ES2342050T3 - Lineas celulares de hepatomas humanos, su obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents

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Abstract

Línea celular de hepatomas como la depositada el 5 de abril de 2001 en el CNCM, con el nº I-2652.

Description

Líneas celulares de hepatomas humanos, su obtención y sus aplicaciones.
La invención se refiere a nuevas líneas celulares de hepatomas humanos. Se refiere también a su obtención por selección celular con ayuda de corticosteroides y DMSO, y a sus aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y profilácticas.
La hepatitis B es una enfermedad infecciosa muy extendida por el mundo. Su virus (VHB de forma abreviada) es un virus pequeño de ADN que tiene una alta especificidad por el huésped. En efecto, solamente el hombre y los primates superiores son infectados por este virus, lo cual limita mucho los modelos de estudios in vivo de esta infección. Sin embargo, existe un modelo llamado "del pato" que permite estudiar un ciclo entero de replicación de un hepadnavirus (in vitro o in vivo). Sin embargo, este hepadnavirus, aunque cercano al virus VHB, presenta una biología bastante diferente. Por otra parte, los comportamientos metabólicos del pato no pueden compararse simplemente con los del hombre.
El VHB presenta además un fuerte tropismo hepático y se dirige con preferencia a las células parenquimatosas. Además, a diferencia de otros virus, solo las células hepáticas diferenciadas son susceptibles de ser infecta-
das.
Una línea celular derivada de hepatomas ha permitido rápidos avances en la comprensión de los mecanismos de replicación. Esta línea celular ampliamente usada se denomina HepG2. Un clon derivado de HepG2 2.2.15, presenta la ventaja de tener una gran capacidad de proliferación y de replicar el virus activamente. Sin embargo, esta replicación solo es posible después de introducir el ADN vírico en las células por transfección. Se ha probado que es imposible la infección natural de esta línea celular por el VHB. Además, debido a la antigüedad de esta línea celular, el cariotipo de sus células se ha modificado mucho, lo cual hace que sea un modelo imperfecto para imitar los hepatocitos humanos. Por último, la capacidad de diferenciación de estas células es bastante limitada.
Se han propuesto otras líneas celulares más o menos diferenciadas. Se citará en particular la línea celular Hep3B, poco diferenciada de la línea celular HepG2, y que presenta los mismos límites que ésta. Estas dos líneas son en particular el objeto de la patente US 4393133, y de artículos de Neurath y col. J. exper. med., nº 175, 1992, páginas 461-469, y de Chiu y col., Hepathology, volumen 11, nº 5, 1990, páginas 834-842. Todos los ensayos de infección de líneas celulares han demostrado ser negativos o decepcionantes en términos de eficacia.
Para estudiar los mecanismos de infección por el VHB, se ha desarrollado un modelo de hepatocitos humanos en cultivo primario. Este modelo presenta el interés de que concierne a hepatocitos humanos y permite el acceso al conjunto del ciclo vírico. Sin embargo, su manipulación es difícil y fastidiosa, y además la obtención de fragmentos de biopsia es difícil y aleatoria.
Los trabajos de los autores de la invención en este campo, les han llevado a constatar que se pueden
obtener líneas celulares de hepatomas humanos que se multiplican activamente aunque son infectables por parási-
tos y/o virus, en especial por el VHB, pudiéndose obtener mediante una selección celular en condiciones específi-
cas.
Por lo tanto, la invención se dirige a proporcionar nuevas líneas celulares de hepatomas humanos infectables por parásitos y/o virus, y las células o elementos de estas células resultantes de estas líneas celulares.
Se dirige igualmente a un procedimiento de selección de dichas líneas.
La invención tiene también por objeto aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y profilácticas de estas líneas celulares.
De acuerdo con la presente invención, las líneas celulares de hepatomas humanos se caracterizan por ser susceptibles de ser infectadas de forma natural por parásitos y/o virus; pudiendo ser dichos parásitos hepatotropos o no, tales como Plasmodium o los parásitos del género leishmania; y expresan receptores de la familia de los virus Flaviviridae y Hepadnaviridae, preferiblemente el VHB y VHC.
Estas líneas celulares nuevas permiten así el estudio completo del ciclo de los parásitos y/o los virus, en particular el ciclo vírico del VHB, desde la etapa de infección natural hasta la replicación y/o la propagación del virus. En este aspecto, se observará que hasta el momento ninguna línea celular de hepatomas humanos es infectable por Plasmodium falciparum, es decir que ninguna línea celular de hepatomas humanos es susceptible de soportar el desarrollo de formas maduras de este parásito hepatotropo (esquizontes). Además, debido a su capacidad de proliferación, estas líneas celulares presentan gran facilidad de manipulación.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, estas líneas celulares pueden alcanzar un nivel de diferenciación elevado.
\newpage
En particular, las células derivadas de las líneas celulares según la invención, permiten alcanzar un estado de diferenciación hepático, es decir, una morfología próxima a la de las células que constituyen el hígado, tales como los hepatocitos y/o las células biliares, en particular con:
-
la formación de filas de células parenquimatosas,
-
la formación de canalículos biliares funcionales, con la reconstitución a nivel celular de un polo biliar.
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En toda la solicitud se hará referencia a nociones típicas de la organización estructural de las células hepáticas. Estas nociones, en particular el polo biliar, se explican en el preámbulo del apartado "Resultados" del ejemplo 1, más adelante. Es sorprendente constatar que las células derivadas de las líneas celulares según la invención son capaces de imitar casi de forma idéntica la organización estructural de estas células hepáticas y de reproducir sus funciones: en efecto, los canalículos biliares formados por las células de las líneas celulares según la invención, son funcionales, es decir son capaces de realizar su función de destoxificación. Esta diferenciación funcional es además muy elevada: las células de las líneas celulares de hepatomas humanos según la invención pueden expresar las funciones características del hepatocito, a saber:
-
la producción de proteínas plasmáticas, en particular la albúmina y la tranferrina,
-
la función de destoxificación, en particular:
-
la expresión de varias formas de citocromos P450, tales como CYP2E1, CYP3A y/o CYP1A, la expresión de varias formas de enzimas de la fase II de destoxificación, en particular la GST\alpha,
-
la conjugación de las sales biliares,
-
la eliminación de la urea.
-
la función energética reguladora:
-
el almacenamiento de azúcar en forma de glucógeno y la producción de glucosa por glucolisis, en particular, la expresión de la aldolasa B y/o la neoglucogenasa,
-
el metabolismo de lípidos.
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Es interesante observar que ninguna línea celular de hepatomas humanos era capaz de producir células que pudieran alcanzar un nivel de diferenciación tal que sus células pudieran expresar la casi totalidad de las funciones del hepatocito humano normal, en particular, las funciones de destoxificación de las fases I y II (CYP2E1, CYP3A, CYP1A y GST\alpha).
Según un aspecto inesperado, las células derivadas de las líneas celulares según la invención tienen propiedades de células pluripotentes, en particular, propiedades de células madre residentes y/u ovaladas, es decir capaces de diferenciarse hacia la ruta hepatocitaria, biliar, pancreática y/o intestinal.
El artículo de Zvibel y col., Differentiation, volumen 63, nº 4, 1998, páginas 215-223, describe líneas celulares de hepatomas de rata que presentan marcadores biliares que evolucionan hacia un estado precoz de diferenciación hepatocitaria. Estas líneas celulares no tienen pues la capacidad de diferenciarse por la ruta hepatocitaria, biliar, pancreática e intestinal. Las células madre residentes son células del hígado capaces, después de una destrucción masiva de éste, de multiplicarse activamente con el fin de regenerar la parte destruida. Estas células pueden evolucionar hacia un linaje hepatocitario o biliar (Figura 1). Por otra parte, estas células madre residentes a veces denominadas también células ovaladas, tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos celulares tales como células pancreáticas, intestinales y/o hepáticas.
Otra ventaja de las líneas según la invención reside en su capacidad para proliferar activamente. Así, en la fase de proliferación, la población celular se duplica en aproximadamente 24 h.
La invención se dirige en particular a la línea celular depositada el 5 de abril de 2001 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, con el nº I-2652.
Esta línea celular denominada HepaRG, es un ejemplo de línea celular que presenta a la vez todas las características de las líneas celulares según la invención: es infectable de forma natural por parásitos y virus, presenta las características morfológicas mencionadas antes, y tiene todas las funciones biológicas de una célula hepática. Aparece como un modelo casi perfecto de células hepáticas.
Por otra parte, la invención se dirige a proporcionar procedimientos de obtención y de selección de líneas celulares hepáticas.
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El procedimiento de selección de líneas celulares humanas comprende:
-
una fase de proliferación celular en un medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación de los hepatocitos humanos normales, y en particular su diferenciación óptima,
-
después, tras alcanzar la confluencia, una fase de diferenciación celular en el mismo medio, por adición de DMSO en cantidad suficiente para inducir la diferenciación,
repitiéndose este procedimiento varias veces, preferiblemente 3 veces, si se desea.
El artículo de Saito y col., Cancer Biochem. Biophys, volumen 15, 1992, páginas 75-84 y la solicitud EP 0972828, describen procedimientos que aplican DMSO o dexametasona para diferenciar líneas celulares de hepatoma o de hepatocitos. Sin embargo, no se propone el uso simultáneo de DMSO y de corticosteroides.
Este procedimiento de selección celular es indispensable para mantener las propiedades de las líneas celulares según la invención. En efecto, este procedimiento de selección induce una mortalidad celular elevada. El ejemplo 3 más adelante, demuestra la cooperación necesaria entre el corticosteroide y el DMSO.
Se llama "concentración no tóxica que favorece la diferenciación de hepatocitos humanos normales" a la concentración de corticosteroide que favorece, cuando se añade a un cultivo de hepatocitos humanos normales, la diferenciación de células hacia una morfología y un estado funcional descrito en el preámbulo del apartado "Resultados" del ejemplo 1. Esta concentración no es tóxica, es decir, su adición no conlleva una tasa de mortalidad celular superior a aproximadamente 10%.
Por otro lado, se llama "cantidad suficiente para inducir la diferenciación" a la cantidad de DMSO necesario para inducir la diferenciación de un cultivo de hepatocitos humanos normales.
