ES2340400T3

ES2340400T3 - Celulas localizadas en tumores modificadas por ingenieria genetica para producir ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (trail).

Info

Publication number: ES2340400T3
Application number: ES05764208T
Authority: ES
Inventors: Alessandro M. Gianni; Carmelo Carlo-Stella; Francesco Colotta
Original assignee: Dompe SpA
Current assignee: Dompe SpA
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2025-07-21
Also published as: PL1771468T3; HRP20100227T1; CN101076540A; MX2007001152A; RS51381B; WO2006010558A8; ATE455847T1; IL180233A0; IL180233A; NZ552223A; AU2005266543B2; SI1771468T1; WO2006010558A1; EP1771468B1; ZA200701231B; PT1771468E; CA2571426A1; CN101076540B; EP1621550A1; NO20070956L

Abstract

Células hematopoyéticas CD34+ procedentes de la sangre periférica de pacientes con cáncer tratados con factor de crecimiento y transducidas con el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral, con la condición de que dichas células no son células dendríticas.

Description

Células localizadas en tumores modificadas por ingeniería genética para producir ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumorales (TRAIL).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células localizadas en tumores que expresan el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) y al uso de las mismas en una terapia antitumoral.

Antecedentes de la invención

Los mecanismos de apoptosis desregulados juegan papeles clave en la patogénesis y progresión de trastornos linfoproliferativos, al permitir que las células neoplásicas sobrevivan más allá de su vida normal, y finalmente adquieran quimiorresistencia [1]. De esta manera, las rutas apoptóticas representan dianas terapéuticas atractivas para restaurar la sensibilidad a la apoptosis de células malignas o activar agonistas de apoptosis [2]. Para modular genes y proteínas apoptóticas, puede preverse varias estrategias que se dirigen a la ruta intrínseca (Bcl-2, Bcl-X_{L}), extrínseca (DR4, DR5, FLIP) o de convergencia (cIAP2) de apoptosis [3].

El ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) pertenece a la familia de ligandos de receptores de muerte del TNF [4].

En el documento WO 97/01633 se desvelan secuencias de ADN aisladas que codifican TRAIL, vectores de expresión que comprenden dichas secuencias de ADN y polipéptidos TRAIL recombinantes.

TRAIL se une al receptor de muerte 4 (DR4) y al receptor de muerte 5 (DR5), que se expresan en la superficie celular de muchas células cancerosas [5]. La unión de TRAIL soluble a DR4 o DR5 conduce a activación de caspasas y a la apoptosis [6].

Liu Zhongyu y col., J Clin Invest. Vol 112, nº 9, 9.11.2003, 1332-1341, desvelan células dendríticas transducidas con TRIAL por adenovirus recombinantes y su posible uso médico en el tratamiento de artritis. No se menciona el posible uso de dichas células para el tratamiento de tumores.

Ciertos estudios in vitro e in vivo sugieren que debido a su alta especificidad por células cancerosas así como a su potente actividad antitumoral, el TRAIL recombinante soluble podría jugar un papel clave en la terapia contra el cáncer [7]. De hecho, TRAIL induce selectivamente la apoptosis en muchas células transformadas, mientras que respeta a las células normales [4]. Además, la administración de TRAIL en ratones ejerce una notable eficacia contra xenoinjertos tumorales de carcinoma de colón [8, 9], cáncer de mama [10], mieloma múltiple [11] o glioma [12, 13].

Ciertos estudios de toxicidad en ratones y primates no humanos han demostrado que los hepatocitos y queratinocitos normales son resistentes a la versión trimerizada de TRAIL [14, 15], mientras que muestran una sensibilidad significativa a la inducción de apoptosis por preparaciones de TRAIL no optimizadas o variantes entrecruzadas con anticuerpos del ligando [16]. Sigue creando polémica si la toxicidad hepática podría representar o no un problema importante cuando se usa una versión trimerizada de TRAIL a altas dosis.

Una limitación adicional al uso de TRAIL soluble se representa por la respuesta apoptótica reducida observada en un número y diversidad sustancial de líneas de células tumorales que requieren un tiempo de incubación prolongado o una dosis muy elevada de TRAIL soluble para experimentar apoptosis [17, 18]. Dado el perfil farmacocinético de TRAIL después de la inyección intravenosa (semivida plasmática de 32 minutos y semivida de eliminación de 4,8 horas), las condiciones de un tiempo de exposición prolongado y altas concentraciones no son transferibles para ninguna estrategia de tratamiento in vivo [10]. Para superar las limitaciones relacionadas con TRAIL recombinante soluble y dirigirse específicamente a las células tumorales, actualmente se están explotando varias estrategias de transferencia génica de TRAIL mediada por adenovirus usando diferentes modelos animales [19, 20].

