ES2340475T3 - Estructura cristalizada de proteina aurora-2 y sus bolsillos de union. - Google Patents
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Abstract
Un cristal perteneciente al grupo espacial P3221 y que tiene parámetros de celda unitaria de a=b=87 ± 2Å, c=76 ±2 Å; α,β=90º y γ=120º, que comprende una molécula o complejo molecular que comprende los residuos de aminoácidos 107-403 de la SEQ ID NO:1 de una proteína quinasa Aurora -2 no fosforilada de acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4, donde la desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que 5 Å.
Description
Estructura cristalina de proteína
Aurora-2 y sus bolsillos de unión.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 60/377.510, presentada
el 1 de mayo de 2002, cuya descripción se incorpora en la presente
por referencia.
La presente invención describe moléculas o
complejos moleculares cristalinos que comprenden bolsillos de unión
de Aurora-2 o sus homólogas. La presente invención
también se refiere a cristales que comprenden
Aurora-2. En el contexto de la presente invención
también se divulgan métodos para utilizar las coordenadas
estructurales para resolver la estructura de proteínas homólogas o
complejos de proteínas. Además, se divulgan métodos de uso de
coordenadas estructurales para diseñar compuestos, que incluyen
compuestos inhibidores y anticuerpos, que se unen a
Aurora-2 o sus homólogas en el contexto de la
presente invención.
Las proteína quinasas median la transducción de
señales intracelulares al producir una transferencia de fosforilo
de un nucleósido trifosfato a una proteína aceptora involucrada en
una vía de señalización. Existen numerosas quinasas y vías a través
de las cuales estímulos extracelulares y otros determinan que una
variedad de respuestas celulares ocurran en el interior de la
célula. Ejemplos de tales estímulos incluyen señales de estrés
ambientales y químicos (por ejemplo, shock osmótico, shock térmico,
radiación ultravioleta, endotoxinas bacterianas, H_{2}O_{2}),
citoquinas (por ejemplo, interleuquina-1
(IL-I) y factor de necrosis tumoral \alpha
(TNF-\alpha)), factores de crecimiento (por
ejemplo, factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y
factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Un estímulo
extracelular puede afectar a una o más respuestas celulares
relacionadas con el crecimiento, migración y diferenciación celular,
secreción de hormonas, factores de activación de transcripción,
contracción muscular, metabolismo de la glucosa, control de síntesis
de proteínas y regulación del ciclo celular.
Muchos estados de enfermedad se asocian con
respuestas celulares anormales desencadenadas por eventos mediados
por proteína quinasas. Estas enfermedades incluyen enfermedades
autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurológicas
y neurodegenerativas, cáncer, enfermedades cardiovasculares,
alergias y asma, enfermedad de Alzheimer y enfermedades
relacionadas con hormonas. En consecuencia, una comprensión de la
estructura, función e inhibición de la actividad de quinasa podría
conducir a terapias humanas útiles.
Entre las quinasas de importancia medicinal se
hallan las serina/treonina quinasas. La familia de serina treonina
quinasas incluye las proteína quinasas activadas por mitógenos de
mamíferos (MAP). Las quinasas MAP se activan por fosforilación dual
de treonina y tirosina en el segmento
Thr-X-Tyr del bucle de activación.
Los miembros de la familia de quinasas MAP también comparten
semejanza de secuencia y dominios estructurales conservados, e
incluyen las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK),
quinasas Jun N-terminales (aNKs) y quinasas p38.
Las quinasas MAP también fosforilan varios sustratos que incluyen
los factores de transcripción, que a su vez regulan la expresión de
conjuntos de genes específicos y median una respuesta específica al
estímulo.
Otro grupo importante de la familia de
serina/treonina quinasas incluye un subgrupo de tres proteína
quinasas de serina/treonina estrechamente relacionadas, las
quinasas Aurora. Las quinasas Aurora cumplen un papel clave en los
eventos de fosforilación de proteínas que regulan la fase mitótica
del ciclo celular. La Aurora-2, por ejemplo, se
regula por aumento durante la fase M del ciclo celular y se localiza
en el polo del huso durante la mitosis, lo que sugiere una posible
participación en las funciones del centrosoma. Las quinasas Aurora
comparten una estructura común, que incluye un dominio catalítico
altamente conservado, y un dominio N-terminal muy
corto que varía en tamaño (R. Giet y C. Prigent, J. Cell
Sci., 112, pp. 3591-3601 (1999)). Los dominios
N-terminales no comparten ninguna semejanza de
secuencia. Las quinasas Aurora se sobreexpresan en varios tipos de
cáncer, tales como colon, mama y otros tumores sólidos (para una
revisión, véase T. M. Goepfert y B. R. Brinkley, Curr. Tap. Dev.
Biol., 49, pp. 331-342 (2000)). Más importante
aún, ambos genes de Aurora-1 y 2 se amplifican en
cánceres de mama y colorrectal mientras que el gen de
Aurora-3 se ubica en una región que está reordenada
o suprimida en varias células cancerosas. La sobreexpresión de
Aurora-2 en fibroblastos de roedores induce la
transformación, lo que indica que Aurora-2 es
oncogénica. Recientemente, la expresión de ARNm de
Aurora-2 se ha vinculado con la inestabilidad
cromosómica en cánceres de mama humanos (Y. Miyoshi et al.,
Int. J. Cancer, 92, pp. 370-373 (2001)).
Por consiguiente, ha habido interés en hallar
inhibidores de Aurora-1, Aurora-2 o
Aurora-3 que sean efectivos como agentes
terapéuticos. Ha sido un desafío hallar inhibidores de proteína
quinasas que actúen de modo selectivo para las quinasas de la
familia Aurora. Debido a que existen numerosas proteína quinasas
involucradas en una variedad de respuestas celulares, los
inhibidores no selectivos pueden producir efectos secundarios no
deseables. En este aspecto, la estructura tridimensional de la
quinasa debe contribuir al diseño racional de los inhibidores. La
determinación de los residuos de aminoácidos en los bolsillos de
unión de Aurora-2 y la determinación de la forma de
esos bolsillos de unión permitiría diseñar inhibidores selectivos
que se unan favorablemente a esta clase de enzimas. La
determinación de los residuos de aminoácidos en los bolsillos de
unión de Aurora-2 y la determinación de la forma de
estos bolsillos de unión también permitiría diseñar inhibidores que
puedan unirse selectivamente a Aurora-1,
Aurora-2 o Aurora-3, o a cualquiera
de sus combinaciones.
A pesar del hecho de que se han aislado genes
para varias Aurora-1, Aurora-2 y
Aurora-3 y se conocen las secuencias de aminoácidos
de Aurora-1, Aurora-2 y
Aurora-3, la información de coordenadas
estructurales del cristal por rayos X de la proteína
Aurora-1, Aurora-2 o
Aurora-3 aún no ha sido descrita. Dicha información
sería útil para identificar y diseñar inhibidores terapéuticos de
las quinasas Aurora o sus homólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a los
siguientes aspectos:
1. Un cristal perteneciente al grupo espacial
P3_{2}21 y que tiene parámetros de celda unitaria de a=b=87 \pm
2\ring{A}, c=76 \pm2 \ring{A}; \alpha,\beta=90º y
\gamma=120º que comprende una molécula o complejo molecular que
comprende los residuos de aminoácidos 107-403 de la
SEQ ID NO: 1 de una proteína quinasa Aurora-2 no
fosforilada de acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4, en el que la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 5 \ring{A}.
2. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende una entidad química, en el que la
entidad química se selecciona del grupo que consiste en
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
adenosina, ATP, un análogo de ATP y un nucleótido trifosfato.
3. El cristal de acuerdo con el aspecto 2, en el
que dicha entidad química se selecciona del grupo que consiste en
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-
ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
y adenosina.
4. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 L139, L194, L210, E211, A213, L263 y W277
de acuerdo con cualquiera de las Figuras 1-4, donde
la desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3 \ring{A}.
5. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 L139, G140, F144, V147, A160, K162, L194,
L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273 y W277
de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación cuadrática media de
los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha
molécula o complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3
\ring{A}.
6. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 L139, G140, F144, V147, A160, K162, L194,
L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273, W277 y
S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la desviación cuadrática
media de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos
de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
7. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 L139, G140, F144, V147, A160, K162, L194,
L210, E211, 1212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273, W277,
S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos
de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
8. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 R137, L139, G140, G142, F144, G145, N146,
V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162, L194, R195, L208,
I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220,
E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275 y W277
de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación cuadrática media de
los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha
molécula o complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3
\ring{A}.
9. El cristal de acuerdo con el aspecto 1, donde
dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido por
las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 R137, L139, G140, G142, F144, G145, N146,
V147, Y148, L149, L158, L159, L160, L161, K162, L194, R195, L208,
I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220,
E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275, W277 y
S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la desviación cuadrática
media de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos
de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
10. El cristal de acuerdo con el aspecto 1,
donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido
por las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 R137, L139, G140, G142, F144, G145, N146,
V147, Y148, L149, L158, L159, A160, L161, K162, L194, R195, L208,
I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220,
E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275, W277,
S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
11. El cristal de acuerdo con el aspecto 1,
donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido
por las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 F133, I135, G136, R137, F144, N146, V147,
Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160, L161, K162, V163,
V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195, L196, Y197, G198,
Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214,
L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230, Q231, R232, T233,
A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241, N242, A243, L244,
S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252, I253, H254, R255,
D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263, L264, G265, S266,
G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275 y W277 de acuerdo
con la Figura 3, donde la desviación cuadrática media de los átomos
del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha molécula o
complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3
\ring{A}.
12. El cristal de acuerdo con el aspecto 1,
donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido
por las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 F133, I135, G136, R137, F144, N146, V147,
Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160, L161, K162, V163,
V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195, L196, Y197, G198,
Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214,
L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230, Q231, R232, T233,
A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241, N242, A243, L244,
S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252, I253, H254, R255,
D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263, L264, G265, S266
G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275, W277 y S278 de
acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la desviación cuadrática media
de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de
dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
13. El cristal de acuerdo con el aspecto 1,
donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión definido
por las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 F133, I135, G136, R137, F144, N146,V147,
Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160, L161, K162, V163,
V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195, L196, Y197, G198,
Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214,
L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230, Q231, R232, T233,
A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241, N242, A243, L244,
S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252, I253, H254, R255,
D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263, L264, G265, S266,
G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275, W277, S278 y V279
de acuerdo con la Figura 2, donde la desviación cuadrática media de
los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha
molécula o complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3
\ring{A}.
14. Un método para diseñar, seleccionar y/u
optimizar una entidad química que se une a todo o parte del bolsillo
de unión o proteína de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos
1-13, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1,
2, 3 o 4, en un ordenador que comprende el medio para generar
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales; y
(b) diseñar, seleccionar y/u optimizar dicha
entidad química realizando una operación de ajuste entre dicha
entidad química y dicha información de la estructura tridimensional
de todo o parte de dicho bolsillo de unión o proteína.
15. Un método para evaluar la capacidad de una
entidad química para asociarse con todo o parte del bolsillo de
unión o proteína de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos
4-13, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1,
2, 3 o 4, en un ordenador que comprende el medio para generar
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales;
(b) emplear medios computacionales para realizar
una operación de ajuste entre la entidad química y todo o parte del
bolsillo de unión o proteína; y
(c) analizar los resultados de dicha operación
de ajuste para cuantificar la asociación entre la entidad química y
todo o parte del bolsillo de unión o proteína.
\newpage
16. El método de acuerdo con el aspecto 15, que
además comprende generar una representación gráfica tridimensional
de todo o parte del bolsillo de unión o proteína antes de la etapa
(b).
17. Un método para identificar un agonista o
antagonista de una molécula o complejo molecular de acuerdo con uno
cualquiera de los aspectos 4-13, que comprende las
etapas de:
(a) utilizar una estructura tridimensional del
bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4,
de la molécula o el complejo molecular para diseñar o seleccionar
una entidad química;
(b) poner en contacto la entidad química con la
molécula o el complejo molecular;
(c) monitorear la actividad catalítica de la
molécula o el complejo molecular; y
(d) clasificar la entidad química como agonista
o antagonista sobre la base del efecto de la entidad química sobre
la actividad catalítica de la molécula o el complejo molecular.
18. Un método para diseñar un compuesto o
complejo que se asocia con todo o parte del bolsillo de unión de
acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 4-13:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1,
2, 3 o 4, en un ordenador que comprende el medio para generar
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales; y
(b) usar el ordenador para realizar una
operación de ajuste para asociar una entidad química con todo o
parte del bolsillo de unión;
(c) realizar una operación de ajuste para
asociar al menos una segunda entidad química con todo o parte del
bolsillo de unión;
(d) cuantificar la asociación entre la primera y
la segunda entidad química y todo o parte del bolsillo de
unión;
(e) opcionalmente repetir las etapas b) a d) con
otra primera y segunda entidad química, seleccionar una primera y
una segunda entidad química sobre la base de dicha asociación
cuantificada del total de dicha primera y segunda entidad
química;
(f) opcionalmente, inspeccionar visualmente la
relación de la primera y la segunda entidad química entre sí en
relación con el bolsillo de unión en una pantalla de ordenador
usando la representación gráfica tridimensional del bolsillo de
unión y dichas primera y segunda entidad química; y
(g) ensamblar la primera y la segunda entidad
química en un compuesto o complejo que se asocia con todo o parte
de dicho bolsillo de unión mediante construcción modelada.
19. Un método para utilizar un reemplazo
molecular para obtener información estructural acerca de una
molécula o un complejo molecular de estructura desconocida, que
comprende las etapas de:
(a) cristalizar dicha molécula o complejo
molecular;
(b) generar un patrón de difracción de rayos X a
partir de dicha molécula o complejo molecular cristalizado; y
(c) aplicar al menos una porción de las
coordenadas estructurales de un cristal de acuerdo con uno
cualquiera de los aspectos 1-13, según se expone en
la Figura 1, 2, 3 o 4, o un modelo de homología de la misma, al
patrón de difracción de rayos X para generar un mapa de densidad
electrónica tridimensional de al menos una porción de la molécula o
el complejo molecular cuya estructura se desconoce.
20. El método de acuerdo con el aspecto 19, en
el que la molécula es una proteína Aurora-2 u
homóloga.
21. El método de acuerdo con el aspecto 19, en
el que el complejo molecular se selecciona del grupo que consiste
en un complejo de la proteína Aurora-2 o un complejo
de una homóloga de Aurora-2.
Los solicitantes han resuelto este problema al
proporcionar, por primera vez, las estructuras cristalinas de los
complejos inhibidores de Aurora-2 y la estructura
cristalina de Aurora-2 unida a adenosina. En el
contexto de la presente invención, se divulgan moléculas o
complejos moleculares cristalinos que comprenden bolsillos de unión
de Aurora-2, o bolsillos de unión de tipo
Aurora-2 que tienen configuraciones tridimensionales
similares. En una realización, las moléculas o los complejos
moleculares son proteínas Aurora-2 u homólogas, o
complejos de proteínas Aurora-2 u homólogos de los
mismos. En otra realización, las moléculas o los complejos
moleculares son dominios de Aurora-2 quinasa u
homólogas de la misma, o complejos de dominios de
Aurora-2 quinasa u homólogas de la misma.
\newpage
En el contexto de la presente invención también
se divulgan composiciones cristalinas que comprenden la proteína
Aurora-2, dominio de Aurora-2
quinasa u homólogos de la misma en presencia o ausencia de una
entidad química. También se divulga un método para cristalizar una
proteína Aurora-2, un complejo de la proteína
Aurora-2 u homólogas de las mismas en el contexto
de la presente invención.
En el contexto de la presente invención también
se divulga un ordenador que comprende un medio de almacenamiento de
datos que comprende las coordenadas estructurales de las moléculas y
los complejos moleculares que comprenden todos o parte de los
bolsillos de unión de Aurora-2 o los bolsillos de
unión de tipo Aurora-2. Dicho medio de
almacenamiento, cuando es leído y utilizado por un ordenador
programado con software apropiado, exhibe en una pantalla del
ordenador o dispositivo de visualización similar, una representación
gráfica tridimensional de una molécula o complejo molecular que
comprende dichos bolsillos de unión.
En el contexto de la presente invención, se
divulgan métodos para seleccionar, diseñar, optimizar, evaluar e
identificar compuestos que se unen a las moléculas o los complejos
moleculares o sus bolsillos de unión. Dichos compuestos son
inhibidores potenciales de Aurora-2 o sus homólogas.
Dichos métodos se pueden usar para identificar un agonista o
antagonista de Aurora-2 y sus homólogas.
