ES2341646T3 - Composiciones y metodos para administrar farmacos fotosensibles. - Google Patents
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Abstract
Nanopartícula cargada con un fotosensibilizador que comprende una o más porfirinas verdes y uno o más polímeros de poliéster, en la que las nanopartículas son un vehículo de administración de liberación rápida del fotosensibilizador en un medio que contiene suero.
Description
Composiciones y métodos para administrar
fármacos fotosensibles.
La invención se refiere al campo de la terapia
fotodinámica (PDT), y en particular a unas composiciones y métodos
para la administración local o parenteral de porfirinas verdes. Se
proporcionan unas composiciones de nanopartículas biodegradables
que contienen unos polímeros de poliéster para administrar
porfirinas verdes como agente activable en la PDT. También se
proporcionan unos métodos para la preparación y uso de tales
composiciones de nanopartículas.
La terapia fotodinámica (PDT) es un proceso en
dos etapas. Primero, se administra un agente o fármaco fotoactivable
(denominado "fotosensibilizador" o "PS" de manera
intercambiable en la presente memoria) bien sistémicamente o
localmente. A continuación tras un intervalo apropiado, tiempo en el
que el fármaco fotoactivable se acumula en un tejido diana más que
en un tejido no diana, se aplica radiación con radiación
electromagnética, como la luz visible (no térmica) a una zona de
tratamiento durante un período de tiempo corto. Durante el tiempo
de radiación el fármaco actúa como fotosensibilizador catalítico,
que absorbe un fotón y que transfiere esta energía al oxígeno. Este
proceso convierte el oxígeno molecular benigno estable disponible en
oxígeno en estado singlete citotóxico u otra especie de oxígeno
tóxico, que mata las células diana o modifica o modula la actividad
celular en ellas. La PDT se utiliza ampliamente en el tratamiento
del cáncer, y en determinadas enfermedades oftálmicas
caracterizadas por la neovascularización en el ojo, por ejemplo, la
degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Visudyne®
(Novartis Ophthalmics, Inc.), que contiene un fotosensibilizador de
porfirina verde, verteporfina, está aprobado en muchos países para
el tratamiento de la neovascularización coroidea y la AMD.
Aunque muchos fotosensibilizadores son
hidrófobos o insolubles en agua, a menudo resultan necesarios en
medios acuosos o basados en agua en los que se encuentran las
células diana. Así pues, se han desarrollado múltiples sistemas
como vehículos de administración para tales agentes.
Preferentemente, se fabrican vehículos para la administración
farmacéuticamente aceptables de fotosensibilizadores de manera
simple y rentable, a la vez que se mantienen las propiedades de
administración eficaz del fármaco.
Las nanopartículas son partículas coloidales
sólidas formadas por la asociación de polímeros adecuados. Las
nanopartículas son producidas por medios mecánicos o químicos y
pueden formularse para contener una sustancia activa como un
fármaco hidrófobo en asociación con los polímeros. De esta manera
las nanopartículas proporcionan una alternativa a otros portadores
coloidales como los liposomas, micelas, niosomas (vesículas
surfactantes no iónicas), y microemulsiones.
Los polímeros sintéticos utilizados en la
preparación de nanopartículas incluyen poliésteres como el ácido
(poli)láctico, copolímero de láctido y glicólido y
poli(\varepsilon-caprolactona) (patente
U.S. nº 4.968.350). Las nanopartículas suelen prepararse utilizando
uno de los siguientes métodos: técnica de evaporación de la
emulsión, técnica del desplazamiento del disolvente, técnica de
emulsificación-difusión y técnica de la purificación
salina. Estas técnicas son similares en lo referente a que implican
una solución orgánica que contiene los componentes de
nanopartículas y un componente acuoso que contiene estabilizadores
que actúa como medio de dispersión para las nanopartículas.
Se han investigado ampliamente las partículas
biodegradables basadas en polímeros de poliéster como el copolímero
de D,L-láctido y glicólido (PLGA) y el polímero de
D,L-láctido (PLA) como sistemas de administración
parenteral (Allémann et al., 1.998; Kawashima et al.,
1.998; Rodrigues Jr et al., 1.995; Scholes et al.,
1.993; Smith et al., 1.986). Los polímeros de poliéster,
aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos,
resultan de interés debido a sus propiedades biológicas y
fisicoquímicas (Vert 1.987; Vert et al., 1.998). Se han
utilizado las nanopartículas para modificar la farmacocinética de
los fármacos, como se detalla en los siguientes: Roland, Clinical
pharmacokinetics of doxorubicin in hepatoma patients after a single
intravenous injection of free or nanoparticles bound anthracycline,
Int. J. Pharm., 54:113(1.989); J. Kattan, J.P. Droz, P.
Couvreur, J.P. Marino, A.B. Laroze, P. Rougier, P. Brault, H.
Vranckx, J. M. Grognet, X. Morge and H.
Sancho-Carnier, Phase I clinical trial and
pharmacokinetic evaluation of doxorubicin carried by
polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles, Invest. New Drugs, 10:191
(1.992); H.S. Yoo, J.E. Oh, T.G. Park, Biodegradable nanoparticles
containing doxorubicin-PLGA conjugate for sustained
release, Pharm. Res., 16: 1114 (1.999); E. Allémann, R. Gurny, E.
Doelker, F.S. Skinner, H. Schutz, Distrubution, kinetics and
elimination of radioactivity after intravenous and intramuscular
injection of 14C-savoxepine loaded
poly(D,L-lactic acid) nanospheres to rats,
J. Controlled Release 29: 97-104 (1.994); R. Jalil,
Biodegradable poly(lactic acid) and
poly(lactide-co-glycolide)
polymers in sustained drug delivery, Drug Dev. Ind Pharm., 16:2353
(1.990), C. Tasset; N. Barette; S. Thysman; J.M. Ketelslegers; V.
Preat et al, Polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles as
sustained release system for calcitonin, J. Control. Rel., 33: 23
(1.995); T. Harmia; P. Speiser, J. Kreuter, Nanoparticles as drug
carriers in ophthalmology, Pharm. Acta. Helv., 62: 322(1987);
and M. El-Samaligy; P. Rohdewald, Triamcinolone
diacetate nanoparticles, sustained release drug delivery system
suitable for parenteral administration Pharm. Acta. Helv.,
57(7): 201-4 (1.982).
Tradicionalmente, las nanopartículas
biodegradables han servido como depósitos de fármacos inmovilizados
que se liberan lentamente de la matriz del polímero. Se creía que
esto era un efecto de una degradación lenta del polímero para
resultar en una liberación lenta del fármaco a lo largo del tiempo.
Por ejemplo, las inyecciones intramusculares en mujeres de
microcápsulas inyectables de acción prolongada compuestas por
copolímero de D,L-láctido y glicólido que contenían
contraceptivos proporcionaban una liberación controlada (Beck LR
et al., A. J. Obstet. Gynecol. 147, 815-821,
1.983). Además, se creía que las nanopartículas de doxorubicina se
depositaban en un reservorio intrahepático y se liberaban lentamente
al administrase en nanopartículas de poliisohexilcianoacrilato y
polimetacrilato (Kattan J. et al., Investigational New Drugs,
10, 191-199, 1.992, Rolland A International Journal
of Pharmaceutics, 54, 113-121, 1.989).
Para la administración parenteral, las
formulaciones de nanopartículas deben satisfacer los requisitos
farmacopeicos de esterilidad. Sin embargo, la esterilización de
tales dispositivos poliméricos mediante una técnica satisfactoria
sigue siendo un reto. La labilidad química o física de la matriz del
polímero suele limitar los métodos más convencionales para obtener
unos productos estériles aceptables. Por ejemplo, la esterilización
mediante autoclavado puede inducir la degradación de los
poliésteres y el fármaco por hidrólisis. Estos polímeros también son
sensibles al calor debido a su naturaleza termoplástica (Athanasiou
et al., 1.996). La esterilización química mediante gases
como el óxido de etileno puede resultar en problemas de toxicidad a
residuos tóxicos. Numerosos estudios han demostrado los efectos de
la radiación \gamma en la estabilidad y la seguridad de los
portadores coloidales basados en poliésteres, principalmente las
micropartículas (Hausberger et al., 1.995; Mohr et
al., 1.999; Montanari et al., 1.998; Volland et
al., 1.994). Se demostró que la radiación gamma alteraba las
propiedades de las micropartículas de poliéster cargadas con el
fármaco de varias maneras como las reacciones radiolíticas,
escisión de cadenas y reticulación (Volland et al., 1.994).
Estas reacciones pueden tener consecuencias en el contenido nominal
de fármaco, el patrón de liberación del fármaco y la bioresorción
del sistema. Además, el fármaco encapsulado puede degradarse tras
la exposición a radiación gamma. Por tanto, la selección de un
método de esterilización adecuado para ese tipo de formulaciones
resulta crucial para asegurar su integridad física y química, su
rendimiento y seguridad in vivo.
