ES2341283T3 - Separacion de analitos mediante masa molecular y carga. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la separación de analitos de acuerdo con su peso molecular, que comprende las etapas de: someter un complejo cargado de dichos analitos a un campo eléctrico usando una matriz que comprende un agente de separación cargado, en el que el agente de separación cargado se distribuye a través de la matriz para crear un gradiente de densidad de carga, separándose de este modo dichos analitos de acuerdo con su carga y peso molecular.
Description
Separación de analitos mediante masa molecular y
carga.
La presente invención se refiere, en general, a
la separación de analitos mediante la aplicación de campo eléctrico
y, más específicamente, a un procedimiento y aparato novedoso para
la separación de analitos de acuerdo con su masa molecular y su
carga, usando una matriz modificada con un agente de separación
cargado.
Las técnicas más ampliamente usadas para la
separación e identificación de productos bioquímicos y otros
analitos implican electroforesis en gel. Las matrices usadas
actualmente para electroforesis en gel incluyen poliacrilamida,
agarosa, gelatina u otros geles formados de polímeros reticulados o
polímeros de cadena larga. En electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE), las proteínas cargadas se separan en geles de
poliacrilamida basándose en su tamaño (masa molecular) en forma
nativa y desnaturalizada. Existen diversos tipos de geles de
poliacrilamida, que varían en el grado de reticulación y la
naturaleza del tensioactivo de desnaturalización incluido en el gel.
El tensioactivo que tiene el uso más extendido es dodecilsulfato
sódico (SDS).
El principio de SDS-PAGE se basa
en el reconocimiento de que la reacción de proteínas de un intervalo
de peso molecular amplio con SDS da como resultado la formación de
un complejo con una proporción de masa a carga constante (1,4 g de
SDS por 1 g de proteína). El complejo de SDS proteína está cargado
negativamente. El depósito de una muestra de proteína
desnaturalizada de SDS en un gel de poliacrilamida y la aplicación
de un voltaje eléctrico provocará que las proteínas se desplacen en
el gel y dará como resultado una separación por tamaño molecular
debido a la dependencia del tamaño del coeficiente de fricción del
complejo de SDS proteína en el gel para proteínas de tamaños
diferentes. Esto da como resultado una dependencia logarítmica de la
movilidad el complejo de SDS proteína de la masa de la proteína. Se
utilizan geles de diferentes densidades para cubrir intervalos de
tamaño molecular específicos. El modo de separación preferido
mediante SDS-PAGE se realiza en geles de gradiente
en los que la densidad de la poliacrilamida se varía desde la parte
superior del gel hasta la parte inferior, típicamente del
4-24% de acrilamida incorporada y posibilita la
separación en un intervalo de tamaño amplio.
Otro procedimiento de separación electroforético
convencional es el enfoque isoeléctrico (IEF), una técnica especial
para separar sustancias anfóteras tales como péptidos y proteínas en
un campo eléctrico, a través del cual existe tanto un voltaje como
un gradiente de pH, ácido en la región del ánodo y alcalino cerca
del cátodo. Cada sustancia en la mezcla migrará hasta una posición
en la columna de separación en la que el pH circundante corresponde
a su punto isoeléctrico. Allí, en forma zwiteriónica sin carga neta,
las moléculas de esa sustancia dejan de moverse en el campo
eléctrico. De ese modo, diferentes sustancias anfóteras se enfocan
en bandas estacionarias estrechas.
Bjellquist y col. en Journal of Biochemical and
Biophysical Methods, 6 (1982), páginas 317-339,
describen una combinación de IEF ("primera dimensión") y
SDS-PAGE ("segunda dimensión").
Otro procedimiento usado comúnmente para la
separación de proteínas basándose en la carga de la proteína es
cromatografía de intercambio iónico (IEC). En IEC, las sustancias
cargadas se separan a través de materiales de columna que portan
una carga opuesta. Los grupos iónicos de columnas intercambiadoras
se unen covalentemente a la matriz de gel y se compensan mediante
concentraciones pequeñas de contraiones, que están presentes en el
tampón. Cuando una muestra se añade a la columna, tiene lugar un
intercambio con los contraiones unidos débilmente. El principio de
IEC incluye dos enfoques diferentes: intercambio aniónico e
intercambio catiónico de acuerdo con la carga de los ligandos en la
resina de intercambio iónico.
Un procedimiento adicional para la separación de
proteínas mediante el tamaño de la proteína es cromatografía de
exclusión por tamaño. Este procedimiento, también conocido como
filtración en gel (GPC) o cromatografía de tamiz molecular, se basa
en el tamaño y la forma diferentes de las proteínas. Las proteínas
de tamaños diferentes penetran en los poros internos de las perlas
hasta grados diferentes. La columna retarda las moléculas de
proteína pequeñas mientras que las moléculas grandes pasan a través
de la misma más rápidamente.
Otros procedimientos para la separación de
proteínas incluyen Electroforesis de Zona Capilar y
electrocromatografía.
Aunque estas técnicas de separación se aceptan y
utilizan de forma universal, las mismas sufren de varias
desventajas y limitaciones. Por ejemplo, las desventajas principales
de SDS-PAGE son las limitaciones en la separación
de proteínas de masa baja y alta (generalmente <10 kD y >200
kD) y la diferenciación de masa muy baja de proteínas pesadas.
Además, el uso de geles de gradiente es complicado y requiere mucho
trabajo. Este procedimiento también sufre de precisión baja y
repetibilidad baja. Finalmente, el uso de geles de densidad alta
puede ralentizar significativamente el procedimiento de
separación.
Otras biomoléculas tales como ácidos nucleicos
(por ejemplo, ADN, ARN) también se pueden separar mediante
electroforesis en gel. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden
separar usando geles de agarosa. Las técnicas usadas actualmente
para separar ácidos nucleicos sufren de muchas de las desventajas y
limitaciones de las técnicas usadas para separar proteínas.
Existe una necesidad no satisfecha en la técnica
de procedimientos para la separación de productos bioquímicos tales
como proteínas, aminoácidos, ADN, ARN y oligonucleótidos que sean
eficaces, rentables y que se puedan utilizar para separar analitos
de un amplio intervalo de peso molecular, tamaño y longitud y que se
puedan adaptar a gran escala (por ejemplo, purificación) y/o
automatizarse.
La presente invención se basa en un principio
novedoso para separar analitos tales como proteínas, péptidos,
aminoácidos, ADN, ARN y oligonucleótidos y otras biomoléculas,
controlando la movilidad electroforética de los analitos en una
matriz (por ejemplo, un gel polimérico, vidrio poroso, otros medios
porosos, perlas poliméricas inmovilizadas en compartimentos
mediante membranas porosas y líquidos de viscosidad alta
inmovilizados en compartimentos mediante membranas porosas)
modificada con un agente de separación cargado. La matriz comprende
regiones estables distribuidas espacialmente cargadas ordenadas en
un orden monótono que conserva secuencia, preferentemente
comenzando con regiones de carga baja y regiones de densidad de
carga baja y terminando con regiones de carga elevada. El intervalo
de densidad de carga en la matriz se solapa con el de un complejo
de analito cargado de forma opuesta (por ejemplo, un complejo de
proteína desnaturalizada-SDS o un fragmento de ADN
o ARN). Cuando se aplica un campo eléctrico externo a una muestra de
la mezcla de complejo cargado depositada en el extremo de carga
baja de la matriz, el complejo se moverá a través de las diferentes
regiones cargadas y ocurrirá el enfoque (inmovilización mediante
neutralización de carga) de analitos diferentes en diferentes
regiones de carga.
Por el contrario a las técnicas de separación
convencionales tales como geles poliméricos, en los que la
separación se basa en la dependencia de la velocidad de migración
(movilidad) del tamaño y la fricción, el principio de separación de
la presente invención se basa en la carga total del complejo de
analito desnaturalizado. Ya que el complejo conserva la proporción
de carga a masa, la carga total del complejo es directamente
proporcional a su peso. En esta situación, en un medio de fricción
baja, los analitos se moverán en un campo eléctrico con movilidad
inicialmente sólo débilmente dependiente del tamaño y perderán su
movilidad sólo cuando alcancen las regiones en las que se neutraliza
su carga.
