ES2341886T3 - Transcripcion y traduccion in vitro libre de celulas de proteinas de membrana en capas lipidicas planas unidas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas de: (i) proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie, (ii) aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y (iii) expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana.
Description
Transcripción y traducción in vitro libre
de células de proteínas de membrana en capas lipídicas planas
unidas.
La presente invención se refiere a membranas, en
particular a membranas sintéticas, que tienen proteínas de membrana
incorporadas en ellas, y, en particular, a la transcripción y
traducción in vitro libre de células de proteínas de membrana
en membranas, por ejemplo en capas lipídicas planas unidas. En
particular, la presente invención proporciona un nuevo método para
la preparación de tales membranas. Las membranas se pueden usar, por
ejemplo, para la investigación de interacciones de receptor de
membrana/ligando.
Una investigación detallada de la interacción
del receptor de membrana/ligando es un requisito previo para
comprender las rutas biológicas complejas que implican a las
membranas celulares. Para llevar a cabo tales investigaciones, se
requieren sistemas de ensayo in vitro eficaces y
reproducibles para caracterizar la interacción de unión específica
del receptor/ligando aisladamente de otras interacciones, en las que
el receptor puede estar implicado en entornos naturales.
Por lo tanto, se han desarrollado sistemas
modelo para membranas biológicas tales como liposomas, membranas
lipídicas negras (BLM) planas, así como membranas soportadas en
sólidos, tales como bicapas lipídicas soportadas en sólidos y
bicapas lipídicas unidas. Las membranas lipídicas unidas (tBLM) son
películas lipídicas soportadas en sólidos con grupos espaciadores
hidrófilos tales como grupos peptídicos, polietilenglicólicos o de
azúcar, unidos covalentemente a un soporte. Para incorporar la
proteína de membrana en tales sistemas de membrana modelo, hasta
ahora ha sido necesario aislar las proteínas de membrana y
reconstituirlas en el sistema de membrana. De este modo, por
ejemplo, la formación de una monocapa de fosfolípido sobre un
soporte sólido y el sometimiento subsiguiente de esta monocapa a
vesículas lipídicas que contienen el receptor de acetilcolina (AChR)
conduce a la incorporación del receptor de acetilcolina en una
membrana bilipídica, en la que la segunda capa se forma a partir de
lípidos contenidos en la vesícula lipídica (E. K. Schmidt et
al., Biosensors and Bioelectronics 13 (1998)
585-591). R. Naumann et al. (Biosensors and
Bioelectronics 14 (1999) 651-662) describe la
incorporación de citocromo c oxidasa en forma funcionalmente activa
en una membrana lipídica unida a péptidos. Los liposomas que
comprenden fosfatidilcolina se extienden sobre una monocapa lipídica
unida a tiopéptido para formar una membrana de bicapa lipídica unida
a péptido. Esta membrana se incuba entonces con citocromo c oxidasa
aislada.
Un enfoque similar se dio a conocer para la
incorporación de integrinas en membranas lipídicas planas
artificiales (E. K. Sinner, Analytical Biochemistry 333 (2004)
216-224). En este enfoque, las integrinas se
incorporaron en una capa peptídica funcionalizada con lípidos
mediante extensión vesicular. También con este enfoque se tuvo que
preparar en primer lugar vesículas que contienen proteína de
membrana, requiriendo la preparación y el aislamiento de la proteína
de membrana.
Un problema en el caso de los métodos de
fabricación usados hasta ahora fue que las proteínas de membrana
tenían que ser aisladas primero. A menudo, la actividad nativa de
las proteínas se perdía por ello. Además, la incorporación en las
membranas, por ejemplo en el caso de extensión vesicular, a menudo
se efectuaba de forma aleatoria, sin embargo, no dirigida. Esto
condujo a sistemas de ensayo no óptimos, en los que la interacción y
orientación de las proteínas con y en la membrana, así como su
efecto sobre las interacciones con ligandos, no se pudieron
investigar.
