ES2340983T3

ES2340983T3 - Proteinas de retinal translocadas de protones con contenido de todo-trans-retinal constante y fotociclo retardado.

Info

Publication number: ES2340983T3
Application number: ES01960574T
Authority: ES
Inventors: Dieter Oesterhelt; Norbert Hampp; Matthias Pfeiffer
Original assignee: Actilor GmbH
Current assignee: Actilor GmbH
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2010-06-14
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: ATE459641T1; DE50115374D1; DE10048383A1

Abstract

Composición fotocrómica que contiene al menos una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de: (i) Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/o (ii) Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%, que contiene además uno o varios aditivos seleccionados de estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y aditivos absorbentes de luz UV.

Description

Proteínas de retinal translocadoras de protones con contenido de todo-trans-retinal constante y fotociclo retardado.

La invención se refiere a una proteína de retinal translocadora de protones, a una composición fotocrómica que contiene la proteína de retinal translocadora de protones y al uso de la proteína de retinal translocadora de protones y de la composición.

Las halobacterias son arqueas que, además de las bacterias y los eucariotas, forman un tercer dominio de la vida. Las arqueas deben su nombre a los biotopos poco comunes en los que se presentan. Frecuentemente viven en condiciones "arcaicas", es decir, a temperaturas, concentraciones de sales o valores de pH extremos como pudieron haber predominado sobre la antigua superficie terrestre.

Las arqueas halófilas comprenden 9 géneros (por ejemplo, Halobacterium, Haloferax, Natronomonas, etc.) y son en su totalidad extremófilas, es decir, viven en disoluciones salinas cuya concentración va de 2 molar hasta la saturación y que algunas veces todavía presentan adicionalmente valores de pH alcalinos de hasta pH 11. En la naturaleza, las halobacterias son parte de un complejo sistema ecológico. La creciente salinidad con radiación solar permanente en plantas productoras de sal o las condiciones en el Mar Muerto y otras aguas hipersalinas naturales permiten en principio después de los aguaceros anuales el crecimiento fotolitótrofo de la alga verde halotolerante Duniella parva hasta un contenido de sal de aproximadamente el 12%. Después de superar las condiciones óptimas para ella, la Duniella muere y hace posible el crecimiento masivo de arqueas halófilas que, debido a su contenido de carotinoides, frecuentemente conducen a una coloración rojiza de estas aguas.

Las arqueas halófilas poseen, además de la fermentación, respiración aerobia y anaerobia, una posibilidad adicional de transformación de energía que es extraordinaria entre las arqueas: pueden captar y convertir energía mediante fotosíntesis dependiente de retinal. A diferencia de la fotosíntesis verde dependiente de la clorofila, en la captación y transformación de energía sólo participa una única proteína, concretamente una proteína de retinal translocadora de protones impulsada por la luz.

El ejemplo más conocido de una proteína de retinal translocadora de protones es la bomba de protones arqueobacteriana bacteriorodopsina (BR) que aprovecha la energía de la luz directamente para producir un gradiente de protones electroquímico que se transforma en energía química. La bacteriorodopsina es una proteína de la membrana intrínseca con un peso molecular de aproximadamente 26 kDa. La cadena de polipéptidos atraviesa la membrana siete veces y así forma una estructura secundaria de siete regiones transmembrana helicoidales. Un retinal (aldehído de vitamina A) está covalentemente unido a la cadena lateral de una lisina de la séptima hélice en el interior de la proteína. El grupo CH=N formado se llama base de Schiff (SB) y en el estado de partida está protonado en el nitrógeno (SBH). El trabajo de Haupts y col. (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-99, 1999) da una visión general sobre la bacteriorodopsina.

El cromóforo de BR absorbe luz verde amarillenta como máximo a 570 nm de manera que la BR parece violeta para el ojo humano. Después de la absorción de un protón, la proteína experimenta cambios químicos y estructurales que conducen a productos intermedios diferenciables espectroscópicamente medibles. Se denominan con las letras K, L, M, N y O y se indican respectivamente con la longitud de onda de la absorción máxima. El ciclo puede describirse simplificadamente de la siguiente manera:

BR_{570} \rightarrow K_{590} \rightarrow L_{550} \rightarrow M_{410} \rightarrow N_{560} \rightarrow O_{640} \rightarrow BR_{570}

La bacteriorodopsina es hasta la fecha la única proteína de retinal que se presenta en la naturaleza en forma de un cristal bidimensional. En la bacteria, los cristales están localizados en la llamada membrana púrpura. La organización en la membrana púrpura estabiliza la proteína hasta tal punto que ha sido propuesta para una serie de aplicaciones industriales (resumido en Oesterhelt y col., Quarterly Rev. Biophysics 24, 425-478, 1991). A este respecto pueden aprovecharse los cambios que se producen con la iluminación del valor de pH de la disolución, de la tensión eléctrica y del color.