Como técnica alternativa, se ha utilizado la
filtración estéril a través de filtros de membrana de 0,22 \mum
para materiales químicamente o térmicamente sensibles puesto que no
tiene ningún efecto adverso en el polímero y el fármaco. La
presencia de partículas con tamaños por encima del "cutoff" de
la membrana de esterilización, sin embargo, tiende a resultar en
una obstrucción de la membrana y una disminución de la eficacia de
filtración. Resultaría ventajoso contar con métodos para la
preparación de nanopartículas con un tamaño medio significativamente
por debajo del "cutoff" de la membrana de esterilización y con
una distribución de tamaño reducida para evitar la obstrucción de
la membrana. La capacidad de producir nanopartículas en el intervalo
de tamaño de 100-150 nm resultaría atractiva para
los sitios diana situados fuera del sistema vascular. Algunos
tumores, que poseen una microvasculatura deficiente, muestran una
permeabilidad vascular aumentada que favorece la accesibilidad de
los portadores coloidales a las células tumorales extravasculares
(Douglas et al., 1.987).
WO 97/10 811 describe unas nanopartículas para
su uso en la terapia fotodinámica, nanopartículas que comprenden un
complejo de ftalocianina de cinc.
La presente invención proporciona unas
nanopartículas cargadas con una porfirina verde que inesperadamente
liberan la porfirina verde rápidamente una vez que se introducen las
nanopartículas en un ambiente que contiene proteínas séricas, por
ejemplo, el torrente sanguíneo de un sujeto humano sometido a un
tratamiento de terapia fotodinámica (PDT). Esta observación
contrasta con los usos anteriores de nanopartículas para la
liberación controlada, o retardada, de los ingredientes activos de
las nanopartículas. Las nanopartículas de la invención también son
lo suficientemente pequeñas para permitir una esterilización eficaz
mediante un proceso de filtración.
La presente invención proporciona de esta manera
unos métodos para la producción de unas nanopartículas cargadas con
un fotosensibilizador de un tamaño medio de partícula inferior a
aproximadamente 220 nm, opcionalmente inferior a 200 nm, de
diámetro para posibilitar la esterilización mediante un proceso de
filtración. Las nanopartículas de la presente invención también son
lo suficientemente estables para soportar la liofilización y la
reconstitución en un medio acuoso para la administración.
La invención proporciona una composición que
comprende unas nanopartículas cargadas con un fotosensibilizador
que comprenden una o más porfirinas verdes y uno o más polímeros de
poliéster.
En las formas de realización preferentes, los
polímeros son el copolímero de D,L-láctido y
glicólido, también denominado PLGA, y/o el polímero de
D,L-láctido, también denominado PLA. En otra forma
de realización, las nanopartículas cargadas con un
fotosensibilizador se encuentran en forma liofilizada. En una forma
de realización preferente, las nanopartículas son estables tras la
liofilización y tras la reconstitución en un medio acuoso.
En las formas de realización preferentes, las
porfirinas verdes son verteporfina, QLT 0069 ó QLT 0074. Por
supuesto, las porfirinas verdes se utilizan preferentemente en
combinación con PLGA y/o PLA en la práctica de la invención.
El descubrimiento sorprendente de que las
nanopartículas cargadas con un fotosensibilizador liberaban
rápidamente el fotosensibilizador (en unos pocos segundos) tras ser
expuestas a un medio que contenía suero proporciona un fundamento
para el uso de las nanopartículas como vehículo de administración
para los fotosensibilizadores. Como entenderá la persona experta,
la liberación controlada del fotosensiblizador no resulta deseable
en un ámbito clínico o en otro ámbito terapéutico, donde deba
evitarse un estado continuado de fotosensibilización, producido por
una liberación lenta del fotosensibilizador, para evitar efectos
secundarios indeseables. Se han utilizado anteriormente
nanopartículas que contenían compuestos terapéuticos para la
liberación controlada de compuestos terapéuticos a diferencia de la
liberación rápida.
La administración de las nanopartículas es
seguida de la activación del fotosensibilizador tras su rápida
administración a los tejidos o células diana. La administración se
realiza preferentemente por medios parenterales como la inyección
intravenosa, pero sin limitarse a ella.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del proceso de preparación de las nanopartículas.
La Figura 2 es un gráfico que muestra las trazas
de base temporal superpuestas que muestran la liberación de la
verteporfina de las nanopartículas cargadas con verteporfina. En t =
60 s, se inyectaron 200 \muL de FBS; en t = 240 s, se inyectaron
20 \muL de Tritón/5DW v/v al 10%.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
fluorescencia cutánea en ratones hembra SKH1 tras la administración
de una dosis intravenosa de 1,4 \mumol/kg de nanopartículas PLGA
con verteporfina.
La Figura 4 son unos gráficos que muestran la
fotosensibilidad cutánea inducida por las nanopartículas cargadas
con verteporfina administradas intravenosamente, expuesta a luz de
un simulador solar, y puntuadas 1 y 3 días después de la inyección.
La dosis intravenosa de verteporfina fue de 1,4 \mumol/kg; la
dosis de luz fue de 60 J/cm^{2}. Las barras de error indican la
desviación estándar en base a cuatro ratones por grupo.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento sorprendente de que las nanopartículas que contenían
un fotosensibilizador liberaban rápidamente el fotosensibilizador
(entre unos pocos segundos a unos minutos) tras ser expuestas a un
medio que contenía suero. Se cree que este es el primer caso de una
composición de nanopartículas que ha demostrado liberar un
compuesto terapéutico a los pocos segundos de exposición al suero.
El hecho de que tales nanopartículas liberen el fotosensibilizador
rápidamente hace práctico utilizar nanopartículas cargadas con un
fotosensibilizador para administrar un fotosensibilizador a un
sujeto sometido a PDT. En la PDT, resulta muy deseable utilizar una
formulación que libere el fotosensibilizador rápidamente de manera
que pueda tener una activación máxima, pueda acumularse en el tejido
diana a los pocos minutos de la administración, y a continuación se
elimine rápidamente del sujeto tras la activación del
fotosensibilizador mediante la administración de luz. Esto evita
las complicaciones de una fotosensibilidad cutánea prolongada
observada en situaciones donde las concentraciones del
fotosensibilizador permanecen a lo largo de un período prolongado.
Sin restringirse a la teoría, y ofrecido en beneficio de mejorar la
comprensión de la invención, la combinación de una porfirina verde
y un polímero de poliéster en una nanopartícula puede desestabilizar
la nanopartícula de manera que libere fácilmente la porfirina verde
después de entrar en contacto con el suero. Esta liberación puede
darse en forma de una transferencia del fotosensibilizador de la
nanopartícula a las lipoproteínas en el suero.
De manera alternativa, y nuevamente sin
restringirse a la teoría, la liberación rápida de la porfirina verde
pude deberse al tamaño por debajo de 220 nm de las nanopartículas
de la invención, que puede facilitar la dispersión del
fotosensibilizador. Esto puede sugerir que el fenómeno de liberación
rápida sería aplicable en general a ingredientes activos o agentes
farmacéuticos además de los fotosensibilizadores.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término nanopartículas incluye nanosferas, compuestas por una
estructura tipo matriz polimérica, y nanocápsulas, compuestas por
una cubierta de polímero que rodea un núcleo líquido. La
"liberación rápida" del fotosensibilizador (PS) de una
preparación de nanopartículas que las contiene se refiere a la
capacidad de una nanopartícula que contiene un PS de liberar o
administrar el PS aproximadamente a los 5 minutos después de entrar
en contacto con un medio que contiene suero. Preferentemente, la
liberación de más del 50% del PS se da en menos de 5 minutos tras
el contacto, más preferentemente en menos de aproximadamente 4
minutos, menos de aproximadamente 3 minutos, menos de
aproximadamente 2 minutos, menos de aproximadamente 60 segundos, o
menos de aproximadamente 30 segundos. En otras formas de realización
de la invención, la cantidad de PS liberado puede ser más del 60% o
más del 70% del PS presente en la nanopartícula. Los
fotosensiblizadores y los polímeros que forman las nanopartículas
para la práctica de la invención se proporcionan más adelante.
"Porfirinas verdes" se refiere a derivados de porfirinas
obtenidos haciendo reaccionar un núcleo de porfirina con un alquino
en una reacción tipo Diels-Alder para obtener una
mono-hidrobenzoporfirina.
La invención también proporciona unos métodos
para la formulación de nanopartículas que contienen PS como se
describe más adelante. Los métodos descritos incluyen el
descubrimiento de unos medios para preparar nanopartículas de un
tamaño pequeño de manera predecible y de una uniformidad relativa
(en la distribución de tamaño) de manera que las nanopartículas
puedan esterilizarse fácilmente mediante filtración, como a través
de un filtro de 0,22 micrones. Las nanopartículas preferentes de la
invención tienen un tamaño medio de partícula inferior a
aproximadamente 200 nm, más preferentemente inferior a o de
aproximadamente 190 nm, inferior a o de aproximadamente 180 nm,
inferior a o de aproximadamente 170 nm, inferior a o de
aproximadamente 160 nm, inferior a o de aproximadamente 150 nm,
inferior a o de aproximadamente 140 nm, o inferior a o de
aproximadamente 130 nm de diámetro. El uso de "diámetro" no
indica que las nanopartículas de la invención tengan necesariamente
una forma esférica. En cambio el término se refiere a la anchura
media aproximada de las nanopartículas como se describen en la
presente memoria.
Las nanopartículas de la invención también
pueden deshidratarse para una mayor estabilidad y mejor
almacenamiento. Los medios preferentes de deshidratación incluyen
el secado por congelación o liofilización, aunque pueden utilizarse
otros métodos. Opcionalmente, se incluye un lioprotector como
aditivo en las nanopartículas de la invención para mejorar la
estabilidad durante un proceso de liofilización. Tales aditivos
pueden servir adicionalmente para mejorar la rehidratación (o
redispersión) de las nanopartículas liofilizadas antes de su
uso.
