ES2341645T3

ES2341645T3 - Medios para cultivo celular.

Info

Publication number: ES2341645T3
Application number: ES02791342T
Authority: ES
Inventors: Richard Fike; Robert Radominski; Barbara Dadey; Richard Hassett
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2010-06-24
Anticipated expiration: 2022-12-02
Also published as: EP1461420A4; DK1461420T3; JP2005530480A; AU2002365893A1; US20060270038A1; ATE462781T1; EP2251417A1; AU2002365893C1; AU2008264233A1; AU2002365893B2; US20030153079A1; JP2011239794A; JP2010000088A; EP1461420B1; DE60235835D1; CA2468742A1; WO2003048313A2; NZ533689A; EP1461420A2; WO2003048313A3

Abstract

Procedimiento de producción de un polvo de medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un polvo de tampón aglomerado, comprendiendo el procedimiento: aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, con un disolvente que comprende al menos un lípido disuelto en el mismo, suministrar el disolvente al menos un lípido para su incorporación en el polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, y en el que el al menos un lípido se compleja con una ciclodextrina.

Description

Medios para cultivo celular.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a células, medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y formulaciones tampón. Específicamente, la presente invención proporciona formulaciones de medio nutritivo en polvo seco, particularmente formulaciones de medio de cultivo celular, que comprenden todos los factores nutritivos necesarios que facilitan el cultivo in vitro de las células, y a procedimientos de producción de estas formulaciones de medios. La presente invención se refiere específicamente a procedimientos que incorporan lípidos y/u otros componentes escasamente solubles en disolventes inorgánicos o polares tales como agua. La invención también se refiere a procedimientos de producción de complementos de medios en polvo seco, tales como sueros en polvo seco (por ejemplo, suero bovino fetal) con ingredientes complementarios tales como lípidos u otros ingredientes útiles para soportar el cultivo celular. La invención también se refiere a formulaciones tampón en polvo seco que producen condiciones iónicas y de pH particulares tras la rehidratación. La invención también se refiere a procedimientos de preparación de medios nutritivos, complementos de medios (particularmente sueros en polvo seco), subgrupos de medios y formulaciones tampón en polvo seco estériles preparados con aditivos solubles en disolventes orgánicos o apolares. La invención también se refiere a medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios, formulaciones tampón en polvo seco y células preparadas mediante los procedimientos de la invención. La presente invención también se refiere a kits y procedimientos para el cultivo de células procariotas y eucariotas que usan estos medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y formulaciones tampón en polvo seco.

Antecedentes de la invención Medios de cultivo celular

Los medios de cultivo celular proporcionan nutrientes para mantener y/o hacer crecer células en un entorno controlado, artificial e in vitro. Las características y composiciones de los medios de cultivo celular varían dependiendo de los requisitos celulares particulares y cualquier función para la que se cultivan las células. Los parámetros importantes incluyen osmolalidad, pH y formulaciones de nutrientes. El entorno normal de una célula en cultivo es un medio acuoso en el que se disuelven o suspenden los nutrientes y otros componentes del cultivo. Es especialmente ventajosa la incorporación de cantidades útiles de lípidos u otros componentes que son sólo escasamente solubles en agua.

Se han utilizado formulaciones de medios para cultivar una serie de tipos de células incluyendo células animales, vegetales y bacterianas. Las células cultivadas en medios de cultivo catabolizan los nutrientes disponibles y producen sustancias biológicas útiles tales como anticuerpos monoclonales, hormonas, factores de crecimiento, virus, factores antigénicos, enzimas, citocinas y similares. Tales productos tienen aplicaciones industriales y/o terapéuticas y, con la llegada de la tecnología del ADN recombinante, pueden modificarse células mediante ingeniería para que produzcan grandes cantidades de estos productos. Por tanto, la capacidad para cultivar células in vitro no sólo es importante para el estudio de la fisiología celular, sino que también es necesaria para la producción de sustancias útiles que no pueden obtenerse de otra manera por medios rentables.

Las formulaciones de medios de cultivo celular se han documentado bien en la bibliografía y una serie de medios están disponibles comercialmente. En los primeros trabajos de cultivo celular, las formulaciones de los medios se basaron en la composición química y las propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, osmolalidad, pH, etc.) de la sangre y se denominaron "soluciones fisiológicas" (Ringer, S., J. Physiol. 3:380-393 (1880); Waymouth, C., En: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1, Academic Press, Londres, págs. 99-142 (1965); Waymouth, C., In Vitro 6:109-127 (1970)). Sin embargo, las células en diferentes tejidos de organismos multicelulares, por ejemplo, plantas, invertebrados incluyendo insectos, vertebrados incluyendo peces y mamíferos están expuestos a diferentes microentornos con respecto a la presión parcial de oxígeno/dióxido de carbono y las concentraciones de nutrientes, vitaminas y oligoelementos; por consiguiente, el cultivo in vitro satisfactorio de diferentes tipos celulares con frecuencia requerirá el uso de diferentes formulaciones de medios. Los componentes típicos de los medios de cultivo celular incluyen aminoácidos, sales orgánicas e inorgánicas, vitaminas, metales traza, azúcares, lípidos y ácidos nucleicos, cuyos tipos y cantidades pueden variar dependiendo de los requisitos particulares de un tipo de célula o tejido dado y el fin al que se aplica la célula. Con frecuencia, particularmente en composiciones de medios complejos, los problemas de estabilidad dan como resultado productos tóxicos y/o menores concentraciones eficaces de los nutrientes requeridos, limitando de ese modo la vida funcional de los medios de cultivo. Por ejemplo, la glutamina es un constituyente de casi todos los medios que se usan en el cultivo de células de mamíferos in vitro. La glutamina se descompone espontáneamente en ácido pirrolidona-carboxílico y amoniaco. La velocidad de degradación puede estar influenciada por las condiciones iónicas y de pH pero en los medios de cultivo celular, con frecuencia no puede evitarse la formación de estos productos de degradación. (Tritsch et al., Exp. Cell Res. 28:360-364 (1962)).

Wang et al. (In Vitro 14(8):715-722 (1978)) han demostrado que se producen fotoproductos tales como peróxido de hidrógeno, que son letales para las células, en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). La riboflavina y el triptófano o la tirosina son componentes necesarios para la formación de peróxido de hidrógeno durante la exposición a la luz. Dado que la mayoría de los medios de cultivo para mamíferos contienen riboflavina, tirosina y triptófano, es probable que se produzcan fotoproductos tóxicos en la mayoría de los medios de cultivo celular.

Para evitar estos problemas, los investigadores preparan los medios "cuando es necesario", y evitan el almacenamiento a largo plazo de los medios de cultivo. Los medios disponibles comercialmente, normalmente en forma de polvo seco, son una alternativa conveniente a preparar los medios desde cero, es decir, añadiendo cada nutriente individualmente, y también evitan algunos de los problemas de estabilidad asociados con los medios líquidos. Sin embargo, sólo está disponible un número limitado de medios de cultivo comerciales, a excepción de aquellas formulaciones a medida suministradas por el fabricante.

Los líquidos (medios acuosos) con frecuencia se complementan con concentrado lipídico, por ejemplo, el lípido Lipid Concentrate (100X), disponible de GIBCO de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California. Convencionalmente los medios en polvo no podían contener eficazmente componentes que no fueran fácilmente solubles en agua, el disolvente más común utilizado para la reconstitución. Por tanto, después de que se reconstituya un polvo para formar un medio, frecuentemente se añaden componentes adicionales con una pequeña cantidad de disolvente orgánico tal como alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, glicoles, etc.), éteres (por ejemplo, MEK), cetonas (por ejemplo, acetona), DMSO, etc. Estos disolventes deben usarse con moderación ya que generalmente provocan efectos tóxicos o indeseados en las células que están cultivándose. La toxicidad y la solubilidad interaccionan limitando la cantidad del componente deseado que puede añadirse al cultivo.

Aunque las formulaciones de medios en polvo seco pueden aumentar la vida útil de almacenamiento de algunos medios, existen varios problemas asociados con los medios en polvo seco, especialmente en la aplicación a gran escala. La producción de grandes volúmenes de medios requiere instalaciones de almacenamiento para los medios de polvo seco, por no mencionar las cocinas especializadas para los medios necesarias para mezclar y pesar los componentes de nutrientes. Debido a la naturaleza corrosiva de los medios de polvo seco, los tanques de mezclado deben sustituirse periódicamente.

Normalmente, las formulaciones de medios de cultivo celular se complementan con una gama de aditivos, incluyendo componentes indefinidos tales como suero bovino fetal (FBS) (por ejemplo, al 10-20%, 5-10%, 1-5%, 0,1-1% v/v) o extractos o hidrolizados de plantas, embriones, órganos o glándulas de animales (por ejemplo, al 0,5-10%, 0,1-1%). Aunque el FBS es el complemento aplicado más comúnmente en los medios de cultivo de células animales, también se utilizan de manera rutinaria otras fuentes de suero, incluyendo de ternero recién nacido, caballo y ser humano. Los órganos o las glándulas que se han usado para preparar extractos para la complementación de medios de cultivo incluyen la glándula submaxilar (Cohen, S., J. Biol Chem. 237:1555-1565 (1961)), hipófisis (Peehl, D.M., y Ham, R.G., In Vitro 16:516-525 (1980); patente estadounidense n.º 4.673.649), hipotálamo (Maciag, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5674-5678 (1979); Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol. 120:377-383 (1984)), retina ocular (Barretault, D., et al., Differentiation 18:29-42 (1981)) y cerebro (Maciag T., et al., Science 211:1452-1454 (1981)). Estos tipos de complementos químicamente indefinidos sirven para varias funciones útiles en los medios de cultivo celular (Lambert, K.J. et al., En: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Press Nueva York, págs. 85-122 (1985)). Por ejemplo, estos complementos proporcionan vehículos o quelantes para nutrientes lábiles o insolubles en agua; se unen y neutralizan restos tóxicos; proporcionan hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de proteasas y nutrientes de bajo peso molecular esenciales, a menudo no identificados o indefinidos; y protegen a las células frente al daño y el estrés físico. Por tanto, el suero o los extractos de órganos/glándulas se usan comúnmente como complementos de coste relativamente bajo para proporcionar un medio de cultivo mejorado para el cultivo de células animales.

Particularmente para usos alimentarios o terapéuticos, hay una tendencia a reducir e incluso eliminar componentes indefinidos, particularmente de origen animal, debido a preocupaciones de seguridad y costes. Los medios de cultivo mejorados también pueden producirse usando cantidades pequeñas de componentes que tienen baja solubilidad en agua.

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Procedimientos de producción de los medios de cultivo

Los medios de cultivo normalmente se producen en forma líquida o en forma de polvo (véase por ejemplo el Catálogo de productos de 2000-2001 de GIBCO BRL). Cada una de estas formas tiene ventajas y desventajas particulares.

Por ejemplo, el medio de cultivo líquido tiene la ventaja de que se proporciona listo para su uso (a menos que sea necesario o se desee la complementación con nutrientes u otros componentes), y de que las formulaciones se han optimizado para tipos celulares particulares. Sin embargo, los medios líquidos tienen las desventajas de que con frecuencia requieren la adición de complementos (por ejemplo, L-glutamina, suero, extractos, citocinas, lípidos, etc.) para un óptimo rendimiento en el cultivo celular. Además, el medio líquido con frecuencia es difícil de esterilizar de manera económica, dado que muchos de los componentes son termolábiles (obviándose así el uso de tratamiento en autoclave, por ejemplo) y los líquidos a granel no son particularmente susceptibles a procedimientos de esterilización penetrantes tales como la irradiación con rayos gamma o ultravioleta; por tanto, los medios de cultivo líquidos de la manera más frecuente se esterilizan mediante filtración, lo que puede convertirse en un proceso que requiere mucho tiempo y es costoso. La filtración tiene una desventaja porque se eliminan del medio componentes sin disolver, por ejemplo, liposomas, micelas, partículas insolubles, etc., algunos de los que son deseados. Además, la producción y el almacenamiento de grandes tamaños de lote (por ejemplo, 1000 litros o más) de medios de cultivo líquidos son poco prácticos, y los componentes de los medios de cultivo líquidos con frecuencia tienen vidas útiles de almacenamiento relativamente cortas.

Para superar algunas de estas desventajas, un medio de cultivo líquido puede formularse en forma concentrada; estos componentes de los medios pueden diluirse entonces hasta concentraciones de trabajo antes de su uso. Este enfoque proporciona la capacidad de preparar tamaños de lotes más grandes y más variables que con los medios de cultivo convencionales, y las formulaciones de medios concentrados o los componentes de los mismos con frecuencia tienen vidas útiles de almacenamiento más largas (véase la patente estadounidense n.º 5.474.931, que se refiere a tecnología de concentrados de medios de cultivo). Sin embargo, a pesar de estas ventajas, los medios líquidos concentrados todavía tienen las desventajas de la necesidad de adición de complementos (por ejemplo, FBS, L-glutamina o extractos de órganos/glándulas), y pueden ser difíciles de esterilizar de manera económica.

Alternativamente a los medios líquidos, con frecuencia se utilizan medios de cultivo en polvo. Los medios en polvo normalmente se producen mezclando los componentes secados del medio de cultivo por medio de un procedimiento de mezclado, por ejemplo, molienda con molino de bolas, o liofilizando un medio de cultivo líquido preparado previamente. Este enfoque tiene las ventajas de que pueden producirse tamaños de lotes incluso más grandes, los medios en polvo normalmente tienen vidas útiles de almacenamiento más largas que los medios líquidos, y los medios pueden esterilizarse mediante irradiación (por ejemplo, irradiación con rayos gamma o ultravioleta) o la penetración con óxido de etileno tras la formulación. Sin embargo, los medios en polvo convencionales tienen varias desventajas diferenciadas. Por ejemplo, algunos de los componentes de los medios en polvo se vuelven insolubles o se agregan tras la liofilización de tal manera que la resolubilización es difícil o imposible. Además, los medios en polvo normalmente comprenden partículas de polvo fino que pueden hacerlos particularmente difíciles de reconstituir sin cierta pérdida de material, y que además pueden hacerlos poco prácticos para su uso en muchas instalaciones de producción de biotecnología que operan en el marco de las normas BPF/BPL, USP o ISO 9000. Además, muchos de los complementos utilizados en los medios de cultivo, por ejemplo, L-glutamina y FBS, no pueden añadirse al medio de cultivo antes de la liofilización o la molienda con molino de bolas debido a su inestabilidad o propensión a conglomerarse tras la concentración o debido a su sensibilidad al cizallamiento mediante procesos tales como la molienda con molino de bolas. Finalmente, muchos de estos complementos, particularmente los complementos de suero tales como FBS, muestran una pérdida sustancial de la actividad o se vuelven completamente inactivos si se hacen intentos para producir complementos en polvo mediante procesos tales como la liofilización.

Por tanto, existe una necesidad actual de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de polvo seco estables, nutricionalmente complejos, que se disuelvan rápidamente, que puedan prepararse en cantidades volumétricas variables y que sean susceptibles de esterilización, particularmente mediante ionización o irradiación con rayos ultravioleta. En particular, existe una necesidad de proporcionar medios nutritivos de polvo seco que sean completos, es decir, que no requieran o reduzcan sustancialmente la necesidad de complementación por ejemplo, con un complemento lipídico, tras la reconstitución.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para la producción de polvos de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones que comprenden aglomerar un medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón de polvo seco con un disolvente o disolventes. El disolvente comprende al menos un lípido disuelto en el mismo, y libera el al menos un lípido para su incorporación en el polvo. El al menos un lípido se compleja con una ciclodextrina, por ejemplo, \beta-metilciclodextrina. La invención también se refiere en algunas realizaciones a un procedimiento de este tipo que comprende secar por pulverización un medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o tampón líquido en condiciones suficientes para producir sus equivalentes de polvo seco. Tales condiciones pueden comprender, por ejemplo, controlar el calor y la(s) presión/presiones parcial(es) del/de los disolvente(s) hasta que se forme el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en polvo. El polvo puede formarse en una etapa o en múltiples etapas. Cuando se utiliza más de un disolvente, los disolventes pueden introducirse a través del mismo orificio o boquilla o pueden introducirse a través de boquillas separadas. Los disolventes compatibles, por ejemplo, los solubles entre sí o miscibles de manera suficiente pueden compartir un orificio o boquilla mientras que puede utilizarse una boquilla separada para uno o más disolventes incompatibles con el primer disolvente.

Según la invención, el procedimiento puede comprender además esterilizar el polvo de medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón, lo que puede llevarse a cabo antes de o después de envasar el polvo. En procedimientos preferidos particularmente, la esterilización se lleva a cabo después del envasado del polvo mediante irradiación del polvo envasado con rayos gamma.

Los polvos de medio nutritivo particularmente preferidos que pueden producirse según la invención incluyen polvos de medio de cultivo seleccionados del grupo constituido por un polvo de medio de cultivo bacteriano, un polvo de medio de cultivo de levaduras, un polvo de medio de cultivo vegetal, un polvo de medio de cultivo animal.

Los complementos de medios particularmente preferidos que pueden producirse mediante los procedimientos de la invención incluyen: sueros animales en polvo, tales como sueros bovinos (por ejemplo, sueros bovino fetal, de ternero recién nacido o normal de ternero), sueros humanos, sueros equinos, sueros porcinos, sueros de mono, sueros de simio, sueros de rata, sueros murinos, sueros de conejo, sueros ovinos y similares; citocinas (incluyendo factores de crecimiento (tales como EGF, aFGF, bFGF, HGF, IGF-1, IGF-2, NGF y similares), interleucinas, factores estimulantes de colonias e interferones); factores de adhesión o componentes de la matriz extracelular (tales como colágenos, lamininas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, fibronectina, vitronectina y similares); lípidos (tales como fosfolípidos, colesterol, concentrado de colesterol bovino, ácidos grasos, esfingolípidos y similares); glicanos y extractos de tejidos, órganos o glándulas de animales (tales como extracto de hipófisis bovina, extracto de cerebro bovino, extracto de embrión de pollo, extracto de embrión bovino, extracto de carne de pollo, tendón de Aquiles y extractos del mismo) y similares). Otros complementos de medios que pueden producirse mediante los presentes procedimientos incluyen una variedad de proteínas (tales como albúminas séricas, particularmente albúminas séricas bovina o humana; inmunoglobulinas y fragmentos o complejos de las mismas; aprotinina; hemoglobina; hemina o hematina; enzimas (tales como tripsina, colagenasas, pancreatinina o dispasa; lipoproteínas; ferritina; etc.) que pueden ser naturales o recombinantes; vitaminas; aminoácidos y variantes de los mismos (incluyendo, pero sin limitarse a, L-glutamina y cistina), cofactores enzimáticos y otros componentes útiles en el cultivo de células in vitro con los que estará familiarizado un experto.

Los medios nutritivos y los complementos de medios preparados mediante la invención también pueden comprender subgrupos tales como suero (preferiblemente aquellos descritos anteriormente), L-glutamina, insulina, transferrina, uno o más lípidos (preferiblemente uno o más fosfolípidos, esfingolípidos, ácidos grasos o colesterol), una o más citocinas (preferiblemente aquellas descritas anteriormente), uno o más neurotransmisores, uno o más extractos de tejidos, órganos o glándulas de animales (preferiblemente aquellos descritos anteriormente), una o más proteínas (preferiblemente aquellas descritas anteriormente) o uno o más tampones (preferiblemente bicarbonato o fosfato), o cualquier combinación de los mismos.

Los polvos de tampón particularmente adecuados para su preparación según los procedimientos de la invención incluyen polvos de solución salina tamponada, lo más particularmente polvos de solución salina tamponada con fosfato o polvos de solución salina tamponada con Tris.

La invención también proporciona polvos de medio nutritivo, polvos de complemento de medios (incluyendo los polvos de los complementos descritos anteriormente) y polvos de tampón preparados según estos procedimientos.

Otras realizaciones preferidas de la presente invención resultarán evidentes para un experto a la luz de los siguientes dibujos y la descripción de la invención, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un histograma de un barrido densitométrico de SDS-PAGE de muestras de suero bovino fetal (FBS) preparadas en forma de polvo (figura 1A) y FBS líquido convencional (figura 1B).