Por tanto, el cambio de color del violeta de la bacteriorodopsina en el estado inicial BR570 al amarillo en el producto intermedio M_{410} es la base para aplicaciones en la tecnología de la información óptica. La descomposición del producto intermedio M_{410} que tiene una vida media de pocos milisegundos es la etapa determinante de la velocidad en este ciclo. La intensidad de la luz y la constante de descomposición térmica del producto intermedio M determinan en el fotociclo la relación de los colores violeta y amarillo.

La parte de retinilideno de la bacteriorodopsina está presente en la oscuridad como una mezcla de configuraciones todo-trans, 15-anti y 13-cis, 15-sin en la relación de aproximadamente 60:40. Sólo la forma todo-trans del cromóforo media en el proceso fisiológico de la translocación de protones y pasa por el producto intermedio amarillo M_{410} ("ciclo trans"). Aunque la absorción de protones en la configuración 13-cis también conduce a un ciclo de cambios de color, el "ciclo cis", sin embargo éste se diferencia del "ciclo trans" en que no se forma ningún producto intermedio amarillo similar a M. Del "ciclo cis" la molécula salta con iluminación con una probabilidad muy pequeña al "ciclo trans". Este cambio del "ciclo cis" al "trans" se denomina adaptación a la claridad de la forma adaptada a la oscuridad. En la práctica esto significa que después de guardar en la oscuridad una muestra (adaptación a la oscuridad), una iluminación inicial sólo conduce a aproximadamente el 60% del producto intermedio M teórico. Mediante otra iluminación, la muestra se adapta poco a poco (adaptación a la claridad) de manera que finalmente todas las moléculas se transfieren al "ciclo trans" y pasan por el producto intermedio M.

El cambio de las moléculas del "ciclo cis" al "trans" conduce a un desplazamiento de varios nm del máximo de absorción y significa una desventaja considerable para el uso de bacteriorodopsinas durante la preparación de productos fotocrómicos, por ejemplo, películas ópticas o tintas de impresión.

Por tanto, sería deseable preparar proteínas de retinal translocadoras de protones cuyo máximo de absorción en estado adaptado a la oscuridad se correspondiera a ser posible de forma exacta al estado adaptado a la claridad. Además, sería ventajoso si pudiera aumentarse la estabilidad del producto intermedio M para poder observar a ser posible de forma exacta el cambio de color de violeta a amarillo de las moléculas presentes en el "ciclo trans".

Según la invención, ahora se proporciona una proteína de retinal translocadora de protones que se selecciona del grupo de:

(i): Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo: contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/o

(ii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuya composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%.

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Por una muteína se entiende proteínas de retinal translocadoras de protones modificadas por una sustitución, deleción o inserción. Las muteínas pueden presentar una o varias mutaciones. Las mutaciones de tipo 1 son a este respecto mutaciones que conducen a un retardo del fotociclo en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1). La medición del fotociclo se realiza a este respecto como se describe, por ejemplo, por Miller & Oesterhelt, Biochem. Biophys. Acta 1020, 57-64, 1990. Las mutaciones de tipo 2 conducen a una elevada constancia en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) del contenido de todo-trans-retinal en la proteína adaptada a la claridad y a la oscuridad. El contenido de todo-trans-retinal se determina a este respecto como se describe por Tittor y col., Biophys. J. 67, 1682-1690, 1994. El porcentaje se refiere al contenido total de los isómeros de retinal determinables mediante el procedimiento mencionado. Normalmente, las mutaciones de tipo 1 y las mutaciones de tipo 2 afectan a distintos aminoácidos. Sin embargo, también es posible que una única mutación presente ambas acciones deseadas y, por tanto, pueda clasificarse al mismo tiempo como mutación de tipo 1 y de tipo 2. En tanto que las proteínas de retinal translocadoras de protones arqueobacterianas que se presentan naturalmente presenten un fotociclo retardado en comparación con la proteína de retinal translocadora de protones más conocida, es decir, la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) y su contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencie entre sí más del 10%, también valen en el marco de la presente invención como muteínas.