Es interesante observar que un procedimiento preferido comprende un corticosteroide presente de forma continua con una concentración alta en el medio, al contrario que los procedimientos usados habitualmente en el cultivo de células de hepatomas. Sorprendentemente, la presencia de este corticosteroide no impide en absoluto que proliferen las líneas celulares.
Este procedimiento de selección ha permitido desarrollar un procedimiento de obtención de las líneas celulares según la invención, que comprende una etapa de biopsia de un tumor sólido de tipo hepatocarcinoma, una etapa de aislamiento de la población celular con ayuda de una enzima proteolítica y una etapa de selección de las líneas con ayuda del procedimiento de selección detallado más adelante.
La enzima proteolítica preferiblemente usada es la tripsina y/o la colagenasa.
La invención propone también un procedimiento de infección de células hepáticas por un parásito hepatotropo y/o un virus, que comprende:
-
una fase de selección con ayuda del procedimiento de selección mencionado antes,
-
una fase de diferenciación que permite a las células alcanzar una morfología próxima al hepatocito con ayuda del medio de cultivo que comprende al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica, que favorece la diferenciación óptima de los hepatocitos humanos normales, con DMSO añadido en cantidad suficiente para inducir una diferenciación,
-
una fase de infección con incubación de las células hepáticas en un medio de cultivo que comprende al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación óptima de los hepatocitos humanos normales, al que se ha añadido la fuente infecciosa.
El parásito hepatotropo puede ser un Plasmidium, y el virus puede ser el VHB o el VHC.
Una fuente infecciosa posible es el líquido sobrenadante de células HepG2 y/o el suero de enfermo.
Los medios de cultivo usados para los procedimientos de selección, obtención e infección, contienen preferiblemente insulina en cantidad suficiente para favorecer la supervivencia de hepatocitos humanos normales, preferiblemente de 2,5 \mug/ml a 10 \mug/ml, en particular del orden de 5 \mug/ml.
La insulina permite mejorar considerablemente la viabilidad de las células.
Por otro lado, los corticosteroides de estos medios de cultivo son preferiblemente hemisuccinato de hidrocortisona y dexametasona. Se pueden usar otros inductores de diferenciación, en particular ácido retinoico y/o sus análogos de síntesis, estrógenos y hormonas tiroideas.
Se denominan "análogos de síntesis" a los análogos de dichos corticosteroides y retinoides de origen no natural.
La concentración de corticoide es de 10^{-7} M a 10^{-1} M, preferiblemente de aproximadamente 5.10^{-5} M para el hemisuccinato de hidrocortisona y de aproximadamente 10^{-6} para la dexametasona. Por último, la concentración de DMSO, cuando éste se añade al medio de cultivo es de 1% a 4%, preferiblemente de aproximadamente 2%.
Por otra parte, la invención se dirige a un procedimiento de transfección de líneas celulares según la invención, con ayuda de un vector que comprende la secuencia completa y/o una parte de material genético del virus VHB y/o VHC. Se dirige también a un procedimiento de selección de alto caudal de genes expresados de forma diferencial con ayuda de una herramienta de tipo chip producida a partir de la línea celular y/o las células y/o partes de células según la invención, preferiblemente, expresándose dichos genes de forma diferencial bajo el efecto de condiciones de cultivo, exposición a una molécula y/o un virus y/o un parásito.
Se da un ejemplo de herramienta de tipo chip en el ejemplo 7, a continuación. Se trata de un chip de ADNc cuya construcción permite la selección de alto caudal de genes expresados de forma diferencial.
Por último, la invención cubre el uso de diferentes medios de cultivo que permiten la obtención, mantenimiento, proliferación, selección, diferenciación, transfección, infección de las líneas celulares según la invención. Se trata en particular, del uso de un medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide, preferiblemente el hemisuccinato de hidrocortisona, en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación óptima de los hepatocitos humanos normales, con el fin de mantener la estabilidad de la población celular de las líneas celulares y/o las células según la invención; así como el uso de un medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide, preferiblemente el hemisuccinato de hidrocortisona, en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación óptima de hepatocitos humanos normales, al que se ha añadido DMSO en cantidad suficiente con el fin de inducir una diferenciación de las células derivadas de las líneas celulares según la invención; y el uso del medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide en la concentración mencionada, así como butirato de sodio en una concentración suficiente para inducir una diferenciación de tipo biliar, preferiblemente una concentración de 2,5 a 5 mM, en particular de aproximadamente 3,75 nM.
Como ya se ha indicado, las líneas celulares según la invención son capaces de evolucionar hacía rutas de diferenciación distintas. En la ruta de diferenciación influye mucho la elección del medio de cultivo. Las evoluciones hacia las rutas hepática, biliar y pancreática se ilustran con el ejemplo 4.
La línea celular de hepatomas humanos según la invención es objeto de muchas aplicaciones, dada su capacidad de alta diferenciación, su gran funcionalidad y su facilidad de manipulación.
Una primera aplicación interesante corresponde al uso de las líneas celulares y/o de las células derivadas de las líneas celulares según la invención, para ensayos metabólicos y/o de toxicidad dirigidos preferiblemente a la evaluación de nuevos medicamentos y/o de constituyentes nutricionales y/o de contaminantes medioambientales.
En efecto, las líneas celulares según la invención son hasta el momento el mejor modelo que imita los hepatocitos humanos normales, en particular en cuanto a la destoxificación.
En particular, las líneas celulares según la invención permiten la fabricación de un biorreactor extracorpóreo para tratar de forma transitoria las insuficiencias hepatocelulares agudas. La invención también cubre igualmente el uso de líneas celulares según la invención para la selección y/o fabricación de nuevas vacunas y/o de moléculas antivíricas, en particular para la selección de moléculas activas frente a una de las etapas del ciclo vírico; para la fabricación de anticuerpos dirigidos contra un virus que pertenece a la familia de Flaviviridae y Hepadnaviridae, en particular dirigidos contra el VHB y VHC y/o sus receptores de membrana celulares; para realizar ensayos de neutralización vírica y/o de composición de vacunas que comprenden al menos partículas víricas y/o de polipéptidos obtenidos después de infección y/o transfección de las líneas celulares según la invención, asociados a un vehículo y/o un excipiente y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En los siguientes ejemplos se dan otras características y ventajas de la invención. Se refieren, con el fin de ilustrar, a la línea I-2652 depositada en la CNCM, denominada HepaRG. En estos ejemplos se hace referencia a las figuras 1 a 13, que representan respectivamente:
la fig. 1 es una representación esquemática de los diferentes tipos celulares que participan en la hemostasia del hígado;
la fig. 2 es un corte esquemático del hígado que muestra la organización estructural de las diferentes células constitutivas del hígado;
la fig. 3 es la curva de crecimiento de la línea celular HepaRG;
la fig. 4 son microfotografías de contraste de fase de células HepaRG en diferentes estadios de diferenciación,
la fig. 5 son micrografías electrónicas de células HepaRG,
la fig. 6 es el cariotipo en coloración de tipo RHG de una metafase pseudodiploide representativa de la línea celular HepaRG,
la fig. 7 es un análisis de transferencia Northern de la expresión de los ARNm en 2 biopsias de hígado, células HepG2 y células HepaRG,
la fig. 8 son los efectos de inductores de las actividades CYP1A (fenacetina desetilasa) y CYP3A4 (nifedipina oxidasa),
la fig. 9 es la influencia de corticoides y de DMSO en el nivel de los ARNm hepáticos en las células HepaRG,
la fig. 10 son los efectos de diferentes factores que influyen en la infectabilidad de las células y
la fig. 11 son los resultados de la infección de células HepaRG por el VHB,
las figs. 12 y 13 son las diferenciaciones biliares y pancreáticas,
las figs. 14 y 15 son la infectabilidad de células HepaRG por el suero de pacientes portadores del VHC, en presencia o ausencia de interferón \alpha,
la fig. 16 es la cinética de replicación o inhibición del VHC por el interferón \alpha,
la fig. 17 son las cinéticas de infección por parásitos del género Leishmania, y
las fig. 18 y 19 son optimizaciones del protocolo de infección por parásitos del género Leishmania.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Aislamiento de la línea celular de hepatomas 1. Materiales y procedimientos
El aislamiento de células se realiza a partir de un tumor de hígado extraído de un paciente que padecía un hepatocarcinoma y hepatitis vírica C. Todo el procedimiento se ha llevado a cabo en conformidad con la ley y los reglamentos franceses y aprobados por el Comité Nacional de Ética, y de forma confidencial.
Las extracciones se cortan en láminas finas, después se aclaran con disolución tampón basada en HEPES [(pH 7,7); NaCl 140 mM, KCl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,2 mM y HEPES 10 mM], y se hacen digerir con colagenasa D al 0,025% (Boehringer Mannheim) diluida en la misma disolución tampón a la que se ha añadido CaCl_{2} al 0,075% (adición con agitación suave a 37ºC). Después de 2 lavados con la disolución tampón de HEPES, las células se vuelven a suspender en un medio William E, complementado con suero de ternero fetal al 10% (FCS), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, insulina 5 \mug/ml, L-glutamina 2 mM/ml y hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-7}. Después la suspensión celular se reparte en diferentes pocillos sobre soporte plástico. Después de varias semanas, el crecimiento celular es suficiente para poder realizar un cultivo. Su población es heterogénea, pero hay células muy diferenciadas y presentan una morfología de tipo hepatocito. Los pocillos que presentan las poblaciones celulares más homogéneas se despegan con tripsina y después se redistribuyen. Después de 3 pases, las células se reparten en partes alícuotas, después se congelan en medio de cultivo con DMSO al 10% añadido y se conservan en nitrógeno líquido. Después de descongelación, se seleccionan los pocillos que presentan la proporción mayor de células que tienen una morfología de tipo hepatocitaria. Las células se cultivan en los medios de cultivos usados para su aislamiento y/o en el medio de diferenciación usado para perfeccionar la selección celular.
Para obtener una diferenciación hepatocitaria más frecuente en el seno de la línea celular, las células HepaRG derivadas de la primera selección se cultivan en medio William E, al que se ha añadido insulina 5 \mug/ml, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-1}, L-glutamina 2 mM y FCS al 10%.
