ES2340978B1 - Metodo de extraccion y deteccion de antigenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal. - Google Patents
Metodo de extraccion y deteccion de antigenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal. Download PDFInfo
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Abstract
Método de extracción y detección de antígenos
de
Anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal.
Anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal.
La presente invención se refiere a un método de
extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en
muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción
se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica,
homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de
pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos
inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que
permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como
anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4,
que por sus características físico-químicas resiste
el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que
se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1ppm con tasas
de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico
ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las
distintas matrices ensayadas.
Description
Método de extracción y detección de antígenos de
Anisakis en alimentos destinados al consumo humano o
animal.
La presente invención se refiere a un método de
extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en
muestras alimentarias para el consumo humano o animal. La extracción
se basa en aplicar soluciones con baja fuerza iónica,
homogeneización, sonicación y diferentes pH a diversos tipos de
pescado ya sean frescos o tratados. La detección se basa en métodos
inmunoquímicos mediante el uso de anticuerpos policlonales que
permiten detectar proteínas antigénicas del parásito así como
anticuerpos policlonales que permiten detectar el alérgeno Ani s 4,
que por sus características físico-químicas resiste
el tratamiento térmico del alimento. El método es sensible, ya que
se puede detectar Ani s 4 en cantidades inferiores a 1 ppm con tasas
de recuperación mayores a un 65%. El método descrito es específico
ya que no muestra reactividad cruzada con componentes de las
distintas matrices ensayadas.
El género Anisakis incluye parásitos
nemátodos que pertenecen a varias especies relacionadas. Mediante el
uso de marcadores morfológicos y genéticos/moleculares actualmente
se reconocen las siguientes especies de Anisakis: Anisakis
pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis
simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica,
Anisakis brevispicuiata o Anisakis paggiae.
Las especies de Anisakis alcanzan la
madurez sexual en el estómago de cetáceos y, menos frecuentemente,
en pinnipedos. Estos mamíferos pueden infestarse por ingestión de a)
hospedadores paraténicos, es decir, peces (principalmente
teleósteos) y cefalópodos (principalmente calamares), que albergan
la tercera fase larvaria del parásito (L3), y b) por ingestión de
krill, como intermedio, que también alberga las larvas L3 (por
ejemplo, ballenas).
Al igual que los mamíferos marinos, los seres
humanos también pueden infestarse por larvas L3 de Anisakis
mediante la ingestión de peces y calamares crudos o poco cocinados
portadores del parásito, lo cual produce una enfermedad clínica
denominada anisakiosis o anisakiasis.
Cuando las larvas L3 de Anisakis infestan
a seres humanos, a menudo causan síntomas gastrointestinales que
pueden estar asociados con reacciones alérgicas de distinta
gravedad. Dependiendo de la localización de las larvas y los
síntomas dominantes, se han presentado cuatro formas clínicas
principales de anisakiosis (gástrica/gastroalérgica, intestinal,
extragastrointestinal y alérgica) en seres humanos. En la forma
gástrica (aguda) de anisakiosis, la larva penetra la pared gástrica
y frecuentemente se observa un curso clínico caracterizado por dolor
epigástrico agudo, náuseas y vómitos unas pocas horas después de la
ingestión de pescado que contenga larvas de Anisakis L3
vivas. Además, también pueden observarse síntomas alérgicos en
individuos sensibilizados (aproximadamente el 10% de los casos).
La presencia de larvas de Anisakis en
pescado produce en el consumidor la infestación por las larvas vivas
cuando se consume el pescado crudo o sometido a tratamientos. La
larva L3 de Anisakis es capaz de segregar proteínas que
pueden producir reacciones alérgicas graves en individuos
sensibilizados. Estas reacciones pueden ser producidas por la
ingestión de las larvas vivas o muertas. Varios de los alérgenos de
Anisakis descritos hasta la fecha son estables a congelación,
altas temperaturas o altas presiones y resistentes a variaciones de
pH y a la acción de enzimas digestivas. En su estructura poseen
entre otros, grupos sulfidrilo (SH) que posibilitan la formación
enlaces covalentes con proteínas de la matriz en la que se
encuentran, lo que puede complicar su extracción y modificar su
capacidad antigénica.
