ES2342159T3

ES2342159T3 - Integracion aleatoria de un polinucleotido despues de linealizacion in vivo.

Info

Publication number: ES2342159T3
Application number: ES02798716T
Authority: ES
Inventors: Andre Choulika; Jean-Stephane Joly; Violette Thermes; Filomena Ristoratore
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-12
Publication date: 2010-07-02
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: AU2002333832B2; DE60236182D1; DK1427828T3; WO2003025183A2; AU2002333832B9; EP1427828A2; JP4436130B2; WO2003025183A3; US20030106077A1; JP2005503161A; EP1427828B1; ATE466088T1; US7098031B2

Abstract

Un procedimiento no terapéutico para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped mediante preparación en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5'' y 3'' libres a partir de un vector, en el que dicho procedimiento comprende: a) Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5'' y 3'' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en el genoma de la célula huésped; b) producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5'' y 3'' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y, c) mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido liberado en dicho genoma de la célula huésped, y en el que dicha célula huésped es una célula no humana.

Description

Integración aleatoria de un polinucleótido después de linealización in vivo.

Antecedentes Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de liberación in vivo de un fragmento de ADN lineal de un vector con el fin de integrar este fragmento en el genoma celular. La invención se refiere además al uso de este procedimiento y a los resultados de este uso.

Breve descripción de la técnica anterior

El primer gran avance de la genética inversa hace 20 años fue la transgénesis. La transgénesis es la técnica que permite introducir una secuencia de ADN exógeno en una célula huésped. Por ejemplo, la microinyección de ADN en un huevo fecundado por mamífero conduce, en un cierto número de casos, a la integración de la molécula de ADN microinyectado en el genoma del huevo fecundado. La transgénesis implica que un fragmento de ADN extraño se introduzca en el genoma de un organismo multicelular y se transmita a la progenie. Por tanto, el ADN extraño debe estar presente en una forma estable en el embrión en una fase precoz de desarrollo con el fin de transmitirse a la progenie.

La transfección de ADN en células de mamífero por medio de precipitación de fosfato de calcio precipitado también puede conducir, en un cierto número de casos, a la integración del ADN exógeno en el genoma de la célula huésped que se llama transfección estable. El ADN exógeno puede introducirse en células bajo dos formas, bien lineal o circular. Cuando el ADN se introduce en forma lineal, el fragmento lineal se prepara in vitro antes de su introducción en la célula huésped, generalmente por escisión del fragmento deseado con enzima de restricción de, por ejemplo, un plásmido. En lo que se refiere al ADN en forma circular, el ADN introducido es generalmente un plásmido superenrollado.

\vskip1.000000\baselineskip

Todas las células tienen sistemas de mantenimiento y reparación de su ADN. Una de las señales particulares de estrés que activa la intervención de estos sistemas es la generación de extremos libres de ADN en la célula. La célula tiene entonces dos soluciones para resolver este tipo de problema:

-: La primera solución es la degradación del ADN que presenta los extremos libres (por ejemplo, el caso en el que la célula debe eliminar un ADN que puede tener una actividad viral). Esta solución se basa en la presencia en estos sistemas de mantenimiento y reparación de exonucleasas que degradan el ADN digeriéndolo a partir de los extremos libres.

-: Otra solución es la recombinación de los extremos libres con el genoma celular. Esta recombinación puede tomar diferentes formas, particularmente la integración de la molécula exógena en el genoma de la célula.

\vskip1.000000\baselineskip

Como consecuencia, los trabajos que tienen como objetivo integrar el ADN exógeno mediante la introducción de ADN bicatenario desnudo en forma circular o lineal se encuentran con tres tipos de problemas principales, además de un cierto número de problemas colaterales.

-: El primero de estos problemas es la eficiencia de la integración de la molécula exógena en el ADN del huésped celular. Esta falta de eficiencia implica la inyección de una cantidad muy alta de ADN exógeno para un número muy pequeño de integración. En algunas especies tales como peces, plantas o insectos, las exonucleasas son tan eficaces que el ADN exógeno nunca se integra en el cromosoma y permanece episomal. Por ejemplo, si se usa la forma circular para el ADN exógeno, para tener la integración es necesario una mella. De hecho, el procedimiento de integración necesita la presencia de un extremo libre. Si se usa la forma lineal, la mayoría del ADN exógeno es degradada por las exonucleasas debido a la presencia de los extremos libres.

-: El segundo problema es la integridad del ADN integrado. El fragmento lineal de ADN exógeno expone sus extremos libres a las exonucleasas celulares antes de su llegada al núcleo. Esta exhibición prolongada de sus extremos en la célula limita de una forma significativa las oportunidades del ADN exógeno para integrarse completamente en el genoma celular. Una forma para aumentar las oportunidades de integrarse completamente en el genoma consiste en añadir algunos nucleótidos protuberantes de ADN monocatenario cohesivos a cada extremo del ADN exógeno, por ejemplo, preparados por digestión con la misma enzima de restricción. Estas extremidades cohesivas permiten que los fragmentos de ADN se asocien en un multímero y evitan la degradación completa del ADN antes de su integración. Otra forma para aumentar las oportunidades es rodear el fragmento de ADN para integrarlo con secuencias de ADN largas y neutras. En el caso del ADN exógeno está incluido en un plásmido superenrollado, el fragmento integrado comprende no sólo el ADN exógeno, sino también el vector completo.

-: El tercer problema es el control del número de copias integradas. La multimerización, deliberada o no, del ADN exógeno presenta el inconveniente de favorecer la inserción de varias copias del fragmento de ADN exógeno. Similarmente, cuando el ADN exógeno tiene una forma circular, el plásmido se integra como un concatémero. Esta inserción múltiple tiene por consecuencia introducir una inestabilidad de cromosoma y dar como resultado problemas de regulación de la expresión debido a la presencia del mismo gen en múltiples copias.

\vskip1.000000\baselineskip

La transgénesis es más que nunca una herramienta esencial para los biólogos. El estudio de enfermedades humanas se basa en gran parte en el uso de modelos animales. Están disponibles una gran cantidad de informaciones de secuencias génicas para la industria farmacéutica. Estas informaciones proporcionarían nuevas dianas para fármacos. Sin embargo, la función de la mayoría de los genes y las proteínas relacionadas en un organismo sigue siendo desconocida y la eficiencia de la validación de dianas no parece haber cambiado significativamente.

Los estudios genéticos y la genómica estructural han mostrado que las rutas bioquímicas y la fisiología están sumamente conservadas en todo el mundo animal. Por tanto, pueden usarse modelos animales para investigar procedimientos relevantes para enfermedades humanas. El modelo animal puede usarse para identificar y validar eficazmente dianas de cribado óptimas. La selección de dianas de cribado puede mejorarse y conducirá a menos fallos y a un procedimiento de desarrollo de fármacos más eficaz.

El ratón es un modelo de mamífero muy conocido que se usa abundantemente. El procedimiento más ampliamente usado para la producción de animales transgénicos es la microinyección de ADN en los pronúcleos de embriones fecundados. Este procedimiento es bastante eficiente para la producción de ratones transgénicos pero es mucho menos eficaz para la producción de mamíferos transgénicos grandes tales como vacas y ovejas. Además, los animales transgénicos del procedimiento de transgénesis disponible son frecuentemente un mosaico para el transgén dando como resultado la falta de transmisión del transgén a la progenie. Algunos animales presentan una alta resistencia a la transgénesis tales como peces o aves. Entre ellos, el problema de transgénesis de peces se detalla más a continuación.

Los peces de pecera han alcanzado una alta popularidad como modelos de vertebrados en la biología y la genética del desarrollo. De hecho, el pez cebra (Danio rerio) es un sistema de modelo popular para estudios de desarrollo de vertebrados porque ofrece la oportunidad de combinar análisis de genética clásica con un embrión fácilmente accesible y manipulable. Los estudios genéticos de los peces cebra se benefician del tiempo de generación de 2-3 meses, la capacidad de las hembras de poner rutinariamente cientos de huevos y el pequeño tamaño de los adultos. Los estudios embriológicos se benefician de los grandes embriones transparentes.

Sin embargo, la utilidad de peces de pecera está todavía limitada por la falta de algunas herramientas metodológicas, sobre todo una tecnología simple y eficaz para la transgénesis, que se ha convertido en una técnica importante en la investigación fundamental y tiene varias aplicaciones en agronomía y biomedicina. En particular, los intentos por establecer células madre embriónicas (ES) en peces como vectores celulares para la transgénesis ha sido hasta la fecha poco satisfactorios.

Por tanto, el procedimiento de elección para generar peces transgénicos sigue siendo la inyección de altas concentraciones de ADN (aproximadamente 10^{6} copias de plásmidos) en el citoplasma de embriones en la fase de una célula. Los plásmidos han sido microinyectados en forma linealizada y circular y en ambos tipos de experimentos se ha logrado la transgénesis. Esta tecnología es rápida y fácil debido a la transparencia y al gran tamaño de la mayoría de los huevos de peces, pero desafortunadamente también es bastante ineficaz con una frecuencia de integración genómica y transmisión de la línea germinal que normalmente se encuentra en un intervalo de un pequeño porcentaje [Stuart y col., 1988 Development 103, 403-412; Stuart y col., 1990, Development 109, 577-584; Culp y col., 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88, 7953-57; Lin y col., 1994 Developmental biology 161, 77-83; Collas y col., 1998 Transgenic Research, 7, 303-309]. Estudios recientes han mostrado que probablemente esto es debido a integraciones tardías y de mosaicos: el ADN persiste en una forma sin integrar en el citoplasma del huevo y sólo es heredado por un subconjunto de blastómeros. Después de la inyección, las secuencias de plásmidos se amplifican transitoriamente y forman largos concatémeros que están constituidos por muchas copias de longitud la unidad del plásmido dispuesto en tándem (Stuart y col. 1988, anteriormente). El ADN extraño normalmente se inserta en un sitio en el genoma del huésped pero normalmente está constituido por matrices de tándem del constructo inyectado original (Culp y col., 1991, anteriormente).

Generalmente se acepta que es difícil aumentar la frecuencia de peces transgénicos generados por microinyección de plásmidos. El inyectar mayores cantidades de ADN es tóxico para los embriones por lo que debe intentarse mejorar la eficiencia de integración. Se han realizado varios intentos por mejorar la tasa de integración y transmisión de transgenes. Por ejemplo, se ha notificado el uso de complejos de ADN-NLS, aunque la mayoría de los autores no encontraron mejoras con esta tecnología [Liang y col., 2000 Mol Reprod Dev 55, 8-13]. En principio, las tecnologías que usan repeticiones flanqueantes de virus adenoasociados [Fu, 1998 Nature Biotech, 16, 253-257] o de transposones [Izsvak y col., 2000 J Mol Biol 302, 93-102] también pueden aumentar la integración de transgenes. Sin embargo, al leal saber de los inventores no se han notificado resultados positivos con estas técnicas, que también experimentan la presencia potencialmente perjudicial de repeticiones en los plásmidos. Además, estos vectores están limitados por el tamaño de las secuencias de ADN que pueden manipularse en ellos. Se ha observado un aumento en la frecuencia de transformación de fragmentos lineales en Hansenula polymorpha mediante la adición de una enzima de restricción (van Dijk y col., 2001 Mol Genet Genomics 266, 646-656). Sin embargo, la adición de enzima de restricción estaba asociada a una preferencia de integración en sitios de escisión genómicos de dicha enzima de restricción.

Por tanto, han aparecido varios procedimientos para mejorar y desarrollar nuevas rutas para aumentar la eficiencia de la transgénesis. Sin embargo, una cantidad muy limitada de procedimientos permite un mejor control y quedan varias especies resistentes o muy ineficaces para esta tecnología. Los principales problemas encontrados son:

-: Control y eficiencia de la transgénesis

-: Acontecimientos de integración precoces (transmisión de la línea germinal)

-: El control del número de copias integradas.

Resumen

La presente invención tiene exactamente como objetivo ofrecer un procedimiento que permita mejorar la eficiencia de integración aleatoria de ADN durante la transgénesis y permitir un mejor control de la integridad del ADN integrado, además de reducir el número de copias de ADN integrado.

El procedimiento para integrar aleatoriamente un ADN exógeno en el ADN genómico según la invención consiste en la linealización del polinucleótido de ADN que va a integrarse que no tiene extremos libres 5' y 3' a partir de un vector en la célula huésped.

El procedimiento según la invención consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped mediante preparación (in vivo o in ovo) en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres, comprendiendo dicho procedimiento:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión y encontrándose dicho sitio de escisión en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,

b): producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,

c): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado en dicho genoma de la célula huésped.

Opcionalmente, dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión. Preferentemente, dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped dicho agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es un vector de expresión o un ARNm. Opcionalmente, dicha célula huésped es una célula transgénica que expresa dicho agente de escisión. Dicha secuencia de polinucleótidos que va a integrarse según la presente invención no puede someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a escindirse no comprende ningún sitio de escisión. Preferentemente, dicho vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse comprende además dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos está flanqueada por al menos un sitio de escisión. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse está flanqueada por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente. Más preferentemente, dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, Pi-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, Pi-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es un vector de ADN bicatenario. Opcionalmente, dicho vector es un plásmido o un vector viral. Preferentemente, dicho vector es un plásmido. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos es una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora o una secuencia de reconocimiento para una molécula. Preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo. Más preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, un blastómero y un huevo. Opcionalmente, dicho procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped se usa para transfección estable o transgénesis.

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización de la presente invención, el procedimiento consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped mediante preparación (in vivo o in ovo) en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de endonucleasa y encontrándose dicho sitio de endonucleasa en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de endonucleasa no se encuentra en el genoma de la célula huésped;

b): opcionalmente, introducir en dicha célula huésped o la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa presente en dicho vector o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa; y,

c): producir la escisión de dicho sitio en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,

d): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferentemente, la etapa b) consiste en introducir en dicha célula huésped la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa. Preferentemente, las etapas a) y b) son simultáneas. Opcionalmente, dicho vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa es un vector de expresión o un ARNm. Opcionalmente, dicha célula huésped es una célula transgénica que expresa dicha endonucleasa. Dicha secuencia de polinucleótidos que va a integrarse según la presente invención no puede hacer significativamente una recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Opcionalmente, dicho vector comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la endonucleasa. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse y dicho ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa están constituidos cada uno por un vector distinto. Preferentemente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse no comprende ningún sitio de endonucleasa. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos está flanqueada por al menos un sitio de endonucleasa. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse está flanqueada por dos sitios de endonucleasa. Preferentemente, dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PO-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, Pi-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev y F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es bicatenario. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula. Preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo. Más preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, un blastómero y un huevo. Opcionalmente, dicho procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped se usa para transfección estable o transgénesis.

La presente invención se refiere a una composición para transgénesis o para la transfección estable que comprende:

1): un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse aleatoriamente, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,

2): un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.

Preferentemente, dicha composición se usa para transgénesis. Preferentemente, dicha composición comprende el agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es un vector de expresión o un ARNm. Dicho transgén que va a integrarse según la presente invención no puede hacer significativamente una recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho transgén que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho transgén que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Preferentemente, dicho transgén no comprende ningún sitio de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende dicho transgén comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el agente de escisión. Opcionalmente, dicho transgén y dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión están constituidos cada uno por un vector distinto. Preferentemente, dicho transgén está flanqueado por al menos un sitio de escisión. Preferentemente, dicho transgén está flanqueado por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente. Preferentemente, dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, Pi-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es bicatenario. Preferentemente, dicho vector es un plásmido. Opcionalmente, dicho transgén puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula.

La invención se refiere al uso de la composición según la presente invención para producir células, animales no humanos o plantas transgénicos. Preferentemente, dichos animales no humanos se seleccionan de mamíferos no humanos, aves, reptiles, anfibios y peces. Por ejemplo, la invención contempla ganado (vacas), cabras, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos (arañas, mariposas, moscas), peces, calamares, Amphoxius, Xenopus, aves, pollos, ascidios y razas ovinas (ovejas). Más particularmente, la invención contempla peces tales como pez espinoso, Astyanax, medaka y pez cebra, aves como pollos y roedores tales como ratones.

La presente invención también se refiere a las células resultantes de cualquier procedimiento de linealización in vivo o in ovo de un polinucleótido y de integración de polinucleótidos aleatoria según la presente invención y a sus usos, por ejemplo, para la producción de proteínas u otros genes, biomoléculas, biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, plantas y animales transgénicos o para el tratamiento o la profilaxis de una afección o trastorno en un individuo. Más particularmente, la invención se refiere a cualquier animal transgénico no humano y a cualquier planta transgénica que comprende una célula resultante de cualquier procedimiento de linealización in vivo de un polinucleótido y de integración de polinucleótidos aleatoria según la presente invención. La invención también se refiere a cualquier uso de una célula, de un animal transgénico no humano o de una planta transgénica según la presente invención para la producción de proteína, antisentido, biomolécula, biomaterial o vacuna. La invención se refiere además al uso de cualquier célula resultante para el tratamiento o la profilaxis de una afección o trastorno en un individuo.

Además, la invención se refiere a un procedimiento de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo en necesidad del mismo mediante integración aleatoria de un polinucleótido que comprende las etapas de:

a): Introducir en dicha célula del individuo un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula del individuo a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;

b): producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dichas células del individuo creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula del individuo; y,

c): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dichas células del genoma del individuo; dicha integración aleatoria de dicho polinucleótido compensa el defecto genético que causa dicha enfermedad genética.

\vskip1.000000\baselineskip

Opcionalmente, dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en dichas células del individuo un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión. Dicha secuencia de polinucleótidos que va a integrarse según la presente invención no puede hacer significativamente una recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a escindirse no comprende ningún sitio de escisión. Preferentemente, dicho vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse comprende además dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse está flanqueada por al menos un sitio de escisión. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse está flanqueada por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente. Más preferentemente, dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, Pl-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv 1, F-Tev I y F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es un vector de ADN bicatenario. Opcionalmente, dicho vector es un plásmido o un vector viral. Preferentemente, dicho vector es un plásmido. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos es una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora o una secuencia de reconocimiento para una molécula. Preferentemente, dichas células del individuo es una célula madre o una célula somática.