El término conocido para el experto "homólogo" designa una semejanza entre dos o más péptidos, polipéptidos o proteínas que puede determinarse mediante la coincidencia entre las secuencias mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, de comparaciones de secuencias asistidas por ordenador (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410). El porcentaje de identidad resulta del porcentaje de intervalos idénticos en dos o más secuencias considerando los huecos u otras particularidades de secuencias. Generalmente se utilizan programas informáticos especiales con algoritmos que consideran los requisitos especiales.

Los procedimientos preferidos para determinar la homología generan inicialmente la mayor coincidencia entre las secuencias investigadas. Los programas informáticos para determinar la c identidad entre dos secuencias comprenden, pero no se limitan a, el paquete informático GCG, incluido GAP (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (12):387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410) (1999)). El programa BLASTX puede obtenerse del Centro nacional de información biotecnológica (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., y col., Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). También puede usarse el conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar el porcentaje de identidad.

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Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos comprenden los siguientes:

100

El programa GAP también es adecuado para el uso con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros por defecto (default parameters) para las comparaciones de secuencias de aminoácidos no cambiando los huecos el valor en los extremos. Por tanto, la invención también comprende proteínas de fusión, es decir, proteínas de retinal translocadoras de protones con una proporción de proteínas de fusión. En secuencias muy cortas en comparación con la secuencia de referencia puede ser además necesario aumentar el valor esperado hasta 100.000 (expectation valué) y dado el caso reducir la longitud de palabra (word size) hasta 2.

Pueden usarse otros algoritmos a modo de ejemplo, valores de apertura de huecos (gap opening penalties), valores de extensión de huecos (gap extensión penalties), matrices comparativas, incluidas las mencionadas en el manual del programa, Wisconsin-Paket, versión 9, septiembre de 1997. La elección depende de la comparación que va a realizarse y además de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, prefiriéndose GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una amplia base de datos de secuencias, prefiriéndose FASTA o BLAST.

Una coincidencia del 40% determinada con el algoritmo anteriormente mencionado se designa en el marco de esta solicitud como el 40% de identidad. Se aplica lo mismo a mayores porcentajes.

Ahora se ha mostrado sorprendentemente que la combinación de una mutación de tipo 1 y una mutación de tipo 2 en la proteína de retinal translocadora de protones según la invención puede conducir a una constancia considerable del contenido de todo-trans-retinal, así como a un retardo del fotociclo. El contenido de todo-trans-retinal de la forma adaptada a la oscuridad de la proteína de retinal translocadora de protones según la invención se diferencia de la forma adaptada a la claridad generalmente en no más del 10%. En formas de realización preferidas, las diferencias son incluso más pequeñas y se encuentran en como máximo el 8 o incluso como máximo el 5%. Además, se ha mostrado sorprendentemente que precisamente las muteínas cuyo contenido de todo-trans-retinal no se diferencia esencialmente en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad, es decir, en no más del 10% presentan un contenido de todo-trans-retinal de al menos el 60% en estado adaptado tanto a la claridad como a la oscuridad. Este efecto secundario inesperado es extraordinariamente ventajoso ya que cualquier aumento de la proporción de las moléculas que participan en el "ciclo trans" conduce con iluminación a un cambio de color más obvio y, por tanto, a una mejora de las propiedades ópticas.

Según la invención se proporcionan muteínas que presentan un contenido de todo-trans-retinal constante en el intervalo de al menos el 60 al 100%, preferiblemente del 62% o 65% al 100%. Mientras que la mayoría de las proteínas de retinal presentan un contenido de todo-trans-retinal en el intervalo del 60 ó 65% al 85%, formas de realización especialmente preferidas prevén un contenido de todo-trans-retinal de al menos el 70% o el 75%, mejor incluso del 80% al 100%.

En una forma de realización preferida, la proteína de retinal translocadora de protones natural cuya(s) muteína(s) presenta(n) las propiedades anteriormente mencionadas es una bacteriorodopsina arqueobacteriana, por ejemplo, una rodopsina halobacteriana, preferiblemente bacteriorodopsina (SEC ID No. 1) de Halobacterium salinarum.

