ES2340376T3

ES2340376T3 - Desproteccion del azufre posterior a la escision para la sintesis convergente de proteinas mediante ligacion quimica.

Info

Publication number: ES2340376T3
Application number: ES03760111T
Authority: ES
Inventors: Paolo Botti; Matteo Villain; Sonia Manganiello; Hubert Gaertner
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2002-06-10
Filing date: 2003-06-09
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2023-06-09
Also published as: US20070059792A1; WO2003106615A3; WO2003106615A2; EP1529056B1; ATE458745T1; CA2487342A1; EP1529056A2; DE60331437D1; AU2003276286A1; JP2005529186A; US7781488B2; JP4559219B2

Abstract

Compuesto de fórmula: Xaai- ... -Xaam-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH2)n-S-R'']-Y en la que: Xaai es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; C* es un carbono quiral en configuración R o S, y sustancialmente libre de la configuración contraria; R es una cadena lateral de un aminoácido; R'' es -SR'''', Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de Rc, alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc, -C(O)-Rd, -S(O)p-alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos Rc; cada grupo Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH2, -C(O)-NHHN2, -S(O)2NH2, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; Rd es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)2, ORe y -SRe; cada Re es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y -SO2-alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos Re, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos puede formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene entre 1 y 3 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y en el que R'''' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de etilo, t-butilo y fenilo sustituido.

Description

Desprotección del azufre posterior a la escisión para la síntesis convergente de proteínas mediante ligación química.

Antecedentes de la presente invención

La secuenciación del genoma humano ha generado la promesa y la oportunidad de comprender la función de todos los genes y proteínas relevantes a la biología y patología humanas (Peltonen y McKusick, Science 291:1224-1229, 2001). Sin embargo, deben superarse varios obstáculos importantes antes de cumplir por completo dicha promesa. En primer lugar, incluso conociendo la secuencia del genoma humano, todavía resulta difícil distinguir los genes y las secuencias que controlan su expresión. En segundo lugar, aunque el seguimiento de la expresión génica a nivel de transcritos se ha robustecido con el desarrollo de la tecnología de micromatrices, una parte importante de la variabilidad y del control de función se origina en sucesos posteriores a la transcripción, tales como el procesamiento alternativo y el procesamiento y modificación posteriores a la traducción. Finalmente, debido a la escala de la biología molecular humana, potencialmente deberán aislarse y someterse a ensayo varias decenas de miles de genes, y sus productos de expresión, para comprender su papel en los estados de salud y de enfermedad (Dawson y Kent, Annu. Rev. Biochem. 69:923-960, 2000).

Con respecto a la cuestión de la escala, la aplicación de las metodologías recombinantes convencionales para la clonación, expresión, recuperación y aislamiento de proteínas todavía es un procedimiento largo y laborioso, de manera que su aplicación en el cribado de grandes cantidades de productos génicos diferentes para determinar su función ha sido limitada. Recientemente, se ha desarrollado un enfoque de síntesis que puede satisfacer la necesidad de un acceso fácil a cantidades altamente purificadas a escala de investigación de proteínas para el cribado funcional (Dawson y Kent (citado anteriormente), y Dawson et al., Science 266:776-779, 1994). En su implementación más atractiva, un intermediario oligopéptido no protegido que presente un tioéster C-terminal reaccionan con una cisteína N-terminal de otro intermediario oligopéptido bajo condiciones acuosas suaves para formar un enlace tioéster que se reorganiza espontáneamente formando un enlace peptídico natural (Kent et al., patente US nº 6.184.344). El enfoque ha sido utilizado para ensamblar oligopéptidos en proteínas activas tanto en fase solución, por ejemplo Kent et al., patente US nº 6.184.344, y sobre un soporte de fase sólida, por ejemplo Canne et al., J. Am. Chem. Soc. 121:8720-8727, 1999). Recientemente, la técnica se ha extendido, permitiendo el acoplamiento de fragmentos tioéster C-terminales a un abanico más amplio de aminoácidos N-terminales de péptidos correactivos mediante la utilización de un grupo etiltio desplazable unido al nitrógeno N-terminal del correactivo, imitando de esta manera la función de una cisteína N-terminal (Low et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:6554-6559, 2001).

En la actualidad, la síntesis de tioésteres de oligopéptido se lleva a cabo principalmente utilizando grupos protectores basados en t-butoxicarbonilo ("Boc"). Alternativamente, también pueden utilizarse grupos protectores basados en 9-fluorenilmetoxicarbonilo ("Fmoc"), aunque únicamente en el caso de que los tiempos de reacción sean cortos, debido a que los reactivos nucleofílicos utilizados para desplazar los grupos protectores Fmoc también degradan los tioésteres de los oligopéptidos con el tiempo, tal como indican Botti et al., publicación de patente internacional WO nº 02/18417. Para resolver este problema, Botti et al. han sugerido la utilización de un precursor tioéster estable frente a nucleófilos que es desplazable bajo condiciones no nucleofílicas, en combinación con un grupo protector Fmoc lábil nucleofílico como grupo protector N-terminal. Aunque el trabajo de Botti et al. no facilita el acoplamiento de aminoácidos y oligopéptidos, los carboxiésteres 2-mercapto de Botti et al. son susceptibles de corte nucleofílico en los tiempos de reacción prolongados. Debido a que la preparación de oligopéptidos, polipéptidos y proteínas muy largos requiere tiempos de reacción prolongados, resultaría ventajoso un nuevo método que proporcione grupos protectores N-terminales y C-terminales estables para la preparación de oligopéptidos, polipéptidos y proteínas. Inesperadamente la presente invención proporciona estos métodos.

Descripción resumida de la presente invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un producto oligopéptido o polipéptido, que comprende: (a) ligar en una primera reacción un primer y un segundo oligopéptidos, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en la que el primer oligopéptido comprende un extremo C-terminal que presenta un grupo tioéster, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, en el que el segundo oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido, o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo, en el que dicho segundo oligopéptido es un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, y en el que la ligación forma un primer producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, (b) ligar en una segunda reacción un tercer y un cuarto oligopéptidos, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en la que el tercer oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que comprende un tioéster, en el que el cuarto oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido o el 1,3-aminotiol no protegido, y en el que la ligación forma un segundo producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido o el 1,3-aminotiol no protegido, (c) transformar el precursor tioéster inactivo del primer producto de ligación oligopéptido de la etapa (a) en un tioéster, formando un tercer producto de ligación oligopéptido que presenta un extremo C-terminal que comprende un tioéster, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, (d) desproteger el extremo N-terminal del segundo producto de ligación oligopéptido de la etapa (b) para formar un cuarto producto de ligación que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido o el 1,3-aminotiol no protegido, y (e) ligar el tercer producto de ligación oligopéptido de la etapa (c) con el cuarto producto de ligación oligopéptido de la etapa (d) para formar un quinto producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta un grupo tioéster C-terminal, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta una cisteína N-terminal no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que presenta la fórmula siguiente:

Xaa_{i}- ... - Xaa_{m}-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; C* es un átomo quiral en configuración R o S, y sustancialmente libre de la otra configuración; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es SR''; R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de alquilo C_{2-10}, arilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono, bencilo sustituido, y heteroarilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono y entre 1 y 4 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHHN_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(R^{e})_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos un anillo hterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene entre 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... - Xaa_{m}-(CH-R)-CO-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un grupo protector de azufre; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHHNH_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, o y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-NH-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un grupo protector de azufre; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2},
-S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un grupo de protección carboxitioéster de la presente invención (figura 1a, en la que n=1 y R'=H), un grupo de protección carboxitioéster protegido con disulfuro de la presente invención (figura 1b, en la que n=1 y R'=S-R'') y una forma protegida general de la presente invención (figura 1c, en la que n=1 y R'=PG).

La figura 2 ilustra la utilización de oligopéptidos de la presente invención en un esquema de síntesis convergente para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido.

La figura 3 ilustra la ligación química nativa con ayuda de grupos auxiliares ("ligación química nativa extendida") utilizando un intermediario oligopéptido modificado con tioéster heterocíclico protegido, de la presente invención.

La figura 4 ilustra un primer esquema para la síntesis de oligopéptidos modificados con tioéster heterocíclico protegido, de la presente invención.

La figura 5 ilustra un segundo esquema para la síntesis de oligopéptidos modificados con tioéster heterocíclico protegido, de la presente invención.

La figura 6 ilustra un tercer esquema para la síntesis de oligopéptidos modificados con tioéster heterocíclico protegido, de la presente invención.

La figura 7 ilustra un esquema de síntesis para preparar un tioéster de oligopéptido protegido con 1,3-tiazolidina 4-sustituida.

La figura 8 ilustra un ejemplo de la utilización de oligopéptidos de la presente invención en un esquema de síntesis convergente para preparar un producto oligopéptido o polipéptido. Las figuras 8a a 8d muestran la señal de absorbancia en la salida de un aparato de HPLC en diferentes tiempos durante la reacción.

La figura 9 muestra la separación en un gráfico de la fragmentación de material crudo de los dos diastereómeros en la posición C-1 del carboxitioéster de la presente invención.

La figura 10 ilustra la preparación de los grupos carboxitioéster de disulfuro protegido de la presente invención según diferentes estrategias sintéticas (figuras 10A a 10D).

La figura 11 ilustra la ligación del péptido modelo LYRAF-COO-CH(CH_{2}-S-S-t-But)-CONH_{2} en el tiempo=0 y después de la reacción durante la noche.

La figura 12 ilustra la ligación del péptido modelo LYRAG-COO-CH(CH_{2}-S-S-t-But)-CONH_{2} en dos tiempos diferentes (t=0, fig. 12a y tras la reacción durante la noche, fig. 12b) y también bajo diferentes condiciones (figs. 12c a 12e).

La figura 13 ilustra los cromatogramas de HPLC tras la síntesis de NNY-RANTES 1 a 68.

La figura 14 ilustra los datos del MS de NNY-RANTES 1-68 sintetizados.

La figura 15 ilustra un análisis de RP-HPLC de la ligación química para formar la proteína SPT1 1-54 (ver el Ejemplo 12).

La figura 16 muestra el análisis de cromatografía por exclusión de tamaños de la ligación química de SPT1 1-54 (ver el Ejemplo 12).

La figura 17 muestra el análisis de MS de la SPT1 purificada fosforilada en la serina de la posición 8.

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Descripción detallada de la presente invención I. Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "péptido", "fragmento de péptido", "oligopéptido" o "fragmento" en referencia a un péptido se utilizan como sinónimos y se refieren a un compuesto constituido por una única cadena no ramificada de residuos aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Los residuos aminoácidos en ocasiones se representan en la presente memoria con el símbolo "Xaa_{i}", en el que "i", en caso de encontrarse presente, designa la posición del aminoácido dentro de un péptido. Cada Xaa_{i} se selecciona independientemente de entre el grupo de aminoácidos naturales y no naturales. Los aminoácidos en un péptido u oligopéptido puede derivatizarse con grupos lipídicos, polietilenglicol, pigmentos, biotina, haptenos, oligonucleótidos o grupos similares. El número de residuos aminoácidos en dichos compuestos varía ampliamente. Los péptidos u oligopéptidos a los que se hace referencia en la presente memoria preferentemente presentan entre 2 y 70 residuos aminoácidos. Más preferentemente, los péptidos u oligopéptidos a los que se hace referencia en la presente memoria presentan entre 2 y 70 residuos aminoácidos. Más preferentemente, los péptidos u oligopéptidos a los que se hace referencia en la presente memoria presentan entre 2 y 50 residuos aminoácidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína" se utiliza como sinónimo del término "polipéptido", o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos que pueden unirse mediante enlaces diferentes de los enlaces peptídicos, por ejemplo, dichos polipéptidos que forman la proteína pueden unirse mediante enlaces disulfuro. El término "proteína" también puede incluir una familia de polipéptidos que presentan secuencias de aminoácidos idénticas aunque modificaciones post-traduccionales diferentes, tales como fosforilaciones, acilaciones, glucosilaciones y similares. En particular, dichas modificaciones post-traduccionales pueden añadirse al expresarse dichas proteínas en huéspedes eucarióticos. Los polipéptidos y proteínas a los que se hace referencia en la presente memoria habitualmente presentan entre unas cuantas decenas de residuos aminoácidos, por ejemplo 20, hasta unos cuantos cientos de residuos aminoácidos, por ejemplo 200 ó más.