Por lo tanto, un objeto de la invención fue
proporcionar un método mejorado para la preparación de membranas que
tienen proteínas de membrana incorporadas en ellas, especialmente un
método en el que las proteínas de membrana no tienen que ser
aisladas en primer lugar.
Según la invención, este objeto se logra
mediante un procedimiento para la preparación de proteínas de
membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas
de:
- (i)
- proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,
- (ii)
- aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y
- (iii)
- expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana.
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El método de la invención permite incorporar
proteínas de membrana en forma funcional nativa en membranas, en
particular en membranas sintéticas, sin que las proteínas de
membrana se tengan que aislar en primer lugar. Además, se encontró
sorprendentemente que, cuando se lleva a cabo el método de la
invención, las proteínas expresadas con el sistema de expresión
libre de células se incorporan en las membranas en forma dirigida.
Según la invención, de este modo, se pueden obtener proteínas
activas funcionales en membranas sin necesitar el aislamiento
previo. Además, las membranas producidas según la invención tienen
una estabilidad elevada, puesto que debido al uso de sistemas de
expresión libres de células, por ejemplo, no se encuentran en el
sistema proteasas que degradan la
proteína.
proteína.
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Se supone que debido a la expresión de las
proteínas de membrana con un sistema de expresión libre de células
en presencia de una membrana, esta última actúa como un
cuasisustituto del retículo endoplasmático. Los sistemas de
expresión libres de células se han usado para expresar proteínas
solubles en sistemas acuosos, con lo cual en muchos casos se
obtienen proteínas no nativamente activas sino proteínas
desnaturalizadas, por ejemplo en forma de cuerpos de inclusión.
Sorprendentemente, se ha encontrado que mediante la expresión de
proteínas en tal sistema de expresión libre de células en presencia
de una membrana, preferiblemente una membrana sintética, las
proteínas se incorporan en la membrana y, además, están presentes en
ella en forma funcional. La incorporación en membranas sintéticas es
incluso más sorprendente, puesto que los mecanismos de incorporación
para proteínas de membrana que posiblemente todavía están presentes
en membranas que aparecen de forma natural o en membranas de origen
natural no pueden estar presentes en membranas sintéticas. Por
ejemplo, las preparaciones microsómicas que contienen membranas
derivadas de fuentes naturales pueden tener mecanismos de
incorporación para proteínas de membrana. Sorprendentemente, ahora
se ha encontrado por los inventores, sin embargo, que la
incorporación funcional de proteínas de membrana también se puede
lograr de forma excelente con membranas sintéticas que ya no tienen
tales mecanismos.
La membrana empleada es una membrana unida a
superficie. También se prefiere usar una membrana plana. Se
prefieren particularmente las membranas unidas.
Según una realización particularmente preferida
de la invención, en primer lugar se proporciona una membrana
sintética. La membrana sintética es preferiblemente una membrana
plana y/o tiene una arquitectura de material compuesto vesicular.
Especialmente de forma preferible, es una membrana unida aplicada
sobre un soporte.
La unión de las membranas se puede efectuar, por
ejemplo, vía anclajes peptídicos, anclajes de PEG, anclajes de
azúcares, anclajes de silano, anclajes de silano/tiol o anclajes
poliméricos, preferiblemente vía anclajes peptídicos. La ligación o
unión de la membrana a la superficie se logra preferiblemente usando
moléculas espaciadoras hidrófilas.
Las superficies soporte adecuadas, por ejemplo,
son un metal u óxido metálico, especialmente superficies de oro o de
sílice. En el caso de superficies de oro, la membrana se une a la
superficie de oro preferiblemente mediante una interacción
Au-S. Las superficies pueden ser dieléctricas o no
dieléctricas. En una realización, se usan superficies
semiconductoras.