La figura 2 es una combinación de gráficos de líneas de crecimiento (figura 2A) y éxito de pase (figura 2B) de células SP2/0 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 2% (p/v) preparado en forma de polvo mediante aglomeración.

La figura 3 es una combinación de histogramas de barridos espectrofotométricos (8 = 200-350 nm) de suero bovino fetal (FBS) en polvo preparado mediante secado por pulverización (figura 3A) o de FBS líquido convencional (figura 3B).

La figura 4 es una combinación de gráficos de líneas que muestra la valoración del pH (capacidad tamponante), en dos fechas diferentes (figuras 4A y 4B), de diversos medios en polvo seco (DPM, dry powdered media) preparados mediante aglomeración o mediante molienda con molino de bolas, con o sin la adición de bicarbonato de sodio.

La figura 5 es una combinación de gráficos de barras que muestra el efecto de la aglomeración sobre las velocidades de disolución (en agua) de Opti-MEM I^{TM} (figura 5A) o DMEM (figura 5B). Los medios se aglomeraron con agua o FBS según se indica.

La figura 6 es una combinación de gráficos de líneas que muestra el crecimiento durante siete días de células SP2/0 en Opti-MEM I^{TM} (figura 6A) o DMEM (figura 6B) aglomerado, ambos conteniendo FBS al 2%.

La figura 7 es una combinación de gráficos de líneas que muestra el crecimiento durante siete días de células SP2/0 (figura 7A), células AE-1 (figura 7B) y células L5.1 (figura 7C) en DMEM aglomerado que contenía FBS al 10%.

La figura 8 es una combinación de gráficos de líneas que muestra el éxito de pase de las células SP2/0 en Opti-MEM I^{TM} (figura 8A) o DMEM (figura 8B) aglomerados con o bien agua o bien FBS, complementado con FBS al 2%.

La figura 9 es una combinación de gráficos de líneas que muestra el éxito de pase de células SP2/0 (figura 9A), células AE-1 (figura 9B) y células L5.1 (figura 9C) en DMEM aglomerado con FBS y bicarbonato de sodio y complementado con FBS al 10%.

La figura 10 es un gráfico de líneas que muestra el crecimiento de células SP2/0 durante cuatro pases en medios de cultivo en polvo reconstituidos con agua convencionales (medios de control), o en medios de cultivo en polvo aglomerados preparados en cantidades a gran escala. Los resultados se muestran para medios de control (\Box), medios de cultivo en polvo aglomerados con agua de la invención (\blacklozenge) y medios de cultivo en polvo con pH automático aglomerados con agua (que contenían bicarbonato de sodio) de la invención (\blacksquare).

La figura 11 es un gráfico de líneas de células AE-1 cultivadas durante seis o siete días en un medio que contenía suero bovino fetal líquido (FBS) al 2% (\ding{115}) o al 10% (\blacklozenge), o FBS en polvo al 2%(x) o al 10% (\blacksquare) preparado mediante secado por pulverización. Se muestran los experimentos por duplicado en las figuras 11A y 11B.

La figura 12 es un gráfico de líneas de células SP2/0 cultivadas durante siete días en un medio que contenía FBS líquido al 2% (\ding{115}) o al 10% (\blacklozenge), o FBS en polvo al 2%(x) o al 10% (\blacksquare) preparado mediante secado por pulverización. Se muestran los experimentos por duplicado en las figuras 12A y 12B.

La figura 13 es un gráfico de líneas del crecimiento de células AE-1 durante cuatro pases en un medio que contenía FBS líquido al 5% (\blacklozenge) o FBS en polvo al 5% preparado mediante secado por pulverización (\blacksquare).

La figura 14 es un gráfico de líneas que indica el efecto de la irradiación con rayos \gamma y la aglomeración sobre el crecimiento de células SP2/0 durante cinco días.

La figura 15 es un gráfico de barras que indica el efecto de la radiación \gamma sobre el crecimiento de células VERO en medios de cultivo aglomerados.

La figura 16 es una serie de gráficos de líneas que indican el efecto de la radiación \gamma sobre la capacidad de la transferrina de soportar el crecimiento de células 293 durante cuatro pases. En cada gráfico, se cultivaron las células en medio 293 libre de suero convencional (\blacklozenge), en medio sin transferrina (\blacksquare), en medio que contenía transferrina en polvo que se había irradiado con rayos \gamma a -70ºC (\ding{115}) o a temperatura ambiente (\ding{91}), o en medio que contenía transferrina en polvo que no se había irradiado con rayos \gamma pero que se había almacenado a -70ºC (x) o a temperatura ambiente (\medbullet). Los resultados de cada punto de datos son los promedios de matraces por duplicado.

Figura 16A: células del pase 1;

Figura 16B: células del pase 2;

Figura 16C: células del pase 3;

Figura 16D: células del pase 4.

La figura 17 es una serie de gráficos de barras que indican el efecto de la irradiación, en diferentes condiciones de irradiación, sobre la capacidad del FBS para soportar el crecimiento de células independientes del anclaje (figuras 17A y 17B) y células dependientes del anclaje (figuras 17C y 17D) en los pases primero (Px1), segundo (Px2) y tercero (Px3).

Figura 17A: células SP2/0;

Figura 17B: células AE-1;

Figura 17C: células VERO;

Figura 17D: células BHK.

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Descripción detallada de la invención Definiciones

En la descripción que sigue, se utilizan extensamente varios términos usados convencionalmente en el campo de los medios de cultivo celular. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, y el alcance que ha de darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

El término "polvo" tal como se usa en el presente documento hace referencia a una composición que está presente en forma granular, que puede o puede no complejarse o aglomerarse con un disolvente tal como agua o suero. El término "polvo seco" puede usarse de manera intercambiable con el término "polvo"; sin embargo, "polvo seco" tal como se usa en el presente documento simplemente hace referencia al aspecto macroscópico del material granulado y no se pretende que signifique que el material está completamente libre de disolvente complejado o aglomerado a menos que se indique lo contrario.

El término "ingrediente" hace referencia a cualquier compuesto, ya sea de origen químico o biológico, que puede utilizarse en medios de cultivo celular para mantener o promover el crecimiento de la proliferación de las células. Los términos "componente", "nutriente" e "ingrediente" pueden utilizarse de manera intercambiable y todos hacen referencia a tales compuestos. Los ingredientes típicos que se utilizan en los medios de cultivo celular incluyen aminoácidos, sales, metales, azúcares, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, vitaminas, ácidos grasos, proteínas y similares. Otros ingredientes que promueven o mantienen el cultivo de células ex vivo pueden seleccionarse por los expertos en la técnica, según la necesidad particular.

El término "citocina" hace referencia a un compuesto que induce una respuesta fisiológica en una célula, tal como crecimiento, diferenciación, senescencia, apoptosis, citotoxicidad, síntesis o transporte, respuesta inmunitaria o secreción de anticuerpos. En esta definición de "citocina" están incluidos los factores de crecimiento, interleucinas, factores estimulantes de colonias, interferones, tromboxanos, prostaglandinas, hormonas y linfocinas.

Por "cultivo celular" o "cultivo" se entiende el mantenimiento de las células en un entorno artificial, por ejemplo, un entorno in vitro. Debe entenderse, sin embargo, que el término "cultivo celular" es un término genérico y puede usarse para abarcar el cultivo no sólo de células procariotas (por ejemplo, bacterianas) o eucariotas (por ejemplo, de animales, vegetales y fúngicas) individuales, sino también de tejidos, órganos, sistemas de órganos u organismos completos, para los que los términos "cultivo tisular", "cultivo de órganos", "cultivo de sistema de órganos" o "cultivo organotípico" pueden utilizarse ocasionalmente de manera intercambiable con el término "cultivo celular".

Por "cultivo" se entiende el mantenimiento de células en un entorno artificial en condiciones que favorecen el crecimiento, diferenciación, producción biológica o viabilidad continuada, en un estado activo o quiescente, de las células. Por tanto, "cultivo" puede utilizarse de manera intercambiable con "cultivo celular" o cualquiera de sus sinónimos descritos anteriormente.

Por "recipiente de cultivo" se entiende un recipiente de vidrio, plástico o metal que puede proporcionar un entorno aséptico para cultivar células.

Las frases "medio de cultivo celular", "medio de cultivo" (en plural "medios" en cada caso) y "formulación de medio" hacer referencia a una disolución nutritiva que soporta el cultivo y/o crecimiento de las células; estas frases pueden utilizarse de manera intercambiable.

Por "extracto" se entiende una composición que comprende una preparación purificada, parcialmente purificada o concentrada de los subgrupos de una sustancia, normalmente formada mediante el tratamiento de la sustancia o bien mecánicamente (por ejemplo, mediante tratamiento con presión) o bien químicamente (por ejemplo, mediante destilación, solubilización, precipitación, acción enzimática o tratamiento con elevadas concentraciones de sales).

Por "digesto enzimático" se entiende una composición que comprende un tipo especializado de extracto, concretamente uno preparado tratando la sustancia que va a extraerse (por ejemplo, componentes vegetales o células de levaduras) con al menos una enzima que puede degradar los componentes de la sustancia en formas más sencillas (por ejemplo, en una preparación que comprende mono o disacáridos y/o mono, di o tripéptidos). En este contexto, y para los fines de la presente invención, el término "hidrolizado" puede utilizarse algunas veces de manera intercambiable con el término "digesto enzimático".

"Lípido" tendrá su significado como generalmente se entiende en bioquímica. "Lípido" también significa una parte de la célula o un ingrediente de un medio que es soluble en un disolvente apolar o no acuoso. El lípido puede ser escasamente soluble o insoluble en agua en presencia o ausencia de otros ingredientes del medio. El lípido puede ser soluble en una mezcla de disolventes que incluye agua y uno o más disolventes orgánicos. Los lípidos pueden comprender ácidos grasos, hormonas, metabolitos, citocinas, vitaminas, indicadores, estimuladores o inhibidores. "Lípido" en algunos contextos puede hacer referencia a ingredientes que normalmente son insolubles o escasamente solubles en agua, pero que se han convertido, por ejemplo, mediante saponificación, hidroxilación, etc., en una forma de compuesto o ión que es soluble en agua. Por tanto, por ejemplo, un ácido graso es un lípido, pero también ha de incluirse en la definición una sal de un ácido graso. Además, "lípido" se utiliza genéricamente para que signifique generalmente cualquier componente que se introduce favorablemente utilizando disolventes orgánicos o apolares o que normalmente no es soluble en agua o medios acuosos. Los lípidos pueden estar presentes como moléculas disueltas, o en otras formas tales como micelas u otras asociaciones sueltas de moléculas. Un lípido puede utilizarse como una molécula libre o puede unirse a una o más de otras moléculas. Por ejemplo, las proteínas o péptidos pueden asociarse con uno o más de otros lípidos para proporcionar estabilidad y/o para ayudar en la liberación del polvo aglomerado. El lípido también puede hacer referencia a un ingrediente que podría actuar como un fármaco para inhibir o activar una o más funciones de una célula o componente celular.

El término "poner en contacto" hace referencia a la colocación de las células que van a cultivarse en un recipiente de cultivo con el medio en el que van a cultivarse las células. El término "poner en contacto" abarca, entre otros, mezclar las células con el medio, perfundir las células con el medio, pipetear el medio sobre células en un recipiente de cultivo y sumergir las células en el medio de cultivo.

El término "combinar" hace referencia a mezclar o incorporar los ingredientes en una formulación de medio de cultivo celular. La combinación puede producirse en forma de líquido o polvo o con uno más polvos y uno o más líquidos.

Un medio de cultivo celular está compuesto por varios ingredientes y estos ingredientes varían de un medio de cultivo a otro. Una "formulación 1X" se entiende que hace referencia a cualquier disolución acuosa que contiene algunos o todos los ingredientes que se encuentran en un medio de cultivo celular a concentraciones de trabajo. La "formulación 1X" puede hacer referencia, por ejemplo, al medio de cultivo celular o a cualquier subgrupo de ingredientes para ese medio. La concentración de un ingrediente en una disolución 1X es aproximadamente la misma que la concentración de ese ingrediente que se encuentra en una formulación de medio de cultivo celular utilizada para mantener o cultivar células in vitro. Un medio de cultivo celular utilizado para el cultivo in vitro de células es por definición una formulación 1X. Cuando están presentes varios ingredientes, cada ingrediente en una formulación 1X tiene una concentración aproximadamente igual a la concentración de aquellos ingredientes en un medio de cultivo celular. Por ejemplo, el medio de cultivo RPMI-1640 contiene, entre otros ingredientes, L-arginina 0,2 g/l, L-asparagina 0,05 g/l y ácido L-aspártico 0,02 g/l. Una "formulación 1X" de estos aminoácidos contiene aproximadamente las mismas concentraciones de estos ingredientes en disolución. Por tanto, cuando se hace referencia a una "formulación 1X", se pretende que cada ingrediente en la disolución tenga la misma o aproximadamente la misma concentración que la que se encuentra en el medio de cultivo celular que esta describiéndose. Las concentraciones de los ingredientes en una formulación 1X del medio de cultivo celular las conocen bien los expertos en la técnica. Véase Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss, N.Y. (1984), que se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad. Sin embargo, pueden diferir la osmolalidad y/o el pH en una formulación 1X en comparación con el medio de cultivo, particularmente cuando están contenidos menos ingredientes en la formulación 1X. La concentración 1X de cualquier componente no es necesariamente constante a través de diversas formulaciones de medios. Por tanto 1X podría indicar concentraciones diferentes de un único componente cuando se hace referencia a medios diferentes. Sin embargo, cuando se usa generalmente, 1X indicará una concentración que se encuentra comúnmente en los tipos de medios a los que se hace referencia. Una cantidad 1X es la cantidad de un ingrediente que dará como resultado una concentración 1X para el volumen apropiado del medio.

Una "formulación 10X" se entiende que hace referencia a una disolución en la que cada ingrediente en esa disolución está aproximadamente 10 veces más concentrado que el mismo ingrediente en el medio de cultivo celular. Por ejemplo, una formulación 10X del medio de cultivo RPMI-1640 puede contener, entre otros ingredientes, L-arginina 2,0 g/l, L-asparagina 0,5 g/l y ácido L-aspártico 0,2 g/l (compárese con la formulación 1X, anteriormente). Una "formulación 10X" puede contener varios ingredientes adicionales a una concentración aproximadamente 10 veces la que se encuentra en el medio de cultivo 1X. Tal como resultará fácilmente evidente, la "formulación 20X", "formulación 25X", "formulación 50X" y "formulación 100X" designan disoluciones que contienen ingredientes a concentraciones de aproximadamente 20, 25, 50 ó 100 veces, respectivamente, en comparación con un medio de cultivo celular 1X. De nuevo, pueden variar la osmolalidad y el pH de la formulación de los medios y la disolución concentrada. Véase la patente estadounidense n.º 5.474.931, que se refiere a la tecnología de concentrados de medios de cultivo.

Por "sin pérdida significativa de la actividad biológica y bioquímica" se entiende una disminución inferior a aproximadamente el 30%, preferiblemente inferior a aproximadamente el 25%, más preferiblemente inferior a aproximadamente el 20%, todavía más preferiblemente inferior a aproximadamente el 15% y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente el 10%, de la actividad biológica o bioquímica de los medios nutritivos, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en comparación con medios nutritivos, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón recién preparados de la misma formulación.

Un "disolvente" es un líquido que disuelve o que ha disuelto otro ingrediente del medio. Los disolventes pueden utilizarse en la preparación de los medios, en la preparación de polvos de medios, en la preparación de subgrupos o complementos u otras formulaciones, particularmente polvos de la presente invención y en la reconstitución de un polvo o la dilución de un concentrado en la preparación para cultivar células. Los disolventes pueden ser polares, por ejemplo, un disolvente acuoso, o apolares, por ejemplo, un disolvente orgánico. Los disolventes pueden ser complejos, es decir, que requieren más de un ingrediente para solubilizar un ingrediente. Los disolventes complejos pueden ser mezclas sencillas de dos líquidos tales como alcohol y agua o pueden ser mezclas de sales u otros sólidos en un líquido. Pueden ser necesarios en algunos casos dos, tres, cuatro, cinco o seis o más componentes para formar una mezcla soluble. Se prefieren los disolventes sencillos tales como mezclas de etanol o metanol y agua debido a su facilidad de preparación y manipulación. Debido a preocupaciones ambientales, de toxicidad y/o incendios, se prefiere usar mezclas acuosas en las que la cantidad del disolvente orgánico es la cantidad mínima en la mezcla para disolver suficientemente el ingrediente o ingredientes relevantes.

Por un "periodo de tiempo prolongado" se entiende un periodo de tiempo más largo que aquél durante el que se almacena un medio nutritivo, complemento, subgrupo o tampón cuando se prepara mediante procedimientos tradicionales tales como molienda con molino de bolas. Tal como se usa en el presente documento, un "periodo de tiempo prolongado" por tanto significa aproximadamente 1-36 meses, aproximadamente 2-30 meses, aproximadamente 3-24 meses, aproximadamente 6-24 meses, aproximadamente 9-18 meses o aproximadamente 4-12 meses, en condiciones de almacenamiento dadas, que puede incluir el almacenamiento a temperaturas de aproximadamente -70ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente -20ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 25ºC, de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 25ºC o de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC. Los ensayos para la determinación de la actividad biológica o bioquímica de un medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón se conocen bien en la técnica y un experto está familiarizado con los mismos.

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Visión general

La presente invención se refiere generalmente a procedimientos de producción de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones y los medios producidos de ese modo. Los medios nutritivos, complementos de medios y subgrupos de medios producidos mediante los presentes procedimientos son cualquier medio, complemento de medios o subgrupo de medios (libres de suero o que contienen suero) que pueden usarse para soportar el crecimiento de una célula, que puede ser una célula bacteriana, una célula fúngica (particularmente una célula de levaduras), una célula vegetal o una célula animal (particularmente una célula de insectos, una célula de nematodos o una célula de mamíferos, más preferiblemente una célula humana), cualquiera de las cuales puede ser una célula somática, una célula germinal, una célula normal, una célula enferma, una célula transformada, una célula mutante, una célula madre, una célula precursora o una célula embrionaria. Tales medios nutritivos preferidos incluyen, pero no se limitan a, medios de cultivo celular, lo más preferiblemente un medio de cultivo de células bacterianas, medio de cultivo de células vegetales o un medio de cultivo de células animales. Los complementos de medios preferidos incluyen, pero no se limitan a, complementos indefinidos tales como extractos de células, glándulas, tejidos u órganos de bacterias, animales o plantas (particularmente extracto de hipófisis bovina, extracto de cerebro bovino y extracto de embrión de pollo); y fluidos biológicos (particularmente sueros de animales, y lo más preferiblemente suero bovino (particularmente suero bovino fetal, de ternero recién nacido o normal de ternero), suero de caballo, suero porcino, suero de rata, suero murino, suero de conejo, suero de mono, suero de simio o suero humano, cualquiera de los cuales pueden ser suero fetal) y extractos de los mismos (más preferiblemente albúmina sérica y lo más preferiblemente albúmina sérica bovina o albúmina sérica humana). Los complementos de medios también pueden incluir sustitutos definidos tales como LipoMAX8®, OptiMAb®, Knock-Out^{TM} SR (cada uno disponible de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), y similares, que pueden usarse como sustitutos para los complementos de medios indefinidos descritos anteriormente. Tales complementos también pueden comprender componentes definidos, incluyendo pero sin limitarse a, hormonas, citocinas, neurotransmisores, lípidos, factores de adhesión, proteínas y similares.

Los medios nutritivos también pueden dividirse en diversos subgrupos (véase la patente estadounidense
n.º 5.474.931) que pueden prepararse mediante, y usarse según, los procedimientos de la invención. Tales subgrupos pueden combinarse para producir los medios nutritivos de la presente invención.