En la presente memoria se hace referencia a los residuos aminoácidos con sus notaciones estándares de una letra o de tres letras: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano, e Y, tirosina. Una secuencia de aminoácido indicada en la presente memoria, tal como "DKLLM", ordena los aminoácidos desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal de izquierda a derecha, a menos que indique lo contrario el contexto. El experto en la materia apreciará que los aminoácidos no naturales también resultan útiles en la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "aceptor de electrones" se refiere a la tendencia de un sustituyente de atraer electrones de valencia de la molécula a la que se encuentra unido, es decir, es electronegativo, y "donador de electrones" se refiere a la tendencia de un sustituyente de donar electrones de valencia a la molécula a la que se encuentra unido, es decir, es electropositivo, por ejemplo Smith y March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, Structure, 5a edición (Wiley-Interscience, New York, 2001). Los sustituyentes aceptores de electrones preferentes son halógeno, amidas sustituidas o no sustituidas, sulfonamidas sustituidas o no sustituidas, bencilo sustituido o no sustituido, hidroxiamina sustituida o no sustituida, polihaloalquilo, hidrazida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario, o grupos alquilo que presentan entre 1 y 3 carbonos y sustituidos con uno o más de los sustituyentes anteriormente indicados, grupos arilo sustituidos con uno o más de los sustituyentes anteriormente indicados, ésteres sustituidos o no sustituidos, o tioésteres sustituidos o no sustituidos. Más preferentemente, los sustituyentes aceptores de electrones son metilos halosustituidos. Entre los sustituyentes donadores de electrones preferentes se incluyen alquilo que presenta entre 1 y 3 átomos de carbono, metoxi, tiol, hidroxilo y metiltio. Más preferentemente, lo sustituyentes donadores de electrones son metoxi, tiol, metiltio o hidroxilo. Preferentemente, siempre que se sustituya un sustituyente con un grupo donador de electrones o un grupo aceptor de electrones, tal como fenilo sustituido donador de electrones o aceptor de electrones, se unen entre 1 y 3 de dichos grupos. Más preferentemente, se unen entre 1 y 2 de dichos grupos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ligación química" se refiere a la unión de dos oligopéptidos para formar un único producto, tal como otro oligopéptido, un polipéptido, o una proteína, por ejemplo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "transformar" se refiere a la transformación de un primer grupo químico en un segundo grupo químico. En una realización preferente, la transformación del primer grupo químico en el segundo se produce a través de por lo menos un intermediario.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "precursor tioéster inactivo" se refiere a un grupo químico que, tras la transformación, proporciona un grupo tioéster activo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "productos de ligación" se refiere a productos formados mediante la ligación química de oligopéptidos.

Un grupo alquilo está ramificado o no ramificado y contiene entre 1 y 7 átomos de carbono, preferentemente entre 1 y 4 átomos de carbono. El término "alquilo" representa, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo o isobutilo. Los grupos alquilo pueden sustituirse con hasta 3 sustituyetnes seleccionados de entre alcoxi, arilo, heterociclilo, hidroxi, halógeno, ciano, amino opcionalmente sustituido, aminooxi o trifluorometilo opcionalmente sustituidos.

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El término "arilo" representa un sistema anular aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico, por ejemplo fenilo o fenilo monosustituido, disustituido o trisustituido con uno, dos o tres radicales seleccionados independientemente de entre alquilo, alcoxi, fenilo no sustituido, hidroxi, halógeno, ciano, amino, aminoalquilo, trifluorometilo, alquilendioxi y oxi-C_{2}-C_{3}-alquileno, la totalidad de los cuales se sustituye opcionalmente adicionales, por ejemplo tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. El término arilo también puede representar 1-naftilo o 2-naftilo, o 1-fenantrenilo o 2-fenantrenilo.

Resulta preferente como arilo, naftilo, fenilo o fenilo monosustituido o disustituido con alcoxi, halógeno, alquilo o trifluorometilo, especialmente fenilo o fenilo monosustituido o disustituido con alcoxi, halógeno o trifluorometilo, y en particular fenilo.

Son ejemplos representativos de grupos fenilo sustituidos, por ejemplo, 4-clorofén-1-ilo, 3,4-diclorofén-1-ilo, 4-metoxifén-1-ilo, 4-metilfén-1-ilo, 4-aminometilfén-1-ilo, 4-metoxietilaminometilfén-1-ilo, 4-hidroxietilaminometilfén-1-ilo, 4-hidroxietil-(metil)-aminometilfén-1-ilo, 3-aminometilfén-1-ilo, 4-N-acetilaminometilfén-1-ilo, 4-aminofén-1-ilo, 3-aminofén-1-ilo, 2-aminofén-1-ilo, 4-fenilfén-1-ilo y 4-(2-metoxietil)aminometil)-fen-1-ilo.

El término "bencilo" representa un grupo fenil-CH_{2}. La expresión "bencilo sustituido" se refiere a un grupo bencilo en el que el anillo fenilo se sustituye con uno o más sustituyentes sistemas anulares. Entre los grupos bencilo representativos se incluyen 4-bromobencilo, 4-metoxibencilo, 2,4-dimetoxibencilo y similares.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema anular aromático monocíclico o bicíclico que presenta entre 5 y 12 carbonos y 1 a 4 miembros anulares, tales como heteroátomos, seleccionado cada uno independientemente de entre N, O y S. Entre los ejemplos representativos se incluyen piridilo, indolilo, indazolilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotienilo, benzofuranilo, benzopiranilo, benzotiopiranilo, furanilo, pirrolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo y tienilo, cada uno de los cuales se encuentra opcionalmente sustituido, preferentemente monosustituido o disustituido con, por ejemplo, alquilo, nitro o halógeno. El término "piridilo" representa 2-piridilo, 3-piridilo ó 4-piridilo, ventajosamente 2-piridilo o 3-piridilo. El término "tienilo" representa 2-tienilo o 3-tienilo. El término "quinolinilo" representa preferentemente 2-quinolinilo, 3-quinolinilo ó 4-quinolinilo. El término "isoquinilo" representa preferentemente 1-isoquinolinilo, 3-isoquinolinilo ó 4-isoquinolinilo. Los términos "benzopiranilo" y "benzotiopiranilo" representan, preferentemente, 3-benzopiranilo y 3-benzotiopiranilo, respectivamente. El término "tiazolilo" representa preferentemente 2-tiazolilo o 4-tiazolilo, y más preferentemente, 4-tiazolilo. El término "triazolilo" es preferentemente 1-(1,24-triazolilo), 2-(1,2,4-triazolilo) ó 5-(1,2,4-triazolilo). Tetrazolilo es preferentemente 5-tetrazolilo.

Preferentemente, heteroarilo es piridilo, indolilo, quinolinilo, pirrolilo, tiazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furanilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, isoquinolinilo, benzotienilo, oxazolilo e indazolilo, cada uno de los cuales se encuentra opcionalmente sustituido, preferentemente monosustituido o disustituido.

Biarilo preferentemente puede ser, por ejemplo, bifenilo, es decir 2-bifenilo, 3-bifenilo o 4-bifenilo, preferentemente 4-bifenilo, cada uno opcionalmente sustituido con, por ejemplo, alquilo, alcoxi, halógeno, trifluorometilo o ciano, o biarilo heterocíclico-carbocíclico, preferentemente, por ejemplo, tienilfenilo, pirrolilfenilo y pirazolilfenilo.

Amino puede sustituirse opcionalmente con, por ejemplo, alquilo.

El término "heterociclilo" representa un hidrocarburo cíclico saturado que contiene uno o más, preferentemente 1 ó 2, heteroátomos seleccionados de entre O, N o S, y entre 3 y 10, preferentemente entre 5 y 8, átomos anulares. Por ejemplo tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropirrolilo, piperidinilo, piperazinilo o morfolino, la totalidad de los cuales puede encontrarse opcionalmente sustituido, por ejemplo tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria para arilo.

El término "halógeno" (halo) preferentemente representa cloro o flúor, aunque también puede ser bromo o yodo.

El término "polihalo" define un compuesto o radical que presenta por lo menos dos hidrógenos disponibles sustituidos con un halógeno. Aquellos compuestos o grupos químicos en los que se ha sustituido la totalidad de los hidrógenos disponibles con un halógeno se denominan "perhalo". Por ejemplo, perfluorofenilo puede referirse a 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, perfluorometano puede referirse a 1,1,1-trifluorometilo y perfluorometoxi puede referirse a 1,1,1-trifluorometoxi.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sales de amonio cuaternario" se refiere a grupos químicos que presentan la fórmula siguiente:

1

en la que R^{f}, R^{g}, R^{h} y R^{t} son generalmente hidrógeno, alquilo o arilo, o uno de entre R^{f}, R^{g}, R^{h} y R^{t} puede ser un aminoácido, un péptido, o una proteína, por ejemplo, y X- es un grupo químico aniónico, tal como un halógeno, sulfato, nitrato, fosfato o carbonato, que se encuentra iónicamente unido al átomo de nitrógeno de carga positiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "hidroxiamina" se refiere a compuestos que presentan la estructura siguiente: N(R^{11})_{2}-OR^{5}, en la que cada uno de R^{11} y R^{5} pueden ser hidrógeno, alquilo y arilo, por ejemplo. En algunas realizaciones, ambos grupos R^{11} pueden formar conjuntamente un doble enlace de la fórmula siguiente: =CH-R^{4}.

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II. Parte general

La presente invención se basa en el hecho de que la estructura carboxiéster mostrada en la fig. 1a con el tiol libre presenta una aplicabilidad limitada debido a que presenta una tendencia a la hidrólisis, generando el ácido carboxílico libre y, por lo tanto, la efectividad de la estructura ilustrada depende del tamaño de los fragmentos peptídicos en la ligación. Lo anterior resulta crucial durante la preparación de cadenas oligopeptídicas y polipeptídicas largas, en las que, debido a la complejidad del sistema, la ligación es mucho más lenta que en péptidos modelo pequeños. Por lo tanto, cualquier mejora de la estabilidad del sistema carboxi-tioéster puede presentar un impacto muy significativo sobre los rendimientos de producción de oligopéptidos, polipéptidos y proteínas más grandes, potencialmente de elevada importancia biológica.

Según la presente invención, una solución para reducir la cantidad de ácido carboxílico libre es mantener protegido el tiol durante las etapas de corte y purificación. Este esquema de protección presenta varias ventajas: en el caso de que se proteja el tiol tal como, por ejemplo, un enlace disulfuro (S-S-R'') (fig. 1b), el 2-mercapto-carboxiéster con disulfuro protegido muestra una estabilidad total bajo condiciones de corte, incluso cuando Lys y Phe son residuos aminoácidos contiguos. Además, la purificación del intermediario se simplifica debido a que el tiol protegido no se encuentra sometido a isomerismo debido a la migración de O-acilo a S-acilo. Además, el carboxiéster con el tiol protegido puede diferenciarse más fácilmente a partir de la forma hidrolizada debido a la masa adicional del grupo protector. Este tipo de esquema también facilita significativamente la preparación de intermediarios 2-mercapto-carboxiéster con S-disulfuro protegido. De hecho, la cisteína con S-disulfuro protegido puede acoplarse a un soporte sólido utilizando condiciones de acoplamiento estándares, y tras eliminar el grupo protector amino, seguidamente se transforma la amina libre en un grupo OH mediante la reacción con KNO_{2} bajo condiciones ácidas. En este punto, la resina puede funcionalizarse con el aminoácido de elección utilizando un acoplamiento catalizado por bases, tal como HBTU/DIEA con DMAP (figura 10). Esta transformación resulta mucho más eficiente en el caso de que el grupo protector de la cisteína sea un disulfuro y no un tioéter general. En el caso de que el tiol se encuentre protegido en forma de disulfuro, el átomo de azufre se encuentra en un estado de oxidación diferente que en el caso de que el azufre se encuentre en un tioéter. Por lo tanto, el azufre en el enlace disulfuro es más estable que el azufre en el tioéter. El carboxi-tioéster con tiol protegido en forma de disulfuro (fig. 1b) puede cortarse, purificarse y almacenarse fácilmente.