En una realización particularmente preferida,
como moléculas espaciadoras hidrófilas para unir membranas lipídicas
se usan péptidos. Las moléculas espaciadoras peptídicas adecuadas
tienen preferiblemente una longitud de 3-100,
preferiblemente 4-30, en particular
5-25, e incluso más preferiblemente
15-20 aminoácidos. Además, las secuencias escogidas
tienen un resto de cisteína en un extremo. Cuando se usa una
superficie de oro, se puede obtener una capa peptídica monomolecular
mediante autoensamblaje provocado por la fuerte interacción de
oro-azufre del resto de N-cisteína
terminal preferido. El péptido 19-mérico
CSRARKQAASIKVAVSADR (P19) derivado de la subunidad de
\alpha-laminina ha demostrado ser particularmente
útil.
La membrana usada según la invención es
preferiblemente una membrana sintética, es decir, no es una membrana
de origen natural. Esto es ventajoso debido a que realmente se
obtienen de ese modo sistemas modelo, en los que se pueden analizar
propiedades deseadas específicas y se excluyen otras interacciones
potenciales que pueden estar provocadas por componentes de membranas
naturales. Por lo tanto, la membrana usada según la invención
consiste preferiblemente en lípidos producidos sintéticamente, en
particular fosfolípidos. Sin embargo, también es posible emplear
membranas naturales o fragmentos de membranas naturales, por ejemplo
microsomas. De forma especialmente preferible, la membrana comprende
dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) y/o fosfatidilcolina.
El acoplamiento de una primera capa lipídica a
las moléculas de unión, tales como péptidos, es preferiblemente un
acoplamiento covalente. Si se usan péptidos como moléculas de unión,
el acoplamiento se puede lograr, por ejemplo, enlazando
covalentemente los péptidos vía su término carboxi a restos de amino
primario de moléculas fosfolipídicas tales como
dimiristoilfosfatidiletanolamina. El acoplamiento se puede llevar a
cabo mediante cualquier química de acoplamiento conocida, por
ejemplo mediante un procedimiento de acoplamiento de éster activo
usando EDC
(N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida)
y NHS (N-hidroxisuccinimida). Entonces se forma una
segunda capa lipídica añadiendo al sistema moléculas lipídicas
adicionales, por ejemplo mediante fusión vesicular.
La proteína de membrana a incorporar en una
membrana según la invención puede ser cualquier proteína de
membrana. Los ejemplos son receptores acoplados a proteínas G, tales
como receptores sensibles a olores, receptores de rodopsina, en
particular de rodopsina bovina, receptores de feromonas, receptores
de hormonas peptídicas, receptores del gusto, receptores de GABA,
receptores opiáceos, receptores de serotonina, receptor de
Ca^{2+}, melanopsina, receptores de neurotransmisores, de apertura
y cierre controlados por ligandos, de apertura y cierre controlados
por voltaje o de apertura y cierre controlados mecánicamente, tales
como acetilcolina (ACh), nicotínicos, adrenérgicos, norepinefrina,
catecolaminas, L-dopa, dopamina y serotonina -
aminas biogénicas, endorfinas/encefalinas - receptores de
neuropéptidos, cinasas tales como serina/treonina cinasas, tirosina
cinasas citoplásmicas, tirosina cinasas receptoras, fosfatasas
proteasas, cinasas inactivas, porinas/canales tales como canales de
cloruro, canales de potasio, canales de sodio, proteínas OMP,
transportador de ABC (transportador del casete de unión a ATP) tal
como un transportador de aminoácidos, transportador de
Na-glucosa, transportador de Na^{+}/yoduro,
transportadores de iones tales como el complejo de recolección de la
luz, citocromo c oxidasa, ATPasa Na/K, H/K, Ca, receptores de la
adhesión celular tales como metaloproteasas, integrinas,
caterinas.
Para el examen e investigación subsiguientes del
sistema, la proteína de membrana se acopla preferiblemente con un
marcador. El marcador se selecciona preferiblemente de epítopos que
permiten la unión de un anticuerpo específico a ellos. Los
marcadores adecuados, por ejemplo, son VSV (glicoproteína del virus
de la estomatitis vesicular), un marcador de His, un marcador de
Strep, un marcador de Flag, un marcador de inteína o un marcador de
GST. Sin embargo, también es posible acoplar a la proteína de
membrana una pareja de un par de unión de elevada afinidad, tal como
biotina o avidina, o una etiqueta tal como una etiqueta enzimática o
una etiqueta fluorescente que permite la determinación directa de la
proteína de membrana.