Mediante los procedimientos de la presente invención, puede producirse cualquier medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón y almacenarse durante un periodo de tiempo prolongado sin una pérdida significativa de actividad biológica y bioquímica. Mediante los procedimientos de la presente invención se consigue una mejora significativa en la incorporación de lípidos y/o ingredientes escasamente solubles en agua. El componente lipídico puede incorporarse en un subgrupo, complemento, etc., pero preferiblemente el componente lipídico así como todos los demás ingredientes que van a reconstituirse están contenidos en una única mezcla/composición. Cuando se usan varias composiciones para reconstituir un medio, preferiblemente se necesita un número pequeño de diferentes polvos, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5.

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Formulación de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones

Se puede preparar cualquier medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o tampón mediante los procedimientos de la presente invención. Los medios nutritivos, complementos nutritivos y subgrupos de medios particularmente preferidos que pueden prepararse según la invención incluyen medios de cultivo celular, complementos de medios y subgrupos de medios que soportan el crecimiento de células animales, células vegetales, células bacterianas o células de levaduras. Tampones particularmente preferidos que pueden prepararse según la invención incluyen soluciones salinas equilibradas que son isotónicas para células animales, células vegetales, células bacterianas o células de levaduras.

Los ejemplos de medios de cultivo de células animales que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, DMEM, RPMI-1640, MCDB 131, MCDB 153, MDEM, IMDM, MEM, M199, medio McCoy 5A, medios E de Williams, medio L-15 de Leibovitz, medio para insectos de Grace, medio para insectos IPL-41, medio para insectos TC-100, medio para Drosophila de Schneider, medio de cultivo para células de anfibios de Wolf & Quimby, medios libres de suero específicos de células (SFM) tales como aquellos diseñados para soportar el cultivo de queratinocitos, células endoteliales, hepatocitos, melanocitos, etc., mezcla de nutrientes F10 y mezcla de nutrientes F12. Otros medios, complementos de medios y subgrupos de medios adecuados para la preparación mediante la invención están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, y Sigma; St. Louis, Missouri). Las formulaciones para estos medios, complementos de medios y subgrupos de medios, así como muchos otros medios, complementos de medios y subgrupos de medios de cultivo de células animales utilizados comúnmente se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Catálogo y Guía de Referencia de GIBCO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) y en el Catálogo de Células Animales de Sigma (Sigma; St. Louis, Missouri).

Los ejemplos de medios de cultivo de células vegetales que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, medios de cultivo de plantas de Anderson, medios basales CLC, medios de Gamborg, medios de cultivo de plantas marinas de Guillard, medios marinos de Provasoli, medios de Kao y Michayluk, medios de Murashige y Skoog, medios para plantas leñosas de McCown, medios para orquídeas de Knudson, medios para orquídeas de Lindermann, y medios de Went y Vacin. Las formulaciones para estos medios, que están disponibles comercialmente, así como para muchos otros medios de cultivo de células vegetales utilizados comúnmente, se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse por ejemplo en el Catálogo de Cultivo de Células Vegetales de Sigma (Sigma; St. Louis, Missouri).

Los ejemplos de los medios de cultivo de células bacterianas que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, medios de tripticasa-soja, medios de infusión de cerebro-corazón, medios de extractos de levaduras, medios de extractos de levaduras-peptona, medios de infusión de carne de vacuno, medios de tioglicolato, medios de indol-nitrato, medios MR-VP, medios de citrato de Simmons, medios CTA, medios de bilis-esculina, medios de Bordet-Gengou, medios de carbón-extracto de levaduras (CYE), medios de manitol-sales, medios de MacConkey, medios de eosina-azul de metileno (EMB), medios de Thayer-Martin, medios de Salmonella-Shigella, y medios de ureasa. Las formulaciones para estos medios, que están disponibles comercialmente, así como para muchos otros medios de cultivo de células bacterianas utilizados comúnmente, se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Manual de DIFCO (DIFCO; Norwood, Massachusetts) y en el Manual de Microbiología Clínica (Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC).

Los ejemplos de medios de cultivo de células fúngicas, particularmente medios de cultivo de células de levaduras, que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, medios de Sabouraud y medios de morfología de levaduras (YMA). Las formulaciones para estos medios, que están disponibles comercialmente, así como para muchos otros medios de cultivo de células de levaduras utilizados comúnmente, se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Manual de DIFCO (DIFCO; Norwood, Massachusetts) y en el Manual de Microbiología Clínica (Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC).

Tal como apreciará el experto, cualquiera de los medios anteriores u otros medios que pueden prepararse según la presente invención también pueden incluir uno o más componentes adicionales, tales como agentes indicadores o de selección (por ejemplo, colorantes, antibióticos, aminoácidos, enzimas, sustratos y similares), filtros (por ejemplo, carbón vegetal), sales, polisacáridos, iones, detergentes, estabilizadores y similares. La invención no se limita en su aplicación a medios formulados actualmente, sino que es aplicable ampliamente a cualquier formulación para cultivar células.

En una realización particularmente preferida de la invención, los medios de cultivo descritos anteriormente pueden comprender una o más sales tampón, preferiblemente bicarbonato de sodio, a concentraciones suficientes para proporcionar una capacidad de tamponamiento óptima para el medio de cultivo. Puede añadirse una sal tampón, tal como bicarbonato de sodio, en forma de polvo al medio en polvo antes de, durante o tras la aglomeración del medio. En un ejemplo, puede añadirse el bicarbonato de sodio al medio de cultivo antes de, durante o tras la aglomeración con un disolvente apropiado (tal como agua, suero o un agente de ajuste de pH tal como un ácido (por ejemplo, HCl a una concentración de 0,1 M a 5 M, preferiblemente a 1 M) o una base (por ejemplo, NaOH a una concentración de 0,1 M a 5 M, preferiblemente a 1 M) de tal manera que, tras la reconstitución del medio aglomerado, el medio de cultivo está a un pH óptimo o sustancialmente óptimo para el cultivo de una variedad de tipos celulares. Por ejemplo, los medios de cultivo de células bacterianas preparados mediante los presentes procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de aproximadamente 4-10, más preferiblemente de aproximadamente 5-9 o de aproximadamente 6-8,5. Los medios de cultivo de células fúngicas (por ejemplo, levaduras) preparados mediante los presentes procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de aproximadamente 3-8, más preferiblemente de aproximadamente 4-8 o de aproximadamente 4-7,5; los medios de cultivo de células animales preparados mediante los presentes procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de aproximadamente 6-8 o de aproximadamente 7-8, más preferiblemente de aproximadamente 7-7,5 o de aproximadamente 7,2-7,4; y los medios de cultivo de células vegetales preparados mediante los presentes procedimientos, tras la reconstitución, preferiblemente tendrán un pH de aproximadamente 4-8, preferiblemente de aproximadamente 4,5-7, 5-6 ó 5,5-6. Por supuesto, el pH óptimo para un medio de cultivo dado que va a utilizarse en un tipo celular particular también puede determinarlo empíricamente un experto usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden cultivarse células gástricas a pH muy inferiores a los de otras células, por ejemplo, de 1-3. Un experto aprecia que otras células adaptadas a entornos agresivos pueden tener tolerancias o necesidades especiales que podrían estar fuera de los intervalos normales que satisfacen las condiciones de cultivo para las células cultivadas comúnmente.

En otro ejemplo, pueden añadirse una o más sales tampón, por ejemplo, bicarbonato de sodio, directamente a un medio nutritivo en polvo mediante la aglomeración del/de los tampón/tampones en el medio usando un aparato de lecho fluidizado, o secando por pulverización el/los tampón/tampones sobre un medio en polvo aglomerado o seco (usando un aparato de secado por pulverización tal como se describe a continuación). En una realización relacionada, puede añadirse un agente de ajuste del pH tal como un ácido (por ejemplo, HCl) o una base (por ejemplo, NaOH) a un medio nutritivo en polvo, que puede contener una o más sales tampón (tales como bicarbonato de sodio), mediante la aglomeración del agente de ajuste del pH en el medio nutritivo en polvo en un aparato de lecho fluidizado, mediante el secado por pulverización del agente de ajuste del pH sobre el medio nutritivo aglomerado o en polvo, o mediante una combinación de los mismos; este enfoque obvia la adición subsiguiente de un agente de ajuste del pH tras la reconstitución del medio en polvo. Por tanto, el procedimiento descrito en la frase anterior proporciona un medio de cultivo nutritivo en polvo útil en el cultivo o crecimiento de células in vitro que, tras la reconstitución con un disolvente (por ejemplo, agua o suero), tiene un pH que es óptimo para el soporte del cultivo o crecimiento celular sin necesidad de ajuste del pH del medio líquido. Este tipo de medio, definido en el presente documento como "medio con ajuste de pH de manera automática", por tanto obvia las etapas que requieren mucho tiempo y propensas a errores de adición de tampón/tampones al medio tras la reconstitución y ajuste del pH del medio tras la disolución del/de los tampón/tampones. Por ejemplo, un medio de cultivo de células de mamíferos preparado según estos procedimientos puede, tras la reconstitución, tener un pH de entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,5, más preferiblemente entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,4 y lo más preferiblemente de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4 o de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,3. La preparación de un ejemplo de medio de cultivo con ajuste de pH de manera automática de este tipo se muestra con mayor detalle a continuación en los ejemplos 3 y 6.

Los ejemplos de los complementos de medios que pueden prepararse como polvos mediante los presentes procedimientos incluyen, sin limitación, sueros animales (tal como sueros bovinos (por ejemplo, suero bovino fetal, de ternero recién nacido y de ternero), sueros humanos, sueros equinos, sueros porcinos, sueros de mono, sueros de simio, sueros de rata, sueros murinos, sueros de conejo, sueros ovinos y similares), sustitutos definidos tales como LipoMAX®, OptiMAb®, Knock-Out^{TM} SR (cada uno disponible de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), hormonas (incluyendo hormonas esteroideas tales como corticosteroides, estrógenos, andrógenos (por ejemplo, testosterona) y hormonas peptídicas tales como insulina, citocinas (incluyendo factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, aFGF, bFGF, HGF, IGF-1, IGF-2, NGF y similares), interleucinas, factores estimulantes de colonias, interferones y similares), neurotransmisores, lípidos (incluyendo fosfolípidos, esfingolípidos, ácidos grasos, colesterol y similares), factores de adhesión (incluyendo componentes de la matriz extracelular tales como fibronectina, vitronectina, lamininas, colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y similares), y extractos de tejidos, órganos o glándulas de animales (tales como extracto de hipófisis bovina, extracto de cerebro bovino, extracto de embrión de pollo, extracto de embrión bovino, extracto de carne o tejido de pollo, tendón de Aquiles y extractos de los mismos) y similares). Otros complementos de medios que pueden producirse mediante los presentes procedimientos incluyen una variedad de proteínas (tales como albúminas séricas, particularmente albúminas séricas humana o bovina; inmunoglobulinas y fragmentos o complejos de las mismas; aprotinina; hemoglobina; hemina o hematina; enzimas (tales como tripsina, colagenasas, pancreatinina o dispasa); lipoproteínas; fetuina; ferritina; etc.), que pueden ser naturales o recombinantes; vitaminas; aminoácidos y variantes de los mismos (incluyendo, pero sin limitarse a, L-glutamina y cistina), cofactores enzimáticos; polisacáridos; sales o iones (incluyendo oligoelementos tales como sales o iones de molibdeno, vanadio, cobalto, manganeso, selenio, y similares); y otros complementos y composiciones que son útiles en el cultivo de células in vitro con los que estará familiarizado el experto. Estos sueros y otros complementos de medios están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, y Sigma Cell Culture, St. Louis, Missouri); alternativamente, los sueros y otros complementos de medios descritos anteriormente pueden aislarse de sus fuentes naturales o producirse de manera recombinante mediante procedimientos conocidos en la técnica que serán rutinarios para el experto (véase Freshney, R.I., Culture of Animal Cells, Nueva York: Alan R. Liss, Inc., págs. 74-78 (1983), y las referencias citadas en ese documento; también véase Harlow, E., y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory, págs. 116-120 (1988)).

Los ejemplos de los tampones que pueden prepararse según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, formulaciones de solución salina tamponada con fosfato (PBS), formulaciones de solución salina tamponada con Tris (TBS), formulaciones de solución salina tamponada con HEPES (HBS), soluciones salinas equilibradas de Hank (HBSS), PBS de Dulbecco (DPBS), soluciones salinas equilibradas de Earle, soluciones salinas de Puck, soluciones salinas basales para plantas de Murashige y Skoog, soluciones salinas basales para plantas marinas de Keller, soluciones salinas basales para plantas marinas de Provasoli y soluciones salinas basales de Kao y Michayluk. Las formulaciones para estos tampones, que están disponibles comercialmente, así como para muchos otros tampones utilizados comúnmente, se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el Catálogo y Guía de Referencia de GIBCO (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California), en el Manual de DIFCO (DIFCO; Norwood, Massachusetts) y en
los Catálogos de Cultivo Celular de Sigma para el cultivo de células animales y vegetales (Sigma; St. Louis, Missouri).

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Preparación de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo

Los procedimientos de la presente invención prevén la preparación de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo descritos anteriormente. Estos medios, complementos, subgrupos y tampones en polvo se preparan usando aglomeración (por ejemplo, tecnología de lecho fluidizado) y opcionalmente por medio de secado por pulverización.

En una realización, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo se preparan usando la tecnología de lecho fluidizado para aglomerar las disoluciones de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones, produciendo de ese modo sus formas en polvo seco. La tecnología de lecho fluidizado es un proceso de producción de polvos aglomerados que tienen características alteradas (particularmente, por ejemplo, la solubilidad) a partir de los materiales de partida. En las aplicaciones generales de la tecnología, los polvos se suspenden en una columna de aire con movimiento ascendente mientras que al mismo tiempo una cantidad controlada y definida de líquido se inyecta en el flujo de polvo para producir un estado humedecido del polvo; luego se usa calor suave para proporcionar la energía para el secado del material, produciéndose de ese modo un polvo aglomerado.

Están disponibles comercialmente aparatos para producir y/o procesar materiales particulados mediante la tecnología de lecho fluidizado (por ejemplo, de Niro, Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland), y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.^{os} 3.771.237; 4.885.848; 5.133.137; 5.357.688 y 5.392.351; y en el documento WO 95/13867. La aglomeración también incluye variaciones en la tecnología de lecho fluidizado tradicional o adiciones a la tecnología de lecho fluidizado convencional tales como mezcladoras Processall Mixmill, mezcladora/extrusora Extrud-O-Mix, mezcladora/recubridora Turbulizer y extrusora/granuladora Bextruder. Véanse, por ejemplo, los productos de Hosokawa Bepex Corporation, 333 NE Taft St., Minneapolis, MN 55413-2810 y sus competidores. Tales aparatos se han usado para preparar los polvos aglomerados de diversos materiales, incluyendo suero de leche (patente estadounidense n.º 5.006.204), emulsiones de carne aciduladas (patente estadounidense n.º 4.511.592), proteasas (patente estadounidense n.º 4.689.297) y otras proteínas (documento DK 167090 B1) y bicarbonato de sodio (patente estadounidense n.º 5.325.606).

Según esta realización, puede usarse la tecnología de lecho fluidizado para preparar medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones aglomerados en volumen. En la práctica de esta realización, se coloca un medio nutritivo, complemento de medio o tampón en polvo seco en una máquina de aglomeración, por ejemplo, un aparato de lecho fluidizado y se somete a la aglomeración en su interior. Los medios nutritivos en polvo (particularmente medios de cultivo celular en polvo), complementos de medios en polvo (particularmente sueros animales en polvo) y tampones en polvo (particularmente soluciones salinas tamponadas en polvo), pueden obtenerse preparadas previamente de fuentes comerciales (por ejemplo, Invitrogen Corporation, Carlsbad California). Alternativamente, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo pueden prepararse mezclando componentes individuales o conjuntos de componentes según las formulaciones descritas anteriormente. Tales formulaciones pueden incluir componentes que normalmente no están presentes en las formulaciones de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo debido a su inestabilidad, tales como suero, L-glutamina, cistina, insulina, transferrina, lípidos (particularmente fosfolípidos, esfingolípidos, ácidos grasos y colesterol), citocinas (particularmente factores de crecimiento, interleucinas, factores estimulantes de colonias e interferones), neurotransmisores y tampones (particularmente bicarbonato de sodio). Si se añade L-glutamina a la formulación, puede ser en forma de un complejo con cationes divalentes tales como calcio o magnesio (véase la patente estadounidense n.º 5.474.931). En otro ejemplo, pueden mezclarse dos o más componentes en polvo y entonces aglomerarse para producir medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones complejos. Por ejemplo, puede mezclarse un medio nutritivo en polvo con un suero en polvo (producido, por ejemplo, mediante secado por pulverización tal como se describe a continuación) tal como FBS a una concentración de suero de aproximadamente el 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% o superior (p/p como un porcentaje del medio en polvo); la mezcla de suero-medio en polvo resultante puede entonces aglomerarse para producir un complejo de suero-medio aglomerado que se disolverá fácilmente en un disolvente de reconstitución y por tanto estará listo para su uso sin complementación adicional.

Una vez que se coloca el medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en polvo (o mezcla de los mismos) en el aparato de lecho fluidizado, se somete a suspensión en una columna con movimiento ascendente de un gas, preferiblemente aire atmosférico o un gas inerte tal como nitrógeno, y se hace pasar a través de uno o más filtros de partículas. Dado que la mayoría de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones no aglomerados, de polvo seco son de un tamaño de partícula relativamente pequeño, los filtros que han de usarse en la invención deben ser tamices de mallas que permitan que el aire fluya a su través pero que retengan los polvos, por ejemplo filtros de aproximadamente 1-100 de malla, preferiblemente de aproximadamente 2-50 de malla, más preferiblemente de aproximadamente 2,5-35 de malla, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3-20 de malla o de aproximadamente 3,5-15 de malla y lo más preferiblemente de aproximadamente 4-6 de malla.

Tras la colocación dentro de la cámara de lecho fluidizado, el medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón de polvo seco (o mezcla de los mismos) se somete entonces a aglomeración inyectando, preferiblemente usando una boquilla de pulverización en el aparato de lecho fluidizado, una cantidad definida y controlada de disolvente en el polvo, para producir un polvo humedecido. Los disolventes preferidos para su uso en la presente invención incluyen cualquier disolvente que sea compatible con la formulación del medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón. Por "compatible" se entiende que el disolvente no induce cambios perjudiciales irreversibles en las características físicas o de rendimiento del medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón, tales como degradación de los componentes de nutrientes del medio nutritivo o cambios en las características iónicas del tampón. Disolventes particularmente preferidos para su uso en la invención son el agua (lo más particularmente agua destilada y/o desionizada), suero (particularmente suero bovino o humano y lo más particularmente suero de ternero o suero bovino fetal), disolventes orgánicos (particularmente dimetilsulfóxido, alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, glicoles, etc.), éteres (por ejemplo, MEK), cetonas (por ejemplo, acetona), y similares), y cualquier combinación o secuencia de los mismos, pudiendo contener cualquiera de los mismos uno o más componentes adicionales (por ejemplo, sales, polisacáridos, iones, detergentes, estabilizadores, etc.).

Puede ser deseable o ventajoso incluir en el disolvente uno o más componentes que, debido a las concentraciones de los componentes requeridos en el producto final, no pueden incorporarse de manera óptima en el producto mediante otros procedimientos tales como la molienda con molino de bolas. El/los componente(s) puede(n) disolverse, suspenderse, formarse como coloides o introducirse de otra manera en el disolvente a la concentración deseada, antes del uso del disolvente en la aglomeración del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en polvo de la invención. Los componentes pueden incorporarse ventajosamente en el disolvente de tal manera incluyen, pero no se limitan a, uno más de los sueros, hormonas, citocinas, neurotransmisores, lípidos, factores de adhesión, proteínas, aminoácidos, vitaminas, cofactores enzimáticos, polisacáridos, sales, iones, tampones y similares descritos anteriormente.