La invención se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que las células madre embriónicas se transfectan mediante el procedimiento según la presente invención y se criban para el acontecimiento de integración aleatoria, las células se inyectan en embriones en una fase en la que pueden integrar las células transfectadas, por ejemplo, en la fase de blastocisto, los embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los que se observa la colonización por células madre embriónicas de la línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos. Por lo demás, la invención se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que los huevos fecundados se transfectan mediante el procedimiento según la presente invención, y o los huevos se reimplantan en una madre sustituta y los individuos transgénicos se obtienen al final de la gestación o los huevos se incuban en condiciones apropiadas para el desarrollo del animal transgénico.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático que representa una realización del procedimiento para integrar un transgén siendo dicho transgén liberado in vivo a partir de un vector de plásmido superenrollado. El transgén está flanqueado por dos sitios de escisión. El agente de escisión se añade y produce in vivo una rotura bicatenaria en los dos sitios de escisión. El transgén lineal se libera y una copia del transgén se integra en el genoma.

La Figura 2 es una tabla que desvela la meganucleasa conocida. T. significa teórico, Exp demonstración experimental y Pot potencial.

La Figura 3 es un diagrama esquemático que representa algunas rutas para la preparación del vector lineal según la presente invención.

La Figura 4 es un diagrama esquemático de constructos de ADN descritos en el Ejemplo 1. "I-Sce I" se refiere al sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I. "IR" se refiere a repetición invertida. "pA_{sv40}" se refiere a la señal de poliadenilación de SV40.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que desvela el sistema de validación usado en el Ejemplo 1. "I-Sce I", "IR", "pA_{sv40}" se refieren respectivamente al sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I, repetición invertida y la señal de poliadenilación de SV40.

La Figura 6 es una reproducción fototipográfica de un gel de electroforesis del análisis de Southern después de una digestión con EcoR V del genoma de la célula transfectada con tanto pVirtkU3R\betageo como pCMV-1 SceI y un diagrama que describe el fragmento de restricción obtenido. +IN significa que las células también se transfectaron con un plásmido que codifica una integrasa. Si una copia del fragmento \DeltaU_{3}RfigeopA_{sv40} se integra en el genoma de la célula, el análisis de Southern muestra una banda a 1,2 kb y otra de al menos 2,5 kb. Si el fragmento \DeltaU_{3}R\betageopA_{sv40} se integra en el genoma de la célula con al menos dos copias consecutivas, el análisis de Southern muestra al menos una banda a 1,2 kb y una banda a 2,5 kb.

La Figura 7 muestra los resultados de la transfección estable en células COS con el procedimiento de linealización in vivo.

La Figura 7A es una diagrama que ilustra la estructura del constructo ppSNIE. Los sitios de escisión HindIII y I-Sce I (I-SceICS) están indicados además por la localización de la sonda NEO (Probe).

La Figura 7B es una reproducción fototipográfica de un análisis de transferencia de Southern. La transferencia izquierda se corresponde con una cotransfección con los plásmidos ppSNIE y pCMV-I-SceI (-). La transferencia derecha se corresponde con una cotransfección con los plásmidos ppSNIE y pCMV-I-SceI (+).

La Figura 8 muestra la expresión transitoria de GFP en embriones inyectados con \alpha-actina-GFP.

La Figura 8A es un diagrama que ilustra la mejora de la expresión transitoria de GFP cuando la meganucleasa se añade al tampón de inyección. Paneles derechos: embriones descorionados que expresan GFP a diferentes niveles. Para observaciones rutinarias, los coriones no se eliminan. S: fuerte; M: moderado; D: débil.

La Figura 8B es una tabla que resume las frecuencias de los diferentes patrones de expresión muscular de GFP agrupada como se muestra en la figura 7A. N (negativo), D (débil), M (moderado) y fuerte (F).

La Figura 9 muestra la eficiencia de la transgénesis en medaka.

La Figura 9A es una tabla que muestra la eficiencia de la transgénesis en medaka tras la inyección de p\alphaact-GFPM2. Carril 1: fragmento lineal correspondiente al promotor de \alpha-actina y el gen indicador GFP obtenido por digestión con I-SceI in vitro y purificación en gel de agarosa.

La Figura 9B es una reproducción fototipográfica de un análisis de transferencia de Southern de estructuras de inserto en líneas p\alphaact-GFPM2 inyectadas con (carriles 1 a 4) o sin (carril C) la meganucleasa. P: control p\alphaact-GFPM2 digerido con BamHI. Promotor de \alpha-actina: cuadro gris. EGFP, poliA: cuadro blanco. La enzima de restricción usada en el filtro representado es BamHI. La sonda usada se obtuvo con digestos de XhoI y EcoRV y se corresponde con el promotor de actina y el gen indicador GFP. En Southern, dos fragmentos de 1 y 2 kb correspondientes respectivamente a GFP/pA y a la región aguas abajo del promotor de actina (3'\alphap) se observan en el carril 1 a 4. 5'\alphap+pBluSK: banda de 4,8 kb, diagnóstico de la región aguas arriba del promotor ligado a la secuencia de plásmi-
dos.

La Figura 10 es un diagrama esquemático de los constructos de plásmidos usados para la transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por un vector que expresa I-SceI.

La Figura 10A es un diagrama del constructo de plásmidos Megafluo. Las flechas I-Sce I indican la localización del sitio de escisión de I-Sce I. Un promotor fuerte (promotor del gen Gas5 de ratón) está dirigiendo la transcripción de un indicador fluorescente (DSRed1-E5 de Clontech). Dos sitios de reconocimiento/escisión de I-Sce I en la misma orientación están flanqueando el transgén subclonado en un derivado de vector pUC.

La Figura 10B es un diagrama del vector que expresa I-Sce I (pl-SceI/EGFP). La secuencia codificante de la proteína I-Sce I se subclonó en el MCS de pIRES2-EGFP (Clontech). El promotor de CMV está accionando la transcripción de un único ARN de tanto la proteína I-Sce I como del indicador fluorescente de EGFP como una expresión bicistrónica.

La Figura 11 muestra los resultados de la transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por un vector que expresa I-SceI.

La Figura 11A es una reproducción fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la extracción de ADN genómico. Los carriles 1, 25, 2, 3, 4 son extracción de ADN genómico de ratones de tres semanas de edad. Los carriles A y B son extracción de ADN genómico de ratones nacidos muertos. Se cargaron aproximadamente 500 ng de DBA en un gel de agarosa al 1% en TAE. El ADN genómico de los animales nacidos muertos (A y B) se degrada como cabía esperar a partir del animal muerto, pero todavía puede usarse el ADN para un análisis por PCR.

La Figura 11B es una reproducción fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación por PCR de un fragmento del gen \beta-globina de ratón y de la secuencia de indicador de Megafluo (Red5). Panel izquierdo: todas las muestras de ADN genómico son adecuadas para amplificación por PCR ya que se detecta el producto de PCR de 494 pb para el gen \beta-globina. Panel derecho: los animales 1 y 25 y el animal nacido muerto A son transgénicos ya que se detecta el fragmento de 484 pb del gen indicador Megafluo (DSRedE1-5). Los carriles 1, 25, 2, 3, 4 son extracción de ADN genómico de ratones de tres semanas de edad. Los carriles A y B son extracción de ADN genómico de ratones nacidos muertos. El control negativo (-) se corresponde con el plásmido pl-SceI/EGFP. El control positivo (+) se corresponde con el plásmido de Megafluo. Wt se corresponde con ADN genómico extraído de ratones sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el control de contaminación por PCR realizado sin ADN.

La Figura 11C es una reproducción fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación por PCR de un subfragmento de pl-Sce I/EGFP. El control positivo (+) se corresponde con el plásmido pl-SceI/EGFP. Wt se corresponde con ADN genómico extraído de ratones sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el control de contaminación por PCR realizado sin ADN.

La Figura 12 muestra los resultados de la "transgénesis clásica". La Figura 12 es una reproducción fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación por PCR de la secuencia de indicador de Megafluo (Red5). Los carriles 14 a 21 se corresponden con los 8 recién nacidos.

La Figura 13 es un diagrama esquemático de los constructos de plásmidos usados para la transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por un vector que expresa PI-SceI. El promotor de Gas5 acciona la expresión del gen indicador LagoZ (una secuencia de LacZ casi libre de CPG). Estas dos secuencias están flanqueadas por dos sitios de reconocimiento/escisión de PI-SceI en la misma orientación que separan las secuencias de esqueleto del vector. Un único sitio de I-SceI de reconocimiento/escisión está presente entre el promotor y el gen indicador.

La Figura 14 muestra los resultados de la transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por la proteína I-Sce I o PI-Sce I con el constructo PIFF-Lago. La Figura 14 es una reproducción fototipográfica de un gel de agarosa que muestra los resultados de PCR de un fragmento del gen indicador (LagoZ). El control positivo se corresponde con el plásmido PIFFLago. Wt se corresponde con un ADN genómico de ratón sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el control de contaminación por PCR realizado sin ADN.

Panel izquierdo: se realiza el genotipado por PCR en los ADN genómicos de los nueve embriones de 12 días después de la inoculación (dpi) inyectados con el plásmido PIFFLago más proteína I-SceI. El producto de PCR de 370 pb del indicador Lago se detecta en cuatro de nueve embriones (número 101, 102, 103, 105).

Panel derecho: se realiza el genotipado por PCR en los ADN genómicos de los nueve embriones de 14 dpi inyectados con el plásmido PIFFLago más proteína I-SceI. El producto de PCR de 370 pb del indicador Lago se detecta en tres de diez embriones (número 111, 112, 114).

La Figura 15 muestra los resultados de la transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por la proteína I-Sce I con el constructo PIFF-Lago. La Figura 14 es una reproducción fototipográfica de un análisis de transferencia de Southern.

El genotipado de los nueve embriones de 12 dpi inyectados con plásmido PIFFLago más proteína I-SceI se realiza por experimentos de transferencia de Southern. Los ADN genómicos se digirieron con enzima de restricción EcoRI. Se usaron dos sondas diferentes marcadas con digoxigenina; una que se hibrida a las secuencias de Gas5 y la segunda al gen indicador Lago. La detección se realiza con el sustrato CDP-Star (Roche) quimioluminiscente sobre películas Hyperfilm ECL (Amersham). Se detecta un fragmento de 3,1 kpb con la sonda Gas5 y se corresponde con el gen Gas5 de ratón endógeno. Los animales 105, 103 y 101 son transgénicos ya que se detecta una banda adicional. Este fragmento también se detecta cuando la transferencia se deshibrida y se vuelve a sondar con la sonda Lago (panel derecho).

Descripción detallada Definiciones

Por "transgénesis" se pretende la introducción de nuevas secuencias de ADN en el genoma, preferentemente dando como resultado la producción de animales o plantas transgénicos.

Como se usa indistintamente en el presente documento, los términos "ácido nucleico" "oligonucleótido" y "polinucleótido" incluyen ARN, ADN o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido en o bien la cadena sencilla o la forma de dúplex. El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de unidades que comprenden una purina o pirimidina, un resto de azúcar de ribosa o desoxirribosa y un grupo fosfato, o enlace fosfodiéster. "Polinucleótidos" también se refiere a polinucleótidos que comprenden "nucleótidos modificados" que comprenden al menos una de las siguientes modificaciones (a) un grupo de enlace alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina o (d) un azúcar análogo.

Por "in vivo" se desea en una célula estando dicha célula aislada o comprendida en un organismo. El término "in vivo" engloba "in ovo". Por "in ovo" se desea en un huevo.

Flanqueado: Un polinucleótido que va a linealizarse o escindirse está flanqueado por un sitio de escisión si un sitio tal está presente en o cerca tanto en uno como en ambos extremos del polinucleótido. Puede haber un sitio de escisión presente o cerca de un extremo del polinucleótido que va a linealizarse o escindirse o puede haber dos sitios de escisión, uno en o cerca de cada extremo del polinucleótido que va a linealizarse o escindirse. Por "cerca" se desea preferentemente en la presente invención que el sitio de escisión se localice a menos de 1 kb, preferentemente menos de 500 pb, más preferentemente menos de 200 ó 100 pb del extremo del polinucleótido que va a integrarse.

Por escisión se pretende en la presente invención la formación de una rotura bicatenaria de ADN. Por "agente de escisión" se desea el agente que puede escindir el "sitio de escisión".

Por "endonucleasa" se desea una enzima que produce una rotura bicatenaria en la molécula de ADN en localizaciones altamente específicas. Esta endonucleasa puede ser natural. Preferentemente, la enzima es una endonucleasa o meganucleasa casera. Esta endonucleasa también puede ser sintética.

Por "biomolécula" se pretende en la presente invención cualquier molécula orgánica que es una parte esencial de un organismo vivo tal como polipéptido, proteína, polinucleótido de ADN o ARN.

Por "extremos libres" se pretenden extremos romos y nucleótidos protuberantes de 5' o 3' disponibles para la degradación de exonucleasa. Por tanto, en el caso de una molécula lineal, cualquier modificación de 5' y 3' que suprima o disminuya significativamente la degradación de exonucleasa no se considerará como extremos libres. Por ejemplo, un polinucleótido lineal que comprende estructuras secundarias o nucleótidos modificados en sus extremidades que confieren una resistencia a exonucleasa no se considera que tenga extremos libres.

"Células" o "células huésped" son términos usados indistintamente en este documento. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino a la progenie o la posible progenie de una célula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido tanto a una mutación como a influencias medioambientales, tal progenie puede no ser idéntica a la célula parental, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término como se usa en este documento. La célula puede ser una célula madre (preferentemente una célula madre embriónica), una célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo (preferentemente un huevo fecundado).

Por "polinucleótido exógeno" se pretende un polinucleótido sin ninguna similitud con el cromosoma de la célula huésped. Por "sin similitud" se desea menos del 50% de identidad, preferentemente 40 ó 30% de identidad, más preferentemente menos del 20% de identidad con una secuencia del cromosoma de la célula huésped. La similitud de polinucleótidos es tan baja que el polinucleótido no puede hacer recombinación homóloga con el cromosoma de la célula huésped.

"Identidad" se refiere a identidad de secuencias entre dos moléculas de ácidos nucleicos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácidos nucleicos es una función del número de nucleótidos idénticos o de apareamiento en posiciones compartidas por las secuencias de ácidos nucleicos. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST que están disponibles como una parte del paquete de análisis de secuencias por GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con, por ejemplo, parámetros por defecto.

Como se usa en este documento, el término "transgén" significa una secuencia de ácidos nucleicos (o un transcrito antisentido para la misma) que se ha introducido en un genoma de la célula. Un transgén podría ser parcial o completamente heterólogo, es decir, extraño para el animal/planta o célula transgénico en el que se introduce; o es homólogo a un gen endógeno del animal o célula transgénico en el que se introduce, pero se introduce en el genoma del animal en una localización que se diferencia de la del gen natural. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico tal como intrones que pueden ser necesarios para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado. En toda la presente invención, el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse e integrarse es un transgén.

Los "animales no humanos" o "animales transgénicos" de la invención incluyen, pero no se limitan a, mamíferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, peces, ascidios. Los animales no humanos preferidos se seleccionan de la familia de los roedores que incluye rata y ratón, lo más preferentemente ratón, aunque los anfibios transgénicos tales como miembros del género Xenopus y los pollos transgénicos, vaca, ovejas, y peces también pueden proporcionar herramientas importantes.

Un "animal transgénico" o "planta transgénica" se refiere a cualquier animal o planta en el que una o más de las células del animal o planta contienen un transgén introducido a modo de intervención humana tal como por técnicas transgénicas muy conocidas en la técnica. El transgén se introduce en la célula, directamente o indirectamente mediante introducción en un precursor de la célula, a modo de manipulación genética deliberada tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. El término manipulación genética no incluye cruce clásico ni fecundación in vitro, sino que se refiere a la introducción de una molécula de ADN recombinante. Esta molécula se integra dentro de un cromosoma. Además, "animal transgénico" o "planta transgénica" también incluye aquellos animales o plantas recombinantes en los que la alteración génica de uno o más genes se produce por intervención humana que incluye la técnica antisentido. Por animal transgénico también se desea un embrión transgénico.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados se denominan en este documento "vectores de expresión". Un vector según la presente invención comprende, pero no se limita a, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (artificial bacteriano), un vector de baculovirus, un fago, un fagómido, un cósmido, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede estar constituida por un ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de "plásmidos" que se refieren generalmente a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. Aquellos expertos en la materia conocen una gran cantidad de vectores adecuados y están comercialmente disponibles tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiXI74, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pOE-30 (QIAexpress).

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, variolovacuna, viruela aviar y canaripox). Otros virus incluyen, por ejemplo, virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, tipo C de los mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo de HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Fields, y col., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996). Otros ejemplos incluyen virus de la leucemia murina, virus del sarcoma murino, virus del tumor mamario de ratón, virus de la leucemia bovina, virus de la leucemia felina, virus del sarcoma felino, virus de la leucemia aviar, virus de la leucemia de células T humanas, virus endógeno de babuino, virus de la leucemia del mono gibón, virus del mono Mason Pfizer, virus de la inmunodeficiencia simia, virus del sarcoma simio, virus del sarcoma de Rous y lentivirus. Otros ejemplos de vectores se describen, por ejemplo, en McVey y col., documento US5.801.030, cuyas enseñanzas se incorporan en este documento por referencia.

Los vectores según la presente invención pueden comprender transposón (Ivicz y col. 1997, Cell, 91, 501-510; Raz y col., 1998, Current Biology, 8, 82-88; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia).

Los vectores pueden comprender marcadores de selección (por ejemplo, neomicina fosfotransferasa, histidinol deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina fosfotransferasa, timidina cinasa del virus del herpes simple, adenosina desaminasa, glutamina sintetasa e hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa para cultivo celular eucariota; TRP1 para S. cerevisiae; resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli; etc.). Sin embargo, se desea que la invención incluya otras formas tales de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes y que se harán conocidas en la técnica posteriormente a la misma.

\vskip1.000000\baselineskip

Visión general de la invención

La presente invención tiene exactamente como objetivo ofrecer un procedimiento que permita mejorar la eficiencia de integración aleatoria de ADN durante la transgénesis o la transfección estable y permitir un mejor control de la integridad del ADN integrado, además de reducir el número de copias de ADN integrado. La aplicación más interesante de la presente invención es la transgénesis, más particularmente en especies en las que el procedimiento de transgénesis es ineficaz.

