ES2340270T3 - Granzima b dependiente de peptidos hsp70/hsp70 como inductora de apoptosis en celulas tumorales. - Google Patents
Granzima b dependiente de peptidos hsp70/hsp70 como inductora de apoptosis en celulas tumorales. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento ex vivo de inducción o mejora de la expresión de la granzima B en células natural killer (NK) que comprende poner en contacto células NK con (a)proteína Hsp70; (b)un fragmento (C-terminal) de (a) que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; (c)un (poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; o (d)una combinación de (a), (b) y/o (c).
Description
Granzima B dependiente de péptidos Hsp70/Hsp70
como inductora de apóptosis en células tumorales.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para inducir o aumentar la expresión de la granzima B
en células citotóxicas naturales o natural killer (NK). Además, la
presente invención se refiere a la granzima B para su utilización
en el tratamiento de tumores, donde las células tumorales expresan
Hsp 70 en su superficie celular.
Se ha encontrado que los niveles citoplásmicos
elevados de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70) protegen las
células tumorales contra la muerte celular programada (Nylandsted
et. al. (2000) Ann. N.Y. Acad. Sci. 926, 122). La Hsp70 es
la forma inducible de estrés más importante de la familia de
proteínas de choque térmico (HSP), que se encuentra principalmente
localizada en el cytosol. Los resultados acumulados durante los
últimos años han demostrado que las HSPs unidas a la membrana
plasmática y localizada extracelular son altamente inmunogénicas y
exponen a las células a un ataque inmune (Schild et. al.
(1999) Current Opinion in Immunology 11, 109). Tras la captación
mediada por receptor (Amold-Schild et. al.
(1999) J. Immunol. 162, 3757) y de nuevo la presentación por
células presentadoras de antígeno (APC), los péptidos acompañantes
de HSP provocan la destrucción de las células, respuesta de las
células CD8^{+} T (Suto et. al. (1995) Science 269, 1585).
Se han identificado varios receptores, que incluyen CD91 y
receptores tipo Toll 2 y 4 (TLR2/4), que median la interacción de
complejos peptídicos HSP90 (gp96), HSP70 (Hsp70, Hsc70) y HSP6 0 con
APCs (Basu et. al. (2001) Immunity 14, 303; Binder et.
al. (2000) Nat. Immunol. 1, 151; Sondermann et. al.
(2000) Biol. Chem. 3 81, 1165.; Ohashi et. al. (2000) J.
Immunol. 164, 558). Se ha descrito "el efecto acompañante"
independiente de péptido por los miembros del grupo HSP70. La unión
de HSP70 exógeno a monocitos vía TLR2/4 en un patrón dependiente de
CD14 induce la agrupación de receptores y la secreción de
citoquinas proinflamatorias vía transducción de la señal
MyD88/IRAK/NF\kappa-B (Pfeiffer et. al.
(2001) Eur. J. Immunol. 31, 3153; Asea et. al. (2000) Nature
Medicine, 6, 435; Asea et. al. (2000) Cell Stress &
Chaperones, 5, 425; Asea et. al. (2002) J Biol Chem. 277
(17), 15028).
Se ha encontrado que las células (NK) natural
killer interactúan específicamente con un epítope localizado
C-terminal de Hsp70 (Botzler et. al. (1998)
Cell Stress & Chaperones, 3, 6), que se presenta en la membrana
celular de las células tumorales (Multhoff et. al. (1995)
Int. J. Cancer, 61, 272; Multhoff et. al. (1997) J. Immunol.
158, 4341). La cantidad de Hsp70 unida a la membrana en las células
tumorales se correlaciona positivamente con la intensidad de lisis
mediada por las células NK: Se ha encontrado que el estrés físico
(calor) así como químico (fármacos citostáticos) aumentan la
expresión en la superficie celular de Hsp70 en células tumorales y,
por lo tanto, representan las mejores dianas para las células NK
(Multhoff (1997) Int. J. Hyperthermia 13, 39; Botzler et.
al. (1999) Exp. Hematol. 27, 470; Rabinovich et. al. (2
000) J. Immunol. 165, 23 90; Feng et. al. (2001) Blood 97,
3505). La incubación de células NK purificadas con proteína Hsp70
recombinante aumenta su actividad citolítica contra las células
tumorales positivas a la membrana de Hsp70 (Multhoff et. al.
(1999) Exp. Hematology 27, 1627). Se consigue el mismo efecto
mediante un péptido de 14 aminoácidos, terminado TKD
(TKDNNLLGRFELSG, aa450-463), derivado de la
C-terminal del dominio Hsp70. Esta región
corresponde al dominio Hsp70 expuesta a un medio extracelular de
células tumorales viables (Multhoff et. al. (2001) Cell
Stress & Chaperones 6, 337). Concomitante con un aumento de la
actividad citolítica, tras el contacto con la Hsp70 o con
Hsp70-péptido TDK, la expresión de la superficie
celular de la forma activa del receptor de lectina CD94
tipo-C se ha mejorado en las células NK. Los
análisis de bloqueo que utilizan un anticuerpo inhibidor específico
de CD94 revelaron una participación de CD94 en la interacción de las
células NK con las células tumorales positivas a la membrana de
Hsp70 (Multhoff et. al. (1999) Exp. Hematología 27,1627).
Estos datos indican que, aparte de péptidos líder que presentan
HLA-E de alelos HLA clásicos (Lanier et. al.
(1998) Inmunidad 8.693; Braud et. al. (1998) Naturaleza 391,
795), el terminal localizado Hsp70-secuencia de
péptido TKD podría considerarse un ligando potencial para un aún
complejo receptor CD94 activador indefinido. A pesar de que las
observaciones anteriores indican que las funciones de
Hsp70-péptido como un estructura de reconocimiento
diana selectiva al tumor para las células NK positivas CD94
(Multhoff et. Al. (1997) J. Immunol. 158,4341), el mecanismo
por el cual las células NK lisan las células diana tumorales
positivas Hsp70 queda todavía por dilucidar. Además, es preferible
estimular específicamente la actividad lítica de las células NK
hacia células tumorales de la manera más específica que hasta ahora
sea posible. Todos estos objetivos científicos sirven como medios
para encontrar un enfoque más eficaz y más específico en el
tratamiento de enfermedades y, en particular, en el tratamiento de
tumores.
Se han hecho informes de la expresión en
superficie de proteínas de choque térmico que incluyen la Hsp70
para encontrar también después infección vírica o en respuesta al
estrés. En particular, se encontró Hsp70 en membrana en células
limfoides infectadas por HIV (Di Cesare et al.(1992),
Immunology 76, 341) y en líneas celulares de conejos infectados por
HTLV I (Chouchane et al. (1994), J. Infect. Dis. 169, 253).
De forma parecida, es concebible que las células infectadas por
bacterias o afectadas por inflamación expresen Hsp70 en sus
superficies celulares. En consecuencia, la actividad lítica de las
células NK o granzima B puede estar dirigida hacia células
infectadas por virus o bacterias así como hacia células afectadas
por inflamación.
El estado de la técnica también incluye las
siguientes divulgaciones: WO 99/49881: Efectos antitumorales de
células NK en células tumorales que expresan en la superficie
celular Hsp70 (ejemplos 2 y 3), WO 01/80880: se hace referencia a
las páginas 7 y 8 para la producción de granzina B por células NK
activadas.
Por tanto, el problema técnico que plantea la
presente invención es proporcionar medios y procedimientos para el
tratamiento específico de enfermedades y, en particular, de tumores,
infecciones víricas y bacterianas y enfermedades inflamatorias.
La solución a dicho problema técnico se consigue
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento ex vivo de inducción o mejora de
la expresión de la granzima B en células (NK) natural killer que
comprende poner en contacto células NK con
- (a)
- proteína Hsp70;
- (b)
- un fragmento (C-terminal) de (a) que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG;
- (c)
- un (poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; o
- (d)
- una combinación de (a), (b) y/o (c).
La granzima B es una proteasa serina bien
conocida en el estado de la técnica y se ha descrito que está
implicada en el proceso de la apóptosis/muerte celular programada
(Berke (1995) Cell, 81(1), 9-12; Froelich
et. al. (1998) Immunology Today, 19(1),
30-26); Metkar S et al. Apoptosis mediada por
gránulos de células citotóxicas: las perforinas liberan complejos
de serglicina de granzima B en la células diana sin información de
poro de la membrana plasmática, Inmunidad 16 (2002),
417-428.