Sin embargo, las estrategias de transferencia génica dependen en gran medida de la infección eficaz del tumor y de la elusión de la eliminación inmune para ser eficaces [21]. Además, aún no se han abordado varias cuestiones de seguridad asociadas con la inyección sistémica de vectores adenovirales [22]. Por ejemplo, la transferencia de genes adenovirales de TRAIL soluciona una respuesta apoptótica reducida de células de hepatoma, pero produce una apoptosis severa en hepatocitos primarios humanos [19]. Actualmente, las estrategias de terapia génica basadas en adenovirus principalmente se basan en el suministro intratumoral de adenovirus que codifican TRAIL [23]. A pesar de una actividad antitumoral local, el suministro intratumoral de TRAIL no tiene actividad antitumoral sistémica, por lo que carece de valor clínico.

Se sabe que diversos tipos celulares se localizan preferentemente en tumores [24] y pueden cargarse con las construcciones necesarias para producir moléculas anticancerosas. Debido a sus características de localización, las células CD34+ [25] y las células destructoras naturales (NK) [26] pueden usarse como vehículos de suministro para moléculas anticancerosas.

Después de una infusión intravenosa, las células CD34+ presentan propiedades de localización específicas, incluyendo la capacidad de colonizar permanentemente la médula ósea, y colonizar transitoriamente el hígado y el bazo [27-30]. Estas propiedades de localización están relacionadas estrictamente con la expresión de receptores de adhesión (por ejemplo, CXCR-4, VLA-4, VLA-5, CD44, etc.) que interaccionan con ligandos específicos (por ejemplo, SDF-1, VCAM-1, etc.) que se expresan en células estromáticas que residen dentro del microentorno de la médula ósea así como en el microentorno del tumor [31-34].

Las células NK son una subserie de linfocitos que juegan un papel esencial en la defensa inmune basada en células contra células tumorales por medio de mecanismos no restringidos al complejo principal de histocompatibilidad [35]. Después de la infusión intravenosa, las células NK se localizan en la médula ósea y órganos linfoides y se extravasan a sitios tumorales bajo la influencia de señales de citocinas apropiadas. Hasta ahora muchos grupos han tratado de usar la localización de células NK en tumores con fines terapéuticos [36-38].

Aunque se conocen las propiedades de localización en tumores de las células NK, las células modificadas genéticamente experimentan un estrés que depende del tipo de gen transducido. Como consecuencia de dicho estrés, las células pueden perder las propiedades originales de localización en tumores cuando se transducen con el gen de TRAIL. Por lo tanto, no hay una expectativa razonable de éxito y se necesitan ensayos experimentales reales para confirmar si la estrategia considerada específica puede ser viable o no.

Ahora se ha descubierto que células CD34+ modificadas por ingeniería genética para expresar TRAIL pueden explotarse ventajosamente para conseguir una actividad antitumoral mediada por células in vivo.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, se modifican por ingeniería genética células CD34+ de localización en tumores para producir ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) mediante transferencia génica mediada por adenovirus. Las células de acuerdo con la presente invención pueden administrarse sistémicamente para suministrar TRAIL en el sitio del tumor sin ocasionar los inconvenientes mencionados anteriormente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a células de localización tumoral que expresan TRAIL y a preparaciones celulares que las contienen. La invención también se refiere al uso de dichas células para la preparación de composiciones celulares para terapia anticancerosa, en particular para la terapia de linfomas humanos.

Las células de la invención pueden obtenerse por transducción de células de localización tumoral con un adenovirus deficiente en la replicación que codifica el gen de TRAIL humano (Ad- TRIAL) bajo el control de un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor de CMV. La transducción puede realizarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos para los biólogos moleculares, preferentemente después del procedimiento descrito en los ejemplos.

La expresión células "de localización tumoral" se usa de acuerdo con la invención para definir células que pueden: (1) localizarse en un tejido tumoral después de una inyección intravenosa y (2) expresar cantidades adecuadas de TRAIL unido a la membrana (mTRAIL) durante al menos algunos días.

Las células de localización en tumores de la presente invención son células hematopoyéticas CD34+ procedentes de sangre periférica de pacientes con cáncer tratados con factor de crecimiento modificadas por ingeniería genética para que expresen mTRAIL. Pueden preverse varios procedimientos para obtener una expresión adecuada de mTRAIL, incluyendo el uso de plásmidos y vectores virales con elementos genéticos reguladores apropiados tales como promotores y/o potenciadores con especificidad de tejido.

Puede obtenerse una eficacia de transducción óptima de células CD34+ por exposición a una Multiplicidad de Infección (MDI) graduada (de 50 a 500) de Ad-TRAIL (de 50 a 500) en condiciones sin suero a 37ºC. Después se añade medio suplementado con suero (RPMI- 1640/FBS al 20%) y, unas pocas horas después, los cultivos se suplementan con Gene Booster (1:200) y se incuban adicionalmente durante 18 horas.

