ES2342152T3 - Metodo para identificacion de un compuesto para modulacion de la cascada de señales wnt. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de identificación de un compuesto para modular la cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de fijación a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que comprende: (a) poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto a cribar; y (b) determinar si el compuesto afecta a una actividad de dicho polipéptido o si se ha producido fijación del compuesto a dicho polipéptido.
Description
Método para identificación de un compuesto para
modulación de la cascada de señales Wnt.
La presente invención se refiere a un método
para identificación de un compuesto para modulación de la cascada de
señales Wnt que está basado en la identificación de una pareja de
fijación, activador/agonista o inhibidor/antagonista de Kremen 1 y/o
Kremen 2.
La tumorigénesis representa un proceso complejo
multietápico en el cual se cree que cambios genéticos y factores
ambientales desregulan los procesos celulares que controlan la
proliferación y diferenciación celular. Entre otras, la cascada de
señales Wnt juega un papel crucial en lo que respecta a la
regulación de la proliferación y diferenciación de las células
durante la embriogénesis, como se muestra, v.g., en
Drosophila, Xenopus y ratones (Nusse y Varmus, Cell
69 (1992), 1073-1087). Los genes Wnt
codifican glicoproteínas secretoras que activan una cascada de
señales bien caracterizada por la vía de un receptor Wnt denominado
"frizzled (rizado)". Ejemplos más notables de efectores de esta
cascada de señales son beta-catenina y el gen
supresor de tumores APC (Miller y Moon, Genes Dev. 10 (1996),
2527-2539). Varios estudios indican que una cascada
de señales Wnt aberrante podría estar implicada en el desarrollo del
cáncer de colon, el cáncer de mama y el melanoma (Pfeifer, Science,
275 (1997), 1752-1753; Polakis, Genes Dev.
14 (2000), 1837-1851). El primer gen
codificante de una proteína de la cascada de señales Wnt,
int-1, se aisló a partir del virus del tumor
mamario del ratón (MMTV) y pudo demostrarse que se trata de un
oncogén. Se supone que una regulación aberrante de la actividad de
Wnt y/o componentes de la cascada de señales Wnt aguas abajo de la
señal Wnt, v.g., beta-catenina y APC, están
implicados en la tumorigénesis. En estudios recientes, pudo
identificarse una nueva familia de genes, Dkk ("Dickkopf"), que
actúan como inhibidores de Wnt.
DKK1 fija e inhibe el correceptor de Wnt LRP 5/6
(Zorn, Curr. Biol. 11 (2001), R592-595) pero
por lo demás, se conoce acerca del mecanismo de modulación de la
cascada de señales Wnt por Dkk.
WO 00/77239A describe una proteína (TANGO 202)
que comprende 475 aminoácidos, siendo los primeros 473 aminoácidos
idénticos a Kremen 1 sin describir función biológica alguna de esta
proteína. WO 02/02603A describe una proteína
(PMMM-6) que presenta cierta identidad con Kremen 2.
Sin embargo, sin embargo, su función biológica no se describe.
De acuerdo con ello, medios para la terapia o
diagnosis de enfermedades asociadas con una cascada de señales Wnt
dis-regulada no estaban disponibles. Así, el uso de
marcadores moleculares fiables de diagnóstico podrían ser útiles
para una comprensión de la base molecular de enfermedades asociadas
con una cascada de señales Wnt aberrante, v.g. tumores, v.g., para
distinguir tejido benigno de tejido maligno. Adicionalmente, la
señalización de Wnt está implicada en la fibrosis renal (Surendran,
Am. J. Physiol Renal Physiol 282 (2002)
431-441), la enfermedad de riñón poliquístico
(Saadi-Kheddouci, Oncogene 20 (2001)
5972-5981) y el receptor de Dkk LRP5 está implicado
en el síndrome del trastorno autosómico recesivo
osteoporosis-pseudoglioma (que afecta a los huesos y
los ojos (OPPG; Gong, Cell (2001) 107,
513-523). Puede esperarse que tales marcadores sean
útiles también para terapia y para el desarrollo de nuevas vías
terapéuticas para el tratamiento de enfermedades dependientes de la
cascada de señales Wnt, v.g. tumores o enfermedades de los riñones,
huesos y ojos.
Así, el problema técnico que subyace en la
presente invención es proporcionar un ensayo para identificar un
compuesto útil para la terapia de enfermedades asociadas con una
cascada aberrante.
La solución a dicho problema técnico se consigue
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones. Durante los experimentos que han conducido a la
presente invención, pudieron identificarse dos genes, Kremen 1 y
2, cuyos productos se fijan con afinidad alta a los polipéptidos
Dkk1 y Dkk2. Pudo demostrarse que esta fijación tiene importancia
fisiológica dado que la cotransfección de células con dkk1
así como Kremen 1 y 2 da como resultado una inhibición
sinérgica de la activación de la cascada de señales Wnt. Estos datos
demuestran que Kremen (1 y 2) puede considerarse como un receptor
para los polipéptidos Dkk y que la función biológica de
Kremen es la mediación de la inhibición de la cascada de
señales Wnt por polipéptidos Dkk. Los datos obtenidos proporcionan
evidencia de que la expresión de Kremen es muy compleja y que
los genes que codifican kremen están implicados en una diversidad de
funciones biológicas y podrían tener actividad supresora de tumores.
