ES2342971T3 - Antigenos recombinantes quimericos de toxoplasma gondii. - Google Patents

Antigenos recombinantes quimericos de toxoplasma gondii. Download PDF

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Abstract

Un antígeno quimérico recombinante que contiene la fusión de al menos tres regiones antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii, en el que las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1

Description

Antígenos recombinantes quiméricos de Toxoplasma gondii.
Campo de la invención
La invención descrita en el presente documento se refiere a un campo técnico de la preparación de medios diagnósticos no aplicados directamente al cuerpo animal o humano. La invención también proporciona, compuestos, procedimientos para su preparación, procedimientos para uso y composiciones que los contienen, que son adecuados para aplicación industrial en el campo farmacéutico y diagnóstico, en particular para la detección y diagnosis de infecciones de Toxoplasma gondii, así como para el tratamiento y prevención de dichas infecciones.
Antecedentes de la invención
La diagnosis precoz es un objetivo prioritario y altamente deseable en todos los campos de medicamento, en particular debido a que permite una mejora apreciable en la vida del paciente y un ahorro concomitante en la parte de los sistemas de asistencia sanitaria o en la parte de los pacientes. En el caso particular de la invención descrita en el presente documento, diagnosis temprana es la de la infección potencial o existente de Toxoplasma gondii en mujeres embarazadas, con una referencia particular para la salud del feto, y en sujetos infectados, en particular aquellos con inmunidad alterada.
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que infecta todas las células de mamífero, incluyendo los de los sujetos humanos (McCabe y Remington, N. Engl. J. Med. 1988, 318 - 313 - 5). Morfológicamente, el parásito muestra tres formas distintas de infección: taquizoito (asexual), bradizoito (en quistes de tejido, asexual) y esporozoitos (en ooquistes reproducción sexual). La transmisión típicamente se produce mediante la ingestión de carne no bien cocinada que alberga quistes de tejido u hortalizas contaminados con ovoquistes desprendidos por los gatos. La infección humana es en general asintomática y autolimitante en los huéspedes inmunocompetentes. Por el contrario, en sujetos con inmunidad alterada (en particular los afectados por SIDA AIDS), toxoplasmosis es una infección oportunista grave, que puede dar lugar a encefalitis con muy graves resultados (Luft, B.J., Remington J.S., 1992, Clin. Infect. Dis. 15, 211 - 22). Además, el contraer la infección primaria durante el embarazo puede conducir a abortos o a enfermedad fetal grave en mamíferos.
Para una extensiva visión general del problema de toxoplasmosis el lector se remite a la bibligrafía médica específica.
La diagnosis de infección por T. gondii infección se establece mediante aislamiento del microorganismo en la sangre o fluidos corporales, identificación del parásito en los tejidos, detección de secuencias de nucleótidos específicas mediante PCR, o detección de inmunoglobulinas específicas anti-T. gondii producidas por el huésped en respuesta a la infección (Beaman et al., 1995 Principles and Practice of Infectious Diseases 4ª Ed, Churchill Livingstone Inc., New York, 2455 - 75; Remington JS et al. 1995, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140 - 267).
Los desafíos principales para los médicos son la diagnosis de infecciones por T. gondii primarias en mujeres embarazadas y la diagnosis de infección congénita en sus recién nacidos/niños. En ambos casos, para implementar terapias adecuadas con tiempo y evitar posible daño al feto y nacidos/niños, es muy importante establecer si la infección parasitaria se ha contraído antes o después de la concepción en mujeres embarazadas. Además, es esencial determinar cuando se produce la transmisión vertical desde la madre o al feto. Finalmente, para el tratamiento clínico de recién nacidos/niños existe una necesidad urgente de un procedimiento sensible de diagnóstico que pueda determinar, de manera temprana en su vida, los sujetos infectados y no infectados, ambos nacidos de madres con toxoplasmosis en el embarazo.
Seroconversión durante la gestación y diagnosis de infección congénita en neonatos se realiza en general intentando detectar la presencia de diversas clases de inmunoglobulinas anti-Toxoplasma (IgG, IgM, IgA, con avidez de IgG), y comparar los perfiles inmunológicos de la madre frente a su hijo.
Sin embargo, los ensayos comerciales disponibles no proporcionan suficiente sensibilidad y especificidad para permitir la diagnosis de la infección en todos los pacientes. Por lo tanto es deseable la disponibilidad de agentes de diagnóstico específicos, sensibles e innovadores.