Este principio de neutralización de carga para
atrapar especies cargadas específicamente es el principio de
funcionamiento de las columnas de intercambio iónico. La presente
invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que este
concepto se puede aplicar a sistemas de separación convencionales
tales como sistemas electroforéticos en gel para generar matrices
novedosas para separar proteínas, ADN, ARN y otras biomoléculas
basándose en su carga total, que corresponde a su masa molecular.
Tales sistemas de separación no se han descrito previamente.
Por tanto, la presente invención proporciona un
procedimiento y un sistema para la separación de analitos,
sometiendo a un complejo cargado de analitos a un campo eléctrico
usando una matriz (preferentemente una matriz de fricción baja) que
comprende un agente de separación cargado, en el que los analitos se
separan en base a su peso molecular, como se define en las
reivindicaciones 1 y 7.
De acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, las escala de masa del analito (por ejemplo, proteína,
péptido, aminoácido, ADN, ARN u oligonucleótido) generada por el
gradiente de carga se puede diseñar para cualquier dependencia
funcional de masa separada de la distancia (por ejemplo, lineal) en
lugar de logarítmica como en los sistemas de separación
convencionales tales como SDS-PAGE. Esto proporciona
una ventaja significativa sobre SDS-PAGE, ya que el
reemplazo de la escala logarítmica por una escala de masa lineal
proporciona precisión mejorada de la determinación de masa y
permite la extensión del intervalo de masa separada en regiones de
masa muy baja y muy alta.
Cuando la matriz es un gel polimérico, los
procedimientos de la presente invención pueden usar cualquier tipo
de gel conocido en la técnica. De acuerdo con una realización
preferida, el gel polimérico es un gel de poliacrilamida. Sin
embargo, también se pueden usar otros geles, por ejemplo, geles de
agarosa, geles compuestos de poliacrilamida-agarosa,
gelatinas y similares. Una de las ventajas de la presente invención
es que la misma favorece el uso de geles de densidad baja para
minimizar la fricción y posibilita el enfoque de proteínas grandes
en un periodo de tiempo relativamente corto. Los geles adecuados
para este tipo de separación incluyen, pero sin limitación, geles
de poliacrilamida de porcentaje bajo (por ejemplo, igual o menor de
aproximadamente el 5%) o geles de acrilamida agarosa compuestos
(por ejemplo, aproximadamente del 2%-5% de acrilamida y
aproximadamente del 0,5%-1% de agarosa).
Otra propiedad importante del procedimiento de
separación propuesto es la comprensión de que la resolución de una
banda separada es independiente de la dimensión del paquete inicial
y depende únicamente del gradiente de la distribución de carga en
el medio de separación (gel). Esta propiedad retira la necesidad de
añadir un gel de apilamiento para compresión de banda como se usa
generalmente en SDS-PAGE convencional. Los efectos
de difusión que influyen de forma marcada en la dimensión final de
las bandas separadas en SDS-PAGE convencional, están
ausentes en el procedimiento nuevo debido al procedimiento de
enfoque.
Los procedimientos de la presente invención se
pueden usar para separar una amplia diversidad de biomoléculas y
otros analitos incluyendo proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos
nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) y oligonucleótidos.
Cuando los analitos que se tienen que separar
son proteínas o péptidos, el complejo de proteína cargado se puede
preparar típicamente poniendo en contacto las proteínas con un
agente desnaturalizante cargado, de forma de obtener un complejo de
proteína desnaturalizada cargado. El agente desnaturalizante puede
ser cualquier reactivo cargado (catiónico o aniónico) y
preferentemente es un detergente. Un ejemplo preferido de un agente
desnaturalizante de este tipo es dodecilsulfato sódico (SDS). Sin
embargo, se pueden usar otros agentes aniónicos o catiónicos
desnaturalizantes y de formación de complejos. Los detergentes
aniónicos incluyen, por ejemplo, dodecilsulfato de Li y
dodecilsulfato de amonio. Los detergentes catiónicos que producen un
complejo cargado positivamente son, por ejemplo, bromuro de
cetil-metil-amonio (CTAB), cloruro
de tetradeciltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilamonio
(DOTMAC) y desoxicolato sódico.
Los procedimientos descritos en el presente
documento son aplicables no sólo a separación de proteínas y
péptidos, sino también a la separación de ácidos nucleicos y
oligonucleótidos. El ADN y otras cadenas de ácido nucleico están
cargadas de forma natural y, por consiguiente, los mismos ácidos
nucleicos pueden formar el complejo de analito cargado que se separa
usando los geles de la presente invención.
En general, el agente de separación cargado
(también denominado en el presente documento medio de separación
cargado) es un material que está cargado positivamente (catiónico) o
negativamente (aniónico) y puede ser típicamente cualquier material
que se use comúnmente en las técnicas de separación de intercambio
iónico (es decir, resinas de intercambio iónico). Como alternativa,
el agente de separación puede ser derivados de acrilamido usados
para la preparación de tiras de enfoque isoeléctrico
(inmobilinas).
Los geles adecuados para su uso en los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, geles de placa, geles planos, geles capilares, geles en
tubo, geles en canales separados (por ejemplo, un canal de gel en
una matriz sólida), columnas de separación o cualquier otra
geometría que conserve la distribución de carga de forma que se
pueda generar un gradiente de densidad de carga. Esto posibilita un
diseño en el que la resolución de masa lineal se puede optimizar
para diferentes regiones de masa.
Otros medios o sustratos adecuados para su uso
en los procedimientos y sistemas de la presente invención son
medios porosos sobre los que se pueden inmovilizar especies
aniónicas o catiónicas cargadas (vidrio poroso, etc.) o líquidos de
viscosidad alta inmovilizados en compartimentos mediante membranas
porosas. Otro medio adecuado puede comprender perlas de polímero
porosas que incorporan el agente de separación cargado, por ejemplo,
perlas de intercambio iónico y colocadas en compartimentos
separados por una membrana porosa.
La cantidad del agente de separación que se
tiene que incluir en la matriz variará dependiendo del tipo de
analito que se esté separando. Por ejemplo, si el analito tiene un
peso molecular elevado, típicamente se usará una concentración más
grande de agente de separación para conseguir una densidad de carga
más elevada y la separación adecuada. Si el analito tiene un peso
molecular bajo, se usarán cantidades y concentraciones de los
agentes de separación más bajas. Las cantidades típicas de agentes
de separación cargados que se tienen que usar en los geles de la
presente invención incluyen desde aproximadamente 0,1 nM hasta
aproximadamente 400 mM de agente de separación cargado.
Los procedimientos novedosos de la presente
invención eliminan la mayoría de las limitaciones de las técnicas
de separación convencionales, tanto prolongado el intervalo de masa
a la región de tamaños de analito bajos y altos como mejorando la
precisión de la determinación de masa en el intervalo completo. Las
ventajas de los procedimientos de la presente invención con
respecto a los sistemas de separación convencionales incluyen: 1)
reemplazo de la escala logarítmica con una escala de masa
prediseñada (por ejemplo, lineal) para precisión mejorada de la
determinación de masa; 2) extensión del intervalo de masa en
analitos de masa baja y alta (por ejemplo, proteínas, ADN, ARN,
etc.); 3) sin efectos de difusión; 4) no hay dependencia de la
anchura de banda separada de las dimensiones de paquete iniciales;
5) la densidad de gel usada en esta aplicación es preferentemente
muy baja lo que facilita el procedimiento de separación (velocidad
de desplazamiento más rápida); 6) no hay necesidad de geles de
gradiente; 7) no hay necesidad de gel de apilamiento; 8)
rentabilidad y 9) debido a la abundancia enorme de resinas de
intercambio iónico y otros medios de separación cargados tales como
inmobilinas, los procedimientos de la invención son fáciles de usar
y se pueden utilizar para separar una gran variedad de analitos de
un amplio intervalo de masa, tamaño o longitud.
Como se ha demostrado en el presente documento,
una ventaja significativa de la presente invención es la capacidad
de separar proteínas en el intervalo de masa bajo, por ejemplo,
entre 1-20 kD. Este intervalo generalmente no se
puede conseguir en SDS-PAGE convencional y se está
volviendo cada vez más importante debido al interés en los péptidos
y proteínas de señalización de masa baja (Peptidome) y en péptidos
que se producen como resultado de la digestión de proteínas
específicas. Adicionalmente, los procedimientos de la presente
invención permiten el fraccionamiento de componente de masa baja a
partir de una mezcla de complejo de proteína atrapando
selectivamente el componente de masa elevada.