El/los disolvente(s) debe(n) introducirse en el polvo seco en un volumen que depende de la masa del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón en polvo que va a aglomerarse. Los volúmenes preferidos de disolvente por 500 gramos de medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón son de aproximadamente 5-100 ml, más preferiblemente de aproximadamente 10-50 ml, todavía más preferiblemente de aproximadamente 25-50 ml, y lo más preferiblemente de aproximadamente 35 ml. Por supuesto, un experto se da cuenta de que las consideraciones de escala influirán en el volumen y la velocidad o el suministro del disolvente. Velocidades de introducción de disolvente preferidas por 500 gramos de medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón son una velocidad de aproximadamente 1-10 ml/min., preferiblemente de aproximadamente 2-8 ml/min., más preferiblemente de aproximadamente 4-8 ml/min. y lo más preferiblemente de aproximadamente 6 ml/min. En algunas situaciones, puede ser deseable realizar ciclos entre añadir disolvente durante aproximadamente un minuto y luego no añadir disolvente durante aproximadamente un minuto (permitiendo el secado del polvo dentro de la cámara del aparato), de manera que se impida la aglutinación del polvo durante la aglomeración. En algunas situaciones puede ser deseable realizar ciclos entre añadir un primer disolvente y un segundo o tercer disolvente, con o sin un periodo en el que no se añade disolvente. En algunas situaciones puede ser deseable añadir varios disolventes de manera coincidente desde orificios separados dentro del aparato.

Una vez que la aglomeración del polvo es completa, como se evidencia por un mayor tamaño de partícula que el del polvo no aglomerado, original y por la ausencia de partículas de polvo fino en el polvo aglomerado, se seca completamente el polvo en el aparato. En algunas situaciones puede ser deseable secar parcial o completamente un polvo antes de añadir ingredientes adicionales con un segundo o tercer disolvente. En algunas situaciones puede ser deseable usar un disolvente anterior, por ejemplo, un primer disolvente como un disolvente posterior, por ejemplo, un tercer disolvente. En algunas situaciones puede ser deseable usar un disolvente sencillo como, por ejemplo, primer disolvente y un disolvente complejo, por ejemplo, como segundo disolvente. Un experto apreciará que son posibles muchos órdenes y secuencias y que pueden determinarse las condiciones óptimas mediante procedimientos simples conocidos en la técnica. Temperaturas preferidas de los aparatos para el secado del polvo aglomerado son de aproximadamente 50-80ºC, más preferiblemente de aproximadamente 55-75ºC, y lo más preferiblemente de aproximadamente 60-65ºC; el polvo se seca preferiblemente en el aparato durante aproximadamente 3-10 minutos y lo más preferiblemente durante aproximadamente 5-7 minutos, por 500 gramos de polvo. Se elige la temperatura de tal manera que se eviten efectos perjudiciales tales como la desnaturalización irreversible de los ingredientes. Temperaturas superiores, por ejemplo, de 80-150ºC, o temperaturas superiores o inferiores, por ejemplo, de 20-40ºC pueden ser especialmente ventajosas cuando se usan disolventes menos volátiles o más volátiles, respectivamente.

Se elige el flujo de aire para mantener las condiciones de fluido en el lecho. La temperatura se puede ajustar para retener el líquido introducido en el aparato durante un periodo de tiempo que permita una aglomeración suficiente. La aglomeración es generalmente suficiente cuando las partículas son de mayor tamaño que los polvos que van a aglomerarse y cuando los ingredientes introducidos con el disolvente se asimilan en partículas de mayor tamaño. Por ejemplo, cuando se usan disolventes más volátiles, puede usarse una temperatura inferior, por ejemplo, de -10ºC, 0ºC, 5ºC, 10ºC, 20ºC, 25ºC, 35ºC o 40ºC. Un experto apreciará que según se volatilice(n) el/los disolvente(s), se requiere energía que tenderá a enfriar la mezcla de aglomeración. Por tanto, la temperatura puede controlarse mediante el control del tipo y la velocidad de suministro de disolvente y la velocidad de calentamiento de la mezcla. La aglomeración de los ingredientes disueltos se logra preferiblemente cuando el líquido puede actuar como un agente para unir, por ejemplo, mediante fuerzas superficiales, polvos más pequeños, ingredientes disueltos o ingredientes suspendidos o formados como coloides a la mezcla de aglomeración en el lecho. Por tanto, la temperatura de aglomeración variará con el disolvente en uso, con la velocidad de flujo que mantiene el lecho fluidizado, la velocidad de suministro del/de los disolvente(s), la velocidad de volatilización del/de los disolvente(s) y la velocidad de calentamiento. La temperatura puede oscilar, por ejemplo, desde un límite inferior, por ejemplo, -20ºC, -10ºC, 0ºC, 5ºC, 10ºC, 20ºC, 25ºC, 35ºC, 40ºC o 50ºC cuando se usan disolventes volátiles o durante un tiempo de residencia más largo del líquido para efectuar la aglomeración, hasta un límite superior, por ejemplo, 40ºC, 50ºC, 60ºC, 65ºC, 75ºC, 85ºC, 90ºC, 95ºC, 100ºC, 110ºC, 120ºC, 125ºC, 140ºC, 150ºC, 175ºC, 200ºC, 220ºC, 240ºC, 250ºC, 275ºC, 300ºC o más para disolventes menos volátiles, para una volatilización más rápida y cuando es necesario menos tiempo de aglomeración. Por ejemplo, cuando se están usando múltiples disolventes o bien de manera coincidente o bien de manera secuencial, el disolvente menos volátil puede ser suficiente para la aglomeración permitiendo una volatilización más rápida de un disolvente más volátil.

Puede usarse una mezcla de disolventes para controlar el tiempo de volatilización de modo que el líquido resida en el aparato durante un tiempo suficiente para efectuar la aglomeración. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de un disolvente más volátil, por ejemplo, un disolvente orgánico tal como alcohol, especialmente etanol, y un disolvente menos volátil, por ejemplo, un disolvente polar tal como el agua. Por ejemplo, un ingrediente insoluble o escasamente soluble en un disolvente polar puede ser soluble en un disolvente orgánico. El ingrediente puede ser soluble en una mezcla de disolvente polar y orgánico. Por tanto, algunas realizaciones usan una mezcla de disolvente orgánico y polar para suministrar uno o más ingredientes. La mezcla de disolventes, es decir, la razón del disolvente polar con respecto al orgánico variará con el/los ingrediente(s) que vayan a asimilarse en el lecho. Los parámetros que van a usarse en la elección de la mezcla incluirán la solubilidad, por ejemplo, la razón podría ajustarse para contener la mínima cantidad de disolvente orgánico que suministrará la cantidad deseada del/de los ingrediente(s) para la aglomeración; la volatilidad, por ejemplo, la razón puede ajustarse para contener un disolvente menos volátil que dé como resultado una aglomeración suficiente; preocupaciones sobre seguridad o normativas, por ejemplo, la razón podría ajustarse para contener una mínima cantidad de disolvente orgánico que sea suficiente para la solvatación y aglomeración en el lecho pero que no presente riesgos indebidos para el lugar de trabajo o el entorno o pueden elegirse o evitarse disolventes específicos para cumplir con las normativas; las condiciones del lecho, por ejemplo, la mezcla puede elegirse de modo que se logre una temperatura y/o flujo deseados suficientes para la aglomeración; usos específicos del polvo de los medios, por ejemplo, para algunos usos, los protocolos de fabricación incluirán preferiblemente uno o más disolventes, mientras que excluirán o prohibirán preferiblemente otros disolventes; y la compatibilidad con el aparato, por ejemplo, disolventes o mezclas de disolvente que permitan la fácil introducción a través de un orificio o boquilla y que no daña de manera inaceptable los componentes de los aparatos. La mezcla puede introducirse de varias maneras. Por ejemplo, puede prepararse una mezcla de disolventes, opcionalmente con uno o más ingredientes solubles, formados como coloides o suspendidos, y suministrarse como una mezcla a través de un orificio o boquilla. Otra manera en que puede obtenerse una mezcla es introduciendo disolventes separados o mezclas de disolventes a través de rutas separadas. Por ejemplo, la separación puede ser espacial, podrían usarse múltiples orificios o boquillas; la separación podría ser temporal, los disolventes o mezclas podrían introducirse secuencialmente a través de un único orificio o boquilla o a través de orificios o boquillas separados; la separación puede implicar diferentes fases, puede introducirse un disolvente como un vapor antes, durante y/o después de la introducción de un disolvente en una fase líquida, o puede suministrarse un disolvente como un componente sólido al lecho y volatilizarse durante el funcionamiento del lecho; etc. Cualquier medio para la introducción se aplicará igualmente para suministrar los disolventes o las mezclas de disolventes.

En otra realización de la invención, pueden prepararse los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo mediante secado por pulverización. En este aspecto de la invención, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en sus formas líquidas se colocan en un aparato de secado por pulverización; estos líquidos se convierten entonces en sus polvos correspondientes mediante la pulverización de la disolución dentro de una cámara en el aparato en condiciones apropiadas para producir los polvos, tales como a temperatura y humedad controladas, hasta que se formen los polvos. En algunas situaciones, puede ser deseable o ventajoso secar por pulverización mezclas complejas de dos o más de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y/o tampones descritos anteriormente. Por ejemplo, pueden mezclarse medios nutritivos líquidos que contienen sueros animales a una concentración deseada, o sueros animales líquidos que contienen componentes de medios nutritivos a concentraciones deseadas, y entonces prepararse como polvos secados por pulverización según los procedimientos de la invención. El secado por pulverización y otros procedimientos para obtener polvos pueden proporcionar ingredientes de polvo para la aglomeración.

En un enfoque típico de secado por pulverización, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones líquidos se aspiran en el aparato y se atomizan en una pulverización con un atomizador de tipo giratorio o de boquilla. La pulverización líquida atomizada resultante se mezcla entonces con un gas (por ejemplo, nitrógeno o más preferiblemente aire) y se pulveriza en una cámara de secado en condiciones suficientes para promover la producción de un producto en polvo. Estas condiciones pueden comprender el control electrónico de la temperatura y la humedad dentro de la cámara de tal manera que se promueve el secado final del producto. En estas condiciones, el disolvente en el líquido se evapora de manera controlada, formándose de ese modo partículas de flujo libre (es decir, polvo) de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones de la invención. Entonces se descarga el polvo de la cámara de secado, y se hace pasar a través de uno o más filtros (tales como la tamices de malla descritos anteriormente para la preparación de lecho fluidizado) y se recoge para su procesamiento adicional (por ejemplo, envasado, esterilización, etc.). En algunas aplicaciones, particularmente cuando se producen polvos a partir de formulaciones sensibles al calor de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones, el aparato de secado por pulverización puede combinarse con un aparato de lecho fluidizado integrado dentro de la cámara de secado, lo que permite la introducción de disolventes de aglomeración tales como los descritos anteriormente en el polvo secado por pulverización para producir medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo secados por pulverización aglomerados.

Los aparatos para producir materiales particulados a partir de materiales líquidos mediante secado por pulverización (con o sin la tecnología de lecho fluidizado integrado) están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Niro, Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland), y se describen, por ejemplo, en los folletos técnicos "Spray Drying" ("Secado por pulverización"), "Powdered Pharmaceuticals by Spray Drying" ("Productos farmacéuticos en polvo mediante secado por pulverización") y "Fresh Options in Drying" ("Nuevas opciones de secado") de Niro, Inc./Aeromatic-Fielder, cuyas descripciones se incorporan como referencia al presente documento en su totalidad. Según este fabricante, tales aparatos se han utilizado para preparar polvos de diversos materiales, incluyendo productos lácteos, analgésicos, antibióticos, vacunas, vitaminas, levaduras, proteínas vegetales, huevos, productos químicos, aromatizantes alimentarios y similares. En la presente invención, se ha descubierto que el secado por pulverización es particularmente útil para la preparación de complementos de medios en polvo, tales como sueros y en particular aquellos sueros descritos anteriormente, lo más particularmente sueros bovinos y humanos (tales como suero de ternero y suero bovino fetal).

En la práctica de esta realización de la invención, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios, tampones o agentes de ajuste del pH líquidos pueden pulverizarse en la cámara a través del atomizador a una velocidad de pulverización de aproximadamente 25 a 100 g/min., preferiblemente a una velocidad de pulverización de aproximadamente 30-90 g/min., 35-85 g/min., 40-80 g/min., 45-75 g/min., 50-75 g/min., 55-70 g/min. o 60-65 g/min., y más preferiblemente a aproximadamente 65 g/min.. La temperatura del aire de entrada en el atomizador se ajusta preferiblemente a aproximadamente 100-300ºC, más preferiblemente a aproximadamente 150- 250ºC, y lo más preferiblemente a aproximadamente 200ºC, con una temperatura de salida de aproximadamente 50-100ºC, más preferiblemente de aproximadamente 60-80ºC, y lo más preferiblemente aproximadamente 70ºC. El flujo de aire en el atomizador se ajusta preferiblemente a aproximadamente 50-100 kg/h, más preferiblemente de aproximadamente 75-90 kg/h, y lo más preferiblemente de aproximadamente 80,0 kg/h, a una presión en la boquilla de aproximadamente 100-500 kPa, más preferiblemente de aproximadamente 200-300 kPa, y lo más preferiblemente de aproximadamente 200 kPa. Se ha encontrado en la presente invención que estas condiciones y ajustes son preferibles para la producción de una variedad de polvos de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones mediante secado por pulverización, particularmente para la producción de los sueros en polvo descritos anteriormente. Tras el secado, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo secados por pulverización pueden recogerse en la cámara de secado a través de uno o más filtros, preferiblemente tales como aquellos descritos anteriormente para la tecnología de lecho fluidizado.

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Tras esta preparación, los polvos de la invención preparados mediante los procedimientos de lecho fluidizado o de secado por pulverización descritos anteriormente tienen características físicas alteradas con respecto a las de los polvos de partida o a las de los medios, complementos, subgrupos y tampones en polvo preparados liofilizando los correspondientes líquidos. Por ejemplo, los polvos no procesados o liofilizados con frecuencia producen un significativo polvo fino cuando se usan, y se disuelven escasa o lentamente en diversos disolventes, mientras que los aglomerados están sustancialmente libres de polvo fino y/o se disuelven rápidamente. Normalmente, los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo de la invención presentarán tanto una formación de polvo fino reducida como una disolución más rápida que sus equivalentes en polvo preparados mediante técnicas convencionales tales como la molienda con molino de bolas. En algunos polvos que están sustancialmente libres de polvo fino pero que no pueden demostrar una disolución mejorada, los polvos pueden disolverse rápidamente mediante solvatación mecánica rápida del polvo, tal como usando una rueda de paletas mecánica, o en primer lugar proporcionando una niebla de disolvente sobre el polvo tal como mediante solvatación por pulverización.

Por tanto, en una realización de la invención, los enfoques de secado por pulverización y aglomeración descritos anteriormente se combinan para producir polvos de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones secados por pulverización aglomerados. En esta realización, un medio, complemento, subgrupo o tampón en polvo que se ha preparado mediante secado por pulverización puede, tras haberse secado por pulverización, aglomerarse entonces con un disolvente (tales como aquellos descritos anteriormente) para mejorar adicionalmente las características físicas y de rendimiento del medio, complemento, subgrupo o tampón resultante. Por ejemplo, puede prepararse un polvo de suero de animal secando por pulverización suero animal líquido tal como se describió anteriormente, y este polvo de suero secado por pulverización puede mezclarse entonces en los medios nutritivos de polvo seco (preparados mediante secado por pulverización o mediante técnicas convencionales tales como la molienda con molino de bolas); este polvo mezclado puede aglomerarse entonces tal como se describió anteriormente. Alternativamente, un polvo de medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o tampón secado por pulverización puede aglomerarse como anteriormente, para mejorar las propiedades de disolución del polvo. Este enfoque puede ser particularmente ventajoso cuando se secan por pulverización líquidos con bajo contenido en sólidos (aproximadamente del 1-10%), tal como sueros animales líquidos. Como apreciará un experto, estos enfoques facilitarán la preparación de un lote grande de uno o más componentes (por ejemplo, sueros u otros complementos de medios) que se usan como una reserva para la adición a un medio, complemento, subgrupo o tampón en polvo a una concentración deseada, mientras que también se obtienen los beneficios de la aglomeración descritos anteriormente. Además, este enfoque puede reducir la variabilidad entre lotes, lo que puede ser un problema con ciertos complementos de medios (particularmente sueros animales).

Los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo aglomerados o secados por pulverización preparados tal como se describió anteriormente pueden envasarse entonces, por ejemplo en recipientes tales como viales, tubos, botellas, bolsas, sobres, cajas, cajas de cartón, bidones y similares, antes de o tras la esterilización tal como se describe a continuación. Los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo pueden envasarse en una forma envasada al vacío, compacta, tal como la conocida en la técnica como "envase tipo brick" en el que se envasa el polvo en un recipiente flexible (tal como una bolsa o un sobre) que se sella mientras se practica el vacío. Tales envases pueden comprender ventajosamente una o más orificios de entrada (tales como válvulas, orificios de cierre tipo luer, etc.) que permiten la introducción de un disolvente (por ejemplo, agua, sueros, medios u otros disolventes o disoluciones acuosos u orgánicos) directamente en el envase para facilitar la rápida disolución del polvo. El envase puede comprender dos o más compartimentos adyacentes, uno o más de los cuales pueden contener uno o más de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones de polvo seco de la invención y uno u otros más de los cuales pueden contener uno o más disolventes acuosos u orgánicos que pueden ser estériles. Entonces, el polvo seco puede disolverse simplemente eliminando o rompiendo la barrera entre los compartimentos, de manera ideal sin pérdida de esterilidad, para permitir la mezcla del polvo y el disolvente de tal manera que el polvo se disuelve y produce un medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o tampón estéril a una concentración deseada.

Los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones envasados de la invención se almacenan preferiblemente durante tiempos prolongados, y a las temperaturas, indicadas anteriormente, normalmente durante aproximadamente 1-24 meses a temperaturas inferiores a aproximadamente 30ºC, más preferiblemente a temperaturas inferiores a aproximadamente 20-25ºC, hasta su uso. A diferencia de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo tradicionales, el almacenamiento a temperaturas reducidas (por ejemplo, 0-4ºC) no es necesario para el mantenimiento de las características de rendimiento de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones preparados mediante los presentes procedimientos. Por supuesto, pueden requerirse otras temperaturas de almacenamiento para aquellos aspectos de la invención en los que los envases también comprenden compartimentos separados que contienen uno o más disolventes; en estos casos, las condiciones de almacenamiento óptimas estarán impuestas por los requisitos de almacenamiento del/de los disolvente(s) que conocerá el experto.

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Aglomeración de lípidos o solutos no acuosos

Una ventaja particular de la presente invención son los procedimientos que logran la aglomeración de lípidos e ingredientes no suficientemente solubles en preparaciones de disolventes acuosos comunes en los medios de polvo seco. Convencionalmente, tales ingredientes se han añadido en procedimientos por debajo del nivel óptimo, por ejemplo, como concentrados disueltos en disolvente orgánico. Mediante los procedimientos de la presente invención, pueden conseguirse medios de polvo seco que contienen solutos no acuosos deseados.

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Son ejemplos de tales solutos no acuosos: ácidos grasos, grasas neutras, ceras, esteroides y compuestos esteroideos, fosfátidos, glicolípidos (por ejemplo, esfingosinas, cerebrósidos, ceramidas, gangliósidos), lipoproteínas, fosfolípidos, fosfoglicéridos (por ejemplo, etanolaminas tales como fosfatidiletanolamina o fosfoglicérido de etanolamina, colinas tales como fosfatidilcolina o fosfoglicérido de colina), lipoaminoácidos, cardiolipina y compuestos relacionados, plasmalógenos, esteroles (por ejemplo, colesterol, lanosterol), terpenos, vitaminas liposolubles (por ejemplo, vitamina A y sus vitámeros, vitamina E y sus vitámeros, vitamina K y sus vitámeros, vitamina D y sus vitámeros). Las proteínas liposolubles también son ejemplos de lípidos tal como se usan en los medios en aspectos de la presente invención.