Las composiciones de la invención pueden prepararse usando vehículos adecuados para la administración parenteral, particularmente intravenosa, tales como los presentados en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Por ejemplo, los excipientes que pueden usarse incluyen cualquier agente farmacéutico que no sea perjudicial para el individuo que recibe la composición, por ejemplo, agua, solución salina, glicerol y etanol, opcionalmente mezclado con sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tampones y similares. Las dosis apropiadas dependerán, entre otros factores, del sexo, edad y condiciones de sujeto a tratar, y de la gravedad de la enfermedad. Una cantidad eficaz apropiada puede determinarse fácilmente por cualquier experto en la materia y puede determinarse de cualquier modo por medio de estudios clínicos. Una dosis terapéuticamente eficaz generalmente será de aproximadamente 10^{3} a aproximadamente 10^{15} células transducidas. Por supuesto, pueden establecerse otras dosificaciones por medio de experimentos convencionales, es decir, generando respuestas en curvas de dosis-respuesta, determinando la dosis máxima tolerable (DMT) o realizando en un número limitado de pacientes estudios clínicos de fase I. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o de múltiples dosis. Además, al sujeto se le pueden administrar tantas dosis como sea apropiado. El experto en la materia determinará fácilmente el régimen de dosificación más eficaz.

La invención se ilustrará a continuación con más detalle por medio de los siguientes ejemplos, proporcionando pruebas claras y convincentes de que:

(i): pueden transducirse eficazmente células madre CD34+ in vitro con un adenovector que expresa TRAIL;

(ii): después de la transducción, estos subtipos celulares expresan transitoriamente TRAIL en su superficie celular;

(iii): esta corta duración de expresión de TRAIL está asociada con un potente efecto apoptótico detectado tanto en células tumorales sensibles a TRAIL como en células tumorales resistentes a TRAIL co-cultivadas con células transducidas;

(iv): la inyección in vivo de células transducidas en ratones NOD/SCID que tienen un tumor en estadio temprano o avanzado está asociada con una prolongación significativa de la supervivencia de los ratones, lo que sugiere que las células CD34+ transducidas con adenovirus pueden servir eficazmente como vehículos para el suministro sistémico de TRAIL con fines terapéuticos.

La eficacia de la administración intravenosa proporciona una ventaja característica de la presente invención en comparación con protocolos basados en el suministro intratumoral.

Aunque lo más probable es que el mecanismo del efecto antitumoral in vitro de células humanas que expresan mTRAIL sea la apoptosis inducida por reacción directa entre mTRAIL y sus receptores afines presentes en células tumorales, los presentes inventores no conocen el mecanismo de su actividad antitumoral in vivo. La destrucción directa de las células tumorales posiblemente está acoplada con efectos inhibidores del crecimiento indirectos resultantes de la apoptosis de células no tumorales incluidas en los tumores que expresan receptores de TRAIL (vasculares, perivasculares, intersticiales y otros tipos celulares con papeles críticos en el desarrollo tumoral y en la supervivencia de las células tumorales). Los experimentos en curso pretenden comprender mejor los mecanismos de la actividad antitumoral observada in vivo, aunque, por supuesto, la invención no se limitará por ninguna hipótesis sobre el mecanismo real de las actividades observadas.

Ejemplo 1 Inducción in vitro de apoptosis en líneas celulares de linfoma co-cultivadas con células CD34+ que expresan TRAIL después de transferencia génica mediada por adenovirus

Se evaluaron los efectos de co-cultivar líneas celulares de linfoma con células CD34+ modificadas por ingeniería genética para expresar TRAIL después de la transferencia génica mediada por adenovirus.

En experimentos iniciales in vitro se usó un vector adenoviral que expresaba TRAIL (Ad- TRAIL) para establecer condiciones óptimas para la infección adenoviral de células CD34+. Posteriormente se monitorizó la evolución en el tiempo de la expresión de TRAIL en la superficie de células CD34+ usando un anticuerpo monoclonal anti-TRAIL conjugado con PE (clon Rik-2). Finalmente se evaluó la capacidad de TRAIL unido a la membrana de inducir la apoptosis de líneas celulares de linfoma co-cultivando células Ad-TRAIL/CD34+ y líneas celulares de linfoma.

Procedimientos

Adenovirus que codifica el gen de TRAIL humano. Para estos experimentos se usó un adenovirus deficiente en la replicación que codifica el gen de TRAIL humano (Ad-TRAIL) expresado a partir del promotor de CMV [39]. El Ad-TRAIL contiene la secuencia codificante entera de TRAIL humano clonada en los sitios XhoI y NotI de pAd5CMVK-NpA. El plásmido resultante y las secuencias del esqueleto de adenovirus (Ad5) que tienen los genes E1 delecionados se introducen por transfección en células de riñón embrionario humano 293, y las partículas virales se aislan y se amplifican para el análisis de la expresión de TRAIL. Los adenovirus recombinantes se exploran con respecto a la replicación de virus competentes por medio de un ensayo en placas de A549, y el título de virus se determina por ensayo en placas en células 293. Los virus purificados se almacenan en PBS con sacarosa al 3% y se mantienen a - 80ºC hasta el uso. El producto del gen de TRAIL se expresa en la superficie celular de células transducidas y puede detectarse por medio de citometría de flujo.