Por tanto, la presente invención proporciona un
procedimiento nuevo y versátil y matrices para la separación de
analitos usando técnicas de separación tales como electroforesis.
Los mismos son adecuados para electroforesis plana capilar en tubo,
así como conjuntos de canales múltiples de capilares llenos con
geles de gradiente de carga, conjuntos en serie de compartimentos
específicos con densidad de carga que solapa un intervalo de masa
estrecho, conjuntos en un formato de microplaca (que pueden ser
automatizados), conjuntos de enfoque de masa prediseñados para
masas de proteína específicas en aplicación para diagnósticos de
proteína y de marcador de ADN, dispositivos de inmovilización de
compartimentos múltiples para intervalos de masa específicos
adecuados para fraccionamiento de masa de muestras de complejo de
proteínas o fragmentos de ADN que son susceptibles de aumento de
escala (purificación) y otros sistemas de separación que usan otro
medio de fricción baja, en condiciones ampliamente diferentes.
Por ejemplo, basándose en la capacidad de
inmovilización selectiva (enfoque) de los geles cargados, se puede
construir un sistema de compartimentos múltiples que fraccionará una
muestra de proteína o ADN compleja en masa (tamaño) inmovilizando
las proteínas o fragmentos de ADN en compartimentos específicos de
acuerdo con su tamaño (carga).
La disponibilidad de muchos tipos de resinas de
intercambio iónico cargadas y otros materiales cargados que se
pueden incorporar como medios de separación cargados en geles y
otros medios porosos, permite el uso extensivo de sistemas de la
invención para separar una gran variedad de analitos. Más
importante, la capacidad de generar gradientes de separación
prediseñados proporciona una ventaja enorme con respecto a los
procedimientos practicados actualmente y posibilita la separación
eficaz de analitos a pesos moleculares, tamaños y longitudes muy
altos o muy bajos. De estas manera y de otras, los sistemas de la
presente invención son superiores a los sistemas de separación
convencionales que se usan actualmente.
La presente invención se comprenderá y apreciará
más completamente a partir de la siguiente descripción detallada
considerada junto con los dibujos adjuntos:
Figura 1a, b, c: Ejemplos de gradientes de carga
que se pueden construir en un medio de separación de acuerdo con la
presente invención.
Figura 2: Patrón de separación de masa de
marcadores de peso molecular de proteína coloreados en un gel de
placa.
Figura 3: Distribución de proteínas por masa.
Escala vertical - masa en kilo-Daltons (kD). Escala
horizontal - distancia de bandas diferentes en la imagen del gel
desde el borde superior en milímetros.
Figura 4: Diseño de un patrón de distribución de
carga basado en la Tabla 2a (I) y la Tabla 2b (II) (se conserva el
orden pero no es lineal). Los números en la escala vertical
corresponden al número de composición en las tablas. La escala
horizontal es en kD.
Figura 5: Patrón de separación de una proteína
de hasta 250 kD de acuerdo con la distribución de carga de la Figura
4 (marcadores de proteína: 4 kD - insulina, 22 kD mioglobina, 148 kD
- fosforilasa, 250 kD - miosina).
Figura 6: Separación de proteínas a 400 kD
(colágeno).
Figura 7: Patrón de separación de proteínas en
el intervalo de 100-250 kD a partir de una mezcla
compleja de extracto de semillas de trigo.
Figura 8: Imagen de marcadores de proteína de
masa baja separados en un gel de gradiente de carga.
Figura 9: Patrón de separación de productos de
digestión tríptica de mioglobina (Imagen izquierda - gel de
gradiente de carga, Imagen derecha - gel de PAGE convencional).
Figura 10: Dibujo esquemático de un gel
compuesto (parte superior - sección de inmovilización de
poliacrilamida no cargada, parte inferior - gel de gradiente de
inmobilina de proteína de masa baja).
Figura 11: Imagen de separación de una mezcla de
BSA y productos de tripsinización de BSA en un gel compuesto.
Figura 12: Imagen de separación de mioglobina y
b-lactoglobulina en un gel de resolución en
comparación con SDS PAGE convencional (a - gel cargado de acuerdo
con la presente invención, b - gel convencional).
Figura 13: Dispositivo de fraccionamiento de
masa de compartimentos múltiples (dibujo e imagen de separación de
marcadores de proteína coloreados).
Figura 14: Dibujo esquemático de un dispositivo
de fraccionamiento de masa de compartimentos múltiples basándose en
compartimentos de líquido cargado.
Figura 15: Imagen de SDS-PAGE de
los resultados de fraccionamiento en un dispositivo de
fraccionamiento de dos cámaras.
Figura 16: Dibujo esquemático de un dispositivo
de fraccionamiento de masa de compartimentos múltiples basado en
inmovilización de masa selectiva en perlas de inmobilina PA.
Figura 17: Dibujo esquemático de un dispositivo
de fraccionamiento de masa de compartimentos múltiples en forma de
microplaca.
Figura 18: Imagen de separación de productos de
digestión tríptica de BSA en una microplaca de fraccionamiento de
masa de 70 compartimentos.
Figura 19: Patrón de separación de fragmentos de
ADN.
Figura 20: Distribución de fragmentos de ADN a
lo largo del gel de separación. Eje vertical - longitud de
fragmentos en pb, eje horizontal - distancia en el gel desde el
inicio en mm x 1,72.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de una matriz de separación novedosa para separar
proteínas, péptidos, aminoácidos, ADN, ARN, oligonucleótidos y
otras biomoléculas. La matriz (por ejemplo, una matriz de fricción
baja) está compuesta de un medio tal como un gel polimérico u otro
medio poroso adecuado tal como vidrio poroso, perlas de polímero
porosas inmovilizadas en compartimentos mediante membranas porosas o
un líquido viscoso inmovilizado en un compartimento de membrana
porosa modificado con un agente de separación cargado, que se
distribuye a través de la matriz en regiones cargadas (que pueden
ser continuas o separadas) ordenadas en un orden monótono
conservando la secuencia, preferentemente comenzando con regiones de
carga y densidad de carga baja y finalizando con carga elevada. Un
complejo de analito cargado (por ejemplo, un complejo de proteína
desnaturalizada-SDS) se carga en la matriz,
preferentemente en su extremo de carga baja. Cuando se aplica un
campo eléctrico externo, el complejo migra a través de las
diferentes regiones cargadas y se producirá el enfoque
(inmovilización mediante neutralización de carga) de analitos
diferentes en diferentes regiones de carga. El principio de
separación de la presente invención se basa en la carga total del
complejo de analito, que es directamente proporcional a su peso
molecular o tamaño o longitud. Debido a que los analitos de
diferentes tamaños poseen diferentes cargas, los mismos migrarán de
forma diferente a través de la matriz, consiguiendo de ese modo la
separación de acuerdo con el peso molecular, el tamaño o la longitud
de los analitos.
De acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, la escala de masa del analito (por ejemplo, proteína,
péptido, aminoácido, ADN, ARN u oligonucleótido) generada por el
gradiente de carga tiene una dependencia de la distancia de masa
funcional prediseñada (por ejemplo lineal) en lugar de logarítmica
como en los sistemas de separación convencionales tales como
SDS-PAGE. Los ejemplos no limitantes de la
dependencia de masa funcional que se pueden incorporar en una
matriz se presentan en las Figuras 1a, 1b y 1c. Esto proporciona una
ventaja significativa con respecto a SDS-PAGE, ya
que el reemplazo de la escala logarítmica por una escala de masa
lineal proporciona precisión mejorada de la determinación de masa y
permite la extensión del intervalo de masa separada en proteínas de
masa muy baja y muy alta. La dependencia de distancia de masa se
puede diseñar para tener diferentes pendientes (para gradientes
lineales) en regiones diferentes de la distribución de carga,
permitiendo una separación de alta resolución de los analitos en un
intervalo de peso molecular deseado o dependencia funcional
diferente en regiones diferentes. Esta propiedad es muy importante
para la separación mejorada en el análisis de regiones de masa con
abundancia elevada de proteínas diferentes.
