ES2340708T3 - Tratamiento de esclerosis lateral amiotrofica con pirimetamina y analogos. - Google Patents
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Abstract
Uso de una pirimetamina o un análogo funcional de la misma para la fabricación de un medicamento para prevenir el desarrollo de síntomas, o mejorar los síntomas o progresión de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediada por SOD-1.
Description
Tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica
con pirimetamina y análogos.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la
enfermedad progresiva de las neuronas motoras más habitualmente
diagnosticada. La enfermedad se caracteriza por degeneración de
neuronas motoras en la corteza, tronco encefálico y médula espinal
(Principles of Internal Medicine, 1991 McGraw-Hill,
Inc., New York; Tandan et al. (1985) Ann. Neurol,
18:271-280, 419-431). La causa de la
enfermedad es desconocida, y la ELA sólo se puede diagnosticar
cuando el paciente comienza a experimentar debilidad asimétrica de
las extremidades y fatiga, fasciculación localizada en las
extremidades superiores, y/o espasticidad en las piernas, que
tipifica el comienzo. Hay un componente genético para al menos
algunas incidencias de ELA.
En casi todos los casos, la ELA esporádica y la
ELA familiar (ELAF) dominante autosómica son clínicamente similares
(Mulder et al. (1986) Neurology, 36:511-517).
Se ha demostrado que en algunos árboles genealógicos de ELAF, pero
no en todos, la enfermedad está ligada a un defecto genético en el
cromosoma 21q (Siddique et al., (1991) New Engl. J. Med.,
324:1381-1384).
En particular, parece que las mutaciones en el
gen de SOD-1 que está localizado en el cromosoma 21q
están asociadas con la forma familiar de ELA. Los efectos
perjudiciales de diversas mutaciones en SOD-1 están
mediados muy probablemente a través de una ganancia de función
tóxica, en lugar de una pérdida de actividad de
SOD-1 (Al-Chalabi Y Leigh, (2000)
Curr. Opin. Neurol., 13, 397-405; Alisky et
al. (2000) Hum. Gene Ther., 11, 2315-2329).
Aunque la toxicidad no está clara, existen pruebas que sugieren que
la eliminación de la propia proteína mejorará la toxicidad.
Existe la necesidad de desarrollar terapias que
puedan alterar el curso de enfermedades neurodegenerativas o
prolongar el tiempo de supervivencia de pacientes con tales
enfermedades. En particular, existe la necesidad de reducir la
proteína SOD-1 producida en el cerebro y en la
médula espinal de los pacientes con ELA. La prevención de la
formación de la proteína SOD-1 de tipo salvaje o
mutante puede detener la progresión de la enfermedad, y puede
permitir la mejora de los síntomas de ELA.
El documento EP 1.473.289 describe análogos de
pirimetamina para tratar la enfermedad de Alzheimer.
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Se describen usos para interferir con la
síntesis proteica en el cerebro, médula espinal, meninges y células
musculares, administrando una pirimetamina o un análogo funcional de
la misma. En particular, se describe una pirimetamina o un análogo
funcional de la misma para uso en la disminución de la expresión del
gen de SOD-1.
El uso de la invención se puede usar para
reducir o inhibir la expresión de una proteína asociada con
esclerosis lateral amiotrófica mediada por SOD-1,
que es SOD-1. El uso de pirimetamina o un análogo
funcional de la misma inhibe la transcripción de ARNm de
SOD-1 o la estabilidad del transcrito. Las
disminuciones en ARNm de SOD-1 pueden conducir
entonces a niveles reducidos de proteína SOD-1, que
reduce su acumulación en la célula y mejora la enfermedad. La
expresión y acumulación de SOD-1 mutante es un
mecanismo patofisiológico ampliamente aceptado que subyace a ELA
familiar, y también puede desempeñar un papel en la forma esporádica
de la enfermedad.
En consecuencia, la invención se refiere al uso
de una pirimetamina o análogo funcional de la misma para la
fabricación de un medicamento para prevenir el desarrollo de
síntomas, o mejorar los síntomas o progresión de esclerosis lateral
amiotrófica (ELA) mediada por SOD-1. La célula que
es la diana de dicho uso puede ser una célula neuronal, o cualquier
célula en la médula espinal, el tejido meníngeo, o una célula
muscular, por ejemplo en un sujeto con ELA (por ejemplo, ELA
familiar). Los ejemplos de células incluyen, pero no se limitan a,
neuronas, interneuronas, gliocitos, microgliocitos, células
musculares, células implicadas en la respuesta inmunitaria.
La invención se refiere además a una
pirimetamina o un análogo funcional de la misma para uso en un
método para prevenir el desarrollo de síntomas, o mejorar los
síntomas o progresión de esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
mediada por SOD-1.
En una realización, se usa pirimetamina o
análogos funcionales de la misma. En otra realización, se usa
pirimetamina con al menos una modificación en el anillo bencénico.
Todavía en otra realización, se usa pirimetamina con al menos una
modificación en el anillo de pirimidina.
La inhibición de la transcripción del gen
comprende monitorizar midiendo los niveles de expresión de la
proteína SOD-1. Como alternativa, la inhibición de
la transcripción del gen comprende monitorizar los niveles de una
molécula de ácido nucleico que codifica la proteína
SOD-1, por ejemplo monitorizando los niveles de
ácido ribonucleico o de ácido desoxirribonucleico.
La mejora de los síntomas se puede monitorizar
midiendo la prolongación de la supervivencia del individuo, por
ejemplo monitorizando una puntuación neurológica del individuo. Como
alternativa, la mejora se puede determinar monitorizando los
niveles de expresión de la proteína SOD-1 o los
niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína
SOD-1.
La Fig. 1 es una gráfica que muestra la
reducción de la expresión de la proteína SOD-1 por
pirimetamina.
La Fig. 2 es una gráfica de barras que muestra
la expresión reducida de ARNm de SOD-1 con
pirimetamina y noretindrona.
La Fig. 3 es un esquema que muestra análogos
funcionales de pirimetamina representativos de la invención.
La Fig. 4 es una gráfica de barras que muestra
la expresión reducida de ARNm para alfa-sinucleína
en células HeLa tras el tratamiento con pirimetamina y
noretindrona.
La Fig. 5 es una gráfica de barras que muestra
la reducción de la expresión de la proteína SOD-1 en
ratones SOD-93A machos y hembras con tratamiento
crónico con pirimetamina (TX).
La Fig. 6 es una gráfica de barras que muestra
la disminución en la expresión de alfa-sinucleína en
linfocitos de ratón con tratamiento crónico con pirimetamina.
La Fig. 7 es una gráfica de barras que muestra
la expresión disminuida de SOD-1 espinal en ratones
SOD-93A tras la administración oral de
pirimetamina.
La Fig. 8 es una gráfica de barras que muestra
una disminución en los niveles de SOD-1 de
linfocitos en un paciente con ELA familiar después de 30 días de
administración oral de pirimetamina.
La práctica de la presente invención emplea,
excepto que se indique de otro modo, métodos convencionales de
microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante
dentro de la pericia de la técnica. Tales técnicas se explican de
forma más completa en la bibliografía. (Véanse, por
ejemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Edición Actual); DNA Cloning: A Practical
Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide
Synthesis (N. Gait, ed., Edición Actual); Nucleic Acid Hybridization
(B. Names & S. Higgins, eds., Edición Actual); Transcription
and Translation (B. Names & S. Higgins, eds., Edición Actual);
CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijessen, ed.);
Fundamental Virology, 2ª Edición, Vol. I & II (B. N. Fields y
D. M Knipe, eds.)).
De forma que la invención se entienda más
claramente, se definen los siguientes términos:
La expresión "trastorno neurodegenerativo"
o "enfermedad neurodegenerativa" se usa de forma intercambiable
aquí, y se refiere a una alteración o ausencia de una función
neurológica normal, o a la presencia de una función neurológica
anormal en un individuo, o grupo de individuos. Por ejemplo, los
trastornos neurológicos pueden ser el resultado de enfermedad,
lesión, y/o envejecimiento. Como se usa aquí, trastorno
neurodegenerativo también incluye una degeneración que provoca
anormalidad morfológica y/o funcional de una célula neuronal o una
población de células neuronales. Los ejemplos no limitantes de
anormalidades morfológicas y funcionales incluyen deterioro físico
y/o muerte de células neuronales, patrones anormales de crecimiento
de células neuronales, anormalidades en la conexión física entre
células neuronales, sub- o sobreproducción de una sustancia o
sustancias, por ejemplo, un neurotransmisor, por células
neuronales, fracaso de las células neuronales a la hora de producir
una sustancia o sustancias que producen normalmente, la producción
de sustancias, por ejemplo, neurotransmisores, y/o la
transmisión de impulsos eléctricos en patrones anormales o en
tiempos anormales. La neurodegeneración se puede producir en
cualquier área del cerebro de un individuo, y se observa con muchos
trastornos, incluyendo, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica
(ELA), esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, enfermedad de
Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad asociada con priones
(CJD), atrofia muscular espinal, ataxia cerebelosa espinal, y
lesión de la médula espinal.