Un aspecto de la presente invención comprende procedimientos para incorporar de uno o más lípidos en un polvo seco. Los lípidos pueden introducirse suministrando un disolvente que contiene el/los lípido(s) a un lecho de aglomeración. Por ejemplo, un disolvente orgánico que contiene el/los lípido(s) puede introducirse en el aparato de aglomeración. Preferiblemente, se usa un disolvente de baja toxicidad. Dependiendo del tipo celular para el que está preparándose el medio, pueden preferirse disolventes tales como alcoholes, por ejemplo, metanol o etanol. Los disolventes pueden disolver perfectamente el/los componente(s) lipídico (s) o pueden disolver el/los componente(s) en presencia de otro(s) disolvente(s) o soluto(s). Tras la disolución, puede añadirse otro componente, por ejemplo, otro lípido o disolvente.

La mezcla de disolventes que va a introducirse en el aparato puede introducirse antes de, después y/o durante el suministro de otro disolvente o mezcla. El otro disolvente o mezcla puede contener alguno del/de los mismo(s) disolvente(s) o componente(s) como la mezcla de disolventes. Por tanto, una mezcla de disolventes puede contener cualquier razón de disolventes. Por ejemplo, mezclas preferidas de disolventes que van a usarse en la mezcla de disolventes pueden contener agua y alcohol, más preferiblemente, por ejemplo, para la mayoría de células de mamíferos, agua y etanol. La razón se seleccionará según los parámetros descritos anteriormente y por ejemplo puede ser de tan sólo aproximadamente, por ejemplo, el 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 40, 50, 60, 67, 70, 75 o de hasta el 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de etanol (v/v), siendo el resto predominantemente agua. Ocasionalmente, los lípidos por sí mismos pueden actuar parcialmente como disolventes. Otros disolventes orgánicos tales como aquellos ejemplificados anteriormente pueden usarse en razones similares. Un experto apreciará que lípidos diferentes pueden requerir disolventes, mezclas de disolventes y razones de mezclas de disolventes diferentes para el proceso de aglomeración. Cuando se usan varios disolventes orgánicos, pueden usarse secuencialmente o pueden mezclarse juntos en forma líquida. La concentración de cada uno puede ser similar a los porcentajes ejemplificados anteriormente.

Inesperadamente, los presentes inventores han encontrado que una mezcla de agua y etanol funciona mejor que cualquiera de los dos por separado para suministrar lípidos a la aglomeración de polvo seco. Se cree que los parámetros tratados anteriormente, por ejemplo, relativos a la temperatura de solubilidad y tiempo de secado están detrás de este hallazgo inesperado. Siguiendo el ejemplo del etanol y agua, los inventores creen que un experto apreciará los beneficios y compromisos impuestos por otras mezclas de disolventes y solutos.

La invención también incluye realizaciones en las que los lípidos se aglomeran en el polvo seco tras su modificación para aumentar la solubilidad en agua. Por ejemplo, el lípido puede hacerse iónico mediante su conversión en una sal, por ejemplo, puede saponificarse un ácido graso. Un experto apreciará otros medios tales como la hidroxilación o esterificación que mejorarán la solubilidad en agua. El lípido cuya solubilidad se ha mejorado puede añadirse en un disolvente acuoso o puede añadirse en una mezcla de disolventes. Por ejemplo, la mejora de la solubilidad puede permitir que se use una menor cantidad de disolvente orgánico.

Otro aspecto de la presente descripción implica el uso de productos químicos que pueden asociarse o complejarse con estructuras lipídicas para dar como resultado la solubilidad de lípidos en entornos acuosos. Tales interacciones pueden deberse a la formación de micelas en las que la parte hidrófoba de la molécula que provoca la formación de la micela contendrá el resto lipídico y la parte hidrófila de la molécula que provoca la formación de la micela se disolverá en un entorno acuoso dando como resultado la solubilización de lípidos en un entorno acuoso. (Ejemplo: Pluronic F-68 u otros agentes tensioactivos). Otras interacciones similares, a las que se refiere la invención, pueden resultar de compuestos tales como ciclodextrinas que pueden solubilizar (reparto, complejación física) lípidos dentro de la estructura de la ciclodextrina y mantener esa complejación física tras la adición a entornos acuosos, efectuando así la solubilidad de dicho lípido en dicho entorno acuoso. (Ejemplo: \beta-metilciclodextrina).

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Esterilización y envasado

También se describen en el presente documento procedimientos para esterilizar medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la invención, así como para esterilizar medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo preparados mediante procedimientos convencionales tales como molienda con molino de bolas o liofilización. Puesto que los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones se preparan normalmente en disoluciones de gran volumen y con frecuencia contienen componentes termolábiles, no son susceptibles de esterilización mediante irradiación o mediante calentamiento. Por tanto, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones se esterilizan comúnmente mediante procedimientos de eliminación de contaminantes tales como la filtración, lo que aumenta significativamente el gasto y tiempo requeridos para fabricar tales medios, complementos de medios, subgrupos de medios y
tampones.

Los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo preparados según los procedimientos de la invención (por ejemplo, mediante secado por pulverización de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones líquidos, o mediante la aglomeración de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo), sin embargo, pueden esterilizarse mediante procedimientos menos costosos y más eficaces. Por ejemplo, medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo (preparados tal como se describió anteriormente) pueden irradiarse en condiciones que favorecen la esterilización de estos polvos. Preferiblemente, esta irradiación se lleva a cabo en volumen (es decir, después del envasado del medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón), y lo más preferiblemente esta irradiación se lleva a cabo mediante la exposición del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón envasado en volumen de la invención a una fuente de rayos gamma en condiciones tales que las bacterias, hongos, esporas o virus que puedan residir en los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo se inactiven (es decir, impedir que se repliquen). Alternativamente, la irradiación puede llevarse a cabo mediante la exposición de los medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo, antes del envasado, a una fuente de rayos gamma o una fuente de luz ultravioleta. Los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la invención pueden esterilizarse alternativamente mediante tratamiento térmico (si los subgrupos de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampón son termoestables), por ejemplo por pasteurización instantánea o tratamiento en autoclave. Como comprenderá un experto en la técnica, la dosis de irradiación o calor, y el tiempo de exposición, requeridos para la esterilización dependen del volumen de los materiales que vayan a esterilizarse.

Los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo a granel pueden exponerse a una fuente de irradiación a una dosificación total de aproximadamente 10-100 kilograys (kGy), preferiblemente a una dosificación total de aproximadamente 15-75 kGy, 15-50 kGy, 15-kGy o 20-40 kGy, más preferiblemente a una dosificación total de aproximadamente 20-30 kGy, y lo más preferiblemente a una dosificación total de aproximadamente 25 kGy, durante de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 7 días, más preferiblemente de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 días, de 1 hora a aproximadamente 3 días, durante aproximadamente 1-24 horas o durante aproximadamente 1-5 horas, y lo más preferiblemente durante aproximadamente 1-3 horas ("tasa de dosis normal"). Alternativamente, los polvos en volumen de la invención pueden esterilizarse a una "tasa de dosis lenta" de una dosificación total de aproximadamente 25-100 kGy durante un periodo de aproximadamente 1-5 días. Durante la irradiación, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo se almacenan preferiblemente a una temperatura de aproximadamente -70ºC a aproximadamente temperatura ambiente (aproximadamente 20-25ºC), lo más preferiblemente a -70ºC. Un experto apreciará, por supuesto, que la dosis de radiación y los tiempos de exposición pueden ajustarse dependiendo del volumen y/o la masa del material que vaya a irradiarse; las dosificaciones de irradiación, tiempos de exposición y temperaturas de almacenamiento óptimos típicos requeridos para la esterilización de materiales en polvo en volumen mediante irradiación o tratamiento térmico se conocen bien en la técnica.

Tras la esterilización, los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones sin envasar pueden envasarse en condiciones asépticas, por ejemplo envasando los medios, complementos de medios, subgrupos de medios u tampones en recipientes tales como tubos, viales, botellas, bolsas, sobres, cajas, cajas de cartón, bidones estériles y similares, o en el envasado a vacío o el envasado de polvo/disolvente integrado descritos anteriormente. Los medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones envasados estériles pueden almacenarse entonces durante periodos de tiempo prolongados tal como se describió anteriormente.

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Uso de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones

Por tanto, la presente invención proporciona medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo que son fácilmente solubles en un disolvente de rehidratación y que están sustancialmente libres de polvo fino. Para su uso, el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón aglomerado o secado por pulverización pueden hidratarse (o "reconstituirse") en un volumen de un disolvente suficiente para producir las condiciones de nutrientes, electrolitos, iónicas y de pH deseadas requeridas para el uso particular del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón solvatado. Esta reconstitución se facilita particularmente en la presente invención, dado que los presentes medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones se disolverán rápidamente y producirán poca cantidad, si alguna, de polvo o material insoluble, a diferencia de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones liofilizados o molidos con molino
de bolas.

Los disolventes preferidos para su uso en la reconstitución de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones en polvo de la invención incluyen, pero no se limitan a, agua (lo más particularmente agua destilada y/o desionizada), suero (particularmente suero bovino o humano y lo más particularmente suero de ternero o suero bovino fetal), disolventes orgánicos (particularmente dimetilsulfóxido, acetona, etanol y similares), o cualquier combinación de los mismos, pudiendo contener cualquiera de ellos uno o más componentes adicionales (por ejemplo, sales, polisacáridos, iones, detergentes, estabilizadores, etc.). Por ejemplo, se reconstituyen preferiblemente complementos de medios (tales como sueros animales) y tampones en polvo en agua hasta una concentración final 1X, u opcionalmente hasta una concentración superior (por ejemplo, 2X, 2,5X, 5X, 10X, 20X, 25X, 50X, 100X, 500X, 1000X, etc.) para la preparación de disoluciones madre o para almacenamiento. Alternativamente, los medios de cultivo en polvo pueden reconstituirse en una disolución de complementos de medios (por ejemplo, sueros tales como FBS) en agua, tales como aquellas disoluciones en las que el complemento de medios está presente a una concentración, por ejemplo, del 0,5%, 1%, 2%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, o superior, vol/vol en el agua.

La reconstitución de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones en polvo se lleva a cabo preferiblemente en condiciones asépticas para mantener la esterilidad del medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón reconstituido, aunque alternativamente puede esterilizarse el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón reconstituido, preferiblemente mediante filtración u otros procedimientos de esterilización que se conocen bien en la técnica, tras la rehidratación. Tras su reconstitución, los medios complementos de medios, subgrupos de medios y tampones deben almacenarse a temperaturas inferiores a aproximadamente 10ºC, preferiblemente a temperaturas de aproximadamente 0-4ºC, hasta su uso.

Los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones reconstituidos pueden usarse para cultivar células según las técnicas de cultivo celular convencionales que conoce bien un experto en la técnica. En tales técnicas, las células que van a cultivarse se ponen en contacto con el medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón reconstituido de la invención en condiciones que favorecen el cultivo de las células (tales como temperatura, humedad, iluminación y condiciones atmosféricas controladas). Las células que son particularmente susceptibles de cultivo mediante tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, células de levaduras, células vegetales y células animales. Tales células bacterianas, células de levaduras, células vegetales y células animales están disponibles comercialmente de depositarios de cultivos conocidos, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia), Invitrogen (Carslbad, California) y otros con los que estará familiarizado un experto en la técnica. Las células animales preferidas para el cultivo mediante estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, células de insectos (lo más preferiblemente células de Drosophila, células de Spodoptera y células de Trichoplusa), células de nematodos (lo más preferiblemente, células de C. elegans) y células de mamíferos (incluyendo pero no limitadas a células CHO, células COS, células VERO, células BHK, células AE-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma y lo más preferiblemente células humanas tales como células 293, células PER-C6 y células HeLa), cualquiera de las cuales puede ser una célula somática, una célula germinal, una célula normal, una célula enferma, una célula transformada, una célula mutante, una célula madre, una célula precursora o una célula embrionaria, y cualquiera de las cuales puede ser una célula dependiente de anclaje o independiente de anclaje (es decir, "suspensión").

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Kits

Los medios, complementos de medios, subgrupos de medios, tampones de polvo seco y células proporcionadas por la invención son idealmente aptos para la preparación de kits. Un kit de este tipo puede comprender uno o más recipientes tales como viales, tubos de ensayo, botellas, envases, sobres, bidones y similares. Cada uno de los recipientes puede contener uno o más de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones de la invención descritos anteriormente, o combinaciones de los mismos. Tales medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones pueden estar hidratados o deshidratados pero son normalmente preparaciones deshidratadas producidas mediante los procedimientos de la invención. Tales preparaciones pueden ser estériles.

Un primer recipiente puede contener, por ejemplo, un medio nutritivo, complemento de medios, subgrupo de medios o un tampón de la invención, o cualquier componente o subgrupo de los mismos, tales como cualquiera de aquellos medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones de la invención que se describieron anteriormente. Los medios nutritivos, tampones, extractos, complementos, componentes o subgrupos adicionales pueden estar contenidos en recipientes adicionales en los presentes kits. Los kits también pueden contener, en uno o más recipientes adicionales, una o más células tales como las células bacterianas, células de levaduras, células vegetales o células animales descritas anteriormente. Tales células pueden liofilizarse, secarse, congelarse o conservarse de otra manera, o pueden secarse por pulverización. Además, los kits de la invención pueden comprender además uno o más recipientes adicionales, que contengan, por ejemplo, L-glutamina, opcionalmente complejada con uno o más cationes divalentes (véase la patente estadounidense n.º 5.474.931). Los kits pueden comprender además uno o más recipientes adicionales que contengan un disolvente que va a usarse en la reconstitución de los medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios y/o tampones de polvo seco; tales disolventes pueden ser acuosos (incluyendo disoluciones tampón, soluciones salinas, disoluciones de medio nutritivo, disoluciones de complemento de medio nutritivo (incluyendo sueros tales como sueros bovinos (particularmente sueros de ternero o sueros bovinos fetales) o sueros humanos), o combinaciones de los mismos) u orgánicos. Otros ingredientes que no son compatibles para su mezclado con los medios nutritivos, tampones, extractos, complementos, componentes o subgrupos de la invención pueden estar contenidos en uno o más recipientes adicionales para evitar el mezclado de los componentes incompatibles. Un kit a modo de ejemplo puede comprender un recipiente que contiene polvo seco para reconstitución opcionalmente de un volumen suficiente para contener el disolvente de reconstitución, las instrucciones para la reconstitución y medios para acceder al polvo seco tal como una tira de desgarro o un orificio para introducir el disolvente de reconstitución.

El número y los tipos de recipientes contenidos en un kit dado para preparar un medio nutritivo, complemento de medio, subgrupo de medio o tampón puede variar dependiendo del tipo de medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón que vaya a prepararse. Normalmente, el kit contendrá los recipientes respectivos que contienen los componentes o complementos necesarios para preparar un medio, complemento de medios, subgrupo de medios o tampón particular. Sin embargo, pueden incluirse recipientes adicionales en el kit de la invención de modo que puedan prepararse diferentes medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones mezclando diferentes cantidades de diversos componentes, complementos, subgrupos, tampones, disolventes, etc., para preparar diferentes formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones.

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Ventajas

Inesperadamente, la presente invención prevé la preparación de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios, tampones que contienen lípidos y células a un coste reducido e inconveniencias reducidas. Las reducciones de los costes se deben a varios factores. Por ejemplo, las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la presente invención pueden producirse con instalaciones de producción mucho más pequeñas dado que no se requieren los grandes tanques de agitación para las formulaciones 1X. Además, las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la presente invención pueden prepararse según sea necesario usando las técnicas de producción "en el momento oportuno" que reducen los costes de inventario, almacenamiento y mano de obra. El tiempo requerido para la preparación y el envío de las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones puede reducirse desde 6-8 semanas hasta tan sólo un día. Los medios con ajuste de pH de manera automática también proporcionan ahorros significativos de costes y tiempo, y reducen la tendencia de introducción de contaminación en los medios reconstituidos que puede producirse durante el proceso de ajuste del pH según los procedimientos convencionales que usan medios líquidos en volumen o de polvo seco tradicionales. La presente invención también permite la preparación de componentes de medios nutritivos, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones que pueden usarse para preparar cantidades muy grandes de medios, complementos de medios, subgrupos de medios o tampones 1X (por ejemplo, 100.000 litros o más) lo que requeriría sólo una prueba de control de calidad en comparación con las múltiples pruebas de control de calidad para los múltiples lotes producidos según otras técnicas utilizadas comúnmente. Es importante destacar que las formulaciones de medios, complementos de medios, subgrupos de medios y tampones de la presente invención son más sistemáticas entre lotes dado que los componentes individuales son más estables. Los polvos secos de células de la invención también son ventajosos desde el punto de vista tecnológico y económico, dado que pueden almacenarse las células, en pequeño volumen, durante periodos de tiempo prolongados con poca necesidad de equipo especializado más allá del que normalmente está disponible en el laboratorio. Además, las células preparadas mediante los presentes procedimientos se conservan sin exponerse a reactivos de crioconservación que pueden ser tóxicos para las células. La conveniencia mejorada reducirá la carga de suministro de lípidos a las células en cultivo. Los procedimientos mejorados de proporcionar lípidos en las formulaciones de medios secos deben dar como resultado un mejor rendimiento de las células en cultivo en la realización de sus tareas fisiológicas o pretendidas.

En resumen, la presente invención se refiere a:

Un procedimiento de producción de un polvo de medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un polvo de tampón en aglomerado, comprendiendo dicho procedimiento aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, con un disolvente que comprende al menos un lípido disuelto en el mismo, suministrando dicho disolvente dicho al menos un lípido para su incorporación en dicho polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón. El al menos un lípido se compleja con una ciclodextrina.

En determinadas realizaciones de la invención, la aglomeración comprende la aglomeración en lecho fluidizado.

En determinadas realizaciones de la invención, el disolvente esta en fase líquida. En otras realizaciones, el disolvente esta en fase sólida.

El lípido puede estar en forma de una sal, el lípido pude tener uno o más grupos hidroxilo.

En determinadas realizaciones de la invención, el disolvente es una mezcla. La mezcla puede ser una mezcla de líquidos. La mezcla también puede comprender al menos un disolvente polar y/o al menos un disolvente apolar y/o al menos un disolvente orgánico. Por ejemplo, la mezcla puede comprender un 20%-95% de disolvente orgánico, por ejemplo, un 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90% ó 95% de disolvente orgánico.

Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla puede comprender, por ejemplo, disolventes en una razón del 1% al 99% de (a) dicho al menos un disolvente polar con (b) dicho al menos un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar. La mezcla puede comprender disolventes en una razón de, por ejemplo, el 1, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 40, 50, 60, 67, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de (a) dicho al menos un disolvente polar con (b) dicho al menos un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar.

Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla puede comprender un 40-60% de dicho al menos un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar. En ciertas realizaciones, la mezcla comprende un 50% de (a) dicho al menos un disolvente polar y un 50% de (b) dicho al menos un disolvente orgánico o dicho al menos un disolvente apolar.

Cuando el disolvente es una mezcla, la mezcla puede comprender, por ejemplo, agua y al menos un disolvente seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y cetonas. La mezcla puede comprender, por ejemplo, al menos un disolvente seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y cetonas. La mezcla puede comprender aproximadamente un 40-60% de etanol. En una realización, la mezcla comprende aproximadamente un 50% de etanol. El disolvente puede comprender una mezcla de al menos dos disolventes seleccionados del grupo constituido por disolventes apolares y disolventes orgánicos.

En ciertas realizaciones de la invención, dicho suministro se realiza en condiciones que comprenden al menos una de temperatura controlada, humedad controlada y presión parcial controlada de dicho(s) disolvente(s).

En ciertas realizaciones de la invención, dicho lípido se selecciona del grupo constituido por ácido linoleico, ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido linolénico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, esfingomielina, cardiolipina, vitamina A, vitamina E, vitamina K, prostaglandina y un esterol. El esterol puede ser, por ejemplo, un esterol vegetal o uno animal. En ciertas realizaciones, el esterol es colesterol.