De acuerdo con una realización preferida, el
agente de separación cargado se distribuye a través de la matriz de
forma de crear un gradiente de densidad de carga. Preferentemente,
el gradiente se crea distribuyendo las regiones cargadas en una
secuencia monótona (continua o separada) a través del gel. El
término "monótono" se refiere a un aumento o disminución
ordenado y gradual en el gradiente de densidad de carga. El
gradiente preferentemente comienza con regiones de densidad de
carga baja y termina con regiones de densidad de carga alta.
Una realización alternativa de la distribución
de carga en una matriz está representada por una distribución
constante de las especies cargadas a través de la matriz. Cuando las
biomoléculas se mueven electroforéticamente a través de una matriz
cargada de este tipo cada biomolécula adquirirá una carga eficaz
correspondiente a la diferencia entre su carga específica y la
carga de la matriz. La movilidad electroforética resultante se
modificará de acuerdo con esa carga eficaz y dará como resultado la
redistribución de las bandas de masa en comparación con el patrón
en una matriz no cargada. La elección apropiada de la carga
constante permite mejorar la resolución espacial de bandas de masa
específicas. Una matriz cargada de este tipo se puede usar, por
ejemplo, como un gel de resolución cuando se requiere la separación
mejorada de bandas próximas entre sí.
Existe una gran cantidad de procedimientos y
materiales que posibilitan el diseño de medios de separación
cargados con carga distribuida de forma espacial. En general, todos
esos procedimientos se basan en la incorporación de resinas de
intercambio iónico aniónico o catiónico en concentraciones y
composiciones variables. Los solicitantes de la presente invención
han descubierto que estas resinas, cuando se incorporan en y/o se
inmovilizan en matrices tales como geles, vidrio poroso, perlas o
compartimentos de líquido viscoso, crean entornos locales cargados
como en los medios de intercambio iónico. El diseño de la
concentración local de la especie de intercambio iónico activa de
acuerdo con la distribución de carga esperada de los analitos
desnaturalizados, por ejemplo, proteínas, proporcionará el medio
para separar y segregar los analitos de acuerdo con su tamaño.
La matriz usada en la presente invención
preferentemente es una matriz de fricción baja. La movilidad de
proteínas o fragmentos de ADN cuando un campo eléctrico los empuja
en un medio depende de la carga de la biomolécula y de la fricción
en el medio de separación. Por lo tanto, es provechoso minimizar el
componente de fricción para alcanzar la posición de enfoque
(neutralización de carga) en un tiempo razonable. Una "matriz de
fricción baja" como se usa en el presente documento se define
como una matriz en la que el coeficiente de fricción es comparable
con el coeficiente de fricción en una poliacrilamida al 4% o menor.
Los coeficientes de fricción de geles de poliacrilamida se conocen
de forma rutinaria por un experto en la materia. Los intervalos de
coeficiente de fricción de traslación se pueden obtener a partir de
artículos publicados sobre las movilidades y viscosidades de geles
de concentración diversa, como se conoce por un experto en la
materia. Véase, por ejemplo, Reptation Mechanism in
Protein-Sodium-Dodecylsulfate (SDS)
Polyacrylamide -Gel Electrohpresis Autores: Xuan-Hui
Guo y Sow-Hsin Chen, Physical Review Letters
Volumen 64, Número 21 (1990), Páginas 2579-2582 y
las referencias citadas en el mismo. Los valores obtenidos de
coeficientes de fricción para geles entre el 4%-20% para proteínas
entre \sim 20 kD-200 kD están entre
aproximadamente 10^{-5}-10^{-3} Newton/cm/s. Las
matrices de fricción baja de la presente invención tienen, en
realizaciones representativas, coeficientes de fricción que están
dentro de este intervalo, preferentemente en el extremo inferior del
mismo o coeficientes de fricción que son inferiores a
10^{-5}-10^{-3} Newton/cm/s.
La matriz puede comprender geles sólidos de
densidad baja como poliacrilamida o agarosa que pueden incorporar
los agentes de separación cargados. Como alternativa, se pueden usar
matrices líquidas que son capaces de incorporar las moléculas
cargadas. Tales líquidos pueden ser, por ejemplo, poliacrilamida de
concentración muy baja (por ejemplo, al 1%) que se puede
copolimerizar con inmobilinas. Otra posibilidad son polímeros
lineales, los cuales debido a la carencia de reticulación se
comportan como un líquido viscoso. Otra realización puede ser
mezclas de líquidos no cargados (agua) y perlas de polímero que
incorporan el agente de separación cargado (por ejemplo, perlas de
intercambio iónico preparadas a medida, perlas de poliacrilamida con
inmobilinas, etc.). Ya que la neutralización de carga ocurre
únicamente en las perlas su densidad debe ser lo suficientemente
alta para detener a todas las biomoléculas que se desplazan a través
del medio.
Cuando la matriz cargada es un líquido altamente
viscoso o una mezcla de sólido líquido (perlas) existe la necesidad
de contener el medio que representa una densidad de carga específica
en un compartimento aislado de sus compartimentos vecinos para
evitar la mezcla. Esto se consigue colocando el medio cargado entre
separadores que comprenden membrana no cargada. Una membrana de
este tipo debería permitir el transporte de las biomoléculas
cargadas pero evitar la intermezcla del contenido de cada
compartimento. El material de la membrana no cargada puede ser una
membrana polimérica como agarosa, poliacrilamida, celulosa, etc. El
mismo debe ser tan delgado como sea posible para minimizar el
tiempo de desplazamiento y aún así soportar el contenido del
compartimento. El medio de separación (líquido o mezcla de
líquido-perla) preferentemente no se inmoviliza
sobre la membrana. La membrana sirve únicamente como un separador
físico.
Los ejemplos de tales materiales de intercambio
iónico adecuados como los agentes de separación de carga incluyen
diversas resinas de intercambio iónico orgánicas compuestas de
polielectrólitos de peso molecular elevado. Los ejemplos no
limitantes de resinas de intercambio iónico adecuadas son:
1) Resina de Intercambio Aniónico Dowex 66
2) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
1-X2 (AG 1-X2)
3) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
1-X4 (AG 1-4X)
4) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
1-X8 (AG 1-4X)
5) AG MP-1
6) Amberlite^{TM} IRA-401
7) Amberlite^{TM} IRA-402
8) Amberlite^{TM} IRA-400
9) Amberlite^{TM} CG-400
10) Amberlite^{TM} IRA-904
11) DUOLITE® ^{113}
12) DUOLITE® ^{A161}
13) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
^{2-X8} ^{(AG2-x8)}
14) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
^{2-X10} ^{(AG} ^{2X10)}
15) Amberlite^{TM} IRA-410
16) DUOLITE ^{A116}
17) DUOLITE® ^{A162}
18) Biorex 9
19) Biorex 5
20) DUOLITE ^{A} ^{303}
21) DUOLITE ^{A378}
22) Resina de Intercambio Aniónico Dowex
^{3-X4A} ^{(AG} ^{3-X4A)}
23) Amberlite^{TM} IR-45
24) Amberlit IRA-67
25) Amberlite^{TM} IRA-93
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Otro ejemplo de agentes de separación adecuados
son tampones de acrilamido usados para la preparación de Tiras de
Enfoque Isoeléctrico (inmobilinas). Las inmobilinas son derivados de
acrilamida que son ácidos débiles o bases débiles y tienen la
estructura general
CH_{2}=CH-CO-NH-R,
en la que R contiene un grupo carboxilo o uno amino.
Otra forma de preparar los gradientes de
densidad de carga estable en matrices de gel es incorporando
(polimerizando, inmovilizando) secuencias polipeptídicas en el gel
mediante procedimientos conocidos de electroforesis en gel de
afinidad (usando, por ejemplo, hemoglobina, lectinas, etc.).
Para gradientes cargados negativamente, también
es posible utilizar fragmentos de ADN inmovilizados.
Se pueden obtener densidades de carga deseadas
usando cualquiera de estos reactivos, solos o en cualquier
combinación.
Debe ser evidente para un experto en la materia
que la presente invención no está limitada al uso de los reactivos
descritos anteriormente y que se puede usar cualquier otro reactivo
capaz de crear un gradiente de carga estable a través de un gel
polimérico u otra matriz porosa en los procedimientos y sistemas de
la presente invención.