Las expresiones "agente farmacológico" y
"agente farmacológico que modula un receptor nuclear", como se
usan aquí, están destinadas a ser usadas de forma intercambiable, y
estas expresiones se refieren al compuesto, o compuestos, que
interfieren selectivamente con la síntesis proteica en una célula
neuronal de la médula espinal, meníngea, o de los músculos. En
particular, interfieren con la síntesis proteica de una proteína
SOD-1.
Los términos "modular" o "que modula"
o "modulado", como se usan de forma intercambiable aquí,
también se refieren a un cambio en la actividad de
SOD-1, o la expresión, es decir, un aumento o
disminución en la actividad de SOD-1, o expresión,
de forma que la modulación produce un efecto terapéutico en un
individuo, o grupo de individuos. Un efecto terapéutico es aquel
que da como resultado una mejora en los síntomas, o progresión de
ELA. El cambio en la actividad se puede medir por medidas
cuantitativas o cualitativas del nivel de proteína
SOD-1, por ejemplo mediante análisis de
transferencia Western. El ensayo cuantitativo se puede usar para
medir la disminución o aumento de los niveles de proteína
SOD-1 en presencia de un agente farmacológico, tal
como pirimetamina y sus análogos. Un agente farmacológico adecuado
puede ser aquel que disminuya la expresión de SOD-1
en alrededor de 5 por ciento a alrededor de 50 por ciento, en
comparación con un control. El cambio en la expresión también se
puede medir por medidas cuantitativas o cualitativas del nivel de
ácido nucleico asociado con SOD-1, por ejemplo
midiendo el nivel de expresión de ARN o ADN.
El efecto de la modulación de
SOD-1 en un individuo, o grupo de individuos,
también se puede investigar examinando la supervivencia del
individuo, o grupo de individuos. Por ejemplo, midiendo el cambio en
la supervivencia, o la prolongación de la supervivencia en uno o
más modelos de animales para una enfermedad neurodegenerativa, por
ejemplo ELA. El cambio en la supervivencia puede ser debido a la
administración de agente farmacológico, que es pirimetamina o un
análogo funcional, que se administra a un modelo murino de ELA. El
efecto del agente farmacológico se puede determinar basándose en el
incremento en días de supervivencia de un grupo de ensayo de
ratones con ELA, en comparación con un grupo de control de ratones
con ELA a los que se les administró un agente de control o ningún
agente. En una realización, el agente farmacológico, que es
pirimetamina o un análogo funcional, incrementa el porcentaje de
efecto sobre la supervivencia del individuo, o una población de
individuos (por ejemplo, una población de machos, o una población de
hembras) en al menos 2% a alrededor de 100%. Preferiblemente, el
porcentaje de efecto sobre la supervivencia del individuo, o una
población de individuos, es al menos 5% a alrededor de 50%, al
menos 10% a alrededor de 25%. Incluso más preferiblemente, el
porcentaje de efecto sobre la supervivencia del individuo, o una
población de individuos, es al menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,
10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26% 28%, 30%, 32%, 34%, 36%,
38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48% y 50%. El efecto de la modulación de
SOD-1 también se puede determinar examinando la
puntuación neurológica de un individuo, o grupo de individuos, por
ejemplo evaluando la mejora en el movimiento muscular, o examinando
el alivio o mejora de los síntomas de la enfermedad. En una
realización preferida, la puntuación neurológica de un individuo, o
grupo de individuos, es significativamente diferente de la de los
individuos del control no tratados, con un nivel de significancia
entre p < 0,05 y p < 0,0001, según se determina usando
procedimientos de análisis estadístico
estándar.
estándar.
Las expresiones también se pueden usar para
referirse a un cambio en el receptor nuclear al interaccionar con
un agente farmacológico, es decir, un cambio en la actividad del
receptor nuclear, estructura, o la expresión de un receptor
nuclear, o una subunidad del receptor nuclear, es decir, un
incremento o disminución en la actividad, o expresión, del receptor
nuclear, de forma que la modulación produce un efecto terapéutico en
un individuo, o grupo de
individuos.
individuos.
El término "inhibir" o "que inhibe",
como se usa aquí, se refiere a una reducción medible de la expresión
de un gen diana o una proteína diana, por ejemplo
SOD-1. El término también se refiere a una reducción
medible en la actividad de una proteína diana. Preferiblemente, una
reducción en la expresión es al menos alrededor de 10%. Más
preferiblemente, la reducción de expresión es alrededor de 20%, 30%,
40%, 50%, 60%, 80%, 90%, e incluso más preferiblemente alrededor de
100%.
La proteína SOD-1 puede ser una
proteína SOD-1 de tipo salvaje o una proteína
SOD-1 mutante, y puede derivar de un gen de
SOD-1 de tipo salvaje o un gen de
SOD-1 con al menos una mutación.
El término "individuo", como se usa aquí,
se refiere a cualquier organismo vivo en el que se provoca una
respuesta inmunitaria. El término individuo incluye, pero no se
limita a, seres humanos, primates no humanos tales como chimpancés
y otros monos y especies de monos; animales de granja tales como
ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; animales domésticos
tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen
roedores tales como ratones, ratas y cobayas, y similares. El
término no representa ninguna edad o sexo particular. De este modo,
se pretende cubrir los individuos adultos y neonatos, así como
fetos, ya sean machos o hembras.
Como se usa aquí, grupos "alquilo" incluyen
hidrocarburos saturados que tienen uno o más átomos de carbono,
incluyendo grupos alquilo de cadena lineal (por ejemplo,
metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo,
nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo cíclicos (o grupos
"cicloalquilo" o "alicíclicos" o "carbocíclicos")
(por ejemplo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo,
cicloheptilo, ciclooctilo, etc.), grupos alquilo de cadena
ramificada (isopropilo, terc-butilo, sec-butilo,
isobutilo, etc.). Excepto que se especifique de otro modo, el
término alquilo incluye tanto "alquilos no sustituidos" como
"alquilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a grupos
alquilo que tienen sustituyentes que sustituyen uno o más
hidrógenos en uno o más carbonos de la cadena principal
hidrocarbonada.
La expresión "grupo alcoxi", como se usa
aquí, significa un grupo alquilo que tiene un átomo de oxígeno unido
a él. Los grupos alcoxi representativos incluyen grupos que tienen
1-10 átomos de carbono, preferiblemente
1-6 átomos de carbono, por ejemplo, metoxi,
etoxi, propoxi, terc-butoxi, y similares. Los ejemplos de
grupos alcoxi incluyen metoxi, etoxi, propoxi, iso-propoxi,
butoxi, pentoxi.
La expresión "grupo aromático" o "grupo
arilo" incluye hidrocarburos cíclicos insaturados y aromáticos
así como heterociclos insaturados y aromáticos que contienen uno o
más anillos. Los grupos arilo también pueden estar condensados o
formando puentes con anillos alicíclicos o heterocíclicos que no son
aromáticos, para formar un policiclo (por ejemplo,
tetralina). Los grupos arilo también se pueden condensar o formar
puentes con anillos alicíclicos o heterocíclicos que no son
aromáticos, para formar un policiclo (por ejemplo,
tetralina).
