ES2340558T3 - Tratamiento o prevencion de enfermedades neoplasicas e infecciosas con proteinas de choque termico/estres. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION ESTA RELACIONADA CON METODOS Y COMPUESTOS PARA PRODUCIR UNA RESPUESTA INMUNE Y PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEOPLASICAS PRIMARIAS Y METASTASICAS Y DE INFECCIONES. LOS METODOS DE LA INVENCION CONSISTEN EN LA ADMINISTRACION DE UN COMPUESTO CON UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN COMPLEJO QUE CONSTA ESENCIALMENTE DE UNA PROTEINA (HSP) CON ENLACE NO COVALENTE A UNA MOLECULA ANTIGENICA. LA "MOLECULA ANTIGENICA" SE REFIERE A LOS PEPTIDOS CON LOS QUE LAS HSP SE ASOCIAN ENDOGENAMENTE IN VIVO ASI COMO ANTIGENOS/INMUNOGENOS EXOGENOS (ES DECIR, CON LOS QUE LAS HSP NO FORMAN COMPLEJOS IN VIVO NI FRAGMENTOS ANTIGENICOS/INMUNOGENICOS O SUS DERIVADOS. EN UNA PRESENTACION PREFERIDA, EL COMPLEJO ES AUTOLOGO PARA EL INDIVIDUO. LAS CANTIDADES EFICACES DEL COMPLEJO SE ENCUENTRAN EN EL MARGEN DE 100-600 MICROGRAMOS PARA LOS COMPLEJOS QUE CONTIENEN HSP70, DE 50-1.000 MICROGRAMOS PARA LA HSP90 Y DE 10-600 MICROGRAMOS PARA LA GP96. LA INVENCION APORTA TAMBIEN UN METODO PARA MEDIR IN VIVO EL RECHAZO DEL TUMOR EN UN INDIVIDUO, PREFERIBLEMENTE HUMANO, INCLUIDA LA MEDICION DE LA PRODUCCION, POR PARTE DEL INDIVIDUO, DE LINFOCITOS T CITOTOXICOS CD8+ MHC DE CLASE I RESTRINGIDA, ESPECIFICOS DEL TUMOR. SE DESCRIBEN TAMBIEN LOS METODOS DE PURIFICACION DE LOS COMPLEJOS PEPTIDICOS HSP70.

Description

Tratamiento o prevención de enfermedades neoplásicas e infecciosas con proteínas de choque térmico/estrés.

1. Introducción

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades neoplásicas primarias y metastásicas, incluyendo, pero sin limitarse a sarcomas y carcinomas humanos. En la práctica de la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer, las composiciones de complejos de proteínas de choque térmico/estrés (hsp) incluyendo, pero sin limitarse a, hsp70, hsp90, gp96 solas o combinadas entre sí, unidas de forma no covalente a moléculas antigénicas, se utilizan para aumentar la respuesta inmunitaria a factores genotóxicos y no genotóxicos, tumores y agentes infecciosos.

2. Antecedentes de la invención

La era de la inmunología tumoral empezó con los experimentos realizados por Prehn y Main, quienes demostraron que los antígenos en los sarcomas inducidos por metilcolantreno (MCA), que eran específicos del tumor en esos ensayos de trasplante, no podrían detectar esos antígenos en el tejido normal de ratones (Prehn, R.T., et al., 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18:769-778). Esta noción fue confirmada por otros experimentos que demostraron que la resistencia específica a un tumor contra tumores inducidos por MCA puede ser provocada en el huésped autóctono, esto es, el ratón en el que se originó el tumor (Klein, G., et al., 1960, Cancer Res. 20:1561-1572).

En estudios posteriores también se encontraron antígenos específicos de un tumor en tumores inducidos con otros carcinógenos físicos o químicos o en tumores espontáneos (Kripke, M.L., 1974, J. Natl. Cancer Inst. 53:1333-1336; Vaage, J., 1968, Cancer Res. 28:2477-2483; Carswell, E.A., et al., 1970, J. Natl. Cancer Inst. 44:1281-1288). Como estos estudios utilizaron la inmunidad protectora contra el crecimiento de tumores trasplantados como criterio para los antígenos específicos del tumor, a estos antígenos también se les llama comúnmente "antígenos de trasplante específicos del tumor" o "antígenos de rechazo específicos del tumor". Varios factores pueden influir enormemente en la inmunogenicidad del tumor inducido, incluyendo, por ejemplo, el tipo específico de carcinógeno implicado, inmunocompetencia del huésped y periodo de latencia (Old, L.J., et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101:80-106; Bartlett, G.L., 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49:493-504).

La mayoría, si no todos los cancerígenos, son mutágenos que pueden causar mutación, llevando a la expresión de antígenos específicos del tumor (Ames, B.N., 1979, Science 204:587-593; Weisburger, J.H., et al., 1981, Science 214:401-407). Algunos carcinógenos son inmunosupresores (Malmgren, R.A., et al., 1952, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 79:484-488). La evidencia experimental sugiere que hay una correlación inversa constante entre inmunogenicidad de un tumor y período de latencia (tiempo entre la exposición al carcinógeno y aparición del tumor) (Old, L.J., et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101:80-106); y Bartlett, G.L., 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49:493-504). Otros estudios han revelado la existencia de antígenos específicos del tumor que no producen rechazo pero pueden estimular potencialmente respuestas inmunes específicas (Roitt, I., Brostoff, J and Male, D., 1993, Inmunología, 3a ed., Mosby, St. Louis, págs. 17.1-17.12).

2.1. Inmunogenicidades Específicas del Tumor de las Proteínas de Choque Térmico/Estrés hsp70, hsp90 y gp96

Srivastava et al. demostraron la respuesta inmune a sarcomas inducidos por metilcolantreno de ratones endogámicos (1988, Immunol. Today 9:78-83). En estos estudios se descubrió que las moléculas responsables de la inmunogenicidad individualmente diferenciada de estos tumores fueron identificadas como glicoproteínas de superficie celular de 96kDa (gp96) y proteínas intracelulares de 84 a 86kDa (Srivastava, P.K., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3407-3411; Ullrich, S.J., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3121-3125. La inmunización de ratones con gp96 o p84/86 aisladas de un tumor particular hizo a los ratones inmunes a ese tumor particular, pero no a los tumores antigénicamente diferenciados.

Blachere et al. (J. Immunotherapy, 14:352-356 (1993)) demostró que los preparados de gp96 derivados de sarcoma Met A en una dosis de 6 mg eran efectivos para prevenir el crecimiento tumoral en ratones estimulados con células de sarcoma Met A, mientras que los preparados de gp96 derivados del hígado y el bazo normales en la misma dosis no fueron efectivas.

El aislamiento y la caracterización de genes que codifican la gp96 y la p84/86 reveló la homología significativa entre ellas, y mostró que gp96 y p84/86 eran, respectivamente, la contraparte reticular endoplásmica y citosólica de las mismas proteínas de choque térmico (Srivastava, P.K. et al., 1988, Immunogenetics 28:205- 207; Srivastava, P.K., et al., 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123). Además, se demostró que la hsp70 provoca la inmunidad al tumor del que fue aislada pero no a tumores antigénicamente distintos. Sin embargo se descubrió que la hsp70 empobrecida de péptidos perdía su actividad inmunogénica (Udono, M., y Srivastava, P.K., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396). Estas observaciones sugirieron que las proteínas de choque térmico no son inmunogénicas per se, sino que son portadoras de péptidos antigénicos que provocan la inmunidad específica a cánceres (Srivastava, P.K., 1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177).

2.2 Patobiología del Cáncer

El cáncer está caracterizado principalmente por un aumento en el número de células anormales derivadas de un tejido normal dado, la invasión de tejidos adyacentes por estas células anormales, y la extensión linfática o transmisión sanguínea de células malignas a ganglios linfáticos regionales y a zonas distantes (metástasis). Los datos y los estudios clínicos biológicos moleculares indican que el cáncer es un proceso de varias etapas que empieza con cambios preneoplásicos secundarios, que pueden, bajo ciertas condiciones, progresar a neoplasia.

El crecimiento anormal pre-maligno de células es ejemplificado por hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, displasia (para estudiar tales condiciones anormales del crecimiento, consulte Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79.) La hiperplasia es una forma de proliferación controlada de células que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin modificación significativa en la estructura o función. Sólo como ejemplo, la hiperplasia endometrial suele preceder al cáncer de endometrio. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el que un tipo de célula adulta o completamente diferenciada sustituye a otro tipo de célula adulta. La metaplasia puede ocurrir en células de tejido conjuntivo o epitelial. La metaplasia atípica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia suele ser un precursor del cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada del crecimiento celular no neoplásico, implicando una pérdida de la uniformidad celular individual y de la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas suelen tener núcleos anormalmente grandes con hipercromasia y exhiben pleomorfismo. La displasia ocurre típicamente donde existe irritación o inflamación crónicas, y a menudo se encuentra en la cerviz, vías respiratorias, cavidad oral, y en la vesícula biliar.

La lesión neoplásica puede evolucionar clónicamente y puede desarrollar una capacidad creciente de invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad, especialmente bajo condiciones en las que las células neoplásicas escapan de la vigilancia inmune del huésped (Roitt, I., Brostoff, J y Kale, D., 1993, Immunology, 3ª ed., Mosby, St. Louis, págs. 17.1-17.12).

2.3. Inmunoterapia

Los cuatro tipos básicos de células, cuyas funciones han sido asociadas con la inmunidad celular antitumoral y la eliminación de células tumorales del cuerpo, son: i) linfocitos B que secretan inmunoglobulinas en el plasma sanguíneo para identificar y marcar las células invasoras que no son propias; ii) monocitos que secretan las proteínas complementarias que son responsables del lisado y procesamiento de las células invasoras diana revestidas de inmunoglobulina; iii) linfocitos naturales asesinos que tienen dos mecanismos para la destrucción celular dependiente del anticuerpo de las células tumorales, citotoxicidad y matanza natural; y iv) linfocitos T que poseen receptores específicos del antígeno y cada clon de línfocito T que tiene la capacidad de reconocer una célula tumoral que lleve moléculas marcadoras complementarias (Schreiber, H., 1989, en Fundamental Immunology (ed). W.E. Paul, págs. 923-955).

Varios factores pueden influir en la inmunogenicidad de tumores inducidos. Estos factores incluyen dosis de carcinógenos, inmunocompetencia del huésped y período de latencia. La inmunocompetencia del huésped durante el período de inducción y desarrollo del cáncer puede permitir al huésped responder a células tumorales inmunogénicas. Esto puede prevenir el crecimiento de estas células o seleccionar muchos menos variantes de escape inmunogénicos que han perdido su respectivo antígeno de rechazo. Por el contrario, la inmunosupresión o inmunodeficiencia del huésped durante la carcinogénesis o tumorigénesis pueden permitir el crecimiento de tumores muy inmunogénicos (Schreiber, H., 1989, en Fundamental Immunology (ed). W.E. Paul, pp. 923-955).

Actualmente se están explorando tres tipos principales de inmunoterapia contra el cáncer: i) inmunoterapia celular adoptiva, ii) manipulación in vivo de plasma del paciente para eliminar los factores bloqueantes o añadir factores tumoricidas, e iii) administración in vivo de modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, los interferones (IFN; IFN-alfa e IFN-gamma), interleuquinas (IL; IL-2, IL-4 e IL6), factores de estimulación de colonias, factor de necrosis tumoral (TNF), anticuerpos monoclonales y otros agentes inmunopotenciadores, tales como Corynebacterium parvum (C. parvum) (Kopp, W.C., et al., 1994, Cancer Chemotherapy and Biol. Response Modifiers 15:226-286). Existen pocas dudas de que la inmunoterapia contra el cáncer, tal y como es, no satisface las esperanzas depositadas en ella. Aunque se han probado numerosos enfoques inmunoterapéuticos, pocos de estos procedimientos han resultado efectivos como la única o incluso como una forma complementaria de prevención y tratamiento del cáncer.

2.3.1. Interleuquinas (IL-2, IL-4 e IL-6)

La IL-2 tiene actividad antitumoral significativa en un pequeño porcentaje de pacientes con carcinoma celular renal y melanoma. Los investigadores continúan buscando regímenes a base de IL-2 que aumenten las tasas de respuesta en tumores sensibles a la IL-2, pero la mayoría no ha definido nuevas indicaciones ni han abordado problemas fundamentales, como si la intensidad de la dosis es importante en la terapia con IL-2 (Kopp, W.C., et al., 1994, Cancer Chemotherapy and Biol. Response Modifiers 15: 226-286). Numerosos informes han documentado la implicación de la toxicidad asociada a la IL-2 en los aumentos de niveles de nitrato y el síndrome de derrame vascular e hipotensión, análogo al choque séptico. Además, la mayor incidencia de infecciones bacterianas no oportunísticas y complicaciones autoinmunes suelen venir acompañadas de la respuesta antitumoral de la IL-2 (Kopp, W.C., et al., 1994, Cancer Chemotherapy and Biol. Response Modifiers 15:226-286).

También se han probado la IL-4 y la IL-6 como agentes antitumorales ya sea directamente o por mecanismos inmunomoduladores. Se han observado toxicidades limitadoras de la dosis con ambos agentes en ensayos clínicos en Fase I (Gilleece, M.H., et al., 1992, Br. J. Cancer 66:204-210, Weber, J., et al., 1993, J. Clin. Oncol. 11:499-506).

2.3.2. Factor de Necrosis Tumoral

La toxicidad del TNF sistémicamente administrado limita seriamente su uso para el tratamiento del cáncer. El TNF ha sido más efectivo usado en terapia regional, en la que se toman medidas, como el aislamiento del miembro para la perfusión, para limitar la dosis sistémica y consecuentemente la toxicidad del TNF. La toxicidad limitadora de la dosis del TNF consiste en trombocitopenia, dolor de cabeza, confusión e hipotensión (Mittleman, A., et al., 1992, Inv. New Drugs 10:183-190).

2.3.3. Interferones

La actividad del IFN-\alpha ha sido descrita como modesta en varias malignidades, inclusive el carcinoma celular renal, melanoma, linfoma no Hodgkin de bajo grado de leucemia de células vellosas, y otras. Las dosis más altas de IFN-\alpha van asociadas generalmente a tasas más altas de respuesta en algunas malignidades, pero también causan más toxicidad. Además, cada vez más informes indican que las recaídas después de la terapia satisfactoria con interferones coinciden con la formación de anticuerpos neutralizadores del interferón (Quesada, J.R., et al., 1987, J. Interferon Res. 67:678.