Los antígenos de T. gondii se han conocido y están disponibles desde hace tiempo, primero de todo como mezclas de antígenos obtenidas de diversas maneras (documento FR 2.226.468, Mérieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016, Nihon Toketsu Kanso), después como aislamientos posteriores de antígenos puros (documento EP 0 082 745, Mérieux; EP 0 301 961, INSERM, Pasteur; documento WO 89/5658, Transgene) y su caracterización tanto como proteínas, como de sus genes respectivos (documento WO 89/08700, U. Leland, Dartmouth Coll.; documento US 4.877.726, Res. Inst. Palo Alto; documento WO89/12683, INSERM, Pasteur; documento EP 0 391 319, Mochida Pharm.; documento IT 1,196,817, CNR; documento EP 0 431 541, Behringwerke; documento WO 92/01067, CNRS; documento WO 92/02624, U. Flinders; documento WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; documento US 5.215.917, Res. Inst. Palo Alto; documento WO92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; documento WO96/02654, bioMeriéux, Transgene; documento EP 0 710 724 Akzo; EP 0 724 016, bioMeriéux; documento EP 0 751 147, Behringwerke; documento US 5.633.139, Res. Inst. Palo Alto; documento WO 97/27300, Innogenetics; documento US 5.665.542, documento US 5.686.575, Res. Inst. Palo Alto; documento WO 99/32633, Heska; JP 11225783, Yano; documento WO 99/61906, Abbott; documento WO 99/66043, Smithkline Beecham; documento JP 2000300278, Yano; documento WO 00/164243, Virsol), y finalmente, el aislamiento y caracterización de regiones antigénicas de productos del gen de Toxoplasma (documento WO 03/080839, Kenton S.r.l.)
Numerosos estudios han encontrado diversas proteínas antigénicas diferentes de T. gondii y las secuencias génicas de éstas también se han determinado.
Entre las proteínas más interesantes para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos, en la forma de vacunas, los inventores deben mencionar: las proteínas de micronemas (documento WO 03/080839, Kenton S.r.l.; Beghetto et al., The Joumal of Infectious Diseases, 2005, 191: 637 - 645; Beghetto et al., Intemational Journal for Parasitology, 2003, 33:163 - 173); los antígenos de superficie SAG1 (o P30) (documento WO 89/08700, Stanford University; documento WO 89/12683 Pasteur, INSERM; documento WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMeriéux; documento EP 0 724 016, documento WO 99/61906, documento US 5.962.654, Harning et al., Clinical and Diagnostic Laboratory lmmunology, mayo de 1996, 355 - 357) y SAG2 (o P22) (Parmley et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30, 1127 -
33); las proteínas de gránulos densos GRA1 (o P24) (documento EP 0 301 961, Pasteur, INSERM; documento WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw, et al., 1989 P.N.A.S. USA 86, 7537 - 41), GRA2 (o P28) (documento WO 93/25689, INSERM, Pasteur; documento US 5.633.139, documento US 5.665.542, documento US 5.686.575, Res. Inst. Palo Alto; Prince et al., Mol. Biochem. Parasitol., 34 3 - 14), GRA4 (Mevelec et al., Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227 - 38), GRA6 (o P32) (documento FR 2.702.491, INSERM, Pasteur; Lecordier et al., Mol. Biochem. Parasitol. 70, 85 - 94), GRA7 (documento WO 99/61906, Abbott; Jacobs et al., Mol. Biochem. Parasitol. 91, 237 - 49) y GRA3 (Robben et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 17544-47): los antígenos rhoptry ROP1 (o P66) (documento US 5.976.553, U. Leland; documento EP 0 431 541, Innogenetics) y ROP2 (o P54) (Sharma et al., J. Immunol., 131, 377 -
83).