Las nanopartículas que contienen el
fotosensibilizador son un vehículo para administrar los
fotosensibilizadores en aplicaciones conocidas en la técnica. Las
aplicaciones preferentes de la invención incluyen usos terapéuticos,
como la terapia fotodinámica (PDT) como se conoce en la técnica,
donde la selección y la activación del fotosensibilizador son
llevadas a cabo por la persona experta en combinación con el uso de
nanopartículas para administrar el fotosensibilizador.
Preferentemente, las nanopartículas se utilizan para administrar el
fotosensibilizador a un fluido que contiene suero o a un tejido de
un sujeto sometido a PDT.
Ejemplos de polímeros adecuados para la
formación de las nanopartículas de la invención incluyen un
copolímero u homopolímero farmacéuticamente aceptable de monómeros
seleccionados de entre el grupo que consiste en
L-láctido N ó S; D-láctido S;
D,L-láctido S; glicólido S; ó carbonato trimetileno.
Tales polímeros son comercializados por MEDISORB (marca registrada
de Medisorb Technologies Inc.) PURASORB (marca registrada de PURAC
Biochem) ó RESOMER (marca registrada de Boehringer Ingelheim,
Alemania). Los polímeros MEDISORB adecuados son aquellos de las
series L ó DL, como 100 L ó DL, ó 8515, 7525, 6535 ó 5050 DL; los
homopolímeros RESOMER para su uso en la invención son aquellos de
las series L, formados a partir de L láctido, como L 210 ó 214 ó L
210 S; las series R formadas a partir de
D,L-láctido racémico, como R 104, 202, 203, ó
206-208; las series G formadas a partir de
glicólido, como G 205; copolímeros de las series LR formados a
partir de L-láctido, como LR 706 ó 708; ó
DL-láctido con glicólido, como RG 502H ó 503H.
Donde se deseen otros modos de administración,
como la administración tópica, una persona experta puede seleccionar
fácilmente otros polímeros adecuados para la formación de
nanopartículas sin excesiva experimentación.
Un polímero que resulta adecuado para la
formación de nanopartículas de acuerdo con la invención es el
ftalato de acetato de polivinilo (PVAP),
poli(\varepsilon-caprolactona).
La Tabla 1 proporciona una lista de polímeros
que resultaron ser particularmente adecuados para la producción de
nanopartículas cargadas con un fotosensibilizador.
Los fotosensibilizadores útiles para la
invención son las porfirinas.
Ejemplos adicionales de fotosensiblizadores
útiles en la invención incluyen las porfirinas verdes descritas en
las patentes US n^{os} 5.283.255, 4.920.143, 4.883.790, 5.095.030,
y 5.171.749; y los derivados de porfirinas verdes, comentados en
las patentes US n^{os} 5.880.145 y 5.990.149. En las patentes
anteriormente citadas se muestran varias estructuras de porfirinas
verdes típicas, que también proporcionan detalles para la producción
de los compuestos. Otros fotosintetizadotes que pueden resultar
útiles en la invención son los derivados de la porfirina
Diels-Alder de fotosensibilización, descritos en la
patente US nº 5.308.608; compuestos similares a la porfirina,
descritos en las patentes US n^{os} 5.405.957, 5.512.675, y
5.726.304; derivados de la bacterioclorofila A, descritos en las
patentes US n^{os} 5.171.741 y 5.173.504. También pueden
utilizarse formas diméricas de la porfirina verde y formas
diméricas o multiméricas de las combinaciones porfirina
verde/porfirina. Pueden prepararse dímeros y compuestos
oligoméricos de la invención utilizando reacciones análogas a
aquellas para la dimerización y oligomerización de las porfirinas
per se. Las porfirinas verdes o uniones porfirina
verde/porfirina pueden realizarse directamente, o pueden acoplarse
porfirinas, seguido de una reacción Diels-Alder de
cada porfirina terminal o ambas porfirinas terminales para
convertirlas en las porfirinas verdes correspondientes. Por
supuesto pueden utilizarse combinaciones de dos o más
fotosensibilizadores en la práctica de la invención. Es preferible
que el espectro de absorción del fotosensibilizador se encuentre en
el rango visible, por lo general entre 350 nm y 1.200 nm, más
preferentemente entre 400-900 nm, e incluso más
preferentemente entre 600-900 nm.
Los fotosensibilizadores son las porfirinas
vedes derivado monoácido de la benzoporfirina
(BPD-MA), EA6 y B3 (patentes US 5.929.105 y
5.990.149, respectivamente). El BPD-MA, por ejemplo,
es lipófilo y un potente fotosensibilizador. El
BPD-MA es un candidato preferente para su uso en la
invención, pero también pueden utilizarse otros BPDs como el EA6
(también conocido como QLT 0074) y el B3, QLT 0069 u otros
derivados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las porfirinas verdes preferentes tienen la
estructura básica:
ó
donde R^{4} es vinilo ó
1-hidroxietilo y R^{1}, R^{2}, y R^{3} son H o
alquilo o alquilo sustituido, y n es un número entero entre 0 y 6,
preferentemente
2.
El BPD-MA tiene la estructuran
mostrada en la fórmula 1 en la que R^{1} y R^{2} son metilo,
R^{4} es vinilo y uno de los R^{3} es H y el otro es metilo.
EA6 tiene la fórmula 2 en la que R^{1} y R^{2} son metilo y
ambos R^{3} son 2-hidroxietilo (es decir, los
ésteres del etilenglicol). B3 tiene la fórmula 2 en la que R^{1}
es metilo, R^{2} es H, y ambos R^{3} son metilo. Tanto en EA6
como en B3, R^{4} es también vinilo.
Las representaciones de
BPD-MA_{C} y BPD-MA_{D}, que son
los componentes de la verteporfina, así como las ilustraciones de
las formas de anillo A y B de EA6 y B3, son como sigue:
También resultan útiles los compuestos
relacionados con las fórmulas 3 y 4; en general, R^{4} será vinilo
o 1-hidroxietilo y R^{1}, R^{2}, y R^{3} son
H ó alquilo ó alquilo sustituido.
Más adelante se muestran ejemplos adicionales de
compuestos hidrófobos de BPD de anillo B que resultan difíciles de
formular, y que son especialmente apropiados para utilizar en la
invención, donde los asteriscos indican posiciones de carbono
quiral.
Además, los fotosensibilizadores utilizados en
la invención pueden conjugarse con diversos ligandos para facilitar
el direccionamiento al tejido diana. Estos ligandos incluyen
aquellos que son específicos de receptor así como las
inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas. Los ligandos
preferentes incluyen anticuerpos en general y anticuerpos
monoclonales, así como fragmentos inmunológicamente reactivos de
ambos.
La presente invención se aplica con particular
ventaja en situaciones donde el fotosensibilizador es hidrófobo y
por lo tanto no se utiliza o se administra fácilmente en el
tratamiento PDT de los sujetos. Por supuesto, los
fotosensibilizadores de la invención pueden formularse en
nanopartículas para su administración como agente
fotosensibilizador único como una mezcla de más de un agente
fotosensibilizador.
Se conocen diversos métodos para preparar
nanopartículas cargadas con fármacos (véase, Allémann et al.
(1.993) Eur. J. Pharm Biopharm 39(5),
173-191). Resultan especialmente preferentes el
método de purificación salina y el método de emulsión.
La técnica de purificación salina desarrollada
por Bindschaedler, descrita en Bindschaedler et al. (1.998)
J. Pharm. Sci. 77(8):696-698, se adaptó
anteriormente para la preparación de nanosferas cargadas con
fármacos (véase Allémann, Tesis Doctoral, universidad de Ginebra,
1.993). La técnica implica la separación de un disolvente miscible
en agua de una solución acuosa mediante una purificación salina.
Las nanopartículas de la invención pueden
prepararse disolviendo primero el fármaco fotosensibilizador y el
polímero en tetrahidrofurano (THF) u otro disolvente orgánico en el
que los componentes sean solubles para formar una fase orgánica.
Dependiendo de la solubilidad del fármaco, otros disolventes que
podrían utilizarse incluyen, pero no se limitan al ácido acético,
diclorometano, cloroformo, N-metilpirrolidona,
acetona, éter, isopropanol, ter-butanol, etanol,
metanol, bencil alcohol, acetato de etilo y carbonato de porpileno.
La cantidad de fotosensibilizador añadida puede variarse entre
aproximadamente un 1 y un 20% (p/p) del peso total del polímero de
poliéster y fotosensibilizador combinados. Si se añade más de
aproximadamente un 20% en peso de fotosensibilizador, el porcentaje
de fotosensibilizador incorporado en las nanopartículas disminuye, y
el fármaco se desaprovecha. Preferentemente, la cantidad de
fotosensibilizador añadido se encuentra entre aproximadamente un 5
y aproximadamente un 15% y más preferentemente aproximadamente un
10% del peso del polímero de poliéster. Resulta más preferente una
cantidad de fotosensibilizador entre aproximadamente un 5 y
aproximadamente un 10% del peso del polímero.