El procedimiento según la invención consiste en la linealización o escisión (in vivo) en la célula huésped del polinucleótido de ADN que va a integrarse en el genoma de la célula huésped (véase la Figura 1). La invención se refiere a un procedimiento para integrar aleatoriamente un ADN exógeno en el ADN genómico de la célula huésped en la que el polinucleótido que va a integrarse está linealizado o escindido in vivo a partir de un vector. La linealización o escisión in vivo del polinucleótido que va a integrarse permite generar un fragmento lineal con extremos libres disponible para recombinarse con el ADN genómico de la célula huésped. Según este procedimiento, dicho vector no tiene extremos libres que permitan la protección del transgén contra la degradación. El procedimiento según la presente invención no usa la recombinación homóloga. La integración de polinucleótidos es aleatoria y no está dirigida a diana.

Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para la generación in vivo de un polinucleótido lineal con extremos libres 5' y 3' que se corresponden esencialmente al transgén a partir de polinucleótido que no tiene extremo libre, estando dicho polinucleótido lineal aleatoriamente integrado en el genoma de la célula huésped. En una realización particular de este procedimiento, dicho polinucleótido comprende el vector que tiene un sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped. En una realización preferida de este procedimiento, dicho polinucleótido comprende el vector y está flanqueada por un sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped. Preferentemente, el sitio escindido no genera extremos cohesivos. Preferentemente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse in vivo no comprende ningún sitio de escisión. Opcionalmente, dicho vector comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el agente de escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente. Opcionalmente, el ácido nucleico que codifica el agente de escisión comprende un vector de expresión. Opcionalmente, el ácido nucleico que codifica el agente de escisión es un ARNm. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula.

\vskip1.000000\baselineskip

El procedimiento según la invención consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;

b): producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,

c): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.

\vskip1.000000\baselineskip

Preferentemente, el procedimiento según la invención consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped preparando in vivo dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;

\vskip1.000000\baselineskip

En una realización de la presente invención, el procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector comprende las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias;

b): introducir el agente de escisión o un vector que codifica dicho agente de escisión; y,

c): producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,

\vskip1.000000\baselineskip

En otra realización de la presente invención, el procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector comprende las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped:

-: un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias; y,

-: el agente de escisión;

\vskip1.000000\baselineskip

El procedimiento de la invención es extraordinario porque la liberación del polinucleótido que va a integrarse sólo puede hacerse in vivo después de cruzar la membrana plasmídica de la célula huésped, supuestamente dentro del núcleo. Después de cruzar la membrana plasmídica, la liberación de los extremos del polinucleótido, preferentemente por la endonucleasa, puede lograrse en cualquier momento o en cualquier compartimento de la célula huésped.

Sorprendentemente, la integridad del polinucleótido que va a integrarse se mantiene, la eficiencia de la transgénesis aumenta significativamente en comparación con tanto el ADN circular como el ADN linealizado in vitro y el polinucleótido se integra a un número de copias muy bajo. Para los ratones, la tasa de transgénesis aumenta de 3 a 5 veces con el procedimiento según la presente invención. Además, la integridad del transgén es excelente y el transgén se integra frecuentemente en el genoma de la célula a menos de tres copias, más frecuentemente sólo una copia. Mediante procedimientos convencionales se integran al menos de 10 a 20 copias como un concatémero y, si sólo se integra una copia, que es un acontecimiento muy raro, la integridad del transgén no se mantiene.

Más particularmente, la presente divulgación muestra que la transgénesis mediada por meganucleasa es de hecho una técnica muy simple que es espectacularmente más eficaz que los otros procedimientos actualmente notificados en peces. El procedimiento según la presente invención permite integrar eficazmente ADN en el genoma de peces, más particularmente el genoma de peces medaka (Oryzias latipes) o peces cebra (Danio rerio) (véase el Ejemplo 2). La expresión del transgén mejora espectacularmente. Incluso más sorprendente es el espectacular aumento en la transmisión de la línea germinal. Mientras que en experimentos de inyección en huevo clásicos no se supera, en la mayoría de los casos, un pequeño porcentaje debido a las integraciones quiméricas tardías, la frecuencia de transmisión de la línea germinal en peces coinyectados con la meganucleasa se reforzó al 50%, sugiriendo que se produjo una única inserción en la fase de una célula del pez fundador. Además, en la mayoría de los casos se producen integraciones únicas a bajas copias. Por tanto, la linealización in ovo inducida por meganucleasa, limitando la degradación de extremos libres de ADN preintegrativos, es un procedimiento simple y eficaz para mejorar la transgénesis por inyección en el huevo. Además, la generación de extremos libres de polinucleótidos en la célula puede crear focos de recombinación que podrían mejorar la integración de transgenes.

Por tanto, el procedimiento según la presente invención presenta varias ventajas entre las cuales el aumento de la eficiencia de la transgénesis o de la transfección estable y la disminución del número de copias del polinucleótido integrado.

El procedimiento según la presente invención se refiere a la integración aleatoria del transgén. Por tanto, el transgén no está diseñado para someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. La secuencia de 5' y 3' del polinucleótido que va a integrarse en el genoma no tienen homologías significativas con un locus del genoma del huésped. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido que va a integrarse tienen menos del 90% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 80 ó 70%, más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen menos de 5 kb de longitud, preferentemente menos de 3 kb o 1,5 kb de longitud, más preferentemente menos de 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud.

Para introducir un transgén en un huevo de ratón por recombinación homóloga, el experto en la materia normalmente flanquea el transgén con aproximadamente 5 kb de secuencia homóloga, nunca menos de 3 kb. La recombinación homóloga en huevo es un acontecimiento extremadamente raro. De hecho, con 5 kb de secuencia homóloga, la recombinación homóloga se produce en sólo 1 clon de entre los 10 millones de huevos fecundados. En células embriónicas de peces, la recombinación homóloga nunca se produce, más particularmente en huevo fecundado de peces.

Para la transgénesis, el agente de escisión se coinyecta preferentemente con el vector que comprende el transgén. De hecho, una coinyección del agente de escisión evita el retraso debido a la expresión del agente de escisión. Una integración precoz del transgén es importante para disminuir el mosaicismo.

En una realización de la presente invención, el procedimiento consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de endonucleasa que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente menos del 2, más preferentemente nunca se encuentra en el genoma de la célula huésped:

b): opcionalmente, introducir en dicha célula huésped o la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa presente en dicho vector o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa de restricción; y,

c): producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,

d): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido escindido en dicho genoma de la célula huésped.

En una realización particular de este procedimiento, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse está flanqueado por dos sitios de endonucleasa. Preferentemente, la etapa b) consiste en introducir en dicha célula huésped la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa presente en dicho vector. Preferentemente, las etapas a) y b) son simultáneas. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Opcionalmente, dicho vector comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la endonucleasa. Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse y dicho ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa están constituidos cada uno por un vector distinto. Preferentemente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse no comprende ningún sitio de escisión. Preferentemente, dicho vector es bicatenario. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula. Preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo.

La presente invención se refiere a una composición para transgénesis que comprende:

1): un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse, estando dicho transgén flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,

Preferentemente, dicha composición comprende el agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es un vector de expresión o un ARNm. Dicho transgén que va a integrarse según la presente invención no puede hacer significativamente una recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho transgén que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho transgén que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos cohesivos. Preferentemente, dicho transgén no comprende ningún sitio de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende dicho transgén comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el agente de escisión. Opcionalmente, dicho transgén y dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión están constituidos cada uno por un vector distinto. Preferentemente, dicho transgén está flanqueado por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente. Preferentemente, dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es bicatenario. Preferentemente, dicho vector es un plásmido. Opcionalmente, dicho transgén puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula.

La invención se refiere al uso de la composición según la presente invención para producir células, animales o plantas transgénicos.

Sitio de escisión y agente de escisión

El sitio de escisión según la presente invención no se encuentra preferentemente en el genoma de la célula huésped. Si este sitio de escisión existe en el genoma de la célula, el genoma de la célula presenta no más de 5, preferentemente 2, sitios. Si en el vector existen algunos otros sitios distintos de los sitios flanqueantes, están preferentemente localizados fuera de la región que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse.

El sitio de escisión según la invención es una secuencia o un elemento que es específico del agente de escisión. El agente de escisión puede ser, por ejemplo, una ribozima, una endonucleasa. Preferentemente, el agente de escisión es una endonucleasa. El sitio de escisión según la invención podría ser un nucleótido modificado que en condiciones apropiadas conduce a la escisión de ADN. Tal nucleótido modificado podría ser, por ejemplo, un nucleótido abásico (Lhomme y col., 1999, Biopolymer, 52, 65-83; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia). La presencia de un nucleótido abásico conduce a una escisión, por ejemplo, por la acción de la AP-endonucleasa tal como la exonucleasa III.

En una realización particular de la presente invención pueden usarse dos o más endonucleasas diferentes en el presente procedimiento. El polinucleótido que va a integrarse está flanqueado, por ejemplo, por dos sitios de endonucleasa diferentes y el procedimiento comprende una etapa de introducir cada endonucleasa o uno o varios vectores que codifican las endonucleasas usadas.

Preferentemente, los sitios que flanquean la secuencia de polinucleótidos que va a integrarse no generan extremos cohesivos después de la escisión. Por tanto, si la escisión de los sitios podría conducir a la generación de extremos cohesivos, los sitios tienen preferentemente una orientación inversa de manera que evitan la multimerización por los extremos cohesivos.

La endonucleasa necesita elegirse de manera que genere en el genoma de la célula huésped un número muy bajo de escisiones que puedan ser fácilmente reparadas por la célula sin ninguna lesión para esta célula. De hecho, la célula sin ninguna lesión toleraría un número muy bajo de escisiones en el cromosoma, generalmente menos de 5 roturas bicatenarias, más preferentemente menos de 2 roturas bicatenarias. Preferentemente, la endonucleasa se elige de manera que genere cualquier rotura bicatenaria en el cromosoma de la célula huésped.

Las enzimas de restricción de corte de cuatro y seis bases comúnmente usadas no son convenientes para la presente invención ya que normalmente conducirían a la escisión de ADN cromosómico y a muerte de células debido a la existencia de muchos sitios de restricción dentro del ADN celular.

Preferentemente, los sitios de endonucleasa que flanquean la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse según la invención no se producen naturalmente en la célula huésped. Preferentemente, si el vector que comprende la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse es un plásmido, los sitios de endonucleasa flanqueantes no se producen en la bacteria usada para la producción de plásmidos. Preferentemente, los sitios de endonucleasa flanqueantes se corresponden con endonucleasas que tienen un sitio de reconocimiento de al menos 10, 12, 15, 18, 20, 22 ó 25 nucleótidos. En una realización particular, una endonucleasa usada en la presente invención puede tolerar menos del 10% de cambio en su sitio de reconocimiento, preferentemente el 5%, más preferentemente el 2%.

Una endonucleasa o meganucleasa casera que reconoce una secuencia de ADN grande es un ejemplo de una endonucleasa que puede usarse en la presente invención (Dalgaard y col., 1997, Nucleic Acids Research, 25, 4626-463; Chevalier y Stoddard, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 3757-3774). Un ejemplo de una enzima meganucleasa es I-Sce I que reconoce un sitio de 18 pb que no parece que esté representado en ADN murino o humano. I-SceI genera un corte en bisel de 4 pb con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Para más información sobre la meganucleasa I-SceI véase el documento US 6.238.924 cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia. En una realización preferida, el procedimiento según la presente invención usa endonucleasa I-Sce I y el sitio de reconocimiento y de escisión correspondiente.

Las meganucleasas constituyen una familia de enzimas de corte muy raras. Véase la Figura 2 para una lista de meganucleasas. Las endonucleasas caseras codificadas por intrones ORF, genes independientes o secuencias intervinientes (inteínas) se definen ahora como "meganucleasas". Tienen secuencias de reconocimiento que abarcan 12-40 pb de ADN, mientras que las enzimas de restricción "clásicas" reconocen alargamientos de ADN mucho más cortos en el intervalo de 3-8 pb (hasta 12 pb para cortadoras raras). Las meganucleasas están bastante bien caracterizadas estructuralmente y mecanísticamente. Se clasifican en 4 familias separadas basándose en los motivos de aminoácidos bastante bien conservados.

1 - La familia de los dodecapéptidos (dodecámero, DOD, D1-D2, LAGLI-DADG, P1-P2)

Ésta es la familia más grande de proteínas (más de 150 secuencias) agrupadas por su motivo de secuencias más generalmente conservado: una (5 secuencias) o dos copias (la enorme mayoría) de una secuencia de doce residuos: el di-dodecapéptido. Las meganucleasas con un dodecapéptido (D) tienen una masa molecular de aproximadamente 20 kDa y actúan de homodímero. Aquellas con dos copias (DD) oscilan de 25 kDa (230 AA) a 50 kDa (HO, 545 AA) con 70 a 150 residuos entre cada motivo y actúan de monómero.

2 - Familia GIG

El motivo común es corto, pero está bastante bien conservado: KSGIY (10/11 AA) YIGS. Para estas meganucleasas (28 secuencias) el sitio de escisión es diferente de la secuencia de reconocimiento.

3 - Familia HC

Las secuencias en este grupo son ricas en residuos de histidina y cisteína y la secuencia conservada es aproximadamente: "SHLC - G - G - H - C". La enzima mejor caracterizada: I-Ppo I

4 - Familia HNH y sin motivo

El último grupo de secuencias, reunidas porque no tienen ninguno de los motivos previos, no están estructuralmente bien caracterizadas. La secuencia consenso (HH - N - H - H en una ventana de 35 residuos de aminoácidos) es bastante complicada. Varias propiedades de estas proteínas son distintas de otras meganucleasas porque dejan una extensión en 5' de 2 pb después de una rotura bicatenaria o tienen un largo tamaño de corte en bisel de al menos 10 nucleótidos. (La mayoría de las meganucleasas escinden las dos cadenas de un ADN bicatenario y dejan un extremo sobresaliente en 3' de 4 pares de bases)

\vskip1.000000\baselineskip

Las diferentes clases se resumen:

CLASE I que se caracteriza por: un motivo de dodecapéptido (D1, LAGLI, P1) o dos motivos de dodecapéptido (D1 - D2, LAGLI - GDAG, P1 - P2); y escisión dentro del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 4 nt con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Hay 8 subfamilias que incluyen:

: Un motivo de dodecapéptido: algunos ejemplos son I-Ceu I, I-Cre I

: Dos motivos de dodecapéptido: algunos ejemplos son I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II

CLASE II que se caracteriza por: al menos un motivo específico (GIY-N_{10/11}-YIG); y escisión fuera del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 2 nt con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Algunos ejemplos son I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I

CLASE III que se caracteriza por: caja de His-Cys (SHLC-G-H-C) o sin motivo definido; y o escisión dentro del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 4 nt con nucleótidos protuberantes de 3'OH (un ejemplo es I-Ppo I) o escisión de tamaño largo de corte en bisel de al menos 10 nucleótidos (algunos ejemplos son I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II)

CLASE IV que se caracteriza por: mitad del motivo específico (GIY-N_{10/11}-YIG); y escisión fuera del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 2 nt con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Un ejemplo es I-Tev II

CLASE V que se caracteriza por: motivo HNH (HH-G-N-CH-H); y escisión dentro del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 2 nt con nucleótidos protuberantes de 5'OH. Un ejemplo es I-Tev III.

\vskip1.000000\baselineskip

Las meganucleasas también podrían codificarse por genes "libres". Hasta la fecha se conocen 5 genes caracterizados (F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I, F-Tev II) en levadura y bacteriófagos.

Las meganucleasas podrían ser inteínas. Hasta la fecha se han caracterizado 120 secuencias de proteínas (35 con demostración experimental, 75 teóricas) en 46 especies y cepas diferentes (7 eucariotas, 23 bacterias, 16 arqueas). Hay más de 200 secuencias posibles.

La endonucleasa en el procedimiento de la invención puede elegirse del grupo que incluye, a título no restrictivo: I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II. Preferentemente, dicha endonucleasa se elige del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Sce I. Más preferentemente, dicha endonucleasa es I-Sce I.

Algunas endonucleasas tales como la endonucleasa I-Sce I podrían permanecer no covalentemente unidas a una mitad de sitio de escisión después de la escisión (el sitio grande para I-Sce I). Esta propiedad puede usarse para proteger los extremos libres del polinucleótido escindido contra la degradación de exonucleasa. De hecho, los sitios de escisión están orientados de manera que la mitad del sitio que tiene la capacidad de unión se coloca en las extremidades del polinucleótido. Además, algunas endonucleasas de restricción tales como la endonucleasa I-Sce I presentan adicionalmente una secuencia similar a NLS (secuencia de localización nuclear) que permite elegir como diana el núcleo. Esta propiedad adicional puede usarse para facilitar la elección como diana del núcleo del polinucleótido linealizado o escindido si la linealización o escisión se produce en el citoplasma.

Por tanto, en una realización de la presente invención, los sitios flanqueantes están orientados de manera que la mitad de los sitios que tienen una capacidad de unión de endonucleasa se colocan hacia el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse. En esta realización, los extremos libres del polinucleótido escindido se protegen de la degradación de exonucleasa y/o se facilita el transporte del polinucleótido escindido al núcleo.

Por lo demás, la presencia de una endonucleasa en la mitad del sitio escindido del polinucleótido escindido o linealizado enmascara los extremos libres y hace que estos extremos estén menos disponibles para recombinarse con el genoma de la célula huésped.

Por tanto, en una realización alternativa de la presente invención, los sitios flanqueantes están orientados de manera que la mitad de los sitios que tienen una capacidad de unión de endonucleasa se colocan hacia el vector.

Las endonucleasas sintéticas también se consideran en la presente invención. Estas endonucleasas sintéticas comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio de escisión de ADN.