En el contexto de la presente invención también
se divulga un método para determinar al menos una porción de la
estructura tridimensional de las moléculas o los complejos
moleculares que contienen al menos algunas características
estructuralmente similares a Aurora-2, en particular
las homólogas de Aurora-2. Esto se logra utilizando
al menos algunas de las coordenadas estructurales obtenidas a partir
de los complejos de Aurora-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes abreviaturas se usan en las
Figuras 1-4:
"Tipo de átomo" se refiere al elemento
cuyas coordenadas se miden. La primera letra de la columna define el
elemento.
"Resid" se refiere a la identidad del
residuo de aminoácido en el modelo molecular.
"X, Y, Z" definen la posición atómica del
elemento medido.
"B" es un factor térmico que mide el
movimiento del átomo alrededor de su centro atómico.
"Occ" es un factor de ocupación que se
refiere a la fracción de las moléculas en las que cada átomo ocupa
la posición especificada por las coordenadas. Un valor de "1"
indica que cada átono tiene la misma conformación, es decir, la
misma posición en las moléculas.
"Mol" se refiere a la molécula en la unidad
asimétrica.
La figura 1A a 1HH enumera las coordenadas
estructurales atómicas para el complejo inhibidor
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
derivado por difracción de rayos X del cristal.
La figura 2A a 2HH enumera las coordenadas
estructurales atómicas para el complejo inhibidor
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
derivado por difracción de rayos X del cristal.
La figura 3A a 3GG enumera las coordenadas
estructurales atómicas para el complejo inhibidor
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina
derivado por difracción de rayos X del cristal.
La figura 4A a 4GG enumera las coordenadas
estructurales atómicas para el complejo
Aurora-2-adenosina derivado por
difracción de rayos X del cristal.
La figura 5 ilustra un diagrama de cinta del
plegamiento total del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina.
El lóbulo N-terminal del dominio catalítico de
Aurora-2 corresponde al subdominio de cadena \beta
y abarca los residuos de aminoácidos 127 a 215. El subdominio de
\alpha-hélice corresponde a los residuos de
aminoácidos 216 a 390. Se indican las características clave del
plegamiento de quinasa tal como la bisagra (aproximadamente los
residuos de aminoácidos 132 a 135), el bucle rico en glicina
(aproximadamente los residuos de aminoácidos 140 a 149) y el bucle
de activación o labio de fosforilación (aproximadamente los residuos
de aminoácidos 272 a 289). En cada una de las estructuras del
cristal de Aurora-2, algunos de los residuos de
aminoácidos del extremo N-terminal
(-107-126), el extremo C-terminal
(-391-403) y el bucle de activación
(-279-289) se desordenaron. Exhiben sólo densidad
electrónica débil y no se pudieron ajustar.
La figura 6 muestra una representación detallada
de los bolsillos del sitio catalítico activo del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina.
\newpage
La figura 7 muestra una comparación entre los
bucles de activación del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
en blanco, GSK-3\beta no fosforilada en gris
(véase Haar, E. et al., Nat. Struct. Biol. 8,
593-596 (2001)), y CDK2 humana activada unida al
sustrato en negro (PDB, número de acceso 1B38).
La figura 8 muestra que en cada una de las
estructuras del cristal del inhibidor de Aurora-2,
el sitio catalítico activo de Aurora-2 está
parcialmente ocupado por la región del bucle de activación (residuos
275-279), que forma un bolsillo hidrófobo único en
el sitio catalítico activo de Aurora-2. En
comparación (ver la figura 7), los bucles de activación de otras
quinasas adoptan una conformación más extendida y "abierta". El
residuo W277 está conservado en los sitios catalíticos activos de
Aurora-1, Aurora-2 y
Aurora-3 y cumple un papel importante en la
formación de este bolsillo hidrófobo único. La figuras 8A, B, C y D
representan los complejos
Aurora-2-adenosina,
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-[2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenilquinazolin-4-il)-amina,
respectivamente.
La figura 9 muestra un diagrama de un sistema
usado para llevar a cabo las instrucciones codificadas por el medio
de almacenamiento de las figuras 10 y 11.
La figura 10 muestra una sección transversal de
un medio de almacenamiento magnético.
La figura 11 muestra una sección transversal de
un medio de almacenamiento de datos legible en forma óptica.
A fin de que el contexto de la presente
invención divulgado en la presente se pueda comprender más
plenamente, se exponen la siguiente descripción detallada.
A lo largo de la memoria descriptiva, se
entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como
"comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un
número entero indicado o grupos de números enteros pero no la
exclusión de ningún otro número entero o grupos de números
enteros.
Las siguientes abreviaturas se usan en toda la
solicitud:
Como se usa en la presente memoria, se aplicarán
las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario.
El término "aproximadamente", cuando se usa
en el contexto de valores de RMSD, tiene en cuenta el error estándar
del valor de RMSD, que es \pm 0,1 \ring{A}.
La expresión "asociación con" se refiere a
una condición de proximidad entre una entidad química o compuesto,
o porciones de estos, y un bolsillo de unión o sitio de unión en una
proteína. La asociación puede ser no covalente - donde la
yuxtaposición está energéticamente favorecida por enlaces puente de
hidrógeno o las interacciones de van der Waals o electrostáticas -
o puede ser covalente.
La expresión "análogo de ATP" se refiere a
un compuesto derivado de la
adenosina-5'-trifosfato (ATP). El
compuesto puede ser ADP, o un análogo no hidrolizable, tal como,
sin limitación, imidodifosfato de adenililo (AMPPNP). El análogo
puede estar en un complejo con iones magnesio o manganeso.
La expresión "proteína Aurora" se refiere a
quinasas de la familia de quinasas Aurora. Ejemplos de esta familia
de quinasas incluyen, sin limitación, Aurora-1,
Aurora-2 y Aurora-3.
El "bolsillo de unión a ATP de
Aurora-2" se refiere a un bolsillo de unión de
una molécula o complejo molecular definido por las coordenadas
estructurales de un cierto conjunto de residuos de aminoácidos
presentes en la estructura de Aurora-2, como se
describe a continuación. En general, el ligando para el bolsillo de
unión a ATP es un nucleótido tal como ATP. Este bolsillo de unión
está en el sitio catalítico activo del dominio de quinasa. En la
familia de proteína quinasas, el bolsillo de unión a ATP se localiza
generalmente en la interfaz de los subdominios de
\alpha-hélice y cadena \beta y está limitado por
el bucle rico en glicina y la bisagra (Véase, Xie et al.,
Structure, 6, pp. 983-991 (1998), que se
incorpora en la presente por referencia).
La expresión "dominio de quinasa de
Aurora-2" o "dominio de quinasa de tipo
Aurora-2" se refiere al dominio catalítico de
Aurora-2 o de una quinasa de tipo
Aurora-2, respectivamente. El dominio de quinasa
incluye, por ejemplo, el sitio catalítico activo que comprende los
residuos catalíticos, el bucle de activación o labio de
fosforilación, el motivo DFGWSxxxxxxxRxTxCGTxDYLPPE o DFG, y el
ancla de fosfato rica en glicina o el bucle rico en glicina (Véase,
Xie et al., Structure, 6, pp. 983-991
(1998); R. Giet y C. Prigent, J. Cell Sci., 112, pp.
3591-3601 (1999), que se incorpora en la presente
por referencia). El dominio de quinasa de la proteína
Aurora-2 comprende los residuos de aminoácidos
seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos
107-103, 127-403,
107-387 y 127-387 de acuerdo con SEQ
ID NO: 1.
La expresión "de tipo
Aurora-2" se refiere al total o una porción de
una molécula o complejo molecular que tiene una similitud de forma
con toda o una porción de la proteína Aurora-2. Por
ejemplo, en el bolsillo de unión a ATP de tipo
Aurora-2, la similitud de forma se define por una
desviación cuadrática media de las coordenadas estructurales de los
átomos del esqueleto entre los aminoácidos del sitio de unión a ATP
de tipo Aurora-2 y los aminoácidos del sitio de
unión a ATP de Aurora-2 (como se expone en las
figuras 1, 2, 3 o 4). En comparación con un aminoácido del bolsillo
de unión a ATP de Aurora-2, los aminoácidos
correspondientes del bolsillo de unión a ATP de tipo
Aurora-2 pueden o no ser idénticos. Dependiendo de
los residuos de aminoácidos de Aurora-2 que definen
el bolsillo de unión a ATP de Aurora-2, los expertos
en la técnica podrían localizar los residuos de aminoácidos
correspondientes que definen un bolsillo de unión a ATP de tipo
Aurora-2 en una proteína sobre la base de la
homología de secuencia y estructural.
La expresión "complejo de proteína
Aurora-2" o "complejo de una homóloga de
Aurora-2" se refiere a un complejo molecular
formado por la asociación de la proteína Aurora-2 o
una homóloga de Aurora-2 con una entidad química,
por ejemplo un ligando, un sustrato, un nucleótido trifosfato, un
nucleótido difosfato, un fosfato, un agonista o antagonista, un
inhibidor, un anticuerpo, un fármaco o un compuesto. En una
realización, la entidad química se selecciona del grupo que
consiste en ATP, un análogo de ATP, un nucleótido trifosfato y un
inhibidor del bolsillo de unión a ATP. En otra realización, el
inhibidor es un análogo de ATP tal como MgAMP-PNP
(imidodifosfato de adenililo), adenosina,
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)quinazolin-4-il)-amina
o
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
o
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina.
La expresión "bolsillo de unión" se refiere
a una región de una molécula o complejo molecular que, como
resultado de su forma y carga, se asocia favorablemente con otra
entidad química o compuesto. El término "bolsillo" incluye,
sin limitación, surco, canal o sitio. Las moléculas de
Aurora-2 o de tipo Aurora-2 pueden
tener bolsillos de unión que incluyen, sin limitación, sitios de
unión a péptidos o sustratos, de unión a ATP y de unión a
anticuerpos.
La expresión "sitio catalítico activo" o
"sitio activo" se refiere a la porción de la proteína quinasa a
la que se unen los sustratos nucleotídicos. Por ejemplo, el sitio
catalítico activo de Aurora-2 está en la interfaz
entre el subdominio N-terminal de cadena \beta y
el subdominio C-terminal de
\alpha-hélice, y está limitado por el bucle rico
en glicina y la bisagra (Véase, Xie et al., Structure,
6, pp. 983-991 (1998).
La expresión "entidad química" se refiere a
compuestos químicos, a complejos de al menos dos compuestos químicos
y a fragmentos de dichos compuestos o complejos. La entidad química
puede ser, por ejemplo, un ligando, un sustrato, un nucleótido
trifosfato, un nucleótido difosfato, un fosfato, un nucleótido, un
agonista, un antagonista, un inhibidor, un anticuerpo, un fármaco,
un péptido, una proteína o un compuesto.
"Sustituciones conservadoras" se refiere a
residuos que son física o funcionalmente similares a los
correspondientes residuos de referencia. Es decir, una sustitución
conservadora y su residuo de referencia tienen similar tamaño,
forma, carga eléctrica, propiedades químicas, que incluyen la
capacidad de formar enlaces covalentes o puente de hidrógeno, o
similares. Las sustituciones conservadoras preferidas son las que
cumplen los criterios definidos para una mutación puntual aceptada
en Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and
Structure, 5, pp. 345-352 (1978 & Supp.),
que se incorpora en la presente por referencia. Ejemplos de
sustituciones conservadoras son sustituciones que incluyen, sin
limitación, los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina,
alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico,
ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina;
(g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina.
La expresión "aminoácido correspondiente" o
"residuo que corresponde a" se refiere a un aminoácido
particular o análogo del mismo en una proteína
Aurora-2 u homóloga de Aurora-2 que
es idéntico o funcionalmente equivalente a un aminoácido de
Aurora-2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Se conocen en la técnica métodos para
identificar un aminoácido correspondiente y se basan en la
secuencia, en el alineamiento estructural, en, su posición
funcional o en una combinación de estos en comparación con la
quinasa Aurora-2. Por ejemplo, se pueden identificar
los aminoácidos correspondientes por superposición de los átomos
del esqueleto de los aminoácidos de Aurora-2 y de la
homóloga de Aurora-2 usando aplicaciones de
software bien conocidas, tales como QUANTA (Accelrys, San Diego, CA
©2001, 2002). Los aminoácidos correspondientes también se pueden
identificar usando programas de alineamiento de secuencia tales como
el programa de "mejor ajuste" disponible en Genetics Computer
Group, que usa el algoritmo de homología local descrito por Smith y
Waterman en Advances in Applied Mathematics 2, 482 (1981),
que se incorpora en la presente por referencia.
La expresión "solución de cristalización"
se refiere a una solución que promueve la cristalización que
comprende al menos un agente que incluye un tampón, una o más
sales, un agente precipitante, uno o más detergentes, azúcares o
compuestos orgánicos, iones de elementos lantánidos, un compuesto
poli-iónico y/o un estabilizante.
El término "dominio" se refiere a una
porción de la proteína Aurora-2 u homóloga que se
puede separar sobre la base de su función biológica, por ejemplo la
catálisis. El dominio puede comprender un bolsillo de unión, una
secuencia o un motivo estructural.
La expresión "operación de ajuste" se
refiere a una operación que utiliza las coordenadas estructurales de
una entidad química, bolsillo de unión, molécula o complejo
molecular, o porción de los mismos, para asociar la entidad química
con el bolsillo de unión, molécula o complejo molecular, o porción
de los mismos. Esto se puede lograr posicionando, rotando o
trasladando la entidad química en el bolsillo de unión para igualar
la forma y complementariedad electrostática del sitio de unión. Las
interacciones covalentes, interacciones no covalentes tales como el
enlace puente de hidrógeno, interacción electrostática, hidrófoba,
interacciones de van der Waals e interacciones electrostáticas no
complementarias tales como interacciones repulsivas
carga-carga, dipolo-dipolo y
carga-dipolo, se pueden optimizar. En forma
alternativa, se puede minimizar la energía de deformación de la
unión de la entidad química al bolsillo de unión.
La expresión "generar una estructura
tridimensional" o "generar una representación
tridimensional" se refiere a convertir las listas de coordenadas
estructurales en modelos estructurales o en una representación
gráfica en el espacio tridimensional. Esto se puede lograr mediante
software disponibles en el comercio o en forma pública. La
estructura tridimensional se puede exponer o usar para realizar el
modelado por ordenador o las operaciones de ajuste. Además, las
propias coordenadas estructurales se pueden usar para realizar el
modelado por ordenador y las operaciones de ajuste.
La expresión "modelo de homología" se
refiere a un modelo estructural derivado de (una)
estructura(s) tridimensionales conocida(s). La
generación del modelo de homología, denominado "modelado por
homología", puede incluir el alineamiento de secuencias,
reemplazo de residuos, ajuste de conformaciones de residuos a través
de la minimización de energía o una combinación de los mismos.
La expresión "homóloga de
Aurora-2" u "homóloga de
Aurora-2" se refiere a una molécula que es
homóloga de Aurora-2 en cuanto a estructura o
secuencia, pero que retiene la actividad de quinasa de una proteína
Aurora. Los ejemplos de homólogas incluyen, sin limitación,
Aurora-2 y Aurora-2 humana
proveniente de otra especie con sustituciones conservadoras,
adiciones, supresiones o una combinación de las mismas; u otro
miembro de la familia Aurora de proteína quinasas que incluyen, sin
limitación, Aurora-1 y Aurora-3, con
sustituciones conservadoras, adiciones, supresiones o una
combinación de las mismas.
La expresión "homólogo del dominio de quinasa
de Aurora-2" u "homólogo del dominio de
quinasa de Aurora-2" se refiere a una molécula
que tiene aminoácidos que corresponden a los aminoácidos del dominio
de quinasa de Aurora-2. Ejemplos de homólogos
incluyen, sin limitación, el dominio de quinasa de
Aurora-2 humana y Aurora-2 de otra
especie con sustituciones conservadoras; o el dominio de quinasa de
otro miembro de la familia Aurora de proteína quinasas que
incluyen, sin limitación, Aurora-1 y
Aurora-3, o con sustituciones conservadoras.
La expresión "complejo molecular" o
"complejo" se refiere a una molécula asociada con al menos una
entidad química.
El término "motivo" se refiere a una
porción de la proteína Aurora-2 u homóloga que
define un compartimiento estructural o realiza una función en la
proteína, por ejemplo catálisis, estabilización estructural o
fosforilación. El motivo puede estar conservado en cuanto a
secuencia, estructura y función. El motivo puede ser contiguo en la
secuencia primaria o espacio tridimensional. Los ejemplos de motivo
incluyen, sin limitación, el labio de fosforilación o el bucle de
activación, el bucle de anclaje de fosfato rico en glicina, el bucle
catalítico, el bucle DFG o DFGWSxxxxxxRxTxCGTxDIYPPE (Véase, Xie
et al., Structure, 6, pp. 983-991
(1998); R. Giet y C. Prigent, J. Cell Sci., 112, pp.