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Las células se someten a un pase cada 10-15 días, a una dilución de 1/5. La fase de diferenciación se realiza en 2 fases:
-
las células se mantienen en su medio de crecimiento durante 2 semanas, alcanzándose la confluencia al cabo de una semana,
-
después se mantienen en un medio de diferenciación (correspondiente al medio de cultivo precedente al que se ha añadido DMSO al 2%) durante otras 2 semanas, renovándose el medio cada 2 ó 3 días.
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Análisis citogenético:
El cariotipo de las células HepaRG se analiza después de 8 pases. Las células primero se mantuvieron durante 24 a 48 horas en RPMI 1640 con FCS al 10% añadido, y después se bloquearon en la metafase por exposición a colcemida (10 \mug/ml) durante 45 minutos.
Las células después se trataron con una disolución hipotónica (MgCl_{2} 0,1 M), se fijaron en una disolución acética de Carnoy y los cromosomas se revelaron por coloración RHG.
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2. Resultados Preámbulo
La figura 2 es un corte esquemático del hígado que muestra la organización estructural de las células del hígado. En particular, un hepatocito humano normal presenta las siguientes características morfológicas:
-
Son células con un citoplasma granuloso debido a la riqueza de orgánulos tales como las mitocondrias y las vesículas del retículo endoplasmático rugoso, y un núcleo central redondo y regular con un nucléolo muy denso.
-
Estas células se reagrupan y se organizan en filas típicas, con frecuencia formadas de cuerdas de 2 a 4 células, ligadas entre ellas por estructuras de unión de tipo desmosoma, y estructuras de comunicación de tipo "hueco" y bordeadas a cada lado por sinusoides por los que circula la sangre. Esta organización en filas determina la polaridad doble que caracteriza al hepatocito: un polo sinusoidal del lado de los sinusoides y un polo biliar en la interfase de los hepatocitos.
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El polo biliar está asociado con la función de destoxificación y más en particular con la eliminación de las sales biliares. Se trata de un espacio intercelular dilatado, cerrado por uniones complejas características (uniones estrechas más desmosomas) que delimitan para cada célula una zona de membrana especializada, por una parte en el plano funcional para la expresión de proteínas específicas, y por otra parte, en el plano morfológico para la formación de numerosas vellosidades.
Además, se llaman células biliares a las células constitutivas de estos canales y canalículos biliares. Éstos permiten evacuar hacia la bilis, las sales biliares que provienen de hepatocitos y que han circulado a lo largo de la fila de células parenquimatosas a través del polo biliar.
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Selección de las células que presentan una morfología de hepatocito
Las células obtenidas de los pocillos seleccionados inicialmente por su alta proporción de células de tipo hepatocitario se mantienen en un medio de cultivo que contiene hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-7} M. Se constata que su morfología se hace cada vez más heterogénea y alejada de la de un hepatocito.
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Con el fin de encontrar una población de células de tipo hepatocitario, se usa de acuerdo con la invención, el siguiente procedimiento de selección:
-
se usa un medio de diferenciación formado a partir de un medio base que contiene solamente insulina 5 mg/l y FCS al 10% al que se añade DMSO al 2% y hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M. Una vez bien establecida la confluencia, las células HepaRG se cultivan en este medio.
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En los 2 a 4 días siguientes, el medio muy tóxico, provoca la muerte de más de 90% de las células. Paralelamente, la morfología de algunas células supervivientes cambia considerablemente.
Después de 2 semanas de este tratamiento, la tasa de mortalidad de las células parece nula y algunas células supervivientes presentan la misma morfología que los hepatocitos humanos normales, cultivados en las mismas condiciones.
Se constata, por lo tanto, que las células diferenciadas son más resistentes al DMSO que las otras.
Las células, una vez devueltas al medio desprovisto de DMSO, vuelven hacia una fase de proliferación activa.
Se sigue el procedimiento de selección. Después de 3 etapas de selección en este medio de diferenciación, la mayor parte de las células se convierten en resistentes al DMSO y capaces de diferenciarse otra vez, una vez alcanzada la confluencia.
La homogeneidad de la población se mejora más gracias a otros 2 protocolos de selección.
Los autores de la invención han observado y han aprovechado el hecho de que un tratamiento con tripsina tiende a despegar las células más diferenciadas en forma de cúmulos multicelulares, mientras que se aíslan las células menos diferenciadas. La purificación de los agregados grandes permite enriquecer la población de células susceptibles a la diferenciación.
El uso de la colagenasa se basa en un principio muy diferente: el tratamiento usado con la colagenasa implica el despegado selectivo de las células más diferenciadas que pueden recuperarse y volver a sembrarse.
Por último, la estabilidad del fenotipo de la línea celular se favorece mucho por el uso de forma continua de una concentración alta de hemisuccinato de hidrocortisona (5.10^{-5} M).
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Modificaciones morfológicas de la proliferación a la diferenciación
Una característica inesperada de las células seleccionadas se refiere a su capacidad para proliferar en presencia de concentraciones altas de corticoide. Después de un despegado, la mayoría de las células se unen al soporte en 2 horas y vuelven a proliferar. Durante la fase exponencial de la proliferación, la población se duplica en 24 horas y después, cuando las células llegan a la confluencia, se ralentiza el crecimiento. Éste alcanza una meseta en los 10 días después del pase, tras la cual las células ya no pueden dividirse, pero siguen vivas durante varias semanas.
En la figura 3, las células cultivadas en ausencia -\blacksquare- o en presencia de hidrocortisona (5.10^{-5}) -\blacklozenge- durante 10 pases, se sembraron con una densidad de 40.000 células por pocillo de 4 cm^{2} y se mantuvieron en el mismo medio de cultivo. Las células se recogieron por tripsinización y se contaron manualmente.
Durante la fase de proliferación, las células HepaRG forman una población homogénea de fenotipo epitelial (ausencia de organización estructural regular) y de formas diferentes de las de los hepatocitos (figura 4A, células HepaRG en las condiciones de proliferación). Una vez alcanzada la confluencia, las células sufren modificaciones morfológicas importantes. En 4 semanas aparecen numerosas colonias de células granulosas de tipo hepatocitario, mientras que en la periferia se pueden ver claramente células epiteliales (figura 4B, células HepaRG mantenidas en confluencia durante 20 días). La adición de DMSO 2 semanas después del pase inducía una diferenciación morfológica muy completa: organización de las células en filas comparables a las obtenidas en el cultivo primario de hepatocitos normales, en las que se pueden reconocer estructuras de tipo caniculares (indicadas por una flecha negra en la figura 4D). Las figuras 4C y 4D presentan células HepaRG mantenidas en confluencia durante 5 días, y después tratadas con DMSO al 2% durante 15 días (escala = 100 \mum).
Algunas células epiteliales ocupan los espacios libres (células planas, regulares, claras en la figura 4C e indicadas con la letra E en la figura 4D). La morfología característica hepatocitaria se traduce también a nivel de la organización en filas de cadenas de hepatocitos. Se obtiene después de 2 semanas de exposición al DMSO, y las células granulosas se parecen entonces mucho a los hepatocitos (figura 4C, células indicadas con la letra H en la figura 4D). Después de estas 2 semanas, ya no se constatan más modificaciones significativas.
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Por lo tanto, las condiciones que permiten obtener una diferenciación hepatocitaria completa están definidas por:
-
una semana de confluencia en presencia de corticoide (hidrocrotisona 5.10^{-5} M),
-
después 2 semanas de diferenciación en presencia de hidrocortisona y de DMSO al 2%.
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Sorprendentemente, se ha observado que recogiendo selectivamente la población de células granulosas de las filas, ésta es capaz, incluso después de un periodo largo de quiescencia, de volver a la fase de proliferación activa y dar lugar otra vez a dos tipos de células hepatocitarias y epiteliales cuando se alcanza la confluencia.
Un estudio mediante microscopio electrónico ha permitido poner de manifiesto la organización estructural de las células: 2 células vecinas están fuertemente unidas entre sí por desmosomas (figura 5A, vista con poco aumento), con estructuras que se parecen mucho a los canalículos biliares y rodeadas de complejos típicos de las uniones (uniones "estrechas" + desmosomas). Las figuras 5B y 5C presentan vistas con mayor aumento que muestran una acumulación típica de gránulos de colágeno y una estructura de tipo canalículo biliar (escala = 2 \mum).
En la figura 5A se pueden ver núcleos redondos regulares característicos que comprenden 1 ó 2 nucléolos. Las mitocondrias muy numerosas del citoplasma tienen una forma ligeramente abombada que presenta algunos picos. También se pueden observar numerosos gránulos citoplasmáticos, que son de hecho una acumulación de partículas de glucógeno organizadas en "roseta" como se describe en el hígado normal in vivo (Fig. 5B).
Por último, de forma inesperada, el cariotipo de las células de la línea celular es subdiploide. Se ha deducido la siguiente fórmula cariotípica: 46 <2n>, XX, + del (7) (q11 q21) inv? (7) (q21 q36), -der (22) t(12; 22) (p11; q11). La determinación de los puntos de deleción y de traslocación se ha hecho por hibridación in situ. De 40 mitosis estudiadas el 65% contienen 46 cromosomas. El 100% de las células presentan las siguientes anomalías (Fig. 6):
-
un cromosoma 7 excedente y modificado que conduce a una trisomía 7, y
-
una translocación t (12,12) con una pérdida de fragmento 12p que conduce a una monosomía 12p (fig. 6).
Se detectaron otras anomalías puntuales y se dan en la siguiente tabla I:
TABLA I Características citogenéticas de la línea celular HepaRG
1
Ejemplo 2
Capacidad funcional de la línea celular 1. Materiales y procedimientos Extracción del ARN y análisis
El ARN celular total se extrae con ayuda del kit Total SV RNA® (Promega, Francia), se separa en gel de agarosa al 1,5% y se analiza por transferencia Northern. El control de la cantidad de ARN transferida a los filtros se lleva a cabo después de marcaje con azul de metileno. La hibridación se realiza según el protocolo de Gripon y col. (1993, Virology, 192:534-540).