El dominio de reconocimiento de ADN puede derivarse de proteínas que se producen naturalmente que presentan un dominio de reconocimiento de ADN tal como el dominio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción tipo IIS (por ejemplo, aminoácidos 1-382 de FokI, documento US 5.356.802, cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia). Los dominios de reconocimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el dominio de reconocimientos de motivos de dedo de cinc; motivos de dominio homeo; dominios POU; otros dominios de proteínas de unión a ADN de represor tal como represor lambda, represor lac, cro, ga14; dominios de proteínas de unión a ADN de oncogenes tales como myc, jun; y otras proteínas de unión a ADN específicas de secuencia que se producen naturalmente que reconocen más de 6 pares de bases. El dominio de reconocimiento de ADN podría comprender los siguientes motivos: hélice-giro-hélice, dedo de cinc, receptor esteroideo, hélice-bucle-hélice u otro motivo helicoidal como cremallera de leucina. El dominio de reconocimiento de ADN es preferentemente una combinación de dominios de reconocimiento de ADN existentes si su sitio de reconocimiento tiene menos del 10 nucleótidos (documento WO 96/20951, cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia), por ejemplo, una combinación de al menos tres dedos de cinc (documentos US 6.013.453; US 6.007.988, cuyas divulgaciones se incorporan en este documento por referencia). El dominio de reconocimiento de ADN existente puede ser modificado o natural. Sin embargo, tal dominio de reconocimiento de ADN también podría ser sintético. El dominio de reconocimiento de ADN también podría ser un polinucleótido natural o modificado.

El dominio de escisión de ADN puede derivarse de proteínas que contienen un dominio de escisión de ADN tal como el dominio de escisión de la endonucleasa de restricción tipo II (por ejemplo, aminoácidos 383-578 de Fokl, documento US 5.356.802, cuya divulgación se adjunta en este documento por referencia).

Vector que comprende un ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa

La acción del agente de escisión sobre la célula huésped puede obtenerse tanto mediante administración a la célula huésped del agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, como por expresión del agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, en la célula huésped. En este último caso, el procedimiento de la invención puede realizarse transformando la célula huésped con un ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, bajo el control de secuencias de regulación, en particular un promotor adaptado a la célula huésped. Otra alternativa para la expresión del agente de escisión es la introducción de un ARNm que codifica el agente de escisión en la célula huésped. En la presente invención, el vector que comprende un ácido nucleico que codifica el agente de escisión también designa un ARNm que codifica el agente de escisión.

La invención también contempla el uso de célula huésped de un animal o planta transgénico que expresa el agente de escisión. En este caso, la introducción del agente de escisión o un ácido nucleico que codifica el agente de escisión ya no es necesaria. El ácido nucleico que codifica el agente de escisión está preferentemente operativamente ligado a un promotor específico de la línea germinal tal como VASA, promotores de la síntesis de proteínas en ovocito, promotor fuerte con expresión tan pronto como en la fase II.

El vector que comprende un ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente una endonucleasa, contiene toda o parte de la secuencia codificante para la endonucleasa operativamente ligada a una o más secuencias de control de la expresión por lo que la secuencia codificante está bajo el control de señales de transcripción para permitir la producción o síntesis de la endonucleasa. Por tanto, dicho ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa está comprendida en un casete de expresión. Más particularmente, el vector comprende un origen de replicación, un promotor operativamente ligado a dicho ácido nucleico codificante, un sitio de unión a ribosoma, un sitio de corte y empalme de ARN (cuando se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la ruta deseada para expresar la endonucleasa.

De hecho, para un huésped eucariota, el promotor puede ser un promotor fuerte tal como el promotor de metalotioneína, un promotor de SV40, un promotor retroviral, el promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor ubicuo tal como promotor de vilina o actina, un promotor constitutivo o inducible, un promotor específico de tejido o promotores específicos de tumores tales como el promotor de \alpha-fetoproteína, el promotor de amilasa (especialmente, el promotor de amilasa murina), el promotor de catepsina E, el promotor del receptor muscarínico M1 o el promotor de \gamma-glutamiltransferasa. Opcionalmente, el vector podría contener adicionalmente un potenciador y aislante (Kaffer y col., Genes Dev. 2000, 14, 1908-19; documentos EP 859.059; WO96/04390, cuyas divulgaciones se incorporan en este documento por referencia). Si la célula huésped es un huevo fecundado o una célula de blástula, el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, necesita expresarse en una fase temprana.

Los elementos que permiten la producción o síntesis de la endonucleasa pueden ser nativos, derivados de elementos nativos o preparados de novo. Entonces, los elementos pueden aislarse y fusionarse juntos mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como usando sitios de clonación y restricción compatibles. Una ventaja del procedimiento según la presente invención es que sólo una expresión transitoria de la endonucleasa apropiada es necesaria para escindir el polinucleótido lineal que va a integrarse en el genoma de la célula huésped.

Si la célula huésped es procariota, los vectores de la presente invención contendrán, por tanto, al menos un promotor que puede ser reconocido por una ARN polimerasa procariota y así permitir la transcripción de un polinucleótido que está operativamente ligado a ese promotor. El vector puede tener múltiples promotores procariotas si se desea. El (Los) promotor(es) procariota(s) específico(s) empleado(s) dependerá(n) de la célula procariota que va a ser el huésped del vector. Ejemplos de promotores adecuados incluyen promotores procariotas constitutivos o inducibles tales como los promotores \lambdapL o \lambdapR, el promotor de T6 polimerasa, el promotor de T7 polimerasa u otros promotores bien caracterizados (por ejemplo, lac, recA, gal, trp, ara, hut, etc.). Lo más preferentemente, el promotor usado para la expresión en células procariotas será inducible.

Los vectores de expresión eucariotas preferidos contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los diversos procedimientos empleados en la preparación de plásmidos y la transformación de organismos huésped son muy conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, además de los procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) capítulos 16 y 17; cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia.

Polinucleótido que va a linealizarse o escindirse en la célula huésped

El polinucleótido que va a linealizarse o escindirse con el procedimiento de la invención puede ser cualquier polinucleótido natural o sintético. Dicho polinucleótido es preferentemente exógeno a la célula huésped. Más preferentemente, dicho polinucleótido es no similar a la secuencia de cromosomas de la célula huésped. Puede comprender una secuencia de genes o una secuencia de intergenes. Puede comprender secuencia codificante o no codificante. Dicha secuencia codificante codifica cualquier producto deseado que incluye péptidos, proteínas y ARN. El polinucleótido puede codificar una proteína indicadora. Puede comprender una secuencia codificante para un polipéptido o un antisentido, o una secuencia reguladora tal como un promotor, un potenciador, un silenciador, etc. Puede comprender una secuencia de reconocimiento para una molécula tal como una hormona, un factor de transcripción, una endonucleasa, un polinucleótido, etc.

El polinucleótido que va a integrarse puede comprender un gen indicador tal como \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, proteína verde fluorescente, tirosinasa, proteínas DsRed. Por gen indicador se desea cualquier ácido nucleico que codifica un producto fácilmente ensayado. Preferentemente, el gen indicador está bajo el control de un promotor fuerte o un promotor específico de tejido.

Más particularmente, el polinucleótido que va a integrarse con el procedimiento de la invención puede elegirse del grupo que incluye, a título no restrictivo:

: Proteínas que codifican genes: proteínas secretadas tales como eritropoyetina, albúmina, hormona de crecimiento, \alpha1-antitripsina; proteínas de superficie; por lo demás, proteínas tales como hemoglobina (\alpha, \beta, \gamma, \varepsilon), colágenos (tipo I, II, III, IV, \alpha1 a 5), receptores de quimiocina, interferones (a, \beta, \gamma), caspasa, p53, etc.

: Secuencias que codifican ARN de transferencia: ARNt para codones inusuales (ARNt mitocondrial o sintético),

: Secuencias que codifican el gen \alpha de vacunación, un superantígeno, un adyuvante (C3d);

: Secuencias que codifican un péptido tal como un péptido de CMH reducido;

: Secuencias que codifican una cadena de HLA;

: Secuencias que codifican la combinación de citocromo p450;

: Secuencias que codifican una ruta metabólica (lisina o fenilalanina).

: Secuencias reguladoras de cromatina tales como el gen de la inactivación del cromosoma X (gen xist), gen con efecto materno (gen ddk), secuencia de apertura de cromatina (HNF4), secuencia rica en CpG con bajo o alto número de sitios SP1 (CCCGCC/G o C/GGCGGG), secuencia de MAR o SAR, origen de replicación cromosómico eucariota, bacteriano o viral:

: secuencias reguladoras de la transcripción tales como secuencias que controlan la apertura de cromosomas para la transcripción (región de control de locus LCR, región de control dominante DCR), promotores constitutivos eucariotas o específicos de tejido, promotores inducibles (metaloproteína, operadores bacterianos, promotor T7, promotor inducible de tetraciclina (tet-ON y tet-OFF), potenciadores, silenciadores, ARN polimerasa (T7 polimerasa o polimerasa viral), sitios internos de entrada al ribosoma IRES seguidos de un gen de interés;

: Secuencias interesantes para la manipulación del genoma tales como sitios de meganucleasas (ej: I-Sce I, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II, I-Ceu I, I-Dmo I, I-Chu I, PI-Sce I, PI-Pspl o sitios para meganucleasas sintéticas); secuencias repetidas (ALU, SINES, LINES); micro y minisatélites; sitios de RAG, IoxP, FRT o \beta-resolvasa; secuencias de repeticiones invertidas de transposones; transposones; provirus; LTR de transposones y virus;

: Secuencias antisentido y ribozimas: antisentido de ARNm, más particularmente de ARNm de p53, Rb, p16, p21, ARNm de proteínas implicadas en la manipulación del genoma tales como meganucleasas, RAG, transcriptasas, ARNm virales.

En el caso de un gen, el polinucleótido incluye preferentemente todos los elementos necesarios para la expresión del gen. Por tanto, el polinucleótido codificante está operativamente ligado a una o más secuencias de control de la expresión por lo que la secuencia codificante está bajo el control de señales de transcripción para permitir la producción o síntesis del producto codificado. Dicho polinucleótido codificante está comprendido en un casete de expresión. Más particularmente, el vector comprende un origen de replicación, un promotor operativamente ligado a dicho ácido nucleico codificante, un sitio de unión a ribosoma, un sitio de corte y empalme de ARN (cuando se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la ruta deseada para expresar el producto codificado. De hecho, el promotor puede ser un promotor fuerte tal como el promotor de metalotioneína, un promotor de SV40, un promotor retroviral, el promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor ubicuo tal como promotor de vilina o actina, un promotor constitutivo o inducible, un promotor específico de tejido (véase el documento WO 98/56902, Tabla 1; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) o promotores específicos de tumores tales como el promotor de \alpha-fetoproteína, el promotor de amilasa (especialmente, el promotor de amilasa murina), el promotor de catepsina E, el promotor del receptor muscarínico M1 o el promotor de \gamma-glutamiltransferasa. Opcionalmente, el vector podría contener adicionalmente un potenciador y aislante (Kaffer y col., Genes Dev. 2000, 14, 1908-19; documento EP 859.059; WO96/04390, cuyas divulgaciones se incorporan en este documento por referencia).

Los elementos que permiten la producción o síntesis del transgén pueden ser nativos, derivados de elementos nativos o preparados de novo. Entonces, los elementos pueden aislarse y fusionarse juntos mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como usando sitios de clonación y restricción compatibles.

Vector que comprende un polinucleótido que va a linealizarse o escindirse

En una realización preferida de la invención, el vector que comprende la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse también comprende la secuencia que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, correspondiente a los sitios flanqueantes. En esta realización bastante preferida, el gen que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, contiene sus propias secuencias de regulación y, por tanto, no está situado en el mismo marco de lectura abierto que el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse.

El vector que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse en el genoma de la célula huésped flanqueado por el sitio de escisión puede prepararse según procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, este vector puede prepararse por síntesis química, tecnología de ADN/ARN recombinante o una combinación de ambos (Sambrook y col., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor University Press, Nueva York (1989); y Ausubel y col., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1997); cuyas divulgaciones se incorporan en este documento por referencia).

El vector que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse según la presente invención no presenta ningún extremo 5' o 3' libre. El vector es ventajosamente una molécula de ADN circular tal como un plásmido, pero también puede ser una molécula lineal que tiene sus extremos inaccesibles para la exonucleasa. En un primer ejemplo, los extremos adoptan una estructura secundaria tal como una horquilla que protege los extremos de la exonucleolisis. En un segundo ejemplo, los extremos podrían modificarse químicamente con el fin de bloquear la acción de exonucleasas. Tales modificaciones pueden ser, por ejemplo, el uso de enlaces de fosfotioato que son resistentes a exonucleasa (Putney 1981; Olsen y Ecktein 1990). En un tercer ejemplo, los extremos podrían ligarse a moléculas estéricamente bloqueantes que impiden el acceso a la exonucleasa. Tales moléculas pueden ser, por ejemplo, una proteína o una poliamida. Esta proteína podría tener algo de afinidad por el núcleo y podría desencadenar el vector al núcleo. Preferentemente, el sustituyente de bloqueo tiene un peso molecular de no más de 1 kD. Puede usarse una variedad de sustituyentes no tóxicos tales como biotina, colesterol u otros esteroides, o un colorante fluorescente catiónico no intercalante.

La Figura 3 desvela algunos ejemplos de vectores lineales según la presente invención. En la Figura 3A, un vector lineal puede obtenerse a partir de un plásmido que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por dos sitios de endonucleasa tales como sitios de I-Tev III, flanqueados por sí mismos por otra endonucleasa tal como los sitios F-Tev I. In vitro, la endonucleasa F-Tev I escinde los sitios F-Tev I y esta escisión produce extremos protuberantes que pueden adoptar una estructura de horquilla. Opcionalmente puede usarse una ligasa con el fin de cerrar covalentemente el bucle. La célula huésped puede transfectarse con este constructo lineal con las horquillas en sus extremos estando el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por dos sitios de endonucleasa tales como los sitios I-Tev III.

Similarmente, en la Figura 3B, un vector lineal con una horquilla en cada uno de los extremos puede prepararse como sigue. In vitro, el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse se prepara con extremos romos o extremos cohesivos. Este polinucleótido se mezcla con oligonucleótidos que forman una horquilla presentando tal horquilla un sitio de escisión, preferentemente un sitio de endonucleasa, en su cola. El extremo de la cola de horquilla puede ser romo o cohesivo. Se hace una ligación con el fin de unir covalentemente la horquilla y el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse. (Perrin y col., EMBO J 1993, 12, 2939-2947; cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia).

Los vectores que comprenden el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por el sitio de escisión y/o el ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, pueden introducirse en una célula mediante una variedad de procedimientos (por ejemplo, transformación, transfección, captación directa, bombardeo de proyectiles, usando liposomas). Ejemplos de procedimientos adecuados de transfección o transformación de células incluyen precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, infección, lipofección y captación directa. Tales procedimientos se describen en más detalle, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición. Cold Spring Harbor University Press, Nueva York (1989); y Ausubel, y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1998), cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia. Otros procedimientos adecuados también se describen en la técnica. En una realización de la presente invención, los vectores están asociados a la sustancia susceptible de permitir o de facilitar la transformación de la célula huésped. Los vectores que comprenden el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por el sitio de escisión y/o el ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, también pueden introducirse en una célula huésped dirigiendo el vector a los fosfolípidos de la membrana celular. Por ejemplo, dirigiendo el vector a una proteína VSV-G, una proteína viral con afinidad por todos los fosfolípidos de la membrana celular. Un constructo tal puede producirse usando procedimientos muy conocidos para aquellos expertos en la materia.

El agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, puede introducirse en una célula según procedimientos generalmente conocidos en la técnica que son apropiados para la endonucleasa particular y el tipo de célula. Por ejemplo, una endonucleasa puede introducirse en una célula por captación directa, microinyección, precipitación de fosfato de calcio, electroporación, infección y lipofección. Tales procedimientos se describen en más detalle, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor University Press, Nueva York (1989); y Ausubel, y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1998), cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia. Otros procedimientos adecuados también se describen en la técnica. La endonucleasa puede acoplarse a un facilitador de la entrada de proteínas para facilitar la introducción de la enzima en una célula. Ejemplos de facilitadores de la entrada de proteínas incluyen tat, HSV VP22 y la toxina del carbunco. El acoplamiento de una proteína a un facilitador de la entrada de proteínas puede llevarse a cabo usando procedimientos muy conocidos para aquellos expertos en la técnica. Las estrategias de liberación de proteínas (por ejemplo, HSV VP22, toxina del carbunco) pueden evaluarse según los procedimientos de la invención descritos en este documento.

Una vez en la célula, los vectores que comprenden el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por el sitio de escisión y, si es necesario, el ácido nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, o el propio agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, se importan o se translocan por la célula desde el citoplasma hasta el núcleo.

Células huésped y organismos multicelulares

Como se usa en este documento, una célula se refiere a una célula procariota tal como una célula bacteriana o una célula eucariota tal como una célula de animal, planta o levadura. Más preferentemente, la célula es una célula eucariota. La célula puede ser una célula madre (preferentemente una célula madre embriónica), una célula somática, un gameto, un blastómero o un huevo (preferentemente un huevo fecundado). La célula huésped puede provenir de pez, ave, mamíferos no humanos, insecto, anfibio, reptil, preferentemente de medaka, pez cebra, ratones, pollos, Xenopus, ovejas, vaca conejo, más preferentemente de peces, pollos y ratones. La célula huésped puede tener todas las fases de diferenciación, de células totipotentes a diferenciadas. Ejemplos de células de mamífero incluyen células humanas (tales como células HeLa), bovinas, ovinas, porcinas, murinas (tales como células madre embriónicas), de conejo y mono (tales como células COS1). La célula puede ser una célula embriónica, célula madre de médula ósea u otra célula progenitora. Si la célula es una célula somática, la célula puede ser, por ejemplo, una célula epitelial, fibroblasto, célula de músculo liso, célula sanguínea (incluyendo una célula hematopoyética, eritrocito, célula T, célula B, etc.), célula tumoral, célula de músculo cardiaco, macrófago, célula dendrítica, célula neuronal (por ejemplo, una célula glial o astrocito, o célula infectada por patógenos, por ejemplo, aquellas infectadas por bacterias, virus, virusoides, parásitos o priones). De hecho, el procedimiento para integrar un polinucleótido en el genoma de la célula huésped según la presente invención está muy adaptado para la transfección estable.