Con el fin de utilizar este tipo de carboxi-tioéster, puede liberarse un tiol activo libre in situ bajo condiciones de ligación mediante la adición de: (i) tioles para catalizar la ligación (por ejemplo tiofenol), y/o (ii) fosfina (TCEP o Pbut_{3}) o cualquier otro agente reductor compatible con la ligación, tal como ditionita sódica. El tiol activo generado in situ experimenta una rápida isomerización, generando un tioéster deseado para la reacción de ligación química.

Esta estrategia resulta especialmente ventajosa en el caso de que la pareja disulfuro se prepare con S-S-terc-butilo (azufre protegido en forma de S-terc-butiltio). En efecto, debido al elevado impedimento estérico del grupo terc-butiltio, el corte del disulfuro resulta mucho más lento que en una pareja disulfuro estándar bajo condiciones similares. En esta situación, el tiol activo libre se libera lentamente, permitiendo la presencia de un fuerte exceso de cisteína N-terminal o de fragmento aminotiol 1,2-N-terminal o 1,3-N-terminal, impulsando de esta manera que el proceso se complete con un rendimiento más alto. Este efecto positivo del esquema de protección S-S-terc-butilo (es decir, la reducción del carboxiéster hidrolizado durante la ligación) en teoría podría imitarse mediante la utilización de derivados 2-mercapto-carboxiéster no protegidos con un exceso más fuerte del fragmento cisteína N-terminal. Sin embargo, esto requeriría desperdiciar una cantidad significativa del exceso de fragmento cisteína N-terminal, provocando de esta manera que el proceso resultase más ineficiente.

Además, dicha protección con S-S-terc-butilo (azufre protegido en forma de S-terc-butiltio) puede explotarse como estrategia de protección en una síntesis convergente o multietapa. Un fragmento peptídico que porte en el extremo N-terminal una cisteína libre y en el extremo C-terminal un S-terc-butiltio carboxiéster puede someterse selectivamente a ligación química nativa con un fragmento tioéster de entrada utilizando un agente reductor suave o un nucleófilo suave. Resultaría útil un agente reductor suave, tal como fosfina, por ejemplo TCEP o PBut_{3}, debido a que no reduce el grupo S-S-terc-butilo muy rápidamente. Además, un nucleófilo suave, por ejemplo tiofenol o ditionita sódica, ambos en cantidad estequiométrica o en exceso reducido, resultarían útiles debido a que ambos actúan sin cortar significativamente el grupo protector S-S-terc-butilo. Tras completar la primera ligación se produce la desprotección del grupo S-S-terc-butilo. Simplemente mediante la adición en la misma mezcla de reacción de un tercer fragmento con una cisteína libre N-terminal o con un 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol, conjuntamente con un exceso más fuerte de agente reductor o de un nucleófilo, se produce la ligación química con el tercer fragmento, permitiendo de esta manera la síntesis de N a C (figura 2).

Con dicha estrategia, puede llevarse a cabo secuencialmente una síntesis por ligación de tres segmentos, de una misma mezcla de reacción sin purificaciones intermedias, permitiendo de esta manera realizar el procedimiento de manera más rápida, fácil y eficiente, sin pérdida posterior de material durante las etapas de purificación (figura 8).

Además, debido a que el impedimento estérico y las propiedades físicas del voluminoso grupo S-S-terc-butilo, resulta más fácil la separación de los dos diastereómeros generados durante la síntesis, debido a que presentan una estabilidad y reactividad diferentes durante la ligación. Por lo tanto, resulta posible aislar y utilizar en el esquema de ligación de la presente invención la estructura más estable de las dos. Esto resulta en una cantidad más reducida de ácido carboxílico hidrolizado, incrementando de esta manera la eficiencia de todo el procedimiento (Ejemplo 9 y figura 9).

La figura 2 muestra un esquema para la estrategia convergente de ligación química de fragmentos peptídicos para preparar los productos oligopéptido y polipéptido de la presente invención. En la figura 2 se presentan dos pares de oligopéptidos, A y B, y C y D, en los que cada oligopéptido presenta un extremo N-terminal y un extremo C-terminal. El oligopéptido A presenta un grupo tioéster en el extremo C-terminal y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster en el extremo C-terminal. El oligopéptido B presenta una cisteína o un 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol en el extremo N-terminal, y un precursor tioéster inactivo en el extremo C-terminal. En el otro par de oligopéptidos, el oligopéptido C presenta una cisteína protegida o un 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol en el extremo N-terminal, y un tioéster en el extremo C-terminal. El oligopéptido D presenta una cisteína no protegida o un 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol no protegido en el extremo N-terminal, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida o el 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol no protegido. En un reactor, se ligan químicamente los oligopéptidos A y B para formar el primer producto de ligación oligopéptido (A-B), que presenta un precursor tioéster inactivo en el extremo C-terminal y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster. En un reactor separado, aunque paralelo, los oligopéptidos C y D se ligan químicamente para formar un segundo producto de ligación oligopéptido (C-D), que presenta una cisteína protegida o un 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol protegido en el extremo N-terminal, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida o con 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol no protegido. El precursor tioéster inactivo del primer producto de ligación (A-B) seguidamente se transforma en un tioéster, proporcionando un tercer producto de ligación oligopéptido A-B*). La cisteína protegida o 1,2-aminotiol o 1,3-aminotiol protegido del segundo producto de ligación oligopéptido (C-D) se desprotege, proporcionando el cuarto producto de ligación oligopéptido (C*-D). El tercer (A-B*) y cuarto (C*-D) productos de ligación oligopéptidos seguidamente se introducen en un único reactivo y se ligan químicamente, formando un quinto producto de ligación oligopéptido (A-B-C-D).

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III. Métodos para la síntesis convergente de oligopéptidos, polipéptidos y proteínas

La presente invención proporciona métodos para el ensamblaje de oligopéptidos en un oligopéptido o polipéptido mediante el procedimiento de ligación química nativa. Se describen métodos relacionados en Dawson et al., Science 266:776-779, 1994; Low et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:6554-6559, 2001, y Botti et al., Tetrahedron Letters 42:1831-1833, 2002. En particular, la presente invención proporciona un método y compuestos para producir intermediarios tioéster de oligopéptido utilizando reacciones de Fmoc que, a su vez, permiten estrategias de síntesis convergente para la síntesis química de polipéptidos mediante la utilización de dichos intermediarios.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido, que comprende: (a) ligar en una primera reacción un primer y un segundo oligopéptidos, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en la que el primer oligopéptido comprende un extremo C-terminal que presenta un grupo tioéster, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, en el que el segundo oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido, o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo, y en el que la ligación forma un primer producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, (b) ligar en una segunda reacción un tercer y un cuarto oligopéptidos, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en la que el tercer oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido, o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que comprende un tioéster, en el que el cuarto oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido, o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido, o el 1,3-aminotiol no protegido, y en el que la ligación forma un segundo producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido, o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido, o el 1,3-aminotiol no protegido, (c) transformar el precursor tioéster inactivo del primer producto de ligación oligopéptido de la etapa (a) en un tioéster, formando un tercer producto de ligación oligopéptido que presenta un extremo C-terminal que comprende un tioéster, y un extremo n-terminal que es sustancialmente no reactivo con el grupo tioéster, (d) desproteger el extremo N-terminal del segundo producto de ligación oligopéptido de la etapa (b), formando un cuarto producto de ligación que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con la cisteína no protegida, el 1,2-aminotiol no protegido, o el 1,3-aminotiol no protegido, y (e) ligar el tercer producto de ligación oligopéptido de la etapa (c) con el cuarto producto de ligación oligopéptido de la etapa (d), formando un quinto producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta un grupo tioéster C-terminal, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta una cisteína N-terminal no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido.

En un aspecto preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto olgiopéptido o polipéptido, que comprende además la etapa siguiente: (f) ligar el quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) con uno o más oligopéptidos adicionales, con la condición de que el quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) y el oligopéptido u oligopéptidos adicionales porte, o se encuentre preparado para portar, grupos N-terminales y C-terminales capaces de ligación química, en el que el grupo N-terminal capaz de ligación química comprende una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y en el que el grupo C-terminal capaz de ligación química comprende un tioéster.

En otro aspecto preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que el extremo N-terminal del quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) comprende un aminoácido N-terminal no protegido, o un aminoácido N-terminal protegido. En un aspecto más preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que el aminoácido N-terminal protegido es cíclico. En un aspecto más preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que el aminoácido N-terminal protegido comprende una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido.

En un aspecto preferente adicional, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que el extremo C-terminal del quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) comprende un aminoácido no protegido o un precursor tioéster inactivo.

En todavía otro aspecto preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que cualquiera de los oligopéptidos o de los productos de ligación oligopéptidos que presentan un precursor tioéster inactivo en el extremo C-terminal se define mediante la fórmula siguiente:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}(CH-R)-CO-O-CH[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo protector de azufre y -SR''; R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de alquilo C_{2-10}, arilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono, bencilo sustituido y heteroarilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono, y entre 1 y 4 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos pueden formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 ó 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

En otra realización preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que R' es un grupo protector de azufre.

En todavía otra realización preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que R' es -SR''. En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de etilo, t-butilo y fenilo sustituido.

En una realización preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que el producto oligopéptido o polipéptido se prepara según el procedimiento en la figura 10.

En una realización más preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que cada etapa se lleva a cabo en una solución seleccionada de entre el grupo que consiste de un solvente orgánico y una mezcla de solvente orgánico y acuoso.

En otra realización preferente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido en el que Y es -C(O)NH_{2}.

Todos los grupos Y de la presente invención son suficientemente aceptores de electrones para activar eficientemente el carboxiéster y permitir la transposición de O-acilo a S-acilo. Sin embargo, las variaciones en el grupo Y pueden presentar efectos durante la ligación. Por ejemplo, pueden sintetizarse dos modelos peptídicos de secuencia LYRAF-COO-CH(CH_{2}-SH)-Y: péptido A, en el que Y=CONH_{2} (carboxiamida) y péptido B, en el que Y=COO-CH_{2}-COONH_{2} (carboxiéster). Bajo condiciones de ligación idénticas, el péptido A genera aproximadamente 20% de carboxiéster hidrolizado, mientras que el péptido B, en el que el grupo éster presenta un efecto de aceptación de electrones más fuerte que la carboxiamida, produce aproximadamente 30% del carboxiéster hidrolizado. Por lo tanto, aunque todos los grupos Y de la presente invención incrementan la estabilidad del carboxiéster, algunos grupos Y presentan un efecto estabilizador mayor sobre el carboxiéster que los demás grupos Y de la presente invención.