Transducción adenoviral de células CD34+. Se obtuvieron células CD34+ a transducir con Ad-TRAIL a partir de sangre periférica de pacientes con cáncer que dieron su consentimiento que recibían quimioterapia y tratados con factores de crecimiento hematopoyéticos. Las células CD34+ se enriquecieron a partir de muestras de leucaféresis por medio de una técnica inmunomagnética y selección positiva (Miltenyi Biotech). Para la transducción adenoviral, se cultivaron células CD34+ a 2 x 10^{6}/ml en placas Petri de 35 mm en 1 ml de medio sin suero (IMDM) que contenía una dilución apropiada de soluciones madre de Ad-TRAIL que permitía una multiplicidad final de infecciones (MDI) que variaba de 100 a 1000. Después de la incubación (37ºC, 5% de CO_{2}) durante 2 horas, los cultivos se suplementaron con 1 ml de IMDM/FBS al 20% y 4 horas después se añadió Gene Booster (1:200). Las células se incubaron adicionalmente durante 18 horas y después se lavaron exhaustivamente (3 veces) en medio que contenía suero, y finalmente se evaluó la eficacia de transducción por inmunofluorescencia directa usando un anticuerpo anti-TRAIL conjugado con PE.

Co-cultivos. La actividad inductora de apoptosis de TRAIL expresado en la membrana de células CD34+ se ensayó in vitro por medio de experimentos de co-cultivo. En resumen, se co-cultivaron células Ad-TRAIL/CD34+ (células efectoras) con células de linfoma (células diana). La inducción de la apoptosis se evaluó 24 y 48 horas después del inicio del co-cultivo. En estos experimentos, la relación de efector:célula diana se calculó basándose en la eficacia de transducción de células efectoras.

Resultados

Transducción adenoviral de células CD34+. Los experimentos preliminares demostraron que se conseguía sistemáticamente una eficacia de transducción óptima de células CD34+ exponiendo células CD34+ (2 x 10^{6}/ml) a una MDI graduada de Ad-TRAIL (intervalo, de 100 a 1000) en condiciones sin suero durante 2 horas (37ºC). Después se añadió un volumen igual de medio suplementado con suero (IMDM/FBS al 20%) y, 4 horas después, los cultivos se suplementaron con Gene Booster (1:200) y se incubaron adicionalmente durante 18 horas. Finalmente, las células se lavaron exhaustivamente (3 veces) en medio que contenía suero y la expresión del transgén se evaluó por inmunofluorescencia directa usando un anticuerpo anti-TRAIL conjugado con PE.

Aunque no se detectó señal de TRAIL de fondo en las células de control, las células expuestas a Ad revelaron un porcentaje de células CD34+ positivas para TRAIL que aumentó de una manera dependiente de la MDI. En un experimento representativo, los porcentajes de células CD34+ positivas para TRAIL fueron del 25% y el 84% a una MDI de 100 y 1000, respectivamente.

El protocolo de infección descrito anteriormente tuvo como resultado sistemáticamente una eficacia de transferencia génica máxima a una MDI de 1000 con una media (\pmDT) del 83 \pm 8% (intervalo 70-95%, n = 5) de células CD34+ que expresan TRAIL. La viabilidad celular, evaluada por el ensayo de exclusión de colorante azul de trípano, no se vio afectada por una MDI de hasta 1000 (con \geq85% de células viables).

Para evaluar la evolución en el tiempo de la expresión del transgén, se transdujeron células CD34+ con una MDI de 1000 y se analizaron con respecto a la expresión de TRAIL hasta 7 días después de la transducción. En estos experimentos, para permitir la supervivencia de células CD34+, los cultivos se suplementaron con una baja dosis (3 ng/ml) del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). Como se muestra en la tabla 1, un porcentaje sustancial de células CD34+ (25%) continuaron expresando TRAIL hasta 120 horas después de la transducción.

TABLA 1 Expresión de transgén a lo largo del tiempo de células CD34+ transducidas con Ad-TRAIL

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Co-cultivos. Finalmente, los presentes inventores evaluaron la capacidad de TRAIL unido a la membrana de inducir la apoptosis en células linfoides por co-cultivo de células Ad-TRAIL/CD34+ y líneas de células tumorales (células diana). Para estos experimentos se seleccionaron dos líneas celulares de acuerdo con su sensibilidad a TRAIL soluble. En particular, se usaron la línea celular KMS-11 sensible a TRAIL y la línea celular JVM-2 resistente a TRAIL.