Existen diferentes técnicas de complejidad y
eficacia variables para detectar la presencia de la larva de
Anisakis en el músculo y vísceras de pescado. Se pueden
enumerar las siguientes: Examen visual simple, transiluminación con
luz ultravioleta, digestión, espectroscopia de imagen por
absorción/reflexión, diferencia de conductividad (W093/14400). Todas
ellas tienen como objetivo la detección del parásito vivo o muerto
pero no detectan la presencia de antígenos del parásito en el
músculo del pescado.
Por otra parte han sido descritas técnicas de
detección basadas en secuencias nucleotídicas y peptídicas
pertenecientes a las larvas de Anisakis pero que no están
basadas en la extracción, concentración o captura de los antígenos
de Anisakis a partir de muestras alimentarias (WO2008006927
A1).
El problema técnico que plantea la detección de
antígenos alergénicos de larvas de Anisakis es la dificultad
en la extracción de antígenos propios del parásito que sean válidos
en un paso posterior para inducir la producción de anticuerpos
contra dichos antígenos y/o para que sean detectados por anticuerpos
ya generados con anterioridad.
Se han descrito métodos de extracción de
antígenos que utilizan la incubación de larvas vivas a rangos de pH
similares al del estómago de humanos (ES2209592 y Moneo et
al. (2005) Parasitol. Res.
96(5):285-9). Para una detección precisa se
requiere un proceso de extracción de antígenos que sea robusto,
rápido, eficaz y sencillo que permita la detección de antígenos
presentes en una muestra que contenga o haya contenido larvas de
Anisakis vivas o muertas.
\newpage
En el caso de parásitos de peces que suponen un
riesgo para la salud, como las especies pertenecientes al género
Anisakis, hay que añadir que las matrices varían de un
pescado a otro, incluso tratándose de pescados frescos, y se pueden
modificar al aplicar procesos de conservación y tratamiento
tecnológico debido a la labilidad de las proteínas del pescado y a
la rápida oxidación de sus lípidos. Por ello, es necesario disponer
de un método de extracción sencillo, sin pasos complejos de captura
y aislamiento de un alérgeno de interés en salud humana, que sea
aplicable a diferentes pescados, ya sean frescos, congelados o
cocinados y que permita la detección de antígenos alérgenos en
concentraciones traza.
La presente invención se refiere a un método de
extracción y detección de alérgenos de parásitos de pescado en
muestras alimentarias para el consumo humano o animal. El método
permite la extracción sencilla y eficaz sin pasos de captura y
aislamiento del alérgeno. Además se identifica la presencia de
alérgenos de interés en salud humana. Mediante la aplicación de este
método se extraen alérgenos de Anisakis en concentraciones
inferiores a 1 ppm y con tasas de recuperación superiores a un 65%.
El método es aplicable a diferentes pescados, a muestras procedentes
de diferentes partes del pescado o a otras muestras que contienen
cualquier procesado de pescado. La detección de los antígenos de
Anisakis se lleva a cabo por medio de técnicas inmunoquímicas
basadas en anticuerpos policlonales. Utilizando anticuerpos
policlonales frente a un extracto crudo del Anisakis, se
detectan diferentes proteínas del parásito permitiendo la
identificación de antígenos incluso en los casos en que la
inspección veterinaria no detecta al parásito. Asimismo al utilizar
anticuerpos policlonales dirigidos al alérgeno Ani s 4, se puede
detectar la presencia del alérgeno que, debido a sus propiedades
físico-químicas de bajo peso molecular,
termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones resiste
los procesados, tratamientos o los diferentes procesos culinarios.
El método descrito es específico ya que no muestra reactividad
cruzada con componentes de las distintas matrices ensayadas.
La extracción y posterior detección de algunos
alérgenos en alimentos puede ser complicada ya que suelen estar en
concentraciones traza y en matrices complejas. Además cuando se
trata de alimentos ya elaborados, conservados o cocinados, la
extracción y detección de los alérgenos puede verse alterada por el
procesamiento del alimento. La detección por métodos inmunoquímicos
basados en anticuerpos (ELISA, Western blot, dot blot o tiras
inmunocromatográficas) permite la identificación específica del
alérgeno en el extracto. Sin embargo, la alteración del alérgeno por
el procesamiento del alimento puede alterar su extracción y/o
detección. En la presente invención, esto se soluciona utilizando un
método de extracción sencillo y eficaz y una detección por medio de
anticuerpos policlonales generados contra un extracto crudo del
parásito y/o detectando alérgenos que sean estables y por lo tanto
que puedan ser detectados incluso después de que el alimento sea
congelado, calentado o sometido a otros tratamientos.