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A. Reacción de ligación de oligopéptido

En la técnica de ligación química nativa original, por ejemplo tal como se describe en Dawson et al., y en Kent et al., el acoplamiento de fragmentos peptídicos podría tener lugar únicamente entre una cisteína N-terminal y un tioéster C-terminal. En Dawson et al. y en Kent et al., se proporciona un primer oligopéptido con una cisteína N-terminal que presenta una cadena lateral sulfhidrilo no oxidada, y se proporciona un segundo oligopéptido con un tioéster C-terminal. En la reacción de acoplamiento posterior, la cadena lateral sulfhidrilo no oxidada de la cisteína N-terminal se condensa con el tioéster C-terminal, produciendo un intermediario oligopéptido que une el primer y segundo oligopéptidos con un enlace \beta-aminotioéster. El enlace \beta-aminotioéster del intermediario oligopéptido seguidamente experimenta una reorganización intramolecular, produciendo un producto oligopéptido que une el primer y segundo oligopéptidos mediante un enlace amida.

En dicho esquema se presenta un problema en el caso de que se ensamble un oligopéptido o polipéptido a partir de tres o más fragmentos. En esta situación, por lo menos un fragmento presenta tanto una cisteína N-terminal como un tioéster C-terminal, creando de esta manera la posibilidad de autoligación, que bajo condiciones de reacción convencionales es bastante significativa debido a la estrecha proximidad entre los grupos intramoleculares reactivos. En vista de lo anterior, puede protegerse la cisteína N-terminal de un fragmento interno frente a dichas reacciones utilizando un grupo protector de tiazolidina cíclica, tal como han demostrado Gaertner et al., Proceedings of the 17th American Peptide Symposium, páginas 107 y 108 (San Diego, 9 a 14 de junio de 2001). Estas estrategias de grupo protector, sin embargo, no se encontraban disponibles anteriormente para ligaciones químicas con grupos auxiliares, tal como se da a conocer en Low et al. y en Botti et al.

Según la presente invención, se proporciona una nueva clase de grupos protectores heterocíclicos que incrementa significativamente la eficiencia de las ligaciones al impedir las autoligaciones en ligaciones asistidas por un grupo auxiliar. El funcionamiento de los grupos protectores heterocíclicos se ilustra en la figura 3 para una ligación de tres componentes. En la figura 3, el radical R^{4} debe estimular la apertura del anillo tiazolidina, R^{5} es hidrógeno o alquilo, R^{3} es hidrógeno o un grupo donador de electrones, y R^{6} es un línker alquilo con una amida o un aminoácido. El oligopéptido modificado con un tioéster heterocíclico protegido (102) presenta un grupo tioéster (106) y un grupo protector heterocíclico ejemplar (200). El tioéster (106) reacciona con la cisteína N-terminal (104) del oligopéptido (100) en un procedimiento similar al descrito por Dawson et al., Kent et al. y otros (citados anteriormente), proporcionando el producto de ligación oligopéptido (202) consistente de oligopéptido (100) y oligopéptido (102) conjugados mediante un enlace amida (204). El producto de ligación oligopéptido en esta etapa seguidamente se trata con una O-alcoxihidroxilamina (206) bajo condiciones ácidas para abrir el grupo protector heterocíclico (200), proporcionando un grupo sulfhidrilo terminal libre en el grupo auxiliar (212), que se une a la amina secundaria del aminoácido N-terminal (208), que en la presente ilustración es la glicina. Tras dicha desprotección, el siguiente oligopéptido modificado con tioéster (210) reacciona (214) con la amina N-terminal (208) en un procedimiento similar al de Low et al. y Botti et al. (citados anteriormente), proporcionando el producto intermediario (216). El grupo auxiliar (212) se elimina (220) mediante tratamiento con ácido, proporcionando el producto final (218). Preferentemente, dicha eliminación se lleva a cabo mediante tratamiento con HF o ácido trifluoroacético (TFA). Entre las condiciones ejemplares de eliminación se incluyen: (i) HF al 95% y p-cresol al 5%, (ii) TFA/bromotrimetilsilano, e (iii) TFA al 95%, triisopropilsilano (TIS) al 2,5%, y 2,5% de agua. Otras condiciones de eliminación resultarán evidentes para el experto en la materia. A menos que se indique lo contrario, dichas reacciones y aquéllas indicadas posteriormente tienen lugar a temperatura ambiente.

El grupo protector heterocíclico (200) puede formarse en el extremo N-terminal de un tioéster de oligopéptido mediante la síntesis, en primer lugar, del tioéster de oligopéptido con un grupo auxiliar (212), seguido de la ciclización del sulfhidrilo libre del grupo auxiliar con la \alpha-amina secundaria (208) del aminoácido terminal. Puede sintetizarse de varias maneras un tioéster de oligopéptido que presente un grupo auxiliar, incluyendo la alquilación del grupo amino mediada por halógeno o la aminación reductora. Alternativamente, el grupo protector heterocíclico puede formarse mediante la preparación de un monómero aminoácido totalmente protegido con el grupo protector heterocíclico preparado para el último ciclo de adición en la síntesis de un tioéster de oligopéptido deseado. Sin embargo, generalmente la síntesis se inicia con un tioéster de oligopéptido unido a una resina, tal como se muestra en las figuras 4 a 6.

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B. Síntesis en fase sólida de oligopéptidos

Los oligopéptidos preparados mediante los métodos descritos anteriormente también pueden prepararse en un soporte sólido adecuado. Puede seleccionarse un soporte de fase sólida adecuado basándose en el uso final deseado y en la conveniencia para diversos protocolos sintéticos. Por ejemplo, en la síntesis de la poliamida, un soporte de fase sólida útil puede ser una resina tal como el poliestireno (por ejemplo la resina PAM obtenida de Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), la resina POLYHIPE^{TM} (obtenida de Aminotech, Canada), la resina de poliamida (obtenida de Peninsula Laboratories), la resina de poliestireno injertada con polietilenglicol (TentaGel^{TM}, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania), la resina de polidimetilo-acrilamida (disponible de Milligen/Biosearch, California) o las perlas de PEGA (obtenidas de Polymer Laboratories).

Pueden prepararse oligopéptidos que presentan un tioéster C-terminal siguiendo procedimientos similares a los descritos en las referencias siguientes: Kent et al., patente US nº 6.184.344; Tam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:12485-12489, 1995; Blake, Int. J. Peptide Protein Res. 17:273, 1981; Canne et al., Tetrahedron Letters 36:1217-1220, 1995; Hackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7845-7850, 1997, o Hackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:10068-10073, 1999; Ingenito et al., J. Am. Chem. Soc. 121:11369-11374, 1999.

Pueden sintetizarse oligopéptidos en un soporte de fase sólida típicamente a una escala de 0,25 mmoles mediante la utilización de un procedimiento de neutralización in situ/activación con HBTU para la reacción de Boc, siguiendo un procedimiento similar al dado a conocer por Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40:180-193, 1992 (HBTU es hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio y Boc es terc-butoxicarbonilo). Cada ciclo sintético consiste de la eliminación de N^{\alpha}-Boc mediante un tratamiento de 1 a 2 minutos con TFA puro, un lavado de 1 minuto con un flujo de DMF, 10 a 20 minutos de acoplamiento con 1,0 mmol de Boc-aminoácido preactivado en presencia de DIEA, y un segundo lavado con un flujo de DMF (TFA es ácido trifluoroacético, DMF es N,N-dimetilformamida y DIEA es N,N-diisopropiletilamina). Los N^{\alpha}-Boc-aminoácidos (1,1 moles) se preactivan durante 3 minutos con 1,0 mmoles de HBTU (0,5 M en DMF) en presencia de un exceso de DIEA (3 mmoles). Tras cada etapa de acoplamiento, se determinan los rendimientos a partir de la medición de la amina libre residual con un ensayo convencional cuantitativo de ninhidrina, por ejemplo tal como se da a conocer en Sarin et al., Anal. Biochem. 117:147-157, 1981. Tras el acoplamiento de los residuos de Gln, se utiliza un lavado con un flujo de DCM antes y después de la desprotección utilizando TFA, con el fin de evitar la posible formación catalizada a alta temperatura (TFA/DMF) de pirrolidona. Opcionalmente, tras completarse el ensamblaje de la cadena, puede añadirse un grupo haloacetilo, tal como bromoacetilo, en un procedimiento similar al dado a conocer por Zuckerman et al., J. Am. Chem. Soc. 114:10646-10647, 1992, como ruta para sintetizar compuestos de la presente invención.

Los tioésteres de oligopéptido de la presente invención pueden sintetizarse utilizando reacciones de Fmoc o de Boc. En el caso de que se utilice una reacción de Fmoc, se utiliza un línker 3-carboxipropanosulfonamida de "retén de seguridad" para generar el tioéster. Los tioéster de oligopéptido indicados anteriormente preferentemente se sintetizan en una resina de ácido mercaptopropiónico-leucina asociada a tritilo (TAMPAL) preparada en un procedimiento similar al dado a conocer por Hackeng et al., 1999, o protocolo comparable. Se activó N^{\alpha}-Boc-Leu (4 mmoles) con 3,6 mmoles de HBTU en presencia de 6 mmoles de DIEA y se acopló durante 16 minutos a 2 mmoles de resina de p-metilbenzhidrilamina (MBHA) o equivalente. A continuación, se activaron 3 mmoles de ácido S-tritil-mercaptopropiónico con 2,7 mmoles de HBTU en presencia de 6 mmoles de DIEA y se acoplaron durante 16 minutos a resina Leu-MBHA. La resina TAMPAL resultante puede utilizarse como resina de partida para el ensamblaje de una cadena polipeptídica tras la eliminación del grupo protector tritilo con dos tratamientos de 1 minuto de triisopropilsilano al 3,5% y H_{2}O al 2,5% en TFA. El enlace tioéster puede formarse con cualquier aminoácido deseado mediante la utilización de protocolos estándares de acoplamiento de péptidos de neutralización in situ durante 1 hora, en un procedimiento similar al dado a conocer en Schnolzer et al. (citado anteriormente). El tratamiento del oligopéptido final con HF anhidro rinde los tioéster de oligopéptido activados C-terminalmente en ácido mercaptopropiónico-leucina (MPAL).

En una realización preferente, los tioésteres de oligopéptido se desprotegen y se cortan de la resina mediante tratamiento con HF anhidro durante 1 hora a 0ºC con p-cresol al 4% como secuestrador. Los grupos protectores 2,4-dinitrofenilo (DNP) de cadena lateral imidazol permanecen en los residuos de His debido a que el procedimiento de eliminación del DNP es incompatible con los grupos tioéster C-terminales. Sin embargo, el DNP se elimina gradualmente con tioles durante la reacción de ligación. Tras el corte, los tioésteres de oligopéptido pueden precipitarse en éter dietílico helado, disolverse en acetonitrilo acuoso y liofilizarse.

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C. Preparación de intermediarios tioéster de oligopéptido protegidos con grupos heterocíclicos Reacción de aminas N-terminales con aminoácidos protegidos

Los tioésteres de oligopéptido protegidos con grupos heterocíclicos se sintetizan mediante una diversidad de esquemas, tal como se ilustra en las figuras 4 a 6. En el Esquema 1, mostrado en la figura 4, se hace reaccionar una amina N-terminal libre del tioéster de oligopéptido (300) con un aminoácido protegido (302), que presenta un grupo auxiliar (-D-S-R^{7}), en una reacción de acoplamiento estándar (304), por ejemplo la de Schnolzer et al. (citado anteriormente), proporcionando un tioéster de oligopéptido (306) que presenta un grupo auxiliar (308) unido a la \alpha-amina. R^{9} es una cadena lateral de un aminoácido, diferente de la cadena lateral de la prolina. Preferentemente, R^{9} es una cadena lateral de aminoácido que no provoca ningún impedimento estérico, o la cadena lateral de la histidina. Más preferentemente, R^{9} es hidrógeno, metilo, hidroximetilo o la cadena lateral de la histidina. El tioéster de oligopéptido (312) se forma mediante desprotección selectiva (310) de la \alpha-amina y del grupo sulfhidrilo del grupo auxiliar. En una realización preferente, la desprotección selectiva (310) se consigue mediante el tratamiento suave con ácido, por ejemplo ácido trifluoroacético (TFA), bajo condiciones de reacción convencionales, por ejemplo según Green y Wuts (citado posteriormente), en presencia de un secuestrador, tal como triisopropilsilano (TIS), bajo la condición de que R^{8} es Boc o un grupo protector similar, y de que R^{7} es trifenilmetilo, es decir tritilo, o un grupo protector similar. Pueden encontrarse directrices para la selección de los grupos protectores amino y sulfhidrilo apropiados y de los grupos protectores N^{\alpha} para la desprotección selectiva en Greene y Wuts, Protecting Groups in Organic Chemistry, 3a edición (John Wiley & Sons, New York, 1999). Tras la desprotección, el tioéster de oligopéptido (312) se hace reaccionar con carbonilo sustituido (314) de manera que se forme el grupo protector heterocíclico (316).