Así pues, Kremen es útil para la diagnosis y el desarrollo de
terapias para enfermedades mediadas por Wnt. Puede esperarse que,
v.g., la inhibición de la cascada de señales Wnt por aumento de la
expresión de kremen y/o por estimulación de la actividad del
polipéptido propiamente dicho podría tener efecto terapéutico. Por
otra parte, el receptor Kremen (o el gen que codifica el mismo)
puede considerarse como un fármaco diana que permite la
identificación de compuestos útiles para terapia.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Alineación multisecuencia de ácido
nucleico de cDNAs que codifican Kremen 1 (kremen1) y 2 (kremen2) de
ratón y humanos
hkremen1 y 2 se deducen de la secuencia del
genoma humano en bases de datos públicas. Los nucleótidos idénticos
se hacen resaltar en negro.
Figura 2: Alineación multisecuencia de
aminoácidos de proteínas Kremen 1 y 2 deducidas de cDNAs de ratón y
humanos (véase Figura 1)
Los aminoácidos idénticos se hacen resaltar en
negro, y los aminoácidos similares se representan en gris.
Figura 3: Kremen es un receptor de afinidad
alta para Dkk1 y Dkk2
Se transfectaron células 293T con plásmidos de
expresión dirigidos por el promotor del citomegalovirus (CMV) que
codificaban mkrm1 (superior) o mkrm2 (inferior) como
se indica, se incubaron con Dkk1-AP,
Dkk2-AP o Dkk3-AP recombinantes, y
se tiñeron respecto a actividad fijada de AP. ARRIBA: Curvas de
fijación y análisis Scatchard de la fijación de proteínas de fusión
DKK-AP a células mkrm2 transfectadas. ABAJO:
Curvas de fijación para la fijación de Dkk-APs a
células mkrm1 transfectadas. Se indican las constantes de
disociación (K_{d}); a, c: Curvas de fijación; b, d, e: Análisis
Scatchard.
Figura 4: Kremen y Dkk1 inhiben
sinérgicamente la cascada de señales Wnt
Se transfectaron células de riñón 293 con el
informador Wnt (TOP-FLASH) con o sin los genes
indicados. Dos días después de la transfección, se determinó la
actividad de luciferasa expresada. RLU: unidades relativas de luz
(normalizadas contra luciferasa cotransfectada de Renilla).
Xdkk1 = dkk1 de Xenopus; mkrm1,2 = Kremen 1,2 de ratón; wnt = Wnt1
de ratón, fz = frizzled8 de ratón; Irp6 = Irp6 humano.
Figura 5: Expresión de kremen en los
ratones
La expresión de kremen 1 y kremen
2 se analizó por RT-PCR, en diversos tejidos de
ratones adultos. Los resultados se normalizaron utilizando expresión
constitutiva de la histona H4. Abreviaturas: -RT = muestra de
control en la cual se omitió la transcriptasa inversa; sk muscle =
músculo esquelético; mam. gland = glándula mamaria; H4 = Histona 4
como control de carga; mkrm1,2 = kremen 1,2 de ratón.
La presente invención se refiere a un método
in vitro de identificación de un compuesto para modular la
cascada de señales Wnt que está basado en la identificación de una
pareja de fijación a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que
comprende:
- (a)
- poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto a cribar; y
- (b)
- determinar si el compuesto afecta a una actividad de dicho polipéptido o si se ha producido fijación del compuesto a dicho polipéptido.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"polipéptido Kremen 1" y "polipéptido Kremen 2" se refiere
no sólo a polipéptidos codificados por la secuencia de nucleótidos
que se representa en Figura 1 y/o 2 sino también a polipéptidos que
difieren en secuencia de amino-ácidos debido a inserción, deleción
y/o sustitución de uno o más aminoácidos y que muestran al menos una
actividad biológica de un receptor de Kremen 1 y/o Kremen 2, v.g. la
capacidad de transducción de señales después de fijación de
ligandos. Preferiblemente, los polipéptidos referidos son
polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos exhibe una identidad de
al menos 40%, en particular una identidad de al menos 65%,
preferiblemente al menos 80% y, de modo particularmente preferido,
al menos 90% con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos
codificados por las secuencias de nucleótidos que se muestran en
Figura
1 ó 2.
1 ó 2.
El término "ligando", como se utiliza en
esta memoria, hace referencia a cualquier molécula que sea capaz de
fijarse específicamente a Kremen 1 y/o Kremen 2, permitiendo así
determinar el nivel de moléculas receptoras. Ejemplos de tales
moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas o
moléculas pequeñas. La molécula puede ser el ligando natural de
Kremen, es decir Dkk1 o Dkk2, o puede estar estrechamente
relacionada con dicho ligando, v.g. un fragmento del ligando, o un
sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional;
véase, v.g., Coligan, Current Protocols in Immunology 1 (2) (1991);
capítulo 5. En cualquier caso, la molécula puede aislarse o
diseñarse racionalmente utilizando técnicas conocidas; véase también
abajo.