El método de la presente invención conduce a un
resultado inesperado, ya que se simplifican los pasos de extracción
de antígenos de Anisakis, consiguiéndose de al mismo tiempo
un efecto sorprendente en la detección posterior de antígenos
específicos de Anisakis, tal como se demuestra en los
ejemplos, obteniéndose una tasa de recuperación del antígeno Ani s
4, inyectado en músculo de pescado, de un 65% y una sensibilidad de
detección de menos de 1 ppm.
En este sentido, el principal aspecto de la
presente invención es un método de extracción y detección de
antígenos del género Anisakis en un alimento destinado al
consumo humano y/o animal que comprende: Obtener la muestra de
alimento. Añadir una solución hipotónica a la muestra de alimento
para fracturar las membranas celulares y homogeneizar para seguir
fracturando las membranas intactas. Sonicar el homogenado para
liberar con mayor eficacia los antígenos. Separar el sobrenadante.
Reducir el pH del sobrenadante hasta un valor igual o menor de 3.
Incubar el sobrenadante. Neutralizar el pH. Separar el sobrenadante
del producto obtenido, en este caso el sobrenadante se denomina
extracto crudo y, analizar el extracto crudo por medio de técnicas
inmunoquímicas.
Los ejemplares del género Anisakis son
nematodos parásitos, cuyo ciclo vital afecta a los peces y mamíferos
marinos. Son infecciosos para los seres humanos y causan
anisakiasis, una reacción alógica severa. Las especies del género
Anisakis a las que se refiere la presente invención se
seleccionan de la lista que comprende, sin limitarse, Anisakis
pegreffii, Anisakis physeteris, Anisakis schupakovi, Anisakis
simplex, Anisakis typical, Anisakis ziphidarum, Anisakis typica,
Anisakis brevispicuiata o Anisakis paggiae.
Preferiblemente se selecciona la especie Anisakis
simplex.
El término "solución hipotónica" hace
referencia a una solución con una concentración de soluto menor que
la concentración de soluto del interior de la célula (citoplasma).
De este modo, en una célula sumergida en una solución hipotónica, el
agua difunde al interior de la célula sin límite y como consecuencia
tiende a romper las membranas celulares, es decir, la célula muere y
se libera el contenido del citoplasma.
El término "homogeneizar" tal como se usa
en la presente invención hace referencia al proceso que permite
romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta
a las paredes de un tubo. El dispositivo que permite la
homogeneización se denomina homogeneizador. Existen homogeneizadores
en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared
para producir homogenizados con un tamaño de partícula
determinado.
El término "sonicar" tal como se usa en la
presente invención se refiere a la aplicación de ultrasonidos a una
suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las
membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y
energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras
subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele
aplicar en frío para evitar el sobrecalentamiento de las muestras
que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.
Por tanto, todas las técnicas descritas
anteriormente se emplean para destruir las células y liberar sus
proteínas. Cada una de las técnicas produce un efecto en la
destrucción de las membranas celulares y todos ellos constituyen una
forma efectiva de extraer las citadas proteínas.
El término "separar el sobrenadante" tal
como se entiende en la presente invención se refiere al
fraccionamiento y selección de la fracción líquida también
denominada sobrenadante. Para ello se emplean técnicas que permiten
la separación de las fracciones sólidas o en suspensión que son
insolubles de las fracciones líquidas que contienen las proteínas
solubles. Preferiblemente la separación se lleva a cabo mediante
centrifugación.
Concretamente, una vez que el homogenado es
sonicado, se procede a su fraccionamiento mediante centrifugación y
se selecciona solamente el sobrenadante.