A continuación se añade una solución acuosa
(fase acuosa) que contiene una sal soluble en agua como cloruro de
magnesio (como una forma de realización preferente) o acetato de
magnesio, y un polímero hidrófilo como el alcohol de polivinilo
(PVAL) a la fase orgánica descrita anteriormente. El PVAL actúa como
un coloide estabilizante. A continuación se emulsiona la mezcla
bajo agitación mecánica enérgica, por ejemplo, mediante agitación
magnética. Otras formas de agitador mecánico que podrían utilizarse
son un agitador de hélice, o un agitador equipado con una paleta, o
un agitador equipado con una hélice de cuatro brazos, u otro medio
de agitación conocido en la técnica. Resultan preferentes los PVALs
con un grado de hidrólisis superior al 70%, y preferentemente
superior al 85%. PVALs adecuados se comercializan bajo la marca
comercial MOWIOL® (Hoechst AG, Alemania). Otros polímeros
hidrófilos que podrían utilizarse como alternativa a los PVALs son
los poloxámeros, como el Poloxámero 407 (Pluronic F127) o el
Poloxámero 188 (Pluronic F68). La concentración de PVAL en la fase
acuosa se encuentra en el intervalo de aproximadamente
5-20%, y más preferentemente aproximadamente
10-15%. La sal soluble en agua se incluye para
facilitar la separación de la fase acuosa de la fase orgánica.
La invención incluye el descubrimiento de que
generalmente, una agitación mecánica más enérgica favorece la
producción de nanopartículas más pequeñas. Por ejemplo, a una
velocidad de agitación de 400 RPM, las nanopartículas formadas
tienden a ser mayores, en el intervalo de varios miles de nm de
diámetro. Aumentar la velocidad de agitación a 800 RPM o más, y
preferentemente hasta aproximadamente 1.800 RPM o más, tiende a
disminuir el tamaño de las nanopartículas formadas. La cantidad de
agitación mecánica a utilizar con cualquier dispositivo concreto
puede determinarse empíricamente midiendo el tamaño de las
nanopartículas producidas a una intensidad de agitación tras un
período de tiempo dado, y aumentando a continuación la intensidad o
la duración de la agitación hasta obtener el tamaño de partícula
deseado.
Se diluye la emulsión con un volumen suficiente
de agua para mejorar la difusión del THF en la fase acuosa,
induciendo la formación de nanopartículas. Las nanopartículas se
purifican eliminando el cloruro de magnesio y el THF residuales
mediante una filtración de flujo cruzado u otros medios conocidos en
la técnica.
En un protocolo típico, se disolvió un
fotosensibilizador, p. ej., BPD-MA ó QLT 0069 en
4,15 g de THF. A continuación se disolvió PLA (0,85 gm menos el
peso del fotosensibilizador utilizado) en el THF bajo agitación
magnética para producir 5 mg de una solución viscosa. Se añadieron
veinte gramos de una fase acuosa que contenía 3 gm de PVAL y 12 g
de MgCl_{2}.6H_{2}O bajo agitación magnética enérgica (2.000
rpm) a temperatura ambiente (véase la Tabla 2). Tras la inversión
de fase, se formó una emulsión de aceite en agua. Se agitó la
emulsión durante 15 minutos para permitir una buena
homogeneización. Posteriormente, se añadieron 40 gm de agua
destilada para inducir la difusión completa del THF en la fase
acuosa, llevando así a la formación de nanopartículas.
Las nanopartículas también pueden producirse
mediante una técnica de emulsificación-difusión,
como alternativa al proceso de purificación salina. Una fase
orgánica, como un PLGA y un fotosensibilizador disueltos en alcohol
de bencilo (u otro disolvente orgánico en el que el fármaco sea
soluble) se emulsiona con una fase acuosa, preferentemente
tamponada, que contenga polímeros hidrófilos como el PVAL mediante
agitación mecánica a 2.000 RPM durante 15 minutos. A continuación
se añade agua o un tampón a la emulsión resultante bajo agitación
para permitir la completa difusión del disolvente en el agua e
inducir la formación de nanopartículas. En la Tabla 3 se muestra
una fórmula típica para la preparación de nanopartículas mediante el
método de emulsificación-difusión.
Las nanopartículas producidas mediante los
métodos de purificación salina y emulsión-difusión
pueden esterilizarse mediante filtración a través de un filtro de
0,22 micrones, si se desea una preparación estéril. La invención
incluye los parámetros de proceso para producir nanopartículas de un
tamaño lo suficientemente pequeño para facilitar una esterilización
eficaz mediante filtración. Los parámetros incluyen el uso de una
velocidad de agitación desde 2.000 hasta 8.000 rpm; aumentar el
porcentaje de PVAL para que se encuentre por encima de un 10% p/p;
y aumentar el tiempo de agitación para que sea superior a 5 minutos.
De esta manera un conjunto inicial de parámetros de proceso a
utilizar es una velocidad de agitación de 2.000 rpm, un 15% de PVAL,
y un tiempo de agitación de 15 minutos utilizando una concentración
del 17% de polímero de poliéster. Los parámetros de proceso
adicionales para reducir el tamaño de las nanopartículas incluyen
disminuir la cantidad de polímero de poliéster para que se
encuentre por debajo del 25% (que es equivalente a disminuir la
viscosidad de la fase orgánica aumentando el disolvente); la
naturaleza del disolvente orgánico; la relación entre la fases
acuosa y la orgánica; la elección del polímero de poliéster, la peso
molecular del polímero de poliéster; y el pH de la fase acuosa.
Tras la producción, las nanopartículas pueden
liofilizarse para prolongar su durabilidad, y de esta manera la
durabilidad del fotosensibilizador cargado. Es preferible incluir un
lioprotector antes de la liofilización para ayudar a la
redispersión de las nanopartículas tras la liofilización. El
lioprotector también puede ayudar a mantener un tamaño pequeño tras
la liofilización. Preferentemente, se añade una cantidad de
lioprotector de manera que la relación de masa
lioprotector/nanopartícula se encuentre entre 0/1 y 2/1.
Lioprotectores adecuados incluyen, trehalosa, lactosa, glucosa y
manitol. La trehalosa es un lioprotector preferente.
Las nanopartículas cargadas con el
fotosensibilizador liofilizadas pueden reconstituirse con un volumen
de agua estéril que dé una concentración de fotosensibilizador en
el intervalo comprendido entre 1 y 2 mg/ml antes de administrase a
un sujeto o destinarse a otro uso.
Las nanopartículas cargadas con el
fotosensibilizador tienen preferentemente un diámetro medio inferior
a 220 nm, aunque pueden ser mayores si no se desea una filtración
estéril. Preferentemente, una preparación de nanopartículas tiene
un diámetro medio aproximadamente inferior a 200 nm, más
preferentemente entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 200
nm. El tamaño de las nanopartículas puede medirse mediante una serie
de medios conocidos en la técnica para medir partículas pequeñas,
que incluyen el uso de un equipo medidor de partículas
Nicomp^{TM} como se describe en el Ejemplo 4, o un equipo Coulter®
Nano-Sizer (Coulter Electronics, Harpenden,
Hertfordshire, RU).
Por lo general, la concentración de porfirina
verde en las nanopartículas depende de la naturaleza del
fotosensibilizador utilizado. Cuando se utiliza una porfirina
verde, como la verteporfina o la QLT 0069, la cantidad de
fotosensibilizador incorporado en la nanopartícula se encuentra
preferentemente entre aproximadamente un 1% en peso y
aproximadamente un 20% en peso, y más preferentemente entre
aproximadamente un 3% y aproximadamente un 13% en peso, e incluso
más preferentemente entre aproximadamente un 3 y aproximadamente un
10% en peso.
Las nanopartículas cargadas con un
fotosensibilizador de la invención tienen la propiedad inesperada de
liberar el fármaco de la nanopartícula rápidamente tras el contacto
con un suero o un suero diluido. Sin limitarse a ninguna teoría, se
cree que el fotosensibilizador se transfiere a las proteínas del
suero. Preferentemente, las nanopartículas liberan por lo menos un
50% del fotosensibilizador dentro de aproximadamente los 5 minutos,
y preferentemente dentro de los aproximadamente de uno a tres
minutos tras el contacto con el medio que contiene suero. El medio
que contiene suero puede ser un medio que contiene desde un 1 hasta
un 100% de seroalbúmina bovina (BSA) o suero humano o de otro
animal, o puede ser la sangre u otro fluido corporal de un ser
humano o de otro animal. El contacto con el medio que contiene
suero se da cuando las nanopartículas cargadas con el
fotosensibilizador se administran a un sujeto humano sometido a
terapia fotodinámica. De manera alternativa, el contacto puede
darse mediante la administración de nanopartículas a un fluido
corporal, como la sangre, extraída de un animal y devuelta
opcionalmente al animal como parte de un protocolo de tratamiento
PDT. La velocidad de liberación del fotosensibilizador de las
nanopartículas puede determinarse mediante un ensayo similar al
descrito en el Ejemplo 6.
Las nanopartículas cargadas con un
fotosensibilizador se formulan convencionalmente como unos polvos
liofilizados estériles que contienen trehalosa u otro lioprotector.
Un polvo típico contiene preferentemente una relación
lioprotector/nanopartícula en el intervalo comprendido entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5, preferentemente en el
intervalo comprendido entre aproximadamente 0,6 y 3,0, y más
preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente
0,8 y 2,0 en peso/peso. Un polvo liofilizado estéril que contiene
nanopartículas y un lioprotector opcional puede reconstituirse en
un medio acuoso para administrase a un ser humano o a otro animal.