Actividades enzimáticas asociadas a la función de destoxificación
Las actividades enzimáticas se establecen gracias a los protocolos desarrollados por Guillouzo y col. (1993, Hepatology 18:406-414).
Se han estudiado:
-
la desetilación de la fenacetina en paracetamol,
-
la oxidación de la nifedepina en la 3,5-dimetoxi-carbonil-2,6-dimetil-4-(2-nitro-fenil)piridina
-
la desmetilación del dextrometorfano en tartrato de dextrorfano,
-
la hidroxilación de la tolbutamida en hidroxitolbutamida,
-
la hidroxilación de la 4-mefenitoína en 4-hidroxi-mefenitoína.
Para la comparación también se han determinado las actividades enzimáticas en cultivos de hepatocitos humanos normales incubados durante 2 a 16 horas en presencia de los siguientes sustratos:
-
fenacetina 2.10^{-4} mol/l
-
nifedepina 2.10^{-4} mol/l
-
dextrometorfano y mefenitoína 2.10^{-4} mol/l
-
tolbutamida 1 mmol/l
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Las dosificaciones se realizan por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Los resultados se expresan en picomoles de metabolitos formados por hora y por \mug de ADN. La actividad de la glutatión-S-transferasa (GST) se calcula usando el 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNP) (Merck) como sustrato, a pH 6,5 y a temperatura ambiente.
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2. Resultados
El nivel de diferenciación de las células se ha controlado por análisis de las cantidades de diferentes ARNm específicos del hígado, en particular los ARNm de proteínas de funciones específicas del hígado, como las proteínas del suero (albúmina, transferrina), una enzima hepática implicada en la glucolisis (aldalosa B) y 3 enzimas específicas implicadas en la destoxificación (CYP2E1, CYP3A y GST\alpha). Todos estos ARN son expresados por hepatocitos adultos.
Se comparó su nivel de expresión en la fase de proliferación y de diferenciación. Además, se estableció una comparación con el nivel de expresión correspondiente a los hepatocitos humanos y a las células HepG2.
La figura 7 es un análisis por transferencia Northern de la expresión de ARN mensajeros en 2 biopsias de hígado, células HepG2 y células HepaGR. Las células se mantuvieron en condiciones de proliferación (prolif.) o en confluencia durante 1 mes. Un tratamiento de las células con DMSO al 2% durante los últimos 15 días de cultivo se indica como sigue: +D.
Se detecta poco o no se detectan ARNm hepáticos específicos en las células en proliferación. En cambio, se pueden detectar en las células en confluencia, mantenidas durante 2 semanas en presencia de una concentración alta de corticoide. Los de la albúmina y la aldolasa B se expresan en gran cantidad, mientras que los de CYP2E1 y CYP3A4 en poca cantidad. Se observa igualmente que en las células que han adquirido la organización típica en filas, la exposición al DMSO provoca un aumento de los transcritos correspondiente a la expresión creciente de estos dos últimos tipos de enzimas, haciendo que su nivel de expresión sea prácticamente igual al observado en las células obtenidas de biopsias.
El estudio llevado en paralelo en células de la línea celular HepG2 usadas como referencia, pone de manifiesto que 3 de las 5 funciones específicas estudiadas son expresadas poco o no son expresadas en estas células. Además, la acción del DMSO en HepG2 parece inhibir la expresión de algunas de estas funciones, en particular de CYP2E1 y CYP3A4.
Estos análisis ponen de manifiesto el carácter original de la línea celular HepaRG.
Después se ha llevado a cabo la medición de la actividad de estas diferentes enzimas correspondiente a las fases I y II de destoxificación. Las otras líneas celulares expresan poco estas enzimas, a menudo de forma tardía, o tampoco responden a inductores específicos.
La actividad de estas enzimas diferentes se ha medido en células HepaRG confluentes tratadas con DMSO. Esta actividad se ha comparado con la de cultivos primarios de hepatocitos humanos, así como con la de líneas celulares HepG2 y el clon BC2 de la línea celular HBG. Los resultados se dan en la siguiente Tabla II.
TABLA II Actividad de las enzimas en fase I y II
2
El examen de esta tabla muestra que las células HepaRG tienen actividades enzimáticas asociadas a la función de destoxificación en tasas casi equivalentes a las expresadas por los hepatocitos humanos normales, excepto para la dextrometorfano desmetilasa cuya actividad es ligeramente inferior. La activación de la fenacetina desetilasa y de la nifedepina oxidasa es importante comparada con la obtenida con las otras líneas celulares. Esta activación es inferior a la observada en los hepatocitos humanos normales, aunque sigue siendo del mismo orden de magnitud (Fig. 8, las actividades se midieron después de 72 h de tratamiento y se expresan en relación con las células tratadas frente a las células no tratadas correspondientes a las células de control).
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Ejemplo 3
Cooperación necesaria entre el corticoide y el DMSO para una diferenciación completa
Se llevaron a cabo experimentos con el fin de verificar si los 2 agentes eran necesarios para inducir una diferenciación completa.
1. Efecto en la diferenciación
Se llevó a cabo una primera serie de experimentos para estudiar los efectos de la ausencia del corticoide en las células que se habían mantenido siempre en su presencia. En la figura 9A, las células HepaRG en el pase 13 se mantuvieron durante 2 pases complementarios en presencia continua de hidrocortisona (crecimiento: HN), o en ausencia de hidrocortisona (crecimiento: HO). Después se indujo la diferenciación (dif.) durante 3 semanas en ausencia de hidrocortisona (HO) o en presencia de hidrocortisona 5x10^{-5} M (HN), y en presencia de diferentes concentraciones de DMSO.
La retirada del corticoide se hizo en la confluencia, es decir en el momento en el que las células empezaban su diferenciación.
Después de 2 semanas de cultivo en ausencia de DMSO no se detectó ninguna función específica (ningún transcrito) del hígado, excepto la albúmina. La adición de DMSO al 2% es tan tóxica que su uso es imposible. La adición de DMSO al 1%, menos tóxica, no indujo diferenciación más elevada.
Una segunda serie de experimentos ha permitido estudiar los efectos debidos a la ausencia de DMSO.
Cuando las células se exponen solo al corticoide, se detecta la presencia de algunos transcritos (de la albúmina, transferrina y aldolasa B) en tasas muy pequeñas. La adición de DMSO de 1 a 2% en el medio de cultivo produce la acumulación rápida de numerosos transcritos, en particular los ya citados y los de CYP2E1 y CYP3A.
Ésto demuestra que la cooperación entre el corticoide y el DMSO es indispensable para alcanzar una diferenciación máxima. Finalmente, se constató la estabilidad de los cultivos durante al menos 6 semanas.
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2. Efecto en la proliferación: uso continuo de corticoide
Las células se mantienen en un medio de cultivo exento de corticoide y se ensaya su capacidad para realizar una diferenciación después de 2 (Fig. 9A) y 10 pases (Fig. 9B).
En los dos casos no se observa diferenciación y solo se detecta el ARNm de la albúmina. La adición de DMSO al 2% se demuestra muy tóxica y la adición de DMSO al 1% no provoca cambios notables.
En cambio, la adición de corticoide solo en la confluencia provoca una acumulación de diferentes transcritos específicos del hígado. Pero esta diferenciación es incompleta ya que los transcritos de CYP2E1 y de CYP3A se detectan con dificultad, incluso después de la adición de DMSO al 1 o al 2%, mostrándose esta última dosificación muy tóxica después de 10 semanas sin corticoide.
Finalmente, las células exentas de corticoide experimentan poco a poco modificaciones de su crecimiento: se retarda la inhibición del contacto aunque la meseta de confluencia presenta una densidad de células 2 veces superior a la constatada con las células mantenidas de forma continua en presencia de corticoide (Fig. 3).
Este estudio muestra la importancia de la cooperación entre el DMSO y el corticoide tanto a nivel de la fase de proliferación (el corticoide permite disminuir la toxicidad del DMSO) como en la fase de diferenciación (en la que la acción de los dos agentes es complementaria).
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Ejemplo 4
Capacidad de las células HepaRG para evolucionar hacia rutas de diferenciación biliar y pancreática 1. Materiales y procedimientos
Las células HepaRG se despegaron, se diluyeron hasta 1/5 en medio William E al que se había añadido insulina 5 \mug/ml, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M, L-glutamina 2 mM y FCS al 10%, y después se redistribuyeron en pocillos de soporte de plástico. Se realizaron 4 condiciones de cultivo:
-
las células HepaRG se trataron con butirato de sodio 3,75 mM en el medio de mantenimiento desde el día siguiente del trasplante según el protocolo descrito por Blouin y col. (1995, Specialization switch in differentiating embryonic rat liver progenitor cells in response to sodium butyrate, Exp. cell res., 217:22-33). Después el medio se renueva cada 2-3 días,
-
las células HepaRG se trataron 5 días después del trasplante con butirato de sodio 3,75 mM o DMSO al 2%. El medio se renovó todos los días durante 5 días.
-
las células HepaRG se trataron en estado de alta confluencia con butirato de sodio 3,75 mM; el medio se renovó cada 2-3 días.
-
las células HepaRG se sembraron en soporte de plástico o en monocapa de células epiteliales primitivas biliares de rata en medio MEM alfa complementado con L-glutamina (2 mM), i-inositol (0,2 mM), ácido fólico (20 mM), \beta-mercaptoetanol (10^{-4} M), transferrina 200 \mug/ml, FCS al 12,5% y suero de caballo al 12,5%. En algunas situaciones se añadieron al medio citoquinas como LIF, IL-3, SCF o G-CSF. Este medio se renovó cada 2-3 días.
Inmunohistoquímica indirecta
Las células después de lavado con PBS se fijan con una disolución de paraformaldehído al 4% tamponada con cacodilato de sodio 0,1 M a pH 7,4, durante 20 minutos a 4ºC. Después se conservan en tampón de PBS hasta el momento del análisis.