Esta encima promueve la fragmentación del ADN
por desdoblamiento de procaspasas en sus formas activadas y, por lo
tanto, induce la muerte celular programada a través de la ruta
inhibida Bcl-2. La granzima B empieza a inducir el
proceso de apoptosis después de la presencia en el cytosol de una
célula diana.
El término "células NK" ("células natural
killer") comprende linfocitos granulares grandes que expresan
CD45 en la superficie y que muestran actividad para matar sin
estimulación previa. Están especialmente caracterizadas por el
hecho de que no expresan CD3 o receptor de células T
\alpha/\beta- o \gamma/\delta y pueden estimularse por la
interleucina-2.
Las células NK estimuladas por el procedimiento
de la presente invención además se caracterizan por las siguientes
propiedades:
- -
- tienen adherencia plástica transitoria después de la adición de IL-2 en cantidades de 10 a 10.000 unidades, por ejemplo de 100 I U, donde IL-2 puede adquirirse de la firma Chiron;
- -
- la adherencia tiene efecto 3-18 horas después de la adición de IL-2 en las recién aisladas PBL (linfocitos de sangre periférica empobrecidos por monocitos);
- -
- las células NK muestran un expresión CD16dim (valor medio de la fluorescencia débil);
- -
- las células NK expresan CD56 y CD57 como marcador NK típico;
- -
- las células NK expresan CD94 (receptor celular asesino de lecitina tipo C);
- -
- las células NK secretan después de la activación con Hsp70 y citocinas IFNgamma;
- -
- las células NK puede estimularse por la adición de Hsp70, Fragmento de Hsp70 o Hsp70-péptido (proteína purificada) (crecimiento y actividad citotóxica);
- -
- no son dependientes del tipo MHC del paciente.
De acuerdo con la invención, también pueden
utilizarse otras poblaciones de células NK. Se conocen en el estado
de la técnica otros procedimientos para la obtención de dichas
poblaciones e incluyen el aislamiento utilizando bolas magnéticas y
clasificación de células. En este caso, sin embargo, es un requisito
previo que puedan activarse por Hsp70 o por los fragmentos citados
más arriba o (poli)péptidos. De acuerdo con la invención,
pueden utilizarse células NK aisladas. Además, es posible utilizar
mezclas de células tales como células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) que contiene células NK.
En una realización especialmente preferida del
procedimiento ex vivo de la invención, se utilizan células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) o una fracción de esta que
contiene las células NK como suspensiones celulares
fisiológicas.
Utilizando procedimientos adecuados, las células
NK pueden obtenerse de los pacientes a tratar o de un donante sano
por extracción de sangre. Preferiblemente, se utilizan células
mononucleares de cultivo o concentrados de linfocitos obtenidos por
otros medios que contienen células NK.
Las células mononucleares de cultivo o
concentrados de linfocitos se toman de los pacientes a través de
las venas y, por ejemplo, se añade heparina para prevenir la
coagulación de las células. Las células mononucleares de cultivo a
las que se ha añadido la heparina se recogen en un recipiente
estéril (generalmente, bolsas de plástico estéril) y después se
centrifuga utilizando centrifugación de densidad Ficoll que da como
resultado una acumulación de células sanguíneas (=PBMC, células
mononucleares sanguíneas periféricas, por ejemplo, linfocitos,
monocitos, granulocitos y así sucesivamente). El concentrado de
linfocitos permanece estéril en bolsas de cultivo estéril.
Las células mononucleares de cultivo que
contienen células mononucleares sanguíneas periféricas se utilizan
en forma de una suspensión celular fisiológica, preferiblemente con
adición de heparina. La heparina previene la agregación de las
células.
En WO 99 49 881 se han descrito procedimientos
para la estimulación de las células NK por incubación con proteínas
Hsp70 de fragmentos C-terminal de éstas.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la expresión de la granzima
B está inducida o mejorada en las células NK por el contacto de
dichas células con la proteína Hsp70, un fragmento de la misma que
comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG, un
(poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos
TKDNNLLGRFELSG, o una combinación de dichas
proteínas/(poli)péptidos, preferiblemente, en combinación
con IL-2. Preferiblemente, el fragmento referenciado
arriba y en relación con otras realizaciones (preferidas) de la
invención es un fragmento (C-terminal) carboxi
terminal de Hsp70.
De acuerdo con la invención, el término
"proteína Hsp70" se refiere a las proteínas de choque térmico,
las células eucariotas (HSP). La expresión de dichas HSPs puede
inducirse por calor pero también por una serie de otros reactivos
tales como, por ejemplo, análogos de aminoácidos, metales pesados,
ionóforos o cytotoxinas, en donde el factor de aumento de la
expresión por medio de la inducción es de por lo menos 5 en
comparación con la expresión constitutiva. La secuencia completa de
aminoácidos se ha publicado en Milner et al. (1990)
Inmunogenética 32 (4), 242-251.
De acuerdo con la invención, el término
"fragmento" de la proteína Hsp70 también comprende
(poli)péptidos que muestran una secuencia de aminoácidos del
margen de aminoácidos 384-641 de la Hsp70 humana.
Todos los fragmentos C-terminal
(carboxi-terminal) por lo menos comprende la
secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG. Los procedimientos para el
aislamiento de los correspondientes (poli)péptidos son
conocidos en el estado de la técnica y especialmente descritos en
el ejemplo 1 que sigue más adelante. Por tanto, el experto en la
materia también es capaz de producir fragmentos a partir del
fragmento mencionado más arriba 384-641 por técnicas
recombinantes sin más preámbulos (se describen procedimientos
estándares para ello en Sambrook et al. "La clonación
molecular, un manual de laboratorio", 2^{a} Edición 1989, CSH
Press, Cold Spring Harbor, NY) y ponerlos a prueba para las
propiedades de activación deseadas.
El término (poli)péptido se refiere a los
péptidos así como polipéptidos (proteínas). De acuerdo con la
práctica habitual, los péptidos comprenden hasta 30 aminoácidos,
mientras que los polipéptidos consisten en más de 30 aminoácidos.
Esta práctica también se emplea en la invención. Además, de acuerdo
con la invención, los aminoácidos a través de toda la descripción
se referencían por un código de letras.
En una alternativa, los (poli)péptidos
que comprenden la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG son
(poli)péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos
enumerada y, opcionalmente, comprenden otros aminoácidos
N-terminalmente y C-terminalmente
derivados de la Hsp70, unidos a las secuencias de aminoácidos
seleccionadas que se forman de forma aleatoria o natural. Así, el
procedimiento ex vivo según la presente invención se refiere
a la estimulación de células NK mediante proteínas de fusión que
comprenden la secuencia del péptido 14-mer
Hsp70.
Una realización preferida de la invención se
refiere a un procedimiento en el que la proteína Hsp70, el
fragmento (C-terminal) de la misma, los
(poli)péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos
TKDNNLLGRFELSG, o la combinación de los mismos se encuentra en un
estado no complejado.
Las HSPs son conocidas en el estado de la
técnica por formar complejos con un gran número de péptidos de
diferentes sustratos (Tamura et al.(1997) Ciencia,
278,117-223). Sin embargo, sorprendentemente se ha
encontrado que las proteínas de choque térmico, los fragmentos
(C-terminal) de las mismas o derivados procedentes
de los mismos (véase más arriba) inducen actividades inmunológicas
por medio de la activación de las células NK, incluso si no forman
complejos con los péptidos.
Así, según los procedimientos descritos en
WO9949881, el experto en la materia es capaz de estimular las
células NK mediante la proteína Hsp70 o (poli)péptido que
comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG en un estado
no complejado.
Un procedimiento previsto incluiría la inyección
de Hsp70, fragmento de Hsp70 o péptido de Hsp70 en pacientes para
la estimulación in vivo de células NK y así producir granzima
B.
En realizaciones de la invención, los
procedimientos se llevan a cabo ex vivo o in
vitro.
Este procedimiento comprende el aislamiento de
las células NK o una población de células que comprende las células
NK como se ha descrito aquí más arriba, en el que se mezcla una
suspensión celular fisiológica que contiene células NK con la
proteína Hsp70, el fragmento C-terminal de la misma
o un derivado del mismo o una proteína/(poli)péptido que
comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG y se incuban
para inducir o mejorar la expresión de granzima B en células
NK.
La incubación puede llevarse a cabo, por
ejemplo, en una incubadora a la temperatura fisiológica (37ºC) en
un agitador (agitación suave), el 5% de CO_{2} +> 80% atmósfera
humificada también en condiciones fisiológicas de retención que
permiten la supervivencia de las células NK.
El procedimiento previsto incluiría una
reinfusión de preferiblemente autoplastia y/o células NK alogénicas
con expresión de granzima B inducida o mejorada en un mamífero.