Un grupo "aralquilo" es un grupo alquilo
sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, fenilmetilo
(es decir, bencilo)). Un resto "alquilarilo" es un
grupo arilo sustituido con un grupo alquilo (por ejemplo,
p-metilfenilo (es decir, p-tolilo)). Un grupo
"alcoxifenilo" (o grupo "alquiloxifenilo") es un grupo
fenilo sustituido con un grupo alcoxi (por ejemplo,
p-metoxifenilo). Un grupo "arilalcoxi" es un grupo
alcoxi sustituido con un grupo fenilo (por ejemplo,
benciloxi). Un grupo "ariloxialquilo" es un grupo alquilo
sustituido con un grupo oxiarilo (por ejemplo, fenilmetiléter
(es decir, fenoximetilo)). Un grupo "ariloxifenilo" es
un grupo fenilo sustituido con un grupo fenoxi (por ejemplo,
éter bifenílico (es decir, fenoxifenilo)). Un grupo
"fenoxi" es un átomo de oxígeno unido a un grupo fenilo.
La expresión "grupo heteroarilo" incluye
grupos cíclicos insaturados y aromáticos en los que uno o más de
los átomos de carbono en el anillo es un elemento distinto de
carbono, por ejemplo nitrógeno, azufre u oxígeno.
La expresión "grupo heterocíclico" incluye
estructuras anulares cerradas análogas a grupos carbocíclicos, en
las que uno o más de los átomos de carbono en el anillo es un
elemento distinto del carbono, por ejemplo nitrógeno, azufre u
oxígeno. Los grupos heterocíclicos pueden ser saturados o
insaturados. Adicionalmente, los grupos heterocíclicos (tales como
pirrolilo, piridilo, isoquinolilo, quinolilo, purinilo, y furilo)
pueden tener un carácter aromático, en cuyo caso se pueden
denominar como grupos "heteroarilo" o
"heteroaromático".
Un grupo "heteroarilalquilo" es un grupo
alquilo sustituido con un grupo heteroarilo (por ejemplo,
4-metilpiridina).
Un grupo "heteroarilalcoxi" es un grupo
alcoxi sustituido con un grupo heteroarilo (por ejemplo,
4-metoxipiridina).
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La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también
denominada enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad
neurodegenerativa mortal que afecta a las neuronas motoras en la
corteza, tronco encefálico y médula espinal (Hirano, (1996)
Neurology, 47 (4 Supl. 2): S63-6). El comienzo de
ELA se produce en la cuarta o quinta década de vida (la edad media
de comienzo es 57 años), y es mortal en dos a cinco años después del
diagnóstico (Williams, et al. (1991) Mayo Clin. Proc., 66:
54-82). La ELA afecta a aproximadamente 30.000
norteamericanos, con casi 8.000 muertes comunicadas en los Estados
Unidos cada año. Los pacientes con ELA pierden progresivamente toda
función motora - son incapaces de andar, hablar o respirar por sí
mismos.
El fallo principal de ELA es la pérdida de
neuronas motoras de la médula espinal, lo que provoca que los
músculos bajo su control se debiliten y se consuman, conduciendo a
parálisis. La ELA tiene una forma tanto familiar
(5-10%) como esporádica, y ahora las formas
familiares se están ligando a varios loci genéticos distintos
(Deng, et al. (1995) Hum. Mol. Genet., 4:
1113-16; Siddique, et al. (1995) Clin.
Neurosci., 3: 338-47; Siddique, et al.,
(1997) J. Neural Transm. Supl., 49: 219-33; Ben
Hamida, et al. (1990) Brain, 113: 347-63;
Yang, et al. (2001) Nat. Genet. 29: 160-65;
Hadano, et al. (2001) Nat. Genet. 29:
166-73). Alrededor de 15-20% de los
casos familiares son debidos a mutaciones en el gen que codifica
Cu/Zn superóxido dismutasa 1 (SOD1) (Siddique, et al. (1991)
N. Engl. J. Med., 324: 1381-84; Rosen, et al.
(1993) Nature, 362: 59-62).
Aunque la etiología de la enfermedad es
desconocida, una teoría es que la muerte de las células neuronales
en ELA es el resultado de la sobreexcitación de células neuronales
debido a un exceso de glutamato extracelular. El glutamato es un
neurotransmisor que es liberado por neuronas glutaminérgicas, y es
captado en gliocitos en los que se convierte en glutamina mediante
la enzima glutamina sintetasa, la glutamina vuelve a entrar
entonces en las neuronas y es hidrolizada por glutaminasa para
formar glutamato, reponiendo así la reserva de neurotransmisor. En
una médula espinal y tronco encefálico normales, el nivel de
glutamato extracelular se mantiene a niveles micromolares bajos en
el fluido extracelular, debido a que los gliocitos, que funcionan
en parte para sostener las neuronas, usan la proteína transportadora
de aminoácidos excitadores tipo 2 (EAAT2) para absorber
inmediatamente el glutamato. Una deficiencia en la proteína EAAT2
normal en pacientes con ELA se identificó como importante en la
patología de la enfermedad (véase, por ejemplo, Meyer
et al. (1998) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 65:
594-596; Aoki et al. (1998) Ann. Neurol. 43:
645-653; Bristol et al. (1996) Ann Neurol.
39: 676-679). Una explicación para los niveles
reducidos de EAAT2 es que EAAT2 se empalma aberrantemente (Lin
et al. (1998) Neuron, 20: 589-602). El
empalme aberrante produce una variante de empalme con una supresión
de 45 a 107 aminoácidos localizados en la región C terminal de la
proteína EAAT2 (Meyer et al. (1998) Neureosci Lett. 241:
68-70). Debido a la falta o al defecto de EAAT2, el
glutamato extracelular se acumula, provocando que las neuronas se
disparen continuamente. La acumulación de glutamato tiene un efecto
tóxico sobre las células neuronales, debido a que el disparo
continuo de las neuronas conduce a la muerte celular prematura.
Aunque se sabe mucho sobre la patología de ELA,
poco se sabe sobre la patogénesis de la forma esporádica ni sobre
las propiedades causales de la proteína SOD mutante en ELA familiar
(Bruijn, et al. (1996) Neuropathol. Appl. Neurobiol., 22:
373-87; Bruijn, et al. (1998) Science 281:
1851-54). Se han especulado muchos modelos,
incluyendo toxicidad por glutamato, hipoxia, estrés oxidativo,
agregados proteicos, disfunción de neurofilamentos y mitocondrial
(Cleveland, et al. (1995) Nature 378: 342-43;
Cleveland, et al. Neurology, 47(4 Supl. 2):
S54-61, discusión
S61-2(1996); Cleveland, (1999) Neuron, 24:
515-20; Cleveland, et al. (2001) Nat. Rev.
Neurosci., 2: 806-19;
Couillard-Despres, et al. (1998) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 95: 9626-30; Mitsumoto, (1997) Ann.
Pharmacother., 31: 779-81; Skene, et al.
(2001) Nat. Genet. 28: 107-8; Williamson, et
al. (2000) Science, 288: 399).
Actualmente no hay cura para ELA, ni hay ninguna
terapia que haya demostrado ser eficaz para prevenir o invertir el
curso de la enfermedad. Recientemente la Food and Drug
Administration (FDA) ha aprobado varios fármacos. Hasta la fecha,
los intentos para tratar ELA han implicado tratar la degeneración
neuronal con alcoholes grasos de cadena larga que tienen efectos
citoprotectores (véase, patente U.S. nº 5.135.956); o con una
sal de ácido pirúvico (véase patente U.S. nº 5.395.822); y
usar una glutamina sintetasa para bloquear la cascada del glutamato
(véase patente U.S. 5.906.976). Por ejemplo, los Estados
Unidos han aprobado Riluzole^{TM}, un inhibidor de la liberación
de glutamato, para el tratamiento de ELA, y parece que prolonga la
vida de al menos algunos pacientes con ELA. Sin embargo, algunos
informes han indicado que, incluso aunque la terapia con
Riluzole^{TM} puede prolongar el tiempo de supervivencia, no
parece proporcionar una mejora en la fuerza muscular de los
pacientes. Por lo tanto, el efecto de RiluzoleA^{TM} es limitado
por cuanto la terapia no modifica la calidad de vida para el
paciente (Borras-Blasco et al. (1998) Rev.