Los principios de la presente invención
diferencian significativamente del principio de cromatografía de
intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico se basa
en la propiedad anfótera de proteínas y la carga de proteína
específica se determina mediante el pH de la solución tampón que
contiene la mezcla de proteína. La columna de intercambio iónico se
diseña para atrapar mediante neutralización de carga esa proteína
cargada específica mientras que otras proteínas pasan a través de
la columna. De acuerdo con la presente invención cuando se aplica a
la separación de proteínas, cada proteína adquiere una carga
específica mediante la formación de complejo con un agente
desnaturalizante tal como SDS y la carga es proporcional a la masa
de la proteína. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención,
se usa un medio de gradiente de carga y las proteínas se neutralizan
por su carga (masa) independiente de los tampones.
La cantidad de agente de separación cargado que
se tiene que incluir en la matriz variará dependiendo del tipo del
analito que se esté separando. Por ejemplo, si el analito tiene un
peso molecular elevado, se usará típicamente una cantidad mayor de
agente de separación para conseguir la separación adecuada. Si el
analito tiene un peso molecular bajo, se usarán cantidades más
bajas de los agentes de separación. En general, para generar un
gradiente de densidad de carga inmovilizado en un medio de
separación, se tiene que calcular la concentración necesaria de las
especies generadoras de carga que se tienen que incorporar en el gel
en cada punto del gradiente. La densidad de carga se estima a
partir de la concentración y la constante de disociación del
compuesto cargador. La Tabla 1 más adelante presenta algunos
ejemplos de un diseño de un gradiente de concentración en un gel de
poliacrilamida utilizando un agente de separación cargado de
inmobilina con pH=9,3. La constante de disociación conocida para
esta inmobilina particular es \sim0,1 a temperatura ambiente.
Suponiendo una geometría de banda convencional
como en SDS-PAGE, las densidades y volúmenes de
carga en esta tabla corresponden a la neutralización de carga de
cantidades máximas de 1 microgramo de proteína específica.
La Tabla 1 presenta las composiciones de un
gradiente de densidad de carga construido para masas moleculares de
desde 0,1 kD hasta 300 kD.
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Las Tablas 2A y 2B presentan las composiciones
de un gradiente de densidad de carga compuesto a partir de una
mezcla de inmobilinas construidas para masas moleculares de hasta
250 kD.
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La Tabla 3 presenta las composiciones de un
gradiente de densidad de carga compuesto a partir de una mezcla de
inmobilinas construidas para masas moleculares de hasta 400 D.
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La Tabla 4 presenta composiciones seleccionadas
de inmobilinas para enfoque de fragmento de ADN de longitud
específica. Los valores de inmobilinas específicas se proporcionan
en microlitros.
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Los procedimientos de la presente invención se
pueden usar para separar una amplia diversidad de biomoléculas y
otros analitos incluyendo, pero sin limitación, proteínas, péptidos,
aminoácidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN) y
oligonucleótidos. Un complejo cargado del analito se separa usando
los sistemas de la presente invención y se consigue la separación de
acuerdo con el peso molecular, el tamaño o la longitud del
analito.
Cuando los analitos que se tienen que separar
son proteínas o péptidos, típicamente se puede preparar un complejo
de proteína cargado poniendo en contacto las proteínas con un agente
desnaturalizante, de forma de obtener un complejo de proteína
desnaturalizada cargada. El agente desnaturalizante puede ser
cualquier reactivo que, cuando se pone en contacto con las
proteínas, da como resultado un complejo de proteína cargado.
Típicamente el agente de desnaturalización es un detergente y está
cargado positivamente o negativamente. Un ejemplo preferido de un
agente desnaturalizante de este tipo es dodecilsulfato sódico (SDS).
Sin embargo, es evidente para un experto en la materia que el
complejo SDS-proteína es únicamente un ejemplo de
complejos desnaturalizados cargados de proteínas conocidos en la
técnica y que se pueden usar otros reactivos desnaturalizantes y de
formación de complejo en los procedimientos de la presente
invención. Por ejemplo, los detergentes aniónicos son por ejemplo
dodecilsulfato de Li y dodecilsulfato de amonio. Los detergentes
catiónicos que producen un complejo cargado (cargado positivamente)
son, por ejemplo, bromuro de
cetil-metil-amonio (CTAB), cloruro
de tetradeciltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilamonio
(DOTMAC) y desoxicolato de sodio. Los procedimientos de la
invención son aplicables para la separación de complejos de
proteína-detergente como se han enumerado
anteriormente.
Los procedimientos descritos en el presente
documento son aplicables no sólo a separación de proteína y
péptidos, sino también a la separación de ácidos nucleicos y
oligonucleótidos (por ejemplo, fragmentos de ADN). A diferencia del
caso de complejos de proteínas desnaturalizadas en el que el
complejo se carga debido a la presencia del agente desnaturalizante
cargado, el ADN y otras cadenas de ácido nucleico están cargados de
forma natural. Por consiguiente, cuando los analitos que se tienen
que separar son ácidos nucleicos, los mismos ácidos nucleicos
pueden formar el complejo de analito cargado que después se separa
usando los sistemas de matriz porosa de la presente invención. Ya
que la carga total del ADN es proporcional a su masa, mediante el
uso de los procedimientos de la presente invención, se puede
obtener enfoque de cargas diferentes (longitudes) para fragmentos de
ADN en una escala lineal, mejorando de ese modo la diferenciación y
resolución. Esto es opuesto a los procedimientos de separación
convencionales para ADN, que se caracterizan por movilidades que
dependen logarítmicamente de la longitud del
fragmento.
fragmento.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la presente invención
proporciona sistemas que se pueden usar para separar analitos
basándose en el peso molecular de los analitos. En una realización
actualmente preferida, la matriz es un gel polimérico. De acuerdo
con esta realización preferida, los geles de la presente invención
son geles poliméricos que se han modificado para incluir un agente
de separación cargado. Los geles contienen regiones cargadas que dan
como resultado un gradiente de densidad, que puede ser continuo o
separado, distribuido a través del gel. Preferentemente, el
gradiente de carga se crea desde una carga baja hasta una carga
alta.
Se puede usar cualquier tipo de gel polimérico
conocido en la técnica en los procedimientos y sistemas de la
presente invención. De acuerdo con una realización preferida, el gel
polimérico es un gel de poliacrilamida. Sin embargo, también se
pueden usar otros geles, por ejemplo geles de agarosa, geles de
poliacrilamida-agarosa compuestos, gelatina y
similares.
Otra matriz adecuada para la presente invención
son líquidos viscosos como, por ejemplo, poliacrilamida de muy baja
densidad u otras matrices en las que se pueden incorporar los
agentes de separación cargados.
Una de las desventajas de los sistemas de gel
convencionales tales como SDS-PAGE es la necesidad
de usar geles de gradiente con densidades de polímero variables
para abarcar intervalos de masa más grandes. La conducción de la
separación con geles densos puede ralentizar el procedimiento de
separación debido a una velocidad de desplazamiento lenta. Los
procedimientos de la invención utilizan geles de densidad baja o
líquidos densos para minimizar la fricción y posibilitar el enfoque
rápido de proteínas grandes en un tiempo corto. Los geles adecuados
para este tipo de separación incluyen, pero sin limitación,
poliacrilamida de porcentaje bajo (por ejemplo, aproximadamente el
5% o menos) o geles de acrilamida agarosa compuestos
(aproximadamente del 2%-5% de acrilamida y aproximadamente del
0,5%-1% de agarosa). El sistema de gel anterior permite el uso de
poliacrilamida de porcentaje muy bajo como la matriz y sustrato de
tamizado para especies cargadas enlazadas covalentemente mientras
que la agarosa proporciona soporte mecánico.
Los geles adecuados para su uso en los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, geles de placa, geles planos, geles capilares, geles en
tubo, carriles de gel específicos en canales, columnas de separación
o cualquier otra geometría que conserve la distribución de carga.
Esto posibilitará un diseño en el que la resolución de masa lineal
se puede optimizar para diferentes regiones de masa.