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2.4. Modelos Farmacocinéticos de Fármacos Inmunoterapéuticos y Quimioterapéuticos Anticancerosos: Extrapolación y Adaptación de Datos Animales a Humanos

Las limitaciones éticas y fiscales que requieren el uso de modelos animales para la mayoría de las investigaciones de toxicología también imponen la aceptación de ciertas suposiciones fundamentales para estimar la potencia de la dosis en humanos de los datos de dosis-respuesta en animales. La equivalencia dosis-respuesta entre especies es estimada la mayoría de las veces como el producto de una dosis para una especie de referencia y una única ratio de adaptación basada en un parámetro fisiológico como peso corporal, área de superficie corporal, potencial de esperanza de vida máxima, etc. Lo más frecuente es que la exposición sea expresada como miligramos de dosis administrada en proporción a la masa corporal en kilogramos (mg kg^{-1}). La masa corporal es un sustituto del volumen corporal, y por lo tanto, la relación de miligramos por kilogramo es realmente concentraciones en miligramos por litro (Hirshaut, Y., et al., 1969, Cancer Res. 29: 1732-1740). Las suposiciones clave que acompañan esta práctica y contribuyen a su fracaso para estimar exactamente la exposición equipotente entre varias especie son: i) que los sistemas biológicos implicados son "volúmenes muy mezclados" homogéneos, con una gravedad específica igual a 1,0; ii) que los compuestos administrados son instantánea y homogéneamente distribuidos por toda la masa corporal; e iii) que la respuesta de los sistemas biológicos es directamente proporcional sólo a la concentración inicial del materia de prueba en el sistema. Como las verdaderas condiciones farmacocinéticas parten de estas suposiciones, la utilidad de la adaptación de la concentración inicial entre especies disminuye.

A través de la farmacocinética, uno puede estudiar el curso de tiempo de un fármaco y sus niveles de metabolitos en diferentes fluidos, tejidos y excrementos del cuerpo, y las relaciones matemáticas necesarias para desarrollar modelos para interpretar tales datos. Por lo tanto, proporciona la información básica con respecto a distribución, disponibilidad y toxicidad resultante del fármaco en los tejidos y de ahí, especifica la limitación en la dosis del fármaco para diferentes horarios de tratamiento y diferentes vías de administración del fármaco. El último objetivo de los estudios farmacocinéticos de los fármacos contra el cáncer es así ofrecer un esquema para el diseño de regímenes de dosis terapéuticas óptimas y horarios de tratamiento para pacientes individuales.

Las pautas actualmente utilizadas para la prescripción han evolucionado gradualmente sin tener siempre una justificación completa y explícita. En 1966, Freireich y sus colegas propusieron el uso de proporciones de área de superficie para la extrapolación entre especies de la toxicidad aguda de los fármacos contra el cáncer. Este procedimiento ha llegado a ser el método elegido para muchas aplicaciones para calificar el riesgo (Freireich, E.J., et al., 1966, Cancer Chemotherapy Rep. 50:219-244). Por ejemplo, la adaptación del área de superficie es la base del procedimiento de extrapolación entre especies del Instituto Nacional del Cancer para fármacos contra el cáncer (Schein, P.S., et al., 1970, Clin. Pharmacol. Therap. 11:3-40; Goldsmith, M.A., et al., 1975, Cancer Res. 35:1354-1364). Al aceptar la extrapolación del área de superficie, la basé poco firme para la adaptación de la concentración inicial ha sido reemplazada por un enfoque empírico. La fórmula básica usada para estimar la prescripción de la quimioterapia contra el cáncer por área de superficie corporal (ASC) es ASC = k x kg^{2/3}, donde k es una constante que varía para cada grupo de edad y especie. Por ejemplo, el valor k para humanos adultos es 11, mientras que para ratones es 9 (Véase Quiring, P., 1955, Surface area determination, en Glasser E. (ed.) Medical Physics I Chicago: Libro médico del Año, p. 1490 y Vriesendorp, H.M., 1985, Hematol. (Supplm. 16) 13:57-63). El mayor atractivo de expresar la quimioterapia contra el cáncer por m^{2} de ASC parece ser que ofrece una simplificación fácilmente recordada, es decir, iguales dosis de fármaco por m^{2} de ASC producirán aproximadamente el mismo efecto en especies diferentes comparables y grupos de edad. Sin embargo, la sencillez no es una confirmación y parece que los métodos alternativos para estimar la prescripción de fármacos contra el cáncer tienen una mejor base científica, con el potencial agregado de un uso más efectivo de agentes contra el cáncer (Hill, J.A., et al., 1989, Health Physics 57:395-401).

La eficacia de una dosis óptima de un fármaco utilizado en la quimioterapia y/o la inmunoterapia puede ser alterada por varios factores, inclusive la cinética del crecimiento del tumor, resistencia al fármaco de las células tumorales, carga total en el cuerpo de células tumorales, efectos tóxicos de la quimioterapia y/o la inmunoterapia en células y tejidos distintos del tumor y la distribución de agentes quimioterapéuticos y/o agentes inmunoterapéuticos en los tejidos del paciente. Cuanto más grande sea el tamaño del tumor primario, más grande será la probabilidad de que muchas células (resistentes al fármaco y sensibles al fármaco) hayan metastatizado antes del diagnóstico y de que el paciente recaiga después del primario.

Algunas metástasis surgen en ciertos sitios en el cuerpo donde la resistencia a la quimioterapia se basa en la distribución limitada en el tejido de los fármacos quimioterapéuticos administrados en dosis estándares. Tales sitios actúan como santuarios que protegen las células cancerosas de los fármacos que circulan en la sangre; por ejemplo, hay barreras en el cerebro y los testículos que impiden la difusión del fármaco de los capilares en el tejido. Así, estos sitios pueden requerir formas especiales de tratamiento como inmunoterapia, especialmente porque la inmunosupresión es característica de varios tipos de enfermedades neoplásicas.

3. Resumen de la invención

Los métodos de la invención se refieren a métodos para provocar una respuesta inmunitaria en un individuo en quien se desea el tratamiento o prevención de cáncer administrando una composición que comprende una cantidad efectiva de un complejo, donde el complejo consiste esencialmente en una proteína de choque térmico (hsp) unida en forma no covalente a una molécula antigénica. Las cantidades del complejo están dentro de rangos de dosis efectivas, que el presente inventor ha descubierto que son efectivas y que son sorprendentemente más pequeñas que aquellas cantidades de las que antes se ha dicho que eran efectivas por extrapolación, según los métodos de la técnica anterior, de dosis utilizadas en estudios con animales. En una forma de realización preferida, el complejo es autólogo al individuo; esto es, el complejo es aislado de las células cancerígenas del propio individuo (por ejemplo, preferiblemente preparado de las biopsias del tumor del paciente). Alternativamente, la hsp y o la molécula antigénica pueden ser aisladas del individuo o de otros o por métodos de producción recombinante utilizando una hsp cerrada derivada originalmente del individuo o de otros. "Molécula antigénica", como se utiliza aquí, se refiere a los péptidos con los que las hsp se asocian endógenamente in vivo (por ejemplo, en el tejido precanceroso o canceroso), así como antígenos/inmunogenes exógenos (es decir, con los que las hsp no forman complejo in vivo) o fragmentos antigénicos/inmunogénicos y derivados de los mismos. Tales antígenos exógenos y fragmentos y derivados (tanto péptido como no péptido) del mismo para usar en la formación de complejos con las hsp, pueden ser seleccionados de entre aquellos conocido en la técnica, así como aquellos fácilmente identificados por inmunoensayos estándares conocidos en la técnica detectando la capacidad de unir anticuerpos o moléculas MHC (antigenicidad) o generar una respuesta inmunitaria (inmunogenicidad).

La invención también se refiere a un método para medir la refección in vivo en un individuo, preferiblemente un humano, comprendiendo medir la generación por el individuo de linfocitos T citotóxicos CD8^{+} restringidos por MHC de Clase I específicos al tumor.

La invención se refiere a métodos para determinar la dosis para tratar enfermedades infecciosas o para la inmunoterapia humana contra el cáncer evaluando la dosis óptima de complejos de hsp unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas en modelos experimentales de tumor y extrapolar los datos. La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la prevención y el tratamiento de enfermedades neoplásicas primarias y metastásicas.

Los regímenes terapéuticos, composiciones farmacéuticas y kits específicos están relacionados con la invención. A diferencia del estado de la técnica anterior, el régimen terapéutico y los correspondientes compuestos farmacéuticos de la presente invención no se basan en el peso ni el área de superficie del paciente. El presente inventor ha descubierto que una dosis substancialmente equivalente a aquella considerada que era efectiva en mamíferos no humanos más pequeños (por ejemplo, ratones) es efectiva para la administración humana, opcionalmente sometida a un factor de corrección que no excede un aumento de cincuenta veces, basado en los tamaños relativos de los ganglios linfáticos en tales mamíferos y en los humanos. Las formulaciones farmacéuticas son proporcionadas en base a una extrapolación recientemente descubierta y adaptación de la dosis del animal al humano, comprendiendo composiciones de complejos de moléculas antigénicas y proteínas de choque térmico/estrés, incluyendo pero sin limitarse a hsp70, hsp90, gp96 ya sea solas o combinadas. Específicamente, la equivalencia dosis-respuesta entre especies para la hsp unida en forma no covalente a moléculas antigénicas para una dosis humana es estimada como el producto de la dosis terapéutica observada en ratones y una sola ratio de adaptación sin exceder un aumento de cincuenta veces.

La presente invención se refiere a métodos para la prevención y el tratamiento de cáncer aumentando la competencia inmune del huésped y la actividad de las células efectoras inmunes. Además, la invención se refiere a métodos para evaluar la eficacia de los fármacos en mejorar las respuestas inmunitarias para el tratamiento y la vigilancia del progreso de los pacientes que participan en ensayos clínicos para el tratamiento de enfermedades neoplásicas primarias y metastásicas.

La inmunoterapia usando regímenes terapéuticos relacionados con la invención, administrando tales complejos de proteínas de choque térmico/estrés unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas, puede inducir la inmunidad específica a las células tumorales y llevar a la regresión de la masa tumoral. Los cánceres que son sensibles a la inmunoterapia específica por las proteínas de choque térmico/estrés de la invención incluyen pero no se limitan a sarcomas y carcinomas humanos. En una forma de realización específica, los complejos de hsp-molécula antigénica son alogénicas al paciente; en una forma de realización preferida, las hsp son autólogas a (derivadas de) el paciente a quien son administradas.

Las composiciones particulares de la invención y sus propiedades están descritas en las secciones y las subdivisiones que siguen. Una composición preferida comprende los complejos de hsp-péptido aislados de la biopsia del tumor del paciente a quien debe administrarse la composición. Una composición que comprende hsp70, hsp90 y/o gp96 demuestra una fuerte inhibición a una variedad de tumores en mamíferos. Además, las dosis terapéuticas que son efectivas en el correspondiente modelo experimental en roedores como se describe abajo, en la Sección 6, pueden ser utilizadas para inhibir el crecimiento in vivo de cánceres de colon e hígado en enfermos de cáncer humanos como se describe en la sección 7, abajo. También se describen composiciones que comprenden hsp70, hsp90 y/o gp96 que preferiblemente no exhiben toxicidad cuando se administran a sujetos humanos.

En otra forma de realización, los métodos también comprenden opcionalmente administrar modificadores de la respuesta biológica, por ejemplo, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, u otros factores de crecimiento de citoquinas que afecten a las células inmunes, en combinación con los complejos de hsp.

Además de la terapia contra el cáncer, los complejos de hsp unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas pueden ser utilizados para la prevención de una variedad de cánceres, por ejemplo, en individuos que están predispuestos como consecuencia de la historia familiar o en individuos con un mayor riesgo de padecer cáncer debido a factores ambientales.

También se describe un método mejorado para la purificación de complejos de hsp70-péptido de células.

Los Ejemplos presentados en las Secciones 6 y 7 abajo, detallan el uso según los métodos de la invención de complejos de hsp-péptido en la inmunoterapia contra el cáncer en modelos experimentales de tumor y en pacientes humanos que padecen de cáncer de colon e hígado.

4. Descripción breve de las figuras

Figura 1. Efecto de la Administración de gp96 derivada de carcinomas UV6138 o UV6139SJ en el crecimiento del tumor medido como diámetro medio del tumor (mm).

Panel A: Línea 1, perfil de SDS-PAGE de preparación de gp96; Línea 2, inmunotransferencia de línea 1 con anticuerpo específico para la gp96.

Panel B (arriba): Se estimuló a todos los ratones con células UV6138. El primer grupo de ratones (círculos abiertos) recibió PBS; el segundo grupo de ratones (círculos sólidos) recibió gp96 derivada de células UV6138; y el tercer grupo de ratones recibió gp96 derivada de células UV6139SJ.

Panel B (abajo): Todos los ratones fueron estimulados con células UV6139SJ. El primer grupo de ratones (círculos abiertos) recibió PBS; el segundo grupo de ratones (círculos sólidos) recibió gp96 derivada de células UV6138; y el tercer grupo de ratones recibió gp96 derivada de células UV6139SJ.

Figura 2. Efecto en los ratones con tumor de la administración terapéutica de gp96 derivada de células UV6139SJ en el crecimiento del tumor medido como volumen del tumor (mm^{3}). Todos los ratones fueron estimulados con células UV6139SJ. El primer grupo de ratones no recibió tratamiento, el segundo grupo recibió gp96 derivada de células UV6139SJ, y el tercer grupo recibió gp96 derivada del hígado.

Figura 3. La vacunación con preparados de gp96 cognados provocó CTL restringidos con MHC de clase I. Los ratones fueron inmunizados con gp96 derivada de UV6138 (triángulos) o UV6139SJ (rectángulos) o con células tumorales intactas (círculos), como se describe en la leyenda de la Fig. 1. Diez días después de la segunda inmunización, se quitaron los bazos y se cocultivaron las células del bazo en un cultivo mezclado de tumor y linfocitos (MLTC) con células tumorales irradiadas usadas para la inmunización o la preparación de gp96. Se probó la citotoxicidad de los MLTC en un ensayo de liberación de cromo. Los símbolos abiertos se refieren a la citotoxicidad en presencia del anticuerpo K44 específico de anti-MHC de clase I. (A) Citotoxicidad in vitro de ratones no inmunizados (triángulo) o ratones inmunizados con 20 microgramos de gp96 derivada de UV6138 (círculo) o UV6139SJ (rectángulo) contra dianas como se indica. (B) Citotoxicidad in vitro de ratones no inmunizados (triángulo) o ratones inmunizados dos veces con 107 células de UV6138 irradiadas (círculos) o células UV6139SJ (rectángulos) contra dianas como se indica.

Figura 4. La vacunación con preparados de gp96 cognados provoca la respuesta de células T resistentes a la radiación. Los ratones fueron inmunizados con gp96 derivada de UV6138 (triángulos) o UV6139SJ (rectángulos) y los MLTC se activaron como se describe en la leyenda de la Fig. 2, excepto aquellos ratones que fueron irradiados a 400 rad doce días después de la última vacunación y los MLTC se activaron tres días después de la irradiación. Los símbolos abiertos se refieren a la citotoxicidad en presencia del anticuerpo K44 específico de anti-MHC de clase I.

Figura 5. A. Se descubrió que el preparado de hsp70 eluído con ADP y ligado con ADP se asociaba a péptidos. B. Se descubrió que el preparado de hsp70 eluído con ATP y ligado con ATP hsp70 no se asociaba a péptidos.

5. Descripción detallada de la invención

Se describen los métodos y las composiciones para la prevención y el tratamiento de enfermedades neoplásicas primarias y metastásicas y enfermedades infecciosas y para provocar una respuesta inmunitaria en un individuo humano. La invención se basa, en parte, en un régimen recientemente descubierto de dosificación para la administración de composiciones que comprenden complejos de hsp unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas.