Preferiblemente, el ligando es un anticuerpo. El
término "anticuerpo", se refiere preferiblemente a anticuerpos
que están constituidos esencialmente por anticuerpos monoclonales
agrupados con especificidades epitópicas diferentes, así como
preparaciones de anticuerpos monoclonales distintas. Los anticuerpos
monoclonales se producen a partir de un antígeno que contiene
fragmentos de Kremen 1 o Kremen 2 por métodos bien conocidos para
los expertos en la técnica (véase, V.g., Köhler et al.,
Nature 256 (1975), 495). Como se utiliza en esta memoria,
debe entenderse que el término "anticuerpo" (Ab) o
"anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye tanto moléculas intactas
como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos
Fab y F(ab')2) que son capaces de fijarse específicamente a
Kremen. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fe
del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la
circulación, y pueden tener menos fijación de tejido inespecífica
que un anticuerpo intacto. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:
316-325 (1983)). Así pues, se prefieren estos
fragmentos, así como los productos de una biblioteca de expresión de
FAB u otra inmunoglobulina. Además, los anticuerpos de la presente
invención incluyen anticuerpos quiméricos, monocatenarios, y
humanizados.
Para ciertos propósitos, v.g. métodos de
diagnóstico, la molécula de ácido nucleico utilizada como sonda o el
ligando, v.g., anticuerpo, puede marcarse detectablemente, por
ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un
compuesto quimiolumíniscente, un compuesto fluorescente, un quelato
metálico, o una enzima.
Así, la presente invención se refiere a un
método para identificar una pareja de fijación a un polipéptido
Kremen 1 y/o 2 que comprende:
- (a)
- poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto a cribar; y
- (b)
- determinar si el compuesto afecta a una actividad del polipéptido.
La invención incluye también un método de
identificación de compuestos que se fijan a un polipéptido Kremen 1
y/o Kremen 2 que comprende los pasos de:
- (a)
- incubar un compuesto de fijación candidato con dicho polipéptido; y
- (b)
- determinar si se ha producido fijación.
Los polipéptidos Kremen 1 ó 2 pueden utilizarse
para cribado en busca de proteínas u otros compuestos que se fijan a
Kremen 1 ó 2 o en busca de proteínas u otros compuestos a los cuales
se fijan Kremen 1 y 2. La fijación de Kremen 1 ó 2 y la molécula
puede activar (agonista), aumentar, inhibir (antagonista), o reducir
la actividad de Kremen 1 o Kremen 2 o la molécula fijada. Ejemplos
de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas
(v.g., ligandos), o moléculas pequeñas.
Preferiblemente, la molécula está estrechamente
relacionada con el ligando natural de Kremen 1 ó 2, v.g. un
fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un
mimético estructural o funcional; véase, v.g., Coligan, Current
Protocols in Immunology 1 (2) (1991); capítulo 5.
Preferiblemente, el cribado para estas moléculas
implica la producción de células apropiadas que expresan Kremen 1
y/o 2, sea como una proteína secretada o en la membrana celular.
Células preferidas incluyen células de mamíferos, levaduras,
Drosophila, o E. coli. Las células que expresan Kremen 1 y/o
2 (o membrana celular que contiene el polipéptido expresado) se
ponen en contacto luego preferiblemente con un compuesto de test que
contiene potencialmente la molécula para observar la fijación,
estimulación, o inhibición de la actividad de Kremen 1 y/o 2.
El ensayo puede testar simplemente la fijación
de un compuesto candidato a Kremen 1 y/o 2, en donde la fijación es
detectada por un marcador, o en un ensayo que implica competición
con un competidor marcado. Adicionalmente, el ensayo puede testar si
el compuesto candidato da como resultado una señal generada por
fijación a Kremen 1 y/o Kremen 2. Ensayos adecuados para analizar la
actividad de Kremen 1 y/o 2 incluyen ensayos informadores de
luciferasa inducibles por Wnt en células HEK 293 transfectadas,
donde dkk1 produce sinergia con Kremen 1 y/o 2 para inhibir una
señal inducida por Wnt1, tal como se muestra en la Figura 4.
Alternativamente, el ensayo puede llevarse a
cabo utilizando preparaciones exentas de células,
polipéptido/molécula fijado a un soporte sólido, bibliotecas de
productos químicos, o mezclas de productos naturales. El ensayo
puede comprender también simplemente los pasos de mezclar un
compuesto candidato con una solución que contiene Kremen 1 y/o
Kremen 2, medir la actividad o fijación Kremen/molécula, y comparar
la actividad o fijación Kremen/molécula con un estándar.
Preferiblemente, un ensayo ELISA puede medir el
nivel de actividad de Kremen 1 y/o Kremen 2 en una muestra (v.g.,
muestra biológica) utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal.