El medio acuoso es preferentemente un medio estéril
farmacéuticamente aceptable, por ejemplo dextrosa al 5% o solución
salina normal. De manera alternativa, el medio puede ser agua para
inyección donde la cantidad de lioprotector u otro aditivo resulte
suficiente para dar el material reconstituido adecuado para su uso
terapéutico o farmacéutico.
- Las nanopartículas cargadas con un fotosensibilizador de la invención pueden formularse en una variedad de composiciones adicionales. Estas composiciones también pueden comprender unos componentes adicionales, como excipientes y vehículos de administración convencionales que incluyen agentes isotonizantes, reguladores del pH, disolventes, solubilizadores, tinciones, agentes gelificantes y espesantes y tampones y combinaciones de los mismos. Las dosificaciones y formulaciones apropiadas para la administración de fotosensibilizadores son conocidas en la técnica. Los excipientes adecuados para su uso con fotosensibilizadores incluyen agua, solución fisiológica, dextrosa, glicerol y similares.
La cantidad o concentración concreta de un
fotosensibilizador dado se ajusta de acuerdo con su potencia de
fotosensibilización. Por ejemplo, puede utilizarse
BPD-DA pero a una concentración aproximadamente
cinco veces mayor que la de BPD-MA. Los agentes
isotonizantes adecuados son preferentemente agentes isotonizantes no
iónicos como el glicerol, sorbitol, manitol, aminoetanol o
propilenglicol así como agentes isotonizantes iónicos como el
cloruro de sodio. Las soluciones de esta invención contendrán el
agente isotonizante, si está presente, en una cantidad suficiente
para producir la formulación de una solución aproximadamente
isotónica. Se tomará la expresión "una solución aproximadamente
isotónica" para referirse en este contexto a una solución con una
osmolaridad de aproximadamente 300 miliosmoles (mOsm),
convenientemente 300 + 10% mOsm. Debería tenerse en cuenta que
todos los componentes de la solución contribuyen a la osmolaridad.
El agente isotonizante no iónico, si está presente, se añade en las
cantidades habituales, es decir, preferentemente en cantidades de
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3,5 por ciento en peso,
preferentemente en cantidades de aproximadamente 1,5 a 3 por ciento
en peso. Los resúmenes de las composiciones farmacéuticas adecuadas
para su uso con fotosensibilizadores son conocidos en la técnica y
se encuentran, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical
Sciences.
Las nanopartículas cargadas con un
fotosensibilizador de la invención pueden administrarse
sistémicamente o localmente y pueden utilizarse solas o como
componentes de mezclas. La ruta de administración puede ser tópica,
intravenosa, oral, subcutánea, local (p. ej., en el ojo) o mediante
el uso de un implante. Por ejemplo los fotosensibilizadores
cargados con porfirinas verdes pueden administrarse por medios que
incluyen, las preparaciones tópicas, infusión o inyección
intravenosa, ingesta oral, o administración local en forma de
inyección intradérmica o un implante. Las rutas adicionales de
administración son inyecciones subcutáneas, intramusculares, o
intraperitoneales de formas convencionales o convenientes. Para la
administración tópica, las nanopartículas cargadas con
fotosensibilizador pueden encontrarse en composiciones y
formulaciones tópicas estándares que incluyen lociones,
suspensiones o pastas.
La dosis de los fotosensibilizadores puede ser
optimizada por la persona experta dependiendo de factores como el
fotosensibilizador elegido, la naturaleza del protocolo terapéutico,
el propio sujeto, y el criterio del médico experto. Las cantidades
preferentes de los fotosensibilizadores son aquellas que resulten
clínicamente o terapéuticamente efectivas en el método de
tratamiento que se esté utilizando. Tales cantidades son denominadas
en la presente memoria "cantidades efectivas".
Hay que reseñar que los diversos parámetros
utilizados para la PDT efectiva en la invención están
interrelacionados. Por tanto, la dosis también debería ajustarse
con respecto a otros parámetros, por ejemplo, la fluencia,
irradiancia, duración de la luz utilizada en el PDT, y el intervalo
de tiempo entre la administración de la dosis y la radiación
terapéutica. Con los fotosensibilizadores, por ejemplo, la forma de
administración, como cuando se ha acoplado a un ligando específico
de diana, como un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo
del mismo, es un factor considerado por un experto.
Dependiendo de las necesidades del sujeto y de
las restricciones del método de tratamiento que se esté utilizando,
pueden necesitarse dosis de fotosensibilizador menores o mayores.
Para composiciones que sean altamente específicas de las células y
tejidos cutáneos diana, como aquellas con el fotosensibilizador
conjugado con una preparación de anticuerpos monoclonales altamente
específicos o un ligando específico para el receptor, se sugieren
dosificaciones en el intervalo comprendido entre
0,005-10 mg/kg de peso corporal. Para composiciones,
que sean menos específicas para la diana, pueden resultar deseables
dosificaciones mayores, de hasta 1-10 mg/kg. El
intervalo preferente para su uso en ratones está comprendido entre
los 0,05 mg/kg y los 10 mg/kg. El intervalo útil en seres humanos
para el fotosensibilizador será generalmente menor que el de los
ratones, como desde 0,005 mg/kg hasta 2 mg/kg. Los intervalos
anteriores son una mera sugerencia en lo referente a que el número
de variables con respecto a un régimen de tratamiento individual es
grande y pueden esperarse desviaciones considerables de estos
valores. El experto es libre de variar las concentraciones
anteriores de manera que los parámetros de estimulación/restauración
y absorción estén en conformidad con los objetivos terapéuticos
descritos anteriormente.
Además de los sujetos humanos, la presente
invención puede aplicarse a animales no humanos, como los mamíferos,
especialmente aquellos importantes en aplicaciones agrícolas (como
ganado, ovejas, caballos y otros "animales de granja", pero
sin limitarse a ellos), aplicaciones industriales (como los animales
utilizados para generar moléculas bioactivas como parte de las
industrias farmacéutica y biotecnológica), y a los animales de
compañía (como perros y gatos).
Cada fotosensibilizador requiere activarse con
una radiación de longitud de onda apropiada. Como tal, los métodos
de la invención pueden llevarse a cabo con cualquier radiación,
preferentemente en el intervalo de la luz visible, que activa el
fotosensibilizador utilizado. Preferentemente, la radiación contiene
una o más longitudes de onda capaces de penetrar la piel para
activar el fotosensibilizador utilizado. La(s)
longitud(es) de onda de la radiación o luz útil en la
invención depende del intervalo de activación del fotosensibilizador
utilizado como parte del método de tratamiento. Resultan
preferentes longitudes de onda de aproximadamente
380-900 nanómetros (nm), dependiendo del
fotosensibilizador y de la profundidad de penetración en el tejido
deseada. Resultan más preferentes longitudes de onda desde
aproximadamente 400 hasta aproximadamente 900 nm, más preferentes
desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 700 nm. Por ejemplo,
el BPD-MA, un derivado de la porfirina verde, puede
activarse mediante la luz roja y la azul así como luz ambiental que
contenga longitudes de onda desde 400-900 nm. La
luz con una longitud de onda más corta que 400 nm resulta aceptable,
pero no preferente debido a los efectos potencialmente dañinos de
la luz UVA.
Puede utilizarse una fuente de luz apropiada,
preferentemente un láser o diodo láser, en el intervalo comprendido
entre aproximadamente 550 y aproximadamente 900 nm, dependiendo del
espectro de absorción del fotosensibilizador, para la activación
del fotosensibilizador. Una longitud de onda apropiada y preferente
para un láser de este tipo incluye 690 \pm 12,5 nm a media altura
cuando se utilizan porfirinas verdes BPDs. La dosis de luz
administrada durante el tratamiento PDT contemplada en la presente
memoria puede variar, y puede estar entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 200 J/cm^{2}. La dosis de luz se elige dependiendo
de la potencia del fotosensibilizador, la dosificación del
fotosensibilizador y la finalidad del tratamiento fotodinámico.
Cuando se está llevando a cabo el PDT para extirpar un tejido
canceroso, entonces resultan generalmente deseables dosis de
radiación más altas, en el intervalo comprendido entre
100-250 J/cm^{2} y algunas veces incluso mayores.
Cuando el PDT se lleva a cabo para modular una respuesta inmune,
más que matar el tejido diana, es preferible que la radiación se dé
a una dosis menor para reducir los efectos colaterales no deseados a
la vez que se sigue activando el fotosensibilizador. La dosis de
radiación utilizada (denominada "PDT a dosis baja") es
preferentemente de una intensidad menor que la utilizada para el
tratamiento oncogénico. Un intervalo preferente se encuentra
comprendido entre 0,1 y 20 J/cm^{2}.
Cuando el PDT se lleva a cabo para tratar una
neovasculatura (coroidea) en el ojo (como la asociada a la AMD), se
utilizan generalmente dosis de luz intermedias, en el intervalo
comprendido entre 20 y 100 J/cm^{2}. Por ejemplo, la dosificación
de luz recomendada por Visudyne® utilizada en el tratamiento de la
AMD es de 50 J/cm^{2}. Los aumentos de la radiación pueden
disminuir los tiempos de exposición. Generalmente, una dosis mayor
de fotosensibilizador disminuirá la dosis de luz requerida para
ejercer un efecto terapéutico.