El marcador se puede usar entonces para acoplar
un grupo detectable, tal como un grupo fluorescente, a la proteína
de membrana. El examen de la membrana y, en particular, de la
presencia y actividad de proteínas de membrana, por ejemplo, se
puede realizar mediante espectroscopía de resonancia plasmónica de
superficie o espectroscopía de fluorescencia potenciada por plasmón
de superficie (SPFS). Estos métodos permiten monitorizar el
ensamblaje de membranas lipídicas e interacciones de unión de
proteínas de membrana incorporadas en tiempo real. Estos métodos
también permiten la detección y monitorización de muy pocas
moléculas proteínicas dentro de una membrana, tales como
10-10000, en particular 100-1000
moléculas proteínicas.
Un componente esencial de la presente invención
es el uso de un sistema de expresión libre de células. Mediante el
sistema de expresión libre de células, se transcribe y traduce un
ácido nucleico que codifica la proteína de membrana deseada,
opcionalmente que también codifica un marcador, y, de este modo, la
proteína de membrana se forma in situ y entonces se incorpora
inmediatamente en la membrana sintética. Tal sistema de expresión
libre de células es preferiblemente un sistema de transcripción y
traducción in vitro como se describe, por ejemplo en el
documento US 5.324.637. Preferiblemente, como sistema de expresión
se usa un extracto libre de células eucariotas. Tales sistemas de
expresión están comercialmente disponibles, por ejemplo como el
sistema de transcripción/traducción acoplado TNT® de Promega
Corporation. Sin embargo, también es posible usar un sistema de
expresión libre de células procariotas (por ejemplo, RTS 100 E.
coli hy kit^{TM} de Roche Applied Science), o un sistema de
expresión libre de células arcaicas (por ejemplo Sarma; E.M.
Fleischmann, Cold Spring Harbour Press, ISBN
0-87969-438-6,
Protocolo 18, p. 133).
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica
la proteína de membrana y opcionalmente marcadores u otras porciones
funcionales añadidas a la proteína de membrana se añade como ADNc al
sistema de expresión libre de células.
Como se describió anteriormente, se encontró
sorprendentemente que la expresión de las proteínas de membrana con
un sistema de expresión libre de células, preferiblemente un sistema
de expresión libre de células eucariotas, en presencia de una
membrana sintética, conduce a la integración e incorporación de las
proteínas de membrana en la membrana sintética, con lo que las
proteínas de membrana están en una forma funcionalmente activa. De
este modo, las membranas obtenibles según la presente invención son
muy adecuadas como sistemas de ensayo en investigación, en
particular para la investigación de interacciones entre proteínas de
membrana, tales como receptores y sus ligandos. Por lo tanto,
también se describe una membrana sintética que tiene incorporada en
ella una proteína de membrana, membrana sintética la cual es
obtenible mediante el procedimiento como se describe aquí.
La relación en peso de proteínas de membrana
incorporadas en lípidos membránicos es preferiblemente 1:1 a
1:10000, en particular 1:100 a 1:1000.
Las membranas que han incorporado en ellas
proteínas de membrana funcionalmente activas se pueden usar como
sistemas de ensayo para determinar la función y/o estructura de
proteínas de membrana y, en particular, para la investigación de las
interacciones del receptor/ligando. Sin embargo, también se pueden
usar en la tecnología de sensores, por ejemplo como un receptor
sensible al olor. Los usos adicionales son aplicaciones en la
guerra, detección de material biotóxico, por ejemplo carbunco,
material tóxico o explosivo, sensores iónicos, sensores para drogas
o sensores para aminoácidos.
La invención se explica adicionalmente por las
Figuras que se acompañan y los siguientes Ejemplos.