Los sitios específicos se saturan durante 45 minutos con FCS-PBS al 10%. Las muestras después se tratan con los anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente en saponina al 0,05% en PBS. Después de 3 lavados en saponina al 0,05% en PBS, las muestras se incuban con el segundo anticuerpo acoplado a la peroxidasa. Después se realizan 2 lavados, después la actividad de peroxidasa se revela por incubación con 3,3'-diaminobencidina 0,4 mg/ml en una disolución de Tris 0,05 M a pH 7,6, H_{2}O_{2} al 0,01% hasta 110 volúmenes.
2. Resultados a/ Diferenciación hacia la ruta biliar (figura 12) Modificación morfológica
Antes de cualquier tratamiento y en la confluencia, las células HepaRG constituyen una población poco homogénea, en la que se encuentran células poligonales y células alargadas (figura 12).
En todas las condiciones de tratamiento en confluencia de células HepaRG con butirato de sodio, las células presentan la morfología particular de células biliares en cultivo (figura 12). Las células que se extienden y aumentan de tamaño presentan un citoplasma claro con un núcleo ovoide que contiene varios nucléolos. El contorno de las células en general está mal definido. A veces, se observan gotitas lipídicas. Cuando las células se tratan en confluencia muy alta, algunas células mueren. Estas células corresponden probablemente a las células ya comprometidas hacia la vía hepatocitaria.
También se ensayó el efecto del butirato en las células HepaRG con densidad baja y en fase activa de proliferación. Una característica de estas células es su capacidad de proliferar en presencia de una dosis alta de butirato de sodio (figura 13A). Durante la fase de proliferación, las células HepaRG forman una población homogénea de células de tipo epiteloide, en la confluencia presentan un aspecto de células epiteliales biliares.
Cambios fenotípicos
Las modificaciones morfológicas observadas en presencia de butirato de sodio se correlacionan con cambios fenotípicos (Blouin y col., 1995). Se usaron 4 marcadores de diferenciación por la ruta biliar, \gamma-glutamil transfereasa, cadena \alpha6 de las integrinas y citoquinas 7 y 19 que normalmente desaparecen cuando las células se dirigen hacia la ruta hepatocitaria. Para la diferenciación hacia la ruta hepatocitaria, se ha buscado un aumento de la expresión de la albúmina y una disminución de la expresión de la cadena \alpha1 de las integrinas.
En un primer momento se caracterizaron las células proliferantes no diferenciadas. Las células de la línea celular HepaRG presentan el siguiente fenotipo: expresión de c-kit, citoqueratinas 7 y 19, cadenas \alpha1 y \alpha6 de las integrinas, glutamil transferasa y albúmina, que sugieren que estas células son células ovaladas y/o células madre (véase el esquema de la figura 1).
Cuando las células se cultivan en presencia de butirato de sodio, expresan con más intensidad la \gamma-glutamil transferasa, conservando la expresión de la cadena \alpha6 de las integrinas y las citoquinas 7 y 19, demostrando su inicio hacia la ruta biliar. Cuando se cultivan en presencia de DMSO, inductor de la diferenciación hepatocitaria, se observa una desaparición de la expresión de las citoqueratinas 7 y 19, y de la cadena \alpha6 de las integrinas. Se expresan con un nivel menor la cadena \alpha1 de las integrinas y con mucha intensidad la albúmina, lo que confirma su diferenciación hepatocitaria. Siendo las poblaciones celulares heterogéneas en los cultivos, los fenotipos muy característicos solo se encuentran en las placas que se diferencian hacia una u otra de las rutas.
Los resultados obtenidos después de marcaje in situ de las células tratadas o no con butirato de sodio, se resumen en la siguiente tabla III.
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TABLA III Diferenciación ruta biliar/hepatocitaria
3 
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b/ Diferenciación hacia la ruta pancreática (figura 13B)
Como ilustra el esquema presentado en la figura 1, las células madre "ovaladas" de hígado son pluripotentes. Además de poder diferenciarse en células hepáticas, lo que se ha demostrado antes, tienen la capacidad de diferenciarse en otros tipos de células, uno de ellos es la célula pancreática acinar. Los autores de la invención han buscado si este potencial de diferenciación era una de las características de la línea HepaRG.
Cuando las células se siembran y cultivan en medio de cultivo MEM alfa, las células se adhieren y después se retraen para formar estructuras esferoides que sugieren la formación de redes canaliculares complejas, morfológicamente parecidas a los cultivos tridimensionales de las células epiteliales pancreáticas (Keer-Conte y col., 1996, Ductal cyst formation in collagen-embedded adult human islet preparations: a means to the reproduction of nesidioblastosis in vitro, Diabetes, 45: 1108-1114).
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Ejemplo 5
Infección de la línea celular por el VHB 1. Materiales y procedimientos Infección
La fuente infecciosa está constituida preferiblemente por el líquido sobrenadante de las células HepG2 del clon 2.2.15 concentrado 100 veces. En efecto, esta fuente infecciosa presenta la ventaja doble de que es inagotable y de calidad constante.
Las células usadas para la infección son células que se han cultivado según las condiciones definidas en el ejemplo 1 (presencia permanente de hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M) y que se ha mantenido durante una semana en confluencia, después durante 2 semanas en el mismo medio al que se había añadido DMSO al 2%.
Estas células se incubaron con la fuente infecciosa, diluida 10 veces, en medio de cultivo al que se había añadido PEG 8000 al 4% (Sigma), durante 20 horas a 37ºC. La segunda parte de este protocolo de infección por el VHB lo establecieron Gripon y col., 1993, Virologgy, 192: 534-540.
Los cultivos de control se incubaron con PEG al 4% y FCS al 25% diluido en una disolución salina de tampón fosfato (PBS).
Al final de la incubación, las células se lavan 3 veces con medio de cultivo y se mantienen en presencia de DMSO al 2% y hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M hasta su uso.
Se llevaron a cabo ensayos de neutralización antes de la infección incubando los virus con anticuerpos monoclonales de superficie de la hepatitis B (S39-10) durante 1 hora a temperatura ambiente.
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Detección del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HbsAg)
El antígeno HBs se ha detectado en el medio con ayuda del kit ELISA (Monalisa AgHBs plus®) de los laboratorios Biorad. Los resultados se expresan en pg/ml de líquido sobrenadante.
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Extracción del ADN vírico y análisis
Se aislaron los productos intermedios de replicación del ADN vírico en todos los lisados celulares. Las células se recuperan después del despegado con tripsina y después se lisan a 37ºC con un tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, SDS al 0,5%, 10 ml de EDTA pH 7,4, 10 ml de NaCl) al que se ha añadido proteínasa K (200 \mug/ml). El ADN celular precipitó en 12 h a 4ºC con NaCl 1 M. El líquido sobrenadante que contiene el ADN vírico se extrae. Las partículas víricas completas se aíslan del líquido sobrenadante celular por inmunoprecipitación con un anticuerpo policlonal anti-HBs (Dako, Francia). Finalmente, los ácidos nucleicos se extraen después de 12 h de lisis a 37ºC, en un tampón de lisis al que se ha añadido ARNt (40 \mug/ml) y proteínasa K (200 \mug/ml).
En todos los protocolos anteriores, el ADN se extrae con ayuda de fenol-cloroformo y se hace precipitar con isopropanol.
Los ácidos nucleicos se analizan por transferencia Southern en un gel de agarosa al 1,5%. Los marcadores de peso molecular son fragmentos de restricción del ADN del virus de la hepatitis B (3182 y 1504 pb). La hibridación se realiza según el protocolo de Gripon y col., véase antes.
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2. Resultados Pruebas de la infección
Se analiza el ADN vírico intracelular los 10 días siguientes a la infección.
La figura 10A presenta los efectos del PEG en la infectabilidad de las células. Se trata de un análisis por transferencia Southern de la cinética de aparición del ADN vírico intracelular después de infección de células HepaRG en presencia de PEG al 5% (+PEG) o en ausencia de PEG (-PEG). La posición de las formas de ADN relajado circular (RC) y superenrollado (CCC) se indican a la derecha de la figura. La posición de migración de los marcadores de peso molecular (fragmentos de genoma del virus de la hepatitis B) se indica a la derecha de la figura.
En ausencia de PEG, el perfil de ADN observado es idéntico al puesto de manifiesto por las partículas víricas presentes en el inóculo.
Sin embargo, esta señal desaparece progresivamente hasta hacerse casi indetectable el día 10 después de la infección. Además, no se detecta ninguna forma intermedia de replicación vírica en estas condiciones. En cambio, éstas están claramente presentes cuando las células son infectadas en presencia de PEG. Se observa una señal intensa inmediatamente después de la infección, con un perfil similar al observado en ausencia de PEG. Esto prueba que la penetración de las partículas víricas en las células es eficaz. En el segundo día, la señal se reduce mucho debido a la eliminación de numerosas partículas víricas, pero se puede observar una banda fina situada hacia los 2 kb. Esta banda corresponde a la del ADN ccc (ADN superenrollado cerrado). Las señales detectadas en posiciones intermedias corresponden al ADN vírico que nace y aumenta progresivamente hasta el 10º día.
En paralelo, se establece la cinética de la acumulación del ADN vírico. La figura 10B es un análisis por transferencia Northern de esta cinética después de infección de células HepaRG, se usan células HepG2 como control negativo de la infección vírica. El tamaño de los ARN se indica a la izquierda de la figura.
Las señales a 2,5 y 3,5 kb, correspondientes a las especies de ARN principales específicas del VHB, aparecen a los 2 días de la infección y se acumulan solamente en las células infectadas.
Con el fin de verificar la especificidad de las células HepaRG que se van a infectar, se ha llevado a cabo la infección de las otras dos líneas celulares de hepatomas, HepG2 y BC2, en condiciones idénticas. Estas dos líneas celulares se han seleccionado porque son capaces de diferenciarse. Se han cultivado en condiciones que les permiten acceder a un estado de diferenciación máximo, así como en las mismas condiciones que las usadas para las células HepaRG. Después de aproximadamente 12 h de incubación con las partículas víricas y PEG al 5%, se analizan el ADN vírico intracelular y el ARN vírico producidos. Inmediatamente después de la infección, se detecta una gran cantidad de ADN vírico en todas las líneas celulares, y sobre todo en las de HepaRG y BC2. En la medida en que el tratamiento de tripsina/EDTA elimina las partículas víricas adsorbidas en la superficie de las células, el ADN observado debe corresponder a partículas víricas que han penetrado en el interior de las células. La señal disminuye considerablemente en los 2 días siguientes a la infección. En cambio, 18 días después de la invención, solo la línea celular HepaRG presenta formas correspondientes a productos intermedios de la replicación vírica, el ADN ccc y las formas de ARN víricas. Esto demuestra que solo la línea HepaRG es capaz de ser infectada y de iniciar la replicación del virus.