La invención también se refiere a polvos de medio nutritivo aglomerados, polvos de complemento de medio aglomerados, polvos de subgrupo de medio nutritivo aglomerados y polvos de tampón aglomerados preparados según cualquiera de los procedimientos de la invención. El polvo de la invención, en ciertas realizaciones, tiene una formación de polvo fino reducida en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado, una solubilidad más completa en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado, menos material insoluble en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado y/o una disolución más rápida en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado.

El polvo de la invención, en ciertas realizaciones, está libre de suero, libre de componentes de mamíferos y/o libre de componentes animales.

La invención también proporciona un procedimiento de cultivo de una célula que comprende: (a) reconstituir un polvo aglomerado de la invención con un disolvente para formar una disolución líquida; y (b) poner en contacto una célula con dicha disolución líquida en condiciones que favorecen el cultivo de dicha célula. La célula puede ser, por ejemplo, una célula seleccionada del grupo constituido por célula bacteriana, célula de insectos, célula de levaduras, célula de nematodos, célula de aves, célula de anfibios, célula de reptiles y célula de mamíferos. Cuando la célula es una célula de mamíferos, la célula puede ser, por ejemplo, una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula AE-1, una célula SP2/0, una célula L5.1, una célula PerC6, una célula 293, una célula de hibridoma, o una célula humana. Según ciertos aspectos de la invención, el crecimiento de dicha célula a los 3, 4, 7, 10, 14, 28, 30, 60 ó 90 días es del 50%-120% en comparación con el crecimiento de dicha célula en el mismo punto de tiempo en medio líquido con lípido añadido. Por ejemplo, el crecimiento de dicha célula a los 3, 4, 7, 10, 14, 28, 30, 60 ó 90 días puede ser, por ejemplo, del 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 100%, 105%, 110% ó 120% en comparación con el crecimiento de dicha célula en el mismo punto de tiempo en medio líquido con lípido añadido.

Resultará fácilmente evidente para un experto en las técnicas relacionadas que son obvias otras adaptaciones y modificaciones adecuadas de los procedimientos y aplicaciones descritos en el presente documento y pueden realizarse sin apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en el presente documento sólo con fines de ilustración y no se pretende que limiten de la invención.

Los ejemplos 1-16 contienen información general relativa a la aglomeración y al uso de medios de polvo seco. Los ejemplos 17 y 18 ilustran más particularmente la invención.

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Ejemplo 1 Aglomeración de los medios de polvo seco (DPM) típicos

1. Con un aparato de lecho fluidizado de mesa de laboratorio (Stera-1; Niro, Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland): colocar 100-500 g de DPM dentro de la cámara. Colocar en el aparato y usar la palanca para sellar la unidad.

2. Iniciar el flujo de aire para fluidizar (levitar) el DPM. Puesto que el DPM tradicional es de tamaño de partícula relativamente fino, se necesitará un nivel 4-6. Encender el dispositivo de vacío para captar partículas de DPM finas, que pasan a través de los filtros superiores. Asegurarse de que el polvo fluidizado está aproximadamente centrado dentro de la cámara con respecto al tamiz de malla inferior y los filtros superiores.

3. Poner en marcha el dispositivo de inyección (unidad de pulverización) conectando en primer lugar la tubería de aire comprimido y poniendo en marcha después la bomba que está conectada a una fuente de agua. El objetivo es admitir \sim6 ml de agua por minuto (debe conocerse la tasa de flujo para cualquier bomba dada en base a RPM y el diámetro del tubo). Con el fin de prevenir la aglutinación de DPM, añadir alternativamente agua durante \sim1 minuto y detener después durante \sim1 minuto, permitiendo que se produzca el secado en la cámara.

4. Si los filtros se recubren con DPM durante la ejecución de manera que el retorno de aire no desprenda polvo, bajar la velocidad del ventilador al nivel 2-3 hasta que todos los filtros se hayan desobstruido mediante soplado. Después aumentar la velocidad del ventilador en funcionamiento hasta el nivel anterior.

5. La aglomeración se completará cuando se hayan añadido \sim35 ml de agua por cada 500 g de DPM. Este volumen variará dependiendo de la formulación de DPM. Se observará un flujo descendente de gránulos aglomerados relativamente grandes en la cámara (parte inferior) hacia el final de la ejecución. Las partículas visiblemente grandes y la ausencia de polvo fino indican que el proceso está completo.

6. Permitir que el DPM aglomerado se seque completamente durante 5-7 minutos.

7. Al final de la ejecución, purgar los filtros 4 veces.

8. Apagar la unidad, desconectar el tubo de agua y recoger el DPM aglomerado en un recipiente hermético.

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Estos enfoques deben ajustarse cuando se usa un aparato de lecho fluidizado a escala de proceso o a escala de producción. Por ejemplo, cuando se usa el aparato MP-1 (Niro, Inc./Aeromatic-Fielder; Columbia, Maryland), el siguiente protocolo ha producido resultados satisfactorios:

1.: Sellar la unidad (inflar las juntas).

2.: Poner en marcha el ventilador para precalentar.

3.: Detener el ventilador cuando la temperatura del aire de entrada sea igual al punto de referencia.

4.: Desinflar las juntas, cargar el material, inflar las juntas.

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Las etapas 5-8 deben llevarse a cabo en el plazo de un minuto:

5.: Iniciar el lote.

6.: Poner en marcha el ventilador y encender el limpiador de filtro.

7.: Fijar el rendimiento en % de presión de aire de atomización de la boquilla (comprobar el vacío en la boquilla).

8.: Conectar la tubería de alimentación de líquido.

9.: Poner en marcha el bombeo en el tamiz y en la bomba.

10.: Reinicializar el tiempo de lote.

11.: Pulverizar todo el líquido a una tasa fija (26 g/min.). Usar \sim 250 ml de agua por 2 kg de polvo.

12.: Detener el bombeo en la bomba y en el tamiz cuando se añade todo el líquido.

13.: Reducir el flujo de aire hasta el valor de secado (por ejemplo desde 100 hasta 60).

14.: Cuando el producto alcanza la temperatura deseada (\sim40ºC), ir al tamiz de "ajuste inicial" y ajustar la "duración de lote" para un valor de 2-3 minutos más que el presente "tiempo de lote".

15.: Detener el lote.

16.: Desinflar las juntas.

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Parámetros de los instrumentos típicos (para los aparatos de mesa, a escala de proceso y a escala de producción):

Temperatura de secado: 60-65ºC

Temperatura del aire de salida: \sim33ºC

Presión de eyección: 500 kPa

Presión de atomización: 150-200 kPa

Parada del retorno de aire: 1 tras la pulverización, 2 durante la pulverización.

Capacidad del ventilador: 5 al inicio de la ejecución, 6 después de que sea evidente la aglomeración.

Magnahelics: Resistencia de filtro 150-250, resistencia de la placa de control perforada \sim50, volumen de aire: menos de 50.

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Ejemplo 2 Adición de bicarbonato de sodio como parte integral de DPM

Tal como se indicó anteriormente, normalmente no se añade bicarbonato de sodio al DPM durante la fabricación mediante molienda con molino de bolas o liofilización, debido a las complicaciones potenciales de capacidad de tamponamiento y de emisión de gases encontradas tras el almacenamiento de los medios en polvo. Por tanto, este procedimiento de producción convencional necesita la adición de bicarbonato de sodio, y el ajuste del pH, tras la reconstitución de los medios. Sin embargo, con los presentes procedimientos, estas etapas adicionales pueden obviarse añadiendo el bicarbonato de sodio (o cualquier sal de tamponamiento) directamente al medio en polvo durante la fabricación.

Existen dos maneras de incluir bicarbonato de sodio (o cualquier sal de tamponamiento) dentro del DPM: (a) por medio del dispositivo de inyección y (b) como parte del DPM.

(a) Dispositivo de inyección

Debido a la solubilidad del bicarbonato de sodio y las cantidades que generalmente es necesario añadir a un medio de cultivo de células de mamíferos típico, será necesario inyectar volúmenes bastante grandes de líquido en el polvo (significativamente superiores a los 35 ml de agua mencionados anteriormente). Esto es todavía posible y de hecho puede ser preferible si se añade otro componente que requiere de manera similar un volumen relativamente grande de líquido con el fin de añadirse al DPM, tal como es el caso con el suero por ejemplo. En este caso, debe tenerse cuidado de añadir el líquido de manera secuencial, dejar secar, etc. una serie de veces para asegurarse de que el DPM no llegue a aglutinarse dentro del dispositivo. Es más o menos correcto usar los 6 ml por minuto durante \sim1 minuto y después permitir secar durante otros 2 minutos.

La cantidad de líquido a añadir se determina tal como sigue: preparar bicarbonato de sodio a 75 g/l en agua. Ejemplo: 250 g de DPM en la cámara que va a aglomerarse. Asumir que se requieren 10,0 g de DPM para 1 l de medio líquido 1X. Por tanto, 250 g representan 25 l de medio líquido 1X. Para cada l de líquido, asumir (por ejemplo) un requisito de 2 g de bicarbonato de sodio. Esto significa que se necesitan 50 g de bicarbonato. Ahora, dado que la disolución de bicarbonato está a 75 g/l, entonces deben añadirse 0,67 l de disolución de bicarbonato a los 250 g de DPM.

La disolución de bicarbonato de sodio se añadirá de manera similar al procedimiento para la "aglomeración de un DPM típico" anterior excepto que se necesita un mayor tiempo de secado entre los ciclos dado que el pH de la disolución de bicarbonato de sodio es \sim8,00, lo que puede degradar los componentes de los medios. Es importante que el polvo nunca se "empape" por la adición de disolución de bicarbonato demasiado rápido sin que se permita el tiempo suficiente para el secado completo del polvo de bicarbonato entre los ciclos. También, se requieren mayores tiempos de secado de fluido puesto que es importante tener un contenido en humedad final tan bajo como sea posible dado que la humedad dará como resultado la liberación de gas de dióxido de carbono dando como resultado la pérdida de la capacidad de tamponamiento y la formación de una "almohada" si el polvo está en un paquete de lámina metálica.

(b) Como parte del DPM

Puede molerse bicarbonato de sodio en el DPM de manera similar a para otros componentes de los medios antes del tratamiento de lecho fluidizado. Sin embargo, en el proceso de molienda, el bicarbonato debe añadirse como componente final. Todos los demás componentes de los medios deben molerse como de costumbre y entonces se detiene el molino y se añade el bicarbonato finalmente, con una molienda adicional para alcanzar partículas de tamaño apropiado. Es importante que todo el procesamiento posterior a la molienda (colocación en recipientes, etc.) se haga en un entorno de humedad controlada ajustado tan bajo como sea operacionalmente posible (\sim20-40%). El procesamiento de lecho fluidizado debe llevarse a cabo entonces tan pronto como sea posible tras la molienda. (Si no se procesa el mismo día, el DPM debe envolverse doblemente y colocarse dentro de un recipiente sellado con absorbedores de humedad).

El propio procedimiento de lecho fluidizado se realiza de manera similar al ejemplo dado anteriormente (con el uso de 35 ml por 500 g de DPM) excepto que los tiempos de secado tras la inyección de agua (\sim6 ml/min.) deben prolongarse de nuevo: 1 min. de inyección de agua y 2 minutos de ciclos de secado. Se observará que el color del DPM será rojo oscuro-púrpura claro debido a la presencia de rojo fenol. Puesto que el DPM no tiene esencialmente contenido en humedad, esto no representa una situación degradativa, y es la razón por la que es esencial el procesamiento de lecho fluidizado.

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Ejemplo 3 DPM que incluye sales de tamponamiento (por ejemplo, bicarbonato de sodio) y se formula de manera que el pH del medio (1X) reconstituido sea automáticamente del pH deseado sin los esfuerzos del usuario

Tal como se indicó anteriormente, todos los medios en polvo de cultivo de células de mamíferos disponibles comercialmente requieren la adición de una o más sales tampón (por ejemplo, bicarbonato de sodio) cuando se prepara líquido 1X, y después el ajuste del pH, de manera que la disolución estará a un pH adecuado. Sin embargo, los presentes procedimientos pueden usarse para obviar tanto la adición de bicarbonato de sodio (tal como se describió anteriormente en el ejemplo 2) como la necesidad de ajuste del pH. La tecnología de lecho fluidizado se usa para introducir un ácido o base (dependiendo de la necesidad) a un medio de polvo seco que comprende una o más sales de tamponamiento. Según este aspecto de la invención, cualquier sal de tamponamiento o combinación de las mismas, y cualquier ácido o base, puede usarse dependiendo del pH y la capacidad de tamponamiento deseados en el medio de cultivo de células reconstituido en última instancia.

Si se añade bicarbonato de sodio directamente al DPM como polvo, es posible para el usuario final añadir simplemente agua y mezclar para producir una disolución que ya contiene bicarbonato (véase anteriormente) y de pH apropiado. Es necesario en primer lugar determinar cuánto ajuste de pH se requiere. (1) Colocar 1 l de agua en un vaso de precipitados. Añadir DPM al líquido y mezclar. (La cantidad a añadir/l viene dada por las especificaciones para ese polvo, por ejemplo, 10 g/l, 13 g/l). En este caso, el peso del bicarbonato de sodio también debe considerarse en la determinación de cuánto se añade por litro. (2) Después de que el polvo se haya disuelto, añadir HCl 5 N para ajustar la disolución al pH deseado. Registrar la cantidad. (3) Convertir este número en cantidad de HCl 1 N. Calcular cuánto HCl 1 N es necesario para el ajuste del polvo total que va a aglomerarse. (Ejemplo: se necesitan 5 ml de HCl 1 N para ajustar 1 l de medio 1X A a un pH 7,2 a partir de un pH sin ajustar de 7,9. Ese 1 l de medio 1X representa, por ejemplo, 13,0 g de DPM. Por tanto, para cada 13,0 g de DPM, se necesitan 5 ml de HCl 1 N. Si quiere ajustarse el pH de 250 g de DPM, entonces es necesario añadir 250 divido entre 13,0 = 19,2 x 5 ml o 96 ml de HCl 1 N al polvo para hacer que se ajuste automáticamente el pH.

Este HCl 1 N debe añadirse ahora al DPM. La mejor manera para ello es usar el dispositivo de inyección, añadiendo HCl 1 N en lugar de agua. En general, el protocolo es similar al anterior con las siguientes excepciones: (1) el HCl 1 N debe añadirse lentamente a los medios que contienen bicarbonato de sodio. Si se añade demasiado rápido, puede desprenderse dióxido de carbono, dando como resultado una capacidad de tamponamiento subóptima. Debido al volumen de HCl 1 N requerido generalmente, se necesitan varios ciclos de 1 minuto encendido, 2 minutos apagado. Debe obtenerse un estado de polvo seco al final de cada ciclo de manera que exista un sistema dinámico en el que el DPM tiene características de un procedimiento fluido pero en realidad es un polvo seco. (Sorprendentemente, a medida que se añade HCl al polvo, el color aparente cambia de púrpura rojizo oscuro a un color amarillo-naranja claro incluso aunque el polvo se mantiene esencialmente seco en todo momento debido a la evaporación continua dentro del sistema). Dado que la cantidad total de HCl se ha calculado para producir un pH esencialmente neutro, el polvo nunca se expone realmente a condiciones "ácidas" siempre que el lecho fluidizado se ajuste adecuadamente (véase anteriormente; la posición de las partículas de polvo dentro de la cámara durante la operación). Es importante asegurarse de que todo el polvo se mueve a través del sistema (es decir, se levanta, aglomera y deposita continuamente) y que no tenga zonas "muertas" dentro de la cámara.

Una vez que el polvo se recoge tras la ejecución, puede añadirse a agua y reconstituirse en cualquier momento siempre que se haya mantenido en una ubicación y envase "secos" adecuados. No se necesita ajuste del pH. Por tanto, esto proporciona un medio de polvo seco con ajuste automático del pH, en el que el pH del medio líquido preparado reconstituyendo el medio de polvo seco no requiere ajuste del pH.

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Ejemplo 4 Inclusión de complementos de gran peso molecular tales como suero, albúmina, Hy-Soy, etc., dentro del propio DPM

Hasta ahora, los medios de polvo seco que contienen suero no han estado disponibles comercialmente. Usando los presentes procedimientos (por medio de las tecnologías de lecho fluidizado y secado por pulverización), se ha tenido éxito en la adición de suero a un polvo de una manera en la que se mantiene la funcionalidad (cultivo
celular).

El dispositivo de inyección del aparato de lecho fluidizado puede formar una niebla con suero y albúmina concentrada. Se intentó observar si el suero añadido al DPM y secado de esta manera sería funcional.

Procedimiento para la adición de suero: (1) Determinar el peso del DPM patrón que va a aglomerarse. (2) A partir de esto, basándose en los g/l para el polvo particular, calcular el volumen de medio 1X que prepararán los g de polvo. (3) Calcular el volumen de suero que será necesario a un nivel de porcentaje dado de complementación (por ejemplo, 100 g de polvo que van a usarse en 10 g/l producen 10 equivalentes en l de polvo). A una complementación de suero al 5%, se requerirá que se añadan 500 ml de suero mediante el dispositivo de inyección.

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Protocolo para la adición de suero: El suero y la albúmina son muy viscosos. Debe comprobarse el patrón de pulverización de la boquilla para el patrón y el tamaño de la gotita. Con el tubo de muestra en la disolución que va a añadirse al polvo, someter a prueba la pulverización contra un cartón u otro telón de fondo. Comprobar la uniformidad y el tamaño pequeño de la gotita. Si no es una "niebla", aumentar la presión de atomización en 50 kPa y someter a prueba de nuevo. Hacer esto hasta que la presión suficiente dé como resultado un patrón de niebla fina.

Para el uso en aplicaciones de cultivo celular, es necesario conocer el peso/ml de suero-DPM que va a usarse por l de medio 1X. Para ello, pesar de manera precisa los viales o tubos de ensayo que almacenarán el suero durante el secado. Colocar una cantidad constante (conocida) de suero en cada uno de los viales. Luego colocar los viales en un Speed Vac o liofilizador. Eliminar el agua hasta sequedad. Luego pesar de nuevo los viales, esta vez conteniendo suero liofilizado. Calcular el peso del suero y expresarlo por ml de volumen original. El peso del DPM aglomerado con suero para usar por l entonces será el peso de "uso" de DPM patrón más el peso del suero a un nivel
determinado.

Por ejemplo, asumir que el medio A (DPM) va a usarse a 10 g/l. La complementación de suero ha de ser al 5% v/v. Esto significa que además del peso del DPM patrón, el peso del suero será igual al 5% = 50 ml para añadir por l de medio. Asumir que el polvo de suero pesa 0,06 g/ml. Entonces el peso del suero en polvo = 50 x 0,06 g/l = 3 g. Por tanto, el peso del DPM que contiene suero que se añadirá a 1 l de agua es el peso del polvo de suero (3 g) más el peso del DPM patrón (10 g) por litro = 13 g/l.

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Ejemplo 5

Reducir o eliminar las técnicas de molienda (sistema de entrada de alta energía que rompe los componentes en partículas micrométricas) cuando se fabrica un DPM. Tal como se indicó anteriormente, el medio de polvo seco normalmente se fabrica por medio del proceso de molienda, que es laborioso y tiene una serie de problemas. Algunos procedimientos de la presente invención proporcionan la producción de un medio en polvo seco usando la tecnología de lecho fluidizado, que supera estas limitaciones técnicas y de laboriosidad.

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A. En primer lugar combinar en un dispositivo externo, después tratamiento de lecho fluidizado

Se combina el DPM molido normalmente con bicarbonato de sodio (directamente tal como se recibe del proveedor, no se necesita molienda con molino de bolas adicional). [RPM 1640 con bicarbonato de sodio a 2 g/equivalentes en l]. Esta mezcla se combina durante 20 minutos. Entonces se coloca el polvo dentro de la cámara de lecho fluidizado y se fluidiza tal como anteriormente para los medios que contienen bicarbonato o los medios que contienen bicarbonato con control automático de pH.