Neurol., 27: 1021-1027).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene el efecto de disminuir la
proteína SOD-1 (por ejemplo, proteína
SOD-1 mutante) en células, reduciendo o eliminando
la expresión de la proteína con una pirimetamina y sus análogos
funcionales. El gen de SOD-1 está localizado en el
cromosoma 21q22.1. Las secuencias de SOD-1 según se
describen en la publicación PCT WO 94/19493 son secuencias
oligonucleotídicas que codifican SOD-1, y
generalmente se reivindica el uso de un homólogo de ADN antisentido
de un gen que codifica SOD-1, ya sea en forma
mutante o en forma de tipo salvaje, en la preparación de un
medicamento para tratar un paciente con una enfermedad. La secuencia
de ácidos nucleicos del gen de SOD-1 humana se
puede encontrar en el número de acceso de Genbank NM_000454. La
secuencia nucleotídica de SOD-1 humana también se
presenta en SEQ ID NO: 1. La secuencia proteica de
SOD-1 correspondiente se presenta en SEQ ID NO:
2.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la invención se refiere al uso de
pirimetamina y sus análogos funcionales. La pirimetamina es un
fármaco antimalárico, que penetra fácilmente las células en el
cuerpo y en el cerebro. La pirimetamina se ha usado para el
tratamiento de malaria, toxoplasmosis, y otras varias infecciones
microbianas (para un repaso, véase Schweitzer, et al. (1990)
FASEB J 4: 2441-2452). El efecto antimicrobiano de
pirimetamina es el resultado de su inhibición de dihidrofolato
reductasa (DHFR), y enzimas implicadas en la ruta de la síntesis
del folato. El parásito de la malaria sintetiza folato de novo,
mientras que el hospedante humano debe obtener folatos preformados
y no puede sintetizar folato. La incapacidad del parásito para
utilizar folatos exógenos hace a la biosíntesis de folato una buena
diana farmacéutica. La DHFR es una enzima ubicua que participa en
el reciclaje de folatos, reduciendo el dihidrofolato a
tetrahidrofolato. El tetrahidrofolato se oxida entonces nuevamente
a dihidrofolato a medida que participa en reacciones biosintéticas
(por ejemplo, timidilato sintetasa). La inhibición de DHFR evitará
la formación de timidilato y conducirá a una detención de la
síntesis de ADN y la muerte subsiguiente del parásito. La
pirimetamina es el inhibidor de DHFR más común usado como
antimaláricos. Otros inhibidores de DHFR incluyen, pero no se
limitan a, sulfadoxina, trimetoprima, sulfadiazina, trimetoprima, y
sulfametoxazol.
Mediante el uso de la invención, se reduce la
expresión de SOD-1. La pirimetamina es un potente
inhibidor de la expresión de SOD-1 en la estirpe
celular HeLa y en la estirpe celular Neuro2A de ratón, como se
muestra en los Ejemplos. El mecanismo de acción para la reducción
de SOD-1 no se conoce en este momento, pero los
niveles tanto de la proteína como de ARNm que codifica
SOD-1 se reducen de forma dependiente de la dosis.
Sin embargo, la pirimetamina no actúa vía la inhibición de
dihidrofolato reductasa, debido a que sus efectos no se pudieron
prevenir o invertir usando ácido folínico (el producto enzimático de
DHFR). Además, el metotrexato, un potente inhibidor de DHFR con una
estructura química no relacionada, no redujo la proteína
SOD-1 en la célula HeLa. Finalmente, la
pirimetamina es un inhibidor muy débil de DHFR humana, con una
EC_{50} > 70 \muM (Schweitzer et al., (1990) más
arriba). Se ha dado a conocer que la pirimetamina actúa sobre
ADN centromérico y muy probablemente inhibe la transcripción del gen
de SOD-1 mediante una acción sobre un factor de
transcripción, o menos probablemente mediante una acción directa
sobre el propio ADN genómico.
Aunque no se requiere para proporcionar un
mecanismo, se cree que, para la inhibición de la expresión de
SOD-1, la pirimetamina y sus análogos funcionales
actúan putativamente para reducir la expresión de SOD1 humana vía
un receptor nuclear todavía no identificado. De forma breve, la
pirimetamina se une con afinidad elevada a la proteína del
receptor, activándola y provocando que se dimerice con otro receptor
activado. Los receptores dimerizados se transportan al núcleo de la
célula, o ya están en el núcleo y se unen a 5' del ADN genómico al
codón de partida de hSOD1. Los receptores transportados se unen a un
tramo de ADN palindrómico en la región promotora del gen de
SOD-1, en el que los complejos de
receptor-ligando-ADN ejercen
impedimento estérico para prevenir el inicio de la transcripción.
De este modo, se obtiene menos ARN que codifica SOD1, y
consiguientemente se obtiene menos proteína. Las reducciones en la
cantidad de proteína SOD1 mutante producida evitarían entonces sus
efectos neurotóxicos y mejorarían la progresión de la enfermedad de
ELA.
\newpage
Según la invención, se usa una pirimetamina o un
análogo funcional de la misma. El farmacóforo de pirimetamina se
muestra en la fórmula I.
La relación estructura-actividad
(SAR) dentro de la serie de compuestos de pirimetamina se puede
establecer con un grupo de los 30 compuestos representativos
mostrados en la Figura 3. Un estudio sistemático de SAR puede
demostrar que estos compuestos actúan mediante una diana celular
específica. Algunos de estos compuestos están comercialmente
disponibles, mientras que otros se han sintetizado usando métodos
estándar de química orgánica. El diseño de los compuestos se basa
en la molécula principal pirimetamina, que se puede romper en dos
partes estructurales y se puede modificar separadamente. Las dos
partes estructurales principales son (1) el anillo bencénico, y (2)
el anillo de pirimidina. Se ha diseñado un número de análogos o
derivados, como se describe a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
El anillo bencénico de fórmula I se puede
modificar de diferentes maneras. En una realización, sustituyendo R
en la fórmula II con un grupo alquilo seleccionado del grupo que
consiste en Me, Et, y similares.
En otra realización, optimizando los
sustituyentes en el anillo bencénico con respecto a la posición y la
naturaleza de los sustituyentes. Esto se puede llevar a cabo
colocando el metilo del anillo bencénico en diversas posiciones,
como se muestra en la fórmula III.
\vskip1.000000\baselineskip
El anillo de pirimidina se puede modificar solo
o en combinación con las modificaciones hechas al anillo bencénico.
En una realización, el anillo de pirimidina se modifica eliminando o
sustituyendo el grupo alquilo R de fórmula V con otros grupos
funcionales seleccionados del grupo que consiste en H, Me,
isopropilo (iPr), o similar.
En otra realización, el grupo amino en para (con
respecto al anillo bencénico) se puede eliminar o sustituir por
oxígeno como se muestra en la fórmula VI
En otra realización, el grupo amino en orto (con
respecto al anillo bencénico) se puede eliminar o sustituir por
oxígeno como se muestra en la fórmula VII
En otra realización, ambos grupos amina primaria
se pueden eliminar de la molécula como se muestra en la fórmula
VIII
Todos los compuestos contienen las partes
farmacofóricas que están presentes en la molécula principal mostrada
en la Fórmula I. Estas modificaciones se realizan para retener o
mejorar la potencia, actividad oral y la propiedad farmacéutica de
la molécula. En otras realizaciones, se sintetizan compuestos
completamente nuevos usando química sintética orgánica estándar.
Estos nuevos compuestos retienen las partes farmacofóricas
originales. También se pueden sintetizar análogos de los nuevos
compuestos. En una realización, se puede sintetizar una estructura
que elimina la libertad rotacional entre los dos anillos, como se
muestra en la fórmula XII
En otra realización, se puede sintetizar una
estructura que ata los dos anillos en el grupo
orto-amino, como se muestra en la fórmula XIII.