\newpage
Para preparar los geles modificados de la
presente invención, el agente de separación cargado se mezcla
típicamente con el resto de los constituyentes del gel y se lleva a
cabo la polimerización y el moldeado del gel como lo conoce un
experto en la materia para cada sistema de gel.
En el caso de un gel de poliacrilamida, el
procedimiento o preparación de un gel de placa con un gradiente de
carga incorporado se puede preparar mediante un procedimiento
convencional de moldeado de geles análogo a la preparación de tiras
de Gradiente de pH Inmovilizado (IPG) con las cantidades
apropiadamente diseñadas de resina de intercambio iónico o
inmobilina. La preparación de bandas de IPG se ha descrito en, por
ejemplo: ELECTROPHORESIS IN PRACTICE por Reiner Westermeier, Segunda
Edición, VCH, 1997.
En el caso de un formato de gel de placa los
procedimientos de la presente invención pueden reemplazar todos los
procedimientos convencionales de SDS-PAGE. En este
caso las proteínas desnaturalizadas de SDS se someten a un
procedimiento electroforético en una forma equivalente al
procedimiento usado actualmente y usando el mismo equipo que se usa
convencionalmente en la técnica.
Las matrices de la presente invención pueden
estar en forma de un gel de película plana delgada o gruesa, que
tiene típicamente un espesor que varía de 0,5 mm a 3 mm y las
dimensiones de típicamente 2 cm x 13 cm hasta 18 cm x 20 cm, las
mismas se pueden llenar en un capilar o tubos que tienen típicamente
un espesor de aproximadamente 50-500 mm, por
ejemplo, 100 mm, 75 mm y 50 mm o pueden estar en forma de un canal
único o canales múltiples con sección transversal de 100
micrómetros x 100 micrómetros o 1 mm x 1 mm y una longitud de 1 cm
hasta 20 cm.
Provechosamente, las matrices de la presente
invención se pueden aplicar y extender a sistemas de conjuntos
múltiples tales como conjuntos en serie de compartimentos
específicos con densidad de carga que se solapa con un intervalo de
masa específico unido por un medio de fricción baja, conjuntos en un
formato de microplaca, conjuntos de enfoque de masa prediseñados
para masas de proteína específicas en aplicación para diagnósticos
de proteína y de marcador de ADN, dispositivos de inmovilización de
compartimentos múltiples para intervalos de masa específicos
adecuados para fraccionamiento de masa de muestras complejas de
proteínas o fragmentos de ADN y susceptibles de aumento de escala
(purificación) y otros sistemas de separación que usan otros medios
de fricción baja, en condiciones ampliamente diferentes. Por
ejemplo, basándose en la capacidad de inmovilización selectiva
(enfoque) de los geles cargados, se puede construir un sistema de
compartimentos múltiples que fraccionará una muestra de proteína o
ADN compleja por masa (tamaño) inmovilizando las proteínas o
fragmentos de ADN en compartimentos específicos de acuerdo a su
tamaño (carga).
Los procedimientos de la invención reemplazan
todos los procedimientos de separación de SDS-PAGE y
se pueden usar para la detección de cantidades muy pequeñas de
proteínas en un compartimento específico con una carga específica.
Una aplicación importante de la tecnología se refiere a la capacidad
de la separación de proteínas por masa con una resolución
predeterminada (0,5-1 kD) en un formato y tamaño
conveniente de 1 ó 2 dimensiones.
El dispositivo similar a microplaca, en una
realización, comprende canales específicos (píxeles de masa) de
geles cargados, poseyendo cada píxel una densidad de carga para
enfocar una masa específica. Los píxeles específicos se pueden
interconectar en serie con un puente de un gel no cargado de
fricción baja (por ejemplo, agarosa) o con interconexiones
líquidas. El dispositivo de microplaca puede ser automático usando
técnicas de automatización conocidas comúnmente en el campo.
Tal conjunto lineal interconectado cubrirá un
intervalo de masa específico con la resolución de masa
predeterminada. Los conjuntos lineales colocados en paralelo,
correspondiendo cada uno a un intervalo de masa diferente darán
como resultado un conjunto 2D que cubre un intervalo de masa deseado
desde péptidos de masa muy baja hasta proteínas de masa elevada.
Por ejemplo, las dimensiones totales de una microplaca de 2D con una
resolución de 1 kD en el intervalo de 1-500 kD
puede tener típicamente dimensiones de aproximadamente 7x7 cm.
Usando la misma configuración es posible diseñar
una microplaca que enfoque únicamente proteínas predeterminadas con
propósitos de diagnóstico. Si se emplea con marcadores de color
fluorescentes o marcadores radiomarcados, una microplaca de este
tipo posibilitará la lectura rápida para la detección de marcadores
de proteína específicos.
La invención también se puede usar para enfocar
complejos de proteína-anticuerpo en compartimentos
prediseñados para aplicaciones de diagnóstico, así como para la
separación de resolución alta de fragmentos de ADN.
Además de los geles poliméricos (por ejemplo,
geles de poliacrilamida, geles de agarosa y geles de composición de
poliacrilamida-agarosa), otros medios o sustratos
adecuados para su uso en los procedimientos de la presente invención
son medios en los que se pueden inmovilizar especies aniónicas o
catiónicas cargadas, tales como vidrio poroso, polímeros líquidos de
viscosidad alta, perlas poliméricas etc.
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Un gel de placa de poliacrilamida al 10% de
gradiente de carga de 8 cm de largo y 0,7 cm de ancho se preparó
apilando y polimerizando capas de 40 x 2 mm de alto de solución de
poliacrilamida mezclada con diversas concentraciones de inmobilina
pH 9,3 de acuerdo con la Tabla 1. Esto dio como resultado un gel con
un gradiente de carga incorporado que comenzaba desde una carga y
densidad de carga muy baja y terminaba en una carga alta. El
gradiente de carga se calculó que era lineal hasta un grado
apreciable.
Después de la polimerización, se depositó una
muestra de marcadores de peso de masa de proteína coloreada
desnaturalizada de SDS (solución de SDS al 0,14% incubada con
solución de marcador al 0,1% en DDW compuesto de alfa y beta
insulina, aprotinina, lisozima, inhibidor de tripsina, anhidrasa
carbónica y ovoalbúmina) mediante procedimientos convencionales en
el gel de placa y se sometió a un campo eléctrico de 100 V durante 2
horas en un tampón de DDW.
En la Figura 2 se muestra un patrón de
separación de masa obtenido mediante el procedimiento de separación.
Como se muestra, se obtuvo un patrón de separación de alta calidad
de marcadores de masa en el intervalo de masa de 2,5 kD y hasta 45
kD. Los resultados demuestran la aplicabilidad del procedimiento
para la separación de proteínas por masa.
La distribución de masa de las proteínas en el
gel ha mostrado ser hasta un grado alto lineal en distancia. La
Figura 3 es un gráfico que muestra la distribución de las proteínas
en masa. La escala vertical representa la masa en kilo Daltons (kD)
y la escala horizontal representa la distancia en milímetros de
bandas diferentes en la imagen de gel desde el borde superior. El
reemplazo de la escala logarítmica de sistemas electroforéticos
convencionales con la escala lineal proporciona ventajas
significativas, tales como precisión mejorada de la determinación
de masa y la capacidad de optimizar la separación para diferentes
regiones de masa, incluyendo intervalos de peso molecular muy bajo y
muy alto.
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Este Ejemplo demuestra la flexibilidad de diseño
de los gradientes de densidad de carga de la presente invención. Un
gradiente de carga que se extiende a masa de proteína elevada se
diseñó de acuerdo con la Tabla 2, que se basa en una combinación de
varias inmobilinas con diferentes pH. Basándose en este gradiente,
un gel de placa de poliacrilamida al 4% con dimensiones de 8 cm de
largo, 2 cm de ancho y 0,5 mm de espesor se polimerizó a partir de
capas apiladas de 2 mm de acuerdo con los valores expuestos en la
Tabla 2 en una secuencia como se presenta en la Figura 4. Una
muestra de proteínas constituida por: insulina (4 kD), mioglobina
(22 kD), Fosforilasa (148 kD) y Miosina se separó mediante los
procedimientos de la invención. El tiempo de separación fue 3 h a
150 V en un tampón de DDW. En la Figura 5 se proporciona un patrón
de separación de masa obtenido por el procedimiento de separación.