Como se describe en las referencias anteriormente mencionadas, se obtuvieron los antígenos con técnicas de ADNc recombinante en vectores de expresión. Por ejemplo, para el antígeno SAG1, documento WO 98/08700 usa vectores de expresión conocidos en fago lambda-gt11.El documento WO98/12683 usa el mismo fago y se transfecta E. coli con un plásmido propietario, o mediante la preparación de un módulo de expresión especial, como en el documento WO 96/02654. El documento EP 0 724 016 obtiene mimotopos que usan genotecas de expresión de combinación de péptidos. El documento EP 0 301 961 describe cómo obtener antígenos excreción-secreción con pesos moleculares que varían entre 20 kDa y 185 kDa. El documento WO 89/05658 describe una proteína que contiene los epítopos de la proteína de 24 kDa reconocida por los anticuerpos producidos contra los antígenos de excreción-secreción de Toxoplasma; esta proteína se obtiene mediante transfección de células por medio de vectores de expresión. El documento WO 03/080839 describe un procedimiento basado en la tecnología de despliegue en fago que identifica fragmentos de antígeno de proteínas de T. gondii y su uso como agentes de diagnostico e inmunogénicos. El antígeno P28 (GRA2) se describe en el documento US 5.633.139 y el procedimiento de obtención se implementa de nuevo mediante la expresión en el fago lambda-gt11. El antígeno P32 (GRA6) se describe en la patente FR 2.702.491, el antígeno ROP1 (P66) en la patente de Estados Unidos 5.976.553, P35 (o GRA8) en el documento EP 0 431 541, documento WO 99/57295 y documento WO 99/61906, y posteriormente P68 en el documento EP 0 431 541.
Yang et al. (Parasitol. Res., 2004, 92: 58 - 64) describen una proteína quimérica que contiene SAG1 y SAG2 y su uso para desarrollar inmunidad contra T. gondii en ratones.
La patente china 11 94991C describe una proteína de fusión recombinante que contiene dos antígenos de toxoplasma (GRA6 y p30). No se reseñó ningún dato que mostrara que los ensayos basados en esta proteína de fusión recombinante muestran la sensibilidad requerida en ensayos basados en IgG- e IgM.
Durante los últimos diez años, varios estudios han reseñado el uso de antígenos recombinantes para la diagnosis sexológica de infección por T. gondii. Sin embargo, aunque prometedores, ninguno de los ensayos basados en los antígenos recombinantes mostró todas las características requeridas para reemplazar el antígeno de taquizoitos en ensayos basados en IgG- y IgM-, indicando que se necesita un trabajo adicional antes que un inmunoensayo que emplea productos recombinantes esté disponible para propósitos clínicos.
De este modo el principal deseo de los estudios en este campo es mejorar el comportamiento de inmunoensayos ligados a enzima basados en productos recombinantes, mejorando de esta manera, por ejemplo la diagnosis temprana de toxoplasmosis congénita en recién nacidos/niños.
Sumario de la invención
Se ha encontrado que la combinación de regiones antigénicas de proteínas de Toxoplasma gondii, en la forma de productos de fusión recombinantes, retiene las propiedades antigénicas de los fragmentos de antígenos individuales. Las proteínas quiméricas recombinantes producidas de esta manera se pueden usar para propósitos de diagnóstico y terapéuticos.
\newpage
El uso de dichos antígenos quiméricos como agentes de diagnóstico y los adyuvantes de diagnóstico relacionados que los contienen, por ejemplo en la forma de inmunoensayos ligados a enzima o kits, constituyen un objeto adicional de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención son las secuencias génicas que codifican los antígenos quiméricos anteriormente mencionados, su uso como medicamentos, en particular para la prevención y terapia de infección por Toxoplasma gondii, por ejemplo, como terapia génica. La presente invención también se extiende a las secuencias génicas que se hibridan a las secuencias de los antígenos quiméricos anteriormente mencionados en condiciones de hibridación rigurosas.
Otro objeto de la presente invención es el uso de los antígenos quiméricos como medicamentos, en particular en la forma de vacunas, que son útiles para la prevención y cura de la infección. Las vacunas de acuerdo con la presente invención son adecuados para uso en seres humanos y otros animales (en particular cerdo, gato, oveja).
Éstos y otros objetos de ilustrarán aquí más adelante en detalle, también mediante ejemplos y figuras.
Descripción detallada de la invención
El principal objeto de la presente invención es, por lo tanto, la provisión de antígenos quiméricos recombinantes obtenidos mediante la fusión de regiones antigénicas diferentes de productos génicos de Toxoplasma gondii, y el uso de las proteínas recombinantes obtenidas de esta manera para el desarrollo de medios diagnósticos y terapéuticos selectivos.
Las principales ventajas de la presente invención sobre los otros tipos de antígenos o fragmentos de antígeno conocidos en la bibliografía como se reseñan anteriormente son los siguientes y son evidentes cuando estos antígenos se usan en los inmunoensayos de diagnóstico en suero en muestra para la detección de la infección:
- Con respecto al uso del antígeno de Toxoplasma gondii completo, preparado a partir de parásito como lisado, extracto de células enteras, los antígenos quiméricos recombinantes tienen la ventaja de evitar reacciones no específicas debido a la presencia de de otro material no proteináceo y de proporcionar una mejor reproducibilidad. Además, algunos antígenos de proteína naturales del parásito son insolubles y, por lo tanto, están escasamente representados en ensayos comerciales que emplean el extracto de células enteras lisadas de T. gondii.