En otras realizaciones, se pueden sintetizar las
estructuras mostradas anteriormente y en la Figura 3 y sus
análogos.
Algunas de estas estructuras pueden estar
comercialmente disponibles a partir de bases de datos químicas
globales, tales como Available Chemical Directory. Sin embargo,
muchas de las estructuras son nuevas y no están disponibles en las
bases de datos. La síntesis de aquellos compuestos que no están
comercialmente disponibles se pueden llevar a cabo mediante
metodologías sintéticas consolidadas. Hay muchos documentos y
patentes de síntesis que describen la síntesis de todos los
análogos deseados. (Véase, por ejemplo, documento U.S. 3.940.393;
Sardarian, et al., (2003) Org. Biomol. Chem. 21:
960-964; Ross, et al., (1976) J. Med. Chem.
19: 723-725).
\vskip1.000000\baselineskip
El papel del receptor nuclear en las
enfermedades neurodegenerativas tales como ELA, y la modulación de
la ruta asociada con el receptor nuclear, puede ser una diana para
una investigación clínica en ELA u otra enfermedad
neurodegenerativa. Los datos mostrados en la sección de Ejemplos
indican que la pirimetamina y sus análogos desempeñan un papel
disminuyendo la expresión de SOD-1.
El modelo de ratón G93A de SOD1 (copia elevada)
para ELA es un ratón adecuado que posee 23 copias de la mutación de
SOD G93A humana, y está dirigido por el promotor endógeno. La
supervivencia en el ratón depende de las copias. El G93A de copia
elevada tiene una supervivencia media de alrededor de 128 días. Se
observan complejos de peso molecular elevado de la proteína SOD
mutante en la médula espinal, comenzando alrededor del día 30. En
el día 60, se observa astrocitosis reactiva (GFAP reactiva); se
observan microgliocitos activados desde el día 90 en adelante. Los
estudios de Gurney et al. mostraron que, en el día 90, la
astrocitosis reactiva pierde significancia estadística, mientras
que la activación microglial es significativamente elevada y
continúa elevada hasta la etapa final de la enfermedad
(véase Gurney, et al. (1996) Ann. Neurol., 39:
147-5739).
Muchos fármacos que han mostrado eficacia en
este modelo han pasado a ensayos clínicos humanos. La experiencia
con riluzol, el único fármaco aprobado en el tratamiento de ELA,
indica que el modelo de ELA de ratón es un buen factor pronóstico
de la eficacia clínica. Otros fármacos, tales como creatina,
celebrex, coenzima Q10 y minociclina, están bajo evaluación clínica
basándose en estudios en este modelo.
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La pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso según la presente invención se puede incorporar en
composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un
individuo. Típicamente, la composición farmacéutica comprende
pirimetamina o un análogo funcional de la misma y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, "vehículo
farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los
disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la
absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Los
ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o
más de agua, disolución salina, disolución salina tamponada con
fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus
combinaciones. En muchos casos, será preferible incluir agentes
isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol,
sorbitol, o cloruro sódico, en la composición. Los vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas
cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes
o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el período
de caducidad o la eficacia del agente farmacológico.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en
una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de
dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como
disoluciones líquidas (por ejemplo, disolución inyectables e
infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pastillas,
polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del
modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. El
modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo,
intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una
realización preferida, el agente farmacológico se administra
mediante una inyección intraperitoneal.
Típicamente, las composiciones se preparan como
inyectables, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas;
también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución
en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La
preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o
micropartículas tales como polilactida, poliglicolida, o copolímero
para un efecto adyuvante potenciado (véanse, por ejemplo, Langer,
Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28,
97-119 (1997). Los agentes de esta invención
también se pueden administrar en forma de una inyección de depósito
o preparación de implante, que se puede formular de tal manera para
permitir una liberación prolongada o pulsada del ingrediente activo.
La inyección de depósito o preparación de implante puede
comprender, por ejemplo, uno o más de los compuestos de
pirimetamina o análogos funcionales, o comprender una combinación de
diferentes agentes (por ejemplo, pirimetamina y noretindrona).
Las composiciones farmacéuticas típicamente
deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y
almacenamiento. La composición se puede formular como una
disolución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura
ordenada adecuada para una concentración elevada de fármaco. Las
disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando
el compuesto activo (es decir, el agente farmacológico) en la
cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una
combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se
requiera, seguido de la esterilización por filtración.
Generalmente, las dispersiones se preparan
incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene
un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos
de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos
liofilizados estériles para la preparación de disoluciones
inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son
secado a vacío y secado por pulverización, que produce un polvo del
ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional
procedente de una disolución previamente filtrada de forma estéril
del mismo. La fluidez apropiada de una disolución se puede mantener,
por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina,
mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el
caso de dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La absorción
prolongada de composiciones inyectables se puede provocar mediante
la inclusión en la composición de un agente que retrase la
absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina.
La pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso según la invención se puede administrar mediante una
variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el
experto, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de
los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto
activo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto
frente a la liberación rápida, tal como una formulación de
liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos,
y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar
polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como
etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poliácido
glicólico, colágeno, poliortoésteres, y poliácido láctico. Muchos
métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados
o son conocidos generalmente por los expertos en la técnica.
(Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems, J.R Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New
York, 1978; Patentes U.S. n^{os} 6.333.051 de Kabanov et
al., y 6.387.406 de Kabanov et al.).
En ciertas realizaciones, la pirimetamina o un
análogo funcional de la misma para uso según la invención se puede
administrar oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o un
vehículo comestible asimilable. El compuesto anterior (y otros
ingredientes, si se desea) también se pueden encerrar en una cápsula
de gelatina de corteza dura o blanda, se pueden comprimir en
comprimidos, o se pueden incorporar directamente en la dieta del
individuo. Para la administración terapéutica oral, los compuestos
para uso según la invención se pueden incorporar con excipientes y
se pueden usar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos
bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes,
obleas, y similares. Para administrar un compuesto para uso según la
invención mediante administración distinta de la parenteral, puede
ser necesario revestir el compuesto con, o coadministrar el
compuesto con, un material que evite su inactivación.
En ciertas realizaciones, la pirimetamina o un
análogo funcional de la misma para uso según la invención se puede
administrar de forma líquida. Dichos compuestos deberían ser
solubles en una variedad de disolventes, tales como, por ejemplo,
metanol, etanol, e isopropanol. En la técnica se conoce una variedad
de métodos para mejorar la solubilidad de un agente farmacológico
en agua u otras disoluciones acuosas. Por ejemplo, la patente U.S.
nº 6.008.192 de Al-Razzak et al. enseña un
sistema binario hidrófilo que comprende una fase hidrófila y
cualquier tensioactivo, o mezcla de tensioactivos, para mejorar la
administración de compuestos.
También se pueden incorporar en las
composiciones compuestos activos suplementarios. En ciertas
realizaciones, la pirimetamina o un análogo funcional de la misma
para uso según la invención se puede coformular con y/o se puede
coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son
útiles para mejorar la farmacocinética del agente farmacológico. En
la técnica se conoce una variedad de métodos para mejorar la
farmacocinética del uso de la presente invención (véase, por
ejemplo, patente U.S. nº 6.037.157 de Norbeck et al.).
Se han descrito otros métodos para mejorar la
farmacocinética de agentes farmacológicos, por ejemplo en las
patentes U.S. n^{os} 6.342.250 de Masters, 6.333.051 de Kabanov
et al., 6.395.300 de Straub et al., 6.387.406 de
Kabanov et al., y 6.299.900 de Reed et al. Masters
describe un dispositivo de suministro de fármacos y un método para
la liberación controlada de agentes farmacológicamente activos. El
dispositivo de suministro de fármacos descrito por Masters es una
película que comprende uno o más materiales poliméricos
biodegradables, uno o más disolventes biocompatibles, y uno o más
agentes farmacológicamente activos dispersos uniformemente por toda
la película. En la patente U.S. nº 6.333.051, Kabanov et al.
describen una red copolimérica que tiene al menos un fragmento de
polímero de poliamina reticulado, al menos un fragmento de polímero
soluble en agua no iónico, y al menos un agente biológico adecuado,
incluyendo un agente farmacológico. Según las enseñanzas de esta
patente, esta red, denominada como red de nanogel, mejora el efecto
terapéutico del agente farmacológico disminuyendo los efectos
secundarios y aumentando la acción terapéutica. En otra patente, la
patente U.S. nº 6.387.406, Kabanov et al. también describen
otra composición para mejorar el suministro oral de numerosos
agentes farmacológicos.