El tiempo de la radiación de luz tras la
administración del fotosensibilizador puede resultar importante como
una manera de maximizar la selectividad del tratamiento, y
minimizar así el daño a estructuras diferentes de las células
tumorales diana. En general debería utilizarse el tratamiento de luz
dentro de las tres horas, y más preferentemente dentro de una hora
tras la administración del fotosensibilizador.
Se dan los siguientes ejemplos:
Ejemplo
1
Materiales: Las nanopartículas mostradas en los
ejemplos más adelante se produjeron utilizando tres tipos de
poliésteres todos ellos con diversos pesos moleculares obtenidos de
Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Alemania):
- i)
- 50:50 PLGA (RG502 y RG502H (pesos moleculares (Pm) = 12.000) y RG504H (Pm=48.000));
- ii)
- 75:25 PLGA (RG752 (Pm=12.000), RG755 (Pm=63.000), y RG756 (Pm=98.000)) y
- iii)
- PLA puro (R104 (Pm=2.000), R202 y R202H (Pm=16.000) y R203 (Pm=28.000)).
También pueden utilizarse poliésteres
adicionales, mostrados en la Tabla 1.
Se seleccionaron alcohol de (poli)vinilo
(PVAL) hidrolizado al 87,7% con un Pm de 26.000 (Mowiol®
4-88) e hidrolizado al 82,6% con un Pm de 18.000
(Mowiol® 3-83) (Hoechst, Frankfurt/Main, Alemania)
como coloide estabilizante. Se utilizó cloruro de magnesio
hexahidrato (MgCl_{2}.6H_{2}O) (Fluka Biochemika, Buchs, Suiza)
como agente de purificación salina. Se utilizaron tetrahidrofurano
(THF) (Merck, Darmstadt, Alemania) y acetona (Fluka Biochemika,
Buchs, Suiza) como disolventes orgánicos miscibles en agua. Estos
disolventes se eligieron en base a un trabajo anterior (Ibrahim
et al., 1.992; Allémann et al., 1.992) y las
propiedades farmacéuticas con respecto a la toxicidad (Witschi
et al., 1.997). Se utilizaron D(+)-trehalosa
dihidrato (Sigma, St. Louis, MO, EEUU), lactosa monohidrato
(Hänseler AG, Herisau, Suiza), D(-)-manitol
(Riedel-de Haën®, Seelze, Alemania) y
D(+)-glucosa anhidra (Fluka Biochemika, Buchs,
Suiza) como lioprotectores. Todos los demás productos químicos
fueron de grado analítico y se utilizaron como tales sin una
purificación adicional.
Métodos: Se investigó la posibilidad de producir
nanopartículas muy pequeñas utilizando el proceso de purificación
salina. Primero se eligieron los parámetros de acuerdo con un
trabajo anterior (Ibrahim et al., 1.992; Allémann et
al., 1.992; Allémann et al., 1.993a) y a continuación se
variaron para investigar la influencia en el tamaño medio de las
partículas. Por lo general, se añadieron 5 g de una solución
orgánica que contenía cantidades variables de PLGA o PLA y un
fotosensibilizador bajo agitación mecánica a 20 g de una fase acuosa
que contenía PVAL, un agente de purificación salina al 60% (p/p)
(MgCl_{2}.6H_{2}O). Tras la formación de una emulsión de aceite
en agua a temperatura ambiente, se añadieron 60 ml de agua pura para
inducir la difusión completa del disolvente en la fase acuosa,
llevando así a la formación de nanopartículas. Puesto que la
efectividad del proceso de filtración estéril resulta también
influenciado por la carga microbiana de la suspensión de
nanopartículas a filtrar, se utilizó rutinariamente agua filtrada a
través de un filtro de membrana de 0,1 \mum (Millipore®, MilliQ
Academic, Suiza) para la preparación y la purificación de las
nanopartículas.
Para obtener las condiciones para la preparación
de nanopartículas por debajo de 200 nm, primero se llevaron a cabo
investigaciones preliminares utilizando una solución de THF que
contenía un 17% (p/p) de RG755 como fase orgánica. Se evaluó el
tamaño de las partículas como función de: a) la velocidad de
agitación (2.000-13.500 rpm); b) el tiempo de
agitación de la emulsificación (5-50 min); c) el
peso molecular del PVAL (18.000-26.000 Da); y el
porcentaje de PVAL (10-15% (p/p)). También se varió
el porcentaje de polímero (10-17% (p/p)).
La purificación de las dispersiones de
nanopartículas se realizó mediante filtración de flujo cruzado. Se
purificaron las dispersiones de nanopartículas crudas mediante
filtración de flujo cruzado utilizando un mini dispositivo
Sartocon® equipado con una membrana de ultrafiltración con un "cut
off" de la membrana de 300.000 Da (Sartorius, Goettingen,
Alemania) para eliminar los aditivos solubles (THF, MgCl_{2} y
PVAL). Se llevó a cabo la filtración añadiendo volúmenes de agua
que se recogieron como fracciones de filtración. La cantidad de
PVAL eliminado en cada fracción de filtración se determinó mediante
un método colorimétrico.
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Ejemplo
2
Los intentos iniciales de incorporar
fotosensibilizadores en las nanopartículas de poliéster
proporcionaron nanopartículas demasiado grandes para la filtración
estéril, en el intervalo comprendido entre 300 y 500 nm, o incluso
mayores si se utilizaban velocidades de agitación en el intervalo
comprendido entre 400-800 rpm para homogeneizar las
fases orgánica y acuosa durante la formación de las nanopartículas.
Se llevaron a cabo diversos experimentos en un intento de
identificar las condiciones que producían nanopartículas con un
diámetro medio inferior a 200 nm. Se variaron los siguientes
parámetros para la preparación de las nanopartículas utilizando el
proceso de purificación salina como se indica más adelante, para
obtener nanopartículas por debajo de 200 nm.
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Se utilizaron los siguientes parámetros para el
procedimiento de emulsión.
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Los parámetros de proceso que disminuían el
tamaño medio de las partículas de 300 nm a nanopartículas por
debajo de 200 nm son:
Velocidad de agitación: Un aumento de la
velocidad de agitación de 2.000 a 8.000 rpm llevó a una disminución
del tamaño de las nanopartículas R202 de 270 nm a 150 nm.
Porcentaje de PVAL: A una velocidad de agitación
de 2.000 rpm, cuando se aumentó el porcentaje de PVAL
progresivamente de un 10 a un 15% (p/p), el tamaño medio de las
nanopartículas se redujo de 275 a 148 nm.
Tiempo de agitación: aumentar el tiempo de
agitación durante la emulsificación de 5 a 15 min resultó en la
reducción del tamaño de las nanopartículas RG755 de 198 a 148
nm.
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Con los siguientes parámetros de velocidad de
agitación 2.000 rpm, duración de la emulsificación 15 min,
concentración de PVAL 15% y concentración del polímero 17% como
punto de inicio, los parámetros de proceso adicionales que influían
en el tamaño de las partículas se identificaron como:
Porcentaje del polímero: Disminuir el porcentaje
de polímero en la fase orgánica (o disminuir la viscosidad de la
fase orgánica) de un 25% a un 10% (p/p) llevó a una disminución del
50% del tamaño medio de las partículas (de 300 a 150 nm).
Naturaleza del disolvente orgánico: se
obtuvieron nanopartículas RG504H con un tamaño medio de 210 nm
cuando se utilizó acetona como disolvente, mientras que puedo
conseguirse un tamaño medio de 154 nm con THF.
Relación fase acuosa/orgánica: Un aumento de la
relación entre la fase acuosa/orgánica de 1,5/1 a 4/1 posibilitó la
producción de nanopartículas por debajo de 200 nm.
Propiedades del polímero (composición, peso
molecular): pudieron producirse nanopartículas RG504H por debajo de
200 nm con un tamaño medio de 154 nm, mientras que utilizando los
mismos parámetros de proceso, se obtuvieron partículas mayores con
el polímero RG504. Con respecto a los polímeros de caprolactona, el
tamaño medio de las partículas aumenta de 143 a 290 nm al aumentar
el peso molecular del polímero de 13.000 a 80.000 Da.
Naturaleza de la fase acuosa (influencia del pH
de la fase acuosa): El pH de la fase acuosa (p. ej., utilizando
tampón tris maleato (pH 8,5) como fase externa, resultó posible la
preparación de nanopartículas cargadas con QLT 0069 con un tamaño
de partícula de 120 nm mientras que con agua destilada pura como
fase externa, el tamaño final fue de por lo menos 500 nm.
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Ejemplo
3
Se prepararon nanopartículas que contenían
verteporfina de acuerdo con el protocolo que se presenta a
continuación, y se analizó su tamaño y contenido de fármaco.
Ejemplo
4
Se determinó la retención del fármaco haciendo
pasar las formulaciones a través de filtros Millex GV de 0,22
micrones y se midió la concentración de benzoporfirina mediante
espectrofotometría antes y después de la filtración. A continuación
se almacenaron las formulaciones durante un período seleccionado a
2-8ºC y se analizó la concentración de
benzoporfirina antes y después de la filtración de 0,22
micrones.