La proteína de retinal translocadora de protones según la invención comprende muteínas con una mutación de tipo 1 y de tipo 2 cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1. En otras formas de realización, la identidad asciende a al menos el 50, 60 ó 70%. En formas de realización especialmente preferidas, la identidad asciende a al menos el 80, 90 ó 95%.

En otra forma de realización preferida, en el caso de la proteína de retinal translocadora de protones se trata de un homólogo con una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o la hélice F presenta al menos el 60% de identidad con las secuencias de aminoácidos correspondientes de la bacteriorodopsina madura de SEC ID No.1. En otras formas de realización preferidas, el porcentaje de la identidad para la hélice C y/o la hélice F se encuentra en al menos el 70, 80 ó 90%, preferiblemente en al menos el 95%. El grado de identidad para la hélice C y F puede ser a este respecto igual o distinto.

El fotociclo de la proteína de retinal translocadora de protones según la invención se retarda por la mutación de tipo 1. El tiempo de ciclo térmico asciende en cualquier caso a más de 10 ms, preferiblemente a más de 1 s o incluso a más de 10 s. En formas de realización especialmente preferidas, el tiempo de ciclo térmico se encuentra en el intervalo de minutos, es decir, asciende a más de 1 min, en otras formas de realización preferidas incluso a más de 5 ó 10 min. Sin embargo, el tiempo de ciclo térmico puede ascender en último extremo hasta 2 horas, pero generalmente a no más de 90 ó 60 min.

La mutación de tipo 1 de la proteína de retinal translocadora de protones puede consistir en un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la proteína natural en el ciclo catalítico. Por tanto, la presente invención comprende proteínas de retinal en las que, por ejemplo, una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la translocación de protones del grupo de los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204 según SEC ID No.1 o de los restos de aminoácidos correspondientes a ellos están modificadas en proteínas homologas. Un intercambio de aminoácidos preferido es D96N, es decir, el aminoácido D de la posición 96 de SEC ID No.1 o el aminoácido correspondiente en una proteína homologa se sustituyen con N. Otros intercambios de aminoácidos preferidos son D38R y D102R y/o D104R.

La mutación de tipo 2 de las proteínas de retinal de las proteínas de retinal según la invención conduce a un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal, y/o posiciones inmediatamente contiguas. Por bolsa de unión a retinal se entiende la suma de aminoácidos que confieren a la base de Schiff del retinal sus propiedades químicas y físicas características. Los aminoácidos o aminoácidos inmediatamente contiguos que forman la bolsa de unión a retinal se seleccionan del grupo de los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145 según SEC ID No.1 o de los restos de aminoácidos correspondientes a ellos en proteínas homólogas. En formas de realización preferidas, la mutación de tipo 2 es V49A, V49G, V49F, L93A, G122K, G122C, G122M, S141A, S141M, M1451, M145F, M145W, M145C o M145K. Estas mutaciones de tipo 2 producen de manera sorprendente una constancia de la proporción de todo-trans en la parte de retinilideno de la bacteriorodopsina en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad.

En la siguiente Tabla se muestran los máximos de absorción y las relaciones de isómeros de retinal del tipo natural de Halobacterium salinarum (WT), de los mutantes de tipo 1 puros D96N, de los mutantes de tipo 2 puros M145F y L93A, así como de las proteínas de retinal según la invención D96N-M145F y D96N-L93A:

1

Las combinaciones especialmente preferidas de mutaciones de tipo 1 y de tipo 2 son, por ejemplo, V49A-D96N, L93A-D96N y M145F-D96N (véase la Figura 1).

En otra forma de realización, las proteínas de retinal según la invención se presentan en forma unida a la membrana presentando la membrana una densidad entre 1,10 y 1,20 g/cm^{3}. En una forma de realización preferida, la densidad asciende a entre 1,175 y 1,185 g/cm^{3}. Se prefiere especialmente la forma de una membrana púrpura con una densidad de 1,18 g/cm^{3}.

Según la invención se proporcionan además ácidos nucleicos que codifican las proteínas de retinal anteriormente descritas. Estos ácidos nucleicos pueden producirse, por una parte, mediante mutaciones de genes ya conocidos para proteínas de retinal translocadoras de protones, por ejemplo, del gen que codifica la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (Dunn y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6744-6748, 1981), por otra parte se preparan de forma completamente sintética según procedimientos conocidos. Como el código genético de las arqueas no se diferencia del de los procariotas y eucariotas, según las reglas conocidas también pueden prepararse ácidos nucleicos previstos para la transformación en halobacterias. No obstante, el experto se esforzará en considerar una utilización de codones adaptada al organismo huésped respectivamente previsto. En el caso de los ácidos nucleicos según la invención puede tratarse de ácidos ribonucleicos y/o ácidos desoxirribonucleicos.