La producción de partículas víricas se ha buscado en el líquido sobrenadante de células HepaRG infectadas. El antígeno HBs se ha dosificado por radioinmunología. La figura 11A representa una cinética de secreción del AgHBs en el líquido sobrenadante de células infectadas. Los líquidos sobrenadantes se recogieron durante 15 días después de la infección de las células Hepa RG (\blacksquare), HBG BC2 100 y HepG2 (\boxempty).
Se ha detectado una concentración alta de antígeno HBs en el líquido sobrenadante. La concentración de antígeno aumenta durante los 9 días después de la infección, y después se mantiene en un nivel alto. En cambio, en el líquido sobrenadante de las células HepG2 y BC2, el antígeno solo se ha detectado los 2 días después de la infección, lo que muestra que las partículas víricas han sido adsorbidas por las células, y después poco a poco liberadas en el medio.
Además, las partículas víricas completas presentes en el medio se han calculado por inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-HBs, seguido de análisis por transferencia Southern del ADN presente en el precipitado. La figura 11B presenta este análisis por transferencia Southern de la cinética de aparición del ADN vírico extracelular en el líquido sobrenadante de células HepaRG infectadas por el VHB. Después de inmunoprecipitación de las partículas víricas completas con un anticuerpo anti-HBs, se extrae el ADN vírico y después se analiza. La posición de migración de los marcadores de peso molecular (fragmentos de genoma del virus de la hepatitis B) se indica a la derecha de la figura.
Se observa una señal intensa 2 días después de la infección. Al 4º día ha disminuido mucho pero vuelve a aumentar poco a poco hasta el 8º día y se mantiene durante todo el periodo de cultivo. Este análisis cinético está de acuerdo con el modo de replicación del virus: después de un periodo de reagrandamiento de las partículas víricas que han penetrado la célula (durante 2 a 4 días), el virus empieza a replicarse activamente. El perfil observado difiere ligeramente del obtenido el 2º día.
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Neutralización in vitro de la infección
Con el fin de determinar si un anticuerpo monoclonal anti-S específico es capaz de neutralizar la infección de células, se incuban viriones con concentraciones variables de anticuerpos y después se ponen en contacto con las células. La infección residual se calcula en función de la secreción de antígeno HBs a largo plazo.
La figura 11C presenta este ensayo de neutralización vírico in vitro. Las partículas víricas se incuban con diluciones seriadas de anticuerpo monoclonal dirigido contra el antígeno HBs (anticuerpos S 39-10) 100 o un anticuerpo no relevante (\blacksquare) y se evalúa su infectividad en células HepaRG. El nivel de infección de estas células se calcula midiendo la secreción de antígeno HBs en el líquido sobrenadante de las células infectadas, 10 días después de la infección.
En esta figura se puede ver que concentraciones de 10 y 1 \mug/ml bloquean la infección vírica, mientras que concentraciones inferiores no inducen más que una inhibición parcial. Una inhibición de 50% corresponde a una concentración de 0,03 \mug/ml.
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Influencia del grado de diferenciación en la infección
Se ha estudiado la capacidad de las células HepaRG de ser infectadas en función de su grado de diferenciación. Con ayuda de los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 2, se ha modificado el programa de diferenciación de las células.
Se ha realizado una primera serie de infección en células mantenidas de forma continua en presencia de solo corticoide, y después en presencia de corticoide y diferentes concentraciones de DMSO, con el fin de inducir diferentes estadios de diferenciación. Los análisis realizados 2 semanas más tarde en el ARN vírico muestran una correlación entre la acumulación de 2 transcritos víricos principales y el nivel de diferenciación. La figura 10C presenta los efectos de la diferenciación hepatocelular en la infección por el VHB. Se trata de un análisis por transferencia Northern de los ARN víricos intracelulares después de infección de células HepaRG en presencia de concentraciones crecientes de DMSO.
Esta correlación se ha confirmado por una serie de experimentos efectuados en células infectadas en confluencia (antes de su diferenciación) y después puestas en condiciones óptimas para inducir su diferenciación. Los resultados se dan en la siguiente tabla IV:
4
El examen de esta tabla muestra que estas cantidades de antígeno HBs medidas son pequeñas cuando las células son infectadas antes del tratamiento con DMSO, lo que significa que una infección llevada a cabo en estas células poco diferenciadas es poco eficaz comparada con la llevada a cabo en células muy diferenciadas. Igualmente, una infección realizada en células mantenidas en un medio exento de corticoide (durante 10 pases) y después cultivadas durante 2 semanas en presencia o no de DMSO, demuestra también ser poco eficaz, en particular, para las células que no se han beneficiado de la acción del DMSO.
Finalmente, se ha comparado la eficacia de una infección realizada en células indiferenciadas que se multiplican activamente con la de células de crecimiento detenido y bien diferenciadas. Los resultados se dan en la siguiente tabla V:
TABLA V Efecto de la diferenciación celular en la infectabilidad de células HepaRG
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Los resultados muestran que una infección realizada en las células en fase de proliferación es ineficaz, incluso en presencia de corticoide y DMSO.
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Ejemplo 6
Uso de la línea celular HepaRG para evaluar la actividad antivírica de moléculas químicas o biológicas 1. Materiales y procedimientos
Las células se mantienen e infectan según los protocolos de los ejemplos 1 a 5.
El tratamiento antivírico por 3TC se administra a partir del 8º día y hasta el 15º día siguientes a la infección de células HepaRG, con las concentraciones finales de 0,1 y 10 \muM en el medio de cultivo. Cada 2 días se lleva a cabo la renovación completa del medio. Los líquidos sobrenadantes se almacenan a -20ºC y los sedimentos celulares a -80ºC.
Se ha detectado el antígeno vírico (HBs) en el líquido sobrenadante del cultivo usando el ensayo ELISA comercial ETIMAK-3® (SORIN).
El ADN vírico presente en el líquido sobrenadante del cultivo se ha podido detectar y cuantificar por el ensayo Amplicor-Monitor® (ROCHE). Los resultados se expresan en número de partículas víricas/ml. Para el análisis del ADN vírico intracelular, las células se despegaron con tripsina y se almacenaron a -80ºC. El ADN total se ha aislado según el protocolo descrito antes (Zoulim y col., 1998, Drug therapy for chronic hepatitis B virus replication. J. Hepatol. 29:151-168).
2. Resultados
El antígeno HBs se detecta en el líquido sobrenadante del cultivo después de 8 días de tratamiento con 3TC, quedando el valor constante cualquiera que sea la dosis e igual al control no tratado.
El ensayo Amplicor-Monitor® pone de manifiesto una disminución de la dosis dependiente de la cantidad de ADN vírico presente en las células HepaRG infectadas por el VHB después de 8 días de tratamiento con 3TC, con respecto a las células de controles infectadas por el VHB y no tratadas como muestran los resultados de la siguiente Tabla VI.
TABLA VI Actividad antivírica de 3TC
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Ejemplo 7
Uso de la línea celular HepaRG para evaluar el poder antiséptico de productos susceptibles de inactivar el VHB, por ejemplo, el agua de Javel 1. Materiales y procedimientos
1.1. Las células HepaRG se mantienen de acuerdo con los protocolos del ejemplo 1.
1.2 La infección se lleva a cabo en paralelo:
a)
sea con un inóculo nativo obtenido como se ha descrito antes a partir de células HepG2.2.2.15 cuya infectividad está documentada según el protocolo operatorio del ejemplo 5,
b)
sea con el mismo inóculo puesto en contacto con la disolución inactivante que se va a ensayar, aquí el agua de Javel.
El poder antiséptico dependerá de la concentración y del tiempo de contacto del producto con el inóculo. Se ha ensayado el agua de Javel con 2 concentraciones: 12º y 24º y dos duraciones de exposición: 15 s y 30 s como se detalla en el apartado siguiente.
Exposición del VHB del inóculo al agua de Javel.
- serie 1: Javel 12º durante 15 segundos
- '' 2: Javel 12º durante 30 segundos
- '' 3: Javel 24º durante 15 segundos
- '' 4: Javel 24º durante 30 segundos
- '' 5: H_{2}O destilada usada para diluir el virus: virus testigo
En tubos de ensayo de 4 ml se vierten 200 \mul de disolución madre de virus puro y después 200 \mul de agua de Javel. La reacción se para por adición de 1,6 ml de PBS (dilución a 1/10).
Eliminación del exceso de agua de Javel.
La preparación vírica anterior se trasvasa a tubos especiales (2 tubos por serie) y se ultracentrifuga a 4ºC de modo que el VHB precipite en el fondo.
El líquido sobrenadante que contiene el agua de Javel se aspira delicadamente. El pequeño volumen residual de los 2 tubos para cada dilución se mezcla y los sedimentos de virus se recuperan por homogeneización.
La suspensión vírica más o menos inactivada de cada serie se inócula en los cultivos de células HepaRG según las condiciones de operación idénticas al ejemplo 5.
1.3. Con el fin de poner de manifiesto la infección, se mide a la vez las proteínas y el ADN vírico.
El antígeno vírico (Ag HBs) se busca mediante un ensayo ELISA comercial (por ejemplo, ETI-MAK-3® de Sorin o también Monalisa Ag HBs plus® de Biorad) como se detalla en los ejemplos 5 y 6.
El ADN vírico se busca en la PCR en el líquido sobrenadante del cultivo y también se puede cuantificar por el ensayo Amplicor-Monitor® (ROCHE). Los resultados se expresan en equivalente de genoma vírico/ml. Para analizar el ADN vírico intracelular, las células se despegan con tripsina y se almacenan a -80ºC. El ADN total se aísla y la búsqueda de ADN específico del VHB se realiza según el protocolo descrito anteriormente (Zoulim, 1998).