Fig. 1 muestra un montaje experimental de una
capa bilipídica unida a una capa de péptido. La capa de péptido se
absorbe sobre una superficie de oro de un soporte vía el átomo de S
de un resto de cisteína. A la capa peptídica se le une
covalentemente una capa de DMPE. Una capa lipídica superior se
introduce mediante fusión vesicular.
Fig. 2 muestra esquemáticamente la incorporación
de moléculas de GPCR en un sistema de membrana plana acoplado a un
anticuerpo anti-Cy5 de ratón.
Fig. 3 muestra señales de fluorescencia para
- 1)
- adición de ADNc de GPCR con un marcador de VSV N-terminal,
- 2)
- adición de ADNc de GPCR con un marcador de VSV C-terminal, y
- 3)
- adición de un vector de TnT sin inserto.
La flecha indica la adición de un anticuerpo
anti-VSV secundario marcado con Cy5.
Fig. 4 muestra una transferencia Western de la
proteína expresada por el extracto libre de células
- 1:
- extracto con ADNc de OR5 con marcador VSV C-terminal,
- 2:
- extracto con ADNc de OR5 con marcador VSV N-terminal, y
- 3:
- marcador, patrón proteico SeePlus.
La transferencia Western muestra la
transcripción y traducción exitosas de cada uno de los constructos
de GPCR.
Fig. 5 muestra los resultados de la detección
radioactiva.
Fig. 6 muestra datos de espectroscopía de IR de
la proteína OR5 integrada en tBLM.
Fig. 7 muestra la imagen de proteínas de
membrana marcadas insertadas en una superficie membránica plana
artificial.
Fig. 8 muestra resultados para opsina bovina en
BLM unida a P19.
Fig. 9 muestra un diseño esquemático y regiones
codificantes para la expresión del plásmido
TNT-\rho3/4 que incluye la secuencia de ADNc que
codifica opsina bovina.
Fig. 10 muestra un espectro de SPFS para una
incubación de tBLM con pTNT-\rho3/4.
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Como moléculas espaciadoras hidrófilas para las
membranas lipídicas unidas se usan péptidos. Se usó el péptido
19-mero CSRARKQAASIKVAVSADR (P19) derivado de la
subunidad de \alpha-laminina
(Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemania). Se ensayaron
diferentes concentraciones peptídicas, y se demostró que una
concentración final de 25 \mug/ml en agua millipore es la
concentración peptídica óptima en el experimento de ensamblaje, que
muestra la asociación de P19 a la superficie de oro con respecto al
consumo de tiempo/material y con respecto a la reproducibilidad.
El autoensamblaje de una capa peptídica
monomolecular estuvo permitido por la fuerte interacción
oro-azufre del resto de cisteína
N-terminal. El ensamblaje de una capa peptídica se
completó después de una incubación durante 30 minutos de la
superficie de oro en la disolución peptídica. El péptido en exceso
no unido se aclaró, y el grosor óptico resultante se monitorizó
mediante SPS.
El péptido de laminina se enlazó covalentemente
vía su término carboxi a los restos amino primario de moléculas
fosfolipídicas (dimiristoilfosfatidiletanolamina, DMPE; 0,1 mg/ml
(Sigma); solubilizada en 0,001% (p/v) de Triton
X-100 (Roth, Karlsruhe, Alemania)) mediante un
procedimiento de acoplamiento de tipo éster activo. Se disolvieron
N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC; Fluka, Deisenhofen, Alemania) (11,5 mg/ml) y
N-hidroxisuccinimida (NHS; Fluka) (75 mg/ml) cada
una en 10 ml de agua millipore, y se almacenaron en alícuotas de 200
\mul a -20ºC hasta su uso. La EDC y la NHS se mezclaron en
cantidades iguales en un velocidad de 400 \mul (50 mM de NHS, 200
mM de EDC), y se aplicaron sobre la superficie de oro cubierta con
el péptido. La capa lipídica tiopeptídica resultante forma un
montaje rígido (aproximadamente 1,5 nm de grosor).
A la capa lipídica peptídica se añadieron
vesículas de fosfatidilcolina, formando de ese modo una membrana
lipídica de dos capas.