Por tanto, el procedimiento de la invención es particularmente bastante útil para la transgénesis para la terapia génica, producción de proteína recombinante en animales o plantas, producción de animales transgénicos como modelos. Como consecuencia, la invención tiene por objeto un procedimiento de transgénesis de un organismo pluricelular que consiste en administrar a dicho organismo una composición que comprende uno o varios vectores que comprenden el polinucleótido que va a escindirse o linealizarse y, opcionalmente el agente de escisión, como se define previamente, posiblemente asociados a una sustancia susceptible de permitir o de facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares de dicho organismo por dicho vector para entonces generar en dichas células la molécula lineal lista para ser integrada sometiendo dichas células a la acción de la escisión.

El procedimiento de la invención se realiza in ovo o in vivo en células tales como células en cultivo o directamente in situ en un tejido, órgano u organismo multicelular.

El procedimiento de transgénesis según la invención es particularmente bastante deseado para animales elegidos del grupo que incluye, pero que no se restringe a: ganado (vacas), cabras, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos (arañas, mariposas, moscas), peces, calamar, Amphoxius, Xenopus, aves, pollos, ascidios y razas ovinas (ovejas).

Los peces transgénicos se producen introduciendo un vector según la presente invención en células de pez, gametos tales como espermatozoide o célula embriónica, preferentemente células embriónicas, y más preferentemente en un embrión de una célula. Si el vector se introduce en células embriónicas, el pez transgénico se obtiene permitiendo que la célula o células embriónicas se transformen en un pez. La introducción de los vectores en células embriónicas de peces y el posterior desarrollo del pez se simplifican por el hecho de que los embriones se desarrollan fuera del pez progenitor. Alternativamente, si el vector se introduce en el espermatozoide, la fecundación de los oocitos se hace con el espermatozoide transfectado y se permite que el embrión se transforme en un pez. Preferentemente, el espermatozoide se transfecta con el vector que comprende el transgén y con el agente de escisión.

El pez transgénico se selecciona del grupo que está constituido por salmón, trucha, atún, mero, siluro, pez cebra, medaka, carpa, pez espinoso, Astyanax, tilapia, carpa dorada, lubina, pez espinoso, Astyanax, esturión y locha. Los más preferidos son medaka y pez cebra. Sin embargo, el procedimiento según la presente invención también podría aplicarse para producir especies transgénicas acuáticas tales como Xenopus, gamba, erizo de mar.

\vskip1.000000\baselineskip

La célula huésped en el procedimiento de la invención puede elegirse del grupo que incluye, pero que no se restringe a:

Microorganismo:

Para fin de producción industrial:

: K. lactis, P. pastoris, S. cerevisi\ae, S. pombe, A. immersus, P. limus, E. coli

2) Vacunas bacterianas o eucariotas:

: Listeria monocytognese, bacilo Calmette Guerin

: S. cerevisi\ae, S. pombe, C. albicans, Plasmodium falciparum, amebas

\vskip1.000000\baselineskip

Plantas:

1) Producción de biomoléculas

: Soja, colza, trigo, maíz, arroz

2) Plantas transgénicas

: Tomates, fresas, manzanas, cítricos, tabaco

3) Medicina alimentaria y plantas para vacunas

: Espinaca, cereal

4) Producción de biomateriales

: Caucho, papel, madera

\vskip1.000000\baselineskip

Animales:

1) Producción de biomoléculas y vacunas

: Vacas, cabras, ovejas, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos

2) Animales transgénicos

: Peces, calamar, Amphoxius, Xenopus, aves, pollos, ganado, razas ovinas

3) Producción de biomateriales

: Gusanos de seda, arañas, mariposas, moscas, ovejas, bovino, raza ovina

\vskip1.000000\baselineskip

La presente invención también se refiere a las células resultantes y a sus usos, por ejemplo, para la producción de proteínas u otros genes, biomoléculas, biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, animales transgénicos o para el tratamiento o la profilaxis de una afección o trastorno en un individuo (por ejemplo, un ser humano u otro vertebrado mamífero) que se produce como resultado de un defecto genético. Por ejemplo, las células pueden producirse (por ejemplo, ex vivo) mediante los procedimientos descritos en este documento y luego se introducen en un individuo usando procedimientos conocidos. Alternativamente, las células pueden modificarse en el individuo (sin extraerse del individuo).

Por tanto, la invención se refiere además a un procedimiento de producción de proteínas, biomoléculas, biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, animales transgénicos o a un procedimiento de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo en necesidad del mismo, en el que tal procedimiento comprende el procedimiento de linealización o escisión in vivo según la presente invención.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que las células madre embriónicas se transfectan mediante el procedimiento según la presente invención y opcionalmente se criban para el acontecimiento de integración aleatoria, las células se inyectan en embriones en una fase en la que pueden integrar las células transfectadas, por ejemplo en la fase de blastocisto, los embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los que se observa la colonización por células madre embriónicas de la línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos.

Además, la invención también se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que huevos fecundados se transfectan mediante el procedimiento según la presente invención. Si es necesario, los huevos se reimplantan en una madre sustituta y los individuos transgénicos se obtienen al final de la gestación. Opcionalmente, los huevos pueden cribarse para el acontecimiento de integración aleatoria antes de la reimplantación en una madre sustituta. Por lo demás, los huevos se incuban en condiciones que permitan el crecimiento del embrión y la generación del animal transgénico.

Por ejemplo, generalmente pueden obtenerse embriones de peces o células embriónicas recogiendo huevos inmediatamente después de ser puestos. Dependiendo del tipo de pez, generalmente se prefiere que los huevos se fecunden antes de o en el momento de la recogida. Esto se realiza preferentemente poniendo juntos un pez macho y hembra en una pecera que permita la recogida de huevos en condiciones que estimulen el apareamiento. Después de recoger los huevos se prefiere eliminar el corión del embrión antes de la exposición del embrión para introducir los vectores. Esto puede hacerse manualmente o, preferentemente, usando una proteasa tal como pronasa. Un huevo fecundado antes de la primera división celular se considera un embrión de una célula. Por tanto, el huevo fecundado se considera una célula embriónica. Preferentemente, una célula huésped según la presente invención es una célula embriónica de pez, preferentemente un huevo fecundado o un blastómero de un embrión en la fase de blástula. Lo más preferentemente, la célula huésped es un huevo fecundado.

Los vectores que comprenden el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse según la presente invención pueden introducirse en células embriónicas de peces usando cualquier técnica adecuada (por ejemplo, transformación, transfección, captación directa, bombardeo de proyectiles, usando liposomas). Muchas técnicas para tal introducción de material genético exógeno se han demostrado en peces y otros animales. Éstas incluyen microinyección (Culp, 1991, anteriormente), electroporación (Inoue y col., 1990, Cell. Differ. Develop. 29, 123-128; Müller y col. 1993, FEBS Lett. 324, 27-32; Murakami y col. J. Biotechnol. 34, 35-42; Müller y col. 1992, Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1, 276-281; Symonds y col. 1994, Aquaculture 119, 313-327), bombardeo con pistola de partículas (Zelennin y col., 1991 FEBS Lett. 287, 118-120) y el uso de liposomas (Szelei y col., 1994, Transgenic Res. 3, 116-119) (la enseñanza de estos documentos se incorpora en este documento por referencia). Preferentemente, los vectores se introducen por microinyección.

El agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, puede introducirse en una célula embriónica de pez según procedimientos generalmente conocidos en la técnica que son apropiados para la endonucleasa particular y el tipo de célula. Preferentemente, el agente de escisión se coinyecta con el vector que comprende el transgén.

Después de la introducción del (de los) vector(es) según la presente invención se deja que el embrión se transforme en pez. Esto implica generalmente no más de incubar los embriones bajo las mismas condiciones usadas para incubar el huevo. Sin embargo, las células embriónicas también pueden incubarse brevemente en un tampón isotónico. Si es apropiado, la expresión del transgén puede observarse durante el desarrollo del embrión.

El pez o embrión de pez que alberga el transgén puede identificarse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el genoma de peces puede sondarse para la presencia del transgén por transferencia de Southern o Northern. La presencia del transgén también puede detectarse usando PCR u otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos específicos de secuencia. La presencia de este producto puede ensayarse con el fin de identificar el producto de expresión del transgén.

El pez transgénico puede proporcionar un pez con la característica deseada de forma que el pez o un descendiente del pez tiene la característica deseada. Ejemplos de una característica deseada incluyen valor nutritivo potenciado y/o novedoso, resistencia a enfermedades, potenciación del crecimiento (crecimiento más rápido, aumento del tamaño corporal o aumento del tamaño de la camada) o producción de una proteína deseada. Por proteína deseada se indica una proteína que confiere un rasgo característico al pez en el que se produce o una proteína que cuando se aísla del pez es deseable para usos fuera del pez. La proteína deseada puede producirse en un tejido específico, un subconjunto de tejidos o en una amplia gama de tejidos. Ejemplos de proteínas deseadas incluyen proteínas que corrigen una afección anormal en el pez o proteínas terapéuticas para el pez o algún otro animal.

El pez transgénico puede usarse como modelo de estudio. El patrón de expresión de un gen, más particularmente un gen de pez, puede estudiarse con tal pez transgénico midiendo o identificando la expresión del transgén en tejido diferente (expresión específica de tejido) a diferentes tiempos durante el desarrollo (expresión regulada por el desarrollo o expresión específica de la etapa de desarrollo), en diferentes líneas celulares (expresión específica de la línea celular). Los peces transgénicos también son útiles para identificar compuestos o genes que afectan la expresión de un gen que ha sido introducido por transgénesis, preferentemente un gen de pez. Una forma de analizar la expresión en el tejido de pez diferente es diseccionar el pez y ensayar en la muestra de tejido separada. El ARN puede detectarse usando cualquiera de las numerosas técnicas de detección de ácidos nucleicos. Se prefiere el uso de proteínas indicadoras ya que estas proteínas se detectan fácilmente. Una forma preferida de ensayar el patrón de expresión del transgén durante el desarrollo es usar un producto de expresión que puede detectarse en embriones o animales vivos tales como GFP o DsRed.

En una aplicación de la presente invención, la introducción del transgén puede crear una mutación por inserción en el pez. Tales genes mutados se clonan fácilmente porque el transgén insertado sirve de marca para la clonación. Los genes que afectan cualquier procedimiento de interés que puede detectarse pueden identificarse por tal mutagénesis por inserción. Además, en otra aplicación, el transgén es un gen indicador usado en un constructo de trampa de genes. Por trampa de genes se indica un gen indicador que sólo puede expresarse después de que el ADN se integre en un gen activo en la célula huésped, en este caso una célula de pez. Los vectores de trampas de genes son particularmente útiles para identificar inserciones en genes activos. (Kitajima y col., Biochem Cell Biol 1998 76:1029-37; Zambrowicz y col., Int J Dev Biol 1998 42 1025-36; Cecconi y col., FEBS Lett. 2000 480 63-71; la enseñanza de estos documentos se incorpora en este documento por referencia).

Por tanto, el procedimiento de la invención es particularmente bastante útil para la producción de pez de proteína recombinante, producción de peces transgénicos como modelos. Como consecuencia, la invención tiene por objeto un procedimiento de transgénesis de peces que consiste en administrar a dicha célula embriónica de pez una composición que comprende uno o varios vectores que comprenden el polinucleótido que va a escindirse y, opcionalmente el agente de escisión, como se define previamente, posiblemente asociados a una sustancia susceptible de permitir o de facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares de dicho organismo por dicho vector para entonces generar en dichas células la molécula lineal lista para ser integrada sometiendo dichas células a la acción de la escisión.

La presente invención también se refiere a las células resultantes y a sus usos, por ejemplo, para la producción de pez transgénico como modelo o comida, o para producir proteínas u otros genes, biomoléculas, biomateriales y vacunas.

Por tanto, la invención se refiere además a un procedimiento de producción de proteínas, biomoléculas, biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, pez transgénico, en el que tal procedimiento comprende el procedimiento de linealización o escisión in vivo o in ovo según la presente invención.

Además, la invención también se refiere a un procedimiento para producir un pez transgénico en el que huevos fecundados se transfectan mediante el procedimiento según la presente invención y los huevos se incuban en condiciones que permitan su transformación en pez transgénico. Opcionalmente, los huevos pueden cribarse para el acontecimiento de integración aleatoria antes de su incubación.

Las informaciones detalladas para el pez pueden aplicarse a las especies de no mamíferos tales como Xenopus, gamba, erizo de mar, ascidias, aves, pollos, Amphoxius.

La invención también contempla un procedimiento de transgénesis en el que un material genético completo (el ADN contenido en un núcleo) se transfiere junto con el vector que comprende el polinucleótido que va a integrarse en el genoma del huésped y el agente de escisión en un huevo sin fecundar cuyo núcleo propio se ha eliminado.

Por tanto, la invención tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende como agente activo un vector que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse según la presente invención, posiblemente asociado en la composición farmacéutica a una sustancia susceptible de permitir o de facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares por dicho vector. Una realización de la composición farmacéutica según la invención consiste en asociar dicha composición en un kit transgénico a una composición que contiene el agente de escisión, preferentemente una endonucleasa de restricción.

La invención tiene finalmente por objeto el uso de un vector que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse según la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica prevista para transformar uno o varios tipos celulares de un sujeto al que se administra dicha composición estando dichas células expuestas después de la transformación a la acción del agente de escisión, preferentemente una endonucleasa de restricción. Como se indica previamente, dicho vector está posiblemente asociado en la composición farmacéutica según la invención a una sustancia susceptible de permitir o de facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares por dicha molécula.

La invención se refiere a un procedimiento de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo en necesidad del mismo mediante integración aleatoria de un polinucleótido en el genoma del individuo según la presente invención. Una enfermedad genética se debe frecuentemente a una baja expresión de un gen o por la expresión de un gen mutado que no es funcional. Por ejemplo, mediante la integración de un gen correcto con los elementos apropiados para su expresión, el gen puede expresarse y el defecto genético puede compensarse. En caso de una enfermedad genética debida a una sobreexpresión de un gen, la integración de un polinucleótido que permite la expresión de un antisentido, por ejemplo, podría impedir la expresión de este gen y compensar el defecto genético debido a la sobreexpresión. El procedimiento según la presente invención puede aplicarse a una cualquiera de las terapias génicas contempladas.

Otras ventajas y características de la invención aparecerán en los siguientes ejemplos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimiento de linealización in vivo en células humanas

(véanse las Figuras 4 y 5)

Construcción de pVirtkU_{3}R\betageo (véase la Figura 4)

El plásmido pU_{3}R se obtuvo por la inserción en el plásmido pBS KS+ (Stratagene, # X52328) del fragmento de 990 pb del segmento 7840-8330 del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMULV) que comprende la secuencia U_{3} de la secuencia de repetición invertida de 3' seguida de la secuencia R. El fragmento U_{3}R comprendía las secuencias de potenciador y promotor de MoMULV y la señal de poliadenilación AATAAA contenida en la secuencia R. El plásmido pVirU_{3}R se obtuvo en dos etapas. En primer lugar, la secuencia 5'-ATTACCCTGTTATCCCTAATGAAAGA-3' que comprendía el sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I seguido de la repetición invertida del virus MoMULV se insertó aguas arriba de la secuencia U_{3}R del plásmido pU_{3}R. Este sitio de endonucleasa I-Sce I se llama en este ejemplo "sitio de endonucleasa I-Sce I de 5'". En segundo lugar, la secuencia 5'-TAGGGA
TAACAGGGTAATTTACTTTCA-3' que comprendía la repetición invertida del virus MoMULV seguida del sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I se insertó aguas abajo de la secuencia U_{3}R del plásmido intermedio. Este sitio de endonucleasa I-Sce I se llama en este ejemplo "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". La orientación de los sitios de endonucleasa I-Sce I se hizo de manera que mantuvieran el sitio pequeño (TAGGGAT o ATCCCAT) hacia la secuencia U_{3}R. Por tanto, la orientación del sitio era opuesta con el fin de evitar la generación de extremos cohesivos. Esta orientación se llama "el sitio pequeño hacia el centro del inserto". El plásmido pVirU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en el plásmido pVirU_{3}R de un fragmento de restricción Xho/de 5,3 kb que comprendía el gen de fusión \beta-geo del plásmido pRSV\betageo (Friedrich y Soriano, 1991, Genes Dev, 5, 1513-1523; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) (fusión del gen lacZ que codifica el gen de \beta-galactosidasa bacteriano fusionado en fase en su extremo 3' con el gen de resistencia neo que codifica la neomicina fosfotransferasa) seguido del sitio de poliadenilación del virus SV40 en el sitio Xho/localizado entre la secuencia R y la repetición invertida del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'".En el plásmido pVirU_{3}R\betageo, la expresión de \betageo se controló por el promotor U_{3} de MoMULV. El sitio de poliadenilación de SV40 está dirigido hacia el "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". El plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en pVirU_{3}R\betageo aguas arriba del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 5'" del fragmento de restricción BamHI-NsiI de 2,5 kb del plásmido pHSVTK (Mansour y col., 1988, Nature, 336, 348-352; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) que comprende un gen que codifica la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple HHV1 bajo el control de su propio promotor y sin su sitio de poliadenilación. La expresión del gen tk usa el sitio de poliadenilación de la secuencia R del virus MoMULV. Véase la
Figura 4.

Uso del sistema pVirtkU_{3}R\betageo para la validación del procedimiento de linealización in vivo

Se cotransfectó pVirtkU_{3}R\betageo en el organismo diana con el vector de expresión de la endonucleasa I-Sce I pCMV-I Sce I + o pCMV-I Sce I - (Choulika y col., 1995 Mol Cel Biol, 15, 1968-1973; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia). pCMVI-SceI+ es un vector en que el ORF que codifica la endonucleasa tiene una buena orientación con respecto al promotor de CMV para la expresión de endonucleasa I-Sce I. pCMVI-SceI se refiere a un constructo de plásmidos en el que el ORF que codifica la endonucleasa tiene una orientación inversa con respecto al promotor de CMV y, por tanto, no conduce a la expresión de endonucleasa.