Entre los grupos protectores R^{8} ejemplares se incluyen t-butilcarbamato (Boc), 9-fluorenilmetilcarbamato (Fmoc), 4-nitriofeniletilsulfonil-etiloxicarbonilo (NSC), 2,2,2-tricloroetilcarbamato (Troc), bromobencilcarbamato (BrZ), clorobencilcarbamato (CIZ) y similares. En una realización preferente, los grupos protectores R^{8} son Boc y Fmoc.

Entre los grupos protectores R^{7} ejemplares se incluyen bencilo, 4-metilbencilo, 4-metoxibencilo, tritilo, acetamidometilo, trimetilacetamidometilo, xantilo y similares. Resultarán evidentes para el experto en la materia grupos protectores adicionales que resultarán útiles en la presente invención.

Con respecto a los demás sustituyentes en las figuras, R^{1} y R^{2} se seleccionan para estimular la apertura del grupo protector heterocíclico bajo condiciones ácidas en presencia de un agente nucleofílico. En una realización preferente, R^{1} y R^{2} son, separadamente, hidrógeno, alquilo sustituido aceptor de electrones que presenta entre 1 y 3 átomos de carbono, alquilcarbonilo que presenta 2 ó 3 átomos de carbono, o arilcarbonilo que presenta entre 7 y 10 átomos de carbono.

D es un grupo de unión que, conjuntamente con un sulfhidrilo libre ("HS-D-"), en la presente memoria se denomina "grupo auxiliar". En un aspecto, D es un grupo alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo o cicloalquilo que presenta entre 2 y 16 átomos de carbono y entre 0 y 4 heteroátomos que: (i) mantiene el azufre del grupo heterocíclico estrechamente contiguo al nitrógeno del grupo heterocíclico tras la desprotección, con el fin de potenciar la reacción de reorganización de la ligación química nativa, e (ii) proporciona un enlace escindible del nitrógeno del grupo heterocíclico de manera que, tras la desprotección y el acoplamiento de un fragmento, se elimina el grupo auxiliar. En una realización preferente, en la forma de "HS-D", D mantiene el grupo sulfhidrilo a una distancia equivalente igual o inferior a entre 2 y 3 longitudes del enlace carbono-carbono del N^{\alpha} del aminoácido N-terminal del reactivo tioéster de oligopéptido, siendo los enlaces carbono-carbono los de un grupo alquilo lineal. En un aspecto preferente, el grupo auxiliar es un etiltiol.

R^{3} por sí solo es hidrógeno o un grupo donador de electrones que presenta entre 1 y 12 átomos de carbono y entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados de entre el grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Preferentemente, R^{3} por sí solo es hidrógeno o un grupo donador de electrones que presenta entre 1 y 8 átomos de carbono y entre 0 y 2 heteroátomos seleccionados de entre el grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre. Todavía más preferentemente, R^{3} por sí solo es hidrógeno, fenilo, fenilo sustituido donador de electrones, 2-picolilo o 4-picolilo o 2-picolilo o 4-picolilo sustituidos donadores de electrones. Todavía más preferentemente, R^{3} por sí solo es hidrógeno o fenilo sustituido con metoxi. Más preferentemente, R^{3} por sí solo es 4-metoxifenilo o 2,4-dimetoxifenilo.

R^{6} es alquilo que presenta entre 1 y 6 átomos de carbono o alquilarilo que presenta entre 6 y 8 átomos de carbono, -CH_{2}-CONH_{2}, -CH_{2}CH_{2}CONH_{2} o -(CH_{2})_{k}-CO-Xaa, en los que el subíndice k es un número entero igual a 1 ó 2 y Xaa es un aminoácido.

R^{9} es una cadena lateral de un aminoácido que no es prolina ni cisteína. Más preferentemente, R^{9} es una cadena lateral de un aminoácido que no es prolina, cisteína, valina, isoleucina ni treonina. Más preferentemente, R^{9} es hidrógeno, metilo, hidroximetilo o la cadena lateral de la histidina. Más preferentemente, R^{9} es hidrógeno o metilo.

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Reacción de oligopéptidos bromoacetilados con precursores de grupo auxiliar

En la figura 5 se muestra un segundo esquema (Esquema 2) para la síntesis de tioésteres de oligopéptido protegidos con un grupo heterocíclico. Este Esquema sigue aproximadamente el procedimiento dado a conocer por Botti et al. (citado anteriormente). Se hace reaccionar un tioéster de oligopéptido bromoacetilado (400) con etilamina S-protegida o aminotiofenilo S-protegido (402) o un grupo similar, proporcionando un tioéster de oligopéptido (404) con un grupo auxiliar (406), después de lo cual se elimina el grupo protector de sulfhidrilo (R^{7}) (408) con un tratamiento suave de ácido. En el caso de que R^{7} sea un grupo tritilo, R^{7} se elimina con TFA en presencia de un secuestrador tritilo, tal como TIS. La \alpha-amina del tioéster de oligopéptido (410) y el sulfhidrilo libre del grupo auxiliar se hacen reaccionar (412) con carbonilo (414), formando un tioéster de oligopéptido protegido con un grupo heterocíclico (416). Preferentemente, el carbonilo (414) es formaldehído, acetaldehído, acetona o similar. Más preferentemente, R^{1}=R^{2}, de manera que no se produzcan formas quirales. En algunas realizaciones, puede resultar deseable utilizar R^{1} y/o R^{2} como adyuvante de cromatografía de afinidad o de purificación. Por ejemplo, R^{1} o R^{2} puede ser biotina, digoxigenina o grupo de afinidad similar, conectado con un grupo de unión, por ejemplo biotín-(CH_{2})_{n}, o R^{1} o R^{2} puede ser un grupo hidrofóbico o hidrofílico diseñado para modificar el tiempo de retención cromatográfica para ayudar a la purificación. A continuación, el tioéster de oligopéptido protegido con grupo heterocíclico (416) se desprotege y se corta de la resina (418), por ejemplo mediante tratamiento con HF, proporcionando el producto final (420).

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Reacción de aminas N-terminales con aminoácidos que han sido derivatizados con un grupo auxiliar

En un tercer Esquema (Esquema 3) mostrado en la figura 6, el grupo protector heterocíclico se añade al tióster de oligopéptido mediante acoplamiento de un aminoácido derivatizado al que ya se ha unido dicho grupo. El tioéster de oligopéptido (500) que presenta una amina N-terminal libre se hace reaccionar con un aminoácido derivatizado (502) en una reacción de síntesis peptídica en fase sólida convencional, proporcionando el oligopéptido (504), después de lo cual se desprotege y se recorta (506) de la columna de síntesis, proporcionando el producto final (508). Puede prepararse aminoácido derivatizado (502) mediante varías rutas. En una realización preferente, el aminoácido derivatizado (502) se prepara sintetizando en primer lugar un intermediario que presenta un N\alpha con sustitución de un grupo auxiliar en la reacción de sustitución nucleofílica siguiente:

X-CH(R^{9})-COOR^{10} + R^{7}-S-D-NH_{2} - -> R^{7}-S-D-NH-CH(R^{9})-COOH

en la que X es halógeno, preferentemente bromo, y R^{10} es un grupo protector convencional o un soporte de fase sólida. El grupo sulfhidrilo del aminoácido N^{\alpha}-sustituido resultante puede obtenerse siguiendo protocolos convencionales (por ejemplo TFA/TIS, es decir sulfhidrilo tritilo-protegido), después de lo cual puede hacerse reaccionar con un formaldehído sustituido, CO(R^{1})(R^{2}) y la N^{\alpha}-amina, proporcionando el aminoácido derivatizado (502). Alternativamente, el intermediario anteriormente indicado puede prepararse mediante sustitución nucleofílica o mediante aminación reductora, tal como se muestra en el esquema de reacción siguiente:

H_{2}N-CH(R^{9})-COOR^{10} + R^{7}-S-D-X - -> R^{7}-S-D-NH-CH(R^{9})-COOH

en la que X es un halógeno para la ruta de sustitución nucleofílica y X es un carbonilo para la síntesis mediante aminación reductora. El experto en la materia apreciará que, al preparar el producto anteriormente indicado mediante aminación reductora (en el caso de que X sea un carbonilo), se extiende la cadena del radical D del producto en un solo átomo de carbono. Por consiguiente, el radical D en el material de partida del esquema anteriormente indicado es una unidad de metileno, o de etileno en algunas realizaciones, y un enlace directo en otras realizaciones.

En una realización preferente, los intermediarios tioésteres de oligopéptido protegidos con grupo heterocíclico se utilizan en la ligación química nativa bajo condiciones similares a las indicadas en Hackeng et al., 1999, o bajo condiciones similares. Se añade tampón fosfato 0,1 M (pH 8,5) que contiene guanidina 6 M, bencilmercaptano al 2% (v/v) y tiofenilo al 2% (v/v) a los péptidos secos que deben ligarse, proporcionando una concentración final de péptidos de entre 1 y 3 mM a aproximadamente pH 7. En una realización preferente, la reacción de ligación puede llevarse a cabo en una cámara de calentamiento a 37ºC bajo agitación continua y puede agitarse con vórtex periódicamente para equilibrar los aditivos tiol. Puede realizarse un seguimiento de la reacción para el grado de completitud mediante MALDI-MS o HPLC y MS de ionización por electropulverización.

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Desprotección de las aminas N-terminales y eliminación de los grupos auxiliares

Tras completar o detener una reacción de ligación química nativa, el anillo heterocíclico N-terminal del producto puede abrirse mediante tratamiento con un agente desprotector que sea nucleofílico bajo condiciones ácidas. Entre dichos agentes se incluyen determinadas O-alquilhidroxilaminas, hidrazinas y reactivos similares. Más preferentemente, el anillo heterocíclico N-terminal del producto se abre mediante tratamiento con O-metilhidroxilamina (0,5 M) a un pH de entre 3,5 y 4,5 durante 2 horas a 37ºC, después de lo cual se añade un exceso de 10 veces de Tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) a la mezcla de reacción para reducir completamente cualquier constituyente de reacción oxidante antes de la purificación del producto. El método de purificación preferente es la HPLC preparativa. Preferentemente, las fracciones que contienen el producto de ligación se identifican mediante MS de electropulverización, se agrupan y se liofilizan. Entre otros agentes reductores que pueden utilizarse en lugar de Tris-(2-carboxietil)-fosfina se incluyen \beta-mercaptoetanolamina, ditiotreitol y similares.