Una vez que las células NK se han sometido a un
tratamiento in vitro o ex vivo para inducir o mejorar
la expresión de granzima B, se vuelven a infundir en un paciente. La
re-infusión puede realizarse utilizando el equipo
médico estándar. Por ejemplo, la reinfusión de las células NK o PBMC
que contiene células NK puede ser I.v., i.p., s.c. o
intratumoral.
El mamífero puede ser un humano.
En otra realización preferida del procedimiento
ex vivo de la invención, dicho contacto de las células NK
con la proteína Hsp70, el fragmento (C-terminal) de
la misma o un derivado del mismo o una proteína/(poli)péptido
que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG se realiza
durante por lo menos 12 horas. De acuerdo con otra realización
preferida, dicho contacto se realiza durante por lo menos 4
días.
La presente invención se refiere, en otra
realización preferida a un procedimiento ex vivo en el que
dichas células NK, antes de ponerse en contacto con, se obtienen a
partir de células de médula ósea mediante incubación de dichas
células de médula ósea con interleucina-15
(IL-15) y el factor de células madre (SCF) a
concentraciones de 1 ng/ml - 1000 ng/ml por citoquina durante por lo
menos 7 días y hasta 4 meses.
Esta realización preferida de la invención
permite el aislamiento natural de células NK después de la
estimulación de células de médula ósea con las llamadas citoquinas.
Las células NK obtenidas muestran marcadores típicos de las células
NK referenciados aquí más arriba. La concentración preferida de
citocinas está en el intervalo de 100 ng/ml por citocina. Después
de la estimulación con citoquinas y la diferenciación en las
células NK que muestran CD94 y CD56 en su superficie, el contacto
con estas células puede continuar con la proteína Hsp70 o el
fragmento mencionado más arriba de (poli)péptidos o la
combinación de los anteriores mencionados más arriba en la presente
invención.
De acuerdo con la invención, cuando sea
aplicable, las preparaciones farmacéuticas se definen como
sustancias y preparaciones de sustancias que, cuando se utilizan en
el cuerpo humano, son para curar, aliviar, prevenir o reconocer
enfermedades, dolencias, defectos físicos o malestares
patológicos.
Opcionalmente, dichas composiciones
farmacéuticas comprenden además un portador, diluyente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
El experto en la materia conoce ejemplos de
portadores aceptables farmacéuticamente adecuados (tolerables) que
comprenden, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato,
agua, emulsiones, tales como emulsiones oleaginosas/acuosas,
soluciones estériles, y así sucesivamente. Las composiciones
farmacéuticas (preparaciones farmacéuticas) que contiene dichos
portadores pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos
habituales. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a
los individuos respectivos en una dosis apropiada. Las formas de
administración son, por ejemplo, por vía intravenosa (i.v.),
intraperitoneal (i.p.), intratumoral, subcutánea (s.c.),
intramuscular (i.m.), tópica o intradérmica. La dosis depende de
muchos factores, por ejemplo, del tamaño del paciente, sexo, peso,
edad, así como el tipo de la composición especial administrada, la
forma de administración y así sucesivamente. Las composiciones
pueden administrarse de forma local o sistémica. En general, la
administración se realiza por vía parenteral.
Las preparaciones para la administración
parenteral incluyen suspensiones, emulsiones y soluciones estériles
acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son el
propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como el aceite
de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como el oleato de
etilo. Los portadores acuosos incluyen el agua, soluciones acuosas,
emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina al 0,9% de
NaCl, tampón fosfato, X-20 in vivo, y medios
tamponados. Los vehículos parenteral incluyen una solución de
cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio o
lactato de Ringer. Los vehículos de vía intravenosa incluyen
reconstituyentes de líquidos y nutrientes, reconstituyentes de
electrolitos (como los basados en la glucosa de Ringer) y
similares. Los conservantes y otros aditivos también pueden estar
presentes como, por ejemplo, los antimicrobianos, antioxidantes,
agentes quelantes y los gases inertes, etc. Por otra parte, la
composición farmacéutica de la invención puede comprender otros
agentes como las interleucinas o los interferones en función del
uso previsto de la composición farmacéutica.
La invención también se refiere a la utilización
de granzima B en el tratamiento in vivo de tumores
independiente de la perforina. Más preferiblemente, dichos tumores
se seleccionan entre el grupo que consiste en el estómago,
gástrico, colorrectal, páncreas, mama, pulmón, ginecológico, cáncer
de cabeza y cuello, dermatológico (por ejemplo, el melanoma),
tumores neuronales, leucemia y linfoma.
Los tumores a tratar expresan Hsp70 en la
superficie celular. En el estado de la técnica son conocidos los
procedimiento para la detección de la expresión en superficie de
Hsp70 y comprenden métodos histológicos, citometría de flujo,
etc.
En contraposición con los indicios del estado de
la técnica, de acuerdo con la presente invención podría demostrarse
que la granzima B es eficaz en el tratamiento de tumores
independiente de la ruta perforina. Esto tiene importantes
aplicaciones en la estrategia de tratamiento de tumores ya que la
captación del compuesto farmacéuticamente activo ahora puede
conducirse independiente de la ruta perforina. La granzima B puede
administrarse por vía intratumoral, i.v., subcutánea.
En una realización preferida de la presente
invención, la granzima B se utiliza como el único componente
farmacéuticamente activo en dicha composición farmacéutica.
Una vez más, esta realización preferida de la
invención tiene importantes implicaciones en el diseño de los
componentes necesarios de la composición farmacéutica a utilizar en
el tratamiento de cánceres. Es importante destacar que no existe la
necesidad de incluir otros principios farmacéuticos activos en la
composición farmacéutica con el fin de tratar de forma eficaz los
tumores y/o reducir el tamaño de los tumores o de tratar
infecciones virales o bacterianas o enfermedades inflamatorias.
Se prevee un procedimiento para el tratamiento
de tumores, infecciones víricas o bacterianas o enfermedades
inflamatorias que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto células NK con células tumorales que tienen Hsp70 en su superficie o células afectadas por dicha infección o inflamación y que tienen Hsp70 en su superficie;
- (b)
- permitir que la granzima B entre en dichas células a través de los canales iónicos formados por dicha Hsp70 en la superficie de las células tumorales; y
- (c)
- permitir que dichas células lleguen a la apoptosis como resultado de la actividad enzimática de la granzima B.
Como alternativa, la granzima puede aplicarse
directamente en lugar de expresarse por estimulación de las células
NK. En consecuencia, la presente invención se refiere a un
procedimiento para el tratamiento de tumores, infecciones virales o
bacterianas o enfermedades inflamatorias que comprende las etapas
de:
- (a)
- poner en contacto células tumorales que tienen Hsp70 en su superficie o células afectadas por dicha infección o inflamación y que tienen Hsp70 en su superficie con la granzima B;
- (b)
- permitir que la granzima B entre en dichas células a través de los canales iónicos formados por dicha Hsp70 en la superficie de las células tumorales; y
- (c)
- permitir que dichas células lleguen a la apoptosis como resultado de la actividad enzimática de la granzima B.
A partir del estudio de las enseñanzas incluidas
más arriba en la invención, el experto en la materia puede deducir
los intervalos de células tumorales o células afectadas por dicha
infección o inflamación y las concentraciones de granzima B, así
como los intervalos de tiempo de contacto de la granzima B y las
células tumorales o células afectadas por dicha infección o
inflamación.
En una realización preferida del procedimiento
de la presente invención, la granzima B se administra en una
concentración final de 1 \mug/ml a 500 \mug/ml.
En otra realización preferida del procedimiento
de la invención, la granzima B se administra a una concentración
final de 1 ng/ml a 10 ng/ml. Es todavía más preferible que la
granzima B se administre a una concentración final de
aproximadamente 6 ng/ml. En este sentido, es importante destacar que
son más preferibles las formas de administración que la
introducción de estas concentraciones de granzima B directamente en
las células tumorales o células afectadas por dicha infección o
inflamación.
En otra realización preferida de la presente
invención, la granzima B se introduce/empaqueta en un liposoma.
Es bien conocida en el estado de la técnica la
encapsulación de compuestos farmacéuticos activos en liposomas.
Las figuras muestran:
La figura 1 muestra la identificación de
granzima B por interacción por contacto de la proteína Hsp70 y el
péptido TKD de Hsp70.