La reducción del pH se lleva a cabo mediante la
adición de un ácido con el objeto de conseguir un pH por debajo de
3. Se debe mantener en incubación a ese pH. La incubación se realiza
preferiblemente a temperatura ambiente de entre 16ºC y 27ºC. El
objeto de reducir el pH por debajo de 3 es recuperar de forma
específica aquellos antígenos que permanecen solubles a un pH menor
de 3, ya que este pH se aleja del punto isoeléctrico (Pl) de las
proteínas antigénicas (Pl de Ani s 4 = 5,6) que se pretenden
detectar pero no es necesario que las larvas estén vivas. En el pH
que coincide con el Pl de una proteína, ésta se encuentra en las
condiciones de menor solubilidad y por tanto, para poder recuperar
las proteínas en su forma soluble es necesario alejarse lo
suficiente del Pl de los antígenos de interés. A continuación se
neutraliza el pH alcanzando un valor de entre 6 y 8. Preferiblemente
la reducción del pH se lleva a cabo por medio de ácido clorhídrico
(HCl). Asimismo, la neutralización del pH se lleva a cabo
preferiblemente por medio de NaOH.
El análisis del extracto crudo se lleva a cabo
por medio de técnicas inmunoquímicas. Las técnicas inmunoquímicas
permiten la detección de antígenos del género Anisakis. Parte
de los antígenos que se pueden detectar mediante el método descrito
son alérgenos.
Un antígeno es una sustancia que desencadena la
formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmune.
Un alérgeno es una sustancia que puede inducir
en un individuo una reacción de hipersensibilidad en personas
susceptibles. En estas personas se reconoce el alérgeno como
sustancia "extraña" y ajena al organismo en el primer contacto.
En exposiciones posteriores, el sistema inmunológico reacciona a la
exposición de forma exagerada, con liberación de sustancias que
alteran la homeostasis del organismo, lo que da lugar a los síntomas
propios de la alergia.
La inmunoquímica se basa en la utilización de un
anticuerpo específico (policlonal o monoclonal), previamente marcado
mediante un enlace químico con una enzima (preferiblemente por
conjugación) que puede transformar un sustrato en visible, sin
afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el
antígeno, aplicado a una muestra. El complejo
antígeno-anticuerpo así formado, mediante la
utilización de alguna de las enzimas específicas (peroxidasa,
fosfatasa alcalina, etc), permite ser localizado e identificado
dentro de las muestras obtenidas. El análisis del extracto crudo
mediante técnicas inmunoquímicas puede permitir la detección
(presencia) o no (ausencia) de antígenos de Anisakis en
cualquiera de sus fases de desarrollo reconocidos por anticuerpos
específicos.
Una realización preferida es el método descrito
donde además se lleva a cabo la concentración del extracto crudo
obtenido. La concentración se lleva a cabo preferiblemente mediante
precipitación por un alcohol. Preferiblemente el alcohol es etanol
100% (o etanol absoluto) y se añade al extracto crudo en una
relación de 1:5 a 1:9 (extracto crudo:etanol).
En otra realización preferida del método, el
análisis se lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos
policlonales anti-antígeno de Anisakis y de
anticuerpos policlonales anti-Ani s 4.
Utilizando anticuerpos policlonales frente a un
extracto crudo de Anisakis, se detectan diferentes proteínas
del parásito permitiendo la identificación del mismo incluso en los
casos en que la inspección veterinaria no lo detecte. La utilización
de anticuerpos policlonales dirigidos frente al alérgeno Ani s 4,
permite detectar la presencia del alérgeno y debido a sus
propiedades físico-químicas (bajo peso molecular,
termoestabilidad, resistencia a pepsina y a altas presiones, etc.),
se puede identificar en muestras procesadas industrialmente o en
diferentes procesos culinarios.
Otra realización preferida es el método donde el
análisis se lleva a cabo por medio o bien de western blot o
bien de dot blot. El western blot permite la
separación de proteínas desnaturalizadas mediante la implementación
de la electroforesis. Las proteínas son transferidas desde el gel
hacia la membrana (preferiblemente de nitrocelulosa), donde son
examinadas utilizando los anticuerpos específicos para la proteína.
El dot blot permite la detección de las proteínas antigénicas
de interés mediante la aplicación de la mezcla de proteínas o
extracto crudo a una membrana como un punto (dot) y
seguidamente se aplican anticuerpos específicos. El dot blot
permite ahorrar tiempo al no tener que emplear cromatografía o
electroforesis, sin embargo, no ofrece información acerca de los
antígenos detectados, de modo que solamente se puede confirmar la
presencia o ausencia de dichos antígenos. El análisis puede ser
llevado a cabo además, sin limitarse, o bien por medio de la técnica
ELISA o bien por medio de tiras inmunocromatográficas.