Con respecto nuevamente a las estrategias de desprotección, pueden abrirse los anillos de las tiazolidinas N-terminales con una diversidad de agentes nucleofílicos bajo condiciones ácidas, tal como se ha comentado anteriormente. La apertura de anillos bajo condiciones ácidas depende de los sustituyentes C2 (Wohr et al., J. Am. Chem. Soc. 118:9218, 1994). Pueden utilizarse los agentes siguientes como agentes tiazolidina de apertura de anillo: O-metilhidroxilamina y otros derivados hidroxilamina. También puede utilizarse hidrazina o cualquiera de sus derivados, así como tiosemicarbazidas, que son nucleofílicas bajo condiciones ácidas, aunque esta familia de reactivos es generalmente más tóxica que la primera, y el producto de condensación (hidrazona, tiosemicarbazona, respectivamente) es menos estable que la oxima. Preferentemente, se utiliza Tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP), o un agente reductor similar, en la reacción de desprotección para reducir rápida y estequiométricamente la mayoría de los péptidos y sulfhidrilos, incluso bajo condiciones ácidas (Burns et al., J. Org. Chem. 56:2648-2650, 1991). Preferentemente, se utiliza O-metoxihidroxilamina como el agente tiazolidina de apertura de anillos. La O-metoxihidroxilamina reacciona con la función aldehído enmascarada en el anillo tiazolidina, formando una oxima, tal como se muestra a continuación:

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en la que R^{3} es tal como se ha definido anteriormente, y R^{4} y R^{5} pueden se r, por ejemplo, hidrógeno, alquilo, amida, éster, halógeno, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, todos opcionalmente sustituidos. En una realización preferente, R^{4} estimula la desprotección del anillo tiazolidina. Dichos sustituyentes resultarán evidentes para el experto en la materia. El experto en la materia apreciará que también pueden utilizarse otros agentes para desproteger los grupos protectores tiazolidina de la presente invención.

Pueden eliminarse grupos auxiliares tras cada etapa de ligación, o pueden eliminarse todos simultáneamente tras completar la síntesis del producto polipéptido final. Dependiendo de la estructura del grupo de unión "D", se encuentra disponible una diversidad de procedimientos de eliminación. En la forma preferente de D que dona electrones al N^{\alpha} del aminoácido contiguo, la eliminación del grupo auxiliar puede realizarse con facilidad utilizando condiciones ácidas, tales como las utilizadas en la síntesis convencional de péptidos para la desprotección de cadenas laterales. Entre los ácidos ejemplares para dicho corte se incluyen HF, TFA, ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA) y similares. En algunas realizaciones, pueden utilizarse agentes secuestradores convencionales, por ejemplo p-cresol al 5%, para unirse o reaccionar con arilo, tiol u oros grupos reactivos, y para prevenir las reacciones secundarias no deseadas con cadenas laterales de aminoácido.

Tras completar la síntesis y purificarse el producto final, el producto polipéptido final puede plegarse nuevamente mediante técnicas convencionales similares a las descritas por Creighton, Meth. Enzymol. 107:305-329, 1984; White, Meth. Enzymol. 11:481-484, 1967; Wetlaufer, Meth. Enzymol. 107:301-304, 1984; Misawa et al., Biopolymers 51:297-307, 1999; Anfinsen, Science 181:223-230, 1973, y similares. Preferentemente, se pliega nuevamente un producto final mediante oxidación al aire mediante disolución del producto liofilizado reducido (a aproximadamente 0,1 mg/ml) en hidrocloruro de guanidina 1 M (o agente caotrópico similar) con Tris 100 mM, metionina 10 mM, a pH 8,6. Tras la agitación suave durante la noche, el producto nuevamente plegado se aisló mediante HPLC de fase reversa aplicando protocolos convencionales.

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D. Preparación de grupos carboxitioéster con disulfuro protegido

Puede prepararse 2-mercapto-carboxiéster con disulfuro protegido de un intermediario oligopéptido mediante una diversidad de rutas, incluyendo los esquemas siguientes (figura 10 A, B, C, D): A) formación de mercapto-carboxiésteres con 2-S-disulfuro protegido a partir de una resina de 2-mercapto-carboxiéster de péptido con S protegido, encontrándose el tiol de la resina protegido con un grupo protector lábil frente a ácidos moderadamente a muy fuertes, seguido de la desprotección del grupo tio previamente al recorte de la resina de síntesis y de la formación de un disulfuro previa o concomitantemente al corte. B) Adición de un 1-hidroxi-1-carboxi-etano 2-S-disulfuro-protegido (alternativamente denominado ácido 2-hidroxi-propanoico 3-S-disulfuro-protegido) a la resina, y después, tras la unión del primer aminoácido seleccionado mediante un enlace éster, una síntesis peptídica en fase sólida Fmoc estándar proporciona el péptido deseado. En primer lugar, se acopla un precursor tiol protegido, PG-S-(CH_{2})_{n}-CH(OH)COOH utilizando una reacción de carbodiimida (DCC, o DIC preferentemente) con un agente activado suave, tal como triclorofenol o N-hidroxisuccinimida a una resina de síntesis derivatizada con amino. A continuación, la resina puede funcionalizarse con el primer aminoácido de la secuencia utilizando un acoplamiento catalizado por base, tal como HBTU/DIEA con DMPA. C) Acoplamiento de un carboxiéster de disulfuro protegido del primer monómero aminoácido a la resina. Preferentemente, se forman carboxitioésteres con disulfuro protegido previamente al recorte del intermediario de la resina de síntesis, y D) directamente del derivado cisteína S-protegido seleccionado (de disulfuro protegido y no protegido) mediante tratamiento con NaNO_{2} en medio ácido mediante transformación de análogo de un nitrógeno en un grupo OH.

Más generalmente, se acopla un precursor tiol protegido, PG-S-(CH_{2})_{n}-CH(OCO-Xaa_{1}-Fmoc)COOH utilizando una reacción convencional a una resina de síntesis derivatizada con amino:

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Tras acoplar el aminoácido final, se elimina el Fmoc, seguido de la eliminación del grupo protector, PG, con tratamiento suave de ácido. A continuación, puede formarse un 2-mercapto-carboxiéster de péptido de S-disulfuro protegido según la figura 10A. Preferentemente, PG es monometoxitritilo y se elimina bajo condiciones convencionales, por ejemplo utilizando ácido trifluoroacético al 1-2% y TIS. La eliminación de PG proporciona el compuesto indicado posteriormente, que seguidamente se trata con un reactivo formador de disulfuros, proporcionando el carboxitioéster final con disulfuro protegido. Entre los reactivos formadores de disulfuros se incluyen disulfuros simétricos, tales como disulfuros aromáticos simétricos, disulfuros impedidos de alquilo simétricos y similares. Más particularmente, entre los reactivos formadores de disulfuros se incluyen bitiobis(piridina), ditiobis(5-nitropiridina), ditibios-t-butilo, R''-SO-S-R'' y similares.

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Alternativamente, PG puede ser picolilo, ACM, fenacilo u otros grupos protectores estables frente a ácidos conocidos por el experto en la materia.

El precursor inicial (I) se produjo de la manera siguiente. Se trató cloroalanina con nitrato sódico o nitrato potásico bajo condiciones ácidas para convertir la \alpha-amina en un hidroxilo, tal como se muestra a continuación:

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A continuación, se sustituyó el cloro por un azufre protegido o por un disulfuro protegido, por ejemplo mediante desplazamiento nucleofílico. Preferentemente, se sustituye el cloro por un mercapto que genera un grupo protector de azufre lábil, tal como 4-metoxitritil-mercaptano, después de lo cual se hace reaccionar el producto con un aminoácido activado protegido con Fmoc, tal como Fmoc-AA-OPFP o Fmoc-AA-OSu, proporcionando el compuesto (I).

Tras la utilización del compuesto (II) en una reacción de ligación, se generó un tioéster libre mediante tratamiento del producto de ligación con un agente reductor, preferentemente un agente reductor tiol, tal como bencenotiol. El agente reductor libera el grupo tiol, que espontáneamente forma un tioéster.

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IV. Oligopéptidos, polipéptidos y proteínas

En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; C* es un carbono quiral en configuración R o S y sustancialmente libre de la configuración contraria; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo protector de azufre, -SR'' e hidrógeno; R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de alquilo C_{2-10}, arilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono, bencilo sustituido y heteroarilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono y entre 1 y 4 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)-p-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos, un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

En otra realización preferente, la presente invención proporciona un compuesto en el que R' es un grupo protector de azufre.

En todavía otra realización preferente, la presente invención proporciona un compuesto en el que R' es -SR''. En todavía otra realización preferente, la presente invención proporciona un compuesto en el que R' es hidrógeno. En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto en el que R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de etilo, t-butilo y fenilo sustituido.

En otra realización preferente, la presente invención proporciona un compuesto en el que Y es -C(O)NH_{2}.

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}(CH-R)-CO-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un grupo protector de azufre; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(R^{e})_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos, un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-NH-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m; m es un número entero entre 2 y 200; n es un número entero entre 1 y 10; R es una cadena lateral de un aminoácido; R' es un grupo protector de azufre; Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)p-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; cada grupo R^{c} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2}, -S(O)_{2}
NH_{2}, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario; p es un número entero entre 1 y 2; R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(R^{e})_{2}, -OR^{e} y -SR^{e}; cada R^{e} es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, -SO_{2}-alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}; alternativamente, en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, pueden formar conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos, un anillo heterocíclilo no aromático de 5 a 6 elementos que contiene entre 1 y 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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V. Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de LYRAF-O-COCH(CH_{2}-S-S-Pyr)CONH_{2} (figura 10A)

Se hinchó resina amida Rink (Novabiochem, 0,61 mmoles/g, 0,1 mmoles) en DMF. Tras la eliminación del Fmoc con una solución al 20% de piperidina en DMF, se activó MmtSCH_{2}CH(OH)COOH (0,5 mmoles) con N-hidroxisuccinimida (1,2 eq.) y diisopropilcarbodiimida (1,2 eq.) y se acopla a la resina durante la noche.

Una muestra de la resina proporcionó una reacción de ninhidrina negativa. Se añadió la caperuza con BocGlyOSu.

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El primer aminoácido Fmoc (1 mmol) se activó con HBTU/DIEA en presencia de una cantidad catalítica de DMAP y se acopló a la resina durante 1 hora. Resultó necesario un acoplamiento doble. A continuación, se llevó a cabo la SPPS manualmente, utilizando un exceso de 10 veces de cada aminoácido activado con Fmoc y se realizó un seguimiento mediante la prueba de la ninhidrina.

Tras el ciclo final, se cortó el Fmoc y el péptido-resina se lavó sucesivamente con DMF, DCM, DCM y MeOh y se secó.

A continuación, se suspendió en una mezcla de TFA/TIS/H_{2}O: 95/2,5/2,5 que contenía 5 equivalentes de 2,2'-ditio-bis-(piridina)* (0,5 mmoles, 110,2 mg) bajo agitación a temperatura ambiente. Tras 2 horas 45 minutos, la resina se separó mediante filtración y se lavó con TFA. Se añadió éter dietílico y el sólido se recogió mediante filtración, se lavó con éter dietílico y se secó in vacuo.

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Ejemplo 2 Preparación de ácido cloroláctico, de beta-cloroalanina a ácido cloroláctico (figuras 10B, 10C)

Siguiendo un procedimiento similar al descrito en Morin et al., Synthesis 479-480, 1987, se disolvió beta-cloroalanina (PM=160, 1 g, 6,25 mmoles) en 20 ml de ácido sulfúrico acuoso 1 N y la solución se agitó a 4ºC. Se añadió lentamente, gota a gota, una solución recién preparada de nitrito sódico (PM=69, 1,36 g, 19,75 mmoles) en agua (21 ml), durante 45 minutos, manteniendo la temperatura a 4ºC. Tras la adición, la mezcla se dejó bajo agitación durante 1 hora a 4ºC, y después durante la noche a temperatura ambiente.

Se añadió hidrogenocarbonato sódico sólido para elevar el pH a un valor superior a 2. A continuación, la solución se saturó con cloruro sódico y se extrajo con acetato de etilo (6x40 ml), manteniendo el pH entre 2 y 3 con ácido sulfúrico 1 N. Tras secar con sulfato sódico, se evaporó la fase orgánica, proporcionando un sólido amarillo pálido. Se lavó con hexano y se filtró. Se aislaron 550 mg de cristales blancos.