El anticuerpo puede medir el nivel o la actividad de Kremen 1 y/o
Kremen 2 por fijación, directa o indirecta, a Kremen 1 y/o Kremen 2
o por competición con Kremen 1 y/o Kremen 2 por un sustrato. La
totalidad de estos ensayos anteriores pueden utilizarse como
marcadores de diagnóstico o pronóstico. Las moléculas descubiertas
utilizando estos ensayos pueden utilizarse para tratar enfermedades
o para producir un resultado particular en un paciente (v.g., la
eliminación de un tumor, soporte de procesos regenerativos, etc.)
por modulación, preferiblemente activación de la molécula Kremen 1
y/o Kremen 2. Además, los ensayos pueden descubrir agentes que
pueden inhibir o intensificar la producción de Kremen 1 y/o Kremen 2
por células o tejidos manipulados convenientemente.
Además, la invención incluye un método de
identificación de activadores/agonistas o inhibidores/antagonistas
de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, que comprende los pasos
de:
- (a)
- incubar un compuesto candidato con dicho polipéptido;
- (b)
- ensayar una actividad biológica, y
- (c)
- determinar si se ha alterado una actividad biológica de dicho polipéptido.
Ensayos adecuados incluyen análisis de la
formación de un complejo ternario entre Kremen 1 o Kremen 2 con la
proteína Dkk1 recombinante y el dominio recombinante extracelular de
LRP6.
Se describe adicionalmente un método de
identificación y obtención de un fármaco candidato para terapia de
enfermedades asociadas con (a) expresión aberrante de Kremen
1 y/o Kremen 2 y/o (b) actividades o cantidades
aberrantes de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, que comprende
los pasos de:
- (a)
- poner en contacto un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 o una célula que expresa dicho polipéptido, y opcionalmente el o los ligandos correspondientes, en presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta a la fijación a dicho fármaco candidato a cribar; y
- (b)
- detectar la presencia o ausencia de una señal o el aumento de la señal generada, en donde la presencia o aumento de la señal es indicativa de un fármaco supuesto.
Ensayos adecuados para analizar la actividad de
Kremen 1 y/o 2 incluyen ensayos informadores de luciferasa inducible
por Wnt en células HEK 293 transfectadas, donde dkk1 produce
sinergia con kremen 1 y/o 2 para inhibir una señal inducida por
Wnt1, tal como se muestra en la Figura 4.
El compuesto candidato puede ser un compuesto
simple o una pluralidad de compuestos. El término "pluralidad de
compuestos" en un método de la invención debe entenderse como una
pluralidad de sustancias que pueden ser o no idénticas.
Dicho compuesto o pluralidad de compuestos
puede(n) sintetizarse químicamente o producirse
microbiológicamente y/o pueden estar comprendidos, por ejemplo, en
muestras, v.g., extractos de células de, v.g., plantas, animales o
microorganismos. Adicionalmente, dicho o dichos compuestos pueden
ser conocidos en la técnica, pero de los cuales no se conoce hasta
ahora que sean capaces de suprimir o activar los polipéptidos Kremen
1 y/o Kremen 2. La mezcla de reacción puede ser un extracto exento
de células o puede comprender un cultivo de células o de tejido.
Montajes adecuados para el método de la invención son conocidos por
las personas expertas en la técnica y se describen, por ejemplo, en
líneas generales en Alberts et al., Molecular Biology of the
Cell, 3ª edición (1994) y en los ejemplos incluidos como apéndice.
La pluralidad de compuestos puede añadirse, v.g. a la mezcla de
reacción, al medio de cultivo, inyectarse en una célula o aplicarse
de cualquier otro modo a un animal transgénico. La célula o tejido
que puede emplearse en el método de la invención es preferiblemente
una célula hospedadora, célula de mamífero o animal transgénico no
humano.
Si una muestra que contiene un compuesto o una
pluralidad de compuestos se identifica en el método de la invención,
entonces es posible o bien aislar el compuesto de la muestra
original identificada por contener el compuesto capaz de suprimir o
activar un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, o subdividir
ulteriormente la muestra original, por ejemplo, si la misma está
constituida por una pluralidad de compuestos diferentes, a fin de
reducir el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el
método con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de
la complejidad de las muestras, los pasos arriba descritos pueden
realizarse varias veces, preferiblemente hasta que la muestra
identificada de acuerdo con el método de la invención comprende
exclusivamente un número limitado de sustancias o solamente una
sustancia. Preferiblemente, dicha muestra comprende sustancias de
propiedades químicas y/o físicas similares, y muy preferiblemente
dichas sustancias son idénticas.