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B. Combinar directamente en la cámara de lecho fluidizado, después aglomeración

Se coloca bicarbonato de sodio en la cámara directamente con el DPM molido y se combina (mezcla) durante un breve periodo de tiempo, que va seguido de aglomeración. Esto elimina la combinación en una unidad separada.

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C. Eliminación total del proceso de molienda con molino de bolas

O bien todos los productos químicos del DPM se añaden directamente a la cámara de lecho fluidizado y se mezclan de manera preliminar seguido por aglomeración o bien, más probablemente, a algunos de los productos químicos más gruesos, "pegajosos", etc. se les proporciona un tratamiento de molturación breve en una muela giratoria y luego se colocan dentro del lecho fluidizado para la combinación y la aglomeración final.

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Ejemplo 6 Un procedimiento para tener todas las características anteriores dentro de este mismo DPM

Se ha combinado la adición de bicarbonato de sodio "comercial" con DPM molido y control automático de pH. También se ha combinado el suero con DPM.

Para combinar suero con DPM que contiene bicarbonato de sodio con control automático de pH, un protocolo
es:

1.: Añadir bicarbonato de sodio (polvo, del proveedor) al DPM (molido o molturado).

2.: Combinar los ingredientes (mezclar, o bien unidad externa o bien lecho fluidizado).

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3.: En un recipiente separado, reconstituir 1 l del DPM (que contiene bicarbonato) con agua (1X) y determinar la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N que se requiere para ajustar el pH de la disolución a 7,5. En base a litros, conociendo la masa del polvo que va a aglomerarse (y por tanto los equivalentes en l), calcular la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N para el polvo total que va a aglomerarse a la cantidad calculada anteriormente. Añadir esta cantidad por medio del dispositivo de lecho fluidizado (boquilla de inyección). (Aunque el DPM no es "líquido", es importante tener un polvo tan cerca de la neutralidad como sea posible pero no de un pH ácido tal que se liberaría bicarbonato cuando se añade suero, dado que la humedad está implicada en el procedimiento. A un pH 7,6 o superior, una disolución concentrada de bicarbonato de sodio no desprenderá gas de CO_{2}, sino se desprenderá gas a pH inferior.)

4.: La adición de suero (aglomeración prolongada), en base al porcentaje de complementación y g que van a aglomerarse.

5.: Usando el mismo 1 l de líquido 1X de (3) anterior, determinar la cantidad de HCl 1 N o NaOH 1 N necesaria para ajustar el pH al pH deseado (por ejemplo, 7,2). Usando esta información, calcular la cantidad que va a usarse para el peso del polvo que se ha aglomerado con suero (conociendo las especificaciones de g/l). Añadir esta cantidad por medio del dispositivo de fluido (boquilla de inyección).

6.: Se usa irradiación con rayos gamma para esterilizar los medios en polvo.

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En un procedimiento similar, puede producirse un DPM que contiene suero combinando una cantidad particular de DPM con una cantidad particular de suero en polvo (preparado, por ejemplo, mediante secado por pulverización tal como se describe en el ejemplo 8 a continuación) y aglomerando después la mezcla. Por ejemplo, para la preparación de un medio que contiene FBS en polvo al 10%, pueden añadirse 55,5 g de FBS en polvo a 500 g de medio de cultivo en polvo y se mezclan los polvos bien mediante agitación. Esta mezcla puede aglomerarse entonces con agua tal como se describió anteriormente, y producirá, tras la reconstitución, un medio de cultivo que contiene FBS al 10% que puede ser de pH ajustado automáticamente.

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Ejemplo 7 Producción del 100% de polvo de suero mediante procesamiento de lecho fluidizado (para simular el secado por pulverización) Metodología

1) Se usó un aparato de lecho fluidizado de mesa de laboratorio (Strea-1). Para la producción de suero en polvo, no se coloca nada dentro de la cámara. Se utiliza la palanca para sellar la unidad.

2) Se añadió suero mediante el dispositivo de inyección (unidad de pulverización). A medida que se añade el suero a la cámara, se aumentó el flujo de aire lo suficiente y se ralentizó el flujo del suero lo suficiente de modo que se produjo evaporación del agua y el suero se secó suficientemente de manera que se formó polvo instantáneamente dentro de la cámara. No había recubrimiento húmedo o líquido en ningún lugar de la cámara.

3) La velocidad de la bomba se fijó para permitir \sim1 ml/minuto a la cámara.

4) La velocidad del flujo de aire se fijó a un nivel de \sim8-9.

5) Para limpiar los filtros de manera intermitente, se redujo la velocidad del ventilador hasta \sim2-3. Esto se hizo de manera rutinaria cada 5-10 minutos. (El nivel de flujo de aire de 8-9 es tan alto que los filtros no purgarán el polvo y se limpiarán por sí mismos).

6) Tras una ronda de purga del filtro, la velocidad del ventilador se aumentó hasta los niveles anteriores y se encendió la bomba. Una vez que se fijaron estos parámetros, se ejecutó de manera continua la bomba excepto cuando se limpiaban los filtros tal como se indica).

7) Después de que todo el suero líquido se hubiera añadido al aglomerador, se llevó a cabo el secado final durante cinco minutos.

8) Entonces se purgaron los filtros para recoger tanto polvo como fuera posible, y se apagó la máquina y se retiró el producto. Se colocó el suero en polvo en un recipiente hermético y se protegió de la luz.

Parámetros de los instrumentos típicos

Temperatura de secado: 60-65ºC

Temperatura del aire de salida: \sim33ºC

Presión de eyección: 500 kPa

Presión de atomización: 200-250 kPa

Parada de retorno de aire: 2, entre pulverización

Capacidad del ventilador: 8-9 en toda la ejecución

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Para determinar si la aglomeración del FBS afectaba a la distribución o estructura de proteínas, se ejecutaron muestras de FBS aglomerado y FBS líquido en SDS-PAGE, teñido para proteínas y escaneado densitométricamente. Tal como se muestra en la figura 1, el FBS aglomerado preparado según los presentes procedimientos (figura 1A) mostró un perfil de proteínas casi idéntico al que se observaba con el FBS líquido (figura 1B). Estos resultados indican que la producción controlada de FBS en polvo seco mediante los presentes procedimientos no afecta sustancialmente la estructura o distribución de los principales componentes del suero.

Para determinar si la aglomeración del FBS afectaba a su capacidad para apoyar el crecimiento celular y el pase, se sembraron en placa células SP2/0 en DMEM que contenía o bien FBS ("seco") aglomerado al 2% o bien FBS líquido al 2% y se examinaron las tasas de crecimiento y la recuperación de pase. Tal como se muestra en la figura 2A, las células sembradas en placa en un medio que contenía FBS aglomerado mostraron una cinética de crecimiento similar a la que mostraban las células sembradas en placa en medios que contenían FBS líquido. De manera similar, las células en los medios que contenían FBS aglomerado se recuperaron del pase con tasas de crecimiento prácticamente idénticas a las de las células en medios que contenían FBS líquido (figura 2B). En conjunto, estos resultados indican que el FBS aglomerado funciona aproximadamente de un modo equivalente al FBS líquido en el apoyo del crecimiento y el pase de células cultivadas.

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Ejemplo 8 Producción del 100% de polvo de suero mediante secado por pulverización

Como alternativa al procesamiento de lecho fluidizado, se examinó la viabilidad de producir suero en polvo seco mediante la tecnología de secado por pulverización. Se usó un secador por pulverización de laboratorio de tres pies de diámetro (Mobile Minor Spray Drier; NIRO, Columbia, Maryland) para preparar el suero en polvo. Se aspiró el FBS líquido en el secador por pulverización y se atomizó a través de una boquilla Schlick 940 ubicada en el centro del dispensador de aire, y se introdujo el aire de secado en el atomizador a través del dispensador de aire superior del aparato. El secado por pulverización se llevó a cabo en las siguientes condiciones: temperatura del aire de entrada = 200ºC; temperatura del aire de salida = 70ºC, presión de aire de atomización para la boquilla = 200 kPa; flujo de aire = 80,0 kg/hora; tasa de pulverización = 65 g/minuto. Durante el desarrollo de estos procedimientos, se usó una temperatura del aire de salida inicial de 60ºC; sin embargo, se encontró que esta temperatura era demasiado baja, y se ajustó la tasa de pulverización de nuevo a un nivel para lograr una temperatura de salida de aproximadamente 70ºC que se encontró que era óptima. Tras el secado por pulverización, se recogió el suero en polvo en el ciclón del aparato y se filtró el aire de proceso a través de un filtro de escape antes de la recirculación dentro del
aparato.

Tras la producción, se caracterizó el suero en polvo con respecto a sus propiedades físicas, en comparación con el FBS líquido del mismo lote de fuente. Se reconstituyeron las muestras tomadas de las diferentes fases del lote de producción (muestras "A" y "B") a una concentración de 60,44 g/l en agua destilada libre de endotoxinas (Invitrogen Corporation) y se examinaron para determinar los niveles de endotoxinas usando una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (Invitrogen Corporation), para determinar los niveles de hemoglobina (midiendo espectrofotométricamente la absorbancia a 525 nm), y mediante espectrofotometría UV/Vis. Los resultados se muestran en la tabla 1 y en las figuras 3A y 3B.

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TABLA 1 Caracterización física del suero en polvo

1

Tal como se observa en la tabla 1, el FBS en polvo mostró niveles de endotoxinas y hemoglobina similares a aquéllos del FBS líquido que sirvió como material de fuente para la producción del FBS en polvo. Además, las muestras tomadas de las diferentes fases del procedimiento de producción mostraron niveles de endotoxinas y hemoglobina casi idénticos, lo que indica que los presentes procedimientos dan como resultado la producción de material con una consistencia física aproximadamente uniforme por todo el lote de producción. Cuando se examinaron las muestras de FBS en polvo y líquido mediante espectrofotometría UV/visible (figura 3), la línea observada para el FBS en polvo (figura 3A) no podía distinguirse de la obtenida para el FBS líquido de fuente (figura 3B). En conjunto, estos resultados indican que el polvo de suero preparado mediante los presentes procedimientos de secado por pulverización tiene características físicas casi idénticas a aquéllas de los sueros líquidos a partir de los cuales se preparan los polvos. Tomados conjuntamente con los del ejemplo 7 anterior (véase, por ejemplo, la figura 1), estos resultados demuestran que estos procedimientos dan como resultado la producción de sueros en polvo con características físicas sin alterar con respecto a aquéllas de sueros líquidos de fuente.

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Ejemplo 9 Producción de medios de cultivo en polvo con pH ajustado automáticamente

Una de los motivos por los que nunca se incluye bicarbonato de sodio en los medios en polvo es que cualquier humedad, incluso en el aire, puede dar como resultado una condición ácida dentro de la bolsa que dará como resultado la liberación de gas de CO_{2}. Las bolsas se hincharán y producirán lo que se ha denominado "almohadas". Con el procesamiento de lecho fluidizado, se reduce esencialmente la humedad dentro del aparato hasta niveles insignificantes antes de la finalización del procedimiento. Se ha preparado medios en polvo RPMI-1640 que contienen bicarbonato de sodio y no se han observado evidencias de formación de "almohadas".

Con el fin de preparar un medio en polvo con pH ajustado, es necesario añadir el producto químico de ajuste de pH (normalmente HCl o NaOH) al polvo para llevar el pH hasta aproximadamente 7,0-7,4 tras la adición al agua. Una vez que se añade bicarbonato de sodio al polvo, muchos medios en polvo se reconstituyen en el agua en el lado básico de la neutralidad y necesitan la adición de HCl. Se esperaría que sea problemático añadir HCl a un polvo que contiene bicarbonato de sodio. Sin embargo, puesto que el líquido añadido (HCl 5 N en este caso) nunca da como resultado un estado humedecido o "líquido" dentro del aparato de lecho fluidizado, el bicarbonato de sodio no emite gas de CO_{2} y conserva completamente su capacidad de tamponamiento. Esto se ha examinado en los presentes estudios mediante experimentos de titulación de pH: se encontró que cantidades iguales de ácidos, en dos experimentos separados (figuras 4A y 4B), reducen el pH de medios aglomerados y medios aglomerados con pH ajustado automáticamente en una cantidad idéntica a la de para un medio convencional con bicarbonato de sodio añadido al líquido en el momento de la reconstitución. Estos resultados indican que tanto la aglomeración con ajuste posterior del pH, como la aglomeración con ajuste del pH durante el proceso de aglomeración, funcionan igualmente bien para producir medios de cultivo en polvo con capacidad de tamponamiento significativa.

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Ejemplo 10 Efecto de la aglomeración sobre las tasas de disolución de los medios de cultivo

Para examinar el efecto de la aglomeración de los medios de cultivo sobre la tasa de disolución de los medios, se aglomeraron muestras de Opti-MEM I^{TM} o DMEM con agua o con FBS (sólo al 2% para Opti-MEM I; al 2% o al 10% para DMEM). Tras la reconstitución de los medios aglomerados en agua, la disolución en el tiempo del Opti-MEM I se produjo mucho más rápido que la disolución de Opti-MEM I en polvo convencional (figura 5A); los resultados fueron idénticos para Opti-MEM aglomerado con agua y con FBS. Sin embargo, de un modo interesante, mientras que el DMEM aglomerado con agua se disolvió en agua mucho más rápido que el DMEM en polvo convencional, el DMEM aglomerado con FBS no lo hizo (figura 5B).

Debido a la estructura abierta de los medios en polvo aglomerados (a diferencia de los medios en polvo tradicionales), la acción capilar lleva al agua a proximidad cercana con todas las partículas de polvo. Esto evita la aparición de "bolas" de polvo, una complicación observada tras la reconstitución de la mayoría de los medios en polvo convencionales que conduce a tiempos de disolución más largos. Además de la disolución más rápida, los medios aglomerados también demostraron una formación de polvo fino reducida. Estos resultados indican que los medios de cultivo aglomerados con agua, y algunos de los medios de cultivo aglomerados con FBS, se disuelven mucho más rápido y producen menos polvo fino que los medios de cultivo en polvo tradicionales.

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Ejemplo 11 Crecimiento celular y subcultivo en medios de cultivo aglomerados reconstituidos

Muchos usos de los medios de cultivo requieren adiciones de proteínas de gran peso molecular tales como suero o albúminas. Estas moléculas pueden estar en forma de disoluciones o incluso polvo en el caso de la albúmina. Sin embargo, con el fin de asegurar la uniformidad de los medios en polvo, estas proteínas normalmente no se añaden como polvo sino como líquido tras la reconstitución de los medios en polvo en volumen para dar un medio líquido. Esto presenta algunos inconvenientes puesto que, por ejemplo, el suero debe almacenarse en el congelador para mantener el rendimiento en el tiempo. Esto añade gastos e inconvenientes puesto que el suero debe añadirse asépticamente a los medios, aumentando las posibilidades de contaminación. Si la filtración se realiza tras la adición de suero, se necesita otra etapa de procesamiento. Por tanto habría ventajas en poder proporcionar suero como parte integral de los medios en polvo.

Por tanto, los medios de cultivo se aglomeraron con agua o con diversas concentraciones de FBS. Se añadió FBS a los medios en polvo inyectándolo en los medios en polvo seco suspendidos en el aire a tasas de evaporación altas, tal como se explicó de manera general anteriormente. El nivel de complementación de suero fue del 2% en medios Opti-MEM I, y del 2% o del 10% en DMEM. Después se evaluaron el crecimiento y el éxito de pase de diversas líneas celulares en estos medios.

Tal como se muestra en la figura 6, las células SP2/0 mostraron tasas de crecimiento similares cuando se hicieron crecer en Opti-MEM I aglomerado con o bien agua o bien con FBS (figura 6A), en comparación con células hechas crecer en condiciones de cultivo convencionales (suero líquido añadido a medios en polvo reconstituidos con agua). Se observaron resultados similares con las células SP2/0 cultivadas en DMEM aglomerado con agua y con FBS complementado con FBS al 2% (figura 6B), y con células SP2/0 (figura 7A), células AE-1 (figura 7B) y células L5.1 (figura 7C) cultivadas en DMEM aglomerado con agua y con FBS complementado con FBS al 10%. Además, las células SP2/0 mostraron tasas de recuperación de pase aproximadamente similares cuando se cultivaron en Opti-MEM I aglomerado con agua y DMEM complementado con FBS al 2% (figuras 8A y 8B, respectivamente), tal como en las células SP2/0, células AE-1 y células L5.1 cultivadas en DMEM aglomerado con agua y con FBS complementado con FBS al 10% (figuras 9A, 9B y 9C, respectivamente) y las células SP2/0 cultivadas en DMEM aglomerado con agua complementado con FBS al 5% (figura 10). Además, las células SP2/0 mostraron características de pase idénticas en medios aglomerados con agua producidos en grandes lotes y en DMEM en polvo con pH ajustado automáticamente que contenía bicarbonato de sodio tal como lo hicieron en DMEM líquido convencional complementado con FBS al 5% (figura 10).

En conjunto, estos resultados indican que los complementos de medios de cultivo tales como sueros de animales (por ejemplo, FBS) pueden aglomerarse directamente en medios de cultivo, y que la complementación de los medios de cultivo durante el proceso de aglomeración de esta manera produce un medio de cultivo que proporciona un apoyo óptimo en el crecimiento y el pase de una variedad de células cultivadas. Además, estos resultados indican que los presentes polvos de medios de cultivo pueden producirse satisfactoriamente en grandes lotes, incluyendo los medios con ajuste automático de pH que contienen bicarbonato de sodio.

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Ejemplo 12 Crecimiento celular en medios de cultivo complementados con polvo de suero secado por pulverización

Como consecuencia natural de los experimentos mostrados en el ejemplo 7, las células AE-1 y células SP2/0 se sembraron en placa en DMEM que contenía o bien FBS secado por pulverización al 2% o al 10% preparado tal como se describió en el ejemplo 8, o bien que contenía FBS líquido al 2% o al 10%, y se examinaron las tasas de crecimiento y la recuperación de pase de las células. Las células se inocularon en matraces de 25 cm^{2} por triplicado a una densidad de 1 x 10^{5} células/ml en 10 ml de los medios. Se determinó la densidad de las células viables en los días 3-7, y se sometió a prueba cada línea celular en dos ocasiones. Los resultados se muestran en las figuras 11-13.

Tal como se muestra en la figura 11, las células AE-1 cultivadas en medios que contienen FBS en polvo mostraron una cinética de crecimiento similar a aquellas células cultivadas en medios que contenían FBS líquido convencional. Tal como se esperaba, las células mostraron un crecimiento más rápido hasta una densidad superior en medios de cultivo que contenían FBS al 10% que en medios que contenían FBS al 2%, y mostraron picos de crecimiento aproximadamente en el día cuatro. Se observó una cinética similar para dos experimentos separados (figuras 11A y 11B), lo que indica que estos resultados eran reproducibles. Se obtuvieron resultados análogos en dos experimentos en los que se midieron las tasas de crecimiento de células SP2/0 en medios que contenían FBS en polvo o líquido (figuras 12A y 12B). Además, las células AE-1 cultivadas en medios que contenían FBS en polvo al 5% se recuperaron del pase con tasas de crecimiento idénticas a las células en medios que contenían FBS líquido (figura 13).

Estos resultados indican que el FBS en polvo preparado mediante los procedimientos de secado por pulverización dados a conocer funciona aproximadamente de un modo equivalente al FBS líquido apoyando el crecimiento y pase de las células cultivadas. Junto con aquéllos de los ejemplos 7 y 8, estos resultados indican que estos procedimientos pueden usarse para producir FBS en polvo, mediante tecnologías de lecho fluidizado o secado por pulverización, que muestra características de rendimiento y físicas casi idénticas a aquéllas del FBS líquido.

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Ejemplo 13 Efecto de la irradiación sobre el rendimiento de los medios aglomerados

Recientemente, ha aumentado la preocupación sobre la pureza biológica de los medios y los componentes de los medios (incluyendo complementos) usados para la bioproducción, particularmente en la industria de la biotecnología. La irradiación con rayos gamma es un proceso de esterilización que se sabe que funciona bien con determinados líquidos y polvos que no son normalmente susceptibles a la esterilización por exposición al calor o a gases tóxicos. Por tanto, se irradiaron con rayos \gamma muestras de medios de cultivo aglomerados con agua o con FBS con una fuente de cobalto a 25 kGy durante varios días, y se examinaron las tasas de crecimiento de diversos tipos de células.