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Ejemplo 3 Preparación de ácido láctico S-Mmt (ácido 3S-4'-metoxitritil-2-hidroxi-propanoico) mediante reacción de ácido cloroláctico con Mmt-SH (figura 10B, 10C)

Siguiendo un procedimiento similar al de Hope et al., J. Chem. Soc. (C), 2475-2478, 1979, se añadió una solución de ácido cloroláctico (PM=125, 1,5 g, 12 mmoles) e hidróxido sódico (480 mg, 12 mmoles) en etanol caliente (10 ml, 50ºC) a una solución bajo agitación de 4-metoximetil-mercaptano (PM=306,4, 3,68 g, 12 mmoles) e hidróxido sódico (480 mg, 12 mmoles) en etanol caliente (10 ml, 50ºC). Se enrasó el volumen a 60 ml con etanol. La mezcla se calentó bajo reflujo durante 8 horas, y después se dejó bajo agitación a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el solvente, se disolvió el residuo sólido en agua y se llevó el pH a 4. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (4x50 ml). Los extractos orgánicos agrupados se secaron sobre sulfato de magnesio y el solvente se eliminó bajo presión reducida, proporcionando 4,52 g de un aceite naranja que se solidificó a temperatura ambiente. Se lavaron 2,5 g del material crudo con hexano, se filtraron y se secaron. Se recuperaron 1,4 g de una espuma sólida amarilla.

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Ejemplo 4 MmtSCH_{2}CH(OH)COOH + FmocPheOPfp

A una solución bajo agitación de MmtSCH_{2}CH(OH)COOH (PM=394, 100 mg, 0,25 mmoles) y FmocPheOPfp (PM=553,5, 144 mg, 0,26 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió gota a gota DIEA (0,75 mmoles, 131 \mul). Tras 2 horas a temperatura ambiente, se completó la reacción según se confirmó mediante análisis de HPLC.

Se añadió agua a la mezcla de reacción y el pH se llevó a 3,5/4 con KHSO_{4}. La mezcla se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos agrupados se secaron sobre sulfato de magnesio y el solvente se eliminó bajo presión reducida, proporcionando 250 mg de producto crudo. Tras la purificación mediante HPLC, se recuperaron 80 mg de producto puro.

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Ejemplo 5 Preparación de péptido-COO-CH(-CH_{2}-S-S-t-But)CONH_{2} (figura 10D)

Se hinchó resina amino PEGA (0,2 mmoles) en DMF. La resina se trató con una solución al 10% de DIEA en DMF (2x2 minutos), y después se lavó con DMF. Se activó línker Rink-Fmoc (PM=539,2 mmoles, 1,08 g) con HBTU/DIEA y se acopló a la resina. Tras 1 hora, la resina se drenó y se lavó con DMF. Se repitió el acoplamiento. Tras 1 hora, la resina se drenó y se lavó con DMF. Una muestra de resina proporcionó una reacción de ninhidrina negativa.

Tras la eliminación del Fmoc con una solución al 20% de piperidina en DMF (2x3 minutos), se activó FmocCys(t-Bu-tio)OH (PM=432,2 mmoles, 864 mg) con HBTU/DIEA y se acopló a la resina durante 1 hora. La resina se drenó y se lavó con DMF. Una muestra de resina proporcionó una reacción de ninhidrina negativa.

Tras la eliminación del Fmoc, la resina se lavó con agua y se hinchó en agua durante 10 minutos. Se drenó y después se suspendió en 2 ml de una solución fría 0,5 M de HCl (Harris et al., J. Am. Chem. Soc. 110:940-949, 1988). Se añadió 1 ml de una solución recién preparada de KNO_{2} 2,8 M (PM=85,11, 238,3 mg) a 0ºC gota a gota, durante 20 minutos, bajo agitación, a la resina. Tras la adición, se dejó reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente bajo agitación.

A continuación, se drenó la resina, se lavó con agua y después con una solución saturada de Na_{2}CO_{3}. Se drenó y se añadió una solución fresca de Na_{2}CO_{3}. La resina se suspendió en dicha solución durante 20 minutos. A continuación, se drenó, se lavó con agua y después con DMF. Una muestra de la resina proporcionó una reacción de ninhidrina negativa.

El primer aminoácido-Fmoc (2 mmoles) se activó con HBTU/DIEA en presencia de una cantidad catalítica de DMAP y se acopló a la resina durante 1 hora. Resultó necesario el acoplamiento doble. A continuación, se llevó a cabo manualmente la SPPS utilizando un exceso de 10 veces de cada aminoácido-Fmoc activado y se realizó el seguimiento con la prueba de ninhidrina.

Tras el ciclo final, se cortó el Fmoc y el péptido-resina se lavó en primer lugar con DMF y después con DMC sin secado. A continuación, se suspendió en una mezcla de TFA/TIS/H_{2}O: 90/5/5 bajo agitación a temperatura ambiente. Tras 1 hora 30 minutos, la resina se separó mediante filtración y se lavó con TFA. Se añadió éter dietílico y se recogió el sólido mediante filtración, se lavó con éter dietílico y se secó in vacuo.

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Ejemplo 6 Preparación de péptido-COOCH(-CH_{2}-SHC)ONH_{2} mediante BrCH_{2}COCOOH

Se hinchó resina amida Rink (Novabiochem, 0,61 mmoles/g, 0,18 mmoles, 300 mg) en DMF durante 10 minutos y después se lavó con DMF. Tras la eliminación del Fmoc con una solución al 20% de piperidina en DMF (2x3 minutos, se activó ácido bromopirúvico (PM=166,96, 1,8 mmoles, 300 mg) con 1,5 eq. de DCC (PM=206,33, 2,7 mmoles, 557 mg) y 2 eq. de N-hidroxisuccinimida (PM=115,09, 3,6 mmoles, 414 mg) en 3,6 ml de DMF durante 20 minutos, después la mezcla se añadió a la resina. Tras 3 horas, la resina se drenó y se lavó con DMF. Una muestra de la resina proporcionó una reacción de ninhidrina negativa.

La resina se trató con una solución de trifenilmetil-mercaptano (PM=276,40, 0,9 mmoles, 249 mg) y DIEA (PM=129,25, d=0,742, 0,9 mmoles, 156 \mul) en 1,8 ml de DMF durante 1 hora. A continuación, se drenó, se lavó con DMF y seguidamente con THF. La resina se suspendió en THF durante 10 minutos, después se trató durante la noche con una solución de LiBH_{4} (PM=21,78, 0,5 mmoles, 11,8 mg) en 1,1 ml de THF. La resina se drenó, se lavó con THF y después con DMF.

El primer aminoácido-Fmoc se activó con DCC y DMAP y se acopló a la resina durante 2 horas. El acoplamiento se repitió durante 1 hora. A continuación, la SPPS transcurrió con la activación habitual de los aminoácidos-Fmoc utilizando HBTU/DIEA y se realizó el seguimiento utilizando el ensayo de ninhidrina.

Tras el último ciclo, se escindió el Fmoc, el péptido-resina se lavó respectivamente con DMF, DCM, DCM/MeOH 50/50 y se secó. A continuación, se trató con una mezcla de TFA/TIS/H_{2}O: 90/5/5 bajo agitación a temperatura ambiente. Tras 1 hora 30 minutos, la resina se separó mediante filtración y se lavó con TFA. Se añadió éter dietílico y el sólido se recogió mediante filtración, se lavó con éter dietílico y se secó in vacuo.

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Ejemplo 7 Ligación multietapa - LYRAN-COSR^{6} + CLYRAFCOOCH(-CH_{2}-S-S-t-But)CONH_{2} + CYAKYAKL (figuras 8a a 8d)

Se disolvieron 0,30 mg de LYRAN-COSR^{6} (PM=822, 0,36 \mumoles) y 0,35 mg de CLYRAFCOOCH(CH_{2}-S-S-t-But)CONH_{2} (PM=963, 0,36 \mumoles) en 60 \mul de tampón de ligación (guanidina-HCl 6 M, fosfato sódico 0,2 M, pH=7,5) (figura 8a).

A la mezcla se añadió 1 \mul de una solución madre de tiofenol (1 \mul de tiofenol + 7 \mul de tampón de ligación), proporcionando 0,2% de tiofenol. A continuación, el pH se ajustó a 6,5. La reacción prácticamente había finalizado tras 1 hora (en más del 90%; figuras 8b y 8c, transcurrida 1 hora).

Se añadieron 1,5 eq. de CYAKYAKL (PM=958, 0,51 mg) y 0,9 \mul de tiofenol (al 2% en total) a la mezcla de ligación y el pH se ajustó a 6,5 (figura 8d, que muestra la primera ligación tras 1 hora, superpuesta a un curso temporal (1 hora, 4 horas y toda la noche) de la segunda ligación).

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Ejemplo 8 Ligación de LYRAFCOO-CH(-CH_{2}-S-S-t-But)-CONH_{2} + CYAKYAKL (figura 11) y de LYRAG(-S-S-t-Buyt) + CYAKYAKL (figura 12)

Estas dos reacciones adicionales de ligación ejemplares se ilustran en la figura 11 (para LYRAFCOO-CH(CH_{2}-SS-t-But)-CONH_{2} + CYAKYAKL, a T=0 y tras la reacción de toda la noche) y en la figura 12 (para LYRAG(-S-S-t-But) + CYAKYAKL, a T=0 y tras 4 horas y reacción durante la noche con tiofenol al 2% a pH 6,5, tiofenol al 2% + bencilmercaptano al 1% a pH 6,5 y tiofenol al 2% + tributilfosfina al 2% a pH 6,5).

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Ejemplo 9 Producto crudo de HPLC de la escisión de LYRAF(-S-S-t-But) (figura 9)

La síntesis del péptido modelo LYRAF-COO-CH(CH_{2}-S-S-t-But)-CO-NH_{2} permitió la separación de 2 picos de abundancia relativa diferente: pico 1 (diastereómero 1)-68,5% y pico 2 (diastereómero 2)-31,5% del material deseado, con MS idéntica (figura 9). Se purificó y se ligó cada diastereómero bajo las mismas condiciones con un péptido de cisteína N-terminal: el diastereómero 1 proporcionó 17,5% del producto hidrolizado, mientras que el diastereómero 2 (isómero de baja abundancia) proporcionó 13,8% del producto hidrolizado. Por lo tanto, el producto más inestable era el predominante (diastereómero 1). Lo anterior demuestra la utilidad de utilizar compuesto enantioméricamente puro respecto al racemato para reducir la reacción colateral. En efecto, mejoras incluso moderadas del péptido modelo pequeño en el que la ligación es generalmente muy rápida pueden conducir a una diferencia más significativa durante la ligación más lenta de fragmentos más grandes.

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Ejemplo 10 Ligación de NnyRantes + C-Rantes (figuras 13 y 14)

Con tributilfosfina. Se disolvieron 3 mg de Nny-Rantes (PM=4.016, 0,75 \mumoles) y 3 mg de C-Rantes (PM=4.097, 0,73 \mumoles) en 200 \mul de tampón de ligación (HCl de guanidina 6 M, fosfato sódico 0,2 M, pH=7,5). A la mezcla se añadió sucesivamente tiofenol al 2% (4 \mul) y 10 \mul de una solución de tributilfosfina/isopropanol (50 \mul/50 \mul). A continuación, se ajustó el pH a 7,00. La figura 13 ilustra la reacción en T=0 y tras 2,5 horas (reacción 1).