- Figura 1A: La proteína Hsp70 (Hsp70), albúmina sérica bovina (BSA) y el péptido (TKD) de Hsp70 se incubaron en columnas con células lisadas de la línea celular YT con NK o la línea celular K562 sin NK. Las proteínas unidas se eluyeron de las columnas en 5 fracciones (F1-F5), separadas en SDS-PAGE (electroforesis del gel de poliacrilamida del sulfato dodecil de sodio). Después de la tinción de plata, los eluidos de células YT procedentes de columnas Hsp70 y TKD, revelaron una banda de proteína dominante de 32 kDa en las fracciones dos (F2) y tres (F3). La banda de proteína dominante de 32 kDa se detectó en eluidos YT derivados de las columnas de BSA y en eluidos K562 derivados de las columnas de TKD. La posición de la banda de 32 kDa se indica con una flecha.
- Figura 1B: Los péptidos trípticos de la banda de 32 kDa tintados de azul de Coomassie de la fracción 3 (F3), derivados de la columna de TKD, corresponden a la granzima B humana. La probabilidad de identificación fue del 100% y el puntaje-Z estimado fue de 1,89 correspondiente a > 95% de confianza.
- Figura 1C: Análisis correspondiente de Western-Blot de YT y eluidos de células K562 (F3) después de la incubación en columnas con la proteína Hsp70 (Hsp70) y péptido de Hsp70 (TKD). La mancha fue autoradiografiada y se visualizó la localización de la granzima B por inmunotinción con el anticuerpo monoclonal 2C5 (AcM 2C5) específico para granzima B. Los eluidos de células YT (izquierda), pero no de células K562 (derecha), revelaron una banda de proteína de la granzima B de 32 kDa.
- Figura 1D: Citometría de flujo intracelular de células YT (izquierda) y células K562 (derecha) permeabilizadas utilizando el anticuerpo monoclonal específico HC2-PE de granzima B conjugada con ficoeritrina (PE) (línea continua), en comparación con un anticuerpo de control negativo emparejado a un isotipo (línea discontinua). Sólo las células YT, pero no las células K562, contenían granzima B citoplásmica.
La figura 2 muestra la unión específica de
superficie celular y la acceptación de granzima B (GRB) por células
tumorales positivas a la membrana de Hsp70.
- Figura 2A: Unión comparativa de granzima B (2 \mug/ml) a la superficie celular de células tumorales CX+/Cx- y Colo+/Colo- a 4ºC, y la absorción en el citosol tras un cambio de temperatura 37ºC durante 30 minutos, utilizando el anticuerpo monoclonal específico HC2-PEla de granzima B conjugada a ficoeritrina (PE). La primera fila, de microscopía de luz, segunda fila, inmunofluorescencia de células sin granzima B (control); tercera fila, inmunofluorescencia de las células después de la adición de granzima B, tal como se especifica (grB). Se ilustra la microscopía de fluorescencia representativa de tres resultados idénticos; aumento 40x.
- Figura 2B: Citometría de flujo intracelular de células tumorales Colo+/Colo- (n = 4) y CX+/CX- (n=2) permeabilizadas utilizando el anticuerpo monoclonal específico HC2-PE para granzima B antes (línea discontinua) y después (línea continua) de la incubación de las células tumorales con 1 \mug/ml, 2 \mug/ml, 4 \mug/ml de granzima B a 37ºC durante 30 min. Sólo las células CX+ y Colo+, pero no CX- y Colo- mostraron un cambio de dosis-dependiente del pico de granzima B a la derecha, indicando la captación de granzima B expresada de forma extracelular.
La figura 3 muestra un experimento en el que la
apoptosis es inducida selectivamente por granzima aislada B (grB)
en células tumorales positivas a la membrana de Hsp70.
- Figura 3A: Porcentaje de células CX+/Colo+ (izquierda) y CX-/Colo- (derecha) teñidas con anexina V-FITC positivas y yoduro de propidio (PI) negativas, ya sea sin tratar (barras en negro) o después de la incubación, ya sea con camptotecina (4 \mug/ml; barras de color gris claro) o con granzima B (6 ng/ml; barras gris oscuro) durante 4 h, 12 h y 24 h. Los datos representan la media de desviación estándar de tres a cuatro experimentos independientes; la marca* se refiere a valores significativamente diferentes del control (p<0,05).
- Figura 3B: Análisis correspondiente de citometría de flujo de células CX+ y CX- teñidas positivamente con anexina V-FITC y negativamente con yoduro de propidio (PI), ya sea sin tratar (control), o después de la incubación con granzima B (grB) durante 24 h. El porcentaje de células teñidas positivamente con anexina V-FITC se da en porcentaje en la esquina inferior derecha de cada gráfica.
- Figura 3C: Análisis por microscopía de luz de agrupaciones (clusters) de células tumorales CX+/CX- y Colo+/ Colo- de crecimiento adherentes, ya sea sin tratar (control) o después del tratamiento con camptotecina (CAM, 4 \mug/ml) o granzima B (grB, 10 ng/ml), durante 24 h. La barra en la escala indica 100 \mum.
- Figura 3D: Al mismo tiempo, se tiñeron las células CX+/CX- y Colo+/Colo- ya bien sea sin tratar (control), o bien tratadas con camptotecina (CAM) o con granzima B (grB) (24 h) con DAPI. Se observó una fragmentación del ADN nuclear considerable en todas las sublíneas tumorales seguidas de la incubación con camptotecina (panel central). Después de la incubación con granzima B sólo las células CX+ y Colo+ mostraron fragmentación del ADN nuclear (panel inferior, izquierda). No se observaron signos de apoptosis en las células CX- y Colo- seguidas de la incubación con granzima B (panel inferior, derecha). La barra en la escala indica 10 \mum.
La Figura 4 muestra un experimento en el que se
demuestra la muerte de las células tumorales positivas a la
membrana de Hsp70. La apoptosis mediada por células NK positivas de
granzima B está bloqueada por los AcM específicos de Hsp70.
- Figura 4A: Microscopía de luz (ampliación 20x) de las colonias de células CX- negativas a la membrana de Hsp70 y CX+ positivas a la membrana de Hsp70, o bien sin tratar (control) o después de una incubación de 12 h con células NK (+NK) estimuladas por Hsp70-péptido TKD. La relación efector a célula diana (E:D) fue de 20:1. La barra de escala representa 200 \mum, el compartimento en la esquina inferior derecha de cada gráfica muestra una colonia de células representativas, 2,5x aumentos.
- Figura 4B: Se cuantificó la muerte celular de células tumorales diana CX+/Colo+ (izquierda) y CX-/Colo- (Panel derecho) mediante células NK nativas (NK d0) y estimuladas con Hsp70-péptido TKD (NK d3) en ensayos de liberación ^{51}Cr. Los niveles de granzima B intracelular en células NK nativas (NK d0) respecto a las células NK estimuladas con TKD (NK d3) fueron 1,4 veces mayores; En concordancia, la lisis de células CX+ fue 1,5 veces mayor, y la de las células Colo+ de 2,0 veces a diferentes relaciones de efector diana. La lisis de las células tumorales CX- y Colo- no se vio afectada. Además, el aumento de la actividad citolítica de las células NK estimuladas por TKD (NK d3 AcM Hsp70) contra las células CX+ y Colo+ fue completamente inhibida por la caída de los anticuerpos específicos de Hsp70 hasta el nivel de la lisis de las células tumorales negativas a la membrana de Hsp70 (inhibición de 1,7 veces, línea de puntos). La citotoxicidad se determinó a las releciones E:D que van desde 2:1 a 20:1; la liberación espontánea de cada célula diana fue inferior al 10%. Los datos representan la media de la desviación estándar de tres experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Estos ejemplos no deben interpretarse de manera limitativa: los
ejemplos se incluyen sólo a título ilustrativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cultivó la línea celular YT con NK en
intervalos de densidades de células que van de
0,1-0,5 x 10^{6} células/ml en medio
RPMI-1640 (Life Technologies, Eggenstein, Alemania)
que contenían un 10% suero fetal bovino inactivado por calor (FCS,
Life Technologies, Eggenstein, Alemania) complementado con 6 mM de
L-glutamina y antibióticos (100 UI/ml de penicilina
y 100 \mug/ml estreptomicina, Life Technologies). Las células NK
con adherencia plástica transitoria se derivaron de células
mononucleares de cultivo de voluntarios humanos sanos. Las células
sanguíneas mononucleares periféricas separadas por Ficoll (PBMC)
fueron cultivadas en rIL-2 (100 UI/ml, Quirón,
Frankfur, Alemania) durante 12 h. Después de la selección de
adherencia de los linfocitos de sangre periférica empobrecidos de
monocitos de acuerdo con un método modificado de Vujanovic
(Vujanovic et. al. (1993) de la célula. Immunol. 151,133),
las células fueron cultivadas en un medio RPMI-1640
complementado con Hsp70-péptido TKD (2 \mug/ml)
durante 3 días.