Se recogieron células CD34+ transducidas en condiciones óptimas de acuerdo con los protocolos de infección descritos anteriormente 24 horas después de la exposición inicial a adenovirus, se lavaron exhaustivamente y se co-cultivaron con células KMS-11 o JVM-2.

Cuando las células Ad-TRAIL/CD34+ se co-cultivaron a una relación de efector:célula diana de 0,8:1, se detectó una proporción sustancial (81%) de células apoptóticas y necróticas para las células KMS-11 después de un co-cultivo de 24 horas. La cantidad de células apoptóticas aumentó adicionalmente después de un co-cultivo de 48 horas (93% de células apoptóticas).

Para la línea celular KMS-11 sensible a TRAIL, la potencia del efecto apoptótico ejercido por TRAIL unido a la membrana fue similar a la ejercida por una exposición de 24 a 48 horas a una alta dosis (100 ng/ml) de TRAIL soluble (Tabla 3). Sin embargo, dado el perfil farmacocinético de TRAIL después de la inyección intravenosa (semivida plasmática de 32 minutos y semivida de eliminación de 4,8 horas) no puede conseguirse in vivo una exposición continua de 48 o incluso 24 horas a 100 ng/ml.

TABLA 3 Efecto de TRAIL soluble sobre células KMS-11

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También se realizaron experimentos de co-cultivo incubando células Ad-TRAIL/CD34+ o células Ad-TRAIL/NK con la línea celular NM-2 resistente a TRAIL soluble.

Cuando se co-cultivaron células Ad-TRAIL/CD34+ a una relación de efector:célula diana de 0,8:1, se detectó una proporción sustancial (51%) de células apoptóticas y necróticas para las células JVM-2 resistentes a TRAIL después de un co-cultivo de 48 horas.

Para la línea celular JVM-2 resistente a TRAIL, la potencia del efecto apoptótico ejercido por TRAIL unido a la membrana fue significativamente mayor que la del ejercido por una exposición de 48 horas a una dosis elevada (100 ng/ml) de TRAIL soluble (Tabla 4).

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TABLA 4 Efecto de TRAIL soluble sobre células JVM-2

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Para explorar adicionalmente la potencia de la actividad apoptótica del suministro de TRAIL mediado por células, se co-cultivaron células efectoras (células Ad-TRAIL/CD34+ con células diana (línea celular KMS-11) durante 24 horas a diferentes relaciones de efector:diana.

Como se muestra en la Tabla 5, las células Ad-TRAIL/CD34+ provocaron que un porcentaje sustancial (66%) de células KMS-11 experimentaran apoptosis o necrosis en co- cultivos establecidos con una relación de efector:diana de 0,4:1.

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TABLA 5 Inducción de apoptosis por co-cultivo de células Ad-TRAIL/CD34+ y células KMS-11 durante 24 horas a relaciones crecientes de E:T

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Ejemplo 2 Evaluación in vivo de ratones NOD/SCID de la actividad anticancerosa de células CD34+ modificadas por ingeniería genética para expresar TRAIL después de transferencia génica mediada por adenovirus

Para investigar el potencial terapéutico de células Ad-TRAIL/CD34+, en ratones NOD/SCID se reinfundió la línea celular de mieloma múltiple KMS-11 sensible a TRAIL. Posteriormente, en los ratones se inyectaron células Ad-TRAIL/CD34+ y la supervivencia de los ratones se usó como lectura de la eficacia antitumoral de la administración de TRAIL basada en células.

Procedimientos

Evaluación de la actividad antitumoral de células Ad-TRAIL/CD34+. Se adquirieron ratones NOD/SCID hembra de seis a ocho semanas de edad con un peso corporal de 20 a 25 g, en Charles River (Milano, Italy). Los ratones se alojaron en las condiciones de laboratorio convencionales de acuerdo con las pautas institucionales de los presentes inventores. Los procedimientos experimentales realizados sobre los animales se aprobaron por el Comité de Ética para Experimentación Animal del Instituto Nazionale Tumori y se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Coordinación del Reino Unido sobre la Investigación del Cáncer.

En los ratones se inocularon por intravenosa (IV) células KMS-11 (0,5 x 10^{6} por ratón). El tratamiento con células Ad-TRAIL/CD34+ (1 x 10^{6} por ratón) estaba constituido por inyecciones IV semanales durante 4 semanas empezando el día 7 ó 17 después de la inoculación de células tumorales. Las eficacias medias de transducción de las células Ad-TRAIL/CD34+ reinfundidas fueron del 83 \pm 8% y 61 \pm 18%, respectivamente. De esta manera, cada ratón recibió un número medio de 3,32 x 10^{6} células CD34+ que expresaban TRAIL en cuatro inyecciones. En los ratones se comprobó dos veces por semana la aparición de tumores, se midieron los pesos corporales y la toxicidad. Se registraron los tiempos de supervivencia de los animales en cada grupo y las diferencias entre los grupos se evaluaron por análisis estadísticos. Los grupos de control apropiados incluían: (i) ratones en los que se habían inyectado sólo células tumorales, (iii) ratones en los que se habían inyectado células tumorales más células CD34+ no transducidas.