3591-3601 (1999)), y la caja de degradación.
La expresión "parte de un bolsillo de
unión" se refiere a menos que el total de los residuos de
aminoácidos que definen el bolsillo de unión. Por ejemplo, las
coordenadas estructurales de residuos que constituyen una parte de
un sitio de unión pueden ser específicas para definir el ambiente
químico del bolsillo de unión, o de utilidad para diseñar
fragmentos de un inhibidor que puede interactuar con esos residuos.
Por ejemplo, la porción de los residuos puede consistir en residuos
clave que cumplen una función en la unión del ligando, o pueden ser
residuos que están espacialmente relacionados y definen un
compartimiento tridimensional del bolsillo de unión. Los residuos
pueden ser contiguos o no contiguos en la secuencia primaria.
La expresión "parte de un dominio de quinasa
de Aurora-2" o "parte de un dominio de quinasa
de tipo Aurora-2" se refiere a menos que el
total del dominio catalítico de Aurora-2 o de una
proteína de tipo Aurora-2, respectivamente. Las
coordenadas estructurales de los residuos que constituyen parte de
un dominio de quinasa de Aurora-2 o de una
proteína de tipo Aurora-2 pueden ser específicas
para definir el ambiente químico del dominio, o de utilidad para
diseñar fragmentos de un inhibidor que puede interactuar con esos
residuos. Por ejemplo, la porción de residuos puede consistir en
residuos que cumplen un papel en la unión del ligando, o pueden ser
residuos que están espacialmente relacionadas y definen un
compartimiento tridimensional del dominio. Los residuos pueden ser
contiguos o no contiguos en la secuencia primaria. Por ejemplo,
parte de un dominio de quinasa de Aurora-2 puede
ser el sitio activo, el motivo DFG o DFGWSxxxxxxxRxTXCGTxDYLPPE, el
bucle rico en glicina, el bucle de activación o el bucle catalítico
(véase Xie et al., supra).
La expresión "parte de una proteína
Aurora-2" o "parte de una homóloga de
Aurora-2" se refiere a menos que el total de los
residuos de aminoácidos de una proteína Aurora-2 u
homóloga. En una realización, parte de una proteína
Aurora-2 u homóloga define los bolsillos de unión,
dominios, subdominios y motivos de la proteína u homóloga. Las
coordenadas estructurales de los residuos que constituyen parte de
una proteína Aurora-2 u homóloga pueden ser
específicas para definir el ambiente químico de la proteína, o de
utilidad para diseñar fragmentos de un inhibidor que puede
interactuar con esos residuos. La porción de residuos también puede
consistir en residuos que están espacialmente relacionadas y
definen un compartimiento tridimensional de un bolsillo de unión,
motivo o dominio. Los residuos pueden ser contiguos o no contiguos
en la secuencia primaria. Por ejemplo, la porción de residuos puede
consistir en residuos clave que cumplen un papel en la unión del
ligando o sustrato, unión de péptidos, unión de anticuerpos,
catálisis, estabilización estructural o degradación.
La expresión "desviación cuadrática media"
o "RMSD" significa la raíz cuadrada de la media aritmética de
los cuadrados de las desviaciones de la media. Es un modo de
expresar la desviación o variación de una tendencia u objeto. Para
los fines de esta invención, la "desviación cuadrática media"
define la variación en el esqueleto de una proteína respecto del
esqueleto de Aurora-2, un bolsillo de unión, un
motivo, un dominio, o porción de estos, definido por las
coordenadas estructurales de Aurora-2 descritas en
la presente. Debe ser evidente para los profesionales expertos que
el cálculo de la RMSD involucra un error estándar.
El término "remojado" se refiere a un
proceso en el cual el cristal se transfiere a una solución que
contiene un compuesto de interés.
La expresión "coordenadas estructurales" se
refiere a las coordenadas cartesianas derivadas de las ecuaciones
matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la difracción
de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de
dispersión ) de una proteína o complejo de proteínas en forma
cristalina. Los datos de difracción se usan para calcular un mapa
de densidad electrónica de la unidad repetitiva del cristal. Los
mapas de densidad electrónica posteriormente se usan para establecer
las posiciones de los átomos individuales de la molécula o el
complejo molecular.
El término "subdominio" se refiere a una
porción del dominio definido anteriormente en la proteína
Aurora-2 u homóloga. El dominio catalítico de
quinasa (residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que
consiste en los residuos de aminoácidos 107-403,
127-403, 107-387 y
127-387 de acuerdo con SEQ ID NO: 1) de
Aurora-2 es una estructura bilobular que consiste
en un subdominio de cadena \beta N-terminal
(residuos de aminoácidos 127 a 215) y un subdominio de
\alpha-hélice C-terminal (residuos
de aminoácidos 216 a 390).
La expresión "suficientemente homóloga de
Aurora-2" se refiere a una proteína que tiene una
homología de secuencia de al menos 20% en comparación con la
proteína Aurora-2. En una realización, la homología
de secuencia es al menos 40%.
La expresión "información de la estructura
tridimensional" se refiere a información obtenida de las
coordenadas estructurales. La información estructural generada
puede incluir la estructura o representación gráfica tridimensional
de la estructura. La información estructural también se puede
generar por sustracción de las distancias entre los átomos en las
coordenadas estructurales, cálculo de las energías químicas para una
molécula o complejo molecular de Aurora-2 u
homólogos de los mismos, cálculo o minimización de energías para una
asociación de una molécula de Aurora-2 o complejo
molecular u homólogos de los mismos a una entidad química.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización, en el contexto
de la presente invención se divulga una composición cristalizable o
cristal que comprende el dominio de quinasa de
Aurora-2 o un homólogo del dominio de quinasa de
Aurora-2 en presencia o ausencia de una entidad
química. El dominio de quinasa de Aurora-2 puede
estar fosforilado o no fosforilado. Con preferencia, la entidad
química es un análogo de ATP, un nucleótido trifosfato, un
nucleótido difosfato, un fosfato o un inhibidor del bolsillo de
unión a ATP. Con más preferencia, la entidad química es
MgAMP-PNP (imidodifosfato de adenililo), adenosina,
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
o
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina.
En otra realización, el cristal tiene una dimensión de celda
unitaria de a=b=87 \ring{A}, c=76 \ring{A},
\alpha=\beta=90º, \gamma=120º y pertenece al grupo espacial
P3_{2}21. Será evidente para los expertos en la técnica que las
celdas unitarias de las composiciones cristalinas pueden desviarse
\pm 1-2 \ring{A} de las anteriores dimensiones
de la celda dependiendo de la desviación de los cálculos de la celda
unitaria.
La proteína Aurora-2 o su
homóloga se puede producir por cualquier método bien conocido,
incluyendo métodos de síntesis, tales como síntesis en fase sólida,
fase líquida y combinación de fase sólida/fase líquida; métodos de
ADN recombinante, incluyendo clonación de ADNc, opcionalmente
combinado con mutagénesis dirigida al sitio; y/o purificación de
los productos naturales. En una realización preferida, la proteína
se sobreexpresa en un sistema de baculovirus o en un sistema de
E. coli. En una realización más preferida, la proteína se
sobreexpresa en un sistema de baculovirus.
En el contexto de la presente invención, también
se divulga un método de obtención de cristales de proteína
Aurora-2 o una de sus homólogas en presencia o
ausencia de una entidad química. Dichos métodos comprenden las
etapas de:
- a.
- producir y purificar la proteína Aurora-2;
- b.
- combinar dicha proteína Aurora-2, o una de sus homólogas en presencia o ausencia de una entidad química con una solución de cristalización para producir una composición cristalizable; y
- c.
- someter dicha composición cristalizable a condiciones que promuevan la cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de cristalización puede incluir, sin
limitación, polietilenglicol (PEG) entre aproximadamente 10% a 30%
v/v, sulfato de amonio 100-300 mM y un tampón que
mantiene el pH entre aproximadamente 4,0 y 8,0. En una realización,
la solución de cristalización comprende 25% de PEG 3350, ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 50 mM a
pH 6,0 y sulfato de amonio 200 mM.
De acuerdo con una realización, la composición
cristalizable comprende la proteína Aurora-2 o una
homóloga de esta en presencia o ausencia de una entidad química. En
otra realización, la composición cristalizable comprende una
proteína Aurora-2 y una entidad química. En una
realización, la composición cristalizable además comprende un
precipitante, polietilenglicol (PEG) entre aproximadamente 10 a 30%
v/v, sulfato de amonio 100-300 mM y un tampón que
mantiene el pH entre aproximadamente 4,0 y 8,0, y opcionalmente un
agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) entre aproximadamente
1 a 20 mM. La proteína Aurora-2 puede estar
fosforilada o no fosforilada. La proteína o el complejo de
Aurora-2 con preferencia es 85-100%
puro antes de formar la composición. Con más preferencia, la
proteína o el complejo de Aurora-2 es
90-100% puro. Aun con más preferencia, la proteína
o el complejo de Aurora-2 es 95-100%
puro.
En una realización preferida, la composición
cristalizable comprende el dominio de quinasa no fosforilado de la
proteína Aurora-2, 25% de PEG 3350, ácido 2-
(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 50 mM a pH
6,0, y sulfato de amonio 200 mM. En una realización más preferida,
la composición cristalizable comprende el dominio de quinasa no
fosforilado de la proteína Aurora-2, 25% de PEG
3350, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico
(MES) 50 mM a pH 6,0, sulfato de amonio 200 mM y una entidad
química seleccionada del grupo que consiste en un inhibidor y un
análogo de sustrato.
En otra realización, el método de obtención de
cristales de las proteínas Aurora-2 o una homóloga
de la misma en presencia o ausencia de una entidad química incluye
el uso de un dispositivo para promover las cristalizaciones. Los
dispositivos para promover la cristalización pueden incluir, sin
limitación, los dispositivos de gota colgante, gota sedente, gota
sándwich, diálisis, micro-lote o discontinuo en
microtubos (Patentes de Estados Unidos 4.886.646, 5.096.676,
5.130.105, 5.221.410 y 5.400.741; Pav et al., Proteins:
Structure, Function, and Genetics, 20, pp.
98-102 (1994); Chayen, Acta. Cryst., D54, pp.
8-15 (1998), Chayen, Structure, 5, pp.
1269-1274 (1997), D'Arcy et al., J. Cryst.
Growth, 168, pp. 175-180 (1996) y Chayen, J.
Appl. Cryst., 30, pp. 198-202 (1997), que se
incorpora en la presente por referencia). La gota colgante, gota
sedente y algunas adaptaciones de los métodos de
micro-lote (D'Arcy et al., J. Cryst.
Growth, 168, pp. 175-180 (1996) y Chayen, J.
Appl. Cryst., 30, pp. 198-202 (1997)) producen
cristales por difusión de vapor. La gota colgante y la gota sedente
que contienen la composición cristalizable se equilibran contra un
reservorio que contiene una mayor o menor concentración de
precipitante. A medida que la gota se aproxima al equilibrio con el
reservorio, la saturación de la proteína de la solución lleva a la
formación de cristales.
Se puede usar microsiembra para aumentar el
tamaño y la calidad de los cristales. En este caso, los
microcristales se trituran para producir una solución patrón de
semillas. La solución patrón de semillas se diluyen en forma
seriada. Se añade una pequeña muestra de cada solución diluida,
usando una aguja, cilindro de vidrio o hebra de pelo a un conjunto
de gotas equilibradas que contienen una concentración de proteína
igual o menor a una concentración necesaria para crear cristales
sin la presencia de semillas. El objetivo es obtener un cristal de
semilla único que actuará para nuclear el crecimiento del cristal en
la gota.
Será evidente para los expertos en la técnica
variar las condiciones de cristalización divulgadas anteriormente
para identificar otras condiciones de cristalización que producirían
cristales de proteína Aurora-2 o una homóloga de la
misma en presencia o ausencia de una entidad química. Dichas
variaciones incluyen, sin limitación, ajustar el pH, concentración
de proteína y/o temperatura de cristalización, cambiar la identidad
o concentración de la sal y/o precipitante usado, usar un método
diferente de cristalización, o introducir aditivos tales como
detergentes (por ejemplo, TWEEN 20 (monolaurato), LDOA, Brji 30 (4
lauril éter)), azúcares (por ejemplo, glucosa, maltosa), compuestos
orgánicos (por ejemplo, dioxano, dimetilformamida), iones de
elementos lantánidos o compuestos poli-iónicos que
ayudan en las cristalizaciones. También se pueden usar ensayos de
cristalización de alto rendimiento para contribuir al hallazgo u
optimización de las condiciones de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se reveló anteriormente, los solicitantes
han provisto las estructuras cristalinas tridimensionales por rayos
X de tres complejos inhibidores de Aurora-2 y un
complejo Aurora-2-adenosina. Las
estructuras cristalinas de Aurora-2 aquí
presentadas son las primeras informadas dentro de la subfamilia
Aurora. La invención será de utilidad para diseñar inhibidores y
estudiar el papel de Aurora-1,
Aurora-2 y Aurora-3 en la
señalización celular. Los datos de coordenadas atómicas se
presentan en las figuras 1-4.
A fin de usar las coordenadas estructurales
generadas para Aurora-2, sus complejos, uno de sus
bolsillos de unión, o uno de sus bolsillos de unión de tipo
Aurora-2, con frecuencia es necesario convertir las
coordenadas estructurales en una configuración tridimensional. Esto
se consigue mediante el uso de software disponible en el comercio
que es capaz de generar representaciones gráficas tridimensionales
de moléculas o porciones de estas a partir de un conjunto de
coordenadas estructurales.
Los bolsillos de unión, también denominados
sitios de unión en la presente invención, son de utilidad
significativa en campos tales como el descubrimiento de fármacos.
La asociación de ligandos o sustratos naturales con los bolsillos
de unión de sus correspondientes receptores o enzimas es la base de
muchos mecanismos de acción biológicos. De modo similar, muchos
fármacos ejercen sus efectos biológicos a través de la asociación
con los bolsillos de unión de receptores y enzimas. Tales
asociaciones pueden ocurrir con todo o parte del bolsillo de unión.
Una comprensión de tales asociaciones llevará al diseño de fármacos
que tengan asociaciones más favorables con su receptor o enzima
diana y, en consecuencia, mejores efectos biológicos. En
consecuencia, esta información es valiosa para diseñar potenciales
inhibidores de los bolsillos de unión de dianas biológicamente
importantes. Los bolsillos de unión al ATP y sustrato de la presente
invención serán importantes para el diseño de fármacos.
En una realización, parte del bolsillo de unión
tiene al menos dos residuos de aminoácidos, con preferencia E211 y
A213. En otra realización, el bolsillo de unión a ATP comprende los
aminoácidos L139, L194, L210, E211, A213, L263 y W277 de acuerdo
con una cualquiera de las figuras 1-4. Estos eran
residuos comunes hallados en los bolsillos de unión al ATP de cada
uno de los complejos de proteína descritos en la presente
invención.
En otra realización, el sitio de unión a ATP
comprende los aminoácidos L139, 6140, F144, V147, A160, K162, L194,
L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273, y W277
de acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 3. En otra realización, el bolsillo de unión a ATP
comprende los aminoácidos L139, G140, F144, V147, A160, K162, L194,
L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273, W277 y
S278 de acuerdo con la estructura del complejo de
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenilquinazolin-4-il)-amina
de la figura 1, o el complejo
Aurora-2-adenosina de la figura 4.
En aún otra realización, el bolsillo de unión a ATP comprende los
aminoácidos L139, G140, F144, V147, A160, K162, L194, L210,
E211,Y212, A213, P214, L215, T217, R220, L263, A273, W277, S278, y
V279 de acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 2. Los residuos de aminoácidos identificados
anteriormente estaban dentro de los 5 \ring{A} ("aminoácidos de
esfera de 5 \ring{A}") del inhibidor unido en los bolsillos de
unión al ATP. Estos residuos se identificaron usando el programa
QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA© 1998, 2000), O
(T.A. Jones et al., Acta Cryst., A47, pp.
110-119 (1991)) y RIBBONS (Carson, J. Apps.. Cryst.,
24, pp. 958-961 (1991)), que permiten la
presentación y producción de todos los residuos dentro de los 5
\ring{A} del inhibidor.