En un conjunto de experimentos, se inocularon células SP2/0 en diversos medios a 1 x 10^{5} células/ml y se cultivaron a 37ºC. A diversos intervalos, se obtuvieron muestras asépticamente y se determinaron los recuentos celulares mediante contador Coulter y se determinó la viabilidad mediante la exclusión con azul trípano. Los medios se prepararon disolviendo suficientes medios en polvo para preparar una disolución 1X en 1 l de agua, agitando y filtrando a través de un filtro de 0,22 \mum. Los resultados se muestran en el gráfico de la figura 14. Aquellas condiciones en el gráfico que indican "FBS en polvo" en el gráfico hacen referencia a la adición de FBS en polvo (preparado como en los ejemplos 7 u 8 anteriores) al medio 1X reconstituido preparado a partir o bien de medios en polvo convencionales o bien de medios aglomerados (irradiados o no irradiados). Aquellas condiciones en el gráfico que indican "DMEM + FBS aglomerado irradiado" hacen referencia al uso de lecho fluidizado para preparar los medios aglomerados pulverizando
FBS en los medios en polvo (convencionales o aglomerados) para preparar unos medios aglomerados con FBS.

Tal como se muestra en la figura 14, la irradiación con rayos \gamma de medios basales en polvo convencionales y medios basales aglomerados no afectaron perjudicialmente a la capacidad de estos medios de apoyar el crecimiento de células SP2/0. Además, mientras que la irradiación afectaba negativamente a los medios en polvo que contenían FBS en polvo, y al propio FBS en polvo, este efecto disminuía con el aumento de la concentración de suero.

Para examinar más ampliamente estos efectos de la irradiación con rayos \gamma, se inocularon muestras de células VERO en VP-SFM^{TM} que se había reconstituido o aglomerado de manera convencional tal como anteriormente. Sin embargo, a los medios en polvo en la cámara de aglomeración se les añadieron factor de crecimiento epidérmico (EGF) y quelato de citrato férrico, complementos tradicionales para estos medios, por medio de la boquilla de pulverización durante la aglomeración. Entonces se usaron los medios directamente o se irradiaron con rayos \gamma tal como se describió anteriormente. Se inocularon las células a 3 x 10^{5} células/matraz en matraces T-25 y se incubaron a 37ºC. Los recuentos celulares y la viabilidad se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente, con los resultados mostrados en la figura 15.

Tal como se observa en la figura 15, las células VERO mostraron un éxito de crecimiento y pase aproximadamente equivalente cuando se cultivaron en medios aglomerados que se habían irradiado con rayos \gamma como en medios aglomerados que no se habían irradiado con rayos \gamma. Además, la irradiación de los medios no tuvo ningún efecto sobre los complementos de cultivo de bajo nivel EGF y quelato de citrato férrico que estaban presentes en los medios.

Estos resultados indican que la irradiación con rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en la preparación de muchos medios de cultivo aglomerados en volumen, incluyendo aquéllos que contienen suero, EGF u otros complementos, mediante los presentes procedimientos.

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Ejemplo 14 Efecto de la irradiación sobre el rendimiento de los complementos de medios en polvo

Para demostrar la eficacia de los presentes procedimientos en la producción de complementos de medios estériles, se irradió holotransferrina humana liofilizada mediante la exposición a una fuente de rayos \gamma de cobalto a 25 kGy durante aproximadamente 3 días a -70ºC o a temperatura ambiente. Entonces se cultivaron 293 células en medios que se habían complementado con transferrina irradiada o con transferrina control que no se había irradiado (almacenada a -70ºC o a temperatura ambiente), y se comparó el crecimiento celular al de los medios de cultivo que contenían transferrina convencionales o medios que no contenían transferrina.

Se recogieron las células 293 de fase semilogarítmica que crecían en medio 293 libre de suero (293 SFM), se lavaron una vez a 200 x g durante 5 minutos y volvieron a suspenderse en 293 SFM libre de transferrina para la determinación del recuento y la viabilidad. Se sembraron en placa las células en matraces Ehrlenmeyer de 125 ml por triplicado a una densidad de 3 x 10^{5} células/ml en un volumen de 20 ml en 293 SFM (control positivo), 293 SFM libre de transferrina (control negativo), en 293 SFM que contenía transferrina no irradiada almacenada a -70ºC o a temperatura ambiente, o en 293 SFM que contenía transferrina preparada tal como se describió anteriormente. Se colocaron los matraces en un agitador rotatorio fijado a aproximadamente 125 rpm, en un incubador a 37ºC equilibrado con una atmósfera del 8% de CO_{2}/92% de aire. Se determinaron los recuentos celulares diarios usando un contador de partículas Coulter y se determinaron las viabilidades mediante exclusión con azul trípano según los procedimientos convencionales. Cuando las células alcanzaron una densidad de aproximadamente 1,2 a 1,7 x 10^{6} por matraz, el contenido de uno de los matraces de cada muestra se recogió, centrifugó, volvió a suspenderse en un medio recién preparado y se pasó a tres matraces nuevos. Entonces se llevaron a cabo los recuentos celulares y las viabilidades de los pases anteriores y posteriores tal como se describió anteriormente. Se sometieron a prueba cuatro pases consecutivos de células incubadas en las condiciones anteriores.

Tal como se muestra en las figuras 16A-16D, las células cultivadas en medios que contenían transferrina que había irradiado con rayos \gamma o bien a -70ºC o bien a temperatura ambiente mostraron una cinética de crecimiento y una supervivencia casi idénticas en el primer pase (figura 16A), segundo pase (figura 16B), tercer pase (figura 16C) y cuarto pase (figura 16D) a las de las células cultivadas en 293 SFM convencional o en 293 SFM que contenía transferrina que no se había irradiado con rayos \gamma. Sin embargo, las células cultivadas en medios libres de transferrina, sobrevivieron bien durante el primer pase (figura 16A) pero detuvieron su crecimiento y mostraron una pérdida significativa en la viabilidad tras el subcultivo (figura 16B).

Estos resultados demostraron que la irradiación con rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en la preparación de complementos de medios de cultivo en polvo en volumen, tal como transferrina. Además, estos datos indican que los complementos de medios de cultivo tal como la transferrina pueden irradiarse con rayos \gamma a temperatura ambiente sin pérdida significativa de la actividad.

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Ejemplo 15 Efecto de la irradiación sobre las características bioquímicas de los sueros en polvo

Para determinar adicionalmente el impacto de la irradiación con rayos \gamma sobre los sueros, se irradiaron muestras de FBS en polvo secado por pulverización a 25 kGy a -70ºC o a temperatura ambiente (TA), y se analizaron comercialmente para las concentraciones de diversos constituyentes bioquímicos en los sueros. Como controles, también se analizaron muestras de FBS líquido y FBS secado por pulverización no irradiado. Los resultados se muestran en la tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Análisis químico de FBS secado por pulverización

2

Estos resultados indican que el proceso de irradiación con rayos \gamma no afectaba significativamente a las concentraciones de la mayoría de los constituyentes bioquímicos de FBS. Estos resultados también indican que tras el secado por pulverización, varios de los componentes de FBS (fosfatasa alcalina, AST y LD, y posiblemente glucosa) sufren una reducción significativa en la concentración en comparación con sus concentraciones en el FBS líquido de partida.

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Ejemplo 16 Efectos de la irradiación sobre el rendimiento de los sueros en polvo

Para examinar el impacto de la irradiación con rayos \gamma sobre la capacidad de los sueros de polvo seco para apoyar el crecimiento celular, se usaron muestras de FBS secado por pulverización irradiadas en diversas condiciones para complementar los medios de cultivo, y se hicieron crecer las células adherentes y en suspensión durante hasta tres pases en estos medios. Como células en suspensión modelo, se usaron las líneas hibridoma SP2/0 y AE-1, mientras que se usaron los cultivos de VERO y BHK como células adherentes típicas. Las células se cultivaron en medios que contenían sueros de prueba o sueros control (secados por pulverización pero no irradiados) durante hasta tres pases según los procedimientos generales explicados de manera general en el ejemplo 14 anterior. En cada punto de pase, se recogieron las células y se subcultivaron, mientras que se contó una alícuota tal como anteriormente para determinar las células viables/ml. Los resultados en cada punto se expresaron como un porcentaje del recuento de células viables obtenido en medios complementados con FBS líquido, y se muestran en las figuras 17A, 17B, 17C y 17D.

Pueden extraerse varias conclusiones de los resultados de estos estudios. En primer lugar, la irradiación con rayos \gamma de FBS no parece reducir la capacidad del FBS secado por pulverización para apoyar el crecimiento de las células en suspensión y adherentes (compárense los conjuntos de datos irradiados con el conjunto de datos no irradiados en cada figura). De hecho, las células BHK (figura 17D) en realidad crecieron mejor en los medios que contenían FBS en polvo que se habían irradiado a -70ºC que en los sueros no irradiados. En segundo lugar, los sueros irradiados a -70ºC parecen funcionar mejor que aquéllos irradiados a temperatura ambiente en su capacidad para apoyar el crecimiento celular, excepto tal vez para las células VERO (figura 17C). Finalmente, los resultados de estos estudios fueron muy específicos del tipo de célula: las células en suspensión (figuras 17A y 17B) crecieron mejor en FBS secado por pulverización, irradiado o no irradiado, que las células adherentes (figuras 17C y 17D); y entre las células adherentes, las células BHK (figura 17D) crecieron mejor en FBS secado por pulverización que las células VERO (figura 17C).

Estos resultados demuestran que la irradiación con rayos \gamma puede usarse como técnica de esterilización en la preparación de sueros en polvo en volumen, tal como FBS. Además, a diferencia de aquéllos notificados para la transferrina en el ejemplo 14 anterior, estos datos sugieren que la temperatura óptima para la irradiación de sueros, con el fin de mantener la capacidad de los sueros para apoyar el crecimiento celular, es probable que sea inferior a la temperatura ambiente.

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Ejemplos 17 y 18

Los lípidos (particularmente esteroles y ácidos grasos) son nutrientes críticos para el cultivo de alta densidad de células eucariotas. La inclusión de componentes lipídicos en los medios en forma seca ha sido un reto técnico. Los complementos lipídicos se suministran normalmente para la adición separada tras la reconstitución y filtración del polvo, aumentando la manipulación y las posibilidades de error en una instalación de fabricación biofarmacéutica. La tecnología de granulación avanzada (AGT^{TM}) es un formato de medios en forma seca novedoso que tiene ventajas significativas. Dentro de un medio granulado individual se incorporan todos los componentes de una formulación compleja, para incluir tampones, factores de crecimiento y oligoelementos. La formulación de pH automático, baja en polvo fino, resultante simplemente requiere la adición a agua para producir un medio 1X reconstituido completo. La tecnología de ciclodextrina así como el uso de sales de sodio y disoluciones hidroalcohólicas de lípidos pueden usarse junto con el proceso AGT para suministrar el lípido que puede usarse en un formato de medio seco.

Los lípidos sometidos a prueba fueron colesterol y varios ácidos grasos que se proporcionaron o bien como un complemento aséptico para medios líquidos o bien como parte de una formulación de AGT completa. Los controles incluían medio sin lípido. La línea celular usada fue ECACC n.º 85110503, un auxótrofo del colesterol. Las células se cultivaron en medio CD-hibridoma, que está definido químicamente y no contiene componentes derivados de animales. Los resultados analíticos de CG indicaron una excelente disponibilidad de lípidos tras la filtración cuando se incorporan formas lipídicas complejadas con ciclodextrina en el proceso AGT. El crecimiento y la viabilidad de las células era comparable cuando crecieron en o bien un medio completo derivado de AGT o bien un medio líquido control con complementación de lípido. El pico de las densidades celulares de ambos formatos de medios alcanzó 3,5 x 10^{6} células/ml en un cultivo de células del lote. El uso de las sales, por ejemplo, una sal de sodio de un ácido lipoico en AGT ha demostrado ser eficaz para suministrar el lípido a las células en cultivo.

Para la preparación, se disolvió ciclodextrina en agua a una concentración del 62,5% (62,5 g en 100 ml de agua). Esto puede variar algo menos pero se acerca aproximadamente a la disolución máxima de ciclodextrina en agua a temperatura ambiente. Se prefiere mantener una razón de ciclodextrina con respecto a lípido tan alta como sea práctica puesto que la capacidad de la ciclodextrina para mantener el reparto (complejación física con) del lípido y almacenarlo en disolución tras la dilución en agua depende de los niveles de ciclodextrina. (\sim0,125% o una disolución mayor de ciclodextrina es ventajosa en el medio 1X). Entonces se añadieron lípidos directamente a la disolución de ciclodextrina a una concentración para que estuviera a la concentración deseada cuando se diluyó en medios de cultivo celular acuosos. Se permitió que el lípido se disolviera con agitación. Además de la adición directa del lípido a la ciclodextrina, también es posible añadir el lípido al alcohol antes de la adición a la ciclodextrina. (Esto puede desearse si la cantidad de lípido que va a añadirse es tan pequeña que la adición por sí misma es problemática físicamente). Puesto que la disolución de ciclodextrina-lípido resultante es bastante viscosa, puede ser preferible diluir la disolución de ciclodextrina-lípido anterior por ejemplo, con agua para el uso conveniente. Tales disoluciones pueden dar como resultado un concentrado de por ejemplo 500X o 250X. (Un experto habitual apreciará que a medida que se diluye la disolución de ciclodextrina-lípido, será necesario añadir más volumen al medio de cultivo celular para producir la concentración de lípido deseada).

Tipos de lípido de importancia para el cultivo celular: colesterol (homólogos tanto animales como vegetales), ácido linoleico, ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido palmítico, ácido oléico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido linolénico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, esfingomielina, cardiolipina, vitamina A, vitamina E, vitamina K, prostaglandina, etc.

Experimento de cultivo celular con el complejo ciclodextrina-lípido:

(Las células se sometieron a subpase cada 3 ó 4 días)

1 = Medio granulado (aglomerado) CD hibridoma con lípidos añadidos por medio de pulverización en complejos ciclodextrina-lípido durante (como parte del) proceso de aglomeración.

2 = Medio CD hibridoma con lípidos añadidos como adición de complemento de ciclodextrina-lípido tras la reconstitución.

3 = Medio CD Hibridoma sin la adición de lípidos.

4

: Conclusión: Los lípidos suministrados mediante tecnología de granulación usando pulverización de ciclodextrina-lípido son comparables con los lípidos añadidos usando ciclodextrina-lípido añadido como complemento a un medio reconstituido 1X.

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Habiendo descrito ahora completamente la presente invención en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de la claridad de la comprensión, será obvio para un experto habitual en la técnica que la misma puede llevarse a cabo modificando o cambiando la invención dentro de un intervalo amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o cualquier realización específica de la misma, y que tales modificaciones o cambios están abarcados dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.

Claims

1. Procedimiento de producción de un polvo de medio nutritivo aglomerado, un polvo de complemento de medio aglomerado, un polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o un polvo de tampón aglomerado, comprendiendo el procedimiento:

aglomerar un polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, con un disolvente que comprende al menos un lípido disuelto en el mismo,

suministrar el disolvente al menos un lípido para su incorporación en el polvo de medio nutritivo, polvo de complemento de medio, polvo de subgrupo de medio nutritivo o polvo de tampón, y

en el que el al menos un lípido se compleja con una ciclodextrina.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ciclodextrina es \beta-metilciclodextrina.

3. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la aglomeración comprende aglomeración en lecho fluidizado.

4. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el disolvente está en fase líquida.

5. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el lípido está en forma de una sal.

6. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el lípido tiene uno o más grupos hidroxilo.

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el disolvente es una mezcla.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la mezcla es una mezcla de líquidos.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un disolvente polar.

10. Procedimiento según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un disolvente apolar.

11. Procedimiento según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la mezcla comprende al menos un disolvente orgánico.

12. Procedimiento según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la mezcla comprende un 20%-95% de disolvente orgánico.

13. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la mezcla comprende al menos un disolvente seleccionado del grupo constituido por: (a) al menos un disolvente polar; y (b) al menos un disolvente orgánico o al menos un disolvente apolar.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la mezcla comprende los disolventes en razón del 1% al 99% de (a) el al menos un disolvente polar con (b) el al menos un disolvente orgánico o el al menos un disolvente apolar.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la mezcla comprende un 40-60% del al menos un disolvente orgánico o del al menos un disolvente apolar.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la mezcla comprende un 50% de (a) el al menos un disolvente polar y el 50% de (b) el al menos un disolvente orgánico o el al menos un disolvente apolar.

17. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la mezcla comprende agua y al menos un disolvente seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y cetonas.

18. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la mezcla comprende agua y alcohol.

19. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 18, en el que la mezcla comprende agua y etanol.

20. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la mezcla comprende al menos un disolvente seleccionado del grupo constituido por dimetilsulfóxido, alcoholes, éteres y cetonas.

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21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la mezcla comprende aproximadamente un 40-60% de etanol.

22. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la mezcla comprende aproximadamente un 50% de etanol.

23. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el disolvente comprende una mezcla de al menos dos disolventes seleccionados del grupo constituido por disolventes apolares y disolventes orgánicos.

24. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente es agua.

25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ciclodextrina se disuelve en agua, y después se añade una mezcla de lípido/alcohol a la disolución de ciclodextrina, antes de la aglomeración.

26. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el suministro se lleva a cabo en condiciones que comprenden al menos una de temperatura controlada, humedad controlada y presión parcial controlada del/de los disolvente(s).

27. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el lípido se selecciona del grupo constituido por ácido linoleico, ácido lipoico, ácido araquidónico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido linolénico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, esfingomielina, cardiolipina, vitamina A, vitamina E, vitamina K, prostaglandina y un esterol.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicho esterol es un esterol vegetal o uno animal.

29. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que el esterol es colesterol.

30. Polvo de medio nutritivo aglomerado, polvo de complemento de medio aglomerado, polvo de subgrupo de medio nutritivo aglomerado o polvo de tampón aglomerado, preparados según el procedimiento de las reivindicaciones 1-27.

31. Polvo según la reivindicación 30 que tiene una formación de polvo fino reducida en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado.

32. Polvo según la reivindicación 30 que tiene una solubilidad más completa en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado.

33. Polvo según la reivindicación 30 que tiene menos material insoluble en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado.

34. Polvo según la reivindicación 30 que tiene una disolución más rápida en comparación con un polvo de medio nutritivo no aglomerado.

35. Polvo según la reivindicación 30, en el que el polvo de medio nutritivo está libre de suero.

36. Polvo según la reivindicación 30, en el que el polvo de medio nutritivo está libre de componentes de mamíferos.

37. Polvo según la reivindicación 30, en el que el polvo de medio nutritivo está libre de componentes animales.

38. Procedimiento de cultivo de una célula que comprende: (a) reconstituir el polvo aglomerado según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37 con un disolvente para formar una disolución líquida; y (b) poner en contacto la célula con la disolución líquida en condiciones que favorecen el cultivo de la célula.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la célula es una célula seleccionada del grupo constituido por célula bacteriana, célula de insectos, célula de levaduras, célula de nematodos, célula de aves, célula de anfibios, célula de reptiles y célula de mamíferos.

40. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la célula es una célula de mamíferos.

41. Procedimiento según la reivindicación 40, en el que la célula de mamíferos se selecciona del grupo constituido por una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula AE-1, una célula SP2/0, una célula L5.1, una célula PerC6, una célula 293 y una célula de hibridoma.

42. Procedimiento según la reivindicación 40, en el que la célula de mamíferos es una célula humana.

43. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 42 en el que el crecimiento de la célula a los 3, 4, 7, 10, 14, 28, 30, 60 ó 90 días es del 50%-120% en comparación con el crecimiento de la célula en el mismo momento en un medio líquido con lípido añadido.