Otros métodos para mejorar el suministro y
administración de la pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso según la invención incluyen medios para mejorar la
capacidad de dichos compuestos para atravesar membranas, y en
particular para atravesar la barrera hematoencefálica. En una
realización, los compuestos anteriores para uso según la invención
se pueden modificar para mejorar su capacidad para atravesar la
barrera hematoencefálica, y, en una realización alternativa, los
compuestos anteriores para uso según la invención se pueden
coadministrar con un agente adicional, tal como, por ejemplo, un
agente antifúngico, que mejora su capacidad para atravesar la
barrera hematoencefálica. Como alternativa, el suministro preciso de
los compuestos anteriores para uso según la invención en sitios
específicos del cerebro se puede llevar a cabo usando técnicas de
microinyección estereotáctica. Por ejemplo, el individuo que se está
tratando se puede colocar dentro de una base de marco
estereotáctico (compatible con MRI) y después se le pueden hacer
imágenes usando MRI de alta resolución para determinar la posición
tridimensional de la región particular a tratar. Las imágenes de
MRI se pueden transferir entonces a un ordenador que tiene el
software estereotáctico apropiado, y se usa un número de imágenes
para determinar un sitio diana y la trayectoria para la
microinyección del agente farmacológico. El software traduce la
trayectoria en coordenadas tridimensionales que son registradas de
forma precisa para el marco estereotáctico. En el caso de
suministro intracraneal, se expondrá el cráneo, se taladrarán
orificios de preparación por encima del sitio de entrada, y el
aparato estereotáctico se usará para colocar la aguja y asegurar el
implante a una profundidad predeterminada. Los compuestos para uso
según la invención se pueden suministrar a regiones, tales como las
células de la médula espinal, del tallo encefálico, o del cerebro,
que estén asociadas con la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, las
regiones diana pueden incluir el bulbo raquídeo, la protuberancia,
y el mesencéfalo, el cerebelo, el diencéfalo (por ejemplo, tálamo,
hipotálamo), telencéfalo (por ejemplo, cuerpo estriado, corteza
cerebral, o, dentro de la corteza, los lóbulos occipital, temporal,
parietal o frontal), o sus combinaciones.
Los compuestos para uso según la invención se
pueden usar solos o en combinación para tratar trastornos
neurodegenerativos. Por ejemplo, dichos compuestos se pueden usar
conjuntamente con otros moduladores del receptor nuclear existentes,
por ejemplo para producir un efecto aditivo o sinérgico.
Igualmente, dichos compuestos se pueden usar solos o en combinación
con un agente adicional, por ejemplo un agente que
proporciona un atributo beneficioso a la composición terapéutica,
por ejemplo un agente que afecta a la viscosidad de la
composición. La combinación también puede incluir más de un agente
adicional, por ejemplo dos o tres agentes adicionales, si la
combinación es tal que la composición formada puede realizar su
función pretendida. En algunas realizaciones, la invención incluye
una pirimetamina o análogo funcional de la misma para uso según la
invención, junto con, por ejemplo, al menos un compuesto
relacionado con progesterona, tal como noretindrona, o al menos un
compuesto relacionado con estrógeno, tal como estradiol. Para
descripciones de estos compuestos y su administración, véanse las
Solicitudes en trámite junto con la presente tituladas "Modulation
of Neurodegenerative Diseases through the Progesterone Receptor"
y "Modulation of Neurodegenerative Diseases through the Estrogen
Receptor" presentadas el 1 de marzo de 2006.
Los compuestos para uso según la presente
invención se pueden conjugar con sales de ácidos farmacéuticamente
aceptables, para facilitar su almacenamiento prolongado y
dosificación como disoluciones acuosas. Por ejemplo, la sal puede
derivar de un ácido farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, HCl)
con o sin el uso de un vehículo farmacéuticamente aceptable (por
ejemplo, agua). Tales sales pueden derivar de ácidos inorgánicos u
orgánicos, incluyendo por ejemplo ácidos clorhídrico, bromhídrico,
acético, cítrico, fumárico, maleico, bencenosulfónico, y ascórbico.
Las composiciones farmacéuticas obtenidas mediante la combinación
del vehículo y la sal se usarán generalmente en una dosis necesaria
para provocar el efecto biológico deseado. Éste incluye su uso en
una cantidad terapéuticamente eficaz o en una cantidad menor cuando
se usan en combinación con otros agentes biológicamente
activos.
Las composiciones farmacéuticas que se refieren
al uso de la invención pueden incluir una "cantidad
terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente
eficaz" de una pirimetamina o un análogo funcional de la misma
para uso según la invención. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante
períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico
deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos
para uso según la invención puede variar según factores tales como
el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo, y
la capacidad del agente farmacológico para provocar una respuesta
deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es
también aquella en la que cualesquiera efectos tóxicos o
perjudiciales del agente farmacológico están superados por los
efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad
profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a
dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el
resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis
profiláctica se usa en individuos antes de o en una etapa temprana
de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor
que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación dentro del uso de
la presente invención se pueden ajustar para proporcionar la
respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o
profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo
individual, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo
del tiempo, o la dosis se puede reducir o incrementar
proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación
terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones
parenterales en una forma unitaria de dosificación por facilidad de
administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de
dosificación para el uso según la invención aquí se refiere a
unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para
los mamíferos a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad
predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto
terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico
requerido. La especificación de las formas unitarias de
dosificación para uso según la invención está dictada por y depende
directamente de (a) las características únicas del compuesto activo
y el efecto terapéutico o profiláctico particular a lograr, y (b)
las limitaciones inherentes en la técnica de la obtención de tal
compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en
individuos.
Un intervalo ejemplar, no limitante, para una
cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de, por ejemplo,
pirimetamina dentro del uso de la invención es entre 5 mg/día y
alrededor de 200 mg/día, administrada a un individuo, o grupo de
individuos, preferiblemente alrededor de 10 mg/día a alrededor de
150 mg/día, más preferiblemente alrededor de 5 mg/día a alrededor
de 20 mg/día, y lo más preferible alrededor de 3 mg/día a 10 mg/día.
Preferiblemente, la administración de una cantidad terapéuticamente
eficaz de, por ejemplo, pirimetamina dentro del uso de la invención
da como resultado una concentración de agente farmacológico en el
torrente sanguíneo en el intervalo de una concentración 1 nanomolar
(nM) a 100 milimolar (mM). Por ejemplo, un intervalo de
concentración de alrededor de 100 nM a alrededor de 10 mM,
alrededor de 1 nM a alrededor de 1 mM, alrededor de 1 nM a alrededor
de 100 micromolar (\muM), alrededor de 1 \muM a alrededor de
500 \muM, alrededor de 1 \muM a alrededor de 200 \muM, o
alrededor de 10 \muM a alrededor de 50 \muM. Se ha de observar
que los valores de las dosificaciones pueden variar con el tipo y
gravedad de la afección a aliviar. Se entenderá además que para
cualquier individuo particular, los regímenes de dosificación
específicos se deberían de ajustar a lo largo del tiempo según la
necesidad individual y el juicio profesional de la persona que
administra o supervisa la administración de las composiciones
dentro del uso de la invención, y que los intervalos de dosificación
expuestos aquí son solamente ejemplares y no pretenden limitar el
alcance o la práctica del uso de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que la estirpe celular HeLa derivada
de carcinoma de cuello uterino humano (ATCC) expresa la proteína
SOD-1 y ARNm, y se usó como el sistema modelo para
identificar compuestos que inhiben la expresión de
SOD-1. De forma breve, las células se mantuvieron
en medio esencial mínimo de Dulbecco, con elevado contenido de
glucosa, suplementado con glutamina, 4 mM, suero fetal bovino
certificado, 10%, y penicilina, estreptomicina, y nistatina (todos
de Invitrogen). Las condiciones de incubación fueron 37 grados y 99%
de humedad relativa, con CO_{2} a 5%. Los cultivos se hicieron
pasar cuando alcanzaron una confluencia del 90%. Para los
experimentos farmacológicos, las células se colocaron en placas de
96 pocillos tratadas con cultivo tisular estéril, a una densidad de
3.500 células/pocillo en 150 \mul de medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos se disolvieron en DMSO al
100%, a una concentración madre de 10 mM. Los fármacos se obtuvieron
de Microsource Discovery, o de Sigma Aldrich.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras colocar en placas y después de 6 horas de
adhesión, los fármacos se añadieron al medio en una concentración
de 10 \muM. Después de 72 horas de incubación con los fármacos,
las células se fotografiaron a 100X usando un microscopio invertido
y una cámara digital, de forma que se pudo evaluar la citotoxicidad.