"Molécula antigénica", como se utiliza aquí, se refiere a los péptidos con los que las hsp se asocian endógenamente in vivo (por ejemplo, en células infectadas o tejido precanceroso o canceroso) así como antígenos/inmunogenes exógenos (es decir, con los que las hsp no forman complejo in vivo) o fragmentos antigénicos/inmunogénicos y derivados de los mismos.

Los Métodos según la invención comprenden métodos para provocar una respuesta inmunitaria en un individuo en quien se desea el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas o cáncer administrando una composición que comprende una cantidad efectiva de un complejo, donde el complejo consiste esencialmente en una hsp unida en forma no covalente a una molécula antigénica. Preferiblemente, el complejo es autólogo al individuo; esto es, el complejo es aislado de bien las células infectadas o las células cancerosas o las células precancerosas del propio individuo (por ejemplo, preferiblemente preparado de las biopsias del tumor o de tejidos infectados del paciente). Alternativamente, el complejo es producido in vitro (por ejemplo, cuando se desea un complejo con una molécula antigénica exógena). Alternativamente, la hsp y/o la molécula antigénica pueden ser aisladas del individuo o de otros o por métodos de producción recombinante utilizando una hsp clonada derivada originalmente del individuo o de otros. Los antígenos exógenos y sus fragmentos y derivados (tanto péptido como no péptido) para usarlos en la formación de complejos con hsp, pueden ser seleccionados de entre aquellos conocidos en la técnica, así como aquellos fácilmente identificados por inmunoensayos estándares conocidos en la técnica por la capacidad de ligar anticuerpos o moléculas MHC (antigenicidad) o generar respuesta inmunitaria (inmunogenicidad). Los complejos de hsp y moléculas antigénicas pueden ser aislados del tejido canceroso o precanceroso de un paciente, o de una línea celular cancerosa, o pueden ser producidos in vitro (como es necesario en la forma de realización en la que un antígeno exógeno es utilizado como molécula antigénica).

La invención también se refiere a un método para medir el rechazo a un tumor in vivo en un individuo, preferiblemente un humano, que comprende medir la generación por el individuo de linfocitos T CD8^{+} citotóxicos restringidos por MHC de Clase I específicos al tumor.

Las hsp de la presente invención que pueden ser utilizadas incluyen, hsp70 y gp96 solas o combinadas con otras hsp como, pero sin limitarse a hsp90. Las hsp son hsp humanas.

Las proteínas de choque térmico a las que también se las llama indistintamente aquí proteínas de estrés, útiles en la práctica de esta invención, pueden ser seleccionadas de entre cualquier proteína celular que satisfaga cualquiera de los criterios siguientes.

Es una proteína cuya concentración intracelular aumenta cuando una célula es expuesta a un estímulo estresante, es capaz de unirse a otras proteínas o péptidos, es capaz de soltar las proteínas o los péptidos unidos en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) o pH bajo, o es una proteína que muestra por lo menos un 35% de homología con cualquier proteína celular que tenga cualquiera de las propiedades anteriores.

Las primeras proteínas de estrés en ser identificadas fueron las proteínas de choque térmico (hsp). Como su nombre implica, las hsp son sintetizadas por una célula en respuesta a un choque térmico. Hasta la fecha se han identificado tres familias principales de hsp en base al peso molecular. Las familias han sido llamadas hsp70, hsp70 y hsp90, donde los números reflejan el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en el kilodaltons. Se descubrió posteriormente que muchos miembros de estas familias eran inducidos en respuesta a otros estímulos estresantes incluyendo, pero sin limitarse a, privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno e infección con patógenos intracelulares. (Véase Welch, Mayo 1993, scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gething, et al., 1992, Nature 355:33-45; y Linguist, et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677). Se considera que las proteínas hsp/estrés pertenecientes a estas tres familias pueden ser utilizadas en la práctica de la presente invención.

Las principales hsp se pueden acumular a niveles muy altos en células estresadas, pero lo hace a niveles de bajo a moderado en células que han sido estresadas. Por ejemplo, la hsp70 mamífera altamente inducible es apenas perceptible a temperaturas normales pero llega a ser una de las proteínas más activamente sintetizadas en la célula tras un choque térmico (Welch, et al., 1985, J. cell. Biol. 101:1198-1211). Por el contrario, las proteínas hsp90 y hsp60 son abundantes a temperaturas normales en la mayoría, pero no todas, las células mamíferas y son inducidas aún más por calor (Lai, et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-10; van Bergen en Henegouwen, et al., 1987, Genes Dev.
1:525-31).

Las proteínas de choque térmico están entre las proteínas mejor conservadas de la existencia. Por ejemplo, DnaK, la hsp70 de E. coli tiene una identidad de aproximadamente el 50% de la secuencia de aminoácidos con las proteínas hsp70 de excoriatos (Bardwell, et Al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852). Las familias de hsp60 y hsp90 también muestran niveles igualmente altos de conservación entre familias (Hickey, et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283). Además, se ha descubierto que las familias de hsp60, hsp70 y hsp90 están compuestas por proteínas que están relacionadas con las proteínas de estrés en una secuencia, por ejemplo, teniendo una identidad de aminoácidos de más del 35% pero cuyo niveles de expresión no se alteran por estrés. Por lo tanto se contempla que la definición de proteína de estrés, como se utiliza aquí, abarca otras proteínas, muteínas, análogos y variantes de la misma teniendo una identidad de aminoácidos de por lo menos 35% a 55%, preferiblemente 55% a 75%, y más preferiblemente 75% a 85% con miembros de las tres familias cuyo niveles de expresión en una célula aumentan en respuesta a un estímulo estresante. La purificación de las proteínas de estrés que pertenecen a estas tres familias se describe abajo.

Los complejos inmunogénicos de hsp-péptido de la invención pueden incluir cualquier complejo que contenga una hsp y un péptido que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los péptidos son asociados en forma no covalente a la hsp. Los complejos pueden incluir complejos de hsp70-péptido o gp96-péptido. Por ejemplo, se puede utilizar una hsp llamada gp96 que está presente en el retículo endoplásmico de las células eucarióticas y está relacionada con el de la hsp90 citoplásmica para generar una vacuna efectiva conteniendo un complejo de gp96-péptido.

Aunque las hsp pueden ser alogénicas al paciente, en una forma de realización preferida, las hsp son autólogas a (derivadas de) el paciente a quien son administradas. Las hsp y/o moléculas antigénicas pueden ser purificadas de fuentes naturales, sintetizadas químicamente o producidas por recombinación. La invención proporciona métodos para determinar la dosis para la inmunoterapia humana contra el cáncer evaluando la dosis óptima de hsp unidas en forma no covalente a complejos de péptidos en modelos experimentales de tumor y extrapolar los datos. Específicamente se utiliza un factor de adaptación que no excede en cincuenta veces la dosis efectiva estimada en el animal como el método óptimo de prescripción para la inmunoterapia o vacunación contra el cáncer en sujetos humanos.

La invención proporciona combinaciones de composiciones que aumentan la inmunocompetencia del individuo huésped y provocan la inmunidad específica contra agentes infecciosos o inmunidad específica contra células preneoplásicas y neoplásicas. Los regímenes terapéuticos y las composiciones farmacéuticas de la invención se describen abajo. Estas composiciones tienen la capacidad de prevenir el comienzo y la progresión de enfermedades infecciosas y prevenir el desarrollo de células tumorales e inhibir el crecimiento y la progresión de células tumorales que indican que tales composiciones pueden inducir la inmunidad específica en enfermedades infecciosas e inmunoterapia contra el cáncer.

Parece que las hsp inducen una reacción inflamatoria en el sitio del tumor y finalmente causan una regresión de la carga del tumor en los pacientes tratados de cáncer. Los cánceres que pueden ser tratados con complejos de hsp unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas humanos.

Por consiguiente, la invención se refiere a métodos para prevenir y tratar cáncer en un individuo comprendiendo administrar una composición que estimula la inmunocompetencia del individuo huésped y provoca la inmunidad específica contra las células preneoplásicas y neoplásicas. Como se usa aquí, la célula "preneoplásica" se refiere a una célula que está en transición de una forma normal a una forma neoplásica; y la evidencia morfológica, cada vez más apoyada por estudios biológicos moleculares, indica que la preneoplasia progresa a través de múltiples fases. El crecimiento de la célula no neoplásica consiste comúnmente en hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, displasia (para estudiar tales condiciones anormales de crecimiento véase Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed., M.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79). La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. Sólo como ejemplo, la hiperplasia endometrial suele preceder al cáncer de endometrio. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el que un tipo de célula adulta o completamente diferenciada sustituye a otro tipo de célula adulta. La metaplasia puede ocurrir en células de tejido conjuntivo o epitelial. La metaplasia atípica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia suele ser un precursor del cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada del crecimiento de células no neoplásicas, implicando una pérdida en la uniformidad celular individual y en la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas suelen tener núcleos anormalmente grandes con hipercromasia y exhiben pleomorfismo. La displasia ocurre típicamente donde existe irritación o inflamación crónicas, y a menudo se encuentra en la cerviz, vías respiratorias, cavidad oral, y en la vesícula biliar. Aunque las lesiones preneoplásicas pueden progresar a neoplasia, también pueden permanecer estables durante periodos largos e incluso pueden retroceder, especialmente si se elimina el agente que las incita o si la lesión sucumbir a un ataque inmunológico por su huésped.

Los regímenes terapéuticos y composiciones farmacéuticas según la invención pueden ser utilizados con potenciadores de la respuesta inmunitaria adicionales o modificadores de la respuesta biológica incluyendo, pero sin limitarse a, las citoquinas IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, u otra citoquina que afecte a las células inmunes. De acuerdo con este aspecto, los complejos de hsp y molécula antigénica son administrados en la terapia de combinación con una o con más de estas citoquinas.

La invención también se refiere a la administración de complejos de hsp-moléculas antigénicas a individuos con mayor riesgo de padecer cáncer debido a la historia familiar o factores de riesgo ambientales.

5.1. Regímenes de Dosificación

En modelos de tumores experimentales se estableció que la dosis más baja de complejos de hsp unida en forma no covalente a un péptido que producía una regresión del tumor en ratones era entre 10 y 25 microgramos/ratón con un peso de 20-25 g que es igual a 25 mg/25 g = 1 mg/kg. Los métodos de la técnica anterior extrapolan a humanos dosificaciones basadas en el peso corporal y área de superficie. Por ejemplo, los métodos de la técnica anterior de extrapolar la dosificación humana basada en el peso corporal puede ser llevada a cabo de la siguiente manera: Como el factor de conversión para convertir la dosificación para el ratón a la dosificación para el humano es Dosis para Humano por kg = Dosis de Ratón por kg x 12 (Véase Freireich, E.J., et al., 1966, Cancer Chemotherap, Rep. 50:219-244), la dosis efectiva de complejos de hsp-péptido en humanos que pesen 70 kg debería ser 1 mg/kg/12x70, es decir, aproximadamente 6 mg (5,8 mg).

Las dosis de fármacos también se dan en miligramos por metro cuadrado de área corporal porque este método en lugar del peso corporal logra una correlación buena para algunas funciones metabólicas y excretoras (Shirkey, H.C., 1965, JAMA 193:443). Además, se puede utilizar el área corporal como un común denominador para la dosificación de fármacos en adultos y niños así como en especies animales diferentes como se indica abajo en la Tabla 1 (Freireich, E.J., et al., 1966, Cancer Chemotherap. Rep. 50:229-244).

TABLA 1 Relaciones representativas del área de superficie a peso (km) para varias especies^{1}

1

Ejemplo: Para expresar una dosis en mg/kg en cualquier especie dada como la dosis equivalente en mg/m^{2}, multiplique la dosis por el factor km apropiado. En el humano adulto, 100 mg/kg equivale a 100 mg/kg x 37 kg/m^{2} = 3700 mg/m^{2}.

A diferencia de los dos métodos de la técnica anterior descritos arriba para determinar los niveles de dosificación, la presente invención proporciona dosificaciones de complejos purificados de hsp y moléculas antigénicas que son mucho más pequeñas que las dosificaciones estimadas por la técnica anterior. Por ejemplo, según la invención, se administra una cantidad de complejos de hsp70- y/o gp96-molécula antigénica que está en el rango de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 600 microgramos para un paciente humano, la dosificación preferida para el humano siendo la misma que la utilizada en un ratón de 25 g, es decir, en el rango de 10-100 microgramos. La dosificación para los complejos de hsp90 y péptido en un paciente humano proporcionada por la presente invención está en el rango de aproximadamente 50 a 5.000 microgramos, la dosificación preferida siendo de 100 microgramos.

Las dosis mencionadas arriba se administran preferiblemente una vez a la semana durante un período de aproximadamente 4-6 semanas, y el modo o el sitio de administración varia preferiblemente con cada administración. En un ejemplo preferido, se dan administraciones subcutáneas, cambiando cada sitio de administración secuencialmente. Así, a modo de ejemplo y no como limitación, la primera inyección puede hacerse subcutáneamente en el brazo izquierdo, la segunda en el brazo derecho, la tercera en el vientre izquierdo, la cuarta en el vientre derecho, la quinta en el muslo izquierdo, la sexta en el muslo derecho, etc. Se puede repetir el mismo sitio después de un intervalo de una o más inyecciones. También se pueden dividir las inyecciones. Así, por ejemplo, se puede administrar la mitad de la dosis en un sitio y la otra mitad en otro sitio en el mismo día.

Alternativamente, el modo de administración varía secuencialmente, por ejemplo, se hacen inyecciones semanales en secuencia subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitonealmente.

Después de 4-6 semanas, se administran inyecciones adicionales preferiblemente en intervalos de dos semanas en el período de tiempo de un mes. Las inyecciones posteriores pueden administrarse mensualmente. El ritmo de inyecciones posteriores puede ser modificado, dependiendo del progreso clínico del paciente y la receptividad a la inmunoterapia.

La invención es ilustrada por ejemplos no limitadores en las Secciones 6 y 7.

5.2. Composiciones Terapéuticas para Respuestas inmunitarias al Cáncer

Las composiciones comprendiendo hsp unidas en forma no covalente a moléculas antigénicas son administradas para provocar una respuesta inmunitaria específica efectiva a las moléculas antigénicas del complejo (y no a las hsp).

Los complejos no covalentes de hsp70 y gp96 con péptidos pueden ser preparados y pueden ser purificados posoperatoriamente de células tumorales obtenidas del enfermo de cáncer.

De acuerdo con los métodos descritos aquí, los péptidos inmunogénicos o antigénicos que forman un complejo endógeno con las hsp o antígenos de MHC pueden ser utilizados como moléculas antigénicas. Por ejemplo, se pueden preparar tales péptidos para estimular las respuestas citotóxicas de células T contra diferentes antígenos tumorales (por ejemplo, tirosinasa, gp100, melan-A, gp75, mucinas, etc.) y proteínas víricas incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas del virus de inmunodeficiencia de tipo I (VIH-I), virus de inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II, hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (VHS-I), herpes simplex tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sinticial respiratorio, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubéola y virus de polio. En la forma de realización en la que las moléculas antigénicas son péptidos que forman un complejo no covalente con las hsp in vivo, los complejos pueden ser aislados de células, o alternativamente, producidos in vitro de preparados purificados cada uno de hsp y moléculas antigénicas.