En otra realización, el bolsillo de unión a ATP
comprende los aminoácidos R137, L139, G140, 0142, F144, 0145, N146,
VI47, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162, L194, R195, L208,
I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V2I8, Y219, R220,
E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275 y W277 de
acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 3. En otra realización, el bolsillo de unión a ATP
comprende los aminoácidos R137, L139, G1,40, G142, F144, GI45,
N146, V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162, L194, R195,
L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P2I4, L215, T217, V218, Y219,
R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275,
W277 y S278 de acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 1 o el complejo
Aurora-2-adenosina de la figura 4.
En aún otra realización, el bolsillo de unión a ATP comprende los
aminoácidos R137, L139, G140, G142, F144, G145, N146, V147, Y148,
L149, I158, L159, A160, L161, K162, L194, R195, L208, I209, L210,
E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220, E260, N261,
L262, L263, L264, K271, I272, A273, D274, F275, W277, S278, y V279
de acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 2. Estos residuos de aminoácidos estaban dentro de los
8 \ring{A} ("aminoácidos de la esfera de 8 \ring{A}") del
inhibidor unido en los bolsillos de unión al ATP. Estos residuos se
identificaron usando los programas QUANTA, O y RIBBONS,
supra.
Usado un programa de alineamiento múltiple para
comparar cada estructura de Aurora-2 y las
estructuras de otros miembros de la familia de proteína quinasas
(Gerstein et al., J. Mol. Biol., 251, pp.
161-175 (1995), que se incorpora en la presente por
referencia), los aminoácidos anteriores se identificaron como el
bolsillo de unión a ATP. Para la comparación, en primer lugar, se
realiza un alineamiento de secuencias entre miembros de la familia
de proteína quinasas que incluyen GSK-3\beta (PDB
número de acceso 1109), p38 (K. P. Wilson et al., J. Biol.
Chem., 271, pp. 27696-27700 (1996); Z. Wang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, pp.
2327-32 (1997)), cdk2 (PDB número de acceso 1B38),
SRC (Xu, W., et al., Cell 3, pp. 629-638
(1999); PDB número de acceso 2SRC), MAPKAP2 (solicitud provisional
de Estados Unidos 60/337.513), y ERK2 (Zhang et al., Nature,
367, pp. 704-711 (1994); PDB número de acceso 1ERK).
En segundo lugar, se construye un núcleo putativo por superposición
de una serie de estructuras correspondientes de la familia de
proteína quinasas. En tercer lugar, se descartan los residuos de
alta variación espacial y el alineamiento del núcleo se ajusta
iterativamente. Los aminoácidos que componen la estructura del
núcleo final tienen varianza estructural baja y tienen la misma
conformación local y global con respecto a los correspondientes
residuos de la familia de proteínas.
En consecuencia, en otra realización, el
bolsillo de unión a ATP comprende los aminoácidos F133, I135, G136,
R137, F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159,
A160, L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194,
R195, L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210,
E211, Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229,
E230, Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240,
A241, N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251,
V252, I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262,
L263, L264, G265, S266 G268, E269, L270, K271, I272, A273,
D274, F275 y W277 de acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 3.
En otra realización, el bolsillo de unión a ATP
comprende los aminoácidos F133, I135, G136, R137, F144, N146, V147,
Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160, L161, K162, V163,
Vl82, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195, L196, Y197, G198,
Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, I210, E211, Y212, A213, P214,
L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230, Q231, R232, T233,
A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241, N242, A243, L244,
S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252, I253, H254, R255,
D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263, L264, G265, S266,
G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275, W277 y S278 de
acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 1 o el complejo
Aurora-2-adenosina de la figura
4.
En otra realización, el bolsillo de unión a ATP
comprende los aminoácidos F133, I135, G136, RI37, F144, N146, V147,
Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160, L161, K162, V163,
V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195, L196, Y197, G198,
Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214,
L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230, Q231, R232, T233,
A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241, N242, A243, L244,
S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252, I253, H254, 8255,
D256, I257, K258, P259, E260,N261, L262, L263, L264, G265, S266,
G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275, W277, S278 y V279 de
acuerdo con la estructura del complejo
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
de la figura 2.
Será evidente para los expertos en la técnica
que la numeración de los aminoácidos en otras homólogas de
Aurora-2 puede ser diferente de la expuesta para
Aurora-2. Los aminoácidos correspondientes en las
homólogas de Aurora-2 se identifican fácilmente por
inspección visual de las secuencias de aminoácidos o utilizando
programas de computación de homología de secuencia, homología
estructural o superposición estructural disponibles en el
comercio.
Los expertos en la técnica entenderán que un
conjunto de coordenadas estructurales para una molécula o un
complejo molecular o una porción de los mismos, es un conjunto de
puntos relativos que define una forma en tres dimensiones. En
consecuencia, es posible que un conjunto de coordenadas
completamente diferentes pueda definir una configuración similar o
idéntica. Además, ligeras variaciones en las coordenadas
individuales tendrán poco efecto sobre la forma total. En términos
de bolsillos de unión, no se esperaría que estas variaciones
alteren significativamente la naturaleza de los ligandos que podrían
asociarse con estos bolsillos.
Las variaciones en las coordenadas descritas
anteriormente se pueden generar como resultado de manipulaciones
matemáticas de las coordenadas estructurales de
Aurora-2. Por ejemplo, las coordenadas estructurales
expuestas en la figura 1, 2, 3 o 4 se podrían manipular por
permutaciones cristalográficas de las coordenadas estructurales,
fraccionamiento de las coordenadas estructurales, adiciones o
sustracciones de números enteros a conjuntos de coordenadas
estructurales, inversión de las coordenadas estructurales o
cualquier combinación de las anteriores.
En forma alternativa, las modificaciones en la
estructura cristalina debidas a mutaciones, adiciones,
substituciones y/o supresiones de aminoácidos, u otros cambios en
alguno de los componentes que constituyen el cristal también se
podrían explicar por las variaciones de las coordenadas
estructurales. Si tales variaciones están dentro de una determinada
desviación cuadrática media en comparación con las coordenadas
originales, la forma tridimensional resultante se considera
comprendida por esta invención. Así, por ejemplo, también sería de
esperar que un ligando que se une al bolsillo de unión de
Aurora-2 se una a otro bolsillo de unión cuyas
coordenadas estructurales definen una forma que se cae dentro de la
desviación cuadrática media aceptable.
Varios análisis computacionales pueden ser
necesarios para determinar si un bolsillo de unión, motivo, dominio
o porción de estos de una molécula o complejo molecular es
suficientemente similar al bolsillo de unión, motivo, dominio o
porción de estos de Aurora-2. Tal análisis se puede
llevar a cabo usando aplicaciones de software bien conocidas, tales
como ProFit (A. C.R. Martin, SciTech Software, ProFit versión 1.8,
University College London, http://www.bioinf.org.uk/software),
Swiss-Pdb Viewer (Guex et al.,
Electrophoresis, 18, pp. 2714-2723 (1997)),
aplicación de Semejanza Molecular de QUANTA (Molecular Simulations
Inc., San Diego, CA© 1998, 2000) y como se describe en la Guía del
Usuario adjunta, que se incorporan en la presente por
referencia.
Los programas anteriores permiten las
comparaciones entre diferentes estructuras, diferentes
conformaciones de la misma estructura, y diferentes partes de la
misma estructura. El procedimiento usado en QUANTA (Molecular
Simulations, Inc., San. Diego, CA 51998, 2000) y
Swiss-Pdb Viewer para comparar estructuras se divide
en cuatro etapas: 1) cargar las estructuras que se van a comparar;
2) definir las equivalencias atómicas en estas estructuras; 3)
realizar una operación de ajuste de las estructuras; y 4) analizar
los resultados.
El procedimiento usado en ProFit para comparar
las estructuras incluye las siguientes etapas: 1) cargar las
estructuras que se van a comparar; 2) seleccionar específicamente
los residuos de interés; 3) definir las equivalencias atómicas de
los residuos seleccionados; 4) realizar una operación de ajuste en
los residuos seleccionados; y 5) analizar los resultados.
Cada estructura de la comparación se identifica
por un nombre. Una estructura se identifica como el objetivo (es
decir, la estructura fijada); todas las estructuras restantes son
estructuras activas (es decir, estructuras móviles). Debido a que
la equivalencia atómica de los programa anteriores está definida por
la entrada del usuario, a los fines de esta invención definiremos
los átomos equivalentes como átomos del esqueleto de la proteína
(N, C\alpha, C y O) para los aminoácidos de
Aurora-2 y los aminoácidos correspondientes de las
estructuras que se están comparando.
Los aminoácidos correspondientes se pueden
identificar por los programas de alineamiento de secuencias tales
como el programa "mejor ajuste" disponible del Genetics
Computer Group que utiliza el algoritmo de homología local descrito
por Smith y Waterman en Advances in Applied Mathematics 2,
482 (1981), que se incorpora en la presente por referencia. Un
alineamiento de secuencias de aminoácidos adecuado requerirá que las
proteínas que se alinean compartan un porcentaje mínimo de
aminoácidos idénticos. En general, una primera proteína que se
alinea con una segunda proteína debe compartir más de
aproximadamente 35% de aminoácidos idénticos [Hanks et al.,
Science, 241, 42 (1988); Hanks y Quinn, Methods in
Enzymology, 200, 38 (1991)11. La identificación de
residuos equivalentes también se puede ayudar con el alineamiento de
estructura secundaria, por ejemplo el alineamiento de
\alpha-hélices, láminas \beta de la estructura.
El programa Swiss-Pdb Viewer tiene su propio
algoritmo de ajuste que se basa en los alineamientos de secuencias
secundarias.
Cuando se usa un método de ajuste rígido, la
estructura de trabajo se traslada y rota para obtener un ajuste
óptimo con la estructura buscada. La operación de ajuste utiliza un
algoritmo que computa la translación y rotación óptimas aplicadas a
la estructura móvil, de modo que la diferencia cuadrática media del
ajuste respecto de pares especificados del átomo equivalente es un
mínimo absoluto. Esta cantidad, dada en angstrom, es informada por
los programas anteriores. El programa Swiss-Pdb
Viewer fija un valor límite de RMSD para eliminar pares de átomos
equivalentes que tienen valores de RMSD altos. Un valor límite de
RMSD se puede usar para excluir pares de átomos equivalentes con
valores extremos de RMSD individuales. En el programa ProFit, el
valor límite de RMSD puede ser especificado por el usuario.
El ajuste rígido entre las estructuras se
realizó por QUANTA y posteriormente se ingresó en el programa
ProFit, a partir del cual se determinaron los valores de RMSD. Para
los aminoácidos de la esfera de 5 \ring{A} y 8 \ring{A}, los
valores de RMSD del bolsillo de unión a ATP entre el complejo
Aurora-2-adenosina y los complejos
Aurora-2-inhibidor son de
0,61-0,77 \ring{A} y 0,58-0,64
\ring{A}, respectivamente. La comparación del dominio de quinasa
entero entre las estructuras de Aurora-2 de la
presente invención produce valores de RMSD en el rango de
0,61-0,77 \ring{A} usando
Aurora-2-adenosina como referencia.
Los valores de RMSD son promedios de valores de RMSD individuales
calculados para los átomos del esqueleto (C, O, N y C\alpha) de
todos los residuos de la quinasa o del bolsillo de unión a ATP
entre la estructura de referencia y las otras estructuras del
complejo Aurora-2-inhibidor.
A los fines de esta invención, cualquier
molécula, complejo molecular, bolsillo de unión, motivo, dominio de
estos o porción de estos que esté dentro de una desviación
cuadrática media para los átomos del esqueleto (N, C\alpha, C, O)
cuando se superponen sobre los átomos del esqueleto relevantes
descritos por las coordenadas estructurales listadas de las figuras
1-4, está comprendido por esta invención.
En consecuencia, una realización de esta
invención describe una molécula o complejo molecular que comprende
todo o parte de un bolsillo de unión a ATP de
Aurora-2 definido por las coordenadas estructurales
de un conjunto de residuos de aminoácidos que corresponden a los
residuos de aminoácidos de Aurora-2 L139, L194,
L210, E211, A213, L263 y W277 de acuerdo con una cualquiera de las
figuras 1-4, donde la desviación cuadrática media de
los átomos del esqueleto entre dichos aminoácidos de dicha molécula
o complejo molecular y dichos aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3,0
\ring{A}. En una realización, la RMSD no es mayor que
aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,5
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
\newpage
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
AI60, K162, 1,194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220,
L263, A273 y W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación
cuadrática media (RMSD) de los átomos del esqueleto entre dichos
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
A160, K162, L194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220,
L263, A273, W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la
desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos del esqueleto entre
dichos residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo
molecular y dichos aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,8 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2
\ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
A160, K162, L194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220,
L263, A273, W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la
desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos del esqueleto entre
dichos residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo
molecular y dichos aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,8 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2
\ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, G142,
F144, G145, N146, V147, Y148, L149, I158, LI59, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T2I7,
V218, Y219, R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275 y W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre dichos
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, G142,
F144, G145, N146, V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T2I7,
V218, Y219, R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275, W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre
dichos aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, G142,
F144, G145, N146, V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217,
V218, Y219, R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275, W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre
dichos aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160,
L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195,
L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275 y
W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación cuadrática
media de los átomos del esqueleto entre dichos aminoácidos de dicha
molécula o complejo molecular y dichos aminoácidos de
Aurora-2 es no más que aproximadamente 3,0
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,5 \ring{A}.
En una realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,3
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definidos por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160,
L161, K162, VI63, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195,
L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275,
W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre dichos
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de la presente invención
describe una molécula o complejo molecular que comprende todo o
parte de un bolsillo de unión a ATP de Aurora-2
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160,
L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195,
L196, Y197, GI98, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, 2214, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275,
W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre dichos
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3,0 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 2,0 \ring{A}. En una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 1,0 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 0,8
\ring{A}. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,5A. En una realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 0,3 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,2 \ring{A}.
Otra realización de esta invención describe una
molécula o complejo molecular que comprende una proteína definida
por las coordenadas estructurales de un conjunto de residuos de
aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos de
Aurora-2 de acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4, donde
la desviación cuadrática media entre dicho conjunto de residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos
de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 5 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 4 \ring{A}. En una realización, la RSMD
no es mayor que aproximadamente 3 \ring{A}. En una realización,
la RSMD no es mayor que aproximadamente 2 \ring{A}. En una
realización, la RSMD no es mayor que aproximadamente 1,5
\ring{A}. En otra realización, la RSMD no es mayor que
aproximadamente 1 \ring{A}. En una realización, la RSMD no es
mayor que aproximadamente 0,8 \ring{A}. en una realización, la
RSMD no es mayor que aproximadamente 0,5 \ring{A}.
En una realización, las moléculas o los
complejos moleculares anteriores están en forma cristalina.
De acuerdo con otra realización, en el contexto
de la presente invención, se divulga un medio de almacenamiento de
datos legible por máquina, que comprende un material de
almacenamiento de datos codificado con datos legibles por máquina,
en el que dichos datos definen las moléculas o complejos moleculares
mencionados anteriormente. En una realización, los datos definen
los bolsillos de unión anteriormente mencionados comprendiendo las
coordenadas estructurales de dichos residuos de aminoácidos de
acuerdo con cualquiera de las figuras 1-4. Para usar
las coordenadas estructurales generadas para
Aurora-2, sus homólogos, o uno de sus bolsillos de
unión, a veces es necesario convertirlos en una forma
tridimensional. Esto se logra mediante el uso de software disponible
en el comercio o al público que es capaz de generar una estructura
tridimensional de moléculas o porciones de estas a partir de un
conjunto de coordenadas estructurales. La estructura tridimensional
se puede mostrar como una representación gráfica.
En consecuencia, de acuerdo con otra
realización, en el contexto de la presente invención, se divulga un
medio de almacenamiento de datos legible por máquina que comprende
un material de almacenamiento de datos codificado con datos
legibles por máquina. En una realización, una máquina programada con
instrucciones para usar dichos datos, es capaz de generar una
estructura tridimensional de alguna de las moléculas o complejos
moleculares, o bolsillos de unión de los mismos, que se describen
en la presente.
También se divulga un ordenador que
comprende:
(a) un medio de almacenamiento de datos legibles
por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos
codificado con datos legibles por máquina, en el que dichos datos
definen cualquiera de las moléculas o complejos moleculares
anteriores;
(b) una memoria de trabajo para almacenar
instrucciones para procesar dichos datos legibles por máquina;
(c) una unidad de procesamiento central (CPU)
acoplada a dicha memoria de trabajo y a dicho medio de
almacenamiento de datos legible por máquina para procesar dichos
datos legibles por máquina y medios para generar información de la
estructura tridimensional de dicha molécula o complejo molecular;
y
(d) hardware de salida acoplado a dicha unidad
de procesamiento central para producir información de la estructura
tridimensional de dicha molécula o complejo molecular, o información
producida usando dicha información de la estructura tridimensional
de dicha molécula o complejo molecular.