Tras la fotodocumentación, el medio se retiró y las células se
lavaron una vez con disolución salina tamponada con fosfato, y
después se añadieron 50 \mul de agua de grado biología molecular
que contiene un cóctel de inhibidor de proteasas. Después de 10
minutos de incubación, las placas se colocaron en -80 grados para
inducir la lisis completa. Las placas se descongelaron entonces y
se transfirieron 25 \mul de cada pocillo en una placa de ELISA
maxsorp revestida con anticuerpo
anti-SOD-1 humana, que contenía 75
\mul de disolución salina tamponada con fosfato. Entonces se
añadió al pocillo un segundo par de anticuerpos (un
anti-SOD-1
policlonal/anti-conejo de cabra conjugado con HRP),
y la incubación se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Al terminar la incubación, la placa se lavó tres veces
(tampón de lavado de KPL Inc.), y se añadió el sustrato de HRP Sure
Blue Reserve. Tras una incubación de 5-10 min., la
reacción (que se había puesto azul en grados variables) se detuvo
mediante adición de un reactivo de parada (KPL). La placa se agitó
entonces suavemente durante 5 segundos, y la absorbancia se leyó a
450 nm en un lector de placas Tecan. La absorbancia de cada muestra
se comparó con una curva estándar de SOD-1 humana
recombinante purificada ensayada en la misma placa ELISA, y se
estimó la inmunorreactividad de SOD-1 (ng/ml) por
comparación con la curva
estándar.
estándar.
Para determinar si los decrecimientos
encontrados en el ensayo de SOD-1 fueron simplemente
el resultado de efectos citotóxicos del tratamiento farmacéutico,
se determinó la proteína total para cada pocillo. Mientras que la
incubación de ELISA estaba en desarrollo, se retiraron de cada
pocillo 10 \mul del lisado que queda, y se colocaron en otra
placa vacía, y se añadió a la proteína el reactivo de Bradford de
BioRad (100 \mul). Después de una incubación de 15 minutos a
temperatura ambiente, la placa se agitó suavemente durante 5
segundos, y la absorbancia se leyó a 595 nm en un lector de placas
Tecan Sunrise. De este modo se determinaron las concentraciones
proteicas en cada placa por comparación con patrones proteicos que
se experimentaron en la misma placa.
Células HeLa a 3500 células/pocillo en una placa
de 96 pocillos se trataron con un compuesto de la presente
invención durante 72 h como antes, y entonces las células se lisaron
y el ARN total se extrajo usando el protocolo y reactivos de
extracción de ARN de Gentra. El ARN purificado se usó entonces como
el molde en una reacción de transcripción inversa usando
Superscript III MMLV Transcriptase cebada con oligoDT. Se llevó a
cabo una reacción de PCR sobre el ADNc resultante, para amplificar
el ADNc correspondiente a SOD-1 humana, la proteína
de unión de la caja TATA humana, y la microglobulina
beta-2 humana. Las reacciones de PCR se llevaron a
cabo en tubos separados durante 20, 25 y 30 ciclos, y después los
amplicones se dejaron correr en un gel de agarosa al 2% que
contiene bromuro de etidio. La fluorescencia emitida por las bandas
teñidas de bromuro de etidio tras la estimulación mediante una
fuente de luz UV se capturó usando una cámara digital. Las imágenes
digitalizadas se analizaron usando ImageJ (NIH), y las bandas para
SOD-1 se compararon con las bandas para la proteína
de unión de la caja TATA y la microglobulina beta2 (estos genes de
mantenimiento no se vieron afectados por los fármacos) mientras
estaban en el intervalo lineal de ciclos, 25 ciclos en estas
condiciones, para determinar los incrementos o disminuciones con
relación a controles.
Se preparó ARNm celular total a partir de
células HeLa con o sin tratamiento usando un minikit de ARN de
Qiagen seguido de un minikit de ARNm oligotex. Se sintetizaron ADNc
bicatenarios a partir de 2 \mug de ARNm total usando el
Superscript Choice System for cDNA synthesis (Invitrogen) con el
cebador T7-(dT)24, siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Los ADNc se limpiaron mediante extracción con
fenol-cloroformo con Phase Lock Gel (PLG), y se
concentraron mediante precipitación con etanol. El ARNc marcado con
biotina se sintetizó a partir de ADNc mediante transcripción in
vitro usando el kit Bioarray HighYield RNA transcript Labeling
Kit (Affymetrix) siguiendo la recomendación del proveedor. Los
productos de la transcripción in vitro se limpiaron usando
columnas RNeasy spin (Qiagen) y se fragmentaron mediante hidrólisis
inducida por metal en tampón de fragmentación (40 mM de
Tris-acetato, pH 8,1, 100 mM de KOAc, 30 mM de
MgOAc). El ARNc fragmentado se sometió entonces a conjuntos de
Affymetrix GeneChip en tampón de hibridación (100 mM de MES, NaCl
1M, 20 mM de EDTA, 0,01% de Tween-20). Las imágenes
de GeneChip se analizaron con Affymetrix Microarray Suite V5.0 y
Affymetrix Data Mining Tool V3.0. Las intensidades de las señales
de todos los conjuntos de sondas se aumentaron en escala hasta un
valor diana de 150. Los resultados de Detection Call, Change Call y
Signal Log Ratio se obtuvieron aplicando los parámetros por defecto
a algoritmos estadísticos para análisis tanto absoluto como de
comparación.
Los animales se sobredosificaron con
pentobarbital sódico (250 mg/kg, i.p.). Se disecaron las médulas
espinales y se homogeneizaron en 20 mM de Tris-HCl,
pH 7,5, 2 mM de DTT, 0,1 mg de leupeptina, 1 mM de EDTA, y 1 mM de
EGTA. El homogenado se centrifugó entonces a 14.000 x g para
peletizar el desecho. La concentración de proteína se midió usando
el ensayo de proteína de BCA (Pierce, Rockford, IL). La proteína (25
\mug) de cada muestra se hizo correr en un gel de
Tris-glicina al 4-20% (Invitrogen,
San Diego, CA). Después de la transferencia, las membranas se
lavaron en PBS, seguido de la incubación toda la noche en tampón de
bloqueo (0,2% de I-block (Applied Biosystems,
Foster City, CA), PBS, y 0,1% de Tween 20). La membrana se sondó
entonces con un anticuerpo anti-SOD1 bovina de
conejo policlonal (Sigma) a una dilución de 1:4000. Después de
varios lavados, las membranas se incubaron con un anticuerpo
secundario conjugado con fosfatasa alcalina (1:5000 en tampón de
bloqueo), y las señales inmunorreactivas se visualizaron usando un
reactivo quimioluminiscente potenciado, CDP Star (Western Star kit;
Tropix). Tras la exposición, las películas se barrieron y después se
importaron en NIH Image para la cuantificación de la densidad de
las bandas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe cómo examinar los efectos
in vitro del fármaco antimalárico, pirimetamina, sobre la
actividad de SOD-1. La estirpe celular HeLa derivada
de carcinoma de cuello uterino humano (ATCC) se cultivó en medio
esencial mínimo de Dulbecco, con concentración elevada de glucosa,
suplementado con glutamina, 4 mM, suero fetal bovino certificado,
10%, y penicilina, estreptomicina, y nistatina (todos de
Invitrogen). Las condiciones de incubación fueron 37ºC y 99% de
humedad relativa, con CO_{2} a 5%. Los cultivos se hicieron pasar
cuando alcanzaron una confluencia de 90%. Para experimentos
farmacológicos, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos
tratadas con cultivo tisular estéril, a una densidad de 3.500
células/pocillo en 150 \mul de medio.
