P2X_{1}, P2X_{2}, P2X_{3} o P2X_{7}.

22. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el perfil de expresión del receptor purinérgico P2X se detecta mediante un ensayo colorimétrico.

23. Kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el ensayo es un ELISA.

24. Kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el ensayo es un RIA.

25. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es un fluido corporal.

26. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es un exudado de examen rectal digital.

27. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la muestra es una muestra de biopsia.

28. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-17, en el que el reactivo de anticuerpo específico para un receptor purinérgico P2X, en el que el reactivo es capaz de diferenciar entre células y/o tejido preneoplásicos o neoplásicos y células y/o tejido normales.

29. Procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto que comprende detectar un receptor purinérgico P2X_{7} en células y/o tejido de próstata del sujeto usando un anticuerpo contra P2X_{7}.