En otra forma de realización específica, los antígenos de cánceres (por ejemplo, tumores) o agentes infecciosos (por ejemplo, antígenos víricos, antígenos bacterianos, etc.) pueden ser obtenidos por purificación de fuentes naturales, por síntesis química, o por recombinación y por procedimientos in vitro como los que se describen abajo, formando complejos no covalentes con las hsp.

En una forma de realización en la que el complejo hsp-molécula antigénica para usar es un complejo que es producido in vivo en células, se pueden emplear procedimientos de purificación ejemplares como los que se describen en las Secciones 5.2.1-5.2.3 abajo. Alternativamente, en una forma de realización en la que se desee utilizar moléculas antigénicas formando complejos con hsp in vitro, las hsp pueden ser purificadas para tal uso de complejos endógenos de hsp-péptido en presencia de ATP o pH bajo (o sintetizadas químicamente o producidas por recombinación). Los protocolos descritos aquí pueden ser utilizados para aislar los complejos de hsp-péptido, o las hsp solas, de cualquier célula eucariótica, por ejemplo, tejidos, células aisladas, o líneas de células eucaríotas inmortalizadas infectadas con un patógeno intracelular preseleccionado, células tumorales o líneas de células tumorales.

5.2.1. Preparación y Purificación de Complejos Hsp 70-péptido

La purificación de complejos hsp70-péptido ha sido descrita anteriormente, véase, por ejemplo, Udono et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396. Un procedimiento que puede ser utilizado, presentado a modo de ejemplo pero no como limitación, es como sigue:

En primer lugar se suspenden las células tumorales en 3 volúmenes de tampón de lisis 1X consistente en 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl_{2}, 2 mM de MgCl_{2} y 1 mM de fenilmetilsulfonil-fluoruro (PMSF). Entonces se somete el granulado a sonicación en hielo, hasta que >99% de las células sean lisadas determinado por examen microscópico. Como una alternativa a la sonicación, las células pueden ser lisadas por cizallamiento mecánico y en este procedimiento las células son resuspendidas típicamente en 30 mM de bicarbonato de sodio a pH 7,5, 1 mM de PMSF, incubadas en hielo durante 20 minutos y entonces homogeneizadas en un homogeneizador Dounce hasta que >95% de las células sean lisadas.

Entonces se centrifuga el lisado a 1.000 g durante 10 minutos para eliminar las células intactas, los núcleos y otros restos celulares. El sobrenadante obtenido es recentrifugado a 100.000 g durante 90 minutos, el sobrenadante es cosechado y entonces mezclado con Con A Sepharose equilibrada con tampón de fosfato salino (PBS) conteniendo 2 mM de Ca^{2+} y 2 mM de Mg^{2+} Cuando las células son lisadas por cizallamiento mecánico el sobrenadante es diluido con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de mezclar con Con A Sepharose. Entonces se deja unir el sobrenadante a la Con A Sepharose durante 2-3 horas a 4ºC. Se cosecha el material que no ha conseguido unirse y se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) con 10 mM de Tris-Acetato, pH 7,5, 0,1 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, 1 mM de PMSF. Entonces se centrifuga el dializado a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 20 minutos. Luego se cosecha el sobrenadante obtenido y se aplica en una columna de FPLC Mono Q equilibrada en 20 mM de Tris-Acetato, pH 7,5, 20 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA y 15 mM de 2-mercaptoetanol. La columna entonces es desarrollada con un gradiente de 20 mM a 500 mM de NaCl y entonces se fraccionan las fracciones eluídas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se caracteriza por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-hsp70 apropiado (como el del clon N27F3-4, de StressGen).

Se reagrupan las fracciones totalmente inmunorreactivas con el anticuerpo anti- hsp70 y se precipitan los complejos hsp70-péptido con sulfato de amonio; específicamente con un corte de sulfato de amonio del 50%-70%. Entonces se cosecha el precipitado obtenido por centrifugación a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) y se lava con sulfato de amonio al 70%. Entonces se solubiliza el precipitado lavado y se elimina cualquier resto de sulfato de amonio por filtración en gel en una columna de Sephadex^{R} G25 (Pharmacia). Si fuera necesario, se puede volver a purificar el preparado de hsp70 así obtenido por la columna de FPCL Mono Q como se describe arriba.

El complejo hsp70-péptido puede ser purificado hasta conseguir una homogeneidad aparente utilizando este método. Generalmente se puede purificar 1 mg del complejo hsp70-péptido de 1g de células/tejido.

La presente invención describe también un método nuevo y rápido para la purificación de complejos de hsp70-péptido. Este método mejorado comprende poner en contacto proteínas celulares con ADP o un análogo no hidrolízable de ATP fijado a un sustrato sólido, de modo que la hsp70 en el lisado pueda unirse al ADP o al análogo no hidrolizable de ATP, y eluir la hsp70 ligada. Un método preferido utiliza la cromatografía de columna con ADP fijado a un substrato sólido (por ejemplo, ADP-agarosa). Los preparados de hsp70 obtenidos tienen una mayor pureza y están desprovistos de péptidos contaminantes. Los rendimientos de hsp70 también aumentan apreciablemente en aproximadamente más de 10 veces. Alternativamente se puede usar la cromatografía con un análogo no hidrolizable de ATP, en vez de ADP, para la purificación de complejos de hsp70-péptido. A modo de ejemplo pero no de limitación, se realizó la purificación de complejos de hsp70-péptido por cromatografía de ADP-agarosa como se describe en la Sección del
Ejemplo 9.

5.2.2. Preparación y Purificación de Complejos Hsp 90-péptido

Un procedimiento que puede ser utilizado, presentado a modo de ejemplo pero no como limitación, es como sigue:

En primer lugar se suspenden las células tumorales en 3 volúmenes de tampón de lisis 1X consistente en 5 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7), 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl_{2}, 2 mM de MgCl_{2} y 1 mM de fenilmetilsulfonil-fluoruro (PMSF). Entonces se somete el sedimento a sonicación en hielo, hasta que >99% de las células sean lisadas determinado por examen microscópico. Como una alternativa a la sonicación, las células pueden ser lisadas por cizallamiento mecánico y en este procedimiento las células son resuspendidas típicamente en 30 mM de bicarbonato de sodio a pH 7,5, 1 mM de PMSF, incubadas en hielo durante 20 minutos y entonces homogeneizadas en un homogeneizador Dounce hasta que >95% de las células sean lisadas.

Entonces se centrifuga el lisado a 1.000 g durante 10 minutos para eliminar las células intactas, los núcleos y otros restos celulares. El sobrenadante obtenido es recentrifugado a 100.000 g durante 90 minutos, el sobrenadante es cosechado y entonces mezclado con Con A Sepharose equilibrado con PBS conteniendo 2 mM de Ca^{2+} y 2 mM de Mg^{2+}. Cuando las células son lisadas por cizallamiento mecánico el sobrenadante es diluido con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de mezclar con Con A Sepharose. Entonces se deja unir el sobrenadante a la Con A Sepharose durante 2-3 horas a 4ºC. Se cosecha el material que no ha conseguido unirse y se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) con 10 mM de Tris-Acetato, pH 7,5, 0,1 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, 1 mM de PMSF. Entonces se centrifuga el dializado a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 20 minutos. Luego se cosecha el sobrenadante obtenido y se aplica a una columna de FPLC Mono Q equilibrada con tampón de lisis. Las proteínas son entonces eluídas con un gradiente de sal de 200 mM a 600 mM de NaCl.

Las fracciones eluídas son fraccionadas por SDS-PAGE y las fracciones que contienen los complejos hsp90-péptido identificadas por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-hsp90 como 3G3 (Affinity Bioreagents). Los complejos hsp70-péptido pueden ser purificados hasta conseguir una homogeneidad aparente utilizando este método. Generalmente se puede purificar 150-200 mg del complejo hsp70-péptido de 1g de células/tejido.

5.2.3. Preparación y Purificación de Complejos gp96-péptido

Un procedimiento que puede ser utilizado, presentado a modo de ejemplo pero no como limitación, es el siguiente:

Se resuspende un granulado de tumores en 3 volúmenes de tampón consistente en 30 mM de bicarbonato de sodio (pH 7,5) y 1 mM de PMSF y se dejan hinchar las células en hielo 20 minutos. Entonces se homogeneiza el granulado de células en un homogeneizador Dounce (la tolerancia apropiada del homogeneizador variará según cada tipo de célula) en hielo hasta que >95% de células sean lisadas.

Entonces se centrifuga el lisado a 1.000 g durante 10 minutos para eliminar las células intactas, los núcleos y otros restos. Se centrifuga de nuevo el sobrenadante de esta fase a 100.000 g durante 90 minutos. El complejo gp96-péptido puede ser purificado o del sedimento centrifugado a 100.000 g o del sobrenadante.

Cuando se purifica del sobrenadante, se diluye el sobrenadante con un volumen igual de tampón de lisis 2X y se mezcla el sobrenadante durante 2-3 horas a 4ºC con Con A Sepharose equilibrado con PBS conteniendo 2 mM de Ca^{2+}y 2 mM de Mg^{2+}. Entonces, se compacta la pasta en una columna y se lava con tampón de lisis 1X hasta que el OD_{280} descienda a los valores de referencia. Luego se lava la columna con 1/3 del volumen del lecho de la columna de \alpha-metilmanósido (\alpha-MM) al 10% disuelto en PBS conteniendo 2 mM de Ca^{2+} y 2 mM de Mg^{2+}, se sella la columna con un pedazo de parafilm y se incuba a 37ºC durante 15 minutos. Entonces se enfría la columna a temperatura ambiente y se quita el parafilm del fondo de la columna. Se aplican cinco volúmenes de la columna del tampón \alpha-MM a la columna y se analiza el producto eluído por SDS-PAGE. Normalmente el material resultante tiene una pureza de aproximadamente el 60-95%, sin embargo esto depende del tipo célula y de la proporción usada de tejido con respecto al tampón de lisis. Entonces se aplica la muestra a una columna de FPLC Mono Q (Pharmacia) equilibrada con un tampón que contiene 5 mM de fosfato de sodio, pH 7. Luego se eluyen las proteínas de la columna con un gradiente de 0-1M de NaCl y la fracción de gp96 se eluye entre 400 mM y 550 mM de NaCl.

El procedimiento puede ser modificado, no obstante, por dos fases adicionales, utilizadas solas o combinadas, para producir consecuentemente complejos de gp96- péptido aparentemente homogéneos. Una fase opcional implica una precipitación con sulfato de amonio antes de la fase de purificación en Con A y la otra fase opcional implica purificación de DEAE-Sepharose después de la fase de purificación en Con A pero antes de la fase de FPLC Mono Q.

En la primera fase opcional, el sobrenadante que se obtiene de la fase de centrifugación a 100.000 g es llevado a una concentración final de sulfato de amonio al 50% por la adición de sulfato de amonio. Se añade lentamente el sulfato de amonio mientras se agita suavemente la solución en un vaso colocado en una bandeja de agua helada. Se agita la solución durante aproximadamente 1/2 a 12 horas a 4ºC y se centrifuga la solución resultante a 6.000 rpm (rotor Sorvall SS34). Se elimina el sobrenadante obtenido en esta fase, se lleva a una saturación de sulfato de amonio al 70% añadiendo una solución de sulfato de amonio y se centrifuga a 6.000 rpm (rotor Sorvall SS34). Se cosecha el sedimento obtenido en esta fase y se suspende en PBS conteniendo sulfato de amonio al 70% para enjuagar el sedimento. Se centrifuga esta mezcla a 6.000 rpm (rotor Sorvall SS34) y se disuelve el sedimento en PBS conteniendo 2 mM de Ca^{2+} y Mg^{2+}. Se elimina el material que no se ha disuelto con un breve centrifugado a 15.000 rpm (rotor Sorvall SS34). Entonces, se mezcla la solución con Con A Sepharose y se continúa el procedimiento como antes.

En la segunda fase opcional, se reagrupan las fracciones conteniendo gp96 eluídas de la columna Con A y se cambia el tampón a 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, 300 mM de NaCl por diálisis, o preferiblemente por cambio de tampón en una columna Sephadex G25. Después de cambiar el tampón, se mezcla la solución con DEAE-Sepharose previamente equilibrada con 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, 300 mM de NaCl. La solución de proteína y las perlas son mezcladas suavemente durante 1 hora y vertidas en una columna. Entonces, se lava la columna con 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, 300 mM de NaCl, hasta que la absorbencia a 280 nM descienda a los valores de referencia. Entonces se eluye la proteína ligada de la columna con cinco volúmenes de 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, 700 mM de NaCl. Se reagrupan las fracciones conteniendo la proteína y se diluyen con 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7, para bajar la concentración de sal a 175 mM. Ahora se aplica el material obtenido a la columna de FPLC Mono Q (Pharmacia) equilibrada con 5 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7 y se eluye la proteína ligada a la columna de FPLC Mono Q (Pharmacia) como se ha descrito antes.

Se apreciará, sin embargo, que un experto en la materia puede valorar, por experimentación rutinaria, el beneficio de incorporar la segunda fase opcional en el protocolo de purificación. Además, se apreciará también que el beneficio de añadir cada una de las fases opcionales dependerá de la fuente del material inicial.

Cuando se aísla la fracción con gp96 del sedimento centrifugado a 100.000 g, se suspende el sedimento en 5 volúmenes de PBS conteniendo deoxicolato de sodio al 1% o glucopiranósido de oxtilo al 1% (pero sin el Mg^{2+} ni el Ca^{2+}) y se incuba en hielo durante 1 hora. Se centrifuga la suspensión a 20.000 g durante 30 minutos y se dializa el sobrenadante obtenido contra varios cambios de PBS (también sin el Mg^{2+} ni el Ca^{2+}) para quitar el detergente. Se centrifuga el dializado a 100.000 g durante 90 minutos, se cosecha el sobrenadante y se añaden el calcio y el magnesio al sobrenadante para dar concentraciones finales de 2 mM, respectivamente. Entonces se purifica la muestra ya sea por el método modificado o no modificado para aislar el complejo gp96-péptido del sobrenadante obtenido a 100.000 g, véase arriba. Los complejos gp96-péptido pueden ser purificados hasta conseguir una homogeneidad aparente utilizando este procedimiento. Se pueden aislar unos 10-20 mg de gp96 de 1 g de células/tejido.

Enfermedad Infecciosa

En una forma de realización alternativa en la que se desea tratar un paciente que tiene una enfermedad infecciosa se usan los métodos descritos arriba en las Secciones 5.2.1 - 5.2.3 para aislar los complejos de hsp-péptido de células infectadas con un organismo infeccioso, por ejemplo, de una línea de células o de un paciente. Tales organismos infecciosos incluyen pero no se limitan a, viruses, bacterias, protozoos, hongos y parásitos como los que se describen con todo detalle en la Sección 5.2.4 abajo.

5.2.4. Aislamiento de Componentes Antigénicos/Inmunogénicos

Se ha descubierto que los péptidos y/o componentes antigénicos pueden ser eluídos de hsp-complejos ya sea en presencia de ATP o pH bajo. Estas condiciones experimentales pueden ser utilizadas para aislar péptidos y/o componentes antigénicos de células que pueden contener determinantes antigénicos potencialmente útiles. Una vez aislada, se puede determinar la secuencia de aminoácidos de cada péptido antigénico utilizando metodologías convencionales de secuenciación de aminoácidos. Tales moléculas antigénicas entonces pueden ser producidas por métodos de síntesis química o recombinante, purificadas y formar complejos con las hsp in vitro.