Según otra realización preferida más, la muestra
de alimento se obtiene o bien de pescado o bien de cualquier
alimento que contenga cualquier derivado de pescado.
Teniendo en cuenta que los parásitos del género
Anisakis tienen un ciclo vital que afecta a los peces y
mamíferos marinos, la muestra de alimento puede ser pescado fresco,
elaborado, conservado o cocinado, sin limitarse a estos tipos de
pescado. Además, la muestra de alimento también puede obtenerse de
cualquier producto alimentario que contenga cualquier derivado de
pescado, entendiéndose como derivado de pescado cualquier producto
procesado que comprenda cualquier parte del pescado incluyendo
proteínas o extractos de pescado.
El término "pescado" tal como usa en la
presente invención hace referencia a los peces (pescado vertebrado)
o a las especies acuáticas invertebradas (pescado invertebrado) como
por ejemplo, sin limitar, a los cefalópodos, que han sido extraídos
de un medio natural o artificial en el que se estas especies pasan
alguna de las etapas de su ciclo de vida.
En una realización más preferida, la muestra de
alimento se obtiene de un pescado del género Merluccius o
Engraulis. Preferiblemente la muestra de alimento se
selecciona o bien pescado de la especie Merluccius
merluccius, o bien pescado de la especie Engraulis
encrasicholus. La merluza (Merluccius merluccius) y el
boquerón (Engraulis encrasicholus) son los principales
alimentos relacionados en los casos de alergia por Anisakis,
según la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica
(SEAIC).
Según otra realización preferida la muestra de
alimento se obtiene de un pienso. El pienso puede contener cualquier
derivado de pescado y/o puede estar destinado a la alimentación de
especies de acuicultura u otras especies destinadas a consumo
humano.
En otra realización preferida de cualquiera de
los métodos anteriores se extraen y detectan antígenos de la especie
Anisakis simplex.
Según otra realización preferida, el método se
emplea para evaluar la eficacia de los tratamientos de los alimentos
para matar o eliminar parásitos del género Anisakis o
inactivar o suprimir sus alérgenos. Los tratamientos de los
alimentos comprenden el tratamiento térmico (congelación o alta
temperatura), alta presión hidrostática, succión por vacío o
electrocución, sin limitarse a estos tratamientos.
Según la legislación nacional, se fija la
obligatoriedad, para los establecimientos que sirven comida, de
someter todos los pescados que se vayan a servir en crudo o casi
crudos a una temperatura igual o inferior a -20ºC durante 24 horas
una vez que el producto ha alcanzado esta temperatura. Esto incluye
productos de la pesca que han sido sometidos a un proceso de ahumado
en frío en el que la temperatura central del producto no ha
sobrepasado los 60ºC. Igualmente estarán obligados a garantizar la
congelación en las mismas condiciones si se trata de productos de la
pesca en escabeche o salados, cuando este proceso no baste para
destruir las larvas. Mediante el método de la presente invención se
puede evaluar la eficacia de dichos tratamientos en la elaboración
y/o preparación de los productos de la pesca así como determinar la
presencia o ausencia de alérgenos tales como Ani s 4.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
para la extracción y detección de antígenos del género
Anisakis que comprende solución hipotónica, soluciones para
cambiar el pH de los productos obtenidos, anticuerpos policlonales
anti-antígeno de Anisakis y anticuerpos
policlonales anti-Ani s 4.
Las soluciones para cambiar el pH de los
productos obtenidos tal como se describe a lo largo de esta
explicación de la invención, comprenden una solución que reduzca el
pH por debajo de 3 y una solución que neutralice el pH ácido
conseguido tras adicionar la solución anterior.
Según una realización preferida, el kit
comprende, además, instrucciones para llevar a cabo la extracción y
detección de antígenos del género Anisakis. En las citadas
instrucciones se indica el volumen que ha de añadirse a los
productos obtenidos y el orden de adición, así como los pasos
intermedios que han de llevarse a cabo de acuerdo con el principal
aspecto de la presente invención. Es decir, en las instrucciones se
describirá el protocolo que ha de seguirse para llevar a cabo tanto
la extracción de antígenos de Anisakis como la detección de
los mismos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Muestra el proceso de extracción de
proteínas del parásito en muestras de peces.