En una realización, los datos definen el
bolsillo o la proteína de unión de la molécula o complejo
molecular.
La generación de datos tridimensionales puede
ser provista por una instrucción o conjunto de instrucciones tal
como un programa o comandos del ordenador para generar una
estructura o representación gráfica tridimensional a partir de las
coordenadas estructurales, o por sustracción de las distancias entre
átomos, cálculo de las energías químicas para una molécula de
Aurora-2 molécula o complejo molecular u homólogos
de estos o cálculo o minimización de energías para una asociación
de una molécula de Aurora-2 o complejo molecular u
homólogos de estos a una entidad química. La representación gráfica
puede ser generada o visualizada por programas de software
disponibles en el comercio. Los ejemplos de programas de software
incluyen, sin limitación, QUANTA [Accelrys ©2001, 2002], O [Jones
et al., Acta Crystallogr. A47, PP.
110-119 (1991)] y RIBBONS [Carson, J. Appl.
Crystallogr., 24, pp. 9589-961 (1991)), que se
incorporan en la presente por referencia. Ciertos programas de
software pueden dotar a esta representación de atributos
físico-químicos que son conocidos a partir de la
composición química de la molécula, tales como carga del residuo,
hidrofobicidad, grados de libertad de torsión y rotación para el
residuo o segmento, etc. Los ejemplos de programas de software para
calcular energías químicas se describen en la sección de Diseño
Racional de Fármacos.
En una realización, el ordenador está ejecutando
una instrucción tal como un programa de computación para la
generación de datos tridimensionales.
La información de dicho bolsillo de unión o la
información producida usando dicho bolsillo de unión se puede
producir a través de terminales, pantallas táctiles, máquinas de
fax, modems, impresoras de CD-ROM o unidades de
disco. La información puede estar en forma gráfica o
alfanumérica.
La figura 9 muestra una versión de estas
realizaciones. El sistema (10) incluyen un ordenador (11) que
comprende una unidad de procesamiento central ("CPU") (20),
una memoria de trabajo (22) que puede ser, por ejemplo, RAM
(memoria de acceso aleatorio) o memoria "central", memoria de
almacenamiento de datos (24) (tal como una o más unidades de disco
o unidades de CD-ROM), uno o más terminales de
display de tubos de rayos catódicos ("CRT") (26), uno o más
teclados (28), una o más líneas de entrada (30), y una o más líneas
de salida (40), las cuales están interconectadas por un conductor
de sistema bidireccional convencional (50).
El hardware de entrada (36), acoplado al
ordenador (11) por líneas de entrada (30), se puede implementar en
una variedad de maneras. Los datos legibles por máquina de esta
invención se pueden ingresar por medio de un modem o modems (32)
conectados por línea telefónica o línea destinada a datos (34). En
forma alternativa o adicional, el hardware de entrada (36) puede
comprender unidades de CD-ROM o unidades de disco
(24). En conjunto con la terminal de display (26), también se puede
usar el teclado (28) como dispositivo de entrada.
El hardware de salida (46), acoplado al
ordenador (11) por las líneas de salida (40), se puede implementar
de modo similar por dispositivos convencionales. A modo de ejemplo,
el hardware de salida (46) puede incluir una terminal de display
CRT (26) para visualizar una representación gráfica de un bolsillo
de unión de la presente invención usando un programa tal como
QUANTA como se describe en la presente. El hardware de salida
también puede incluir una impresora (42), de modo que se puede
producir la salida de una copia en papel o una unidad de disco
(24), para almacenar la salida del sistema para uso posterior. El
hardware de salida también puede incluir una grabadora de CD o DVD,
unidades ZIP^{TM} o JAZ^{TM}, u otro dispositivo de
almacenamiento de datos legibles por máquina.
En la operación, la CPU (20) coordina el uso de
los diversos dispositivos de entrada y salida (36), (46), coordina
los accesos de los datos desde la memoria de gran capacidad (24) y
los accesos a y desde la memoria de trabajo {22), y determina la
secuencia de las etapas de procesamiento de datos. Se pueden usar
numerosos programas para procesar los datos legibles por máquina de
la presente invención. Dichos programas se describen con referencia
a los métodos computacionales de descubrimiento de fármacos
descritos en la presente. Se incluyen referencias específicas a los
componentes del sistema de hardware (10) según corresponda a lo
largo de la siguiente descripción del medio de almacenamiento de
datos.
La figura 10 muestra una sección transversal de
un medio de almacenamiento de datos magnético (100) que puede estar
codificado con datos legibles por máquina que pueden obtenerse por
un sistema tal como el sistema (10) de la figura 9. El medio (100)
puede ser un disquete convencional o disco duro, que tenga un
sustrato adecuado (101), que puede ser convencional, y una cubierta
adecuada (102), que puede ser convencional, en uno o ambos lados,
que contenga dominios magnéticos (no visibles) cuya polaridad u
orientación puede ser alterada magnéticamente. El medio (100)
también pueden tener una abertura (no mostrada) para recibir el eje
de una unidad de disco u otro dispositivo de almacenamiento de
datos (24).
Los dominios magnéticos de la cubierta (102) del
medio (100) están polarizados u orientados de modo de codificar de
una manera que puede ser convencional, datos legibles por máquina
tales como los que se describen en la presente, para la ejecución
por un sistema tal como el sistema (10) de la figura 9.
La figura 11 muestra una sección transversal de
un medio de almacenamiento de datos ópticamente legible (110) que
también puede estar codificado con dichos datos legibles por
máquina, o conjunto de instrucciones, que pueden ser llevadas a
cabo por un sistema tal como el sistema (10) de la figura 9. El
medio (100) puede ser un disco compacto de memoria sólo lectura
convencional (CD-ROM) o un medio regrabable tal como
un disco magnetoóptico que es ópticamente legible y grabable en
forma magnetoóptica. El medio (100) con preferencia tiene un
sustrato adecuado (111), que puede ser convencional, y una cubierta
adecuada (112), que puede ser convencional, usualmente de un lado
del sustrato (111).
En el caso de CD-ROM, como es
bien conocido, la cubierta (112) es reflectante y se imprime con una
pluralidad de marcas (113) para codificar los datos legibles por
máquina. La disposición de las marcas se lee por el reflejo de luz
láser fuera de la superficie de la cubierta (112). Una cubierta
protectora (114), que con preferencia es sustancialmente
transparente, se proporciona en la parte superior de la cubierta
(112).
En el caso de un disco magnetoóptico, como es
bien conocido, la cubierta (112) no tiene marcas (113), pero tiene
una pluralidad de dominios magnéticos cuya polaridad u orientación
se pueden cambiar magnéticamente cuando se calienta por encima de
una temperatura determinada, como por un láser (no mostrado). La
orientación de los dominios se puede leer por medición de la
polarización de la luz láser reflejada desde la cubierta (112). La
disposición de los dominios codifica los datos como se describió
anteriormente.
En una realización, las coordenadas
estructurales de dicha moléculas o complejos moleculares son
producidas por un modelado por homología de al menos una porción de
las coordenadas estructurales de la Figura 1, 2, 3 o 4. El modelado
por homología se puede usar para generar modelos estructurales de
las homólogas de Aurora-2 u otras proteínas
homólogas sobre la base de la estructura de Aurora-2
conocida. Esto se puede lograr realizando una o más de las
siguientes etapas: realizar el alineamiento de secuencias entre la
secuencia de aminoácidos de una molécula desconocida contra la
secuencia de aminoácidos de Aurora-2; identificar
las regiones conservadas y variables por secuencia o estructura;
generar las coordenadas estructurales para los residuos de
estructura conservada de la estructura desconocida a partir de los
de Aurora-2; generar conformaciones para los
residuos de estructura variable de la estructura desconocida;
reemplazar los residuos de Aurora-2 no conservados
con los residuos de la estructura desconocida; construir
conformaciones de cadena lateral; y ajustar y/o evaluar la
estructura desconocida.
Por ejemplo, debido a que la secuencia proteica
de los dominios catalíticos de Aurora-2 y
Aurora-1 o Aurora-3 se puede
alinear entre sí, es posible construir modelos de las estructuras de
Aurora-1 o Aurora-3, particularmente
en las regiones del sitio activo, usando la estructura de
Aurora-2. Los programas de software que son útiles
en el modelado por homología incluyen XALIGN [Wishart, D. S. et
al., Comput. Appl. Biosci., 10, pp.
687-88 (1994)] y CLUSTAL W Alignment Tool [Higgins
D. G. et al., Methods Enzymol., 266, pp.
383-402 (1996)]. Véase también, la Patente de
Estados Unidos Núm. 5.884.230. Estas referencias se incorporan en la
presente por referencia.
Para realizar el alineamiento de secuencias, se
pueden usar programas tales como el programa "mejor ajuste"
disponible de Genetics Computer Group [Waterman in Advances in
Applied Mathematics 2, 482 (1981), que se incorpora en la
presente por referencia] y CLUSTAL W Alignment Tool [Higgins D. G.
et al., Methods Enzymol., 266, pp.
383-402 (1996), que se incorpora por referencia].
Para modelar las cadenas laterales de los aminoácidos de
Aurora-1 o Aurora-3, se pueden
reemplazar los residuos de aminoácidos de Aurora-2,
usando un programa de gráficos de computación tal como "O"
[Jones et al, (1991) Acta Cryst. Sect. A, 47:
110-1191, por los de la proteína homóloga, cuando
difieren. Se puede usar la misma orientación o una orientación
diferente del aminoácido. Las inserciones y supresiones de residuos
de aminoácidos pueden ser necesarias cuando se producen brechas en
el alineamiento de secuencias. Sin embargo, ciertas porciones del
sitio activo de Aurora-2 y sus homólogas están
altamente conservadas esencialmente sin inserciones ni
supresiones.
El modelado por homología se puede realizar
usando, por ejemplo, los programas de computación
SWISS-MODEL disponibles de Glaxo Wellcome
Experimental Research en Ginebra, Suiza; WHATIF disponible en
servidores EMBL; Schnare et al., J. Mol. Biol, 256:
701-719 (1996); Blundell et al., Nature 326:
347-352 (1987); Fetrow y Bryant,
Bio/Technology 11:479-484 (1993); Greer,
Methods in Enzymology 202: 239-252 (1991); y
Johnson et al, Crit. Rev. Biochem. Mol Biol.
29:1-68 (1994). Un ejemplo de modelado por homología
se puede hallar, por ejemplo, en Szklarz G.D., Life Sci. 61:
2507-2520 (1997). Estas referencias se incorporan en
la presente por referencia.
En consecuencia, de acuerdo con la presente
invención, los datos capaces de generar la estructura tridimensional
de las moléculas o complejos moleculares anteriores, o sus
bolsillos de unión, se pueden almacenar en un medio de
almacenamiento legible por máquina, que es capaz de mostrar una
representación gráfica tridimensional de la estructura.
\vskip1.000000\baselineskip
Las coordenadas estructurales de
Aurora-2 o la representación gráfica tridimensional
generada a partir de estas coordenadas se pueden usar en
combinación con un ordenador para una variedad de propósitos, que
incluyen el descubrimiento de fármacos.
Por ejemplo, la estructura codificada por los
datos se puede evaluar por medio de computación en cuanto a su
capacidad para asociarse con entidades químicas. Las entidades
químicas que se asocian con Aurora-2 pueden inhibir
a Aurora-2 o a sus homólogas, y son fármacos
candidatos potenciales. En forma alternativa, la estructura
codificada por los datos se puede visualizar en una representación
gráfica tridimensional en una pantalla de ordenador. Esto permite
la inspección visual de la estructura, así como la inspección visual
de la asociación de la estructura con las entidades químicas.
En consecuencia, de acuerdo con otra
realización, la invención describe un método para diseñar,
seleccionar y/u optimizar una entidad química que se une a toda o
parte de la molécula o complejo molecular, que comprende las etapas
de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicha molécula o complejo molecular en un ordenador que
comprende el medio para generar información de la estructura
tridimensional de toda o parte de dicha molécula o complejo
molecular a partir de dichas coordenadas estructurales; y
(b) diseñar, seleccionar y/u optimizar dicha
entidad química empleando medios para realizar una operación de
ajuste entre dicha entidad química y dicha información de la
estructura tridimensional de toda o parte de dicha molécula o
complejo molecular.
En una realización, el método es para diseñar,
seleccionar y/u optimizar una entidad química que se une con el
bolsillo de unión de una molécula o complejo molecular. En una
realización, el método anterior además comprende las siguientes
etapas antes de la etapa (a):
(c) producir un cristal de una molécula o
complejo molecular que comprende Aurora-2 u homóloga
de la misma;
(d) determinar las coordenadas estructurales
tridimensionales de la molécula o complejo molecular por difracción
de rayos X del cristal; y
(e) identificar todo o parte de dicho bolsillo
de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
La información estructural tridimensional de la
etapa (a) puede ser generada por instrucciones, tales como un
programa o comandos de computación que pueden generar una estructura
o representación gráfica tridimensional; sustraer distancias entre
los átomos; calcular las energías químicas para una molécula,
complejo molecular de Aurora-2 u homólogos de los
mismos; o calcular o minimizar las energías de una asociación de
molécula, complejo molecular de Aurora-2 u
homólogos de los mismos a una entidad química. Estos tipos de
programas de computación son conocidos en la técnica. La
representación gráfica se puede generar o visualizar por programas
de software disponibles en el comercio. Ejemplos de programas de
software incluyen, sin limitación, QUANTA [Accelrys ©2001, 2002], O
[Jones et al., Acta Crystallogr. A47, pp.
110-119 (1991)] y RIBBONS [Carson, J. Appl.
Crystallogr., 24, pp. 9589-961 (1991)], que se
incorporan en la presente por referencia. Ciertos programas de
software pueden dotar a esta representación de atributos
físico-químicos que son conocidos a partir de la
composición química de la molécula, tales como carga del residuo,
hidrofobicidad, grados de libertad de torsión y rotación para el
residuo o segmento, etc. Se describen más adelante ejemplos de
programas de software para calcular energías químicas.
En consecuencia, de acuerdo con otra
realización, en el contexto de la presente invención se divulga un
método para evaluar la posibilidad de que una entidad química se
asocie con toda o parte de una molécula o complejo molecular como
se describe previamente en las diferentes realizaciones.
Este método comprende las etapas de: (a) emplear
medios computacionales para realizar una operación de ajuste entre
la entidad química y toda o parte de la molécula o complejo
molecular descritos anteriormente; (b) analizar los resultados de
dicha operación de ajuste para cuantificar la asociación entre la
entidad química y toda o parte de la molécula o complejo molecular;
y opcionalmente (c) dar salida a dicha asociación cuantificada a un
hardware de salida adecuado, tal como una terminal de CRT, una
grabadora de CD o DVD, unidad de ZIP^{TM} o JAZ^{TM}, una
unidad de disco u otros dispositivos de almacenamiento de datos
legibles por máquina, como se describió previamente. El método
también puede comprender generar una estructura tridimensional,
representación gráfica de la misma, o ambas de toda o parte de la
molécula o el complejo molecular antes de la etapa (a). En una
realización, el método es para evaluar la capacidad de una entidad
química de asociarse con todo o parte del bolsillo de unión de una
molécula o complejo molecular.