Se conocen varios métodos por las personas
expertas en la técnica para producir y cribar grandes bibliotecas a
fin de identificar compuestos que tengan afinidad específica para
una diana. Estos métodos incluyen el método de presentación de fago
en el cual péptidos aleatorizados son presentados por un fago y
cribados mediante cromatografía de afinidad a un receptor
inmovilizado; véase, v.g., WO 91/17271, WO 92/01047,
US-A-5.223.409. En otro enfoque,
bibliotecas combinatorias de polímeros inmovilizados en un chip se
sintetizan utilizando fotolitografía; véase, v.g.,
US-A-5.143.854, WO 90/15070 y WO
92/10092. Los polímeros inmovilizados se ponen en contacto con un
receptor marcado y se escanean respecto al marcador para identificar
polímeros que se fijan al receptor. La síntesis y el cribado de
bibliotecas de péptidos sobre soportes continuos de membranas de
celulosa que pueden utilizarse para identificación de ligandos de
fijación de los polipéptidos Kremen 1 y/o 2 y, por tanto, posibles
inhibidores y activadores se describe, por ejemplo, en Kramer,
Methods Mol. Biol. 87 (1998), 25-39. Este método
puede utilizarse también, por ejemplo, para determinación de los
sitios de fijación y los motivos de reconocimiento en el polipéptido
Kremen 1 y/o 2. De modo análogo, se determinó la especificidad de
sustrato de la chaperona DnaK y los sitios de contacto entre la
interleuquina-6 humana y su receptor; véase Rudiger,
EMBO J. 16 (1997), 1501-1507 y Weiergraber, FEBS
Lett. 379 (1996), 122-126, respectivamente.
Adicionalmente, los métodos arriba mencionados pueden utilizarse
para la construcción de supertopes de fijación derivados del
polipéptido Kremen 1 o Kremen 2. Un enfoque similar fue descrito con
éxito para antígenos peptídicos del anticuerpo monoclonal
anti-p24 (HIV-1); véase Kramer, Cell
91 (1997), 799-809. Una ruta general para análisis
de la huella dactilar de interacciones
péptido-anticuerpo utilizando la biblioteca de
péptidos de aminoácidos arracimados se describió en Kramer, Mol.
Immunol. 32 (1995), 459-465. Adicionalmente,
antagonistas de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 pueden
derivarse e identificarse a partir de anticuerpos monoclonales que
reaccionan específicamente con un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2
de acuerdo con los métodos descritos en Doring, Mol. Immunol. 31
(1994), 1059-1067.
Todos estos métodos pueden utilizarse de acuerdo
con la presente invención para identificar activadores/agonistas e
inhibidores/antagonistas de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen
2.
Diversas fuentes para la estructura básica de un
activador o inhibidor de este tipo pueden emplearse y comprenden,
por ejemplo, análogos miméticos de un polipéptido Kremen 1 y/o
Kremen 2. Análogos miméticos de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2
o fragmentos biológicamente activos del mismo pueden generarse
mediante, por ejemplo, sustitución de los aminoácidos que se espera
sean esenciales para la actividad biológica con, v.g.,
estereoisómeros, es decir D-aminoácidos; véase,
v.g., Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541.
Adicionalmente, en el caso de que se utilicen fragmentos para el
diseño de análogos biológicamente activos, pueden incorporarse
componentes pro-miméticos en un péptido para
restablecer al menos algunas de las propiedades estructurales que
pueden haberse perdido durante la eliminación de parte del
polipéptido original; véase, v.g., Nachman, Regul. Pept. 57 (1995),
359-370. Adicionalmente, puede utilizarse un
polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 para identificar miméticos
sintéticos de péptidos químicos que se fijan a o pueden funcionar
como un ligando, sustrato o pareja de fijación de dicho o dichos
polipéptidos tan eficazmente como lo hace el polipéptido natural;
véase, v.g., Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997),
2284-2292. Por ejemplo, pueden realizarse
simulaciones de plegado y re diseño por computadora de motivos
estructurales de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 utilizando
programas de computadora apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996),
286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995),
675-679). La modelización por computadora del
plegado de las proteínas puede utilizarse para el análisis
estructural y energético de modelos detallados de péptidos y
proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995),
995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995),
37-45). En particular, pueden utilizarse los
programas apropiados para la identificación de sitios interactivos
de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 y su ligando u otras
proteínas interactivas por búsquedas asistidas por computadora para
secuencias peptídicas complementarias (Fassina, Immunomethods 5
(1994), 114-120). Sistemas de computadora apropiados
adicionales para el diseño de proteínas y péptidos se describen en
la técnica anterior, por ejemplo en Beny, Biochem. Soc. Trans. 22
(1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501
(1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986),
5987-5991. Los resultados obtenidos a partir de los
análisis por computadora arriba descritos pueden utilizarse para,
v.g., la preparación de miméticos peptídicos de un polipéptido
Kremen 1 y/o Kremen 2 o fragmentos de los mismos. Tales análogos
pseudopeptídicos de la secuencia de aminoácidos natural de la
proteína pueden mimetizar muy eficazmente la proteína parental
(Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224).
Por ejemplo, la incorporación de residuos de
\omega-aminoácidos aquirales fácilmente
disponibles en un polipéptido Kremen 1 ó 2 o un fragmento del mismo
da como resultado la sustitución de enlaces amídicos por unidades
polimetileno de una cadena alifática, proporcionando con ello una
estrategia conveniente para construir un mimético peptídico
(Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). Análogos
peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en
otros sistemas se describen en la técnica anterior (Zhang, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331).