Según la invención se ponen además a disposición vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican la proteína de retinal translocadora de protones. Dependiendo del organismo huésped previsto para este vector, el experto selecciona entre vectores arqueobacterianos, vectores para la expresión en procariotas (E. coli, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, etc.) o eucariotas (levadura, cultivos de células animales (CHO, HeLa, COS, etc.), plantas o células de vegetales, células de insectos).

Según la invención se proporciona además una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de retinal translocadora de protones según la invención o un vector según la invención. En el caso de las células huésped se trata, por ejemplo, de arqueas, preferiblemente halobacterias, con especial preferencia Halobacterium salinarum, cuya transformación se ha descrito (Cline y col., Can. J. Microbiol. 35, 148-152, 1989). Alternativamente, los vectores según la invención también pueden expresarse en E. coli u otros huéspedes procariotas, en caso de necesidad también en las células eucariotas anteriormente mencionadas.

Según la invención se proporciona además una composición fotocrómica que puede contener, adicionalmente a una proteína de retinal translocadora de protones según la invención, estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y/o absorbentes de luz UV y/o sustancias tampón.

La composición fotocrómica según la invención puede contener, por ejemplo, glicerol, polímeros orgánicos y/o disolventes orgánicos.

Las proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención o las composiciones fotocrómicas que las contienen pueden usarse para preparar películas ópticas. La preparación de películas ópticas a partir de bacteriorodopsinas ya se conoce y se ha descrito detalladamente, por ejemplo, en Hampp y col., SPIE 3623, 243, 1999. Una película óptica preparada usando las proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención es adecuada para grabaciones ópticas. Otra posibilidad de uso de tales películas ópticas se da con la interferometría o con el reconocimiento holográfico de patrones. También es posible el uso de películas ópticas como moduladores ópticos de la luz. Además, es posible la preparación de memorias de gran volumen para el almacenamiento óptico de datos (Birge, Scientific American, 1995, 66).

La presente invención proporciona además el uso de una proteína de retinal translocadora de protones y/o una composición fotocrómica como colorante de seguridad. En una primera forma de realización, la proteína de retinal y/o la composición fotocrómica se aplica sobre un documento que requiere seguridad o un objeto que requiere seguridad. En otra forma de realización, la composición fotocrómica (o la proteína de retinal) según la invención aplicada sobre el documento que requiere seguridad o el objeto que requiere seguridad se fija sobre el documento u objeto.

A este respecto, la fijación según de la presente invención puede efectuarse mediante inclusión física o acoplamiento covalente al documento. Según la invención, el documento que requiere seguridad es, por ejemplo, un papel de seguridad, un carnet o un billete de banco. Sin embargo, como documento también puede servir según la invención cualquier otro documento para el que existe una necesidad de seguridad.

Finalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar documentos con característica de seguridad que se caracteriza porque antes, durante o después de la preparación de un documento se aplica de forma habitual una proteína de retinal translocadora de protones según la invención o una composición fotocrómica según la invención y dado el caso se fija.

Las siguientes figuras y ejemplos explican la invención.

La Figura 1 muestra los espectros de absorción de distintas proteínas de retinal translocadoras de protones según la invención en comparación con el espectro del tipo natural o de muteínas con sólo una mutación. Las líneas continuas muestran respectivamente el espectro de absorción en el estado adaptado a la claridad, las líneas discontinuas en el estado adaptado a la oscuridad. En particular muestran:

Figura 1A Halobacterium salinarum natural con la secuencia de aminoácidos de SEC ID No.1. El máximo de absorción en el estado adaptado a la claridad se encuentra en 568 nm, en estado adaptado a la oscuridad en 560 nm.

Figura 1B Espectro de absorción del mutante de tipo 1 D96N. El máximo de absorción se desplaza de 569 nm en el estado adaptado a la claridad hacia 560 nm en el estado adaptado a la oscuridad.

Figura 1C Mutante de tipo 2 V49A. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en el estado adaptado a la oscuridad en 549 nm.