Resultados

Células Ad-TRAIL/CD34+. Los ratones con xenoinjertos de células KMS-11 (0,5 x 10^{6} por ratón) se trataron con 4 inyecciones IV de células Ad-TRAIL/CD34+ en una base semanal de acuerdo con dos programas diferentes, es decir, el tratamiento del tumor en estadio temprano que se inició el día 7, y el tratamiento del tumor en estadio avanzado que se inició el día 17 después de la inyección de células KMS-11. Como la eficacia media de transducción de células Ad-TRAIL/CD34+ reinfundidas fue del 83 \pm 8% (media + DT, n = 9), cada ratón recibió un número medio de 3,32 x 10^{6} células CD34+ que expresaban TRAIL en cuatro inyecciones

Como se muestra en la Figura 1, la supervivencia media de ratones NOD/SCID en los que se habían inyectado únicamente células KMS-11 fue de 56 días. La inyección de células CD34+ de tipo silvestre no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia media (56 días), mientras que los ratones NOD/SCID tratados con células Ad-TRAIL/CD34+ para un tumor en estadio temprano mostró una supervivencia media de 111 días (P \leq0,0001).

El efecto de tratar un tumor en estadio avanzado con células Ad-TRAIL/CD34+ se representa en la Figura 2. La supervivencia media de ratones NOD/SCID en los que se habían inyectado únicamente células KMS-11 fue de 56 días. La inyección de células CD34+ de tipo silvestre no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia media (56 días), mientras que el tratamiento con células Ad-TRAIL/CD34+ del tumor en estadio avanzado se asoció con un aumento significativo de la supervivencia media (98 días, P \leq0,007).

Ejemplo 3 Actividad antitumoral in vitro de células CD34+/Ad-TRAIL contra líneas celulares de cáncer de mama

Una proporción significativa de líneas celulares de cáncer de mama es resistente a la apoptosis inducida por TRAIL debido a varios mecanismos, incluyendo el secuestro de TRAIL por receptores señuelo de TRAIL, la pérdida de expresión de receptores R1 y R2, la sobreexpresión de FLIP, etc. [40]. Basándose en los resultados previos de los presentes inventores que demuestran que las líneas celulares de linfoma resistentes a sTRAIL efectivamente se vuelven sensibles a TRAIL cuando se exponen a mTRAIL, los presentes inventores investigaron la sensibilidad de dos líneas celulares de cáncer de mama a sTRAIL y mTRAIL.

Se evaluó la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de mama a los efectos destructores de sTRAIL en comparación con la evaluación de la inducción de la apoptosis in vitro de líneas celulares de cáncer de mama sensibles a sTRAIL y resistentes a sTRAIL co-cultivadas con células CD34/Ad-TRAIL.

Se usaron dos líneas celulares de cáncer de mama, es decir MCF-7 y MDA-MB-361. Para evaluar la sensibilidad de las líneas celulares individuales al efecto destructor de sTRAIL, se expusieron células tumorales (5 - 10 x 10^{4}/ml) durante 72 horas a una dosis baja (10 ng/ml) y alta (100 ng/ml) de sTRAIL. Posteriormente, la apoptosis se evaluó con tinción doble con anexina- V/yoduro de propidio.

Procedimientos

Líneas celulares. Las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB-361 se adquirieron en DSMZ (Braunschweig, Germany, EU) y ATCC (Manassas, VA, USA), respectivamente. Las células se ensayaron periódicamente por reacción en cadena de la polimerasa con respecto a la contaminación por micoplasma. Todos los experimentos in vitro se realizaron con células en crecimiento exponencial.

Expresión de Anexina-V. El ensayo de Anexina V-FITC (PharMingen) se usó para determinar cuantitativamente el porcentaje de células que experimentaban una apoptosis y necrosis temprana o tardía. En resumen, las células a analizar se lavaron dos veces con PBS fría y después se resuspendieron en tampón de unión (HEPES 10 nM, NaCI 140 nM, CaCl_{2} 5 nM, pH 7,4). Después de la incubación, se transfirieron 0,1 ml de la suspensión celular a un tubo de cultivo de 5 ml y se añadieron 5 microlitros de Anexina V-FITC y 10 microlitros de yoduro de propidio. Después de agitar vorticialmente, las muestras se incubaron durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la incubación, se añadieron 0,4 ml de tampón de unión y las células se analizaron inmediatamente por citometría de flujo.