Asimismo se ha descubierto que los péptidos potencialmente inmunogénicos pueden ser eluídos de los complejos de MHC-péptido utilizando técnicas bien conocidas en la técnica (Falk, K. et al., 1990 Nature 348:248-251; Elliott, T., et al., 1990, Nature 348: 195-197; Falk, K., et al., 1991, Nature 351:290-296).

Así, los péptidos potencialmente inmunogénicos o antigénicos pueden ser aislados bien de los complejos de proteínas de estrés-péptidos endógenos o complejos de MHC-péptidos endógenos para el uso posterior como moléculas antigénicas, formando complejos in vitro con las hsp. Los protocolos ejemplares para aislar péptidos y/o componentes antigénicos de cualquiera de estos complejos están expuestos abajo en las Secciones 5.2.4.1 y 5.2.4.2.

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5.2.4.1 Péptidos De Complejos de Proteína de Estrés-Péptido

Se pueden utilizar dos métodos para eluir el péptido de un complejo de proteína de estrés-péptido. Un proceso implica incubar el complejo de proteína de estrés-péptido en presencia de ATP. El otro proceso implica incubar los complejos en un tampón a pH bajo.

Concretamente, se centrifuga el complejo de interés a través de un sistema Centricon 10 (Millipore) para quitar cualquier material de bajo peso molecular débilmente asociado al complejo. La fracción de alto peso molecular puede ser quitada y analizada por SDS-PAGE mientras la de bajo peso molecular ser analizada por HPLC como se describe abajo. En el protocolo de incubación con ATP, el complejo de proteína de estrés-péptido en la fracción de alto peso molecular se incuba con 10 mM de ATP durante 30 minutos a temperatura ambiente. En el protocolo de bajo pH, se añade ácido acético o ácido trifluoroacético al complejo de proteína de estrés-péptido para dar una concentración final del 10% (vol/vol) y se incuba la mezcla a temperatura ambiente o en un baño de agua hirviendo o cualquier temperatura intermedia, durante 10 minutos (Véase, Van Bleek, et al., 1990, Nature 348: 213-216; y Li, et al., 1993, EMBO Journal 12:3143-3151).

Se centrifugan las muestras resultantes mediante un sistema Centricon 10 como se ha mencionado anteriormente. Se recuperan las fracciones de alto y bajo peso molecular. El resto de complejos de proteína de estrés-péptido de alto peso molecular se puede volver a incubar con ATP o pH bajo para quitar cualquier péptido restante.

Las fracciones de menor peso molecular obtenidas son reagrupadas, concentradas por evaporación y disueltas en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Entonces se fracciona el material disuelto por cromatografía líquida de alta presión y fase inversa (HPLC) T utilizando por ejemplo una columna de fase inversa VYDAC CIB equilibrada con TFA al 0,1%. Entonces se eluye el material unido a una velocidad de flujo de aproximadamente 0,8 ml/min desarrollando la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo entre el 0 y el 80% en TFA al 0,1%. Se puede vigilar la elución de los péptidos por OD_{210} y recoger las fracciones conteniendo los péptidos.

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5.2.4.2 Péptidos de Complejos de MHC-péptido

El aislamiento de péptidos potencialmente inmunogénicos de moléculas MHC es muy conocido en la técnica y por eso no se describe aquí con detalle (Véase, Falk, et al., 1990, Nature 348:248-251; Rotzsche, et al., 1990, Nature 348:252-254; Elliott, et al., 1990, Nature 348:191-197; Falk, et al., 1991, Nature 351:290-296; Demotz, et al., 1989, Nature 343: 682-684; Rotzsche, et al., 1990, Science 249:283-287).

Concretamente, se pueden aislar los complejos de MHC-péptido por un procedimiento convencional de inmunoafinidad. Entonces se pueden eluir los péptidos del complejo de MHC-péptido incubando los complejos en presencia de TFA a aproximadamente el 0,1% en acetonitrilo. Los péptidos eluídos pueden ser fraccionados y purificados por HPLC de fase inversa, como antes.

Se pueden determinar las secuencias de aminoácidos de los péptidos eluídos usando técnicas de secuenciación de aminoácidos manuales o automatizadas bien conocidas en la técnica. Una vez que se ha determinado la secuencia de aminoácidos de un péptido potencialmente protector se puede sintetizar el péptido en cualquier cantidad deseada usando síntesis de péptidos convencional u otros protocolos bien conocido en la técnica.

Los péptidos que tengan la misma secuencia de aminoácidos que aquellos aislados antes pueden ser sintetizados por síntesis de péptidos en fase sólida usando procedimientos similares a los descritos por Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149. Durante la síntesis, se añaden gradualmente aminoácidos N-\alpha protegidos con cadenas laterales protegidas a una cadena creciente de polipéptidos unida por su C-terminal y a un soporte polimérico insoluble, es decir, perlas de poliestireno. Los péptidos son sintetizados uniendo un grupo amino de un aminoácido N-\alpha desprotegido a un grupo \alpha-carboxi de un aminoácido N-\alpha protegido que ha sido activado haciéndolo reaccionar con un reactivo como diciclohexilcarbodiimida. La fijación de un grupo amino libre al carboxilo activado conduce a la formación de un enlace peptídico. Los grupos N-\alpha protectores más comúnmente utilizados incluyen Boc que es lábil en un medio ácido y Fmoc que es lábil en un medio base.

Concretamente, el aminoácido N-\alpha protegido en el C-terminal se fija primero a las perlas de poliestireno. Entonces se quita el grupo N-\alpha protector. El grupo \alpha-amino desprotegido es acoplado al grupo \alpha-carboxilato activado del siguiente aminoácido N-\alpha protegido. El proceso se repite hasta que el péptido deseado sea sintetizado. Los péptidos resultantes entonces son escindidos del soporte de polímero insoluble y las cadenas laterales de aminoácidos desprotegidas. Se pueden obtener péptidos más largos por condensación de fragmentos de péptido protegidos. Los datos sobre sustancias químicas, resinas, grupos protectores, aminoácidos protegidos y reactivos apropiados son muy conocidos en la técnica por lo que no se explicarán aquí con más detalle (Véase, Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, y Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2ª Ed., Springer-Verlag).

La purificación de los péptidos resultantes se realiza utilizando procedimientos convencionales, tales como HPLC preparadora usando cromatografía de permeación en gel, partición y/o intercambio iónico. La elección de matrices y tampones apropiados son muy conocidas en la técnica y por eso no se describen aquí con más detalle.

5.2.5 Moléculas Antigénicas Exógenas

Se pueden seleccionar antígenos o porciones antigénicas de los mismos para usarlos como moléculas antigénicas, para formar complejos con las hsp, de entre aquellos que se conocen en la técnica o se determina por inmunoensayo que son capaces de unirse al anticuerpo o moléculas MHC (antigenicidad) o generar una respuesta inmune (inmunogenicidad). Para determinar la inmunogenicidad o antigenicidad detectando uniones al anticuerpo, se pueden utilizar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo con un inmunoabsorbente ligado a una enzima), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in vivo (utilizando marcas de oro coloidal, enzima o radioisótopo), por ejemplo), inmunotransferencia Western, reacciones de inmunoprecipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación complementaria, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos con proteína A y ensayos de inmunoelectrofóresis, etc. En una forma de realización, se detecta la unión del anticuerpo detectando una marca en el anticuerpo primario. En otra forma de realización, se detecta el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo secundario o el reactivo al anticuerpo primario. En otra forma de realización se marca el anticuerpo. En la técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo y su uso está contemplado. En una forma de realización para detectar la inmunogenicidad, se pueden ensayar respuestas mediadas por células T por métodos estándares, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad in vitro o ensayos de hipersensibilidad de tipo retardado in vivo.

Los antígenos potencialmente útiles o derivados de los mismos para usarlos como moléculas antigénicas también pueden ser identificados por varios criterios, como la participación del antígeno en la neutralización de la patogenicidad de un patógeno (cuando se desee tratar o prevenir la infección por tal patógeno) (Norrby, 1985, summary, en Vaccines 85, Lerner, et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, págs. 388-389), la especificidad del tipo o grupo, el reconocimiento por los antisueros o células inmunes de los pacientes y/o la demostración de efectos protectores de antisueros o células inmunes específicos para el antígeno. Además, cuando se desee tratar o prevenir una enfermedad causada por un patógeno, el epítopo codificado del antígeno debe mostrar preferiblemente un pequeño o ningún grado de variación antigénica en el tiempo o entre diferentes aislados del mismo patógeno.

Preferiblemente, cuando se desea tratar o prevenir cáncer, se usan antígenos conocidos específicos del tumor o fragmentos o derivados de los mismos. Por ejemplo, tales antígenos específicos del tumor o asociados al tumor incluyen pero no se limitan a antígeno pan-carcinoma KS 1/4 (Perez y Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415); antígeno del carcinoma ovárico (CA125) (Yu, et al., 1991, Cancer Res. 51(2):468-475); fosfatasa ácida prostética (Tailer, et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); antígeno específico de la próstata (Henttu y Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeli, et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230); antígeno p97 asociado al melanoma (Estin, et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81 (6):445-446); antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardahl, et al., 1990, J. Etfp. Med. 171 (4): 1375-1380); antígeno de melanoma de alto peso molecular (Natali, et al., 1987, Cancer 59:55-63) y antígeno de membrana específico de la próstata.

En una forma de realización específica se selecciona un antígeno o el fragmento o el derivado del mismo específico a un cierto tumor para formar complejo con la hsp y la posterior administración a un paciente que tiene ese tumor.

Preferiblemente, cuando se desea tratar o prevenir enfermedades víricas, se usan epítopos comprendiendo moléculas de viruses conocidos. Por ejemplo, tales epítopos antigénicos pueden ser preparados de viruses incluyendo, pero sin limitarse a, hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (VHS-I), herpes simplex tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavírus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubéola, virus de polio, virus de inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I) y virus de inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II).

Preferiblemente, cuando se desea tratar o prevenir infecciones bacterianas, se usan epítopos comprendiendo moléculas de bacterias conocidas. Por ejemplo, tales epítopos antigénicos pueden ser preparados de bacterias incluyendo, pero sin limitarse a, mycobacteria rickettsia, mícoplasma, neisseria y legionella.

Preferiblemente, cuando se desea tratar o prevenir infecciones protozoicas, se usan epítopos comprendiendo moléculas de protozoos conocidos. Por ejemplo, tales epítopos antigénicos pueden ser preparados de protozoos incluyendo, pero sin limitarse a, leishmania, kokzidioa y trypanosoma.

Preferiblemente, cuando se desea tratar o prevenir infecciones parasitarias, se usan epítopos comprendiendo moléculas de parásitos conocidos. Por ejemplo, tales epítopos antigénicos pueden ser preparados de parásitos incluyendo, pero sin limitarse a, chlamydia y rickettsia.

5.2.6 Producción in vitro de Complejos de Proteína de Estrés-Molécula Antigénica

En una forma de realización en la que no se emplean complejos de hsp y los péptidos con los que son asociadas endógenamente in vivo, se producen los complejos de hsp asociadas a moléculas antigénicas in vitro. Como apreciarán los expertos en la materia, los péptidos, ya sean aislados por los procedimientos mencionados arriba o sintetizados químicamente o producidos por recombinación, pueden ser reconstituidos con una variedad de proteínas de estrés naturalmente purificadas o recombinantes in vitro para generar complejos de proteínas de estrés-moléculas antigénicas inmunogénicos no covalentes. Alternativamente, se pueden hacer complejos con antígenos exógenos o fragmentos antigénicos/inmunogénicos o derivados de los mismos en forma no covalente a proteínas de estrés para usarlos en las vacunas inmunoterapéuticas o profilácticas de la invención. Abajo se explica un protocolo preferido y ejemplar para hacer complejos con una proteína de estrés unida en forma no covalente y una molécula antigénica in vitro.

Antes de formar el complejo, las hsp son previamente tratadas con ATP o pH bajo para eliminar cualquier péptido que pueda asociarse a la hsp de interés. Cuando se usa el procedimiento con ATP, se elimina el exceso de ATP del preparado por la adición de apiranasa como ha descrito Levy, et al., 1991, cell 67:265-274. Cuando se usa el procedimiento a pH bajo, el tampón es ajustado de nuevo a pH neutro añadiendo reactivos que modifiquen el pH.

Se mezclan las moléculas antigénicas (1 mg) y la hsp previamente tratadas (9 mg) para dar una relación de aproximadamente 5 moléculas antigénicas: 1 proteína de estrés. Entonces, se incuba la mezcla durante 15 minutos a 3 horas a de 4o a 45ºC en un tampón de unión conveniente como uno que contenga 20 mM de fosfato de sodio, pH 7,2, 350 mM de NaCl, 3 mM de MgCl_{2} y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Se centrifugan los preparados con un sistema Centricon 10 (Millipore) para quitar cualquier péptido que no se haya unido. Puede probarse la asociación de los péptidos a las proteínas de estrés mediante un ensayo SDS-PAGE. Este es el método preferido para formar complejos in vitro de péptidos aislados de complejos de MHC-péptidos de péptidos disociados de complejos endógenos de hsp-péptido.

En una forma de realización alternativa de la invención preferida para producir los complejos de hsp70 asociadas a moléculas antigénicas exógenas tales como proteínas, se incuban 5-10 microgramos de hsp purificada con cantidades equimolares de la molécula antigénica en 20 mM de un tampón de fosfato de sodio, pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 3 mM de MgCl_{2} y 1 mM de ADP en un volumen de 100 microlitros a 37ºC durante 1 hora. Esta mezcla de incubación es diluida aún más a 1 ml en el tampón de fosfato salino.

En una forma de realización alternativa relacionada con la invención, preferida para producir los complejos de gp96 o hsp90 con péptidos, se incuban 5-10 microgramos de gp96 o hsp90 purificada con cantidades equimolares o cantidades excedentes del péptido antigénico en un tampón conveniente como uno que contenga 20 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 3 mM de MgCl_{2} a 60-65ºC durante 5-20 min. Se deja enfriar esta mezcla de incubación a temperatura ambiente y se centrifuga una o más veces si fuera necesario, con un sistema Centricon 10 (Millipore) para quitar cualquier péptido que no se haya unido.

Tras la formación de los complejos, se pueden probar los complejos inmunogénicos de proteína de estrés-molécula antigénica opcionalmente mediante un ensayo in vitro usando por ejemplo el ensayo de células diana mezcladas con linfocitos (MLTC) descrito abajo. Una vez que los complejos inmunogénicos han sido aislados pueden ser ulteriormente caracterizados opcionalmente en modelos animales usando los protocolos de administración preferidos y los excipientes explicados abajo.

5.2.7 Determinación de la Inmunogenicidad de los Complejos de Proteína de Estrés-Péptido

Se puede probar mediante ensayo la inmunogenicidad de los complejos purificados de proteína de estrés-molécula antigénica usando el ensayo de cultivo de células diana mezcladas con linfocitos (MLTC) muy conocido en la técnica.