En otra realización, se divulga un método para
analizar una pluralidad de entidades químicas que se asocian con
una energía de deformación de unión menor que -7 kcal/mol con dicho
bolsillo de unión en el contexto de la presente invención:
(a) emplear medios computacionales, que utilizan
dichas coordenadas estructurales para realizar una operación de
ajuste entre una de dichas entidades químicas a partir de la
pluralidad de entidades químicas y dicho bolsillo de unión;
(b) cuantificar la energía de deformación de
unión entre la entidad química y el bolsillo de unión;
(c) repetir las etapas (a) y (b) para cada
entidad química restante; y
(d) producir un conjunto de entidades químicas
que se asocian con el sitio de unión con una energía de deformación
de unión menor que -7 kcal/mol a un hardware de salida adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, el método comprende las
etapas de:
(a) construir un modelo por ordenador de un
bolsillo de unión de la molécula o complejo molecular;
(b) seleccionar una entidad química que será
evaluada por método seleccionado del grupo que consiste en ensamblar
dicha entidad química; seleccionar una entidad química a partir de
una base de datos de moléculas pequeñas; diseño de novo del ligando
de dicha entidad química; y modificar un agonista o inhibidor
conocido, o una porción del mismo, de una proteína de
Aurora-2 u homóloga de la misma;
(c) emplear medios computacionales para realizar
una operación de ajuste entre los modelos por ordenador de dicha
entidad química evaluada y dicho bolsillo de unión a fin de
proporcionar una configuración de energía minimizada de dicha
entidad química en el bolsillo de unión; y
(d) evaluar los resultados de dicha operación de
ajuste para cuantificar la asociación entre dicha entidad química y
el modelo del bolsillo de unión, a través del cual se evalúa la
capacidad de dicha entidad química de asociarse con dicho bolsillo
de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, en el contexto de la
presente invención, se divulga un método para utilizar un ordenador
para evaluar la capacidad de una entidad química de asociarse con
toda o parte de la molécula o complejo molecular, en el que dicho
ordenador comprende un medio de almacenamiento de datos legible por
máquina que comprende un material de almacenamiento de datos
codificado con dichas coordenadas estructurales que definen dicho
bolsillo de unión y el medio para generar una representación
gráfica tridimensional del bolsillo de unión, y en el que dicho
método comprende las etapas de;
(a) ubicar una primera entidad química dentro de
todo o parte de dicho bolsillo de unión usando una representación
gráfica tridimensional de la estructura de la entidad química y el
bolsillo de unión;
(b) realizar una operación de ajuste entre dicha
entidad química y dicho bolsillo de unión empleando medios
computacionales;
(c) analizar los resultados de dicha operación
de ajuste para cuantificar la asociación entre dicha entidad
química y todo o parte del bolsillo de unión; y
(d) dar salida a dicha asociación cuantificada a
un hardware de salida adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
El método anterior también puede comprender las
etapas de:
(e) repetir las etapas (a) a (d) con una segunda
entidad química; y
(f) seleccionar al menos una de dichas primera o
segunda entidad química que se asocia con todo o parte de dicho
bolsillo de unión sobre dicha asociación cuantificada de dicha
primera o segunda entidad química.
\newpage
En forma alternativa, las coordenadas
estructurales de los sitios de unión de Aurora-2 se
pueden utilizar en un método para identificar un agonista o
antagonista de una molécula que comprende un boldillo de unión de
Aurora-2. Este método comprende las etapas de:
(a) usar una estructura tridimensional de la
molécula o complejo molecular para diseñar o seleccionar una
entidad química;
(b) poner en contacto la entidad química con la
molécula o el complejo molecular;
(c) monitorear la actividad de la molécula o
complejo molecular; y
(d) clasificar la entidad química como agonista
o antagonista sobre la base del efecto de la entidad química sobre
la actividad de la molécula o el complejo molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la etapa (a) usa una
estructura tridimensional del bolsillo de unión de la molécula o
complejo molecular. En otra realización, la estructura
tridimensional se visualiza en forma de representación gráfica.
En otra realización, el método comprende las
etapas de:
(a) construir un modelo por ordenador de un
bolsillo de unión de la molécula o complejo molecular;
(b) seleccionar una entidad química que va a ser
evaluada por un método seleccionado del grupo que consiste en
ensamblar dicha entidad química; seleccionar una entidad química a
partir de una base de datos de moléculas pequeñas; diseñar un
ligando de novo de dicha entidad química; y modificar un agonista o
inhibidor conocido, o una porción de los mismos, de una proteína
Aurora-2 u homóloga de la misma;
(c) emplear medios computacionales para realizar
una operación de ajuste entre los modelos por ordenador de dicha
entidad química evaluada y dicho sitio de unión a fin de proveer una
configuración de energía minimizada de dicha entidad química en el
bolsillo de unión; y
(d) evaluar los resultados de dicha operación de
ajuste para cuantificar la asociación entre dicha entidad química y
el modelo del bolsillo de unión, por lo cual se evalúa la capacidad
de dicha entidad química para asociarse con dicho bolsillo de
unión;
(e) sintetizar dicha entidad química; y
(f) poner en contacto dicha entidad química con
dicha molécula o complejo molecular para determinar la capacidad de
dicho compuesto para activar o inhibir a dicha molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención describe un
método para diseñar un compuesto o complejo que se asocia con todo
o parte del bolsillo de unión que comprende las etapas de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína en un ordenador que comprende
el medio para generar información de la estructura tridimensional a
partir de dichas coordenadas estructurales; y
(b) usar el ordenador para realizar una
operación de ajuste para asociar una primera entidad química con
todo o parte del bolsillo de unión;
(c) realizar una operación de ajuste para
asociar al menos una segunda entidad química con todo o parte del
bolsillo de unión;
(d) cuantificar la asociación entre la primera y
la segunda entidad química y todo o parte del bolsillo de
unión;
(e) opcionalmente repetir las etapas (b) a (d)
con otra primera y segunda entidad química, seleccionar una primera
y una segunda entidad sobre la base de dicha asociación cuantificada
del total de dicha primera y segunda entidad química;
(f) opcionalmente, inspeccionar visualmente la
relación de la primera y la segunda entidad química entre sí con
respecto al bolsillo de unión en una pantalla de ordenador usando la
representación gráfica tridimensional del bolsillo de unión y dicha
primera y segunda entidad química; y
(g) ensamblar la primera y la segunda entidad
química en un compuesto o complejo que se asocia con todo o parte
de dicho bolsillo de unión por construcción modelada.
\vskip1.000000\baselineskip
Por primera vez, en el contexto de la presente
invención, se divulga el uso de técnicas de diseño molecular para
identificar, seleccionar y diseñar entidades químicas, que incluyen
compuestos inhibidores, capaces de unirse a los sitios de unión,
motivos y dominios de Aurora-2 o tipo
Aurora-2.
La elucidación por parte de los solicitantes de
los bolsillos de unión en Aurora-2 proporciona la
información necesaria para diseñar nuevas entidades químicas y
compuestos que pueden interactuar con el sustrato
Aurora-2 o los bolsillos de unión al ATP o con el
sustrato de tipo Aurora-2 o los bolsillos de unión
al ATP, en total o en parte. Debido a la homología en el núcleo de
quinasa entre Aurora-2, Aurora-1 y
Aurora-3, también es de esperar que los compuestos
que inhiben a Aurora-2 inhiban a
Aurora-1 y Aurora-3, en especial los
compuestos que se unen al bolsillo de unión al ATP.
En toda esta sección, las discusiones acerca de
la capacidad de una entidad química para unirse, asociarse o
inhibir a los sitios de unión de Aurora-2 se
refieren a las características de la entidad sola. Los ensayos para
determinar si un compuesto se une a Aurora-2 son
bien conocidos en la técnica y se ejemplifican a continuación.
El diseño de los compuestos que se unen a o
inhiben los bolsillos de unión de Aurora-2 de
acuerdo con esta invención generalmente implica la consideración de
dos factores. Primero, la entidad química debe ser capaz de
asociarse en forma física y estructural con partes o la totalidad de
los bolsillos de unión de Aurora-2. Las
interacciones moleculares no covalentes en esta asociación incluyen
enlaces puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals,
interacciones hidrófobas e interacciones electrostáticas.
Segundo, la entidad química debe ser capaz de
asumir una conformación que permita asociarse directamente con los
bolsillos de unión de Aurora-2. Si bien ciertas
porciones de la entidad química no participarán directamente en
estas asociaciones, estas porciones de la entidad química aún pueden
influir en la conformación de la molécula total. Esto, a su vez,
puede tener una influencia significativa sobre la potencia. Dichos
requerimientos conformacionales incluyen la estructura
tridimensional total y la orientación de la entidad química en
relación con el total o una porción del bolsillo de unión, o el
espacio entre los grupos funcionales de una entidad química que
comprende varias entidades químicas que interactúan directamente con
los boldillos de unión de Aurora-2 o de la proteína
de tipo Aurora-2.
El efecto potencial inhibidor o de unión de una
entidad química sobre los bolsillos de unión de
Aurora-2 se puede analizar antes de su síntesis
real y examinar mediante el uso de técnicas de modelado por
ordenador. Si la estructura teórica de la entidad dada sugiere
insuficiente interacción y asociación entre ella y los bolsillos de
unión de Aurora-2, el examen de la entidad se obvia.
Sin embargo, si el modelado por ordenador indica una fuerte
interacción, entonces la molécula se puede sintetizar y analizar en
cuanto a su capacidad para unirse a un bolsillo de unión de
Aurora-2. Esto se puede lograr examinando la
capacidad de la molécula de inhibir a Aurora-2
usando los ensayos descritos en el Ejemplo 8. De esta manera, se
puede evitar la síntesis de compuestos no operativos.
Un potencial inhibidor de un bolsillo de unión
de Aurora-2 puede evaluarse por computación por
medio de una serie de etapas en las que las entidades químicas o
los fragmentos se identifican y seleccionan por su capacidad para
asociarse con los bolsillos de unión de
Aurora-2.
Los expertos en la técnica pueden utilizar uno
de varios métodos para identificar entidades químicas o fragmentos
por su capacidad para asociarse con un bolsillo de unión de
Aurora-2. Este proceso puede comenzar por inspección
visual de, por ejemplo, un bolsillo de unión de
Aurora-2 en la pantalla de un ordenador sobre la
base de las coordenadas estructurales de Aurora-2
en cualquiera de las figuras 1-4 u otras coordenadas
que definen una configuración similar generada a partir del medio
de almacenamiento legible por máquina. Los fragmentos o entidades
químicas seleccionados posteriormente se pueden ubicar en una
variedad de orientaciones, o acoplar en este bolsillo de unión como
se definió más arriba. El acoplamiento se puede lograr usando un
software tal como QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San Diego,
CA ©1998, 2000) y Sybil (Tripes Associates, St. Luis, MO), seguido
de minimización de la energía y dinámica molecular con campos de
fuerza mecánica molecular estándar, tales como CHARMM y AMBER.
Los programas de computación especializados
también pueden asistir en el proceso de seleccionar fragmentos o
entidades químicas. Estos incluyen:
- 1.
- GRID (P. J. Goodford, "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985)). GRID está disponible en Oxford University, Oxford, RU.
- 2.
- MCSS (A. Miranker et al., "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method". Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991)). MCSS está disponible en Molecular Simulations, San Diego, CA.
- 3.
- AUTODOCK (D. S. Goodsell et al., "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure, Function and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990)). AUTODOCK está disponible en Scripps Research Institute, La Jolla, CA.
- 4.
- DOCK (I. D. Kuntz et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982)). DOCK está disponible en Universidad de California, San Francisco, CA.
Una vez que se han seleccionado entidades
químicas o fragmentos adecuados, estos se pueden ensamblar en un
compuesto o complejo único. El ensamblaje puede ser precedido por la
inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la
imagen tridimensional mostrada en una pantalla de ordenador con
respecto a las coordenadas estructurales de
Aurora-2. A esto seguiría la construcción del modelo
manual usando un software tal como QUANTA (Molecular Simulations,
Inc., San Diego, CA ©1998, 2000) o Sybil (Tripos Associates, St.
Louis, MO).
Los programas útiles para ayudar a los expertos
en la técnica para relacionar las entidades químicas o fragmentos
individuales incluyen:
- 1.
- CAVEAT (P. A. Bartlett et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecule", en Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989); G. Lauri y P. A. Bartlett, "CAVEAT: a Program to Facilitate the Design of Organic Molecule", J. Comput. Aided Mol. Des., 8, pp. 51-66 (1994)). CAVEAT está disponible en la Universidad de California, Berkeley, CA.
- 2.
- Sistemas de base de datos 3D tales como ISIS (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Esta área se revisa en Y. C. Martin, "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992).
- 3.
- HOOK (M. B. Eisen et al., "HOOK: A Program for Finding Novel Molecular Architectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a Macromolecule Binding Site", Proteins: Struct., Funct., Genet., 19, pp. 199-221 (1994)). HOOK está disponible en Molecular Simulations, San Diego, CA.
\vskip1.000000\baselineskip
En vez de proceder a construir un inhibidor de
un bolsillo de unión de Aurora-2 de modo escalonado,
se puede diseñar un fragmento o entidad química a la vez como se
describió anteriormente, compuestos inhibidores u otros compuestos
de unión a Aurora-2 como un todo o "de novo"
usando tanto un bolsillo de unión vacío o incluyendo opcionalmente
alguna(s) porción(es) de (un) inhibidor(es)
conocido(s). Existen muchos métodos para diseñar ligandos de
novo, que incluyen:
- 1.
- LUDI (H.-J. Bohm, "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992)). LUDI está disponible en Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA.
- 2.
- LEGEND (Y. Nishibata et al., Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991)). LEGEND está disponible en Molecular Simulations Incorporated, San Diego, CA.
- 3.
- LeapFrog (disponible en Tripos Associates, St. Louis, MO).
- 4.
- SPROUT (V. Gillet et al., "SPROUT: A Program for Structure Generation)", J. Comput. Aided Mol. Design, 7, pp. 127-153 (1993)). SPROUT está disponible en la Universidad de Leeds, RU.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras técnicas de modelado molecular también se
pueden emplear de acuerdo con la presente invención (véase, por
ejemplo, N. C. Cohen et al., "Molecular Modeling Software
and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33,
pp. 883-894 (1990); véase también, M. A. Navia y M.
A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design",
Current Opinions in Structural Biology, 2, pp.
202-210 (1992); L. M. Balbes et al., "A
Perspective of Modern Procceedings in Computer-Aided
Drug Design", Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B.
Lipkowitz y D. B. Boyd, Eds., VCH, New York, pp.
337-380 (1994); véase también W. C. Guida,
"Software For Structure-Based Drug Design",
Curr. Opin. Struct. Biology, 4, pp. 777-781
(1994)).
Una vez que una entidad química se ha diseñado o
seleccionado por los anteriores métodos, se puede evaluar y
optimizar la eficiencia con la que la entidad química puede unirse a
un bolsillo de unión de Aurora-2 por evaluación
computacional. Por ejemplo, un inhibidor efectivo del bolsillo de
unión a Aurora-2 con preferencia debe demostrar una
diferencia relativamente pequeña de energía entre sus estados unido
y libre (es decir, una energía de deformación de unión pequeña). En
consecuencia, los inhibidores más eficientes del bolsillo de unión
de Aurora-2 con preferencia se deben diseñar con una
energía de deformación de unión no mayor que aproximadamente 10
kcal/mol, con más preferencia, no mayor que 7 kcal/mol. Los
inhibidores del bolsillo de unión de Aurora-2
pueden interactuar con el bolsillo de unión en más de una
conformación que sea similar en energía de unión total. En estos
casos, la energía de deformación de unión se toma como la diferencia
entre la energía de la entidad química libre y la energía promedio
de las conformaciones que se observa cuando el inhibidor se une a
la proteína.
Una entidad química diseñada o seleccionada para
unirse a un bolsillo de unión de Aurora-2 también se
puede optimizar por computación de modo que en su estado unido con
preferencia carezca de interacción electrostática repulsiva con la
enzima blanco y con las moléculas de agua circundantes. Dichas
interacciones electrostáticas no complementarias incluyen
interacciones repulsivas carga-carga,
dipolo-dipolo y carga-dipolo.
Se dispone en la técnica de software de
ordenador específico para evaluar la energía de deformación del
compuesto y las interacciones electrostáticas. Ejemplos de
programas diseñados para tales usos incluyen: Gaussian 94, revisión
C (M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA ©1995); AMBER,
versión 4.1 (P. A. Kolinnan, Universidad de California en San
Francisco, ©1995); QUANTA/CHARM (Molecular Simulations, Inc., San
Diego, CA ©1998, 2000); Insight II/Discover (Molecular Simulations,
Inc., San Diego, CA ©1998); DelPhi (Molecular Simulations, Inc.,
San Diego, CA ©1998); y AMSOIJ (Quantum Chemistry Program Exchange,
Universidad de Indiana). Estos programas se pueden implementar, por
ejemplo, usando una estación de trabajo Silicon Graphics tal como un
Indigo2 con gráficos "IMPACT". Otros sistemas de hardware y
paquetes de software serán bien conocidos por los expertos en
la
técnica.
técnica.
Otro abordaje permitido por la presente
invención, es el análisis computacional de bases de datos de
moléculas pequeñas para las entidades químicas o los compuestos que
se pueden unir en forma completa, o en parte, a un bolsillo de
unión de Aurora-2. En este análisis, la calidad del
ajuste de tales entidades al bolsillo de unión se puede juzgar
tanto por complementariedad de configuración como por energía de
interacción estimada (E. C. Meng et al., J. Comp.
Chem., 13, pp. 505-524 (1992)).