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Se empleó el sistema de transcripción y
traducción acopladas (TNT®, Promega, Inc.) basado en reticulocitos
de conejo. Se preparó ADNc que codifica GPCR (receptor OR5 de rata
sensible al olor) con ADNc añadido aminoterminalmente o
carboxiterminalmente que codifica la glucoproteína del virus de la
estomatitis vesicular VSV, respectivamente.
Se aplicó extracto libre de células sobre la
parte superior de la membrana unida producida como se describe en el
Ejemplo 1, y se añadió el constructo de ADNc de GPCR. Después de la
incubación, la superficie se aclaró y se añadió anticuerpo de ratón
primario, que reconoce el epítopo de VSV. La superficie se aclaró
nuevamente, seguido de la incubación con un anticuerpo secundario
marcado para fluorescencia frente a ratón. El incremento de la señal
de fluorescencia resultante indica la presencia del marcador de VSV
en la vecindad de la superficie.
Para demostrar la inserción de la proteína de
GPCR en la membrana unida, se compararon señales de fluorescencia
obtenidas de diversos experimentos. Se obtuvieron potencias de señal
reproducibles y significativamente diferentes para el marcador de
VSV aminoterminal, comparado con el carboxiterminal. El ADNc de GPCR
con el marcador de VSV en el término C da como resultado una señal
cinco veces más baja, que es igual a la señal de fluorescencia
procedente del vector de TnT sin inserto como referencia.
Esto muestra la incorporación de las moléculas
de GPCR en el sistema de membrana plana, como se representa en la
Fig. 2.
Para probar la actividad del extracto libre de
células y la transcripción y traducción con éxito de cada constructo
de GPCR, el extracto libre de células se recogió tras incubarlo en
la membrana lipídica plana, y se sometió a desnaturalización y se
preparó para la transferencia Western.
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Cuando se emplean microsomas caninos en
comparación con liposomas de fosfatidilcolina de haba de soja, no se
pudo observar ninguna diferencia significativa en las señales de
fluorescencia. Esto muestra que la integración con éxito de la
proteína tiene lugar en la membrana lipídica plana, que consiste
sólo en PC.
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Se ha realizado una investigación adicional de
las moléculas proteínicas incorporadas mediante marcado radioactivo.
Por lo tanto, se sintetizó OR5 en presencia de
^{35}S-metionina. Se sugieren los siguientes
experimentos: debido a la incorporación de la membrana, la proteína
de OR5 se protege frente a la digestión con proteinasa K, excepto
para los bucles expuestos de la proteína 7TM. Se calcularon los
fragmentos resultantes en una distribución de tamaños que oscila
desde 5,9 a 6,8 kDa. Los resultados se muestran en la Fig. 5.
Línea A: el experimento in vitro se
desarrolló directamente sobre la superficie de la membrana. La
proteinasa K se aplicó después. Posteriormente, la proteinasa K y
los fragmentos peptídicos digeridos se eliminaron por aclarado. La
superficie de la membrana resultante (bucles de OR5) se aplicó sobre
un gel de acrilamida SDS y se expuso a una película - el marcaje
radioactivo de la proteína (S estaba homogéneamente presente en la
secuencia de OR5) dio como resultado la señal en el intervalo
esperado de 6 kDa. Línea B: el experimento in vitro se llevó
a cabo en un tubo eppendorf y se aplicó subsiguientemente sobre la
membrana - la expresión de OR5 en la membrana dio como resultado la
misma señal, sugiriendo la expresión en fragmentos membránicos
presentes en el extracto in vitro y adsorbidos no
específicamente sobre la superficie de la membrana.
Línea M: marcador 188, 98, 62, 49, 38, 28, 17,
14, 6, 3 kDa.
Línea C: control positivo para la actividad del
ensayo: extracto in vitro aplicado sobre el gel sin
modificaciones.
Línea D: control positivo para la actividad de
proteinasa K: extracto in vitro con incubación con proteinasa
K.