Resultados

Para investigar si la incubación con sTRAIL estaba asociada con la inducción de la apoptosis, se expusieron líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-361 a sTRAIL (10-100 ng/ml, 72 horas) y después se detectaron los porcentajes de células apoptóticas y necróticas por análisis FACS. Como se muestra en la Tabla 7, la exposición a sTRAIL no pudo inducir ninguna respuesta apoptótica en células MCF-7, mientras que produjo una respuesta de muerte celular significativa por células MDA-MB-361 cuando se expuso a 100 ng/ml de sTRAIL durante 72 horas. De acuerdo con estos resultados, MCF-7 es una línea celular resistente a sTRAIL, mientras que MDA-MB-361 es una línea celular sensible a sTRAIL.

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TABLA 7 Sensibilidad a sTRAIL de líneas celulares de cáncer de mama

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Después se evaluó la inducción in vitro de la apoptosis en líneas celulares de cáncer de mama co-cultivadas con células CD34+ que expresan TRAIL después de la transferencia génica mediada por adenovirus (CD34/Ad-TRAIL).

Procedimientos

Adenovirus que codifican el gen TRAIL humano. Para estos experimentos se usó un adenovirus deficiente en la replicación que codifica el gen de TRAIL humano (Ad-TRAIL) expresado a partir del promotor de CMV [39]. El Ad-TRAIL contiene la secuencia codificante entera de TRAIL humano clonada en los sitios XhoI y Notl de pAd5CMVK-NpA. El plásmido resultante y las secuencias del esqueleto de adenovirus (Ad5) que tenían los genes E1 delecionados se introducen por transfección en células de riñón embrionario humano 293, y las partículas virales se aíslan y amplifican para el análisis de la expresión de TRAIL. Los adenovirus recombinantes se exploran con respecto a los virus competentes para la replicación por ensayo en placa en A549, y el título de virus se determina por ensayo en placa en células 293. Los virus purificados se almacenan en PBS con sacarosa al 3% y se mantienen a -80ºC hasta el uso. El producto del gen TRAIL se expresa en la superficie celular de células transducidas y puede detectarse por medio de citometría de flujo.

Transducción adenoviral de células CD34+. Se obtuvieron células CD34+ a transducir con Ad-TRAIL a partir de sangre periférica de pacientes con cáncer que dieron su consentimiento que recibían quimioterapia y se trataban con factores de crecimiento hematopoyéticos. Las células CD34+ se enriquecieron a partir de muestras de leucaféresis por medio de una técnica inmunomagnética y selección positiva (Miltenyi Biotech). Para la transducción adenoviral, se cultivaron células CD34+ a 2 x 10^{6}/ml en placas Petri de 35 mm en 1 ml de medio sin suero (IMDM) que contenía una dilución apropiada de soluciones madre de Ad-TRAIL permitiendo una multiplicidad de infecciones (MDI) de 500. Después de la incubación (37ºC, 5% de CO_{2}) durante 2 horas, los cultivos se suplementaron con 1 ml de IMDM/FBS al 20% y, 4 horas después, se añadió Gene Booster (1:200). Las células se incubaron adicionalmente durante 18 horas, después se lavaron exhaustivamente (3 veces) en medio que contenía suero y finalmente se evaluó la eficacia de transducción por inmunofluorescencia directa usando un anticuerpo anti-TRAIL conjugado con PE.

Co-cultivos. La actividad de inducción de apoptosis de mTRAIL se ensayó in vitro por medio de experimentos de cultivo. En resumen, se co-cultivaron células CD34/Ad-TRAIL (células efectoras) con células de cáncer de mama (células diana). La inducción de la apoptosis se evaluó 48 horas después del inicio del co-cultivo. En estos experimentos, se usaron relaciones de efector:célula diana 1:1 y 4:1.

Resultados

Transducción adenoviral de células CD34+. Sistemáticamente se consiguió una eficacia de transducción óptima de células CD34+ exponiendo células CD34+ (2 x 10^{6}/ml) a Ad-TRAIL graduado a una MDI de 500 en condiciones sin suero durante 2 horas (37ºC). Aunque no se detectó señal de fondo de TRAIL en las células de control, las células que expresaban TRAIL revelaron un porcentaje de células CD34+ positivas para TRAIL del 93 \pm 8% (media \pm DT). La viabilidad celular, evaluada por el ensayo de exclusión de colorante azul de trípano, no se vio afectada por un MDI tan alto como de 1000 (con \geq85% de células viables).

Co-cultivos. Los presentes inventores evaluaron la capacidad de mTRAIL de inducir la apoptosis en líneas celulares de cáncer de mama por co-cultivo de células CD34/Ad-TRAIL (células efectoras) y células tumorales (células diana). Se recogieron células CD34/Ad-TRAIL 24 horas después de la exposición inicial a adenovirus, se lavaron exhaustivamente y se co- cultivaron con células MCF-7 o MDA-MB-361. En estos experimentos se usaron dos relaciones de efector:célula diana, es decir, 1:1 y 4:1. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

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TABLA 8 Actividad tumoricida de mTRAIL en líneas celulares de cáncer de mama

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Se detectó una proporción significativa de muerte celular por co-cultivo durante 48 horas de células CD34/Ad-TRAIL con las células MDA-MB-361 sensibles a sTRAIL a una relación E:T de 1:1 (muerte celular = 28%) y una relación E:T de 4:1 (muerte celular = 50%).