Sin tributilfosfina. Se disolvieron 0,4 mg de Nny-Rantes (PM=4.016, 0,01 \mumoles) y 0,4 mg de C-Rantes
(PM=4.097, 0,098 \mumoles) en 100 \mul de tampón de ligación (HCl de guanidina 6 M, fosfato sódico 0,2 M, pH=7,5). Se añadió tiofenol al 2% (2 \mul) a la mezcla y se ajustó el pH a 7,00. La figura 13 ilustra la reacción en T=0 y tras 16 horas (reacción 2).

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Ejemplo 11 Evaluación de diversos grupos aceptores de electrones

Se han sometido a ensayo grupos aceptores de electrones alternativos para su capacidad de incrementar los rendimientos de la reacción de ligación. Típicamente se midieron los rendimientos como la proporción, en porcentaje, del producto de hidrólisis (Pep1COOH) y el producto ligado. Con el fin de minimizar las reacciones colaterales, se seleccionó el grupo que proporcionaba la proporción mínima.

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Ejemplo 12 Síntesis de proteína 1 de transición nuclear de espermátide fosforilada

La proteína 1 de transición nuclear de espermátide (SPT1, nº de acceso Swiss Prot P22613) es una proteína de 54 residuos presente en el esperma ovino y que se ha informado que se encuentra fosforilado. Uno de los sitios fosforilados es la serina en la posición ocho. Para obtener la proteína de longitud completa, con la secuencia siguiente:

STSRKLKS(PO_{3}H_{2})QGTRRGKNRTPHKGVKRGCSKRRKYRKSSLKSRKRCDDANRNFRSHL

se sintetizó el Fragmento 1 utilizando una reacción y protección estándares de Fmoc, a escala de 0,1 mmoles, partiendo de una resina PEGA preparada tal como en el Ejemplo 5. Se introdujo el primer aminoácido en la resina después del línker, la glicina, 10 equivalentes de la sustitución de resina, en forma de éster activado con HBTU/DIAE en presencia de 0,1 equivalentes de DMAP. Se introdujo la serina en la posición 8 en forma de residuo Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)OH protegido fosforilado (disponible comercialmente). Se llevó a cabo el recorte de la resina en TFA/TIS/H_{2}O (95/2,5/2,5).

El fragmento intermediario 1:

STSRKLKS(PO_{3}H_{2})QGTRRGKNRTPHKGVKRG-CaOOCH(CH_{2}-S-S-t-butil)-CONH_{2}

se purificó mediante RP-HPLC preparativa.

El fragmento 2:

CSKRKYRKSSLKSRKRCDDANRNFRSHL

se preparó mediante reacción química estándar de Boc y tras el corte con HF, se purificó mediante RP-HPLC preparativa. Los fragmentos 1 y 2 se ligaron de la manera siguiente: se disolvieron 0,5 mg de fragmento 1 (PM: 3.192,71, 0,015 \mumoles) y 1,6 mg de fragmento 2 (PM: 3.440,98, 0,045 \mumoles) en 200 \mul de tampón de ligación (HCl de guanidina 6 M, fosfato sódico 0,2 M, pH=7,5). Se añadió tiofenol al 2% (4 \mul) a la mezcla y se ajustó el pH a 6,5. Tras 12 horas, se analizó la solución de ligación mediante RP-HPLC y mediante cromatografía de exclusión por tamaños. La RP-HPLC confirmó la desaparición del fragmento 1. La recolección del pico principal y el análisis mediante espectroscopía de masas confirmó la coelución del fragmento 2 y el producto ligado. Se estimó que el fragmento 1 hidrolizado representaba 12,5% de la forma éster inicial (figura 15). Se utilizó la cromatografía de exclusión por tamaño para resolver el fragmento 2 no reaccionado del material de longitud completa y para la purificación del material final (figura 16). La espectroscopía de masas confirmó la naturaleza de los dos productos (figura 17).

Claims

1. Compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-O-C*H[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que:

: Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m;

: m es un número entero entre 2 y 200;

: n es un número entero entre 1 y 10;

: C* es un carbono quiral en configuración R o S, y sustancialmente libre de la configuración contraria;

: R es una cadena lateral de un aminoácido;

: R' es -SR'',

: Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de Rc, alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc, -C(O)-Rd, -S(O)p-alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos Rc; cada grupo Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH2, -C(O)-NHHN2, -S(O)2NH2, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario;

: p es un número entero entre 1 y 2;

: R^{d} es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)2, ORe y -SRe;

: cada Re es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y -SO2-alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc; alternativamente,

: en el caso de que se encuentren presentes dos grupos Re, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos puede formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene entre 1 y 3 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y

: en el que R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de etilo, t-butilo y fenilo sustituido.

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2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que Y es -C(O)NH_{2}.

3. Compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que:

: Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m;

: m es un número entero entre 2 y 200;

: n es un número entero entre 1 y 10;

: R es una cadena lateral de un aminoácido;

: R' es un grupo protector de azufre;

: Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de Rc, alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc, -C(O)-Rd, -S(O)p-alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos Rc; cada grupo Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH_{2}, -C(O)-NHNH_{2}, -S(O)_{2}NH_{2}, hidroxilamina sustituida y no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario;

: p es un número entero entre 1 y 2;

: Rd es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)2, ORe y -SRe;

: cada Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, -SO2-alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc; alternativamente,

: en el caso de que se encuentren presentes dos grupos Re, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos pueden formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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4. Compuesto de fórmula:

Xaa_{i}- ... -Xaa_{m}-(CH-R)-CO-NH-N[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que:

: Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m;

: m es un número entero entre 2 y 200;

: n es un número entero entre 1 y 10;

: R es una cadena lateral de un aminoácido;

: R' es un grupo protector de azufre;

: Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{e}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-}3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos Rc; cada grupo Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH2, -C(O)-NHNH2, -S(O)2NH2, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario;

: p es un número entero entre 1 y 2;

: Rd es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)2, -ORe y -SRe;

: cada Re es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3 sustituido con 0 a 3 grupos Rc, -SO2-alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc; alternativamente,

: en el caso de que se encuentren presentes dos grupos R^{e}, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos pueden formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, cada uno seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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5. Método para la preparación de un producto oligopéptido o polipéptido, que comprende:

(a): ligar en una primera reacción un primer y un segundo polipéptido, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en el que dicho primer oligopéptido comprende un extremo C-terminal que presenta un grupo tioéster, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicho grupo tioéster,

: en el que dicho segundo oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido, o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo,

: en el que dicho segundo oligopéptido es un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3,

: en el que dicha ligación forma un primer producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo C-terminal que presenta un precursor tioéster inactivo, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicho grupo tioéster;

(b): ligar en una segunda reacción un tercer y un cuarto oligopéptidos, presentando cada uno un extremo N-terminal y un extremo C-terminal, en el que dicho tercer oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que comprende un tioéster, en el que

: dicho cuarto oligopéptido comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicha cisteína no protegida, dicho 1,2-aminotiol no protegido o dicho 1,3-aminotiol no protegido, y

: en el que dicha ligación forma un segundo producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicha cisteína no protegida, dicho 1,2-aminotiol no protegido o dicho 1,3-aminotiol no protegido;

(c): transformar dicho precursor tioéster inactivo de dicho primer producto de ligación oligopéptido de la etapa (a) en un tioéster para formar un tercer producto de ligación oligopéptido que presenta un extremo C-terminal que comprende un tioéster, y un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicho grupo tioéster;

(d): desproteger dicho extremo N-terminal de dicho segundo producto de ligación oligopéptido de la etapa (b) para formar un cuarto producto de ligación que comprende un extremo N-terminal que presenta una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con dicha cisteína no protegida, dicho 1,2-aminotiol no protegido o dicho 1,3-aminotiol no protegido; y

(e): ligar dicho tercer producto de ligación oligopéptido de la etapa (c) con dicho cuarto producto de ligación oligopéptido de la etapa (d) para formar un quinto producto de ligación oligopéptido que comprende un extremo N-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta un grupo tioéster C-terminal, y un extremo C-terminal que es sustancialmente no reactivo con un oligopéptido que porta una cisteína N-terminal no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido.

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6. Método según la reivindicación 5, que comprende además:

(f): ligar dicho quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) con uno o más oligopéptidos adicionales, con la condición de que dicho quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) y dicho oligopéptido u oligopéptidos adicionales porte, o esté preparado para portar, grupos N-terminales o C-terminales capaces de ligación química, en el que dicho grupo N-terminal capaz de ligación química comprende una cisteína no protegida, un 1,2-aminotiol no protegido o un 1,3-aminotiol no protegido, y en el que dicho grupo C-terminal capaz de ligación química comprende un tioéster.

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7. Método según la reivindicación 5, en el que dicho extremo N-terminal de dicho quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) comprende un aminoácido N-terminal no protegido o un aminoácido N-terminal protegido.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicho aminoácido N-terminal protegido es cíclico.

9. Método según la reivindicación 7, en el que dicho aminoácido N-terminal protegido comprende una cisteína protegida, un 1,2-aminotiol protegido o un 1,3-aminotiol protegido.

10. Método según la reivindicación 5, en el que dicho extremo C-terminal de dicho quinto producto de ligación oligopéptido de la etapa (e) comprende un aminoácido no protegido o un precursor tioéster inactivo.

11. Método según la reivindicación 5, en el que cualquiera de dichos oligopéptidos o productos de ligación oligopéptido que presenta un precursor tioéster inactivo en dicho extremo C-terminal se define mediante la fórmula siguiente:

Xaa_{i}- ...-Xaa_{m}-(CH-R)-CO-O-CH[(CH_{2})_{n}-S-R']-Y

en la que:

: Xaa_{i} es un aminoácido protegido o no protegido para i=1 a m;

: m es un número entero entre 2 y 200;

: n es un número entero ente 1 y 10;

: R es una cadena lateral de un aminoácido;

: R' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo protector de azufre y -SR'';

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: R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de alquilo C2-10, arilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono, bencilo sustituido, y heteroarilo sustituido que presenta entre 5 y 12 átomos de carbono y entre 1 y 4 heteroátomos, seleccionados cada uno independientemente de entre el grupo que consiste de N, O y S;

: Y es un grupo aceptor de electrones seleccionado de entre el grupo que consiste de R^{c}, alquilo C_{1-3} sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, -C(O)-R^{d}, -S(O)_{p}-alquilo C_{1-3} sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}, y un arilo sustituido con 1 a 3 grupos R^{c}, pero no una línker-resina;

: cada grupo Rc es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de halógeno, polihaloalquilo, bencilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, -C(O)NH2, -C(O)-NHNH2, -S(O)2NH2, hidroxilamina sustituida o no sustituida, ciano, nitro y sales de amonio cuaternario;

: p es un número entero entre 1 y 2;

: Rd es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, -N(Re)2, -ORe y -SRc,

: cada Re es independientemente un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrógeno, alquilo C1-3 sustituido con 0 a e grupos Rc, y -SO2-alquilo C1-3 sustituido con 1 a 3 grupos Rc; alternativamente,

: en el caso de que se encuentren presentes dos grupos Re, conjuntamente con el átomo al que se encuentran unidos pueden formar un anillo heterocíclico no aromático de 5 a 6 elementos que contiene 1 a 3 heteroátomos, seleccionados, cada uno independientemente, de entre el grupo que consiste de N, O y S, sustituido con 0 a 3 grupos R^{c}.

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12. Método según la reivindicación 11, en el que R' es un grupo protector de azufre.

13. Método según la reivindicación 11, en el que R' es -SR''.

14. Método según la reivindicación 11, en el que R'' es un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste de etilo, t-butilo y fenilo sustituido.

15. Método según la reivindicación 5, en el que dicho producto oligopéptido o polipéptido se prepara según el procedimiento en la figura 10.

16. Método según la reivindicación 11, en el que cada etapa se lleva a cabo en una solución seleccionada de entre el grupo que consiste de un solvente orgánico y una mezcla de un solvente orgánico y un solvente acuoso.

17. Método según la reivindicación 11, en el que Y es -C(O)NH_{2}.