A modo de ejemplo pero no de limitación, se puede utilizar el siguiente procedimiento. Concretamente, se inyecta subcutáneamente a ratones los complejos de proteína de estrés-molécula antigénica candidatos. Se inyecta a otros ratones bien con otros complejos de proteína de estrés y péptido o con células infectadas completas que actúan como controles positivos para el ensayo. Se inyecta dos veces a los ratones, 7-10 días de diferencia. Diez días después de la última inmunización, se quitan los bazos y se liberan los linfocitos. Los linfocitos liberados pueden volver a ser estimados posteriormente in vitro añadiendo células muertas que expresaron el complejo de interés.

Por ejemplo, se pueden estimular 8x10^{6} células inmunes de bazo con 4x10^{4} células infectadas (o células transfectadas con un gen apropiado, según sea el caso) irradiadas con rayos gamma (5-10.000 rads) o tratadas con C mitomicina en 3 ml de medio RPMI conteniendo suero fetal bovino al 10%. En algunos casos se puede incluir un 33% de sobrenadante de cultivo de linfocitos mezclados secundario en el caldo de cultivo como una fuente de factores de crecimiento de células T (Véase, Glasebrook, et al., 1980, J. Exp. Med. 151:876). Para probar la respuesta citotóxica primaria de las células T después de la inmunización, se pueden cultivar células de bazo sin estimulación. En algunos experimentos también se pueden reestimular las células del bazo de los ratones inmunizados con células antigénicamente diferenciadas, para determinar la especificidad de la respuesta citotóxica de las células T.

Seis días después se prueba la citotoxicidad de los cultivos en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas (Véase, Palladino, et al., 1987, Cancer Res. 47:5074-5079 y Blachere, et al., 1993, J. Immunotherapy 14:352-356). En este ensayo, se añade el cultivo de linfocitos mezclados a una suspensión de células diana para dar diferentes relaciones efector:diana (E:T) (generalmente 1:1 a 40:1). Las células diana son previamente marcadas incubando 1x10^{6} células diana en un caldo de cultivo conteniendo 200 mCi ^{51}Cr/MI durante una hora a 37ºC. Las células son lavadas tres veces después del marcado. Cada punto del ensayo (relación E:T) se realiza por triplicado y se incorporan los controles apropiados para medir la liberación de ^{51}Cr espontánea (sin añadir linfocitos al ensayo) y liberación del 100% (células lisadas con detergente). Después de incubar las mezclas de células durante 4 horas, las células son granuladas por centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Se mide la cantidad de ^{51}Cr liberado en el sobrenadante por un contador gamma. Se mide el porcentaje de citotoxicidad como cpm en la muestra de prueba menos cpm espontáneamente liberado dividido por el cpm liberado de detergente total menos cpm espontáneamente liberado.

Para bloquear la cascada de MHC clase I se añade un sobrenadante concentrado de hibridoma derivado de células de hibridoma K-44 (un hibridoma anti-MHC de clase I) a las muestras de prueba a una concentración final del 12,5%.

5.3. Formulación

Los complejos de hsp-molécula antigénica de la invención pueden ser formulados en preparados farmacéuticos para la administración a mamíferos para el tratamiento o la prevención de cáncer o enfermedades infecciosas. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulada en un soporte farmacéutico compatible pueden ser preparadas, envasadas y marcadas para el tratamiento del tumor indicado, como sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cístadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma del conducto bilial, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma vesicular, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependímoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroide); leucemia crónica (leucemia crónica mieloítica (granulocítica) y leucemia crónica linfocítica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström y la enfermedad de las cadenas pesadas. Alternativamente, pueden ser marcados para el tratamiento de la enfermedad infecciosa apropiada. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas para el tratamiento de enfermedades infecciosas apropiadas.

Si el complejo es hidrosoluble, entonces puede formularse en un tampón apropiado, por ejemplo, tampón de fosfato salino u otras soluciones fisiológicamente compatibles. Alternativamente, si el complejo resultante tiene poca solubilidad en solventes acuosos, entonces puede formularse con un surfactante no iónico como Tween, o polietilenogiicol. Así, los compuestos y su solvatos fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para la administración por inhalación o insuflado (o por la boca o la nariz) o administración oral, bucal, parenteral y rectal o, en el caso de tumores, inyectado directamente en un tumor sólido.

Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o puede ser presentado como un medicamento para la reconstitución con agua u otro vehículo conveniente antes del uso. Tales preparados líquidos pueden ser preparados por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (Por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinil pirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de hidrógeno de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Las tabletas pueden ser revestidas por métodos muy conocidos en la técnica.

Los preparados para la administración oral pueden ser formulados convenientemente para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de la manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos para el uso según la presente invención son liberados convenientemente en forma de una presentación en espray de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor conveniente, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas conveniente. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para el uso en un inhalador o insuflador pueden ser formuladas conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo conveniente como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden ser formulados para la administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de bolo alimenticio o infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden ser presentadas en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo conveniente, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes del uso.

Los compuestos también pueden ser formulados en composiciones rectales como supositorios, enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases convencionales para supositorios como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden ser formulados como un preparado de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos convenientes (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos muy conocidos de vehículos o soportes de administración para fármacos hidrófilos.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosis unitarias conteniendo el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una hoja de metal o plástico, como un blíster. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración.

La invención también se refiere a kits para llevar a cabo los regímenes terapéuticos. Tales kits comprenden, en uno o más recipientes, cantidades terapéutica o profilácticamente efectivas de los complejos de hsp-molécula antigénica en forma farmacéuticamente aceptable. El complejo de hsp-molécula antigénica en un vial de un kit de la invención puede estar en forma de una solución farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, en combinación con una solución salina estéril, solución de dextrosa, o solución tamponada, u otro líquido estéril farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, el complejo puede ser liofilizado o puede ser deshidratado; en este caso, el kit opcionalmente comprende también en un recipiente una solución farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina, solución de dextrosa, etc.), preferiblemente estéril, para reconstituir el complejo para formar una solución para la inyección.

En otra forma de realización de acuerdo con la invención, un kit de la invención comprende también una aguja o la jeringa, preferiblemente envasadas de forma estéril, para inyectar el complejo, y/o una toallita con alcohol envasada. Opcionalmente se incluyen instrucciones para la administración de los complejos de hsp-molécula antigénica por parte de un médico o por el paciente.

5.4 Enfermedades Infecciosas Objetivo

Las enfermedades infecciosas que pueden ser tratadas o pueden ser prevenidas por los métodos según la presente invención son causadas por agentes infecciosos incluyendo, pero sin limitarse a, virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos.

Las enfermedades víricas que pueden ser tratadas o pueden ser prevenidas por los métodos según la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, aquellas causadas por hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (VHS-I) herpes simplex tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus coxsackie, virus de paperas, virus de sarampión, virus de rubéola, virus de la polio, virus de inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I) y virus de inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II).

Las enfermedades bacterianas que pueden ser tratadas o pueden ser prevenidas por los métodos según la presente invención son causadas por bacterias incluyendo, pero sin limitarse a, microbacteria rickettsia, micoplasma, neisseria y legionela.

Las enfermedades protozoicas que pueden ser tratadas o pueden ser prevenidas por los métodos según la presente invención son causadas por protozoos incluyendo, pero sin limitarse a, leishmania, lolzidioa y tripanosoma.

Las enfermedades parasitarias que pueden ser tratadas o pueden ser prevenidas por los métodos según la presente invención son causadas por parásitos incluyendo, pero sin limitarse a, chlamydia y rickettsia.

5.5. Cánceres Objetivo

Los cánceres que pueden ser tratados o pueden ser prevenidos por los métodos según la presente invención incluyen, pero sin limitarse a sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcona, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma del conducto bilial, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma vesicular, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meníngioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (leucemia mieloblástica, promíelocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroide); leucemia crónica (leucemia crónica mieloítica (granulocítica) y leucemia crónica linfocítica); y polícitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström y la enfermedad de las cadenas pesadas. Los ejemplos específicos de tales cánceres están descritos en las secciones abajo.

En una forma de realización específica el cáncer es metastásico. En otra forma de realización específica, el paciente que tiene un cáncer está inmunosuprimido por haber experimentado terapia contra el cáncer (por ejemplo, radiación de quimioterapia) antes de la administración de los complejos de hsp-molécula antigénica de la invención.

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5.5.1. Cáncer Colorrectal Metastásico al Hígado

En 1992, aproximadamente 150.000 norteamericanos fueron diagnosticados de cáncer colorrectal y más de 60.000 murieron como consecuencia de metástasis colorrectales. En el momento de sus muertes, el 80 por ciento de los pacientes con cáncer colorrectal tenían una enfermedad metastásica que afectaba al hígado, y la mitad de esos pacientes no tenían evidencias de otras metástasis (extrahepáticas). La mayoría de los tumores metastásicos del hígado provienen de tumores primarios gastrointestinales. Desafortunadamente, la historia natural de las lesiones metastásicas del hígado conlleva un pronóstico grave y los regímenes sistémicos con quimioterapia han sido incapaces de inducir índices significativos de respuesta o alterar la duración de supervivencia (Drebin, J.A., et al., en Current Therapy In Oncology, ed. J.E. Niederhuber, B.C. Decker, Mosby, 1993, p.426).

El cáncer colorrectal se extiende inicialmente a los ganglios linfáticos regionales y luego por la circulación venosa portal al hígado, que representa el sitio visceral más común de la metástasis. Los síntomas que llevan a los pacientes con cáncer colorrectal a buscar cuidados médicos varían con la localización anatómica de la lesión. Por ejemplo, las lesiones en el colon ascendente suelen ulcerarse, lo que conlleva una pérdida crónica de sangre en las heces.

La resección radical ofrece el mayor potencial para la curación en pacientes con cáncer colorrectal invasivo. Antes de la cirugía, se determina la titulación del antígeno carcinoembrionario (CEA). La radioterapia y la quimioterapia son utilizadas en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. Los resultados con agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-fluorouracilo) son diversos y menos del 25 por ciento de los pacientes experimentan una reducción superior al 50 por ciento en la masa del tumor (Richards, 2d., F., et Al., 1986, J. Clin. Oncol. 4:565).

Los pacientes con metástasis muy diseminadas tienen su supervivencia muy limitada y la quimioterapia sistémica tiene poco impacto en este grupo de pacientes. Además, la quimioterapia sistémicamente administrada suele estar limitada por la gravedad de las toxicidades asociadas con los distintos agentes, como diarrea severa, mucositis y/o mielosupresión. Se han explorado otras técnicas, inclusive la radiación hepática, quimioterapia sistémica, ligadura arterial hepática, embolización del tumor e inmunoterapia pero la mayoría han demostrado ser ineficaces en prolongar la supervivencia del paciente.

En una forma de realización específica, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para aumentar la inmunidad específica al tumor en individuos que padecen de cáncer colorrectal extendido con metástasis hepática, para inhibir la progresión de la enfermedad neoplásica. Los métodos preferidos para tratar estas enfermedades neoplásicas comprenden administrar una composición de complejos de hsp autólogas unidas en forma no covalente al péptido, que provoca una inmunidad específica del tumor contra las células tumorales. Más específicamente, el uso de una composición de la invención, comprendiendo gp96, puede tener como resultado la inhibición casi completa del crecimiento del cáncer de hígado en enfermos de cáncer, sin inducir toxicidad y proporcionar así un efecto terapéutico dramático.

Por consiguiente, como un ejemplo del método según la invención, se administra gp96 a un paciente diagnosticado de cáncer colorrectal, con o sin metástasis hepática, a través de una de las muchas vías diferentes de administración, las vías preferidas siendo la subcutánea en sitios anatómicos diferentes, por ejemplo, el brazo izquierdo, el brazo derecho, el vientre izquierdo, el vientre derecho, el muslo izquierdo, el muslo derecho, etc. Estas vías de administración son utilizadas en secuencia cambiando el sitio de inyección para cada inyección semanal como se ha descrito en la Sección 7. Los preparados y el uso de composiciones terapéuticamente efectivas para la prevención y el tratamiento de cánceres primarios y metastásicos están descritos con todo detalle en las secciones que siguen y a modo de ejemplo,
abajo.

5.5.2. Carcinoma Hepatocelular

El carcinoma hepatocelular es generalmente una enfermedad de las personas mayores en Estados Unidos. Aunque muchos factores puedan desencadenar un carcinoma hepatocelular, la enfermedad se limita generalmente a aquellas personas con una enfermedad hepática preexistente. Aproximadamente entre el 60 y el 80 por ciento de pacientes en Estados Unidos con carcinoma hepatocelular tienen un hígado cirrótico y aproximadamente el cuatro por ciento de los individuos con un hígado cirrótico acaban desarrollando un carcinoma hepatocelular (Niederhuber, J.E., (ed.), 1993, Current Therapy in Oncology, B.C. Decker, Mosby). El riesgo es más alto en pacientes cuya enfermedad hepática es causada por hemocromatosis hereditaria o infección vírica hepática B (Bradbear, R.A., et al., 1985, J. Natl. Cancer Inst. 75:81; Beasley, R.P., et al., 1981, Lancet 2:1129). Otras causas de cirrosis que pueden desencadenar un carcinoma hepatocelular incluyen el abuso de alcohol y fibrosis hepática causada por la administración crónica de metotrexato. Los síntomas más frecuentes del carcinoma hepatocelular son el desarrollo de una masa dolorosa en el cuadrante derecho superior o epigastrio, acompañado de pérdida de peso. En pacientes con cirrosis, el desarrollo de carcinoma hepatocelular es precedido por ascitis, hipertensión portal y empeoramiento clínico relativamente repentino. En la mayoría de los casos se observan valores anormales de aminotransferasa sérica y fosfatasa alcalina en pruebas estándares sobre la función del hígado.

Las tomografías computarizadas del hígado son utilizadas para determinar la distribución anatómica de carcinoma hepatocelular y también proporcionar una orientación para la biopsia con aguja percutánea. Aproximadamente el 70 por ciento de pacientes con carcinoma hepatocelular tiene una concentración elevada de alfa- fetoproteinas en suero (McIntire, K.R., et al., 1975, Cancer Res. 35:991) y su concentración tiene correlación con la extensión de la enfermedad.

La resección radical ofrece la única esperanza de curación en pacientes con carcinoma hepatocelular. Tales procedimientos operativos están asociados con índices de cinco años de supervivencia del 12 al 30 por ciento. El trasplante de hígado puede mejorar la supervivencia de algunos individuos más jóvenes. Sin embargo, la mayoría de los pacientes no son candidatos quirúrgicos debido a que padecen un patrón de tumor multifocal cirrosis extensiva y a la escasez de órganos de donantes compatibles. Los agentes quimioterapéuticos han sido administrados bien por vía intravenosa o por un catéter arterial intrahepático. Tal terapia ha sido combinada a veces con irradiación al hígado. Se han presentado resultados de reducciones mensurables del tamaño de los tumores del 50% o más en algunos pacientes tratados con doxorubicina sistémica o 5-fluorouracil. Sin embargo, la quimioterapia suele inducir inmunosupresión y raramente consigue que el tumor desaparezca completamente y la duración de respuesta es corta. El pronóstico para pacientes con carcinoma hepatocelular está correlacionado negativamente con cirrosis y metástasis a los pulmones o huesos. La supervivencia media de los pacientes es de sólo cuatro a seis meses. En otra forma de realización específica, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para aumentar la inmunidad específica en individuos que padecen de carcinoma hepatocelular para inhibir la progresión de la enfermedad neoplásica y esencialmente irradiar todas las células preneoplásicas y neoplásicas.