Como se muestra, se consiguió un patrón de separación de alta
calidad de una proteína con un peso molecular de 250 kD.
Los resultados demuestran la aplicabilidad del
procedimiento para la separación de proteínas de pesos moleculares
elevados y la capacidad de procedimiento para diseñar geles para
regiones de masa específicas.
Los procedimientos de la presente invención
también se pueden usar para separar proteínas de pesos moleculares
incluso más altos. La Figura 6 muestra la extensión del intervalo de
proteínas hasta 400 kD, usando un gel de gradiente basado en la
Tabla 3.
Además, se preparó un gel de gradiente de carga
lineal basándose en la Tabla 2a y 2b por el procedimiento descrito
anteriormente. Una muestra desnaturalizada constituida por un
extracto de semillas de trigo se separó usando el procedimiento
como se ha expuesto en el Ejemplo 2. La Figura 7 representa el
patrón de separación de proteínas por encima de 100 kD.
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Este ejemplo demuestra la aplicabilidad de la
invención para separar proteínas en el intervalo de masa baja entre
1-20 kD. Este intervalo generalmente no se consigue
en SDS-PAGE convencional y se ha vuelto más y más
importante debido al interés en péptidos y proteínas de señalización
de masa baja (Peptidome) y en péptidos que se producen como
resultado de la digestión de proteínas específicas.
Las proteínas usadas en este ejemplo eran
marcadores de masa molecular (intervalo de PM
2.512-16.949) (Amersham - GE, Código N
80-1129-83). El gel de gradiente de
inmobilina PA al 4% usado en este ejemplo se preparó con tampón de
inmobilina pKa 10,3 (Nº de cat. 01741, Fluka). Se prepararon las
siguientes soluciones de monómero de partida:
Solución de Inmobilina de
concentración elevada
(H-IMB)
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Solución de Inmobilina de
concentración
baja
Las soluciones anteriores se usaron para moldear
y polimerizar minigeles de gradiente de 0,75 mm de espesor
(0-18 mM de Inmobilina) empleando un mezclador de
gradiente comercial (Amersham).
La composición del Tampón de Gel (Tris/Acetato
0,48 M pH 6,4) era la siguiente:
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Materiales de partida:
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La separación de proteínas se desarrolló en un
sistema horizontal Multiphor II (Amersham) con un tampón de ánodo y
de cátodo de la manera siguiente:
Tampón de electrodo de cátodo (Tris 0,1 M,
Tricina 0,1 M y SDS al 0,1%)
Tampón de electrodo de ánodo (Tris 0,1 M,
Acetato 0,1 M y SDS al 0,1%).
Condiciones de desarrollo:
La imagen de la separación de los marcadores de
masa baja se muestra en la Figura 8. La Figura 9 presenta una imagen
de separación obtenida a partir de la electroforesis de productos de
una digestión tríptica de mioglobina separada en el gel de gradiente
de inmobilina descrito anteriormente (izquierda) junto con el
resultado de separación obtenido en una SDS-PAGE
convencional (derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra la aplicabilidad del
procedimiento de la invención para el fraccionamiento de componente
de masa baja a partir de una mezcla de proteínas compleja
inmovilizando selectivamente el componente de masa elevada. Para
ese propósito se preparó un gel de poliacrilamida como se presenta
en la Figura 10. El gel estaba constituido por dos partes: la capa
superior de PAAG al 15% (15 mm de longitud, 85 de anchura) sirvió
como la capa de inmovilización para el BSA de masa elevada no
tratado y un gel de gradiente de inmobilina de PAAG al 4% (77 mm de
longitud; 85 mm de anchura) para la separación de péptidos en el
intervalo de hasta 20 kD.
El gel de gradiente de inmobilina (PA al 4%,
concentración de inmobilina 0-25 mM) se preparó
mediante el siguiente procedimiento: se usó tampón de inmobilina pKa
10,3 (nº de Cat 01741, Fluka) para la creación de gradientes de
inmobilina.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de Inmobilina de
concentración
alta
Solución de Inmobilina de
concentración
baja
Las soluciones anteriores se usaron para moldear
y polimerizar minigeles de gradiente de 0,75 mm de espesor
(0-25 mM de Inmobilina) empleando un mezclador de
gradiente comercial (Amersham).
La composición del Tampón de Gel era:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los materiales de partida fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de proteínas se desarrolló en un
sistema horizontal Multiphor II (Amersham) con un tampón de ánodo y
de cátodo de la forma siguiente:
Tampón de electrodo de cátodo (Tris 0,1 M,
Tricina 0,1 M y SDS al 0,1%)
Tampón de electrodo de ánodo (Tris 0,1 M,
Acetato 0,1 M y SDS al 0,1%).
Las condiciones de desarrollo para la
electroforesis fueron:
100 V (corriente \sim3,0 mA; consumo de
energía – 0,3 W) duración – 25 min
300 V (corriente <10 mA; consumo de energía
<3W) duración – 5 h
La imagen de gel resultante obtenida en este
ejemplo se muestra en la Figura 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El siguiente ejemplo demuestra las capacidades
de resolución de un gel con una densidad constante de
inmobilinas.
Se polimerizó un gel de poliacrilamida al 7% que
incorporaba 5 mM de inmobilinas de pK 12. Una muestra que comprendía
una mezcla de dos proteínas con una diferencia de masa de \sim1 kD
(\beta-lactoglobulina y mioglobina) se separó
electroforéticamente en el gel cargado en un sistema de Leamly
convencional.
El patrón resultante en la Figura 12a muestra
una separación grande de esas dos fracciones. La Figura 12b muestra
el patrón correspondiente obtenido en un sistema de Leamly
convencional en un gel de poliacrilamida al 7% no cargado en el que
casi no se observa separación de las dos bandas.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo demuestra una aplicación
importante de los procedimientos de la invención. Basándose en la
capacidad de inmovilización selectiva (enfoque) de los geles
cargados, se puede construir un sistema multicompartimento que
fraccionará una muestra compleja de proteína o ADN por masa (tamaño)
inmovilizando las proteínas o fragmentos de ADN en compartimentos
específicos de acuerdo con su tamaño (carga).
El dispositivo se construye como un sistema en
serie de membrana de gel de inmobilina en orden creciente de
concentración de inmobilina, estando cada membrana separada de su
vecina por un tabique de división de gel de agarosa de baja
densidad. Para este ejemplo se preparó un dispositivo con 25
compartimentos de inmobilina de poliacrilamida al 4% de 1,5 mm de
grosor, dispuestos en un gradiente por etapas de concentración de
inmobilina e intercalados con una membrana de agarosa al 1% de 0,2
mm de espesor. El gradiente de inmobilina en gel por etapas se
preparó vertiendo y polimerizando las soluciones de gel de PA en
formas creadas por las membranas de agarosa. Las composiciones y
procedimientos de polimerización fueron como se ha mostrado en los
ejemplos anteriores.
Para la separación electroforética se
depositaron marcadores de complejos de proteína-SDS
en un compartimento de tampón en el lado de baja concentración de
inmobilina y se desplazaron a través del sistema mediante un campo
eléctrico aplicado.
Se emplearon tampones como en los ejemplos 3 y
4. La muestra de proteína estaba constituida por tres proteínas
coloreadas - insulina (2,5 kD), aprotinina (6,3 kD) e inhibidor de
tripsina (14.3).
Las condiciones de desarrollo fueron:
Voltaje - 500 V. Tiempo de desarrollo - 2
horas
El resultado del experimento muestra una
localización de las proteínas coloreadas en sus compartimentos
apropiados.
La Figura 13 presenta una imagen del resultado y
un dibujo esquemático del dispositivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra el comportamiento de un
dispositivo de fraccionamiento multicompartimento en el que el medio
de neutralización de carga está constituido por un líquido viscoso
en la forma de una poliacrilamida al 1% con inmobilinas y se usa
para el fraccionamiento de una mezcla compleja de proteínas en
fracciones abarcando intervalos de masa diferentes.
El dispositivo se construyó como se presenta en
la Figura 14a y 14b con los siguientes materiales:
Pared del compartimento - un PAAG al 15% (0,75
mm de espesor);
Material del compartimento: poliacrilamida al 15
con inmobilinas.