De acuerdo con otra realización, en el contexto
de la presente invención, se divulgan compuestos que se asocian con
un bolsillo de unión de Aurora-2 producido o
identificado por el método expuesto anteriormente.
Otra técnica de diseño de fármacos
particularmente útil permitida por la presente invención es el
diseño iterativo de fármacos. El diseño iterativo de fármacos es un
método para optimizar las asociaciones entre una proteína y un
compuesto determinando y evaluando las estructuras tridimensionales
de los complejos proteína/compuesto.
En el diseño iterativo de fármacos, se obtienen
cristales de una serie de proteínas o complejos de proteína y
posteriormente se resuelven las estructuras tridimensionales de cada
cristal. Dicho abordaje permite comprender la asociación entre las
proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se logra
seleccionando compuestos con actividad inhibidora, obteniendo
cristales de este nuevo complejo proteína/compuesto, resolviendo la
estructura tridimensional del complejo y comparando las
asociaciones entre el nuevo complejo proteína/compuesto y complejos
proteína/compuesto previamente resueltos. Observando cómo afectan
los cambios en el compuesto a las asociaciones proteína/compuesto,
se pueden optimizar las asociaciones.
En algunos casos, el diseño iterativo de
fármacos se lleva a cabo formando sucesivos complejos
proteína-compuesto y posteriormente cristalizando
cada nuevo complejo. Se pueden usar ensayos de cristalización de
alto rendimiento para hallar una nueva condición de cristalización
o para optimizar la condición de cristalización de la proteína o
complejo original para el nuevo complejo. En forma alternativa, un
cristal de proteína preformado se puede remojar en presencia de un
inhibidor, formándose de este modo un complejo proteína/compuesto y
se obvia la necesidad de cristalizar cada complejo
proteína/compuesto individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Las coordenadas estructurales expuestas en las
figuras 1-4 también se pueden usar para ayudar en la
obtención de información estructural acerca de otras moléculas o
complejos moleculares cristalizados. Esto se puede lograr por
alguna de las numerosas técnicas bien conocidas, que incluyen el
reemplazo molecular.
De acuerdo con una realización alternativa, el
medio de almacenamiento de datos legible por máquina comprende un
material de almacenamiento de datos codificado con un primer
conjunto de datos legibles por máquina que comprende la
transformada de Fourier de al menos una porción de las coordenadas
estructurales expuestas en las figuras 1-4 o un
modelo de homología de la misma y que, cuando se usa una máquina
programada con instrucciones para usar dichos datos, se puede
combinar con un segundo conjunto de datos legibles por máquina que
comprende el patrón de difracción de rayos X de una molécula o
complejo molecular, para determinar al menos una porción de las
coordenadas estructurales correspondientes al segundo conjunto de
datos legibles por máquina.
En otra realización, en el contexto de la
presente invención se divulga un ordenador para determinar al menos
una porción de las coordenadas estructurales correspondientes a los
datos de difracción de rayos X obtenidos de una molécula o complejo
molecular, en el que dicho ordenador comprende:
(a) un medio de almacenamiento de datos legible
por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos
codificado con datos legibles por máquina, en el que dichos datos
comprenden al menos una porción de las coordenadas estructurales de
Aurora-2 de acuerdo con una cualquiera de las
figuras 1-4 o un modelo de homología de la
misma;
(b) un medio de almacenamiento de datos legible
por máquina que comprende un material de almacenamiento de datos
codificado con datos legibles por máquina, en el que dichos datos
comprenden datos de difracción por rayos X obtenidos de dicha
molécula o complejo molecular; y
(c) instrucciones para realizar una transformada
de Fourier de los datos legibles por máquina de (a) y para procesar
dichos datos legibles por máquina de (b) a las coordenadas
estructurales.
\newpage
Por ejemplo, la transformada de Fourier de al
menos una porción de las coordenadas estructurales expuestas en una
cualquiera de las figuras 1-4 o un modelo de
homología de la misma se puede usar para determinar al menos una
porción de las coordenadas estructurales de las homólogas de
Aurora-2. En una realización, la molécula es una
homóloga de Aurora-2. En otra realización, el
complejo molecular se selecciona del grupo que consiste en un
complejo de Aurora-2 y un complejo de una homóloga
de Aurora-2.
En consecuencia, en otra realización esta
invención proporciona un método que utiliza el reemplazo molecular
para obtener información estructural acerca de una molécula o un
complejo molecular de estructura desconocida en el que la molécula
o el complejo molecular es suficientemente homólogo de
Aurora-2, que comprende las etapas de:
(a) cristalizar dicha molécula o complejo
molecular de estructura desconocida;
(b) generar un patrón de difracción de rayos X a
partir de dicha molécula o complejo molecular cristalizado;
(c) aplicar al menos una porción de las
coordenadas estructurales de Aurora-2 expuestas en
una de las figuras 1-4 o un modelo de homología de
la misma al patrón de difracción de rayos X para generar un mapa de
densidad electrónica tridimensional de al menos una porción de la
molécula o complejo molecular cuya estructura se desconoce; y
(d) generar un modelo estructural de la molécula
o complejo molecular a partir del mapa de densidad electrónica
tridimensional.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el método se realiza usando
un ordenador. En otra realización, la molécula se selecciona del
grupo que consiste en Aurora-2 y homólogas de
Aurora-2. En otra realización, la molécula es un
complejo molecular de Aurora o una homóloga de la misma.
Utilizando reemplazo molecular, el total o parte
de las coordenadas estructurales de Aurora-2
provistas por la presente invención o un modelo de homología de la
misma (y expuestas en una cualquiera de las figuras
1-4) se pueden usar para determinar la estructura
del una molécula o complejo molecular cristalizados cuya estructura
no se conoce en forma más rápida y eficiente que intentando
determinar dicha información desde el inicio.
El reemplazo molecular proporciona una
estimación precisa de las fases para una estructura desconocida. Las
fases son un factor en las ecuaciones usadas para resolver las
estructuras cristalinas que no se pueden determinar directamente.
La obtención de valores precisos para las fases, por métodos
diferentes del reemplazo molecular, es un proceso que lleva tiempo,
que involucra ciclos iterativos de aproximaciones y ajustes y
dificulta mucho la solución de estructuras cristalinas. Sin
embargo, cuando se ha resuelto la estructura cristalina de una
proteína que contiene al menos una porción homóloga, las fases de la
estructura conocida pueden proporcionar un estimado satisfactorio
de las fases para la estructura desconocida.
En consecuencia, este método involucra generar
un modelo preliminar de una molécula o complejo molecular cuyas
coordenadas estructurales son desconocidas, orientando y ubicando la
porción relevante de la Aurora-2 de acuerdo con una
cualquiera de las figuras 1-4 dentro de la celda
unitaria del cristal de la molécula o complejo molecular
desconocidos para explicar de la mejor manera el patrón de
difracción de rayos X observado del cristal de la molécula o
complejo molecular cuya estructura se desconoce. Posteriormente se
pueden calcular las fases a partir de este modelo y combinarlas con
las amplitudes del patrón de difracción de rayos X observado para
generar un mapa de densidad electrónica de la estructura cuyas
coordenadas se desconocen. Esto, a su vez, se puede someter a
cualquiera de las técnicas bien conocidas de construcción de modelo
y ajuste de estructura para proveer una estructura precisa final de
la molécula o el complejo molecular cristalizados desconocidos (E.
Lattman, "Use of the Rotation and Translation Functions", en
Meth. Enzymol., 115, pp. 55-77 (1985); M. G.
Rossmann, ed., "The Molecular Replacement Method", Int. Sci.
Rev. Ser., Núm. 13, Gordon & Breach, New York (1972)).
La estructura de cualquier porción de cualquier
molécula o complejo molecular cristalizado que sea suficientemente
homóloga con cualquier porción de la Aurora-2 se
puede resolver por este método.
En una realización, el método de reemplazo
molecular se utiliza para obtener información estructural acerca de
un homólogo de Aurora-2. Las coordenadas
estructurales de Aurora-2 provistas por esta
invención son particularmente útiles para resolver la estructura de
los complejos de Aurora-2 que se unen con ligandos,
sustratos e inhibidores.
Por otra parte, las coordenadas estructurales de
Aurora-2 provistas por la presente invención son
útiles para resolver la estructura de las proteínas
Aurora-2 que tienen sustituciones, adiciones y/o
supresiones de aminoácidos (denominadas colectivamente "mutantes
de Aurora-2", en comparación con las
Aurora-2 naturales). Estas mutantes de
Aurora-2 opcionalmente se pueden cristalizar en
co-complejo con una entidad química, tal como un
análogo de ATP no hidrolizable o un sustrato suicida. Las
estructuras cristalinas de una serie de tales complejos
posteriormente se pueden resolver por reemplazo molecular y
compararse con la de Aurora-2 de tipo salvaje. Los
sitios potenciales para la modificación dentro de los diversos
bolsillos de unión de la enzima se pueden identificar de este modo.
Esta información provee una herramienta adicional para determinar
las interacciones de unión más eficientes, por ejemplo
interacciones hidrófobas aumentadas, entre Aurora-2
y una entidad química o un compuesto.
Las coordenadas estructurales también son
particularmente útiles para resolver la estructura de los cristales
de Aurora-2 u homólogas de Aurora-2
co-complejadas con una variedad de entidades
químicas. Este abordaje permite la determinación de los sitios
óptimos para la interacción entre entidades químicas, que incluyen
los inhibidores de Aurora-2. Por ejemplo, los datos
de difracción de rayos X de alta resolución recolectados a partir de
cristales expuestos a diferentes tipos de disolventes permiten
determinar dónde reside cada tipo de molécula de disolvente. Se
pueden diseñar entonces moléculas pequeñas que se unen firmemente a
esos sitios, y sintetizarse y ensayarse para evaluar su actividad
de inhibición de Aurora-2.
Todos los complejos mencionados anteriormente se
pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien
conocidas y se pueden ajustar usando datos de rayos X de resolución
de 1,5-3,4 \ring{A} para un valor de R de
aproximadamente 0,30 o menor usando software de ordenador, tal como
X-PLOR (Yale University, ©1992, distribuido por
Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Blundell &
Johnson, supra; Meth. Enzymol., vol. 114 & 115,
H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press (1985)) o CNS
(Brunger et al., Acta Cryst., D54, pp.
905-921, (1998)).
Con el fin de que esta invención sea comprendida
más plenamente, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos
son sólo para fines ilustrativos y no deben considerarse de ninguna
manera una limitación al alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de Aurora-2 se
llevó a cabo usando métodos estándares conocidos en la técnica. Una
Aurora-2 truncada (residuos de aminoácidos
107-403) (secuencia de longitud completa: GenBank
AF011468; SEQ ID NO: 1) con una marca de hexahistidina
N-terminal y un sitio de escisión de trombina se
sobreexpresó en un sistema de expresión de baculovirus.
La Aurora-2 se purificó usando
cromatografía de afinidad de metal agarosa Ni/NTA (Qiagen, Hilden,
Alemania) seguida de exclusión por tamaños en una columna Superdex
200 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La marca de
hexahistidina se eliminó por incubación con trombina (Calbiochem, La
Jolla, CA). La incubación toda la noche a 4ºC con 5 unidades/mg de
trombina produjo más de 90% de Aurora-2 (residuos de
aminoácidos 107-403), que se usó para los estudios
cristalográficos. La reacción se inactivó con PMSF (fluoruro de
fenilmetilsulfonilo o fluoruro de
\alpha-toluensulfonilo) y la trombina se extrajo
con benzamidina sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La proteína
se aplicó a una columna MonoS 10/10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia)
equilibrada en HEPES 20 mM, pH 7,3, 10% de glicerol (v/v), DTT 2
mM, y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 500 mM en 80
volúmenes de columna. La Aurora-2 no fosforilada
(107-403) eluyó con NaCl 148 mM. La proteína se
dializó contra Tris 25 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 200 mM y DTT 2
mM a 4ºC, se concentró a 15 mg/ml, y se centrifugó a 100.000 x g
antes de la cristalización. Todos los pesos moleculares de las
proteínas se confirmaron por espectrometría de masas por
electroaspersión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se formaron cristales del complejo
Aurora-2-inhibidor por
cocristalización de la proteína con los inhibidores o con
adenosina. El inhibidor se añadió a la solución de proteína
Aurora-2 inmediatamente después de la etapa de
purificación final de Mono-S y antes de la
concentración de la proteína (Ejemplo 1). En forma alternativa, el
inhibidor se puede añadir a la solución concentrada de proteína
Aurora-2 inmediatamente antes de establecer la gota
de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
La cristalización de Aurora-2 se
llevó a cabo usando la técnica de difusión por vapor de la gota
colgante. La Aurora-2 formó cristales con forma de
diamante o de tipo placa hexagonal sobre un reservorio que contenía
25% de PEG 3350, MES 50 mM, pH 6,0, sulfato de amonio 200 mM. La
microgota de cristalización contenía 1 \mul de solución de
proteína de 15 mg ml^{-1} y 1 \mul de solución del reservorio.
Los cristales se formaron en menos de 48 horas.
Los cristales formados se transfirieron a una
solución de reservorio que contenía 15% de glicerol. Después de
remojar los cristales en glicerol al 15% durante menos de 2 minutos,
se recogieron los cristales con un ansa de cristalización, se
congelaron en nitrógeno líquido y se conservaron para la recolección
de datos.
Las estructuras de los complejos
Aurora-2-inhibidor y la estructura
de Aurora-2- adenosina se resolvieron por reemplazo
molecular usando los datos de difracción de rayos X recolectados (i)
en la línea de rayos 5.0.2 del Advanced Light Source Lawrence
Berkeley Laboratory, Berkeley, California, EE.UU., (ii) en la línea
de rayos de 14.2 de la CCLRC Synchrotron Radiation Source,
Daresbury, Cheshire, RU, o (iii) en la línea de rayos X31, DESY,
EMBL Outstation, Hamburgo, Alemania. Las imágenes de difracción se
procesaron con el programa MOSFLM (A.G. Leslie, Acta Cryst.,
D55, pp. 1696-1702 (1999)) y los datos se llevaron a
escala usando SCALA (Collaborative Computational Project, N.,
Acta Cryst., D50, pp. 760-763 (1994)).
La estadística de los datos, los parámetros de
celda unitaria y los grupos espaciales de la estructura cristalina
de
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
se dan en la Tabla 1. Las fases iniciales para los complejos de
Aurora-2 se obtuvieron por reemplazo molecular
usando las coordenadas de GSK-3\beta (PDB número
de acceso 1109) (E. ter Haar, et al., Nat. Struct.
Biol., 8, pp. 593-596 (2001)) como modelo de
búsqueda en el programa AMoRe (J. Navaza, Acta. Cryst. A, 50,
pp. 157-163 (1994)). La unidad asimétrica contenía
un único complejo de Aurora-2. Las múltiples rondas
de reconstrucción con QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San
Diego, CA ©1998, 2000) y el ajuste con CNX (Accelrys Inc., San
Diego, CA ©2000) dieron como resultado un modelo final que incluyó
los residuos 127 a 279 y los residuos 288 a 390. El modelo refinado
tiene un factor cristalográfico R de 26,3% y libre de R de
33,2%.
La estadística de los datos, los parámetros de
celda unitaria y los grupos espaciales de la estructura cristalina
de
Aurora-2-(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
se dan en la Tabla 2. Las fases iniciales se obtuvieron por
reemplazo molecular usando las coordenadas del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
como modelo de búsqueda en el programa AMoRe. Las múltiples rondas
de reconstrucción con QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San
Diego, CA ©1998, 2000) y el ajuste con CNX (Accelrys Inc., San
Diego, CA ©2000) dieron como resultado un modelo final que incluyó
los residuos 120 a 279 y los residuos 287 a 388. El modelo refinado
tiene un factor cristalográfico R de 25,9% y libre de R de
32,8%.
La estadística de los datos, los parámetros de
celda unitaria y los grupos espaciales de la estructura cristalina
de
Aurora-2-(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina
se dan en la Tabla 3. Las fases iniciales se obtuvieron por
reemplazo molecular usando las coordenadas del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
como modelo de búsqueda en el programa AMoRe. Las múltiples rondas
de reconstrucción con QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San
Diego, CA ©1998, 2000) y el ajuste con CNX (Accelrys Inc., San
Diego, CA ©2000) dieron como resultado un modelo final que incluyó
los residuos 128 a 277 y los residuos 291 a 388. El modelo refinado
tiene un factor cristalográfico R de 23,6% y libre de R de
29,1%.