5.5.3. Cáncer de mama

Otro aspecto específico de la invención se refiere al tratamiento de cáncer de mama. La Sociedad norteamericana del Cáncer estimó que, en 1992, 180.000 mujeres norteamericanas fueron diagnosticadas de cáncer de mama y 46.000 sucumbieron a la enfermedad (Niederhuber, J.E. ed. Current Therapy in Oncology B.C. Decker, Mosby, 1993). Esto hace que el cáncer de mama sea la segunda causa principal de muerte por cáncer en mujeres, situándose justo detrás del cáncer de pulmón. Un hecho perturbador es la observación de que el cáncer de mama ha ido aumentando a razón del 3 por ciento por año desde 1980 (Niederhuber, J.E., ed. Current Therapy in oncology, B.C. Decker, Mosby, (1993)). El tratamiento de cáncer de mama actualmente implica cirugía, radiación, terapia hormonal y/o quimioterapia. La consideración de dos senos, características del cáncer, receptores hormonales y extensión de la enfermedad, ha regido la manera en que las terapias hormonales y la dosis estándar de quimioterapia son secuenciadas para mejorar la supervivencia y mantener o mejorar la calidad de vida. Se ha utilizado una gran variedad de regímenes con múltiples fármacos como terapia adyuvante en pacientes con cáncer de mama, incluyendo, pero sin limitarse a combinaciones de 2 ciclofosfamida, doxorubicina, metotrexato de vincrístina, 5-fluorouracilo y/o leucovorína. En una forma de realización específica, la presente invención se refiere a composiciones de hsp y métodos para aumentar la inmunidad específica a células mamarias preneoplásicas y neoplásicas en mujeres. La presente invención también se refiere a composiciones y métodos para prevenir el desarrollo de células neoplásicas en mujeres con mayor riesgo de padecer cáncer de mama y para inhibir la proliferación de células cancerosas y la metástasis. Estas composiciones pueden ser aplicadas solas o combinadas entre sí o con modificadores de la respuesta biológica.

5.6. Forma de Realización Autóloga

La inmunogenicidad específica de las hsp deriva no de las hsp per se, sino de los péptidos unidos a ellas. En una forma de realización preferida de la invención dirigida al uso de complejos autólogos de hsp-péptidos como vacunas contra el cáncer se superan dos de los obstáculos más insalvables en la inmunoterapia contra el cáncer. Primero está la posibilidad de que los cánceres humanos, como los cánceres de animales experimentales, sean antigénicamente distintos. En una forma de realización según la presente invención, los péptidos antigénicos con hsp chaperonas provienen de las células cancerosas y salvan este obstáculo. Segundo, la mayoría de los procesos actuales para la inmunoterapia del cáncer se centra en determinar los epítopos reconocidos por CTL de líneas de células cancerosas. Este proceso requiere la disponibilidad de líneas de células y CTL contra los cánceres. Estos reactivos no se encuentran disponibles para una proporción abrumadora de cánceres humanos. En una forma de realización de la presente invención dirigida a complejos autólogos de hsp y péptidos, la inmunoterapia contra el cáncer no depende de la disponibilidad de las líneas de célula ni de CTL ni requiere la definición de los epítopos antigénicos de células cancerosas. Estas ventajas hacen de los complejos autólogos de hsp unidas en forma no covalente al péptido inmunogenes atractivos y novedosos contra el cáncer.

5.7. Prevención y Tratamiento de Enfermedades Neoplásicas Primarias y Metastásicas

Hay muchas razones por las que se desea una inmunoterapia como la que provee la presente invención para usarla en enfermos de cáncer. Primero, si los enfermos de cáncer son inmunosuprimidos y la cirugía, con anestesia, y posterior quimioterapia, pueden empeorar la inmunosupresión, puede prevenirse o invertirse esta inmunosupresión con inmunoterapia apropiada en el período preoperativo. Esto podría conllevar menos complicaciones infecciosas y una curación más rápida de la herida. Segundo, la masa tumoral es mínima tras la cirugía y es más probable que la inmunoterapia sea efectiva en esta situación. Una tercera razón es la posibilidad de que las células tumorales se suelten y migren por la circulación durante la cirugía y la inmunoterapia efectiva aplicada en ese momento pueda eliminar estas células.

Los métodos preventivos y terapéuticos según la invención están dirigidos a aumentar la inmunocompetencia del enfermo de cáncer o antes de la cirugía o después de la cirugía, e inducir la inmunidad específica del tumor a células cancerosas, con el objetivo de que sean una inhibición del cáncer, siendo el objetivo clínico esencial conseguir una regresión y erradicación total del cáncer.

5.8. Vigilancia de los Efectos Durante la Prevención e Inmunoterapia del Cáncer con Complejos de Hsp-Péptido

El efecto de inmunoterapia con complejos de hsp-molécula antigénica en el desarrollo y la progresión de enfermedades neoplásicas puede ser vigilado por cualquier método conocido por un experto en la materia, incluyendo pero sin limitarse a medir: a) la hipersensibilidad retardada como una estimación de la inmunidad celular; b) la actividad de los linfocitos T citolíticos in vitro, c) los niveles de antígenos específicos del tumor, por ejemplo, antígenos carcinoembrionarios (CEA); d) los cambios en la morfología de los tumores utilizando técnicas tales como una tomografía computarizada (CT); y e) los cambios en los niveles de posibles marcadores biológicos de riesgo para un cáncer particular en individuos de alto riesgo, y f) los cambios en la morfología de los tumores usando un sono-
grama.

5.8.1. Prueba Cutánea de Hipersensibilidad Retardada

Las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada son de gran valor en la inmunocompetencia general y la inmunidad celular a un antígeno. La incapacidad de reaccionar a una batería de antígenos comunes en la piel es llamada anergia (Sato, T., et al, 1995, Clin. Immunol. Pathol. 74:35-43).

La técnica apropiada de hacer pruebas cutáneas requiere que los antígenos sean almacenados estériles a 4ºC, protegidos de la luz y reconstituidos poco antes del uso. Una aguja con un calibre de 25 o 27 asegura la administración intradérmica, mejor que subcutánea, del antígeno. Veinticuatro y 48 horas después de la administración intradérmica del antígeno se miden con una regla las dimensiones más grandes de ambos el eritema y la induración. La hipoactividad a algún antígeno o grupo de antígenos dado es confirmada probando con concentraciones más altas de antígeno o, en circunstancias ambiguas, con una prueba de repetición con una prueba intermedia.

5.8.2. Actividad de Linfocitos T Citolíticos In vitro

Se reestimularon 8x10^{6} linfocitos T derivados de sangre periférica y aislados por la técnica de centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque, con 4x10^{4} células tumorales tratadas con mistomicina C en 3 ml de medio RPMI conteniendo suero fetal bovino al 10%. En algunos experimentos se incluye un 33% de sobrenadante del cultivo de linfocitos mezclados secundarios o IL-2 en el caldo de cultivo como fuente de factores de crecimiento de
células T.

Para medir la respuesta primaria de los linfocitos T citolíticos después de la inmunización, las células T son cultivadas sin las células tumorales estimuladoras. En otros experimentos, las células T son reestimuladas con células antigénicamente diferenciadas. Seis días después, se probó la citotoxidad de los cultivos en un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas. La liberación espontánea de ^{51}Cr de los objetivos debería alcanzar un nivel inferior al 20%. Para la actividad antibloqueante del anti-MHC clase I, se añadió un sobrenadante diez veces concentrado de hibridoma W6/32 a la prueba en una concentración final del 12,5% (Heike M., et al., J. Immunotherapy 15:165-174).

5.8.3. Niveles de Antígenos Específicos del Tumor

Aunque puede que no sea posible detectar antígenos únicos a un tumor en todos los tumores, muchos tumores muestran antígenos que los distinguen de células normales. Los reactivos de anticuerpos monoclonales han permitido el aislamiento y la caracterización bioquímica de los antígenos y han sido diagnósticamente inestimables para la distinción de células transformadas de las no transformadas y para la definición del linaje celular de las células transformadas. Los antígenos humanos asociados a tumores mejor caracterizados son los antígenos oncofetales. Estos antígenos son expresados durante la embriogénesis, pero están ausente o son muy difíciles de detectar en el tejido adulto normal. El antígeno prototipo es el antígeno carcinoembionario (CEA), una glicoproteína encontrada en el intestino fetal y células cancerosas de colon humanas pero no en células de colon adultas normales. Como los CEA se sueltan de las células del carcinoma de colon y se encuentran en el suero, se pensó originalmente que la presencia de este antígeno en el suero podría ser utilizada para identificar pacientes con cáncer de colon. Sin embargo, los pacientes con otros tumores, como cáncer pancreático y de mama, también tienen niveles elevados de CEA en suero. Por lo tanto, se ha constatado útil vigilar la subida y bajada de niveles de CEA en enfermos de cáncer sometidos a terapia para predecir la progresión del tumor y las respuestas al tratamiento.

Varios otros antígenos oncofetales han sido útiles para diagnosticar y vigilar los tumores humanos, por ejemplo, la alfafetoproteína, una alfa-globulina normalmente secretada por el hígado fetal y células del saco vitelino, se encuentra en el suero de pacientes con tumores en las células germinales y el hígado y puede ser utilizada como un índice de estado de enfermedad.

5.8.4. Tomografía Computarizada (CT)

La CT sigue siendo la técnica elegida para la representación precisa de cánceres. La CT ha demostrado ser más sensible y específica que cualquier otra técnica de diagnóstico por imágenes para la detección de metástasis.

5.8.5. Medición de Posibles Marcadores Biológicos

Los niveles de un posible marcador biológico de riesgo de un cáncer especifico son medidos para vigilar el efecto de los complejos de hsp unida en forma no covalente a un péptido. Por ejemplo, en individuos con mayor riesgo de padecer cáncer de próstata, el antígeno sérico específico de la próstata (PSA) es medido por el procedimiento descrito por Brawer, H.K., et. al., 1992, J. Urol. 147: 841-845, y Catalona, W.J., et al., 1993, JAMA 270:948-958; o en individuos con riesgo de padecer cáncer colorrectal se miden los CBA como se ha descrito arriba en la Sección 4.5.3; y en individuos con mayor riesgo de padecer cáncer de mama, se mide la 16-\alpha- hidroxilación de estradiol por el procedimiento descrito por Schneider, J. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. ISA 79:3047-3051.

5.8.6. Sonograma

Un sonograma sigue siendo una técnica alternativa a elegir para la representación precisa de cánceres.

6. Ejemplo Administración de complejos hsp-péptido en dos modelos de carcinoma inducidos por UV en ratones

a) Modelos de tumor:

Se estudiaron dos carcinomas inducidos por UV en ratones C3H/HeN (Ward, et al., 1989, J. Exp. Med. 170:217): (i) el carcinoma 6138 altamente inmunogénico, y (ii) el carcinoma 6139 menos inmunogénico.

b) Se prepararon preparados de gp96 de los carcinomas 6138 y 6139SJ por los procedimientos descritos arriba en la Sección 5.2.3. Se administraron los preparados de gp96 sin adyuvantes.

6.1 Modalidad de Prevención (a) Materiales y Método

Se probó la capacidad de los preparados de gp96 para prevenir el desarrollo del carcinoma inducido por UV. Se usó un total de seis grupos de ratones hembra C3H/HeN (obtenidos del Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD), con un peso de aproximadamente 25 g cada uno. Se administró a los dos grupos de ratones dos veces con un intervalo de diez días, o (i) tampón de fosfato salino (PBS), (ii) 25 microgramos/ratón de gp96 derivada de carcinomas UV6138, o (iii) 25 microgramos/ratón de gp96 derivada del carcinoma UV3169SJ.

En cada conjunto se estimularon los ratones con 10^{7} células del carcinoma UV6138 o el carcinoma UV6139SJ 15 días después de la segunda inyección con PBS o gp96. Se midieron los tumores a intervalos de 2 días. Dado que el tumor UV6138 es un tumor regresor, se irradiaron los ratones a 400 rad 10 días después de la segunda inyección con PBS o gp96 para permitir el crecimiento del tumor. Los ratones estimulados con UV6139SJ no fueron irradiados.

(b) Resultados

La administración de gp96 aislado del carcinoma UV6138 volvió a los ratones inmunes a la estimulación con UV6138 pero no a la estimulación con UV6139SJ (Figura 1). Por el contrario, la administración de gp96 aislado del UV6139SJ confirió resistencia a las células UV6139SJ pero no a las células UV6138. La resistencia proporcionada por la gp96 derivada del UV6138 contra las células UV6138 fue mucho mayor (6 de 7 ratones) que la resistencia proporcionada por la gp96 derivada del UV6139 contra las células de UV6139 SJ (2 de 4 ratones) (Figura 1). Estos resultados indican que la administración de preparados de gp96 derivada de los dos carcinomas inducidos por UV inmunizó a los ratones singenéicos del tipo célula del cáncer respectivo y que la resistencia proporcionada fue más grande y más uniforme contra las células del carcinoma más inmunogénicas.

6.2 Modalidad de Tratamiento (a) Materiales y Métodos

Se probó la capacidad de los preparados de gp96 para mediar la terapia de cánceres preexistentes. Tres grupos de ratones fueron inyectados intradérmicamente con 10^{7} células del carcinoma UV6139SJ. Se mantuvieron los ratones bajo observación hasta que los tumores llegaron a ser visibles y palpables el día 4. Después, los ratones del primer grupo no recibieron tratamiento, cada ratón del segundo grupo recibió cada dos días un total de 5 inyecciones de 6 microgramos cada una de gp96 derivada de las células del carcinoma UV6139SJ, y cada ratón del tercer grupo recibió de manera similar un total de 5 inyecciones de gp96 derivada del hígado normal.

(b) Resultados

Se retardó apreciablemente el crecimiento del tumor, controlado por el ancho del diámetro, en los ratones tratados con gp96 derivada del tumor pero no en los ratones tratados con el gp96 derivada del hígado ni en los ratones sin tratamiento (Figura 2). Estos resultados indicaron un efecto terapéutico de los complejos de gp96 en el modelo de carcinoma UV6139SJ. Todos los ratones sucumbieron finalmente al crecimiento del tumor. Un escrutinio de la cinética del crecimiento del tumor en los ratones tratados y controlados demuestra que la administración de gp96 derivada del tumor tuvo un efecto inhibitorio inmediato en el crecimiento del tumor y que el efecto parece haber disminuido una vez terminado el tratamiento con gp96.