Miméticos peptídicos apropiados de un polipéptido Kremen 1 y/o
Kremen 2 pueden identificarse también por la síntesis de bibliotecas
peptídicas miméticas combinatorias por alquilación sucesiva de
amidas y testado de los compuestos resultantes, v.g., respecto a sus
propiedades de fijación e inmunológicas. Métodos para la generación
y uso de bibliotecas peptidomiméticas combinatorias se describen en
la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology
267 (1996), 220-234 y Domer, Bioorg. Med. Chem. 4
(1996), 709-715. Adicionalmente, puede utilizarse
una estructura tridimensional y/o cristalográfica de un polipéptido
Kremen 1 y/o Kremen 2 para el diseño de inhibidores miméticos
peptídicos de la actividad biológica del polipéptido (Rose,
Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber,
Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Es también bien conocido por las personas
expertas en la técnica que es posible diseñar, sintetizar y evaluar
miméticos de pequeños compuestos orgánicos que, por ejemplo, pueden
actuar como un sustrato o ligando para un polipéptido Kremen 1 y/o
Kremen 2. Por ejemplo, se ha descrito que miméticos de
D-glucosa de hapalosina exhibían eficiencia similar
a la de hapalosina en el antagonismo de proteínas asociadas de
asistencia a la resistencia a multifármacos en citotoxicidad (sic);
véase Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.
La molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 puede servir también como diana
para activadores e inhibidores. Los activadores pueden comprender,
por ejemplo, proteínas que se fijan al mRNA de un gen codificante de
un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, estabilizando con ello la
conformación nativa del mRNA y facilitando la transcripción y/o
traducción, v.g., de manera análoga al modo en que la proteína Tat
actúa sobre el RNA de HIV. Adicionalmente, se describen en la
bibliografía métodos para identificación de moléculas de ácido
nucleico tales como un fragmento de RNA que mimetiza la estructura
de una molécula diana de RNA definida o no definida a la cual se
fija un compuesto en el interior de una célula dando como resultado
retardo del crecimiento celular o muerte celular; véase, v.g., WO
98/18947 y las referencias citadas en dicho lugar. Estas moléculas
de ácido nucleico pueden utilizarse para identificación de
compuestos desconocidos de interés farmacéutico, y para
identificación de dianas de RNA desconocidas para uso en el
tratamiento de una enfermedad. Estos métodos y composiciones pueden
utilizarse en el cribado para nuevos compuestos o para
identificación de compuestos útiles para alterar los niveles de
expresión de los polipéptidos codificados por una molécula de ácido
nucleico. Alternativamente, por ejemplo, la estructura
conformacional del fragmento de RNA que mimetiza el sitio de
fijación puede emplearse en diseño racional de fármacos para
modificar fármacos conocidos a fin de hacer que los mismos se fijen
con mayor avidez a la diana. Una metodología de este tipo es la
resonancia magnética nuclear (NMR), que es útil para identificar
fármacos y estructuras de conformación del RNA. Otros métodos
adicionales son, por ejemplo, los métodos de diseño de fármacos que
se describen en WO 95/35367,
US-A-5.322.933, donde la estructura
cristalina del fragmento de RNA puede deducirse y se utilizan
programas de computadora para diseñar nuevos compuestos de
fijación.
Los compuestos que pueden testarse e
identificarse de acuerdo con un método de la invención pueden ser
bibliotecas de expresión, v.g., bibliotecas de expresión de cDNA,
péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos
orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, PNAs o análogos
(Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp,
Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994),
193-198 y las referencias arriba citadas).
Adicionalmente, los genes que codifican un regulador supuesto de un
polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 y/o que ejercen sus defectos aguas
arriba o aguas abajo de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 pueden
identificarse utilizando, por ejemplo, mutagénesis de inserción que
emplea, por ejemplo, vectores de direccionamiento de genes conocidos
en la técnica. Dichos compuestos pueden ser también derivados
funcionales o análogos de inhibidores o activadores conocidos. Tales
compuestos útiles pueden ser por ejemplo factores de transacción que
se fijan a un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 o secuencias
reguladoras del gen que codifica el mismo. La identificación de
factores de transacción puede llevarse a cabo utilizando métodos
estándar en la técnica (véase, v.g., Sambrook, supra). Para
determinar si una proteína se fija a la proteína propiamente dicha o
secuencias reguladoras, pueden realizarse análisis estándar de
desplazamiento del gel nativo. Con objeto de identificar un factor
de transacción que se fija a la proteína o secuencia reguladora,
puede utilizarse la proteína o secuencia reguladora como reactivo de
afinidad en métodos estándar de fijación de proteínas, o como sonda
para cribado de una biblioteca de expresión. La identificación de
moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que
interaccionan con un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 arriba
descrito puede conseguirse también, por ejemplo, como se describe en
Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) por el uso
del denominado sistema de levadura de "dos híbridos". En este
sistema, el polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 o una pequeña parte
del mismo se enlaza al dominio de fijación de DNA del factor de
transcripción GAL4. Una cepa de levadura que expresa este
polipéptido de fusión y que comprende un gen informador lacZ
dirigido por un promotor apropiado, que es reconocido por el factor
de transición GAL4, se transforma con una biblioteca de cDNAs que
expresan proteínas de plantas o péptidos de las mismas fusionados a
un dominio de activación. Así, si un péptido codificado por uno de
los cDNAs es capaz de interaccionar con el péptido de fusión que
comprende un péptido de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2, el
complejo es capaz de dirigir la expresión del gen informador. De
este modo, las moléculas de ácido nucleico que codifican Kremen 1 y
Kremen 2, respectivamente, y el péptido codificado pueden utilizarse
para identificar péptidos y proteínas que interaccionan con un
polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2.