2. Resultados
2.1. El inóculo de control sin agua de Javel permite obtener una producción de Ag HBs y de ADN vírico en el líquido sobrenadante, así como los perfiles característicos del ADN del VHB en las células, como se detalla en el ejemplo 5. Esta infección se ha obtenido con el virus puro y diluido hasta 1/10.
2.2. Con el inóculo expuesto a diferentes concentraciones de agua de Javel como se ha descrito antes, parece que después de un contacto de 15 ó 30 segundos con el agua de Javel a 12º, no se ha producido ninguna infección. Ocurre lo mismo con el agua de Javel a 24º (15, 305) y esto para una dilución del virus hasta 1/10.
3. Conclusiones
Por lo tanto, el ensayo en células HepaRG permite por primera vez ofrecer un modelo celular de infección in vitro del VHB susceptible de validar los procedimientos físicos (calentamiento, irradiación) o químicos (disoluciones detergentes/antisépticas o gas: peróxidos de ozono...) capaces de inactivar este virus contaminante principal implicado en las infecciones nosocomiales por los dispositivos e instrumentos medico-quirúrgicos.
En este ejemplo se ha ensayado una sola dilución. Los experimentos en desarrollo precisarán la sensibilidad del modelo y el número de logs de dosis infecciosas (expresado en logaritmo de base 10) que se pueden evaluar incluyendo las capacidades de las concentraciones de virus por ultracentrifugación/filtración/precipitación.
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Ejemplo 8
Construcción de un "chip de ADNc" a partir de la línea celular de HepaRG
Esta construcción implica las siguientes etapas:
-
Preparación de 2 mezclas de ARN totales, después purificación del ARN poliA a partir de, por una parte las células derivadas de la línea celular diferenciada HepaRG después de cultivo en medio que contiene hemisuccinato de hidrocortisona 10^{-5} M y después DMSO al 2%, y por otra parte de células no diferenciadas extraídas 5 días después de trasplante.
-
Preparación de los ADN complementarios, por transcriptasa inversa.
-
Realización de una hibridación sustractiva por supresión usando un kit comercial.
-
Clonación de los ADNc presentes en el banco sustractivo.
-
Ensayo de la representatividad del banco por secuenciación de un número limitado de ADNc.
-
Amplificación por PCR de los productos de los ADNc de interés usando cebadores universales presentes en el vector.
-
Aplicación en manchas puntuales de los productos de la PCR según uno de los procedimientos de tipo "micromatriz".
Así se podrá estudiar la expresión de 1000 a 2000 genes representativos de estados funcionales de la expresión de células hepáticas en diversas situaciones de interés.
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Ejemplo 9
Inoculación y cultivo de formas hepáticas de Plasmodium falciparum en la línea celular HepaRG
Hace algunos años se demostró que los hepatocitos humanos normales en cultivo primario representaban un sistema favorable para la supervivencia de Plasmodium falciparum y que éste podía soportar el ciclo hepático completo del parásito. Al contrario, los modelos de replicación en las células de hepatoma hasta ahora han fracasado.
La nueva línea celular de hepatoma HepaRG puede representar un avance importante por la observación en un ensayo de infestación de estas células por el parásito, de un ciclo completo de formación de esquizontes.
Materiales y procedimientos
Los esporozoitos de P. falciparum se preparan a partir de mosquitos Anopheles stephensi infectados por ingestión de células sanguíneas, ellas mismas infectadas por las formas eritroides del parásito, los gamtocitos.
Aproximadamente 2 semanas después de la ingestión infecciosa, se diseccionan las glándulas salivares infectadas en condiciones asépticas y se recogen en medio de cultivo.
Estas suspensiones, 10 pares de glándulas salivares por 100 ml de medio, se añaden a los cultivos de células HepaRG.
Las células usadas para la infestación se cultivaron según las condiciones definidas en el ejemplo 1 (en presencia permanente de hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M) y se mantuvieron durante 1 semana en confluencia, y después durante 2 semanas en el mismo medio al que se había añadido DMSO al 2%.
En el momento de la infestación son confluentes y están completamente diferenciadas por el tratamiento con corticoide/DMSO descrito en los ejemplos 1 a 4.
El periodo de exposición o inoculación es de aproximadamente 3-4 h y se realiza en el mismo medio exento de DMSO. Después, se añade medio a los cultivos y se renueva cada 2-3 días.
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Detección de parásitos
Las preparaciones se lavan con PBS y después se fijan y colorean con colorante de May-Grunwald Giemsa. Los parásitos intracelulares tienen una localización citoplasmática. Aparece claramente la formación característica de esquizontes. Estos esquizontes presentan al principio un pequeño número de núcleos, y después se agrandan con un número de núcleos mucho mayor, demostrando la realización de un proceso de replicación completo.
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Optimización del protocolo de infestación
El plasmodium falciparum, parásito muy frágil, resultó muy sensible al DMSO. Los resultados que muestran una mayor eficacia se obtuvieron retirando el DMSO del medio de cultivo durante el periodo de inoculación.
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Ejemplo 10
Infección con células hepaRG de un ratón
Se pueden inyectar células HepaRG a un animal de laboratorio inmunodeprimido, tal como un ratón sin sistema inmune, con el fin de obtener un modelo de estudio in vivo.
Esta inyección en el ratón permite que las células hepaRG encuentren un entorno favorable para su proliferación y diferenciación. Esto conduce a la formación de una masa importante de células diferenciadas. Teniendo en cuenta el carácter pluripotente de las células hepaRG, estas células experimentarán diferentes diferenciaciones según el sitio de implantación de las células (células hepáticas, pancreáticas...). Esta inyección permite así reconstruir un órgano de tipo hepático o pancreático en un animal que presenta una alteración de dicho órgano (véase el artículo de M. Dandry y col., 2001, 33:981-988, Hepatology, Repopulation of mouce liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus).
Este modelo permite no solo el estudio de funciones del hepatocito humano en un organismo animal entero, sino también el estudio de la infección de células hepáticas humanas por virus y/o parásitos hepatotropos en el seno de un modelo animal.
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Ejemplo 11
Infección de la línea celular por el VHC 1. Materiales y procedimientos Infección
Las fuentes infecciosas se obtienen de sueros de pacientes infectados por el VHC. Actualmente se trata de la única fuente de virus disponible puesto que hasta ahora no se ha podido desarrollar ningún modelo de producción de virus. Se ensayaron 5 sueros. Los virus de 2 sueros (nº 2 y 4) tienen un genotipo 1b y el del suero nº 3 es un virus de genotipo 3. No se realizó el genotipado en dos de los sueros usados, se trata de los sueros nº 1 y 5.
Las células usadas para la infección se cultivaron según las condiciones definidas en el ejemplo 1 (en presencia permanente de hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M) y se mantuvieron durante 1 semana en confluencia, y después durante 2 semanas en el mismo medio al que se había añadido DMSO al 2%.
Estas células se incuban durante 48 horas a 37ºC con la fuente infecciosa, se diluyen 10 veces en medio de cultivo exento de FCS y se añade de forma opcional PEG 8000 (Sigma).
Para los controles, se incubaron cultivos en condiciones idénticas pero esta vez el suero usado se obtiene de un paciente no infectado por el VHC.
Al final de la incubación, las células se lavan 3 veces con medio de cultivo y se mantienen en presencia de DMSO al 2% y hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M hasta su uso.
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Extracción de los ARN víricos intra y extracelulares y análisis
Se han aislado las formas replicativas de los ARN víricos intracelulares en todos los lisados celulares. Las células se recuperan después de despegado con tripsina, y después se extrae el ARN total con ayuda del kit kit High Pure RNA Isolation (Roche). La cantidad de ARN total extraído se calcula por densidad óptica con el fin de normalizar las diferentes muestras. La calidad y homogeneidad del ARN se examinan visualizando los ARN ribosómicos (ARNr: 28S y 18S) en un gel de agarosa con coloración con bromuro de etidio al 1%. Los ARN de las partículas víricas se extraen del líquido sobrenadante del cultivo con ayuda del kit High Pure viral RNA (Roche).
Se sintetiza por retrotranscripción (RT) el ADN complementario (ADNc) de los ARN víricos de polaridad positiva, a partir de un cebador específico que hibrida en 5' de la región que codifica la proteína de la cápsida vírica. Este oligonucleótido (5'-TTTGAGGTTTAGGATTYGTGCTCAT-3') deriva del descrito por Martell y col., 1999, Journal of Clinical Microbiology, 37:327-332, denominado C-342. Después el ADN se amplifica por la técnica de la "Reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) usando dos cebadores que hibridan en la región 5' no traducida del genoma vírico. Los cebadores usados son los siguientes: el oligonucleótido homosentido (5'-TGAGTGTCGTRCAGCCTCC-3'), y el oligonucleótido antisentido (5'-ACCACAAGGCCTTTCGCRACCCAC-3') que corresponde al concebido por Mercier y col., 1999, Journal of Virological Methods, 77:1-9, denominado NCR- 3. El producto de las amplificaciones (amplicón de 190 pb) se visualiza en un gel de agarosa al 2% coloreado con bromuro de etidio. Se deposita también un marcador de peso molecular de ADN (M) con el fin de verificar la identidad del amplicón por su tamaño. La eficacia de las diferentes etapas se controla siempre detectando el ARN vírico presente en un patrón (T+), que corresponde a un suero diluido obtenido de un paciente infectado. Igualmente, la ausencia de cualquier contaminación se verifica sistemáticamente en los estadios de retrotranscripción (RT) y de amplificación (PCR) sustituyendo las muestras por agua (T-).
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2. Resultados Prueba de la infección
La figura 14 presenta el análisis de infectabilidad de células HepaRG por virus obtenidos de 5 sueros ensayados. Se trata de una investigación de la presencia de ARN vírico a la vez en los compartimentos extracelulares e intracelulares por RT-PCR después de infección de las células en presencia de PEG 8000. El ARN vírico se busca el 12º día después de la infección. La posición del amplicón se indica a la derecha de la figura. Los ARNr se muestran después de homogeneización de las muestras, en la parte inferior de la figura donde la posición de los ARN 28S y 18S se indica a la derecha.