Las sublíneas de tumores humanos CX+/CX- y
Colo+/Colo- se obtuvieron por clasificación de células de las
líneas celulares de carcinoma de colon CX-2 (Hsp70
positivo: 60%) y páncreas Colo357 (Hsp70 positivo: 70%) utilizando
el anticuerpo monoclonal específico Hsp70 C92F3B1, de acuerdo con un
protocolo previamente descrito (Multhoff et al. (1997) J.
Immunol. 158,4341). En consecuencia, CX+ y CX- son autólogas, al
igual que Colo+ y Colo-. Las sublíneas de carcinoma CX+ (Hsp70
positivo: 80%) y Colo+ (Hsp70 positivo: 85%) de expresión altamente
estable de Hsp70 difieren significativamente de las células de
carcinoma de CX-(Hsp70 positivo: 25%) y Colo- (Hsp70 positivo: 35%)
de expresión poco estable de Hsp70.
Se cultivaron sublíneas de carcinoma CX+/Colo+ y
CX-/Colo-, que difieren en cuanto a su expresión en la membrana de
la Hsp70, pero muestran idéntica expresión MHC de clase I, y la
línea de células NK no leucémicas K562 en un medio de
RPMI-1640 complementado con 5% de FCS, 6 mM de
L-glutamina y antibióticos. Se utilizaron para
granzima B las células tumorales de crecimiento exponencial (día 1
tras el paso de células), el tratamiento de la camptotecina y como
objetivos en ensayos de citotoxicidad.
Todas las líneas celulares se examinaron
periódicamente para detectar contaminación por micoplasma mediante
un inmunoensayo encimático para detectar M. arginini, M.
hyorhinis, A. laidlawii y M. orale (Roche, Mannheim,
Alemania). Sólo se utilizaron las líneas de células libres de
micoplasma.
Se incubó albúmina sérica bovina (BSA, 1 mg/ml,
Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), 1 mg/ml
liofilizado, proteína Hsp70 recombinante humana (Stressgen,
Columbia Británica, Canadá) o 2 mg/ml Hsp70-péptido
TKD (TKDNNLLGRFELSG, aa_{450-463}, Bachem,
Bubendorf, Suiza) con perlas de AminoLink agarosa equilibradas
(Pierce, Rockford, EE.UU.) en 2 ml durante 6 horas, junto con el
reductor NaCNBH_{3}. La capacidad de fijación de la BSA, la
proteína Hsp70 y Hsp70-péptido TKD fue superior al
95%. Tras la eliminación del material no acoplado mediante el lavado
con tampón Tris y enfriado de los grupos
no-reactivos, las células de lisis se aplicaron a
las columnas de BSA, proteína Hsp70 y Hsp70-péptido
TKD conjugado durante 1 h.
Tras el lavado con 10 volúmenes de columna de 20
mM de tampón Tris, se eluyeron las proteínas unidas con cloruro
sódico 3M en 2 0 mM de tampón Tris, en 5 fracciones. Cada fracción
se sometió a un 10% SDS-PAGE y se secó en membranas
de PVDF.
La purificación de la membrana se realizó
mediante homogeneización Dounce de 50 x 10^{6} células en
hipotónica, tampón libre de EDTA que contenía inhibidor de proteasa
PMSF seguido de la centrifugación secuencial a 1.000 g durante 5
min y a 100.000 g, a 4ºC, durante 60 min. El pellet que contenía las
membranas se resuspendió en 2 ml de NaCl 0,3M en 50 mM de tampón
Tris, 0,5% NP40, pH 7,6.
Tras el bloqueo en leche desnatada (0,1%) y la
incubación con el anticuerpo monoclonal dirigido contra la granzima
B 2C5 (IgG2a, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania), a 4ºC,
durante 5 h, los Western blots se lavaron y se incubaron con un
anti-IgG HRP Ab secundario (Dianova, Hamburgo,
Alemania), durante 1 h. Las proteínas se detectaron utilizando el
equipo ECL (Amersham Bioscience) durante 5 segundos.
La banda de proteína precipitada de 32 kDa de
Hsp70 y Hsp70-péptido TKD se cortó de los geles
teñidos con Azul de Coomassie, se digirió con tripsina y
desnaturalizó utilizando la fase reversa
(ZIP-Tip) (Millipore, Eschborn, Alemania).
Las muestras se incorporaron en ácido
4-hidroxi-\alpha-ciano-cinámico
y se determinaron las masas de los péptidos con un Perseptive
Voyager DePro MALDI-TOF (Matriz Asistida por láser
de Desorción/Ionización - Detector de iones) espectrómetro de masas
en el modo reflexivo. Se elaboró una lista de picos con el software
de m/z (Proteometrics) y se utilizó para la selección de los picos;
la huella peptídica de masa resultante se utilizó para buscar en la
base de datos de proteína NCBI no redundantes utilizando el equipo
de búsqueda en profundidad (Proteometrics). La granzima B se
identificó con el 100% de probabilidad y confianza > 95%.
Las células (0,5 x 10^{6}) se fijaron en
paraformaldehído (1% PFA en PBS) durante 10 min, y se
permeabilizaron en PBS con BSA (0,5%), NaN_{3} (0,1%) y saponinos
(0,1%). Luego, se incubaron las células permeabilizadas, ya sea con
el anticuerpo monoclonal conjugado de la granzima
B-ficoeritrina HC2-PE (IgG1; Holzes
Diagnostika, Colonia, Alemania), con un anticuerpo de control IgG1
en concordancia con un isotipo, a 4ºC durante 1 h, en la oscuridad.
Las células una vez lavadas se analizaron en un instrumento
FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania).
Las soluciones madre de camptotecina (4 mg/ml,
Sigma, Munich, Alemania) se diluyeron en DMSO y se almacenaron a
4ºC en la oscuridad. Se prepararon soluciones de granzima B
directamente (6 ng/ml, Hölzel, Colonia, Alemania) antes de su uso.
Se incubaron las células en crecimiento exponencial
(0,5-1,5 x 10^{6}/ml), ya sea con camptotecina a
una concentración final de 4 \mug/ml o con granzima B activa
purificada enzimáticamente (10 ng/ml, 1 \mug/ml, 2 \mug/ml; 4
\mug/ml) (Shi et. al. (2 000) Métodos de Enzimología 322,
125) durante 10 min y 30 min, ya sea a 4ºC o a 37ºC. Después de
lavar en un medio RPMI-1640 se determinó la fijación
y captación en las células tumorales permeabilizadas y no
permeabilizadas mediante citometría de flujo y microscopía de
fluorescencia en un microscopio Axioscop 25 (Zeiss, Jena, Alemania)
equipado con un objetivo de 40x y filtros estándares. Las imágenes
fueron tratadas por el sombreado de corrección multiplicativa
utilizando el software Axiovison (Vison Zeiss, Jena, Alemania). La
granzima B se visualizó en rojo utilizando el anticuerpo
HC2-PE. La muerte por apoptosis celular se
determinó después de la incubación de las células tumorales con 6
ng/ml de granzima B durante 4 h, 12 h y 24 h a 37ºC y lavado en
medio RPMI-1640 a partir de diferentes ensayos de
apoptosis, tal y como se describe a continuación.
Tinción con annexin V-FITC:
Brevemente, las células se lavaron dos veces en tampón Hepes que
contenía 5 mM de CaCl_{2} y se incubaron con anexina
V-FITC (Roche) durante 10 min a temperatura
ambiente. Las células teñidas positivamente con Annexin
V-FITC se midieron en un citómetro de flujo
FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Tinción DAPI:
Se incubaron las células fijadas en metanol/acetona (0,1 x 10^{6}
células/100 \mul) con 0,5 \mug/\mul
4,6-diamino-2-fenilindol
(DAPI) en PBS/glicerol (3:1), durante 15 minutos en la oscuridad.
Después del lavado en PBS, las células se montaron en un medio de
montaje fluorescente (Dako, Glostrup, Dinamarca) y, a continuación,
se analizaron por fluorescencia utilizando un microscopio de
exploración Axioscop 2 modelo Zeiss (Zeiss Jena, Alemania) equipado
con un objetivo de 40x y filtros estándares. La apoptosis se
visualizó con tinción DAPI de 50 túneles, cada uno. Las imágenes
fueron tratadas por el sombreado de corrección multiplicativos
utilizando el software AxioVision (Zeiss Vision Jena, Alemania).