Figura 1D Proteína de retinal según la invención con la mutación doble V49A-D96N. El máximo de absorción de 559 nm en el estado adaptado a la claridad se desplaza 2 nm hacia 557 nm en el estado adaptado a la oscuridad.

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Figura 1E Mutación de tipo 1 L93A. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en estado adaptado a la oscuridad en 541 nm.

Figura 1F Proteína de retinal según la invención con la mutación doble L93A-D96N. El máximo de absorción se encuentra tanto en el estado adaptado a la claridad como en el estado adaptado a la oscuridad en 544 nm. Este mutante doble alcanza en el estado adaptado a la oscuridad una proporción de todo-trans de más del 80%.

Figura 1G Mutación de tipo 2 M145F. El máximo de absorción se encuentra en el estado adaptado a la claridad en 559 nm, en el estado adaptado a la oscuridad en 558 nm.

Figura 1H Proteína de retinal según la invención con la mutación doble D96N-M145F. Este mutante doble alcanza en el estado adaptado a la oscuridad una proporción de todo-trans del 66%; el máximo de absorción se encuentra tanto para la proteína de retinal adaptada a la claridad como para la adaptada a la oscuridad en 560 nm.

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Ejemplo 1 Preparación de una composición fotocrómica

Para la preparación de una composición fotocrómica, las proteínas de retinal translocadoras de protones individuales se obtienen inicialmente o a partir de poblaciones de halobacterias naturales o recombinantemente mediante transformación de Halobacterium salinarum (Cline & Doolittle, J. Bact. 169,1341-1344,1987) según mutagénesis específica de sitio del gen de bacteriorodopsina (Dunn y col., Proc. Natl. Acad. Se., USA 78, 6744-6748). La membrana púrpura de las halobacterias transformadas se aísla y se purifica mediante procedimientos conocidos (Oesterhelt & Stoeckenius, Meth. Enzym. 31, 667-678, 1974). Para la obtención de bacteriorodopsina a gran escala puede utilizarse el procedimiento descrito en la solicitud de patente alemana 199 45 798.0.

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Ejemplo 2 Fijación de la composición fotocrómica sobre una superficie

La composición fotocrómica según la invención puede incluirse, por ejemplo, físicamente en un material de matriz. Concretamente se suspenden homogéneamente, por ejemplo, 10 mg de membrana púrpura que contiene bacteriorodopsina-D96N/M145F en 4 ml de un colorante que endurece por UV (IFS 3000, Firma Schmitt) y se aplica sobre el documento que requiere seguridad. Después de la iluminación UV (según instrucciones del fabricante) del documento marcado de esa forma, las partículas de la membrana púrpura se encuentran en el plástico curado.

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Ejemplo 3 Aplicación de la composición fotocrómica mediante distintos procedimientos Impresión serigráfica

El principio de la impresión serigráfica es la impresión por penetración similarmente a una técnica de estarcido. El molde de impresión está constituido por un tejido de tamiz que se provee de una capa de barrera impermeable al colorante. El motivo de impresión queda abierto. La impresión se realiza mediante la extracción del tamiz relleno con colorante con una rasqueta. El colorante se transmite a este respecto al sustrato que se encuentra debajo. Para la preparación de un colorante para impresión serigráfica, en una disolución de PVA al 7,2% (Mowiol tipo 56-98) se agitan 100 mg/ml de membrana púrpura durante la noche. Cuando coinciden las propiedades reológicas con las de una muestra patrón, la mezcla obtenida puede imprimirse con una máquina de impresión serigráfica convencional.

Impresión offset

En 5 ml de un colorante sin pigmento (empresa Schmitt, UFO1) se agitan a 50ºC 1 g de membrana púrpura. La mezcla así obtenida puede imprimirse mediante la técnica de offset usual.

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Ejemplo 4 Preparación de una característica de seguridad resistente a la abrasión

Puede lograrse una resistencia a la abrasión de la composición fotocrómica laminando, por ejemplo, los documentos recubiertos con proteína de retinal translocadora de protones mediante un aparato de laminado en caliente (GPM, Mylam 9) en una bolsa de láminas de tipo GHQ-120TR a una temperatura de 90 a 140ºC.

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Ejemplo 5 Aumento de la resistencia UV de la característica de seguridad

Para aumentar la resistencia UV de la característica de seguridad según la invención, la composición fotocrómica se mezcla con un absorbente de UV o un derivado del mismo en una concentración del 1 al 30%, preferiblemente del 3 al 10% peso/peso. Los absorbentes de UV preferidos son benzofenona, hidroxinaftoquinona, fenilbenzoxazol, éster de ácido cinámico, sulfonamida y éster de ácido aminobenzoico.