M: Muestra.
H: Homogeneización.
S: Sonicación.
SOL: solución hipotónica, pH neutro.
B: Bajar el pH del sobrenadante.
N: Neutralizar.
E: Extracto crudo para analizar.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Muestra la detección de antígenos de
Anisaki y del alérgeno Ani s 4 en diferentes pescados de
consumo humano.
M: Merluccius merluccius (Merluza).
E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).
S: Sardina pilchardus (Sardina).
Mu: Mullus spp. (Salmonete).
\vskip1.000000\baselineskip
Anti-E: Anticuerpos anti
extracto crudo.
Anti-Ani s 4: Anticuerpos
anti-Ani s 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3. Muestra la presencia de antígenos y
del alérgeno de Ani s 4 de Anisakis por western blot
en diferentes partes de un mismo pescado.
V: Ventresca. C: Cola.
\vskip1.000000\baselineskip
Anti-E: Anticuerpos anti
extracto crudo.
Anti-Ani s 4: Anticuerpos
anti-Ani s 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Muestra la presencia de antígenos de
Anisakis y del alérgeno Ani s 4 por dot blot en
diferentes pescados.
M: Merluccius merluccius (Merluza).
E: Engraulis encrasicolus (Boquerón).
M1 a M10 y B1 a B10: muestras correspondientes a
distintos ejemplares de merluza (M) y boquerón (E).
\vskip1.000000\baselineskip
Anti-E: Anticuerpos anti
extracto crudo.
Anti-Ani s 4: Anticuerpos
anti-Ani s 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5. Muestra la sensibilidad de detección
de Ani s 4 y recuperación en ensayos de adición.
A: Recuperación y detección de Ani s 4
recombinante inyectado en músculo de bacaladillas (Micromesistius
poutassou).
B: Recuperación y detección de Ani s 4 para
determinar la recuperación del alérgeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 6. Muestra el efecto del pH en la
extracción de Ani s 4.
A: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius
poutassou (bacaladilla) a pH <3.
B: extracción de Ani s 4 en Miicromessistius
poutassou (bacaladilla) a pH 7.
C: extracción de Ani s 4 en Engrauiis
encrasicoius (boquerón) a pH <3.
D: extracción de Ani s 4 en Engrauiis
encrasicoius (boquerón) a pH =7.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el
método de extracción y detección de antígenos de
Anisakis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron 10 g de músculo de bacaladilla con
30 mL de 30 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 6,8. Se
homogeneizó hasta obtener una mezcla homogénea y sin grumos. La
mezcla se sometió a sonicación durante 30 segundos a 18 watts
y se incubó en agitación orbital vertical durante 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación se centrifugó durante 30
minutos a 4000 g y 20ºC, el sedimento se descartó y 5 mL de
sobrenadante se pasaron a un tubo limpio. Se añadió HCl 5N hasta
obtener un pH de 2. Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente y el
pH se neutralizó con NaOH 5N. Seguidamente se incubó a temperatura
ambiente durante 15 minutos y se centrifugó durante 15 minutos a
3000 g y 20ºC. El sobrenadante fue el extracto en el que se
encontraban los antígenos de Anisakis (extracto crudo). Este
proceso puede verse resumido en la Fig. 1.
Un paso alternativo es la concentración del
extracto. Para ello se tomó una alícuota de 1 mi del extracto crudo
y se mezcló con 9 mi de etanol absoluto en reposo y temperatura
ambiente, durante 15 minutos. A continuación se centrifugó durante
15 minutos a 3000 g y 20ºC. Se Descartó el sobrenadante y el
sedimento se resuspendió en 100 \mul de tampón de muestra de
electroforesis.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de proteínas del parásito o del
alérgeno Ani s 4 por western blot se llevó a cabo mediante
los siguientes pasos:
- 1.
- Se hizo un gel de acrilamida al 16%.
- 2.
- Se prepararon las muestras diluyéndolas en un volumen adecuado de tampón de carga. El tampón de carga de muestras para geles de SDS-PAGE estaba compuesto por: 12.5 mi Tris 1 M pH 6.8 (concentración final 125 mM), 40 mi SDS 10% (concentración final 4%), 20 mi Glicerol (concentración final 20%), 2 mi Azul de Bromofenol 0.2% (concentración final 0.042%), se llevó hasta un volumen final de 100 mi con H_{2}O destilada. En caso de requerirse condiciones reductoras, se añadió 5% de 2-Mercaptoetanol fresco.