- Con respecto al uso de regiones antigénicas individuales o fragmentos de antígenos individuales (como se describe en el documento WO 03/080839), los antígenos quiméricos recombinantes muestran la ventaja de mejorar la sensibilidad de los ensayos en los que se usan. En otras palabras su uso disminuye o suprime la aparición de respuestas negativas falsas.
A) Con respecto al uso de una mezcla o una colección de regiones antigénicas individuales (como también se contempla en el documento WO03/080839), las ventajas son al menos dos. Desde el punto de vista de de la aplicabilidad y producción industrial es mucho más fácil de producir una construcción individual modificada por ingeniería genética que contiene tres o más regiones de antígeno en lugar de producir de manera separada cada fragmento individual y posteriormente ensamblarlas mediante un procedimiento económico y reproducible. En segundo lugar, como ya se ha dicho antes, el uso antígenos recombinantes quiméricos de la invención mejora la sensibilidad de los ensayos.
Éstas y otras ventajas se muestran en la sección de los Ejemplos.
En particular la presente invención se refiere a un antígeno recombinante quimérico que contiene la fusión al menos tres diferentes regiones antigénicas de Toxoplasma gondii, en las que dichas regiones antigénicas son epítopos de células B, que se unen a anticuerpos específicos de Toxoplasma gondii. Preferiblemente los anticuerpos específicos de Toxoplasma gondii se extraen de suero de sujetos que han sido infectados por Toxoplasma gondii.
Más en particular la presente invención cubre un antígeno quimérico, en el que las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42. Las secuencias preferidas en el grupo anterior son SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12.
Por ejemplo el antígeno quimérico de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32.
Los antígenos quiméricos de la presente invención se pueden modificar mediante ingeniería genética mediante procedimientos conocidos. Las fusiones se pueden dirigir (el extremo C de una secuencia de aminoácidos está unido al N-terminal del otro mediante un simple enlace covalente) o pueden emplear un dominio de engarce flexible, tal como la región bisagra de IgG humana, o engarces de polipéptidos que constan de aminoácidos pequeños tales como glicina, serina, treonina o alanina, en diversas combinaciones y longitudes. Por ejemplo el engarce puede ser una repetición de poliglicina interrumpida por serina o treonina a un cierto intervalo. Preferiblemente, el engarce está compuesto por tres restos de glicina y dos restos de serina, proporcionando la secuencia de aminioácidos Ser-Gly-Gly-Gly-Ser (engarce SGGGS).
De manera adicional, los antígenos quiméricos de la invención se pueden marcar mediante His-His-His-His-His-His (His6), para permitir una purificación rápida mediante cromatografía de metal-quelato, y/o mediante epítopos para los que están disponibles los anticuerpos, para permitir la detección sobre transferencias de Western, inmunoprecipitación, o actividad supresión/bloqueo en bioensayos.
Otro objeto de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico como se ha definido anteriormente. De acuerdo con una realización preferida de la invención tal secuencia de nucleótidos comprende al menos tres secuencias de nucleótidos diferentes seleccionadas entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11. De acuerdo con una realización más preferida, tal secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 31.
También se incluyen en el ámbito de la presente invención secuencias de nucleótidos que se hibridan con cualquier secuencia descrita anteriormente en condiciones de hibridación rigurosas, así como el antígeno recombinante quimérico codificado por tal secuencia de nucleótidos hibridada.
Los antígenos quiméricos de la presente invención se pueden preparar mediante clonación y expresión en un sistema de expresión procariótico o eucariótico, usando los vectores de expresión apropiados. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la técnica.
Por ejemplo las moléculas de ADN que codifican los antígenos de la invención se insertan en vectores de expresión construidos de manera apropiada mediante técnicas bien conocidas en la en la técnica (véase Sambrook et al, 1989). Tales vectores son otro objeto de la presente invención.
Con el fin de ser capaz de expresar la proteína deseada (en este caso los antígenos quiméricos), un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicas que contienen información reguladora de transcripción y de traducción ligada al ADN que codifica la proteína deseada de tal manera que permita la expresión génica y producción de la proteína. Primero con el fin de que se transcriba el gen debe estar precedido de un promotor reconocible por la ARN polimerasa, al que se une la polimerasa y de esta manera inicia el proceso de transcripción. Existe una diversidad de tales promotores en uso, que funcionan con eficacias diferentes (promotores fuertes y
débiles).