<110> Max-Planck-Gesellschaft

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<120> Composición fotocrómica

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<130> p31928

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<140>

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<141>

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<150> 1

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 248

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<212> PRT

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<213> Malobacterium salinarum

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<400> 1

2

Claims

1. Composición fotocrómica que contiene al menos una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

(i): Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/o

(ii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,

que contiene además uno o varios aditivos seleccionados de estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y aditivos absorbentes de luz UV.

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2. Composición fotocrómica según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

3. Composición fotocrómica según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

4. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

5. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No.1) de Halobacterium salinarum.

6. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

7. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

8. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

9. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que en la proteína natural participan en el ciclo catalítico.

10. Composición fotocrómica según la reivindicación 9, caracterizada porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

11. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

12. Composición fotocrómica según la reivindicación 11, caracterizada porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

13. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una muteína de la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

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14. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

15. Composición fotocrómica según la reivindicación 14, caracterizada porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm^{3}.

16. Composición fotocrómica según la reivindicación 15, caracterizada porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm^{3}.

17. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque están contenidos glicerol, polímeros orgánicos y/o disolventes orgánicos.

18. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

(iii): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,

y/o una composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-17 para preparar películas ópticas.

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19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para la grabación óptica.

20. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para la interferometría.

21. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para el reconocimiento holográfico de patrones.

22. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada como modulador óptico de la luz.

23. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

(iv): Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,

para preparar memorias de gran volumen para el almacenamiento óptico de datos.

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24. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

o una composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 -20 como colorante de seguridad.

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25. Uso según la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones y/o la composición fotocrómica se aplica sobre un documento que requiere seguridad o un objeto que requiere seguridad.

26. Uso según la reivindicación 25, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones y/o la composición fotocrómica aplicada sobre el documento que requiere seguridad se fija sobre el documento o el objeto.

27. Uso según la reivindicación 26, caracterizado porque la fijación se efectúa mediante inclusión física o acoplamiento covalente al documento o al objeto.

28. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un papel de seguridad.

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29. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un carnet.

30. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un billete de banco.

31. Uso según una de las reivindicaciones 18-30, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

32. Uso según una de las reivindicaciones 18-31, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

33. Uso según una de las reivindicaciones 18-32, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

34. Uso según una de las reivindicaciones 18-33, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No. 1) de Halobacterium salinarum.

35. Uso según una de las reivindicaciones 18-34, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

36. Uso según una de las reivindicaciones 18-35, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

37. Uso según una de las reivindicaciones 18-36, caracterizado porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

38. Uso según una de las reivindicaciones 18-37, caracterizado porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que en la proteína natural participan en el ciclo catalítico.

39. Uso según la reivindicación 38, caracterizado porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácido D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

40. Uso según una de las reivindicaciones 18-39, caracterizado porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

41. Uso según la reivindicación 40, caracterizado porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

42. Uso según una de las reivindicaciones 18-41, caracterizado porque es una muteína de bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC 1 D No. 1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

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43. Uso según al menos una de las reivindicaciones 18-42, caracterizado porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

44. Uso según la reivindicación 43, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm^{3}.

45. Uso según la reivindicación 44, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm^{3}.

46. Procedimiento para preparar documentos con característica de seguridad, caracterizado porque antes, durante o después de la preparación de un documento se aplica de forma habitual una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

o una composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-17 y dado el caso se fija.

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47. Procedimiento según la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

48. Procedimiento según la reivindicación 46 ó 47, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

49. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-48, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

50. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-49, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No.1) de Halobacterium salinarum.

51. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-50, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

52. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-51, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

53. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-52, caracterizado porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

54. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-53, caracterizado porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la proteína natural en el ciclo catalítico.

55. Procedimiento según la reivindicación 54, caracterizado porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

56. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-55, caracterizado porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

57. Procedimiento según la reivindicación 56, caracterizado porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

58. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-57, caracterizado porque es una muteína de bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC 1 D No.1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

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59. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-58, caracterizado porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

60. Procedimiento según la reivindicación 59, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm^{3}.

61. Procedimiento según la reivindicación 60, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm^{3}.

62. Composición fotocrómica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 en la que como otro aditivo están contenidas sustancias tampón.