Liberación de citocromo c: La liberación del
citocromo c se determinó utilizando un inmunoensayo cuantitativo
(DCDCO, R&D Systems, Wiesbaden, Alemania). En pocas palabras, se
lavaron las células (1,5 x 10^{6}/ml) CX+ y CX- tratadas con
granzima B (6 ng/ml) o camptotecina (4 \mug/ml) sin tratar, en PBS
y se trataron con solución tampón de lisis durante 1 hora a
temperatura ambiente. Tras centrifugación a 1.000 g durante 15 min
se retiraron los sobrenadantes y se utilizaron 200 \mul de una
dilución al 1:100, 1:250 y 1:500 para un ensayo ELISA. Después de
la incubación en una solución de sustrato en la oscuridad durante 3
0 minutos se detuvo la reacción. La densidad óptica de cada pocillo
se determinó en un lector ELISA a 450 nm. La cantidad de citocromo
c se determinó de acuerdo con una curva de calibración.
La liberación de granzima B se comparó en
células NK (NK d0) no estimuladas y en células NK estimuladas por
TKD (NK d3) después de un período de co-incubación
de 4 h con líneas de células tumorales CX+/CX- y Colo+/Colo-, a
diferentes proporciones de efector/células diana (E:D) en el
intervalo de 20:1 a 2:1. Se utilizó el kit ELISPOT (# 552572, BD,
Heidelberg, Alemania) para la detección de la granzima B. En pocas
palabras, se recubrieron placas de ELISPOT de
96-pocillos (MAIPN45, Millipore) durante toda la
noche 4ºC con anticuerpos de captura, bloqueadas con medio de
cultivo RPMI-1640 que contenía 10% FCS y se
incubaron con células tumorales y efectoras durante 4 horas a 37ºC,
tal como se ha especificado anteriormente. Después de lavar en agua
desionizada y tampones de lavado A y B, se añadió anticuerpo de
granzina B *anti biotinilado (2 \mug/ml) durante 2 h. Después de
otros dos etapas de lavado la granzima B se visualizó por adición de
la recién preparada avidina-peroxidasa de rábano (2
h) y la solución de sustrato (período de incubación 25 min). Las
manchas se contaron automáticamente utilizando un analizador de
ImmunoSpot Serie I.
Se midió la citotoxicidad mediada por células NK
utilizando un ensayo de radioisótopos ^{51}Cr de 12 h. Como las
células diana, se utilizaron las sublíneas de carcinoma de colon CX+
y CX-. Para los estudios de bloqueación se utilizó el anticuerpo
monoclonal C92F3B1 y un anticuerpo de control emparejado con isotipo
(IgG1) a una concentración final de 5 \mug/1 x 10^{6} células.
Después de la incubación de células diana CX+ y CX- con los
anticuerpos durante 30 min a 4ºC, las células se marcaron con
^{51}Cr y se realizó el ensayo de citotoxicidad según lo descrito
por MacDonald (MacDonald et. al. (1974) J. Exp. Med.
140,718). El porcentaje de lisis específico se calculó como:
[(liberación\
experimental - liberación\ espontánea)/(liberación\ máxima -
liberación\ espontánea)]\ x\
100.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las proteínas se identificaron mediante
cromatografía de afinidad en la proteína Hsp70 humana inmobilizada
(1 mg) o un péptido de 14 aminoácidos, se marcó TKD (TKDNNLLGRFELSG,
aa_{450463}, 2 mg), que contenía el epítopo extracelular de la
Hsp70 que se encontró mediaba la interacción con las células NK.
Este péptido se identificó previamente como el epítopo (Reineke
et. al. (1996) Immunobiol. 196, 96) de un anticuerpo
específico contra Hsp70 (Welch y Suhan (1986) J. Cell. Biol..
103,2035), que detecta específicamente la Hsp70 unida a la membrana
en las células tumorales viables (Multhoff et. al. (1995)
Int. J. Cáncer de 61.272; Multhoff et. al. (1995) Sangre
86,1374). Un lisado de células NK de la línea celular YT (Drexler
et. al. (2000) Leucemia 14.777) se fraccionó en columnas de
péptido TKD o Hsp70 inmovilizadas. El material unido a las columnas
se eluyó con cloruro sódico 3M en cinco fracciones. Como controles,
se administraron lisados de células YT a portadores o columnas
BSA-conjugado. Por otra parte, fue fraccionado un
lisado de una línea de células no-NK (K562) en
columnas de afinidad TKD-conjugado. Las fracciones
eluidas se separaron por SDS-PAGE (10%) y se
visualizaron por tinción de plata. Una banda de proteína dominante
de peso molecular aparente de 32 kDa se observó en las fracciones
dos (F2) y tres (F3) de los eluidos de células YT derivados de la
columna de proteína Hsp70 (Hsp70) y Hsp70-péptido
(TKD) (Figura 1A, YT). Esta banda no se observó en columnas de
eluidos de sefarosa no conjugada (datos no mostrados) o columnas
BSA-conjugado ni en el material eluido de las
columnas de afinidad TKD cargadas con lisados de células K562
(Figura 1A). Idénticos resultados se obtuvieron con columnas de la
proteína Hsp70 (datos no mostrados). Paralelamente, se separaron los
eluidos de Hsp70-péptido TKD y proteína Hsp70
derivados de la fracción 3 (F3) por SDS-PAGE y se
tiñeron con Azul de Coomassie. Se cortó la banda de proteína de 32
kDa derivada de F3 de la columna Hsp70-péptido y se
digirió la tripsina (Figura 1B). Los péptidos resultantes se
analizaron por huella péptídica de masas MALDI-TOF.
La secuencia de péptidos trípticos mostraron 100% de homología con
la granzima B con un valor-Z estimado de 1,89 lo que
indicaba una probabilidad superior al 95% para la granzima B
(Figura 1B). La identidad de la banda de proteína de 32 kDa como
granzima B se confirmó mediante el análisis Western blot utilizando
el anticuerpo 2C5 específico para la granzima B (IgG2a): los
eluidos de células YT obtenidos a partir de las columnas de proteína
Hsp70 (Hsp70) y Hsp70-péptido (TKD), ambas
revelaron una banda de proteína de granzina B dominante de 32 kDa
(Figura 1C). No se detectó la granzima B en la fracción eluida de
las columnas de Hsp70 o de afinidad TKD cargadas con lisados de
células K562 (Figura 1C). La citometría de flujo utilizando un
anticuerpo de granzima B conjugada-ficoeritrina (PE)
(IgG1) de nuevo la granzima B mostró tinción positiva para la
granzima B citoplasmática de las células YT, pero no para las
células K562 (Figura 1D). Estas observaciones corroboran los
resultados anteriores. En resumen, estos datos indican que la
granzima B es una proteína potencial de la Hsp70. La granzima B es
probable que interactúe con la región C-terminal de
la Hsp70 denominada TKD.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los resultados anteriores plantean la pregunta
de si la Hsp70 unida a membrana podría permitir la unión específica
y la entrada de granzima B en el citosol. Por lo tanto, la granzima
B purificada libre de perforina se co-incubó con
sublíneas de células tumorales CX+/CX- y Colo+/Colo- que muestran
expresión en la membrana Hsp70 diferencial. Se muestra un análisis
de microscopía de luz de células CX+ y Colo+ sin tratar (control) a
4ºC respecto a 37ºC en la fila superior de cada panel (Figura 2A).
El microscopio de inmunofluorescencia correspondiente de las
células a 4ºC y a 37ºC se ilustra a continuación (Control).
Inicialmente, ninguna de las células mostró tinción de la granzima
B, ni en la superficie celular, ni en el citoplasma. Sin embargo,
después de un período de incubación de 15 min de las células con
granzima B purificada (grB) a 4ºC, una fluorescencia en forma de
anillo, que indica una coloración típica de la superficie de la
célula se detectó en las sublíneas tumorales CX+ y Colo+ positivas
a la membrana Hsp70 (Figura 2A, izquierda). Un cambio de temperatura
de 4ºC a 37ºC durante el período de incubación de 30 minutos dió
como resultado la captación de granzima B, tal y como se determinó
por un patrón de tinción citoplasmático en las sublíneas tumorales
CX+ y Colo+ (Figura 2A, el panel de la derecha). Por el contrario,
los homólogos CX- y Colón- negativos a la membrana Hsp70, no
mostraron unión en la superficie celular de la granzima B a 4ºC, ni
en la captación a 37ºC (datos no mostrados). El análisis de
citometría de flujo de células permeabilizadas reveló un cambio leve
del pico de la granzima B a la derecha de forma selectiva a CX+ y
Colo+ positiva a la membrana Hsp70, pero no en las sublíneas
tumorales CX- y Colo-, si las células fueron co- incubadas con 1
\mug/ml de granzima B durante 30 min a 37ºC (Figura 2B, gráfico
superior). Se detectó un aumento de la
dosis-dependiente en la captación de granzima B, en
la membrana de las células tumorales
positivas-Hsp70 (CX+/Colo+) después de
co-incubación con 2 \mug/ml y 4 \mug/ml de
granzima B (Figura 2B, bajar el gráfico). Sin embargo, incluso a la
concentración más elevada de 4 \mug/ml, la granzima B se
internalizó mucho más fuerte por la membrana de las células
tumorales positivas-Hsp70 en comparación con la de
las células tumorales negativas-Hsp70 (CX-/Colo-).