Una vez que se ha identificado el factor de
transacción, la modulación de su fijación a o regulación de la
expresión de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 puede continuarse,
comenzando por ejemplo con el cribado para inhibidores contra la
fijación del factor de transacción a un polipéptido Kremen 1 o
Kremen 2. La activación o represión de un polipéptido Kremen 1 y/o
Kremen 2 podría conseguirse entonces en animales por aplicación del
factor de transacción (o su inhibidor) o el gen que codifica el
mismo, v.g. en un vector de expresión. Adicionalmente, si la forma
activa del factor de transacción es un dímero, podrían producirse
mutantes dominantes negativos del factor de transacción a fin de
inhibir su actividad. Ulteriormente, después de la identificación
del factor de transacción, pueden identificarse luego componentes
adicionales en la cascada de señales que conduce a la activación
(v.g. transducción de señales) o represión de un gen implicado en el
control de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2. La modulación de
las actividades de estos componentes puede continuarse, a fin de
desarrollar fármacos y métodos adicionales para modular el
metabolismo de degradación de las proteínas en los animales. Así, la
presente invención se refiere también al uso del sistema de dos
híbridos como se define arriba para la identificación de activadores
o inhibidores de un polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2.
Los compuestos aislados por los métodos
anteriores sirven también como compuestos líder para desarrollo de
compuestos análogos. Los análogos deben tener una configuración
electrónica y conformación molecular estabilizada que permita que
grupos funcionales clave sean presentados a un polipéptido Kremen 1
y/o Kremen 2 o su ligando sustancialmente del mismo modo que el
compuesto líder. En particular, los compuestos análogos tienen
propiedades electrónicas espaciales que son comparables a la región
de fijación, pero pueden ser moléculas más pequeñas que el compuesto
líder, que tienen frecuentemente un peso molecular inferior a
aproximadamente 2 kD y preferiblemente inferior a aproximadamente 1
kD. La identificación de compuestos análogos puede realizarse
mediante el uso de técnicas tales como análisis de campo
autoconsistente (SCF), análisis de interacción de configuración
(Cl), y análisis de dinámica de modo normal. Programas de
computadora para la implementación de estas técnicas están
disponibles; v.g., Rein, Computer-Assisted Modeling
of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, Nueva
York, 1989). Métodos para la preparación de derivados químicos y
análogos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry,
Springer edition, Nueva York Inc., 175 Fifth Avenue, Nueva York,
N.Y. 10010 EEUU, y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, EEUU.
Adicionalmente, dichos derivados y análogos pueden testarse respecto
a sus efectos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica; véase
también arriba. Adicionalmente, peptidomiméticos y/o el diseño
ayudado por computadora de derivados apropiados y análogos pueden
utilizarse, por ejemplo de acuerdo con los métodos arriba
descritos.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se utilizó una biblioteca de cDNA de embrión de
ratón de 13,5 días en el vector de expresión
pCMV-SPORT2 (Gibco BRL) para preparar agrupaciones
de aproximadamente 250 colonias, y el DNA plasmídico de cada
agrupación se transfectó transitoriamente en células 293T en placas
de 24 pocillos utilizando FuGENE6 (Roche). Después de 48 horas, se
incubaron las células con medio que contenía proteína de fusión
Dkk1-fosfatasa alcalina 1 nM
(Dkk1-AP) (Mao et al., Nature 411
(2001) 321-325) y se procesaron respecto a
histoquímica de AP. A partir de 1500 agrupaciones, se identificaron
dos agrupaciones positivas y se aislaron clones simples por
selección de parientes. El análisis de secuenciación demostró que
aquéllos representan aislados independientes de mkrem2. Se
aisló un clon de ratón de longitud total Kremen1 de la misma
biblioteca por PCR utilizando datos publicados de secuencias de
nucleótidos (Nakamura et al., Biochim. Biophys. Acta
1518 (2001), 63-72). El marco de lectura
abierto de mkremen1 y -2 se clonó en pCS2+ para generar
pCS2-mkremen 1 y -2. Se construyó
pCS-flag-mkrm2 por inserción de un
epítope flag ("bandera") después del péptido señal y se utilizó
como molde para generar el
pCS-flag-mkrm2\DeltaWSC por
PCR.
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Ejemplo
2
Para los ensayos de fijación, se transfectaron
(T) células 293T con mkrm1 o mkrm2 como se ha
indicado, se incubaron con la proteína de fusión recombinante
Dkk1-fosfatasa alcalina (Dkk1-AP) o
fosfatasa alcalina (AP) y se tiñeron para actividad fijada de AP.
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Como se muestra en la Figura 4, los ensayos
informadores de Wnt de luciferasa en células 293T se realizaron en
placas de 96 pocillos al menos por triplicado como se ha descrito
(Wu et al., Curr Biol 10 (2000),
1611-1614). La actividad de luciferasa se normalizó
contra la actividad de Renilla utilizando un kit comercial
(Clonetech).