- 3.
- Se cargaron las muestras en los pocillos del gel de acrilamida.
- 4.
- Se realizó la electroforesis a 40 V/gel (1.2 V/cm^{2}).
- 5.
- Se equilibró el gel y la nitrocelulosa (NC) en tampón de transferencia sometiéndolo a agitación orbital durante 15 minutos (Composición del tampón de transferencia: 50 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.4).
- 6.
- Se llevó a cabo la transferencia por difusión durante toda la noche, temperatura ambiente y agitación.
- 7.
- Se Incubó la NC en el detergente no iónico Nonidet P-40 (NP-40) 3% en solución salina tamponada con fosfato (ClNa 0,15 M, Tampón fosfato pH 7.0) (PBS) a temperatura ambiente en agitación durante 30 minutos.
- 8.
- Se lavó la NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces.
- 9.
- Se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo del parásito o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 2 horas a temperatura ambiente y agitación (Composición de la solución diluyente: 10 mM Tris-salino, 5% de Suero de Ternera Fetal (STF), 1% Tween 20, pH 7.4).
- 10.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 3 veces (Composición de la solución de lavado: 0.5M NaCl, 2 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20).
- 11.
- Se incubó con Antisuero Anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en Solución Diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación.
\newpage
- 12.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta un total de 4 veces.
- 13.
- Se lavó en solución salina a temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de la solución salina: 0.15 mM NaCl.
- 14.
- Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- 15.
- Finalmente se paró la reacción con H_{2}O o PBS y se analizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de los resultados cuando se
analizaron diferentes peces se muestra en la Fig. 2. En la Fig. 3 se
muestra los resultados cuando se analizaron diferentes muestras
extraídas del mismo pez.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de proteínas del parásito o del
alérgeno Ani s 4 por dot blot se llevó a cabo mediante los
siguientes pasos:
- 1.
- Se aplicaron 10 \mul del extracto crudo en una membrana de NC.
- 2.
- Se dejó secar la NC durante 30 minutos a 25ºC.
- 3.
- Se lavó la NC en PBS a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces.
- 4.
- se incubó con antisuero de conejo anti-extracto crudo o con antisuero de conejo anti-Ani s 4 diluidos 1/8000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Composición de la solución diluyente: 10 mM Tris-salino, 5% STF, 1% Tween 20, pH 7.4.
- 5.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces. Composición de la solución de lavado: 0.5M NaCl, 2 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.1% Tween 20.
- 6.
- Se incubó con Antisuero Anti-IgG conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/5000 en solución diluyente durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación.
- 7.
- Se lavó en solución de lavado a temperatura ambiente en agitación durante 5 minutos y se repitió hasta 3 veces.
- 8.
- Se lavó en solución salina temperatura ambiente en agitación durante 1 minuto. Composición de la solución salina: 0.15 mM NaCl.
- 9.
- Se incubó con BCIP-NBT (5-Bromo-4-Choro-3-Indolyl Phosphate-Nitro Blue Tetrazolium) a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- 10.
- Finalmente se paró la reacción con H20 o PBS y se analizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de los resultados se muestra en la
Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon diferentes muestras de 10 gr de
bacaladilla. A cada una se le inyectó una cantidad determinada de
Ani s 4 recombinante (4 \mug, 2 \mug, 1 \mug y 0 \mug), para
obtener las siguientes concentraciones del alérgeno: 0,4 ppm, 0,2
ppm y 0,1 ppm. El recombinante se inyectó en diferentes zonas de
cada muestra de músculo de pescado. El extracto se preparó y
concentró como se ha detallado previamente. La detección de Ani s 4
recombinante se realizó como el ejemplo 2. Como control, se
prepararon diferentes concentraciones (0,4 ppm, 0,2 ppm y 0,1 ppm)
de Ani s 4 en PBS con BSA al 0,5% y se introdujo en los pocillos
correspondientes del gel. La recuperación de Ani s 4 recombinante
superó el 65% y la sensibilidad de detección fue < 1 ppm como se
puede observar en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Para valorar el efecto del pH en la extracción
de antígenos, se inyectó la misma concentración de Ani s 4
recombinante en muestras de bacaladillas y boquerones (4 \mug de
recombinante en 10 gr de pescado; volumen de solución inyectada =
250 \mul repartidos en 4 puntos de inyección por muestra de
pescado). Se siguió el proceso de extracción descrito en el ejemplo
1. Una vez que las muestras fueron homogeneizadas, sonicadas y
centrifugadas, el sobrenadante obtenido se dividió en dos alícuotas
de 15 mi. Una de ellas se mantuvo a pH neutro, mientras que la otra
se acidificó a pH <3. Los siguientes pasos se realizaron como se
ha descrito previamente.