Se midió el tamaño de las partículas utilizando
la espectrometría de correlación de fotones utilizando un equipo
Coulter® Nano-Sizer^{TM} (Coulter Electronics
Harpenden, Hertfordshire, RU), o un medidor de partículas Nicomp
380. El índice de polidispersión (PI) es un indicio de la
distribución de tamaño con valores que van de 0 a 9. Las mediciones
se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se confirmó la precisión
del espectrómetro de correlación de fotones utilizando partículas
estándares de látex uniformes de poliestireno (204 \pm 6 nm)
(Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA, EEUU). Cada valor es la media
de tres mediciones. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la redispersabilidad, se
resuspendieron 2 mg de nanopartículas liofilizadas en 1 ml de agua
destilada bajo agitación manual durante 30 s y se midió el tamaño
de las partículas. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Primero se llevó a cabo el estudio de viabilidad
de filtración estéril con una evaluación cualitativa de sistemas de
filtros de membrana diferentes. Se sometieron a ensayo tres
sistemas, Millex®-FG50 (membrana hidrófoba de
politetrafluoroetileno), Swinnex®47 (membrana Durapore hidrófila
(GVWP04700)), Steriflip® (membrana de polietersulfona Express)
(Millipore®, Volketswil, Suiza). Para evitar la posible obstrucción
del dispositivo de filtración, primero se prefiltró la suspensión
de nanopartículas que contenían un lioprotector a través de una
membrana con un tamaño de poro de 0,45 \mum antes del proceso de
filtración de esterilización. A continuación, se filtró la muestra
prefiltrada a través de la unidad de filtros de esterilización
apropiada. Después, se vertieron 40 ml de suspensión estéril en
viales de vidrio estériles de 100 ml pesados previamente bajo una
campana de flujo de aire laminar. Para preservar las partículas de
la contaminación durante el proceso de liofilización, se cubrieron
los viales con unos filtros de membrana estériles de 0.22 \mum
(Durapore hidrófobo, tipo GVHP, Millipore®, Volketswil, Suiza). Se
congelaron las suspensiones estériles y se liofilizaron como se
describe más adelante.
Para determinar si la membrana había retenido
cantidades significativas de nanopartículas, se liofilizaron
alícuotas de las dispersiones de nanopartículas tomadas antes y
después de la filtración. También se examinó la distribución de
tamaño de las partículas antes y después de la filtración.
Se llevó a cabo el ensayo de esterilidad en las
nanopartículas liofilizadas, siguiendo las directrices de la
Farmacopea Europea (adenda 1.999). Se eligió como método de ensayo
la filtración por membrana seguida de la incubación de la membrana
en un medio de cultivo. Por lo general, se hicieron pasar 50 mg de
nanopartículas secas dispersadas en 100 ml de agua estéril a través
de un filtro de membrana de 0,22 micrones (47 mm de diámetro). A
continuación, se retiró asépticamente la membrana del soporte.
Después de lavarla con tres partes de solución de peptona estéril,
cada mitad de la membrana se sumergió en unos tubos que contenían un
medio apropiado. Se utilizó como medio aerobio o anaerobio caldo
tioglicolato con resazurina (BioMerieux®, Marcy, Francia) para la
detección de bacterias (excepto Bacillus subtilis, que crece
en caldo tripticasa-soja) y se utilizó caldo
tripticasa-soja como medio para la detección de
levaduras y hongos. Se utilizaron membranas no estériles como
controles positivos. Se incubaron los tubos durante 14 días a 32,5
\pm 2,5ºC (medio tioglicolato con resazurina) ó a 22,5 \pm
2,5ºC (medio tripticasa). A continuación se observó la turbidez de
los medios durante un período básico de 14 días en comparación a
los controles positivos. El experimento se realizó dos veces.
Se llevó a cabo el ensayo de esterilidad
utilizando las mismas condiciones tal como se ha descrito
anteriormente. Se eligieron varias categorías de microorganismos
para este ensayo: Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
Bacillus subtilis (ATCC 6633) y Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 9027) como bacterias aerobias, Clostridium sporogenes
(ATCC 11437) como bacteria anaerobia y Candida albicans (ATCC
10231) y Aspergillus niger (ATCC 16404) como levaduras y
hongos, respectivamente. Se prepararon cultivos diluidos de cada
bacteria y hongo a partir de las cepas para obtener una
concentración final de microorganismos inferior a 100 ufc/ml. Tras
la filtración de las suspensiones de nanopartículas en las mismas
condiciones utilizadas para el ensayo de esterilidad, se inoculó el
lavado final con 1 ml de solución con microorganismos. Se incubaron
las muestras como se ha descrito anteriormente durante
7 días.
7 días.
Ninguno de los lotes de nanopartículas sometidos
a ensayo mostró un crecimiento visible de microorganismos,
contrariamente a los controles positivos para los que se observó
sistemáticamente un aumento sustancial de la turbidez (datos no
mostrados). Estas observaciones sugerían que se habían obtenido
formulaciones finales de nanopartículas estériles.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prepararon diversos lotes de nanopartículas
cargadas con verteporfina con un contenido inicial de verteporfina
del 10%. Se liofilizaron las suspensiones de nanopartículas en
presencia de trehalosa tras la filtración estéril. Para comprobar
la reproductibilidad del procedimiento, se prepararon los lotes por
duplicado bajo las mismas condiciones. Para evaluar el efecto de
cantidades diferentes de trehalosa en el tamaño de las
nanopartículas cargadas con verteporfina, se dividió cada lote en
dos alícuotas. Independientemente de la relación
trehalosa/nanopartícula, se obtuvo la completa redispersión tras el
liofilización, y el tamaño de las partículas se mantuvo por debajo
de los 200 nm. La carga de fármaco fue del 6,7 al 8,8% (p/p) con
polímeros diferentes, con una eficacia de atrapamiento que llegaba
al 91% con las nanopartículas PLA. Los resultados se muestran en la
Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la concentración de verteporfina
disolviendo una cantidad pesada con precisión de nanopartículas en
5 ml de THF. Su agitó la solución durante 1 h a temperatura
ambiente, y se determinó la concentración de verteporfina
espectrofotométricamente a 691 nm. Se utilizaron soluciones de
verteporfina de concentración conocida para generar una curva de
calibración. La carga de fármaco se define como:
Carga de fármaco (%)=(cantidad de
fármaco en las nanopartículas/cantidad de nanopartículas) X
100.
La eficacia de atrapamiento del fármaco
representa la proporción de la cantidad inicial de fármaco, que se
ha incorporado a las nanopartículas. Se define como:
Eficacia de atrapamiento (%) =
(porcentaje de carga de fármaco/porcentaje de contenido inicial de
fármaco) X
100.
Ejemplo
6
Este ejemplo demuestra que las nanopartículas
cargadas con verteporfina (BPD-MA) se libera de las
nanopartículas a los segundos de entrar en contacto con las
proteínas del suero. El ensayo se basa en la extinción de la
fluorescencia de la verteporfina causada por la gran compresión en
la formulación de las nanopartículas. La adición de suero resulta
en una transferencia de la verteporfina desde la formulación de
nanopartículas a las proteínas del plasma, acompañada de un aumento
de la fluorescencia. La velocidad de transferencia es de
significación biológica porque el fármaco retenido por la
formulación no se encuentra fácilmente disponible para las células
diana y los tejidos y es menos probable que resulte
fotodinámicamente activo dentro de la formulación.
Pudo alcanzarse un aumento adicional de la
fluorescencia de la verteporfina en este sistema de ensayo añadiendo
Triton X-100, lo que resultó en una monomerización
adicional de la verteporfina, y su disociación de los sitios de
unión. Con la adición de Triton, la fluorescencia de la verteporfina
en la mezcla experimental resulta máxima y puede utilizarse como
punto de referencia para la determinación de la magnitud de la
transferencia de verteporfina desde la formulación a las proteínas
del plasma.
Se preparó una muestra de 100 \muM
(concentración de verteporfina) diluyendo la muestra madre de
nanopartículas de verteporfina con una solución de dextrosa al 5%
(5DW). Se excitó la fluorescencia con 440 nm y se recogió a 694 nm.
Se mantuvieron las muestras a 37ºC. Se liberaron los obturadores de
emisión y excitación y se inició la traza de base temporal (T = 0
s). Después de 60 s, se inyectaron 0,2 mL de suero fetal bovino
(FSB) con una jeringa de vidrio Hamilton a través de un septo en la
cubierta de la tapa del espectrómetro. Después de 180 s
adicionales, se inyectaron 0,02 mL de Triton X-100
al 10% v/v (en 5DW) en la cubeta. Las concentraciones finales de
FBS y Triton X-100 fueron apro-
ximadamente 5% v/v y 0,05% v/v, respectivamente. Se recogieron las lecturas de fluorescencia durante otros 180 s.
ximadamente 5% v/v y 0,05% v/v, respectivamente. Se recogieron las lecturas de fluorescencia durante otros 180 s.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Durante los primeros 60 s de cada ensayo, se
redujo la fluorescencia de la verteporfina dentro de la formulación
de nanopartículas, debido a una auto extinción de la formulación
fotosensibilizadora. Tras la inyección del FSB, se elevó la
fluorescencia y alcanzó una meseta. El tiempo requerido para
alcanzar la meseta, y la magnitud de la fluorescencia observada en
la meseta en comparación con la fluorescencia del fármaco en la
solución de Triton, da un indicio de la velocidad y eficacia de la
transferencia del fármaco a las proteínas del suero. La
verteporfina formulada en las nanopartículas mostró una
transferencia rápida (Figura 2). Se obtuvo un valor medio de esta
señal de florescencia equilibrada, marcada FFBS, promediando los
valores de fluorescencia de t = 150 a 220 s. Tras la inyección de
Triton X-100, la señal de fluorescencia se elevó más
y finalmente alcanzó una meseta. Se obtuvo un valor medio de esta
nueva señal de fluorescencia equilibrada, marcada FTX, promediando
los valores de fluorescencia de t = 300 a 420 s. La relación
FFBS/FTX dio un indicio de la eficacia con la que la verteporfina
era transferida a las proteínas del suero desde la formulación
lipídica. El valor medio de FFBS/FTX (promedio de n = 2 pruebas)
fue 0,76 (Figura 2). Estos valores
sugerirían que la mayoría de la verteporfina era trasferida rápidamente a las proteínas del suero dentro de los 150 seg.
sugerirían que la mayoría de la verteporfina era trasferida rápidamente a las proteínas del suero dentro de los 150 seg.