Los canales de iones potenciales formados por Hsp70 pueden
desempeñar un papel en el mecanismo de captación selectiva de la
granzima B en las células tumorales positivas a la membrana de
Hsp70. De hecho, se observó una ruta de conductancia del ion
particular después de la incorporación de las vesículas derivadas de
fosfolípidos purificados de las sublíneas tumorales positivas a la
membrana de Hsp70 (CX+). Esto no se vió en las vesículas obtenidas a
partir de las células tumorales negativas a la membrana de Hsp70
(CX-) (datos no mostrados). En base a estos resultados se podría
especular acerca de una actividad del canal iónico que facilita la
captación
\hbox{de la granzima B, de forma selectiva en las
células tumorales positivas a la membrana de Hsp70.}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los resultados anteriores plantean la pregunta
de si la granzima B purificada puede inducir la apoptosis de las
células tumorales que presentan Hsp70 en su superficie celular. Las
células de carcinoma de colon positivas (CX+/Colo+) y negativas
(CX-/Colo-) en la membrana Hsp70 que muestran idéntica expresión MHC
clase I (Multhoff et. al. (1997) J. Immunol. 158,4341) se
incubaron durante 4 h, 12 h y 24 h con granzima B activa aislada
enzimáticamente (6 ng/ml) (Shi et. al. (2000) Métodos de
Enzimología 322.125). Como control positivo para la apoptosis todos
los tipos de células se incubaron con camptotecina inhibidor de la
topoisomerasa a una concentración de 4 \mug/ml. La apoptosis se
determinó mediante tinción Annexin V-FITC medida por
FACS(FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania),
tinción DAPI y liberación de citocromo c mitocondrial. La apoptosis
no se detectó en las células CX+ y CX- incubadas con camptotecina
(CAM) o granzima B (grB) durante 4 h de incubación (Figura 3A). Las
células CX+ y Colo+, así como CX- y Colo- incubadas con camptotecina
experimentaron la apoptosis después de un período de 12 h y 24 h de
incubación con la camptotecina. Al parecer, las sublíneas de
carcinoma de colon CX+/CX- están mejor protegidas hacia una muerte
celular mediada por camptotecina en comparación con las sublíneas
de carcinoma de páncreas Colo+/Colo-.
Como se muestra en la Figura 3A, después de 12 h
la cantidad de células CX+ positivamente teñidas con anexina
V-FITC aumentó de 16,6% a 28,0% (1,7 veces) y
después de 24 h de 18% a 39% (2,1 veces). En las células CX- la
cantidad de células positivamente teñidas con anexina
V-FITC aumentó de forma similar a partir de 12,1% a
19,8% (1,6 veces) después de 12 h, y de 11,9% a 25,1% (2,1 veces) a
las 24 h. Por el contrario, la apoptosis se observó de manera
selectiva en células CX+ positivas en la membrana Hsp70 incubadas
con granzima B durante 12 h y 24 h, con un aumento del 16,6% al
20,9% (1,3 veces) y del 18% al 30,2% (1,8 veces), respectivamente.
Del mismo modo, se observó un aumento de 1,3 veces y de 2,4 veces en
la cantidad de células Colo+ teñidas positivamente con anexina
V-FITC después de 12 h y 24 h, respectivamente. En
las células CX- y Colo- ni a las 12 h ni a las 24 h de tratamiento
con granzima B se induce apoptosis. En la Figura 3B se ilustra un
patrón comparativo de tinción con Annexin V-FITC de
células CX+ y CX- tratadas con granzima B durante 24 h. En
comparación con las células control sin tratamiento (18%), la
cantidad de células CX+ teñidas negativamente con yoduro de
propidio (PI) y positivamente con anexina V-FITC
aumentó 1,7 veces (30%) después del tratamiento con granzima B. Sin
embargo, la cantidad de células apoptóticas CX- permaneció
inalterada antes y después del tratamiento idéntico con la granzima
B. Además de las células CX+, la granzima B induce apoptosis también
en la línea celular leucémica K562 positiva en la membrana de Hsp70
(datos no mostrados). La cantidad de células K562 teñidas
positivamente con anexina V-FITC pasó de 8,7% a 16%
(1,8 veces).
Con el fin de excluir la apoptosis iniciada por
anoikes (matriz celular) se llevó a cabo un análisis de microscopía
de luz de las células tumorales CX-/Colo- y CX+/Colo+ no tratadas
(control), con camptotecina (CAM) y granzima B (gbB). Como se
muestra en la Figura 3C, 24 h después del tratamiento con granzima
B, ni las líneas de células tumorales negativas ni positivas a la
membrana de Hsp70 presentaba ningún signo de pérdida de adherencia
plástica. En cuanto a estos resultados se descarta la posibilidad de
que anoikes podría ser un posible mecanismo para la inducción de la
muerte celular apoptoica en las sublíneas tumorales positivas a la
membrana Hsp70. Es importante señalar que todos los ensayos de
apoptosis se determinaron en la población de células adherentes
después de una tripsinización de corto tiempo (<1 min).
De acuerdo con los resultados de patrón de
tinción con anexina V-FITC, todos los tipos
celulares, CX+/CX-, Colo+/Colo- mostraron fragmentación del núcleo,
un signo típico de apoptosis en una fase posterior, según lo
detectado por tinción con DAPI del ADN nuclear después del
tratamiento con camptotecina (4 \mug/ml) durante 24 h (Figura 3D,
cam). Sin embargo, la fragmentación del ADN sólo se detectó en las
células tumorales CX+ y Colo+ positivas a la membrana de Hsp70
después de 24 h de tratamiento con granzima B (6 ng/ml), mientras
que no se observó fragmentación del ADN en las células CX- y Colo-
negativas a la membrana de Hsp70 (Figura 3D, grB).
Como ensayo adicional de la muerte celular por
apoptosis, se medió la liberación de citocromo c después de la
incubación de células CX+ y CX-c con granzima B
durante 24 h. Como se resume en la tabla I, después de la
incubación con granzima B (6 ng/ml) durante 24 h, la concentración
de citocromo c se elevó de 0,382 mg/ml a 0,690 mg/ml (1,8 veces) en
las células CX+. Sin embargo, no se observó aumento de citocromo c
en las células CX- después del tratamiento con granzima B (0,452
mg/ml en comparación con 0,425 mg/ml). Por el contrario, una
incubación con camptotecina (4 \mug/ml) durante 24 h, dió como
resultado un aumento comparable de 1,5 veces en las concentraciones
de citocromo c en ambos tipos celulares. Estos resultados indican
que la granzima B aislada induce la muerte celular por apoptosis
selectivamente en las células tumorales que presentan Hsp70 en su
superficie celular. Se propone que el desencadenante de la apoptosis
por granzima B está mediada a través del epítopo TKD extracelular
expuesto a Hsp70.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El papel fisiológico de los resultados fue
probado en ensayos funcionales utilizando células NK humanas
estimuladas por Hsp70 y nativas. Previamente, se demostró que la
incubación de las células NK con proteína Hsp70 a concentraciones
de 10 a 50 \mug/ml o a concentraciones de equivalentes de
Hsp70-péptido (0,2-2,0 \mug/ml)
dió como resultado un aumento de la actividad citolítica de las
células NK contra las células tumorales diana positivas a la
membrana de Hsp70. Al mismo tiempo, se reguló la expresión de la
activación del receptor CD94 tipo C activador de células NK
(Multhoff et. al. (1999) Exp. Hematología 27,1627; Bruto
et. al. (2002) suministrado). Aunque la Hsp70 actúa como una
estructura de reconocimiento selectivo del tumor para las células
NK, según lo determinado por los estudios de bloqueo de anticuerpo
(Multhoff et. al. (1997) J. Immunol. 158,4341; Multhoff
et. al. (1995) Sangre 86,1374), el mecanismo citotóxico
mediado por NK sigue sin estar claro. Para dilucidar el posible
mecanismo, las células NK se incubaron con
Hsp70-péptido TKD (2 \mug/ml) durante 3 días. Se
observó una expresión de la granzima B intracelular
significativamente superior, según lo determinado en 3 experimentos
independientes. Por el contrario, la expresión de la granzima B no
fue mayor en células T positivas a CD3 tratadas con
Hsp70-péptido TKD. En la Figura 4A se ilustran los
análisis de microscopía de luz de células NK activadas con
Hsp70-péptido co-incubadas con
células CX- negativas a la membrana de Hsp70 y + CX+ positivas a la
membrana Hsp70. Las células tumorales CX- negativas a la membrana de
Hsp70 y CX+ positivas a la membrana de Hsp70 (0,1X
10^{6}células/ml) fueron cultivadas por duplicado en 24 placas de
pocillos durante 2 días. La tasa de proliferación de células de
ambas líneas tumorales fue comparable, según lo determinado por el
recuento de células idénticas (0,3 x 10^{6} células/ml). Las
células tumorales CX+ y CX- en el panel superior se cultivaron en
la ausencia de células NK; las células tumorales en el panel
inferior se co-cultivaron durante 12 h con las
células NK que se habían estimulado con
Hsp70-péptido TKD (2 \mug/ml, 3 días). Casi el
100% de las colonias de células CX+ se encontró en clústers con las
células NK y pareció reducirse la viabilidad de las células
tumorales CX+. En contraste, las células tumorales CX- y las células
NK no se encontraron en los clúrsters; las células tumorales CX-
negativos a la membrana de Hsp70 no atrajeron las células NK. La
viabilidad celular de las células tumorales CX- tras el contacto con
las células NK parece estar menos afectada en comparación con el de
la de las células tumorales CX+. Los insertos en la esquina inferior
derecha de cada gráfico ilustra un aumento de 2,5x veces de una
colonia de células representativas.