Si el plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se escindió in vivo por la endonucleasa I Sce I, la escisión se produjo aguas arriba y aguas abajo de los sitios de repeticiones invertidas, concretamente en los sitios de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I. Si el plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se escindió in vivo por I-Sce I, el promotor de MoMULV contenido por U_{3} activó la transcripción del gen \betageo. Si el plásmido pVirtkU_{3}R\betageo no se escindió, la transcripción del cistrón que expresa el gen tk terminó por la poliadenilación en la secuencia R localizada aguas abajo de U3 y se evitó la expresión de \betageo. La selección de integración del fragmento linealizado in vivo se hizo tanto en dos etapas como en sólo una etapa. En la selección de dos etapas; en primer lugar, una selección con 1 \muM de ganciclovir con el fin de eliminar clones que presentan una integración del plásmido completo; y en segundo lugar, una selección con 50 \mug/ml de G418 con el fin de seleccionar los clones que expresan \betageo. En la selección de una etapa, una selección con 50 \mug/ml de G418 con el fin de seleccionar los clones que expresan \betageo. Véase la Figura 5.

Construcción del plásmido de control pU_{3}R\betageo

El plásmido pU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en pU_{3}R de un fragmento de restricción Xho I de 5,3 kb que comprendía el gen de fusión \beta-geo del plásmido pRSV/\betageo (Friedrich y Soriano, anteriormente) seguido del sitio de poliadenilación del virus SV40 en el sitio Xho I localizado aguas debajo de la secuencia R. En el plásmido pU_{3}R\betageo, la expresión de \betageo se controló por el promotor U_{3} de MoMULV. El sitio de poliadenilación de SV40 está dirigido hacia el sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'. Véase la Figura 4.

Preparación del fragmento lineal U_{3}R\betageo como control lineal

El fragmento U_{3}R\betageo lineal se aisló después de la digestión de 10 \mug de plásmido ptkU_{3}R\betageo por Xba I y Not I por electroforesis sobre gel de agarosa al 0,8% con TAE 1X. Se aisló un fragmento de 9,7 kb y se purificó sobre perlas de vidrio con el protocolo de Gene-Clean II. El fragmento U_{3}R\betageo purificado se resuspendió en H_{2}O, pH 7, para la transfección. Véase la Figura 4.

Protocolo de transfección de célula 293T humana

20 h antes de la transfección, células 293T se sembraron a una densidad de 5x10^{4} células por placa de 35 mm en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) con 10% de suero bovino fetal inactivado (SVFi). Las células se incuban en un incubador de 1 atm (0,1 MPa), 5% de CO_{2}, 100% de humedad, 37ºC. La transfección se hizo mediante precipitación de fosfato de calcio con una mezcla de CaCl_{2} 125 mM, NaCl 8,18 \textperthousand (peso/volumen), HEPES 5,94 \textperthousand, Na_{2}HPO_{4} 0,2 \textperthousand pH 7,12 a 25ºC en presencia de 2 \mug de ADN. Los precipitados se mantuvieron 16 h sobre las células. Entonces, el medio de cultivo con el precipitado se sustituyó por medio DMEM-10% de SVFi recién preparado.

48 h después de la transfección, las células se fijaron en una disolución al 4% de paraformaldehído durante 5 min a 25ºC. Las células se lavaron dos veces en PBS x1 (solución salina de tampón fosfato). Entonces, las células se colocaron en medio de coloración X Gal durante 24 h a 37ºC para la tinción histoquímica por expresión de \beta-galactosidasa del gen \betageo. Por lo demás, las células se colocaron en medio de selección DMEM-10% de SVFi con 60 \mug/ml de G418. El medio de selección se cambió por nuevo cada 48 h. La selección se mantuvo durante 15 días hasta la aparición de clones celulares aislados. Estos clones se aislaron en placas de 24 pocillos de 1 cm de diámetro y se amplificaron con el fin de congelarse y analizarse.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados de la transfección de células 293T por pVirtkU_{3}R\betageo

Se transfectaron 2 \mug de mezcla de ADN (pVirtkU_{3}R\betageo + pCMV-1 Sce I) a una densidad 5x10^{4} células por placa de 35 mm con las siguientes relaciones y en presencia de los siguientes controles de transfección que se desvelan en la Tabla 1.

TABLA 1 Se transfectaron placas de 35 mm por concentración ADN y en mezcla según la tabla. Cada ensayo se hizo cuatro veces, dos veces para la tinción histoquímica y dos veces para la selección clónica. Cada nº número se corresponde con una mezcla de transfección indicando las columnas los constructos de plásmidos usados en la mezcla

1

48 h después de la transfección, las células se fijaron y la expresión de \beta-galactosidasa se reveló por tinción histoquímica. Se contaron los clones que mostraban expresión de \beta-galactosidasa (clones \beta-gal) (véase la Tabla 2). Además, las células se seleccionaron en un medio de cultivo que comprendía 60 \mug/ml de G418. El medio de cultivo celular se cambió por medio recién preparado cada 48 h de incubación. Después de 15 días de post-transfección, los clones resistentes a G418 se aislaron y se amplificaron (véase la Tabla 2).

TABLA 2 Resultados de la transfección de 293T por las mezclas según la Tabla 1

2

Los resultados muestran un aumento significativo de la integración de constructos para el número de transfección 1.0. Este número de transfección se corresponde con la transfección de un plásmido que comprende el polinucleótido que va a integrarse, concretamente U_{3}R-\betageo-poliA_{sv40}, flanqueado por dos sitios de endonucleasa I-Sce I con un plásmido que comprende un casete de expresión para endonucleasa I-Sce I. La integración del plásmido con linealización in vivo fue aproximadamente 4 a 10 veces más eficaz que el fragmento lineal U_{3}R\betageo.

El ADN genómico de los clones aislados se extrajo y se analizó por hibridación de Southern (digestión de ADN genómico con EcoR V) con sondas que comprendían un fragmento de restricción EcoRI de 3 kb que contenía el gen lacZ del plásmido pGemnlslacZ (vector pGem de Promega en el que ha sido insertado el gen lacZ y una secuencia de localización nuclear). Véase la Figura 6. El análisis de Southern mostró que la integración es única y no en tándem. De hecho, una integración en tándem mostraría una banda de 2,6 kb que nunca se vio. Algunas veces, como en el carril 12, se produjeron varios acontecimientos de integración. Por tanto, el procedimiento de linealización in vivo hace la integración única.

Se hicieron algunos experimentos con una cotransfección con un plásmido que expresa una integrasa (+IN). La integrasa usada en este experimento es el fragmento activo del virus MoMULV. De hecho, el ácido nucleico que codifica el fragmento activo se ha clonado en un vector de expresión. La integración mostró un aumento de aproximadamente 6 veces en comparación con el procedimiento de linealización in vivo sin ninguna integrasa. Por tanto, opcionalmente, el procedimiento para integrar un polinucleótido en el genoma de la célula huésped según la invención también comprende la introducción en la propia célula huésped de integrasa o un ácido nucleico que codifica integrasa.

El sitio de integración de los constructos integrados en 24 clones aislados diferentes se clonó por PCR inversa y se analizó por secuenciación. Se caracterizaron los empalmes entre los constructos integrados y el ADN genómico. Estos empalmes mostraron que la integridad del polinucleótido que va a integrarse se conserva y que la inserción es única.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Procedimiento de linealización in vivo en células COS Construcción de plásmidos ppSV40NeoIRESegfp

Se obtuvo el plásmido intermedio ppSV40NeoIRESegfp en dos etapas. Primera, el casete que contenía el promotor de virus simio 40 (pSV40) y el gen de resistencia neo que codifica la neomicina fosfotransferasa se escindió del plásmido pcDNA3.1+ (Clonetech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se clonó en el plásmido pIRES2-EGFP (Clonetech, Palo Alto, CA, EE.UU.) en el sitio SmaI dando como resultado la inserción del casete pSV40-Neo aguas arriba del elemento bicistrónico IRES y el gen EGFP. Segunda, el casete PyTknIslacz del plásmido pPytknIslacz (Henry y col., C. R. Acad. Sci. III, 322(12): 1061-1070 (1999)) se escindió y se sustituyó por el casete pSV40-Neo-IRES-EGFP (ppSNIE) completo y se insertó antes del sitio SV40 poliA.

A partir de este constructo inicial se derivó un plásmido insertando la secuencia correspondiente al sitio de escisión I-SceI tanto aguas arriba del promotor de SV40 (5') como aguas abajo del sitio SV40 poliA (3'). Véase la Figura 7A.

Protocolo de transfección de células COS

Un día antes de la transfección, 5 x 10^{4} células COS se sembraron en una placa de 6 pocillos en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) complementado con 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de 7% de CO_{2}. La transfección se hizo por el método Effectene (Qiagen, Chatsworth, CA, EE.UU). El protocolo de transfección se ha ajustado según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, 1 \mug de ADN de plásmido se diluyó en 100 \mul de tampón condensación de ADN en presencia de reactivo potenciador (la relación de ADN/potenciador es 1/8). Después de un periodo de incubación de 5 min se añaden 10 \mul de Effectene al ADN (la relación de ADN/Effectene es 1/10). La mezcla se agita con vórtex y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se añaden 600 \mul de medio completo al complejo de ADN/Effectene, se mezcla y se rocía sobre las células. Las células se lavan al día siguiente y se incuban durante un periodo total de 48 h a 37ºC, 7% de CO_{2}.

Se realiza un análisis FACS^{TM} en una alícuota de las células transfectadas usando un citómetro de flujo FACscan y el software CellQuest (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Las células restantes se siembran en placa en una placa de 10 cm y se añade medio de selección que contiene G418 (Life Technologies) a la concentración de 400 \mug/ml. Alternativamente, las células se resuspendieron a la densidad de 2000 células/ml y 100 \mul de suspensión se sembraron en placas de 96 pocillos. Después de 3 semanas, los clones resistentes se aislaron y se amplificaron en placas de 24 pocillos para análisis adicionales.

Extracción de ADN genómico, cuantificación e hibridación por transferencia de Southern

Se extrajo ADN genómico de células cultivadas usando el kit High Pure DNA Prep (Roche, Mannheim, Alemania) y se cuantificó usando el kit de cuantificación Picogreen^{TM} dsDNA (Molecular Probes, Eugene, ON, EE.UU.) según protocolos del fabricante.

Se digerió 1 \mug de ADN genómico de clones independientes con enzima de restricción HindIII (NEB, Beverly, MA, EE.UU.). Después de la electroforesis del ADN y la transferencia en membranas Hybond-N+ (Amersham, Pisscataway, NJ, EE.UU.), las transferencias se sondaron con la sonda NEO usando un protocolo de detección de ácidos nucleicos basado en DIG no radiactivo (Roche, Mannheim, Alemania).

Resultados de la transfección de células COS por plásmidos ppSNIE

El plásmido ppSNIE se cotransfectó con el vector de expresión de la endonucleasa I-SceI pCMV-1-SceI+ (Choulika y col., 1995 Mol Cel Biol, 15, 1968-1973). Como controles negativos, el plásmido ppSNIE se cotransfectó con pCMV-I-SceI- en el que el ORF que codifica la endonucleasa tiene una orientación inversa y, por tanto, no permite la expresión de I-SceI. Se usó 1 \mug de mezcla de ADN (0,5 \mug de plásmido ppSNIE + 0,5 \mug de pCMV-I-SceI-) o (0,5 \mug de plásmido ppSNIE + 0,5 \mug de pCMV-I-SceI+) para transfectar 5x10^{4} células en placas de 6 pocillos. 48 h después de la transfección, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo. Reproduciblemente, la tasa de transfección de células COS estaba entre el 35 y el 45% de células GFP+. Por tanto, la cotransfección del plásmido ppSNIE con vectores de expresión de I-SceI (pCMV-I-SceI+) o de control (pCMV-1-SceI-) no afectó la expresión transitoria del indicador de EGFP.

Las células restantes se sembraron en placas de 10 cm y se añadió medio de selección. Tres semanas después, los clones resistentes se aislaron y se amplificaron. Se extrajo ADN genómico de clones independientes y se analizó por hibridación de Southern. Se digirieron 0,5 \mug de ADN genómico con enzima de restricción HindIII, se separó en gel de agarosa y se transfirió sobre membrana de nailon. Entonces, la transferencia se sondó con la sonda Neo.

Los resultados se muestran en la figura 7B. Como cabía esperar, todos los clones menos los nº 3 y nº 26 mostraron una banda de 1,5 kb correspondiente al fragmento HindIII dentro del casete ppSNIE. La intensidad de la banda de 1,5 kb es sumamente variable en clones de la cotransfección de I-SceI- con la presencia de enormes concatémeros (véanse los clones nº 5, 6, 8 y en un menor grado los clones nº 11, 15, 16). A diferencia, las bandas en clones de cotransfección de I-SceI+ son menos intensas sugiriendo la presencia de un número pequeño de copias.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

La linealización in ovo por la meganucleasa I-SceI refuerza la integración de transgenes en huevos de pez

Se inyectó ADN plasmídico circular que llevaba un promotor específico de músculo seguido de un gen indicador GFP y flanqueado por dos sitios de reconocimientos I-Sce I en embriones de peces en la fase de una célula. Cuando este constructo se coinyectó con la meganucleasa I-Sce I en un tampón sin magnesio (de manera que la enzima quedara inactiva extracelularmente), la expresión muscular de GFP esperada mejoró espectacularmente (el 80% de los embriones presentaron una fuerte fluorescencia en la musculatura del tronco con respecto al 20% cuando las inyecciones se realizaron sin la meganucleasa). Incluso más sorprendente fue el espectacular aumento en la transmisión de la línea germinal. Mientras que en experimentos de inyección en huevo clásicos no se supera, en la mayoría de los casos, un pequeño porcentaje debido a las integraciones quiméricas tardías, la frecuencia de transmisión de la línea germinal en peces coinyectados con la meganucleasa se reforzó hasta el 50%, sugiriendo que se produjo una única inserción en la fase de una célula del pez fundador. Adicionalmente, el análisis de Southern confirmó que las integraciones únicas a bajas copias se produjeron en la mayoría de los casos. Para ensayar si los acontecimientos de integración precoces pueden ser debidos a la escisión in vivo de ADN, y no a la elección del núcleo como diana por la meganucleasa, los constructos de control que llevaban sitios de reconocimientos delecionados o mutados (unidos, pero no escindidos por la meganucleasa I-Sce I) se inyectaron con la meganucleasa. Los inventores proponen que la linealización in ovo inducida por meganucleasa, limitando la degradación de extremos libres de ADN preintegrativo, es un procedimiento simple y eficiente para mejorar la transgénesis por inyección en huevo.

Este ejemplo muestra que la transgénesis mediada por meganucleasa es de hecho una técnica muy simple que es espectacularmente más eficaz que los otros procedimientos actualmente notificados en peces.

Materiales y procedimientos Constructos de plásmidos

El p\alphaact-GFPM2 se construyó con dos secuencias de reconocimiento I-SceI en un plásmido de 7,8 kb que llevaba un gen indicador EGFP accionado por un promotor específico de músculo de \alpha-actina (p\alphaact-GFP, donación de Dr. Higashijima, [Higashijima, 1997 #698]). Brevemente, se usaron dos etapas de subclonación para insertar "megaligadores" en los sitios Eco RI y KpnI localizados en ambos sitios del casete de \alpha-actina/GFP/poliA en el poliligador Bluescript. Los megaligadores se generaron hibridando oligonucleótidos complementarios que contenían el sitio de reconocimiento I-SceI (CCGCTAGGGATAACAGGGTAATATA) flanqueado por extremos libres compatibles con cualquiera de los productos de digestión de EcoRI o KpnI. Después de la ligación del megaligador con el plásmido linealizado, el ADN se digirió de nuevo por la enzima usada para linealizar el plásmido y se transformó por pulso térmico en E. coli ultra-competente XL1 Blue (Stratagene). Los clones se secuenciaron para determinar la orientación del sitio I-SceI no palindrómico.

Se obtuvieron varios otros constructos insertando diferentes ligadores en el sitio KpnI: p\alphaact-GFPM con sólo un sitio de reconocimiento I-SceI, p\alphaact-GFPDM con un sitio de reconocimiento acortado (GGGTAATATA) y p\alphaact-GFPMM que contenía una versión mutada (TAGGGtTAACAGGGTAAT) del sitio I-SceI. Estos dos últimos sitios unen la meganucleasa, pero no se escinden eficazmente [Colleaux, 1986; Colleaux, 1988].

Microinyección de plásmido ADN con meganucleasa

En todos los experimentos se usaron embriones y adultos de medaka de una cepa Orange-Red (amablemente proporcionada por A. Shima, Universidad de Tokio, Japón y Y. Ishikawa, Chiba, Japón). Los peces se criaron en peceras de 20 litros a 26ºC. Los adultos se colocaron bajo un régimen de reproducción (14 h de luz/10 h de oscuridad). Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove (con el amanecer), se limpiaron y se colocaron en medio de cría de embriones de Yamamoto [Yamamoto, 1975]. Para la inyección se seleccionaron embriones en la fase de una célula con un blastodisco recientemente formado [Iwamatsu; 1994] y se transfirieron a 4ºC para detener el desarrollo. Aproximadamente se posicionaron a la vez diez embriones, discos citoplásmicos hacia arriba, en ranuras de agarosa hechas con un molde de plástico como se describe en [Westerfield; 1993]. En todos los experimentos se usaron un estereomicroscopio Olympus SZX12 equipado con un micromanipulador MM3 (Fine Science Tools, Alemania) y un inyector a presión (FemtoJet, Eppendorf, Alemania). Se extrajeron capilares de vidrio de borosilicato (diámetro externo de 1 mm, GC100T, Clark Electromedical Instruments, RU) usando un extractor vertical (PC-10, Narashige, Japón). Los capilares se rellenaron con la disolución de inyección (ADN: 10 \mug/ml; tampón de meganucleasa (Roche Diagnostic, Alemania): 0,5x; meganucleasa I-SceI: 1 unidad/\mul; 0,1% de rojo de fenol) usando microcargadores estériles (Femtotips, Eppendorf, Alemania). Inmediatamente antes de la inyección, las puntas de las micropipetas se rompieron a aproximadamente un micrómetro de diámetro con pinzas finas. El ADN se inyectó a través del corión insertando la pipeta directamente en el blastodisco fino. Un pulso de presión dio como resultado la inyección de una gotita (volumen estimado de 300 pl) visualizada por el rojo de fenol. Entonces, los embriones se eliminaron de la agarosa y se colocaron en placas de Petri a 26ºC. La expresión de GFP se cribó primero a los tres días después de la inyección. Entonces, los embriones se criaron hasta la madurez sexual y se hicieron cruces por emparejamiento para identificar peces que habían transmitido el transgén a su progenie.