Después de 72 horas de incubación con la
pirimetamina, las células se fotografiaron y se procesaron como se
describe en el Ejemplo 1 (iii). La proteína total de los lisados se
determinó mediante el ensayo de Bradford como se describe en el
Ejemplo 1 (iv). Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 1. Estos resultados muestran que la pirimetamina añadida al
medio de cultivo de células HeLa 72 horas antes de la cosecha redujo
significativamente los niveles de la proteína
SOD-1, mientras que los niveles de proteína total no
se vieron afectados. Esta reducción estaba relacionada con la
dosis, y fue máxima con 10 \muM, con una IC_{50} menor que 3
\muM. La Figura 2 muestra que tanto noretindrona como pirimetamina
(5 \muM) provocó una disminución relacionada con la dosis en ARNm
de hSOD-1 en células HeLa tras el tratamiento de 72
horas.
La alfa-sinucleína ha estado
implicada en trastornos neurodegenerativos caracterizados por
inclusiones de cuerpos de Lewy, tales como enfermedad de Parkinson
(PD) y demencia con cuerpos de Lewy. Las inclusiones similares a
cuerpos de Lewy también se han observado en neuronas espinales de
pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y los informes
sugieren posibles anormalidades de alfa-sinucleína
en pacientes con ELA. La alfa-sinucleína es una
proteína ubicua que comparte homología física y funcional
significativa con la proteína chaperona,
14-3-3, y es particularmente
abundante en el cerebro (Ostrerova, N. et al., J. Neurosci.,
19:5782 (1990)). Un aumento de la velocidad de agregación de
alfa-sinucleína puede contribuir a los mecanismos de
neurodegeneración en enfermedades con cuerpos de Lewy. Los estudios
sobre animales transgénicos también sugieren que la agregación de
alfa-sinucleína es dañina para las neuronas. Se dio
a conocer que se produjo disfunción dopaminérgica en ratones
transgénicos que expresan alfa-sinucleína humana de
tipo salvaje (Masliah, E., et al., Science,
287:1265-1269 (2000)), y que la Drosophila que
sobreexpresa alfa-sinucleína mostró disfunción
dopaminérgica y muerte neuronal dopaminérgica asociada con el
desarrollo de agregados de alfa-sinucleína (Feany, M
B, et al., Nature 404:394-8 (2000)). Las
pruebas sugieren que las neuronas con dopamina desarrollan agregados
de alfa-sinucleína y se degeneran a medida que
estos agregados se desarrollan.
Los resultados del análisis de Genechip
mostrados en la Figura 4 ilustran que la pirimetamina
(ALG-2001) (3 \muM) y noretindrona
(ALG-3001) (3 \muM) disminuyeron sustancialmente
ARNm para alfa-sinucleína en células HeLa tras 4
días de tratamiento. De este modo, los compuestos de la presente
invención pueden ralentizar la neurodegeneración en enfermedades
con cuerpos de Lewy. Esto ilustra un papel para los compuestos de la
presente invención en la ralentización de la progresión o en la
mejora de los efectos de ELA y PD.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de los agentes farmacológicos, por
ejemplo pirimetamina y sus análogos descritos en el Ejemplo 2, se
ensayaron in vivo en el modelo murino SOD-93A
para ELA, y se midió una reducción en los niveles de
SOD-1. La inhibición de la expresión de ARN se
monitorizó mediante muestras de sangre aisladas procedentes del
modelo de ratón de ELA reconocido en la técnica antes y después de
la introducción del compuesto usando técnicas estándar de
RT-PCR. La expresión de la proteína
SOD-1 se determinó usando técnicas de transferencia
Western con un anticuerpo anti-SOD-1
de Sigma.
Como se muestra en las Figuras 5 y 6, el
tratamiento crónico con pirimetamina (10 mg/kg ip X 14 días) redujo
significativamente (P < 0,05, n = 7) la proteína
SOD-1 y alfa-sinucleína en
linfocitos de ratón. Se mostró que los resultados son
estadísticamente significativos usando el análisis de la prueba de
la t de Student. El control fue vehículo (disolución salina).
La pirimetamina crónica (50 mg/kg/d) redujo
significativamente SOD-1 espinal en ratones G93A
tras el tratamiento de 14 días, como se muestra en la Figura 7. La
pirimetamina se administró oralmente durante 14 días. Las médulas
espinales se recogieron y se analizaron mediante análisis de
transferencia Western como se describe anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Un paciente con ELA familiar de 38 años de edad,
voluntario, mostró una reducción significativa en los niveles de
SOD-1 tras el tratamiento oral con pirimetamina (100
mg/d durante 30 días). La Figura 8 muestra los niveles reducidos de
SOD1 linfocíticos en el paciente con SOD1 familiar tras la
administración del fármaco (después del fármaco), en comparación
con antes del tratamiento (antes del fármaco). Se recogieron
aproximadamente 5-8 cc de sangre del paciente. Los
niveles de SOD-1 se analizaron mediante ELISA y
análisis de transferencia Western.
Los efectos in vivo también se pueden
determinar monitorizando la respiración de un sujeto midiendo la
capacidad vital forzada (FVC) usando un espirómetro Renaissance
Puritan Bennett. La fuerza inspiratoria máxima (MIF) también se
puede medir usando un manómetro de mano.
Los efectos de los agentes farmacológicos
moduladores del receptor nuclear, que son pirimetamina o un análogo
funcional de la misma, también se pueden determinar mediante una
puntuación neurológica registrada en una escala de 4 puntos:
- 0 =
- Reflejo normal en las extremidades posteriores (el animal extenderá sus extremidades posteriores cuando es alzado por su cola).
- 1 =
- Reflejo normal (falta de extensión de las extremidades posteriores cuando el animal es alzado por la cola).
- 2 =
- Reflejo anormal y evidencia visible de parálisis.
- 3 =
- Falta de reflejo y parálisis total de las extremidades posteriores.
- 4 =
- Incapacidad para incorporarse por sí mismos cuando se colocan en los lados en 30 segundos, o se encuentran muertos. Los animales se sacrifican en esta etapa si están vivos.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico sobre la puntuación
neurológica, peso corporal y supervivencia se puede llevar a cabo
utilizando ANOVA, Kaplan Meier, la prueba de la t, el modelo de
regresión de Cox de riesgos proporcionales, los métodos logístico y
paramétrico logarítmicos, y los métodos de modelos lineales mixtos.
Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando
procedimientos estándar conocidos en la técnica.
<110> Scott, Sean
\hskip1cmBenjamin, Daniel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Modulación de enfermedades
neurodegenerativas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 106792-0009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Todavía no asignado
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
01-03-2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/658.505
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-03-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\hskip1cm13
Claims (6)
1. Uso de una pirimetamina o un análogo
funcional de la misma para la fabricación de un medicamento para
prevenir el desarrollo de síntomas, o mejorar los síntomas o
progresión de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) mediada por
SOD-1.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
análogo funcional es pirimetamina con al menos una modificación en
el anillo bencénico.
3. El uso de la reivindicación 1, en el que el
análogo funcional es pirimetamina con al menos una modificación en
el anillo de pirimidina.
4. Una pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso en un método para prevenir el desarrollo de
síntomas, o mejorar los síntomas o progresión de esclerosis lateral
amiotrófica (ELA) mediada por SOD-1.
5. Una pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso según la reivindicación 4, en la que el análogo
funcional es pirimetamina con al menos una modificación en el anillo
bencénico.
6. Una pirimetamina o un análogo funcional de la
misma para uso según la reivindicación 1, en la que el análogo
funcional es pirimetamina con al menos una modificación en el anillo
de pirimidina.
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