Los materiales de partida fueron:
Acrilamida (Nº de Cat. 161-0108
BioRad); Inmobilina (tampón de Inmobilina pKa 10,3 (Nº de Cat.
01741, Fluka)); TEMED (Nº de Cat. 161-0800,
Bio-Rad);
Persulfato de Amonio (Nº de Cat.
161-0501, Bio-Rad); dodecilsulfato
sódico (Nº de Cat. L3771, Sigma).
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La composición de la poliacrilamida al 1% fue
la siguiente:
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A objeto del presente ejemplo se preparó un
dispositivo de dos compartimentos. En la cámara de muestra del
dispositivo se depositó una muestra constituida por una mezcla de
BSA y productos de digestión tríptica de BSA. Se empleó un sistema
de dos tampones como en los ejemplos anteriores. El dispositivo se
hizo funcionar a 100 V durante 10 horas. A continuación del
experimento, el contenido de cada compartimento se colocó en una
cavidad de un gel de SDS-PAGE convencional y se
separó electroforéticamente junto con una muestra de marcador de
proteína para el intervalo de masas de hasta 45 kD.
El patrón de separación resultante se presenta
en la Figura 15. Como se puede observar, cada compartimento contenía
inmovilizada una fracción de masa diferente - la imagen de la
izquierda abarca la masa grande, la imagen central la masa ligera y
la línea derecha representa la muestra de marcador de masa
comercial.
En la Figura 16 se muestra otra configuración
que muestra una realización alternativa del sistema
multicompartimento.
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Este ejemplo demuestra el concepto de la
microplaca multicompartimento que representa una aplicación
importante de los procedimientos de la invención. Se preparó una
microplaca multicompartimento de acuerdo con el diseño como se
muestra en la Figura 17. En una placa de PMMA se realizaron con
máquina 70 orificios 1 mm de diámetro y 1 mm de longitud. Cada
orificio se llenó con una solución de poliacrilamida al 4% e
inmobilina para crear un gradiente por etapas en serie de
concentración de inmobilina (0-35 mM). Los lechos
cortos de PA inmobilina resultantes se interconectaron mediante
uniones de agarosa al 1%. Se usó tampón de inmobilina pKa 10.3 (Nº
de Cat. 01741, Fluka) para la creación de los gradiente de
inmobilina. Las soluciones de gradiente de inmobilina se prepararon
como en los ejemplos anteriores.
Una muestra de digestión tríptica de BSA se
depositó en el compartimento de la muestra y se desplazó
electroforéticamente a lo largo del gradiente de inmobilina.
Las condiciones de desarrollo fueron las
siguientes:
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A continuación de la separación, la microplaca
se tiñó mediante Azul de Commassie y se visualizaron las proteínas
acumuladas en diferentes compartimentos. La imagen resultante se
muestra en la Figura 18.
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Se polimerizó una escalera discreta de mezclas
de inmobilina en un gel de poliacrilamida al 4% para preparar una
banda de 7 cm de largo.
Se separó una mezcla de fragmentos de ADN en el
intervalo de 100 pb a 1100 pb en esa banda mediante electroforesis.
El voltaje aplicado fue 200 V y el tiempo de desarrollo fue 3,5
horas.
La Figura 19 presenta el patrón obtenido. Los
número romanos corresponden a fragmentos diferentes. La distribución
de los fragmentos a lo largo de la banda de gel es lineal hasta un
grado elevado como se muestra en la Figura 20.
Claims (13)
1. Un procedimiento para la separación de
analitos de acuerdo con su peso molecular, que comprende las etapas
de:
- someter un complejo cargado de dichos analitos a un campo eléctrico usando una matriz que comprende un agente de separación cargado,
en el que el agente de separación cargado se
distribuye a través de la matriz para crear un gradiente de densidad
de carga, separándose de este modo dichos analitos de acuerdo con su
carga y peso molecular.
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2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que
- la matriz es una matriz porosa; o
- dichos analitos se separan mediante electroforesis; o
- la dependencia de la movilidad del complejo cargado del peso molecular de los analitos está predeterminada; o
- el gradiente de carga es desde una densidad de carga baja hasta una densidad de carga alta; o
- el agente de separación de carga está distribuido uniformemente a través de la matriz; o
- el agente de separación y el complejo de analito tienen cargas opuestas; o
- dicho agente de separación está cargado positivamente; o
- dicho agente de separación está cargado negativamente; o
- dicho agente de separación es una resina de intercambio iónico; o
- dicho agente de separación es una inmobilina; o
- dichos analitos se seleccionan entre el grupo constituido por aminoácidos, polipéptidos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos tales como ADN, ARN y oligonucleótidos; o
- dicha matriz se selecciona entre el grupo constituido por un gel de placa, un gel plano, un gel en un tubo, un gel capilar, un canal de gel en una matriz sólida, series capilares de canales múltiples que comprenden geles de gradiente de carga, conjuntos en serie de compartimentos discretos que comprenden geles de densidad de carga, conjuntos en un formato de microplaca, series de enfoque de masa para masas de proteína preseleccionadas y dispositivos de inmovilización multicompartimento para intervalos de masas preseleccionados.
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3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la matriz se selecciona entre el grupo
constituido por un gel polimérico, vidrio poroso, líquido de
viscosidad alta y perlas poliméricas.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que
- el líquido de viscosidad alta y las perlas poliméricas se separan en compartimentos mediante una membrana porosa; o
- el gel polimérico es un gel de poliacrilamida.
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5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho complejo de analito cargado se
forma poniendo en contacto dichos analitos con un agente
desnaturalizante cargado.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que
- dicho agente desnaturalizante es un detergente; o
- dicho agente desnaturalizante está cargado negativamente, preferentemente en el que dicho agente desnaturalizante se selecciona entre el grupo constituido por dodecilsulfato sódico (SDS), dodecilsulfato de litio y dodecilsulfato de amonio; o
\newpage
- dicho agente desnaturalizante está cargado positivamente, en el que preferentemente dicho agente desnaturalizante se selecciona entre el grupo constituido por bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de tetradeciltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilamonio (DOTMAC) y desoxicolato de sodio.
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7. Un sistema para la separación de analitos de
acuerdo con su peso molecular, que comprende:
- un complejo cargado de dichos analitos; y
- una matriz que comprende un agente de separación cargado, en la que el agente de separación cargado se distribuye a través de toda la matriz para crear un gradiente de densidad de carga.
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8. El sistema de acuerdo con la reivindicación
7,
- en el que la matriz es una matriz porosa; o
- en el que la dependencia de la movilidad del complejo cargado del peso molecular del analito está predeterminada; o
- en el que el gradiente de carga es desde una densidad de carga baja hasta una densidad de carga alta; o
- en el que el agente de separación de carga está distribuido uniformemente a través de la matriz; o
- en el que dicha matriz se selecciona entre el grupo constituido por un gel de placa, un gel plano, un gel en tubo, un gel capilar, un canal de gel en una matriz sólida, series capilares de canales múltiples que comprenden geles de gradiente de carga, conjuntos en serie de compartimentos discretos que comprenden geles de densidad de carga, conjuntos en un formato de microplaca, series de enfoque de masas para masas de proteína preseleccionadas y dispositivos de inmovilización multicompartimento de intervalos de masa preseleccionados; o
- en la forma de una serie de canales múltiples de capilares; o
- en la forma de una microplaca que comprende una pluralidad de compartimentos, comprendiendo cada compartimento una matriz que comprende un agente de separación cargado.
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9. El sistema de acuerdo con la reivindicación
8, en el que la matriz se selecciona entre el grupo constituido por
un gel polimérico, vidrio poroso de poro abierto, líquido de
viscosidad alta, perlas de polímero porosas y gel polimérico
poroso.
10. El sistema de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el líquido de viscosidad alta y las perlas de polímero
porosas están separados en compartimentos por una membrana
porosa.
11. El sistema de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el gel polimérico es un gel de poliacrilamida.
12. El sistema de acuerdo con la reivindicación
11, en el que dichos analitos se separan mediante
electroforesis.
13. El sistema de acuerdo con la reivindicación
7, en el que dichos analitos se seleccionan entre el grupo
constituido por aminoácidos, polipéptidos, proteínas, péptidos,
ácidos nucleicos tales como ADN, ARN y oligonucleótidos.
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