Cuando se usa un inóculo desprovisto de virus (suero VHC-) no se detecta ningún ARN vírico ni en los líquidos sobrenadantes de los cultivos ni en las células. A pesar del origen de la línea celular que se ha seleccionado a partir de un tumor de hígado extraído de un paciente que padece una hepatitis C vírica, no hay replicación vírica residual detectable en las HepaRG.
La técnica semicuantitativa de detección por RT-PCR permite poner de manifiesto la presencia de señales no solo en el compartimento intracelular sino también en los líquidos sobrenadantes de los cultivos cualquiera que sea el suero usado (sueros nº 1 a 5). Estos resultados se traducen en el establecimiento de una replicación del VHC en las células HepaRG que desemboca en una secreción eficaz de los viriones por las células.
Para confirmar que se establece una replicación vírica en las células HepaRG después de su infección, se ha estudiado la sensibilidad de la replicación del VHC a un antiviríco, el interferón \alpha. Las células se inocularon durante 48 horas en presencia de PEG 8000 con suero nº 4 que contiene virus. Se usa un suero desprovisto de VHC como control negativo de la infección vírica. La citoquina (Introna®, Schering-Plough, Francia) se añade al medio de cultivo a partir del final del 6º día y hasta el 12º día después de infección de las células, en las concentraciones finales de 5, 50 o 500 U.I./ml. Se realiza una renovación completa del medio todos los días. Los líquidos sobrenadantes se almacenan a -80ºC para el análisis cinético.
La figura 15 muestra la incidencia de la presencia del interferón \alpha el día 12º después de la exposición de las células a la fuente infecciosa, frente a la cantidad de ARN vírico detectable en las células y los líquidos sobrenadantes. La posición del amplicón se indica a la derecha de la figura. Los ARNr se muestran después de homogeneización de las muestras en la parte inferior de la figura donde la posición de los ARN 28S y 18S se indica a la derecha. Desde la dosis menor (5 U.I./ml) se demuestra una disminución de más de 60% de la señal intracelular después de los 6 días de tratamiento y se obtiene una desaparición completa de la señal en el medio extracelular.
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Cinética de replicación del VHC y de su inhibición por el interferón \alpha
Se ha establecido una cinética de replicación del VHC y de su inhibición por el interferón \alpha y se presenta en la figura 16. La presencia de ARN vírico en los líquidos sobrenadantes se ha buscado en paralelo en un cultivo de referencia no tratado (v) y en un cultivo en el que la citoquina está presente en el medio en 5 U.I./ml, concentración cuya eficacia se ha verificado previamente (Figura 15), a partir del final del 6º día después de la infección y hasta el 12º día después de la exposición a la fuente infecciosa (o).
El análisis de la extracción realizada al final del 2º día después de la infección (v, D2) muestra una señal intensa. Este fenómeno debe corresponder a una separación de los virus del inóculo que en un primer momento han sido adsorbidos sobre o internalizados en las células. Después, la señal constante detectada desde el 4º día después de la infección (v, D4 a D12) se traduce en una replicación activa del virus que da lugar a una secreción constante de viriones en el periodo estudiado. La primera parte de la cinética realizada en los cultivos incubados en presencia de interferón \alpha es idéntica a la realizada en ausencia de antiviríco (comparar v y o de D2 a D8). Esto permite afirmar que se ha establecido una replicación en las células HepaRG antes del tratamiento. Al contrario, después de 4 días de incubación con la citoquina, no se ha detectado ningún ARN vírico extracelular y hasta el final del tratamiento (o, D10 a D12). Por lo tanto, la acción inhibidora del interferón \alpha observada in vivo se reproduce bien en las células HepaRG infectadas por el VHC y se produce después de un tiempo de tratamiento mínimo de 2 días.
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Ejemplo 12
Infección de la línea celular por los parásitos del género Leishmania
Las leishmaniosis son enfermedades secundarias de la infección por un parásito del género Leishmania. La presencia clínica de estas infecciones va desde la infección cutánea localizada a una infección diseminada en el transcurso de la cual los principales órganos infectados son los ganglios, la médula ósea, el bazo y el hígado. Las leishmaniosis se transmiten en forma de promastigote flagelado por un díptero hematófogo, el flebotoma, y se convierten rápidamente en intracelulares en su huésped. Las células actualmente descritas como permisivas a la lehismania son células del sistema de fagocitos mononucleados. Sin embargo, recientemente un ensayo de infección de hepatocitos ha puesto de manifiesto la permisividad de este tipo de células, abriendo perspectivas de investigación para comprender mejor la fisiopatología de la infección y evaluar nuevas dianas terapéuticas.
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1. Materiales y procedimientos Infección
Las promastigotes de Leishmania major, L. donovani, L. infantum, L. tropica, L. braziliensis y L. guyanensis, usados son cepas aisladas de pacientes, identificadas por el procedimiento isoenzimático de referencia y crioconservadas en nitrógeno líquido. La obtención de un inóculo necesita al menos 2 fases de amplificación sucesivas en medio gelificado Novy-McNeal-Nicolle con sangre de conejo añadida y después en medio de Schneider con FCS al 10% añadido.
Las células usadas para la infección se han cultivado según las condiciones definidas en el ejemplo 1 (en presencia permanente de hemisuccinato de hidrocortisona 5.10^{-5} M) y se mantuvieron durante 1 semana a confluencia, y después durante 2 semanas en el mismo medio al que se había añadido DMSO al 2%.
Estas células se incuban durante 18 horas a 37ºC con los promastigotes de leishmania, después se lavan 3 veces con medio de cultivo y se mantienen en presencia de DMSO al 2% y de hemisuccinato de hidrocortisona 5 M.
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Detección de parásitos intracelulares
El control y la cuantificación de la infección se hacen mediante microscopio óptico. Las células se recuperan después de tripsinización de los pocillos y 2 lavados con PBS, se citocentrifugan durante 10 minutos a 9000 revoluciones/minuto, y después se fijan y colorean mediante el colorante de May-Grunwald Giemsa. Los parásitos intracelulares en forma amastigótica tienen una localización citoplasmática, miden 3x6 micrómetros y son fácilmente localizables gracias a su estructura que comprende un citoplasma azulado y un núcleo y cinetoplasto violetas. El número de células infectadas y el número total de parásitos encontrados se calculan para un número medio de 4000 hepatocitos leídos.
2. Resultados Prueba de la infección
La figura 17 presenta las cinéticas de infección observadas con una cepa de L. donovani y una cepa de L. major para relaciones de infección de 25 parásitos por célula. Así pues, las células son infectables con una cepa hepatotrópica (L. donovani) pero también con una cepa dermatrópica (L. major). El número de amastigotes de L. donovani por 100 células está comprendido entre 7 y 45 para 4000 células leídas (de 0,175% a 1,125%), correspondiente a un porcentaje de células infectadas comprendido entre 0,1 y 0,55%. El número de amastigotes de L. major por 100 células está comprendido entre 6 y 38 para 4000 células leídas (de 0,15% a 0,725%), correspondiente a un porcentaje de células infectadas comprendido entre 0,1 0,375%.
Optimización del protocolo de infección
Un primer experimento ha estudiado el efecto de la "duración del cultivo" en el número total de parásitos y el número de células infectadas. Los resultados de este trabajo realizado con células infectadas por L-major (relación de infección = 25 parásitos por célula) se presentan en la figura 18.
Un segundo experimento concernía al estudio del efecto de "inóculo" en el nivel de infección de las células. Se ha inoculado sucesivamente L. major en las células con relaciones de 6, 12, 25, 50, 100 y 200 parásitos por célula. Los resultados de los cultivos el D7 se presentan en la figura 19 y muestran que el número de parásitos por 100 células variaba de 2 a 218 para 4000 células leídas (de 0,05% a 5,45%), correspondiente a un porcentaje de células infectadas que va de 0,05% a 1,6%.
En resumen, parece que la relación de infección por L. major es de 100 parásitos por célula, y que la cuantificación de la infección parasitaria es óptima entre D4 y D7.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet US 4393133 A [0005]
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Claims (8)

1. Línea celular de hepatomas como la depositada el 5 de abril de 2001 en el CNCM, con el nº I-2652.
2. Procedimiento de infección de células hepáticas por un parásito hepatotropo y/o un virus, con una fase de selección que comprende una fase de proliferación celular en un medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación de hepatocitos humanos normales, después, tras alcanzar la confluencia, una fase de diferenciación celular en el mismo medio por adición de DMSO en cantidad suficiente para inducir la diferenciación,
repitiéndose este procedimiento varias veces, preferiblemente 3 veces, si se desea,
estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende
-
una fase de diferenciación que permite que las células alcancen una morfología próxima a la del hepatocito con ayuda del medio de cultivo que comprende al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación de los hepatocitos humanos normales, con DMSO añadido en cantidad suficiente para inducir una diferenciación,
-
una fase de infección con incubación de células hepáticas con el parásito hepatotropo y/o un virus, en un medio de cultivo que comprende al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación de los hepatocitos humanos normales, a los que se ha añadido la fuente infecciosa.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque los medios usados comprenden insulina, en una relación de 2,5 \mug/ml a 10 \mug/ml para favorecer la supervivencia de los hepatocitos humanos normales.
4. Procedimiento de transfección de la línea celular según la reivindicación 1, con ayuda de un vector que comprende la secuencia completa y/o una parte del material genético de los virus del VHB y/o VHC.
5. Procedimiento de selección de alto caudal de genes expresados de forma diferencial con ayuda de una herramienta de tipo chip producida a partir la línea celular según la reivindicación 1, expresándose estos genes de forma diferencial bajo el efecto de las condiciones de cultivo, exposición a una molécula y/o un virus y/o un parásito.
6. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para ensayos metabólicos y/o de toxicidad dirigidos a la evaluación de nuevos medicamentos y/o de constituyentes nutricionales y/o de contaminantes del entorno.
7. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para la fabricación de un biorreactor extracorpóreo para tratar transitoriamente las insuficiencias hepatocelulares agudas.
8. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para selección y/o fabricación de nuevas vacunas y/o de moléculas antivíricas, en particular para la selección de moléculas activas frente a una de las etapas del ciclo vírico.
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