Para la línea celular MDA-MB-361 sensible a sTRAIL, la potencia del efecto apoptótico ejercida por una exposición de 48 horas a mTRAIL fue similar a la ejercida por una exposición de 72 horas a una dosis alta (100 ng/ml) de sTRAIL (Tabla 7).

Para verificar que el efecto citotóxico de CD34/Ad-TRAIL efectivamente se debía a mTRAIL, se co-cultivaron células MDA-MB-361 con células CD34+ transducidas de forma simulada. Como se muestra en la Tabla 2, el co-cultivo de células MDA-MB-361 con células CD34+ transducidas de forma simulada se asoció con un efecto modesto de muerte celular sólo detectado a la máxima relación E:T. Esta inducción de muerte celular modesta probablemente estaba relacionada con la superpoblación de cultivo.

Para descartar la posibilidad de que la actividad de muerte celular de CD34/Ad-TRAIL se debiera a partículas adenovirales libres que no se eliminaron por lavado al final de la infección de CD34 con Ad-TRAIL, se expusieron células MDA-MB-361 a 10^{6} unidades formadoras de placas (ufp). No pudieron detectarse pruebas de toxicidad celular exponiendo células MDA-MB-361 a 10^{6} partículas virales (Tabla 8).

El número de ufp se calculó como se indica a continuación.

Para infectar 5 x 10^{5} células CD34+ a una MDI de 500, se usaron 250 x 10^{6} ufp que se añadieron a 1 ml de suspensión de células CD34+.

Al final de la infección, las células CD34+ se lavaron 3 veces en medio de cultivo. Para cada procedimiento de lavado, se usó un factor de dilución 1:20, es decir, el cultivo de suspensión se diluyó al menos 8.000 veces.

Suponiendo que 250 x 10^{6} ufp aún estaban en el cultivo de suspensión al final del procedimiento de lavado, se diluyeron 8.000 veces, es decir, se esperaba añadir <50.000 ufp residuales en co-cultivo.

De esta manera, para descartar que la actividad de muerte celular detectada en los co- cultivos se debiera a partículas adenovirales libres que no se habían eliminado por lavado, se expusieron líneas celulares de cáncer de mama a un número de ufp igual al valor teórico de ufp residuales (véase el nº 3) multiplicado por 20 (es decir, 50.000 x 20 =
10^{6} ufp).

Después se realizaron experimentos de co-cultivo incubando células CD34/ad-TRAIL con la línea celular MCF-7 resistente a sTRAIL. En estos experimentos, se detectó una proporción significativa de muerte celular por co-cultivo durante 48 horas de células CD34/Ad-TRAIL con las células MCF-7 resistentes a sTRAIL a una relación E:T de 4:1 (muerte celular = 64%), mientras que no pudo detectarse muerte celular a una relación E:T de 1:1.

Para la línea celular MCF-7 resistente a sTRAIL, la potencia del efecto apoptótico ejercido por una exposición de 48 horas a mTRAIL fue significativamente mayor que la del ejercido por una exposición de 72 horas a una alta dosis (100 ng/ml) de sTRAIL (Tablas 7 y 8).

Para verificar que el efecto citotóxico de CD34/Ad-TRAIL se debía efectivamente a mTRAIL, se co-cultivaron células MCF-7 con células CD34+ transducidas de forma simulada. Como se muestra en la Tabla 8, el co-cultivo de células MCF-7 con células CD34+ transducidas de forma simulada estaba asociado con un modesto efecto de muerte celular que probablemente está relacionado con la superpoblación de cultivo.

Para descartar la posibilidad de que la actividad de muerte celular de CD34/Ad-TRAIL se debiera a partículas adenovirales libres que no se habían eliminado por lavado al final de la infección de CD34 con Ad-TRAIL, se expusieron células MCF-7 a 10^{6} ufp. No pudo detectarse ninguna prueba de toxicidad celular exponiendo células MCF-7 a 10^{6} ufp (Tabla 8).

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Claims

1. Células hematopoyéticas CD34+ procedentes de la sangre periférica de pacientes con cáncer tratados con factor de crecimiento y transducidas con el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral, con la condición de que dichas células no son células dendríticas.

2. Células de acuerdo con la reivindicación 1, que pueden obtenerse por transducción de células CD34+ con vectores adenovirales que codifican el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral.

3. Preparaciones celulares que contienen las células de las reivindicaciones 1-2 en mezcla con vehículos fisiológicamente aceptables.

4. Uso de las células de las reivindicaciones 1-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el tumor es un linfoma.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el tumor es un carcinoma de mama.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, 5 ó 6 en el que el medicamento se administra por vía intravenosa.