Xdkk1= Xenopus dkk1 (Glinka, et al. Nature 391, (1998) 357-362); mkrm1,2= kremen 1,2 de ratón; wnt= wnt1 de ratón; fz= frizzled8 de ratón; Irp6= Irp6 humano (Tamai, et al., Nature 407 (2000) 530535); informada de luciferasa Wnt TOP-FLASH (Korinek et al. Science 275 (1997) 1784-1787).
Xdkk1= Xenopus dkk1 (Glinka, et al. Nature 391, (1998) 357-362); mkrm1,2= kremen 1,2 de ratón; wnt= wnt1 de ratón; fz= frizzled8 de ratón; Irp6= Irp6 humano (Tamai, et al., Nature 407 (2000) 530535); informada de luciferasa Wnt TOP-FLASH (Korinek et al. Science 275 (1997) 1784-1787).
Como se muestra en la Figura 3, la fijación de
la proteína de fusión Dkk-fosfatasa alcalina a
Kremen 2 y/o Kremen 1, respectivamente, muestra afinidad alta.
Adicionalmente, pudo demostrarse que únicamente Dkk1 y Dkk2 se fijan
a Kremen, pero no Dkk3.
En un experimento adicional, se transfectaron
células 293 de riñón con el informador Wnt
(TOP-FLASH) con o sin los genes indicados. Dos días
después de la transfección, se determinó la actividad de luciferasa
expresada. Como se muestra en la figura 4, la cotransfección de Wnt
y su receptor, frizzled (fz) da como resultado la
estimulación de la cascada de señales Wnt (véase Figura 4, pista 1
frente a pista 2) y la cotransfección de dkk1 y Kremen
1 y Kremen 2 conduce a una inhibición sinérgica de esta
activación de la cascada de señales Wnt. Este efecto es aún más
acusado si se ha cotransfectado Wnt con su receptor frizzled
(fz) y el correceptor Irp6. Puede observarse una activación muy
fuerte de la cascada de señales Wnt (pista 8). Esta activación puede
ser inhibida únicamente por cotransfección con dkk1 y
Kremen 1,2 (pistas 12 y 13) pero no por transfección con los
genes simples (dkk1, pista 9; Kremen 2, pista 10;
Kremen 1, pista 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La expresión de Kremen 1 y 2 en diversos
tejidos de ratones se estudió por RT-PCR. El
aislamiento del RNA de órganos de ratón adulto y los ensayos
RT-PCR se llevaron a cabo en la fase lineal de
amplificación y con iniciadores de histona 4 como se ha descrito
(Glinka et al., Nature 389 (1997),
517-519). Otros iniciadores fueron: mkrm1 (f,
GTGCTTCACAGCCAACGGTGCA; r, CGTAGCACCAAGGGCTCACGT); mkrm2 (f,
AGGGAAACTGGTCGGC
TC; r, AAGGCACGGAGTAGGTTGC). Los núms. de ciclos eran H4: 26 ciclos; mkrm1: 35 ciclos; mkrm2: 32 ciclos. Los resultados demuestran que ambos kremens se expresan en todos los tejidos de ratón testados, pero con nivel de expresión variable (Figura 5). Se obtuvieron resultados similares utilizando embriones de Xenopus.
TC; r, AAGGCACGGAGTAGGTTGC). Los núms. de ciclos eran H4: 26 ciclos; mkrm1: 35 ciclos; mkrm2: 32 ciclos. Los resultados demuestran que ambos kremens se expresan en todos los tejidos de ratón testados, pero con nivel de expresión variable (Figura 5). Se obtuvieron resultados similares utilizando embriones de Xenopus.
Claims (7)
1. Un método in vitro de identificación
de un compuesto para modular la cascada de señales Wnt que está
basado en la identificación de una pareja de fijación a un
polipéptido Kremen 1 y/o Kremen 2 que comprende:
- (a)
- poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto a cribar; y
- (b)
- determinar si el compuesto afecta a una actividad de dicho polipéptido o si se ha producido fijación del compuesto a dicho polipéptido.
2. Un método in vitro para identificar un
compuesto para modular la cascada de señales Wnt como un
activador/agonista o inhibidor/antagonista de un polipéptido Kremen
1 y/o Kremen 2, que comprende los pasos de:
- (a)
- incubar un compuesto candidato con dicho polipéptido;
- (b)
- ensayar una actividad biológica, y
- (c)
- determinar si se ha alterado una actividad biológica de dicho polipéptido.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde el compuesto candidato o el compuesto a cribar es un
anticuerpo que reconoce Kremen 1 y/o Kremen 2.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el cual el compuesto candidato o compuesto a cribar es una
molécula pequeña.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el cual el compuesto candidato o compuesto a cribar es un
ácido nucleico.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cribado implica células que
expresan Kremen 1 y/o Kremen 2.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el ensayo se lleva a cabo
utilizando preparaciones exentas de células.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02008650A EP1355152B1 (en) | 2002-04-17 | 2002-04-17 | Method for identifying a compound for modulating the wnt signal cascade. |
Publications (1)
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