La estadística de los datos, los parámetros de
celda unitaria y los grupos espaciales de la estructura cristalina
de Aurora-2- adenosina se dan en la Tabla 4. Las
fases iniciales se obtuvieron por reemplazo molecular usando las
coordenadas del complejo
Aurora-2-(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
como modelo de búsqueda en el programa AMoRe. Las múltiples rondas
de reconstrucción con QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San
Diego, CA ©1998, 2000) y el ajuste con CNX (Accelrys Inc., San
Diego, CA ©2000) dieron como resultado un modelo final que incluyó
los residuos 127 a 278 y los residuos 289 a 387. El modelo refinado
tiene un factor cristalográfico R de 26,4% y libre de R de
31,7%.
En los modelos anteriores, los residuos
desordenados no se incluyeron en el modelo. Se usaron residuos de
alanina o glicina en el modelo si las cadenas laterales de ciertos
residuos no se pudieron ubicar en la densidad electrónica.
Aurora-2 tiene el típico
plegamiento o dominio estructural de quinasa catalítica bilobular
(S. K. Hanks, et al., Science, 241, pp.
42-52 (1988); Hanks, S.K. y A.M.Quinn., Meth.
Enzymol., 200, pp. 38-62 (1991)) con un
subdominio de cadena \beta (residuos 127-215) en
el extremo N-terminal y un subdominio de
\alpha-hélice en el extremo
C-terminal (residuos 216-385)
(Figura 5). El bolsillo de unión a ATP está en la interfaz de los
dominios de \alpha-hélice y cadena \beta, y está
limitado por el bucle rico en glicina y la bisagra. El bucle de
activación corre a lo largo de la superficie del sitio catalítico
activo. El dominio de cadena \beta consiste en cinco cadenas
\beta antiparalelas que forman una estructura de
barril \beta.
barril \beta.
La comparación con otras quinasas tales como
GSK-3\beta, CDK2 y p38 reveló que la estructura de
Aurora-2 se asemeja mucho a la forma de una quinasa
activada unida al sustrato. Sin embargo, una característica única
que está presente en las cuatro estructuras cristalinas de
Aurora-2 es la inusual conformación del bucle de
activación (residuos de aminoácidos 273-292). Los
residuos de aminoácidos 275-290 actúan como una
solapa flexible que ocluye parcialmente el sitio catalítico activo
y crea un nuevo bolsillo de unión hidrófobo en el sitio catalítico
activo (Figura 6). Este bolsillo hidrófobo es único ya que se
superpone parcialmente con el bolsillo de unión de trifosfato del
sitio catalítico activo. La comparación de los bucles de activación
de GSK-3\beta (PDB número de acceso 1109) (E. ter
Haar, et al., Nat. Struct. Biol., 8, pp.
593-596 (2001)), P38 (PDB número de acceso 1CM8)
(Bellon, S., et al., Struct. Fold Des., 7, pp.
1057-65 (1999)) y CDK2 activada unida al sustrato
(PDB número de acceso 1B38) (N. R. Brown et al., J. Biol.
Chem., 274, pp. 8746-8756 (1999)) muestra que
en otras quinasas estrechamente relacionadas, el bucle de activación
adopta una conformación más extendida, independientemente de si se
usó proteína activada en la determinación de la estructura
cristalina (Figura 7).
El inhibidor
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
se une en el surco profundo del sitio catalítico activo en la
estructura de Aurora-2 (Figura 6). El inhibidor
forma tres enlaces puente de hidrógeno con la porción de bisagra
del sitio de unión a ATP (líneas de puntos). El nitrógeno del 1H
pirazol comparte un protón con el carbonilo del esqueleto E211. El
otro nitrógeno pirazólico (posición 2) acepta un protón del
nitrógeno del esqueleto A213. La comparación con la estructura
cristalina unida a adenosina revela que el pirazol imita la unión
de la adenosina, un constituyente natural del sustrato ATP.
Las cadenas laterales de L210 y K162 se ubican
en el sitio de unión al ATP. K162 es un residuo catalíticamente
importante y es incapaz de formar un puente salino con D274 debido a
la formación de un sitio de unión hidrófobo único en el sitio
catalítico activo de Aurora-2. Este puente salino de
lisina-ácido glutámico se observa en otras estructuras cristalinas
de quinasas.
La figura 8 representa los bolsillos de unión
para cada complejo de Aurora-2 de la presente
invención.
Las coordenadas de cualquiera de las figuras
1-4 se usan para diseñar compuestos, que incluyen
los compuestos inhibidores, que se asocian con
Aurora-1, Aurora-2,
Aurora-3 u homólogas de Aurora-1,
Aurora-2 o Aurora-3. Este proceso
puede ser asistido con un ordenador que comprende un medio de
almacenamiento de datos legible por máquina codificado con un
conjunto de instrucciones ejecutable por máquina, en el que las
instrucciones grabadas son capaces de presentar una representación
tridimensional de Aurora-2 o una porción de la
misma. La representación gráfica se usa de acuerdo con los métodos
descritos en la presente para diseñar compuestos. Tales compuestos
se asocian con la Aurora-2 en el bolsillo de unión
al ATP o el bolsillo de unión al sustrato.
Se analizaron compuestos para determinar su
capacidad para inhibir la actividad de Aurora-2 de
longitud completa (AA 1-403) usando un sistema
enzimático acoplado estándar (Fox et al., Protein
Sci., 7, pp. 2249 (1998)). Las reacciones se llevaron a cabo en
una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), de MgCl_{2} 10
mM, NaCl 25 mM, NADH 300 \muM, DTT 1 mM y 3% de DMSO. Las
concentraciones finales de sustrato en el ensayo fueron 200 \muM
de ATP (Sigma Chemicals, St Louis, MO) y 800 \muM de péptido
(LRRASLG, American Peptide, Sunnyvale, CA). Las reacciones se
llevaron a cabo a 30ºC y con Aurora-2 35 nM. Las
concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático
acoplado fueron 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 200 \muM de NADH, 60
\mug/ml de piruvato quinasa y 20 \mug/ml de lactato
deshidrogenasa.
Se preparó una solución patrón del tampón que
contenía todos los reactivos enumerados anteriormente con excepción
de ATP y el compuesto de ensayo de interés. La solución patrón del
tampón del ensayo (60 \mul) se incubó en una placa de 96 pocillos
con 2 \mul del compuesto de ensayo de interés a concentraciones
finales que abarcaron desde 0,002 \muM hasta 30 \muM a 30ºC
durante 10 min. Normalmente, se realizó una titulación de 12 puntos
preparando diluciones seriadas (a partir de patrones 1 mM de los
compuestos) con DMSO de los compuestos de ensayo en placas hijas.
La reacción se inició por adición de 5 \mul de ATP (concentración
final 200 \muM). Las velocidades de reacción se obtuvieron usando
un lector de placas Spectramax de Molecular Devices (Sunnyvale, CA)
durante 10 min a 30ºC. Se determinaron los valores de Ki a partir de
los datos de velocidad en función de la concentración del inhibidor
usando regresión no lineal computarizada {Prism 3.0, Graphpad
Software, San Diego, CA).
Las coordenadas atómicas de cualquiera de las
figuras 1-4 también definen, con mayor detalle, las
regiones superficiales externas accesibles a disolventes,
hidrófilas y móviles, del dominio catalítico de quinasa de
Aurora-2. Se sabe que los anticuerpos
anti-péptido reaccionan fuertemente contra regiones
altamente móviles pero no reaccionan con regiones de proteínas bien
ordenadas. En consecuencia, la movilidad es un factor importante en
el reconocimiento de proteínas por anticuerpos
anti-péptido (J. A. Tainer et al., Nature,
312, pp. 127-134 (1984)).
Los expertos en la técnica en consecuencia
podrían usar los datos de cristalografía de rayos X para determinar
posibles sitios antigénicos en el dominio de quinasa de
Aurora-2. Los sitios antigénicos posibles son
regiones expuestas, pequeñas y móviles en la superficie de la
quinasa que tienen factores B atómicos de más de aproximadamente 80
\ring{A}^{2} en las figuras 1, 2, 3 y 4. Esta información se
puede usar en conjunto con datos de estudios inmunológicos para
diseñar y producir anticuerpos monoclonales o policlonales
específicos.
Este proceso puede ser asistido mediante un
ordenador que comprende un medio de almacenamiento de datos legible
por máquina codificado con un conjunto de instrucciones ejecutables
por máquina, en el que las instrucciones grabadas son capaces de
mostrar una representación tridimensional de la
Aurora-2 o una porción de la misma.
<110> VERTEX PHARMACEUTICALS, INC., ET
AL.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ESTRUCTURA CRISTALINA DE LA PROTEÍNA
AURORA-2 Y SUS BOLSILLOS DE UNIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VPI/01-12 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (21)
1. Un cristal perteneciente al grupo espacial
P3_{2}21 y que tiene parámetros de celda unitaria de a=b=87 \pm
2\ring{A}, c=76 \pm2 \ring{A}; \alpha,\beta=90º y
\gamma=120º, que comprende una molécula o complejo molecular que
comprende los residuos de aminoácidos 107-403 de la
SEQ ID NO:1 de una proteína quinasa Aurora -2 no fosforilada de
acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4, donde la desviación cuadrática
media de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos
de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que 5
\ring{A}.
2. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende una entidad química, donde
la entidad química se selecciona del grupo que consiste en
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
(5-ciclopropil-2-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
adenosina, ATP, un análogo de ATP y un nucleótido trifosfato.
3. El cristal de acuerdo con la reivindicación
2, en el que dicha entidad química se selecciona del grupo que
consiste en
(5-metil-2H-pirazol-3-il)-(2-(piridin-3-ilmetilamino)-quinazolin-4-il)-amina,
(5-ciclopropil-2H-pirazol-3-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina,
(5-metiltiazol-2-il)-(2-fenil-quinazolin-4-il)-amina
y adenosina.
4. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, L194, L210, E211,
A213, L263 y V277 de acuerdo con una cualquiera de las Figuras
1-4, donde la desviación cuadrática media de los
átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos de dicha
molécula o complejo molecular y dichos residuos de aminoácidos de
Aurora-2 no es mayor que aproximadamente 3
\ring{A}.
5. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
A160, K162, L194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, 8220,
L263, A273 y W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos
de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
6. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
A160, K162, L194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220,
L263, A273, W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3 \ring{A}.
7. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 L139, G140, F144, V147,
A160, K162, L194, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217, R220,
L263, A273, W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3 \ring{A}.
8. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, 6142,
F144, 6145, N146, V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217,
V218, Y219, 1220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275 y W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
9. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, G142,
F144, G145, N146, V147, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, L210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217,
V218, Y219, R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275, W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3 \ring{A}.
10. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 R137, L139, G140, G142,
F144, G145, N146, VI47, Y148, L149, I158, L159, A160, L161, K162,
L194, R195, L208, I209, I210, E211, Y212, A213, P214, L215, T217,
V218, Y219, R220, E260, N261, L262, L263, L264, K271, I272, A273,
D274, F275, W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la
desviación cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los
residuos de aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y
dichos residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es
mayor que aproximadamente 3 \ring{A}.
11. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
P144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160,
L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, 8195,
L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y719, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, L257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275 y
W277 de acuerdo con la Figura 3, donde la desviación cuadrática
media de los átomos del esqueleto entre los residuos de aminoácidos
de dicha molécula o complejo molecular y dichos residuos de
aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
12. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, L159, A160,
L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195,
L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, P2I4, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, G268, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275,
W277 y S278 de acuerdo con la Figura 1 o 4, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
13. El cristal de acuerdo con la reivindicación
1, donde dicho cristal además comprende un bolsillo de unión
definido por las coordenadas estructurales de un conjunto de
residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de
aminoácidos de Aurora-2 F133, I135, G136, R137,
F144, N146, V147, Y148, L149, A150, R151, E152, I158, LI59, A160,
L161, K162, V163, V182, E183, Q185, H190, N192, I193, L194, R195,
L196, Y197, G198, Y199, F200, V206, Y207, L208, I209, L210, E211,
Y212, A213, P214, L215, T217, V218, Y219, R220, E221, D229, E230,
Q231, R232, T233, A234, T235, Y236, I237, T238, E239, L240, A241,
N242, A243, L244, S245, Y246, C247, H248, S249, K250, R251, V252,
I253, H254, R255, D256, I257, K258, P259, E260, N261, L262, L263,
L264, G265, S266, K258, E269, L270, K271, I272, A273, D274, F275,
W277, S278 y V279 de acuerdo con la Figura 2, donde la desviación
cuadrática media de los átomos del esqueleto entre los residuos de
aminoácidos de dicha molécula o complejo molecular y dichos
residuos de aminoácidos de Aurora-2 no es mayor que
aproximadamente 3 \ring{A}.
14. Un método para diseñar, seleccionar y/u
optimizar una entidad química que se une a todo o parte del bolsillo
de unión o proteína de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, que comprende las etapas
de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1,
2, 3 o 4, en un ordenador que comprende el medio para generar la
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales; y
(b) diseñar, seleccionar y/u optimizar dicha
entidad química realizando una operación de ajuste entre dicha
entidad química y dicha información de la estructura tridimensional
de todo o parte de dicho bolsillo de unión o proteína.
15. Un método para evaluar la capacidad de una
entidad química para asociarse con todo o parte del bolsillo de
unión o proteína de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4-13, que comprende las etapas
de:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura. 1,
2, 3 o 4, en un ordenador que comprende el medio para generar
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales;
(b) emplear un medio computacional para realizar
una operación de ajuste entre la entidad química y todo o parte del
bolsillo de unión o proteína; y
(c) analizar los resultados de dicha operación
de ajuste para cuantificar la asociación entre la entidad química y
todo o parte del bolsillo de unión o proteína.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, que además comprende generar una representación gráfica
tridimensional de todo o parte del bolsillo de unión o proteína
antes de la etapa (b).
17. Un método para identificar un agonista o
antagonista de una molécula o complejo molecular de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 4-13, que
comprende las etapas de:
(a) utilizar una estructura tridimensional del
bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1, 2, 3 o 4,
de la molécula o complejo molecular para diseñar o seleccionar una
entidad química;
(b) poner en contacto la entidad química con la
molécula o el complejo molecular;
(c) controlar la actividad catalítica de la
molécula o el complejo molecular; y
(d) clasificar la entidad química como agonista
o antagonista sobre la base del efecto de la entidad química sobre
la actividad catalítica de la molécula o el complejo molecular.
18. Un método para diseñar un compuesto o
complejo que se asocia con todo o parte del bolsillo de unión de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
4-13:
(a) proporcionar las coordenadas estructurales
de dicho bolsillo de unión o proteína, de acuerdo con la Figura 1,
2, 3 o 4, en una computadora que comprende el medio para generar
información de la estructura tridimensional a partir de dichas
coordenadas estructurales; y
(b) utilizar el ordenador para realizar una
operación de ajuste para asociar una primera entidad química con
todo o parte del bolsillo de unión;
(c) realizar una operación de ajuste para
asociar al menos una segunda entidad química con todo o parte del
bolsillo de unión;
(d) cuantificar la asociación entre la primera y
la segunda entidad química y todo o parte del bolsillo de
unión;
(e) opcionalmente repetir las etapas b) a d) con
otra primera y segunda entidad química, seleccionar una primera y
una segunda entidad sobre la base de dicha asociación cuantificada
del total de dichas primera y segunda entidad química;
(f) opcionalmente, inspeccionar en forma visual
la relación de la primera y la segunda entidad química entre sí en
relación con el bolsillo de unión en una pantalla de ordenador
usando la representación gráfica tridimensional del bolsillo de
unión y dicha primera y segunda entidad química; y
(g) ensamblar la primera y la segunda entidad
química en un compuesto o complejo que se asocia con todo o parte
de dicho bolsillo de unión por construcción modelada.
19. Un método de utilización del reemplazo
molecular para obtener información estructural acerca de una
molécula o un complejo molecular de estructura desconocida, que
comprende las etapas de:
(a) cristalizar dicha molécula o complejo
molecular;
(b) generar un patrón de difracción de rayos X a
partir de dicha molécula o complejo molecular cristalizado; y
(c) aplicar al menos una porción de las
coordenadas estructurales de un cristal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-13, como se
expone en la Figura 1, 2, 3 o 4, o un modelo de homología del mismo,
al patrón de difracción de rayos X para generar un mapa de densidad
electrónica tridimensional de al menos una porción de la molécula o
el complejo molecular cuya estructura es desconocida.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, en el que la molécula es una proteína Aurora-2 u
homóloga.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
19, en el que el complejo molecular se selecciona del grupo que
consiste en un complejo de la proteína Aurora-2 o un
complejo de una homóloga de Aurora-2.
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