Análisis de transferencia de Southern

Para la transferencia de Southern, el ADN genómico del peces F1 se extrajo usando proteinasa K y fenol [Sambrook y Russel; 2001]. Para conseguir suficiente ADN se usaron todos los peces de un mes de edad. Para evitar ADNsas, los músculos de los peces más viejos se diseccionaron para la extracción de ADN. El ADN se digirió hasta finalización con BamHI, EcoRI, XbaI, XhoI. Los patrones de ADN se prepararon digiriendo el plásmido paact-GFP por las enzimas correspondientes. Usando un contenido de ADN estimado de 10^{9} pb por genoma haploide se cargaron 50 pg de plásmido p\alphaact-GFP digerido. Las muestras (10 \mug por carril) se sometieron a electroforesis en agarosa al 0,9% en 1xTBE y se transfirieron a una membrana Zetaprobe de nailon (Biorad) mediante transferencia capilar hacia arriba como recomendó el fabricante de Zetaprobe. Los filtros se hibridaron en una botella rotatoria durante la noche a 65ºC con sondas radiomarcadas cebadas aleatoriamente (fragmento XhoI/EcoRV) correspondientes a \alpha-actina/GfP/poliA.

Microscopía de epifluorescencia

Los embriones se observaron y se puntuaron usando un microscopio de disección MZFLIII Leica usando un filtro de excitación de 370 a 420 nm y un filtro de emisión LP a 455 nm. Las fotografías se adquirieron usando una cámara digital Nikon DXM1200. Para la fotografía, los embriones se descorionaron con enzima de eclosión [Yasumasu; 1994] siguiendo el procedimiento descrito en [Wakamatsu; 1993] y se pusieron en glicerina al 80% en PBS o en medio de montaje Vectashield.

Resultados

La expresión transitoria de GFP en músculos de embriones inyectados mejora cuando la meganucleasa se coinyecta con el constructo.

El ADN de plásmido circular que llevaba el promotor de actina p\alphaact-GFPM2 seguido de un gen indicador GFP y flanqueado por dos sitios de reconocimiento I-SceI (p\alphaact-GFPM2) se probó primero para la expresión inyectándolo en embriones en la fase de una célula (fase 2a, [Iwamatsu; 1994]). La concentración de ADN (13 ng/\mul) se eligió como la más alta que no condujo a una mortalidad significativa de los huevos inyectados.

La expresión del gen indicador GFP en los embriones se examinó en varias fases de desarrollo distintas usando microscopía binocular de fluorescencia. La aparición de la expresión de GFP se observó primero en unos pocos embriones después de dos días (fase x).

Generalmente, los embriones se puntuaron después de tres días de desarrollo cuando la expresión de GFP de \alpha-actina muscular estaba en proceso. Los embriones se agruparon según la intensidad de fluorescencia con el fin de estimar cuantitativamente el nivel y la distribución de expresión transgénica en cada experimento.

Aproximadamente el 50 por ciento de los embriones no mostraron fluorescencia muscular y se clasificaron como negativos (N) (Fig. 8B). En los otros embriones, el número de células positivas para GFP osciló de unas pocas células (clasificado como débil, D) a casi un marcado de células de músculo casi ubicuo (fuerte, F). Cuando la expresión se detectó en un dominio grande de la cola, pero en ningún sitio más, la expresión se calificó como moderada (M). La expresión en células de músculo individuales siempre fue suficientemente fuerte como para ser fácilmente detectable y no se observó expresión ectópica.

Cuando p\alphaact-GFPM2 se linealizó in vitro con I-SceI, se purificó en un gel de agarosa y se inyectó a las mismas condiciones que se notifican anteriormente, los resultados fueron similares a los obtenidos con p\alphaact-GFPM2 circular (Fig. 8B).

Cuando p\alphaact-GFPM2 se coinyectó con la meganucleasa I-SceI comercialmente disponible en un tampón sin magnesio (de manera que la enzima quedara inactiva extracelularmente), la expresión muscular de GFP mejoró espectacularmente. Aproximadamente el 80% de los embriones presentó una expresión moderada o fuerte en la musculatura del tronco con respecto al 20% cuando la inyección se realizó sin la enzima.

Por tanto, la expresión transgénica transitoria en peces F0 mejoró inmediatamente y eficazmente por el protocolo de meganucleasa mediante un mecanismo que supuestamente implica una etapa de linealización in vivo del plásmido circular inyectado.

La mejora en la expresión transgénica de F0 está ligada a la linealización in ovo

Se sabe que la meganucleasa I-SceI tiene algo de actividad de NLS. Para evaluar si los acontecimientos de integración precoces eran de hecho debidos a una escisión in vivo de ADN, y no a la elección del núcleo como diana por la meganucleasa, los constructos de control que llevaban sitios de reconocimientos delecionados (paact-GFPDM) o mutados (p\alphaact-GFPMM) (unidos, pero no escindidos por la meganucleasa) se coinyectaron con la meganucleasa.

Tras la inyección, los embriones se agruparon según los criterios descritos anteriormente (Fig. 8B). La distribución de la expresión de GFP transitoria en embriones F0 coinyectados con p\alphaact-GFPDM o p\alphaact-GFPMM y la meganucleasa fue similar a la obtenida en experimentos que implican la inyección del constructo p\alphaact-GFPM2 sin enzima. Por tanto, la linealización in ovo de meganucleasa es un procedimiento clave que mejora la expresión transitoria en los embriones de peces en la fase de una célula inyectados.

Generación de peces transmisores de la línea germinal usando meganucleasas

La expresión muscular de GFP persistió en algunos adultos que resultan de los experimentos de inyección. Por tanto, un punto importante era investigar si y cómo el transgén se transmitió a la siguiente generación y, en particular, si había alguna correlación entre niveles de expresión en músculos adultos y la frecuencia de transmisión de la línea germinal.

En un primer cribado en 30 adultos inyectados, todos aquellos que no presentaron expresión de GFP en músculos resultaron ser negativos para la transmisión del transgén de la línea germinal. Por tanto, los peces negativos para GFP adultos se consideraron a priori como negativos y posteriormente se descartaron de los procedimientos de apareamiento de F0. Por tanto, la observación de la expresión de GFP en adulto F0 simplificó enormemente el cribado para peces transmisores.

Para investigar los efectos de la meganucleasa sobre la frecuencia de aparición de fundadores transmisores de la línea germinal, los peces inyectados se criaron hasta la madurez sexual y se aparearon con parejas naturales. Entonces, el nivel de fluorescencia muscular en su progenie de tres días de edad se puntuó como se describe anteriormente (los resultados se resumen en la Figura 9A).

Como cabía esperar, los peces fundadores resultantes de la inyección sin la meganucleasa tenían líneas germinales de mosaico y, en la mayoría de las líneas, las tasas de herencia de F1 (como se ensayó por la expresión de GFP) eran espectacularmente bajas (transmisión a sólo un bajo porcentaje de los hermanos). En algunas líneas (con inserciones con alto número de copias; véase más adelante) el transgén se transmitió a una tasa moderada (del 30 al 50 por ciento).

A diferencia, la frecuencia de transmisión de la línea germinal para fundadores coinyectados con el plásmido circular y la meganucleasa se reforzó al 50% en la mayoría de las líneas (Fig. 2A) que se corresponde con un aumento de 5 a 15 veces en la frecuencia media de embriones positivos en la progenie.

Análisis de Southern adicionales confirmaron que las integraciones únicas se produjeron en la mayoría de los casos a un bajo número de copias (Fig. 9B).

El ADN se digirió primero con EcoRI o XhoI, enzimas que no cortan o cortan una vez, respectivamente, en el constructo de plásmidos (no mostrado).Todos los animales analizados contuvieron un único fragmento de tamaño grande que se hibrida con la sonda de inserto, sugerente de un único acontecimiento de integración. Sin embargo, los inventores no pueden excluir la existencia de varios acontecimientos tales porque las digestiones con BamHI o XbaI dieron múltiples fragmentos de empalme. Con la digestión con BamHI, como se representa en la Figura 9B, se observaron dos fragmentos (1 y 2 kb) que se hibridaron con una sonda correspondiente al inserto en el carril 1 a 4 en los que se cargaron ADN de peces inyectados con la meganucleasa. Estos fragmentos se correspondieron respectivamente con el GFP/pA y con la región aguas abajo del promotor de actina (3'\alphap). La presencia de una banda de 4,8 kb, diagnóstico de la región aguas arriba del promotor ligado a la secuencia de plásmidos (5'\alphap+pBluSK), sugirió que algunos transgenes se integraron como repeticiones en tándem directas incluyendo el plásmido. Se espera que este tipo de integración se produzca si sólo uno de los dos sitios de reconocimiento I-SceI se corta y el inserto se integra inmediatamente (sin corte adicional).

Discusión

Este ejemplo expone una tecnología mediada por meganucleasa que conduce a mejoras espectaculares en la transgénesis de peces a varios niveles.

Primero, mejora la expresión transitoria (en F0) de un constructo de ADN inyectado debido a un gran aumento en el número de células que se expresan. Por tanto, la expresión del mosaico del gen indicador en embriones inyectados disminuye enormemente superando en parte una de las principales dificultades de la transgénesis en peces. Este resultado abre un camino, por ejemplo, para análisis más fáciles y más fidedignos de constructos de promotores en especies de peces, una tarea que frecuentemente implica su introducción transitoria preliminar por microinyección.

Segundo, la tecnología mediada por meganucleasa aumenta significativamente las tasas de transmisión de la línea germinal en peces. Además, con el promotor específico de músculo usado hubo una buena correlación entre el mantenimiento de la expresión de indicador en peces inyectados adultos y la capacidad para producir descendientes transgénicos. Por tanto, las herramientas presentadas en este ejemplo simplifican enormemente la tarea que requiere mucho tiempo de seleccionar los individuos F0 que pueden encontrar una familia transgénica.

Tercero y puede ser lo más sorprendente, la tasa de transmisión en cada familia transmisora se reforzó espectacularmente en estos experimentos. En la práctica esto significa que familias de F1 grandes pueden generarse a partir de un número razonable de huevos. Y, lo que es más importante, la tasa de transmisión del 50% observada en la mayoría de los cruces entre F0 transmisor y peces naturales sugiere fuertemente que un único acontecimiento de inserción se produjo en una forma de no mosaico en F0.

Los experimentos de control permiten proponer a los inventores que la linealización in vivo es instrumental en el aumento de las tasas de integración, aunque no es necesariamente el único factor. Por ejemplo, un efecto de elección del núcleo como diana de la enzima I-SceI puede estar en juego en estos experimentos. Los inventores proponen que en una primera etapa la ausencia de extremos de ADN libres en el plásmido circular reduce la tasa de degradación citoplásmica del ADN inyectado. Entonces, la posterior liberación de extremos libres preintegrativos conduce a la eficiencia de integración típica de los plásmidos lineales.

Finalmente, la integración de transgenes en concatémeros largos, una característica frecuentemente encontrada en peces, nunca se produjo en estos experimentos. En su lugar, los inventores encontraron que el transgén se integró como repeticiones en tándem directas cortas, un efecto beneficioso que es probable que sea la razón del espectacular aumento en la expresión de niveles de GFP.

Cabía esperar este tipo de inserción porque, en el constructo plasmídico, los dos sitios ISce-I estaban en la misma orientación. Los datos de transferencia de Southern también sugieren que se produjo la integración de elementos repetidos en tándem similares y comprendió algunas secuencias de plásmidos. Esto indica que estos tándems están compuestos por varios plásmidos cortados en sólo un sitio. Debido a que, in vitro, ISce-I corta a una cinética similar en ambos sitios, una posible explicación para ese fenómeno es que la cantidad de enzima I-SceI era limitante con respecto a la concentración de ADN y que la integración se produjo concomitantemente con el primer corte.

Para mejorar adicionalmente la calidad de integración puede proponerse cambiar las orientaciones de los sitios I-SceI.

Las aplicaciones de esta técnica son numerosas, sobre todo en varias especies de peces, pero también más generalmente. Por ejemplo, prepara el terreno para experimentos más sofisticados tales como experimentos de inactivación mediante inyección de ADN en embriones u oocitos precoces.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Linealización in ovo por la meganucleasa I-SceI en ratones

Con el fin de mejorar la eficiencia de la transgénesis, los inventores desarrollaron un procedimiento novedoso basado en la linealización in ovo de un plásmido superenrollado por meganucleasas.

Los constructos de plásmidos han sido diseñados para llevar uno o dos sitios de reconocimiento/escisión para meganucleasas que flanquean el transgén deseado que va a integrarse. La fuente de meganucleasas se proporcionó tanto por proteínas purificadas como por producción in ovo a partir de un vector que expresa meganucleasas. La mejora de la transgénesis (cuantitativa y cualitativa) se comparó con experimentos de transgénesis "clásica" (es decir, inyección de un fragmento de transgén prelinealizado y purificado). El control negativo se realizó usando la misma preparación de superenrollamiento del ADN de transgén libre de toda fuente de meganucleasas.

Linealización in ovo mediada por vector que expresa I-SceI

Las inyecciones se realizaron en la fase de una célula en pronúcleos macho de huevos de ratón B6SJL. El vector de expresión I-SceI se comprobó in ovo microinyectando el plásmido pl-SceI/EGFP en la fase de una célula en pronúcleos macho de huevos de ratón B6SJL. La fluorescencia de EGFP ya se visualizó en la fase de 2 células en embriones inyectados en un microscopio invertido con filtros de EGFP. Debido a la naturaleza del constructo que llevaba un IRES entre los dos ORF I-SceI y EGFP, a los inventores se les aseguró en aproximadamente el 95% de los casos que cuando la fluorescencia de EGFP se visualiza, I-SceI se produce coordinadamente. Los plásmido Megafluo (Figura 10A) y pl-SceI/EGFP (Figura 10B) se coinyectaron a quinientas copias/pl. Los huevos inyectados se transfirieron a ratón hembra de adopción B6CBA. Se comprobó el parto, los animales nacidos muertos se recuperaron y su ADN se extrajo con el fin de ser genotipado para una integración putativa del transgén inyectado. Los ratones recién nacidos se tiparon a las 3 semanas cortando un pequeño trozo de la cola. Entonces se realizó la extracción de ADN, seguida del genotipado por PCR y/o experimentos de Southern. A partir de este experimento se recuperaron 5 recién nacidos y 2 nacidos muertos. Tras la extracción de ADN, la recuperación de ADN se comprobó en gel de agarosa (Figura 11A). Con el fin de comprobar la calidad del ADN genómico extraído se realizó una PCR amplificando un subfragmento de 494 pb del gen \beta-globina (panel derecho de la Figura 11 B). Todas las muestras de ADN parecieron cualitativamente correctas cuando el producto de PCR de \beta-globina esperado se visualizó a partir de todas las muestras de ADN probadas. Con el fin de probar la integración del transgén se realizó una PCR amplificando 484 pb del gen indicador (DSRed1-E5) (panel izquierdo de la Figura 11B). Entre la progenie de 5 ratones de tres semanas de edad y los 2 nacidos muertos, 2 (número 1 y 25) y 1 (número A) de ellos fueron transgénicos, respectivamente. En general, estos resultados mostraron que el 40% de la progenie era transgénica cuando se consideraron animales vivos y el 43% cuando se consideraron en conjunto ratones inyectados vivos y nacidos muertos.

Normalmente, cuando se realiza una coinyección de plásmido en huevos en la fase de una célula de ratón, la cointegración de ambos plásmidos se detecta en animales inyectados y frecuentemente en la misma localización. Con el fin de probar la integración del vector que expresa I-SceI (pl-SceI/EGFP) también se realizó una PCR amplificando un subfragmento de este plásmido. Todos los animales recuperados (tanto los transgénicos para Megafluo como los no transgénicos) fueron negativos para la presencia del vector que expresa I-SceI (Figura 11C).

Con el fin de probar la transmisión del transgén a la progenie F1, los animales transgénicos 1 y 25 se retrocruzaron con animales sin inyectar B6SJL. Entre los 13 animales F1 y los 54 F1 derivados de 1 hembra y 25 machos, respectivamente, sólo un animal F1 por cada uno retrocruzado era transgénico como se probó por experimentos de transferencia de Southern usando una sonda que se hibrida al promotor pGas 5. Estos resultados demostraron que animales transgénicos obtenidos por transgénesis mediada por meganucleasa eran fértiles y pueden transmitir el transgén a su progenie. Los números indicaron una tasa de transmisión que oscila del 2 al 8% y sugirieron que los fundadores eran mosaico para la integración. Este resultado no era sorprendente ya que no se supone que la producción de I-SceI a partir de sus vectores de expresión correspondientes empiece antes de la fase de 2 células en huevos de ratón cuando la transcripción cigótica empieza y el promotor de CMV empieza a ser activo en huevos de ratón.

Linealización in ovo mediada por proteína purificada I-SceI

El protocolo era equivalente en este experimento, excepto que I-SceI se proporcionó como una proteína purificada a una relación 1:5 de ADN/proteína. Se coinyectaron 750 copias de plásmido superenrollado Megafluo (Figura 10A) con proteína I-SceI purificada (18 \muM). Los huevos inyectados se transfirieron a ratón hembra de adopción B6CBA. Entre nueve ratones recién nacidos, dos de ellos eran transgénicos como se detectó por análisis de transferencia de Southern usando tanto una sonda correspondiente al promotor Gas5 como las secuencias de esqueleto de plásmidos. Este resultado mostró que los animales transgénicos se habían producido en este experimento por este procedimiento con un rendimiento del 22%.