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La actividad de los receptores sensibles al olor
incorporados se midió usando espectroscopía de IR. El cambio de
señal del pico de IR de amida I de un sistema OR5/tBLM con la
adición de 1 mM de lilial indica el reconocimiento del olor por el
receptor. La interacción lilial/OR5 se puede invertir enjuagando con
PBS. De este modo, los datos de IR muestran la actividad biológica
de la proteína de OR5 integrada en tBLM.
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El nuevo método según la invención se usó para
la síntesis in vitro de proteínas de membrana complejas de
mamífero en estructuras membránicas lipídicas planas artificiales.
El extracto celular de reticulocitos de conejo contiene la
maquinaria sintética de proteínas para la síntesis de novo de
una especie receptora olfativa partiendo del simple ADN del
receptor. Se investigó la densidad de las proteínas receptoras
insertadas mediante microscopía de correlación de imágenes, usando
excitación evanescente en la superficie. Por ejemplo, la Figura 7
muestra los anticuerpos marcados fluorescentemente que se unen a los
marcadores de afinidad de las proteínas de membrana individuales. El
área de excitación tiene un diámetro de alrededor de 20 \mum. La
microscopía de correlación de imágenes de alta resolución, es decir,
la autocorrelación espaciotemporal de las proteínas de membrana,
proporciona información sobre la distribución espacial de la
proteína (densidad de incorporación) así como la movilidad de la
proteína (difusión en la membrana).
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La arquitectura de la superficie se ensambló de
la misma manera como se describe para la expresión in vitro
de OR5/inserción en la membrana (Fig. 8).
La expresión in vitro de rodopsina bovina
se realizó con una mezcla de reacción in vitro
T7-TNT® (Promega). La secuencia de ADNc que codifica
la opsina bovina se añadió a la reacción en forma del plásmido de
expresión pTNT®-\rho3/4. En la Fig. 9 se muestra el diseño
esquemático y las regiones codificantes.
La mezcla de reacción in vitro se incubó
durante 90 minutos a 30ºC directamente sobre la parte superior de la
BLM unida a P19 unida a la superficie de un sensor de SPR.
Subsiguientemente, la arquitectura superficial se expuso a una
disolución de PBS que contiene un sistema de sándwich de anticuerpos
que consiste en una mezcla 1:3 de anticuerpos monoclonales
anti-VSV de ratón y anti-IgG de
ratón-Cy5 de cabra. El espectro de SPFS
correspondiente para una incubación de la tBLM con un
pTNT-\rho3/4 que contiene la mezcla de reacción de
la expresión in vitro y aquel para una incubación con una
mezcla de reacción que no contiene plásmido, respectivamente, se
muestra en la Fig. 10.
Claims (11)
1. Un procedimiento para la preparación de
proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende
las etapas de:
- (i)
- proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,
- (ii)
- aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y
- (iii)
- expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la membrana es una membrana sintética.
3. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana
unida.
4. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une
a una superficie dieléctrica o a una superficie no dieléctrica.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une
a una superficie que consiste en un metal u óxido metálico.
6. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la membrana comprende
componentes de membrana natural, lípidos sintéticamente producidos o
polímeros anfifílicos.
7. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana
lipídica de dos capas.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de membrana es
una proteína de TM, una proteína asociada a una membrana, o una
proteína de recubrimiento de una membrana.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana se
acoplan con un marcador, preferiblemente con un marcador
seleccionado de epítopos tales como VSV, marcador de His, marcador
de Strep, marcador de Flag, marcador de inteína o marcador de GST, o
de una pareja de un par de unión de alta afinidad tal como biotina o
avidina, o de una etiqueta tal como una etiqueta fluorescente, una
etiqueta enzimática, una etiqueta de RMN o una etiqueta
isotópica.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana
están libres de marcadores.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de expresión libre
de células es un sistema de expresión libre de células eucariotas
tal como el sistema TNT® basado en reticulocitos de conejo, un
sistema de expresión libre de células procariotas, o un sistema de
expresión libre de células arcaicas.
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