6.3 La Medición de la Generación de CTL CD8^{+} Restringidos por MHC de Clase I Proporciona Un Ensayo de Rechazo del Tumor in vivo

Hasta ahora se ha medido el efecto de vacunación con las hsp en el estado de la técnica anterior con ensayos de rechazo del tumor in vivo. Aunque este ensayo es claramente la evidencia más exigente y rigurosa de inmunogenicidad, es poco práctico para vigilar la respuesta inmunitaria en humanos. Probamos la capacidad de los preparados de gp96 derivada del tumor de provocar una respuesta de las células T CD8^{+} para definir una correlación in vitro para el rechazo del tumor in vivo. Los ratones fueron inmunizados dos veces con 20 microgramos de gp96 derivada de células 6138 ó 6139SJ. Se probaron los cultivos mixtos de linfocito-tumor (MLTC) generados de los ratones inmunizados en un ensayo de liberación de ^{51}Cromo y mostraron una citotoxicidad específica del tumor para el tumor utilizado como fuente de gp96. Esta actividad citotóxica podría ser bloqueada por el anticuerpo K44 anti-MHC clase I (Ozato, K., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2427) (Fig. 3A) y por el anticuerpo YTS 169.4 anti-CD8 (Cobbold, S.P., et al., 1984, Nature 312:548) (no mostrado). No se detectó una actividad correspondiente en los MLTC generados de bazos de ratones sin tratar. Estos resultados demuestran que la vacunación con gp96 provoca una respuesta efectiva de los CTL específicos del tumor, que se puede medir in vitro, e independientemente de las respuestas de regresión del tumor mostradas en las Figs. 1 y 2. A la luz del paradigma general de que los antígenos exógenos se presentan generalmente a través de moléculas MHC de clase II y provocan una respuesta de células T ayudantes (Townsend, A. et al., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:601), la capacidad de los preparados de HSP exógenas de provocar la respuesta de CTL restringidos por MHC de clase I es excepcional.

Al probar la capacidad de los preparados de gp96 derivadas del tumor de provocar respuestas de CTL, se realizó la vacunación con células enteras del tumor irradiadas como control positivo. Como se esperaba, la vacunación con células 6138 intactas irradiadas produjo una respuesta potente de los CTL específicos del tumor. Sin embargo, la vacunación con células 6139SJ intactas irradiadas no produjo una respuesta correspondiente de los CTL (Fig. 3B). Este resultado fue sorprendente ya que los cánceres inducidos por UV de los ratones C3H son generalmente muy inmunogénicos (Kripke, M.L., 1977, Cancer Res. 37:1395). En vista de la observación de que las células 6139SJ son dianas apropiadas para las células T citotóxicas (como se ve en la Fig. 3A), deducimos que no son defectuosas en la presentación de antígenos; en vez de eso, su incapacidad de provocar una respuesta de los CTL sugiere que son deficientes en un paso todavía indefinido crucial necesario específicamente para preparar una respuesta de los CTL in vivo. A este respecto lo más significativo es que, aunque las células 6139SJ no provoquen una respuesta de CTL, los preparados de gp96 derivadas de ellas sí lo hace eficientemente. Esto sugiere que las células tumorales intactas y las HSP derivadas de ellas provocan la inmunidad a través de vías inmunológicas distintas. La capacidad de los preparados de gp96 derivada de un tumor para provocar una respuesta poderosa de los CTL aún cuando el tumor del que proviene la gp96 no es capaz de hacerlo, hace los preparados de hsp atractivos como vacunas terapéuticas.

6.4 Los Complejos de GP96-Péptido Provocan una Respuesta de Memoria de las Células T

La capacidad de provocar una respuesta de memoria es crucial para cualquier vacuna por lo que se provocó la capacidad de la gp96 de provocar una respuesta de memoria de una población de células T. Se utilizaron varios criterios, es decir, resistencia a la radiación, cinética de aparición, pérdida de antígenos de superficie de linfocitos CD45RB y L-selectina, para identificar la respuesta de las células T de memoria. A diferencia de las células T sin tratar (Schrek, R., 1961, Ann. N.Y. Acad. Sci 95:839), las células T de memoria son células cíclicas (Mackay, C.R., et al, 1992, Nature 360:264) y como otros linfocitos cíclicos, son resistentes a la irradiación subletal (Lowenthal, J.W., et al., 1991, Leuc. Biol. 49: 388). Así se puede utilizar la resistencia a la radiación para distinguir las células T latentes sin tratar de las células T de memoria y efectoras activadas. Sin embargo, ningún marcador de superficie conocido distingue las células T efectoras activadas de las células T de memoria siendo las dos distinguibles sólo por la cinética de su aparición. Las células T efectoras activadas desaparecen de la circulación a los siete a diez días de agotamiento de cantidades significativas de antígeno (Sprent, J., 1994, Cell 76:315); por el contrario, las células T de memoria continúan circulando bien más allá de este intervalo de tiempo. Para probar si la vacunación con gp96 derivada del tumor provoca una respuesta de las célula T de memoria además de la respuesta de las células efectoras mostrada en la Fig. 3, se vacunó a los ratones dos veces, a intervalos de diez días, con gp96 derivada del tumor y se les irradió (400 rad) doce días después de la última vacunación. Tres días después de la irradiación, se generaron MLTC de bazos de ratones y se probó la respuesta de los CTL específicos del tumor. Se observó (Fig. 4) que de forma similar a la respuesta de los ratones no irradiados (Fig. 3A), los ratones irradiados vacunados con gp96 generaron respuestas de los CTL específicos del tumor y restringidos por las MHC de clase I. Bajo este régimen de vacunación e irradiación, la irradiación elimina el resto de células T de no memoria, mientras que el espacio de tiempo entre la última vacunación y la generación de MCTC elimina los linfocitos T activados (Sprent, J., 1994, Cell 76:315). Así, la respuesta de los CTL observada deriva de las células T de memoria resistentes a la radiación provocada por los preparados de gp96. Este fenómeno también fue probado en ensayos de rechazo del tumor in vivo y se observó que los ratones vacunados con pg96 e irradiados resistían los estímulos con tumor hasta 17 días después de la vacunación, aún cuando habían sido irradiados (datos no mostrados). Estas observaciones indican que la vacunación con gp96 provoca una población de células T duradera y resistente a la radiación.

Como un parámetro independiente para la respuesta de memoria, se probó la expresión de CD45RB (Birkeland, M.L., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 86:6734) en linfocitos CD8^{+} de ratones irradiados y no irradiados, sin tratar y vacunados con gp96 (Fig. 4). En cada caso, los linfocitos fueron obtenidos bajo el mismo régimen como el descrito en el párrafo anterior, es decir, quince días después de la última vacunación incluyendo tres días después de la irradiación, para permitir que se agotaran las células efectoras activadas. Se observó que la vacunación con gp96 produjo la pérdida relativa de expresión de CD45RB en linfocitos T CD8^{+} en los ratones inmunizados irradiados así como no irradiados. Se observaron resultados similares con L-selectina (datos no mostrados). Estos resultados indicaron que como se juzgó de dos conjuntos independientes de criterios, la vacunación con gp96 provoca una respuesta de las célula T de memoria. Según mi leal saber y entender, esta es la primera demostración de generación de una respuesta de memoria de los CTL por vacunación con una vacuna bioquímicamente definida y purificada de cáncer.

7. Ejemplo Administración de complejos hsp-péptido en el tratamiento del carcinoma hepatocellular

Se inyectaron complejos de hsp-péptido (derivados de sus propios tumores o de otros tumores) a pacientes con carcinoma hepatocelular en el postoperatorio. El tratamiento con complejos de hsp-péptido se inicia en cualquier momento tras la operación. Sin embargo, si el paciente ha recibido quimioterapia, los complejos de hsp-péptido son administrados generalmente después de un intervalo de cuatro semanas o más para permitir que el sistema inmunológico se recupere. Se comprueba la inmunocompetencia del paciente por los procedimientos descritos en las secciones 5.7 arriba.

El régimen terapéutico de complejos de hsp-péptido, por ejemplo, gp96, hsp90, hsp70 o una combinación de las mismas, incluyen inyecciones semanales del complejo de hsp-péptido, disueltas en solución salina u otra solución fisiológicamente compatible.

La dosis utilizada de hsp70 o gp96 está en el rango de 10-600 microgramos, siendo la dosis preferida de 10-100 microgramos. La dosis utilizada para hsp90 está en el rango de 50 a 5.000 microgramos, siendo la dosis preferida de aproximadamente 100 microgramos.

La vía y el sitio de inyección cambia cada vez, por ejemplo, la primera inyección se administra subcutáneamente en el brazo izquierdo, la segunda inyección en el brazo derecho, la tercera inyección en la región abdominal izquierda, la cuarta inyección en la región abdominal derecha, la quinta inyección en el muslo izquierdo, la sexta inyección en el muslo derecho, etc. Se repite el mismo sitio después de un intervalo de una o más inyecciones. Además, las inyecciones son divididas y cada mitad de la dosis es administrada en un sitio diferente en el mismo día.

En términos generales, las primeras cuatro a seis inyecciones se administran a intervalos semanales. Posteriormente, se administran dos inyecciones a intervalos de dos semanas; seguido por un régimen de inyecciones a intervalos mensuales. El efecto de la terapia con complejos de hsp-péptidos es vigilado midiendo: a) la hipersensibilidad retardada como una estimación de la inmunidad celular; b) la actividad de los linfocitos T citolíticos in vitro c) los niveles de antígenos específicos del tumor, por ejemplo, antígenos carcinoembrionarios (CEA); d) los cambios en la morfología de los tumores utilizando técnicas tales como una tomografía computarizada (CT); y e) los cambios en los niveles de posibles marcadores biológicos de riesgo para un cáncer particular en individuos de alto riesgo.

Dependiendo de los resultados obtenidos, como se ha descrito arriba en la Sección 5.7, se desarrolla el régimen terapéutico para mantener y/o aumentar las respuestas inmunológicas del paciente, con el importante objetivo de lograr la regresión del tumor y completar la erradicación de células cancerosas.

8. Ejemplo Administración de complejos hsp-péptido en el tratamiento del cáncer hepatocelular

Se administran los complejos de Hsp-péptido (gp96, hsp70, hsp90 o una combinación de las mismas) como terapia adyuvante y como terapia adyuvante profiláctica en pacientes tras la completa reducción del cáncer colorrectal para eliminar las micrometastasis indetectables y para mejorar su supervivencia.

Los regímenes terapéuticos y profilácticos utilizados en pacientes que padecen de cáncer colorrectal son iguales que los descritos en la Sección 7 arriba para pacientes que se recuperan de un carcinoma hepatocelular. Los métodos para vigilar a los pacientes bajo evaluación clínica para la prevención y el tratamiento del cáncer colorrectal se hacen por los procedimientos descritos en la Sección 5.7. Específicamente, se miden los niveles de CEA como un control útil de la regresión y/o reaparición del tumor (Mayer, R.J.., et al., 1978, cáncer 42:1428).

9. Ejemplo Método para la purificación rápida de hsp70 asociadas a péptidos

Los complejos de hsp70-péptido se pueden obtener fácilmente de células cancerosas o células infectadas por un agente infeccioso u otras células por una cromatografía rápida de una fase en ADP-agarosa, descrita abajo.

9.1 Método y Resultados

Se homogeneizaron células de sarcoma Met A (500 millones de células) en tampón hipotónico y el lisado fue centrifugado a 100.000 g durante 90 minutos a 4ºC. Se dividió el sobrenadante en dos y se aplicó a una columna con ADP-agarosa o con ATP-agarosa. Se lavaron las columnas en el tampón y se eluyeron con 3 mM de ADP ó 3 mM de ATP, respectivamente. Se analizaron las fracciones eluídas por SDS-PAGE: en ambos casos se obtuvieron preparados aparentemente homogéneos de hsp70. Sin embargo, cuando se probó la presencia de péptidos en cada uno de los preparados, se descubrió que el preparado de hsp70 eluída/ligada con ADP se asociaba a los péptidos, mientras que el preparado de hsp70 eluída/ligada con ATP no. (Figuras 5A y 5B)

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante sirve sólo como ayuda al lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto mucha atención en compilar las referencias, no se puede evitar incurrir en errores u omisiones, por lo que la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

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Claims (26)

1. Uso de una composición farmacéutica comprendiendo un soporte farmacéutico y un complejo purificado consistente esencialmente en una molécula antigénica y una proteína humana de choque térmico, cuya proteína de choque térmico es seleccionada del grupo que consiste en una proteína de choque térmico 70 y una proteína de choque térmico gp96, y que la proteína de choque térmico está unida en forma no covalente a la molécula antigénica, para la fabricación de un medicamento que comprende una cantidad de dicho complejo purificado en el rango de 10 a 600 microgramos, para tratar o prevenir cáncer en un individuo humano adulto, donde dicho medicamento puede ser administrado a un individuo humano adulto sin un adyuvante.

2. Uso según la reivindicación 1, donde la proteína de choque térmico es proteína de choque térmico 70.

3. Uso según la reivindicación 1, donde la proteína de choque térmico es proteína de choque térmico gp96.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cantidad del complejo purificado está en el rango de 10 a 100 microgramos.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho medicamento sirve para la terapia de combinación con un modificador de la respuesta biológica seleccionado del grupo consistente en interferón-\alpha, interferón-gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-6 y el factor de necrosis tumoral.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho medicamento sirve para la administración a intervalos semanales.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la molécula antigénica es un péptido con el que la proteína de choque térmico se asocia endógenamente in vivo.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el complejo purificado es aislado del tejido canceroso autólogo al individuo humano adulto.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el complejo purificado es aislado del tejido canceroso alogénico al individuo humano adulto.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la molécula antigénica es un péptido con el que la proteína de choque térmico se asocia endógenamente in vivo y el complejo purificado es aislado del tejido canceroso.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el complejo purificado de la proteína de choque térmico y la molécula antigénica es producido in vitro.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el complejo purificado de la proteína de choque térmico y la molécula antigénica es producido in vitro y donde la molécula antigénica es un antígeno específico del tumor.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el cáncer es cáncer de mama, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, adenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma epitelial, leucemia, cáncer de ovarios, cáncer cervical, glioma o linfoma.

14. Composición farmacéutica comprendiendo un soporte farmacéutico y un complejo purificado que consiste esencialmente en una molécula antigénica y una proteína de choque térmico, cuya proteína de choque térmico es seleccionada del grupo que consiste en una proteína de choque térmico 70 y una proteína choque térmico gp96, y cuya proteína de choque térmico es unida en forma no covalente a la molécula antigénica, dicha composición farmacéutica comprendiendo una cantidad de dicho complejo purificado en el rango de 10 a 600 microgramos, para el uso como un medicamento para tratar o prevenir cáncer en un individuo humano adulto, donde dicho medicamento puede administrarse a dicho individuo humano adulto sin un adyuvante.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, donde la proteína de choque térmico es una proteína de choque térmico 70.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, donde la proteína de choque térmico es una proteína de choque térmico gp96.

17. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la cantidad del complejo purificado está en el rango de 10 a 100 microgramos.

18. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde dicha composición farmacéutica sirve para usarla en la terapia de combinación con un modificador de la respuesta biológica seleccionado del grupo consistente en interferón-\alpha, interferón-gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-6 y el factor de necrosis tumoral.

19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, donde dicha composición farmacéutica sirve para la administración a intervalos semanales.

20. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la molécula antigénica es un péptido con el que la proteína de choque térmico se asocia endógenamente in vivo.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, donde el complejo purificado es aislado del tejido canceroso.

22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, donde el complejo purificado es aislado del tejido canceroso autólogo al individuo humano adulto.

23. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, donde el complejo purificado es aislado del tejido canceroso alogénico al individuo humano adulto.

24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde el complejo purificado de la proteína de choque térmico y la molécula antigénica es producido in vitro.

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, donde la molécula antigénica es un antígeno específico del tumor.

26. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, donde el cáncer es cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, adenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma celular renal, hepatoma, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma epitelial, leucemia, cáncer de ovarios, cáncer cervical, glioma, melanoma o linfoma.