La muerte celular de células tumorales, recién
aisladas, CX+/CX- y Colo+/Colo- tras el contacto con las células NK
(NK d3) estimuladas con Hsp70-péptido TKD o sin
estimular (NK d0) se cuantificó en un ensayo de liberación de
^{51}Cr de 12 h (Figura 4B).En consonancia con lo observado en
microscopía de luz (Figura 4A), la actividad citolítica de células
NK estimuladas con TKD (NK d3) frente a células diana CX+
(izquierda) fue significativamente mayor en comparación con las
células diana CX- (derecha). Junto con el aumento de niveles de
granzima B tras la estimulación con Hsp70-péptido
TKD durante 3 días, la respuesta citolítica contra las células CX+
y Colo+ positivas a la membrana de Hsp70, pero no contra las células
CX- y Colo- negativas a la membrana de Hsp70 fue significativamente
elevada, 1,5 veces (CX+) y 2,0 veces (Colo +) a relaciones E:D de
2:1 a 20:1. Puesto que las células tumorales CX+ CX- sólo difieren
en cuanto a su expresión en la membrana Hsp70, pero muestran
idéntico patrón de expresión MHC clase I, el efecto inhibidor
mediado por los receptores inhibidores de células asesinas (KIR)
podría excluirse. El aumento de la actividad citolítica contra las
células tumorales CX+ positivas a la membrana de Hsp70 (izquierda),
pero no contra las células tumorales CX-negativas a
la membrana de Hsp70 (derecha) puede ser completamente inhibido por
la preincubación de las células diana con el anticuerpo monoclonal
específico de Hsp70 del que se conoce detecta
Hsp70-péptido TKD unido a la membrana en las
células tumorales viables (Multhoff et. al. (1995) Int. J.
Cáncer de 61.272).
Por el contrario, la lisis de las células
tumorales negativas a la membrana de Hsp70 no se vió afectada
después de la incubación con el anticuerpo Hsp70. Técnicamente, no
es posible cuantificar la cantidad absoluta de granzima B que se
transfiere de las células NK a las células tumorales por contacto
célula a célula. Sin embargo, los valores relativos de liberación
de granzima B pueden determinarse por el análisis ELISPOT. Por lo
tanto, una comparación de la respuesta citolítica de las recién
aisladas, células NK (NK d3) estimuladas con TKD y sin estimular
(NK d0) contra las células tumorales CX+/CX-y
Colo+/Colo- se realizó concomitantemente con la definición de la
liberación de granzima B. Independientemente de la línea celular
tumoral y de la relación de E:células diana (D), la
co-incubación de células tumorales con células NK
sin estimular (NK d0), siempre conlleva una baja liberación de
granzima B; el número de manchas fue siempre inferior a 20. Después
de un período de estimulación de 3 días con TKD (NK d3) seguido de
un tiempo de 4 h de coincubación con células tumorales, se reguló
significativamente la liberación de granzima B. A una relación de
E:D de 5:1, el número de manchas de granzima B, según lo
determinado en tres experimentos independientes, fue como sigue: CX+
260\pm20, CX- 165\pm6; Colo+ 13 7\pm55; Colo- 66\pm8. Al
mismo tiempo, las células diana tumorales (CX+/Colo+) positivas a
la membrana de Hsp70 se sometieron a lisis significativamente mejor
en comparación con sus homólogas negativas (CX-/Colo-). Estos datos
sugieren fuertemente que la lisis de las células tumorales positivas
a la membrana de Hsp70 por células NK activadas por TKD está
asociada con la liberación de granzima B.
Se planteó la hipótesis de que la interacción de
granzima B con el péptido TKD enlazado a la membrana Hsp70 es clave
para su captación en las células tumorales y para la inducción de
apoptosis. Cuando las células NK se eliminan mediante lavado con
PBS y las células tumorales se tiñen con DAPI. Las células CX+
positivas a la membrana Hsp70 mostraron una fragmentación del ADN,
mientras que las células CX- negativas a la membrana Hsp70 no
siguieron la co-incubación con las células NK. Se
obtuvieron idénticos resultados cuando se tiñó con Annexina
V-FITC (datos no mostrados). Estas observaciones
sugieren fuertemente que las células NK activadas con TKD matan las
células CX+ positivas a la membrana de Hsp70 por inducción de
apoptosis, que también tiene niveles elevados de granzima
B.
B.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (13)
1. Procedimiento ex vivo de inducción o
mejora de la expresión de la granzima B en células natural killer
(NK) que comprende poner en contacto células NK con
- (a)
- proteína Hsp70;
- (b)
- un fragmento (C-terminal) de (a) que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG;
- (c)
- un (poli)péptido que comprende la secuencia de aminoácidos TKDNNLLGRFELSG; o
- (d)
- una combinación de (a), (b) y/o (c).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la proteína Hsp70, el fragmento (C-terminal)
de la misma, el (poli)péptido que comprende la secuencia de
aminoácidos TKDNNLLGRFELSG o una combinación de estos está en un
estado no complejado.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
que comprende además proporcionar células NK con expresión de
granzima B mejorada o inducida útil para la reinfusión en un
mamífero.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
donde las células NK son células NK autólogas y/o alélicas.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4,
donde dicho mamífero es un humano.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde dicho contacto se realiza durante por
lo menos 12 h.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
donde dicho contacto ser realiza por lo menos durante 4 días.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde dichas células NK antes de ponerse en
contacto con, se obtienen a partir de células de médula ósea
mediante la incubación de dichas células de médula ósea con
interleucina-15 (IL-15) y el factor
de células madre (SCF) a concentraciones de 1 ng/ml - 1000 ng/ml
por citoquina durante por lo menos 7 días y hasta 4 meses.
9. Granzima B para utilizar en el tratamiento
in vivo de tumores independiente de la ruta perforina donde
dichos tumores expresan Hsp70 en la superficie celular.
10. Granzima B según la reivindicación 9, que se
utiliza como único compuesto farmacéuticamente aceptable.
11. Granzima B según la reivindicación 9 ó 10,
que está diseñada para administrarse a una concentración final de 1
\mug/ml a 500 \mug/ml, preferiblemente de 1 \mug/ml a 10 ng/ml
y más preferiblemente a una concentración final de aproximadamente
6 ng/ml.
12. Granzima B según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, que se empaqueta en liposomas.
13. Granzima B según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, donde dichos tumores se seleccionan entre
el grupo que consiste en estómago, gástrico, colorrectal, páncreas,
mama, pulmón, ginecológico, cáncer de cabeza y cuello,
dermatológico (por ejemplo, el melanoma), tumores neuronales,
leucemia y linfoma.
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