La detección se realizó por inmunoblot con
antisuero específico anti-Ani s 4 como se describe
en el ejemplo 2. En la Fig. 6 se observa una gran diferencia en el
rendimiento de la extracción entre los dos pHs, siendo claramente
superior la extracción a pH ácido.
Claims (11)
1. Método de extracción y detección de antígenos
del género Anisakis en un alimento destinado al consumo
humano y/o animal que comprende:
- a.
- Obtener la muestra de alimento,
- b.
- añadir una solución hipotónica a la muestra del apartado (a) y homogeneizar,
- c.
- sonicar el homogenado del apartado (b),
- d.
- separar el sobrenadante del producto del apartado (c),
- e.
- reducir el pH del sobrenadante del apartado (d) hasta un valor igual o menor de 3,
- f.
- incubar el sobrenadante del apartado (e) y neutralizar el pH,
- g.
- separar el sobrenadante del producto del apartado (f) (extracto crudo) y
- h.
- analizar el extracto crudo del apartado (g) por medio de técnicas inmunoquímicas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 donde además
se lleva a cabo la concentración del extracto crudo obtenido en el
apartado (f) antes del apartado de análisis (h).
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 donde el análisis se lleva a cabo mediante la
utilización de anticuerpos policlonales
anti-antígeno de Anisakis y de anticuerpos
policlonales anti-Ani s 4.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde el análisis se lleva a cabo por medio o
bien de western blot o bien de dot blot.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde la muestra de alimento se obtiene o
bien de cualquier parte procedente de pescado o bien de cualquier
alimento que contenga cualquier derivado de pescado.
6. Método de según la reivindicación 5, donde la
muestra de alimento se obtiene de un pescado del género
Merluccius, Micromesistius o Engraulis.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde la muestra de alimento se obtiene de
un pienso.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 donde los antígenos extraídos y detectados
son de Anisakis simplex.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 para evaluar la eficacia de los tratamientos
de los alimentos contra parásitos del género Anisakis.
10. Kit para la extracción y detección de
antígenos del género Anisakis que comprende solución
hipotónica, solución para cambiar el pH de los productos obtenidos,
anticuerpos policlonales anti-antígeno de
Anisakis y anticuerpos policlonales anti-Ani
s 4.
11. Kit según la reivindicación 10 que además
comprende instrucciones para llevar a cabo la extracción y detección
de antígenos del género Anisakis.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200803495A ES2340978B1 (es) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Metodo de extraccion y deteccion de antigenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal. |
| PCT/ES2009/070573 WO2010066936A1 (es) | 2008-12-10 | 2009-12-10 | Método de extracción y detección de antígenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal |
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| ES200803495A ES2340978B1 (es) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Metodo de extraccion y deteccion de antigenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal. |
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| ES2340978A1 ES2340978A1 (es) | 2010-06-11 |
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| ES200803495A Expired - Fee Related ES2340978B1 (es) | 2008-12-10 | 2008-12-10 | Metodo de extraccion y deteccion de antigenos de anisakis en alimentos destinados al consumo humano o animal. |
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|---|---|---|---|---|
| ES2209592A1 (es) * | 2002-01-25 | 2004-06-16 | Instituto De Salud Carlos Iii. | Metodo para la produccion de antigenos excretores/secretores de parasitos humanos o animales. |
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-
2008
- 2008-12-10 ES ES200803495A patent/ES2340978B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-12-10 WO PCT/ES2009/070573 patent/WO2010066936A1/es not_active Ceased
Patent Citations (2)
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| SOLAS, et al. Anisakis antigens detected in fish muscle infested with Anisakis simples L3. Journal of food protection, junio 2008, vol. 71, páginas 1273-1276. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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