"Transgénesis clásica"

Se usó el mismo constructo de plásmidos, Megafluo, en un protocolo clásico para transgénesis de ratones, es decir, inyección de un transgén prelinealizado. Se realizaron dos tipos de experimentos, uno usando el subfragmento de Ndel de 1796 pb y el otro usando el subfragmento de I-SceI de 1824 pb, llevando ambos subfragmentos el promotor Gas5 y el gen fluorescente indicador. Se realizaron dos series de inyección para el fragmento de I-SceI. La primera correspondiente a la inyección de 500 copias/pl del fragmento de ADN ha conducido al nacimiento de 2 ratones que eran negativos por PCR de Red5. La segunda correspondiente a la inyección de 750 copias/pl del fragmento de I-Sce ha conducido al nacimiento de 8 ratones negativos para la integración. La inyección de 750 copias/pl del fragmento de Ndel ha conducido al nacimiento de 8. Entre los 8 recién nacidos, sólo uno era transgénico (número 18) (Figura 12). En este experimento, el número de transgénicos fue del 12,5%. En los tres experimentos, 1 animal transgénico de 18 animales nacidos redujo el número al 5,5% de animales transgénicos obtenidos cuando se usó la misma secuencia de ADN que en comparación con números obtenidos a partir de transgénesis mediada por meganucleasa. La transmisión a F1 del macho transgénico 18 se probó cruzando este macho con hembras B6SJL. Entre los 25 animales F1, 1 de 6 y 3 de 19 obtenidos fueron transgénicos como se detecta en un análisis de transferencia de Southern usando una sonda de promotor. Estos resultados indicaron que la transmisión usando "transgénesis clásica" es aproximadamente el 16%.

Experimentos de control

También se comprobó la integración de 750 copias/pI del plásmido Megafluo superenrollado por sí mismo. Se realizaron dos experimentos independientes. Se obtienen 10 y 11 ratones, respectivamente. Usando tanto PCR como análisis de transferencia de Southern con el fin de genotipar los ratones no se detectaron animales transgénicos.

Linealización in ovo mediada por proteína purificada PI-SceI

Con el fin de probar la eficiencia de la transgénesis mediada por meganucleasa por otra meganucleasa los inventores realizaron experimentos usando una proteína PI-SceI purificada. El constructo transgénico, PIFFLago, se describe en la Figura 13. El promotor Gas5 que conduce a la expresión del gen indicador LagoZ (una secuencia LacZ libre de CPG) está flanqueado por dos sitios de reconocimiento/escisión PI-SceI en la misma orientación que separan las secuencias de esqueleto del vector. Entre el promotor y el gen indicador está presente un único sitio I-SceI.

Se realizó la coinyección de 750 copias/pl de PIFFLAgo con proteína PI-SceI purificada a una relación de ADN de diana/proteína de 1:25. Tras la transferencia de los huevos inyectados, la madre de adopción se sacrificó en el día 12 de gestación y los embriones inyectados se genotiparon tanto por PCR (Lago) como por análisis de transferencia de Southern con una sonda correspondiente a la secuencia del gen indicador. Entre los 10 embriones genotipados, 3 de ellos fueron transgénicos (Figura 14, panel derecho). Se detectó un fragmento de 7 kb en el ADN genómico de aquellos embriones por la sonda Lago correspondiente a una integración de repetición invertida en tándem. Este resultado mostró que la eficiencia de la transgénesis mediada por Pl-SceI era aproximadamente el 30%.

Usando el mismo constructo transgénico, la transgénesis mediada por I-SceI se probó coinyectando PIFFLago a 750 copias/pl con una 1:169 de diana de ADN de I-SceI/molécula de proteína. Tras las transferencia de los huevos inyectados, la madre de adopción se sacrificó en el día 12 de gestación y los embriones inyectados se genotiparon tanto por PCR (Lago) como por análisis de transferencia de Southern con una sonda correspondiente a la secuencia del gen indicador. Entre los 9 embriones obtenidos, 3 de ellos fueron transgénicos (Figura 14, panel izquierdo; Figura 15). Este resultado muestra que una linealización mediada por I-SceI de un transgén en este experimento condujo a un tercio de embriones transgénicos.

Protocolo detallado para la transgénesis mediada por meganucleasa en ratones Preparación de muestras para inyecciones

Se producen disoluciones de ADN de plásmido (superenrollado) en columnas EndoFree de Qiagen. Después de la precipitación, los plásmidos se resuspendieron luego a la concentración deseada en tampón de Brinster, TRIS 10 mM, EDTA 0,25 mM. La disolución madre de I-SceI contuvo 150 \mug/ml (10 unidades/\mul) en HEPES 25 mM, pH 8, glicerina al 5%. La Tabla 3 indica cantidades de I-SceI para una serie de relaciones de proteína:ADN.

TABLA 3

3

Las muestras para inyecciones deberán prepararse considerando que la glicerina estaba presente en la disolución madre de I-SceI. Dependiendo de la cantidad de disolución de I-SceI usada deberá añadirse algo de cantidad de disolución que contiene glicerina (tampón X) para tener en cada caso una concentración de glicerina final constante única. Para las inyecciones, los inventores usaron muestras al 1% de glicerina y una relación de proteína:ADN de 5:1.

(500 copias de plásmidos es equivalente a 3,01 10^{-20} mol. I-SceI es 29,3 KDa)

Se usó un protocolo similar para la transgénesis mediada por PI-SceI, MM 51kDa. Basándose en la condición de actividad de Pl-SceI se preparó una disolución madre de 1,15 mg/ml de PI-SceI que contenía glicerina al 20%. Se usaron dos relaciones finales de ADN/para inyecciones: 50x (307,3 \mug/ml de PI-SceI en glicerina al 5,35% y HEPES 7 mM) y 94x (307,3 \mug/ml de PI-SceI en glicerina al 6,25%). Se prepararon a partir de diluciones de la disolución madre de PI-SceI en tampón de dilución.

Tampón de dilución:

HEPES 25 mM, glicerina al 5%, pH 8 a 25ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Transgénesis mediada por I-SceI

Se inyectó la misma construcción superenrollada tanto con un vector que expresa meganucleasa como con la proteína purificada. Además, se usó la forma prelinealizada y purificada in vitro del mismo transgén para comparar la "transgénesis clásica" con la transgénesis mediada por meganucleasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de plásmidos superenrollados

La producción de plásmido se realizó usando el kit EndoFree de Qiagen (QIAGEN). El ADN recuperado se precipitó con acetato de Na, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en tampón de Brinster (TRIS 10 mM-EDTA 0,25 mM) a la concentración deseada para inyección.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación del transgén linealizado

1.: Se digirió Megafluo para liberar el transgén de las secuencias del vector de plásmido. Para este fin se usaron dos enzimas diferentes: enzimas Ndel o I-SceI que conducen a 1796 pb y 1824 pb, respectivamente.

2.: Los productos de digestión de restricción se separaron en gel de agarosa usando TAE al 0,8%.

3.: El gel se colocó sobre un transiluminador y la banda deseada se cortó y luego se purificó con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN).

4.: Tras la elución del ADN en Tris (pH 7,6), el ADN se precipitó, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en tampón de Brinster a una concentración de 500 copias/pl.

5.: El ADN se conservó a -20 grados centígrados.

\vskip1.000000\baselineskip

Recuperación de huevos de ratón en la fase de una célula a) Superovulación:

-: Inyección intraperitoneal de hembras B6SJL de 3 semanas de edad con PEM (Folligon de Intervet) a 5 UI/ratón, 3 días antes de la inyección

-: Inyección intraperitoneal de hembras B6SJL de 3 semanas de edad con HCG (Chorulon de Intervet) a 5 UI/ratón, un día antes de la inyección y cruce con machos B6SJL

-: Cruce de hembras B6CBA de adopción con machos vasectomizados B6CBA.

b) Recuperación de oocitos:

-: Sacrificar las hembras B6SJL cruzadas con B6SJL, recuperar los oviductos y colocarlos en medios PBI

-: Separar los oocitos en 100 \mul de hialuronidasa a 0,5 mg/ml cortando la ampolla con pinzas durante 2'

-: Aclarar los huevos en PBI

-: Transferir los huevos a Whitten cubierto con aceite siliconizado y mantenerlos a 37ºC, 5% de CO_{2}.

c) Inyecciones en huevo:

-: Los huevos fecundados se microinyectaron en PBI usando un microinyector Eppendorf (Femtojet 5247) con micromanipuladores (Transferman NK2 5188) en un microscopio invertido Nikon (TE2000-U) usando capilares de contención e inyección (GC 100-10 y GC 100F-10 de Phymep)

d) Transferencia de huevos inyectados a hembras de adopción:

-: Anestesia de hembras B6CBA por inyección intraperitoneal de avertina a 150 \mug/ml con 400 \mul/ratón

-: Transferencia de los huevos inyectados a oviductos diseccionados

\vskip1.000000\baselineskip

Extracción de ADN genómico

1): Añadir 750 \mul de tampón de cola y 40 \mul de proteinasa K por 1 cm de cola

: o 500 \mul de tampón de cola y 30 \mul de proteinasa K por membrana de embrión

2): Incubar a 56ºC durante la noche

3): Mezclar 5' en la mezcladora Eppendorf

4): Añadir 250 \mul de NaCl saturado (= 6 M) por cola

: o 170 \mul de NaCl saturado (\approx 6 M) por membrana de embrión

5): Mezclar 5' en la mezcladora Eppendorf

6): Centrifugar 10' a 13000 rpm

7): Recoger 750 \mul de sobrenadante en un tubo Eppendorf nuevo por cola

: o 500 \mul de sobrenadante por membrana de embrión

8): Añadir 500 \mul de isopropanol por cola

: o 350 \mul de isopropanol por membrana de embrión

9): Mezclar 2' en la mezcladora Eppendorf

10): Centrifugar 1' a 13000 rpm

11): Lavar el sedimento dos veces con 500 \mul de EtOH al 70% a TA

\vskip1.000000\baselineskip

Genotipado de ratones transgénicos por experimentos de transferencia de Southern

a): Marcado de 1 \mug de secuencias de ADN plasmídico purificado durante la noche usando el kit de marcación Dig de Roche. Las sondas se purificaron en G-50 sephadex. La cuantificación de la sonda se comprobó en un reacción de transferencia por puntos con el control de Dig del kit de Roche.

b): Se digirieron de 1 a 7 \mug de ADN genómico durante la noche con enzima de restricción EcoRI (NEB)

c): El ADN digerido se cargó en geles de agarosa al 0,8%-TAE

d): Los geles se desnaturalizaron durante 30' en disolución desnaturalizante (NaOH (0,5 M) + NaCl (1,5 M)), luego se neutralizaron en disolución neutralizante (Tris (pH 7,4, 0,5 M) + NaCl (1,5 M))

e): La transferencia de ADN se hizo por capilaridad en 10xSSC durante la noche en una membrana Hybond-N+ de nailon (Amersham)

f): El ADN se fijó en la membrana por reticulación UV (Stratalinker de Stratagene) y se secó en estufa durante 2 h en una estufa a 80ºC

g): Las membranas se prehibridaron en tampón de hibridación durante una hora a 68ºC en una estufa rotatoria

h): La hibridación se realizó en tampón de hibridación con una sonda marcada con Dig predesnaturalizada (10 ng/ml) durante la noche a 68ºC en una estufa rotatoria

i): Dos lavados de 5' a TA con una disolución de lavado precalentada en una plataforma rotatoria

j): Un lavado de 5' a TA en tampón I (1x)/Tween al 0,3%

k): Bloqueo de las membranas en disolución de bloqueo durante 30' en bolsas de plástico herméticamente cerradas centrifugadas a 250 rpm

l): Incubación de los fragmentos Fab anti-digoxigenina-Ap (Roche) a 0,0375 U/ml durante 30' en disolución de bloqueo

m): Dos lavados en tampón I (1x)/Tween al 0,3% de 30' cada uno

n): 5' en tampón de revelación (tampón III)

o): Revelación de membranas con sustrato quimioluminiscente CDP-Star de Roche

\newpage

Composiciones de los tampones

: Tampón de hibridación: NaPi 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM

: Disolución de lavado: NaPi 40 mM, SDS al 1%

: Tampón I (10x): ácido maleico 1 M, NaCl 1,5 M, pH 7,5

: Disolución de bloqueo: reactivo de bloqueo (Roche) a 10% peso/volumen en tampón I

: Tampón III (1x): por litro: Tris 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM

\vskip1.000000\baselineskip

Genotipado de ratones transgénicos por PCR Reacciones de PCR:

: 100 ng de ADN genómico o 1 ng de ADN de plásmido

: 1 \muM de cada cebador

: Mezcla RED Taq Ready (Sigma)

: DMSO del 5 al 10% dependiendo del cebador usado (véanse las condiciones de PCR)

: Qsp con agua esterilizada en autoclave hasta 10 \mul

: Recubrimiento con aceite mineral y colocar en ciclador térmico.

\vskip1.000000\baselineskip

Condiciones de PCR:

: Desnaturalización 3' a 94ºC, 1 ciclo

: Desnaturalización 20'' a 94ºC

: Hibridación 30'' a temperatura variable dependiendo de los cebadores, Tm 35 ciclos

: Amplificación 20'' a 72ºC

: Ronda final de amplificación a 72ºC durante 3'

: Los productos de PCR se analizan en gel de agarosa al 2,5%-TAE

: PCR de \beta-globina

: DMSO al 10%, hibridación a 51ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR del gen \beta-globina de ratón que conducen a la amplificación de un fragmento de 494 pb

: Amplificación por PCR de Red

: DMSO al 10%, hibridación a 55ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de indicador de la secuencia de Megafluo que conducen a la amplificación de un fragmento de 484 pb

: Amplificación por PCR de I-SceI

: DMSO al 10%, hibridación a 55ºC

\newpage

Oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de un subfragmento de las secuencias de pl-SceI/EGFP que conducen a la amplificación de un fragmento de 400 pb

: Amplificación por PCR de Lago

: DMSO al 5%, hibridación a 51ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de indicador de la secuencia de PIFFLago que conducen a la amplificación de un fragmento de 370 pb

: Controles de PCR:

: Control de contaminación: reacción de PCR idéntica excepto sin ADN, pero sólo agua (C) Control positivo: ADN de ratón B6SJL (wt) para garantizar que la muestra de ADN es ``amplificable con el uso de cebadores para la beta-globina de ratón demostrando que un gen de copia única puede amplificarse con los ADN genómico que van a genotiparse.

: El ADN de plásmido superenrollado positivo/negativo se usó sistemáticamente como controles en todos los experimentos de PCR.

Claims

1. Un procedimiento no terapéutico para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped mediante preparación en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, en el que dicho procedimiento comprende:

a): Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en el genoma de la célula huésped;

c): mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido liberado en dicho genoma de la célula huésped,

y en el que dicha célula huésped es una célula no humana.

2. Un procedimiento in vitro para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped mediante preparación en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, en el que dicho procedimiento comprende:

y en el que dicha célula huésped es una célula somática no embriónica humana.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped un agente de escisión.

5. Procedimiento según la reivindicación 1-4, en el que dicho polinucleótido está flanqueado por al menos un sitio de escisión.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho polinucleótido está flanqueado por dos sitios de escisión.

7. Procedimiento según la reivindicación 1-6, en el que dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha endonucleasa es una meganucleasa.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape-I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-MfI I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-TIi I, PI-TIi II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Sce I.

12. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha endonucleasa es sintética.

13. Procedimiento según la reivindicación 1-12, en el que dicho polinucleótido no puede someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped.

15. Procedimiento según la reivindicación 1-14, en el que dicho vector es un plásmido.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-15, en el que dicha célula huésped no humana se selecciona del grupo que está constituido por una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha célula huésped no humana es una célula madre.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha célula huésped no humana es una célula somática.

19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha célula huésped no humana es un huevo.

20. Procedimiento según la reivindicación 1-19, en el que dicha secuencia de polinucleótidos es una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora o una secuencia de reconocimiento para una molécula.

21. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha célula huésped no humana proviene de pez, ave, mamíferos no humanos, insecto, anfibio o reptil.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha célula huésped proviene de medaka, pez cebra, pez espinoso, Astyanax, ratones, pollos, Xenopus, ovejas, vaca, conejo.

23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-22, en el que el procedimiento comprende además la etapa de generar una célula de mamífero o pez, un animal mamífero no humano o pez transgénicos o una planta transgénica para producir proteína, biomolécula, biomaterial o vacuna.

24. Un procedimiento para producir un animal transgénico no humano, en el que células madre embriónicas se transfectan mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y 3-22, las células se inyectan en embriones en una fase en la que pueden integrar las células transfectadas, los embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los que se observa la colonización por células madre embriónicas de la línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos.

25. Un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que el huevo fecundado se transfecta mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y 3-22, los huevos se reimplantan en una madre sustituta y los individuos transgénicos se obtienen al final de la gestación.

26. Un procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el que el huevo fecundado se transfecta mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y 3-22, los huevos se incuban en condiciones apropiadas para desarrollar dicho animal transgénico.

27. Una composición para transgénesis que comprende:

1): un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse en un genoma de la célula huésped, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en dicho genoma de la célula huésped; y,

28. Composición según la reivindicación 27, en la que dicho polinucleótido está flanqueado por al menos un sitio de escisión.

29. Composición según la reivindicación 28, en la que dicho polinucleótido está flanqueado por dos sitios de escisión.

30. Composición según la reivindicación 26-29, en la que dicho sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa correspondiente.

31. Composición según la reivindicación 30, en la que dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos.

32. Composición según la reivindicación 31, en la que dicha endonucleasa es una meganucleasa.

33. Composición según la reivindicación 32, en la que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Chu I, I-Csm I. I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III. I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II, I-Ncr I, I-Ncr II, I-Pan II, I-Tev I, I-Ppo I, I-Dir I, I-Hmu I, I-Hmu II, I-Tev II, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II (HO), F-Suv I, F-Tev I y F-Tev II.

34. Composición según la reivindicación 33, en la que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu I, I-Cre I, I-Sce I.

35. Composición según la reivindicación 32, en la que dicha endonucleasa es sintética.

36. Composición según la reivindicación 27-35, en la que dicho vector es un plásmido.

37. Composición según la reivindicación 27-36, en la que dicho vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse comprende además dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.

38. Composición según la reivindicación 27-37, en la que dicho polinucleótido no puede someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped.

39. Composición según la reivindicación 38, en la que las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido no tienen homología con una secuencia genómica de la célula huésped.