Ejemplo
7
Se diluyeron formulaciones de fármacos con
dextrosa al 5% a 174 \muM (verteporfina) y se inyectaron
intravenosamente en ratones hembra SKH1 a 1,4 \muM/kg (activo).
Tras las inyecciones, a continuación se mantuvo a los ratones en la
oscuridad o con iluminación suave.
Se monitorizó la absorción mediante
fluorescencia cutánea utilizando un espectrofotómetro de
fluorescencia de tejidos no invasiva de Princeton Instruments
equipado con una sonda de fluorescencia de 5 mm de diámetro
conectada a un dispositivo detector de carga acoplada enfriado con
nitrógeno líquido (LN/CCD) con espectrógrafo. Se llevó a cabo la
excitación con un Iluminador de Fibra Óptica Oriel equipado con un
filtro pasa banda de 440 nm durante 5 seg. Se recogió la
fluorescencia de la piel del ratón sobre su músculo femoral de la
pierna derecha. Se normalizaron las señales de fluorescencia a
señales a 650 nm donde se esperaba que la fluorescencia del fármaco
fuese mínima.
Los resultados se muestran en la Figura 3. La
fluorescencia de la verteporfina aumentó inmediatamente tras la IV
administración y a continuación disminuyó rápidamente durante las
siguientes 24 hrs. La eliminación rápida de la piel resulta
deseable en un ámbito clínico.
Ejemplo
8
Se diluyeron formulaciones de nanopartículas
cargadas con el fotosensibilizador con dextrosa al 5% a 174 \muM
(verteporfina) y se inyectaron intravenosamente en ratones macho
DBA/2 con tumor M1 a una dosis de 1,4 \mumol/kg. A continuación
se expuso el sitio del tumor a una luz de 690 nm a 50 J/cm^{2}
durante 9 min y 20 s a los 15, 30 ó 60 min postinyección. Se
monitorizó a los ratones durante 20 días en busca de indicios de una
curación o control del tumor.
En el estudio se utilizaron un láser de ión
argón de Spectra Physics serie 2.000 y un láser de colorante
Coherent modelo 599. La longitud de onda de salida del láser se
puso a 690 \pm 3 nm (FWHM < 1 nm). Se situó la lente de fibra
óptica con microlente para iluminar un área de 1 cm de diámetro y se
puso la potencia de salida de la fibra óptica a 70 \pm 6 mW (90
mW/cm^{2} en la zona diana). El tiempo de exposición fue de 9 min
20 s, lo que envió una dosis de luz de 50 J/cm^{2}. Se evaluó la
actividad antitumoral de la verteporfina formulada en una
formulación de nanopartículas PLGA (YK000814RG755A) en ratones DBA/2
utilizando un modelo tumoral M1. La Tabla 7 muestra los resultados
del bioensayo de tumor de los ratones macho DBA/2 a los que se
había administrado intravenosamente 1,4 \mumol/kg activo y
expuesto a 690 nm de luz a 50 J/cm^{2} durante 9 min y 20 s. Los
tiempos de radiación temprana a los 15 y 30 min habían mejorado el
control del tumor en comparación con la radiación a los 60 min.
Ejemplo
9
Se inyectaron a ratones hembra SKH1
intravenosamente (IV) 1,4 \mumol/kg de nanopartículas cargadas con
verteporfina (lote YK000814RG755A). A continuación se inmovilizó a
los animales con una inyección intraperitoneal de Ketamina (50 -
100 mg/kg)/Valium (5 mg/kg) y se colocaron inmediatamente en una
cama en suspensión, cubierta con papel de aluminio y exponiendo un
círculo de 1 cm sobre el flaco derecho o izquierdo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En los instantes de tiempo postinyección de 15 y
60 min, se expuso el área circular de 1 cm en el flanco a un
simulador solar (dosis de luz 60 J/cm^{2}) durante 10 min por
flanco. Se puntuó la superficie expuesta utilizando los parámetros
descritos en la Tabla 8, en los días 1 y 3 tras la exposición de
luz. Las puntuaciones se basaron en la formación de eritema,
escaras y edemas. Después de la puntuación del día 3, se sometió a
los ratones a eutanasia.
Los ratones hembra SKH-1
mostraron niveles bajos de fotosensibilidad cutánea tras ser
inyectados intravenosamente con 1,4 \mumol/kg de nanopartículas
con verteporfina YK00814RG755A y expuestos a la luz de un simulador
solar durante 10 min. La fotosensibilidad cutánea que surgía de la
exposición al simulador solar fue mayor en los instantes de tiempo
tempranos sometidos a ensayo (15 min) y disminuyó con el tiempo tras
la inyección (Figura 4). Los signos de eritemas, escaras y edemas
habían disminuido para el día 3 lo que confirmaba la eliminación
rápida de la verteporfina administrada en las nanopartículas. La
eliminación rápida del fotosensibilizador resulta deseable en el
ámbito clínico.
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Claims (30)
1. Nanopartícula cargada con un
fotosensibilizador que comprende una o más porfirinas verdes y uno o
más polímeros de poliéster, en la que las nanopartículas son un
vehículo de administración de liberación rápida del
fotosensibilizador en un medio que contiene suero.
2. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que dicha una o más porfirinas verdes se selecciona de entre
BPD-MA, QLT 0074 ó QLT 0069.
3. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 2,
en la que los polímeros se seleccionan de entre el copolímero de
D,L-láctido y glicólido y el polímero de
D,L-láctido.
4. Nanopartícula según la reivindicación 1 ó 2,
en la que los polímeros son copolímero de
D,L-láctido y glicólido.
5. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, con un diámetro medio inferior
a aproximadamente 200 nm.
6. Nanopartícula según la reivindicación 5, con
un diámetro medio de entre 100 y 200 nm.
7. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente
un lioprotector.
8. Nanopartícula según la reivindicación 7, en
la que el lioprotector es trehalosa.
9. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en forma liofilizada.
10. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la que las porfirinas
verdes comprenden desde aproximadamente un 1% hasta aproximadamente
un 20% en peso de la nanopartícula.
11. Nanopartícula según la reivindicación 10, en
la que las porfirinas verdes comprenden desde aproximadamente un 5
hasta aproximadamente un 10% en peso de la nanopartícula.
12. Método para preparar nanopartículas cargadas
con una porfirina verde, que comprende:
- (a)
- disolver una porfirina verde y uno o más polímeros de poliéster en un disolvente orgánico para formar una fase orgánica;
- (b)
- combinar la fase orgánica con una fase acuosa que contenga agua, un coloide estabilizante y una sal;
- (c)
- someter la mezcla a agitación mecánica enérgica para producir nanopartículas, en la que dicha agitación mecánica se realiza a 800 RPM o más; y
- (d)
- aislar las nanopartículas resultantes.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
dicho polímero de poliéster es copolímero de
D,L-láctido y glicólido y/o polímero de
D,L-láctido.
14. Método según la reivindicación 12, en el que
dicho polímero de poliéster es copolímero de
D,L-láctido y glicólido.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, en el que dicho disolvente
orgánico es THF.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, en el que dicho coloide
estabilizante es PVAL.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, en el que dicha agitación
mecánica enérgica se da a más de 2.000 rpm.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, en el que dicho aislamiento
se da mediante filtración de flujo cruzado.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, que comprende adicionalmente
la filtración estéril de las nanopartículas.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, que comprende adicionalmente
la liofilización de las nanopartículas.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
se añade un lioprotector antes de la liofilización.
22. Nanopartícula según la reivindicación 1, en
la que el medio que contiene suero es un fluido corporal de un
animal.
23. Nanopartícula según la reivindicación 22, en
la que el medio que contiene suero es sangre humana.
24. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 22-23, con un tamaño medio de
partícula menor que aproximadamente 200 nm de diámetro.
25. Nanopartícula según la reivindicación 24, en
la que el tamaño medio de partícula se encuentra entre
aproximadamente 100 nm y 200 nm de diámetro.
26. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1-11 ó 22-25 para
su uso en una terapia fotodinámica.
27. Nanopartícula según la reivindicación 26, en
la que dicha terapia fotodinámica se da en un ser humano aquejado
de un tumor o una neovasculatura no deseada.
28. Composición farmacéutica que comprende la
nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones
1-11 ó 22-25 y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
29. Uso de una nanopartícula según cualquiera de
las reivindicaciones 1-11 ó 22-25
para preparar una composición farmacéutica para su uso en una
terapia fotodinámica.
30. Uso de la reivindicación 29, en la que dicha
terapia fotodinámica se da en un ser humano aquejado de un tumor o
una neovasculatura no deseada.
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