Para los huéspedes eucarióticos, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de transcripción y de traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Se pueden derivar de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de simio o similares, donde las señales reguladoras están asociadas a un gen particular, que tiene un nivel de expresión. Los ejemplos son el promotor TK del virus Herpes virus, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Las señales reguladoras del inicio de la transcripción se pueden seleccionar para que permitan la represión y activación, de manera que la expresión de los genes se pueda modular. Todos estos huéspedes son un objeto adicional de la presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos quiméricos de la invención pueden estar ligadas a una secuencia heteróloga de manera que la molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión. Tales moléculas de ácido nucleico combinadas se incluyen dentro de las realizaciones de la invención. Por ejemplo, pueden estar unidas al ADN que codifica una proteína que permite la purificación del antígeno quimérico mediante solamente una etapa de cromatografía de afinidad. Esta proteína unida/fusionada pueden ser por ejemplo Glutation Sulfo Transferasa (GST) para generar los productos de fusión en el extremo carboxi de la proteína GST. Las proteínas recombinantes correspondientes expresadas en el citoplasma de células de E. coli transformadas se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad usando una resina Glutation - Sefarosa.
La molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la molécula quimérica de la invención se inserta en vector (es), que tiene (n) las señales reguladoras de transcripción y de traducción unidas de manera operativa, que es (son) capaz (capaces) de integrar las secuencias génicas en la célula huésped. Las células que se han transformado de manera estable por el ADN introducido se pueden seleccionar también mediante la introducción de uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador también puede proporcionar fototrofía a un huésped auxotrópico, resistencia biocida, por ejemplo, antibióticos, o metales pesados tal como cobre o similares. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o introducirse en la misma célula mediante co-transfección. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de proteínas de la invención.
Los factores de importancia en la selección de un vector plásmido o viral particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras, que contienen el vector se pueden reconocer y seleccionar entre las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped particular; y si es deseable que sea capaz de "transferir" el vector entre las células huésped de especies diferentes.
Una vez que el (los) vector (es) o secuencia de ADN que contiene la construcción (es) se han preparado para la expresión de la construcción (es) de ADN se pueden introducir en una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una diversidad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplasto, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.
Las células huésped pueden ser o bien procarióticas o eucarióticas. El ejemplo de huéspedes eucarióticos son células de mamífero, tales como células humanas, de mono, de ratón, y de ovario de hámster chino (CHO). La expresión en estas células huésped proporciona modificaciones después de la traducción para las moléculas de proteína, incluyendo plagado correcto o glicosilación en los sitios correctos. También células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones de péptidos después de la traducción incluyendo la glicosilación. Existen numerosas estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias de promotores fuertes y un alto número de copias de plásmidos que se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce las secuencias guía sobre productos génicos de mamífero clonados y secreta péptidos que llevan secuencias guía (es decir, pre-péptidos). El ejemplo de huéspedes procarióticos son bacterias, tales como Escherichia coli.
Después de la introducción del (de los) vector (es), las células huésped se desarrollan en un medio selectivo que selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de la secuencia (s) génica (s) clonada (s) da como resultado la producción de las proteínas deseadas.
La purificación de los antígenos recombinantes se lleva a cabo mediante cualquiera de los procedimientos conocidos para este propósito, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electrofóresis, o similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede usar con preferencia para purificar los antígenos de la invención es cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína diana y que se producen e inmovilizan sobre una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen la proteína recombinante se pasan a través de la columna. Los antígenos se unirán a la columna por el anticuerpo específico mientras las impurezas pasarán a través. Después del lavado, el antígeno se eluye del gel mediante un cambio en el pH o resistencia iónica.
Otro aspecto de la presente invención es el procedimiento para la producción recombinante del antígeno quimérico como se ha descrito anteriormente, que comprende el cultivo de la célula huésped transformada con el vector que contiene la secuencia de nucleótidos de la invención y aislamiento del producto deseado.
Un objeto adicional de la presente invención es una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión anterior, así como las secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales.
"Secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales" incluyen todas las otras secuencias de ácido nucleico que, en virtud de la generación del código genético, también codifican la secuencia de aminoácidos dada.
Otro objeto de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que se híbrida al complemento de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico de la invención en condiciones altamente rigurosas o moderadamente rigurosas, mientras que el antígeno obtenido mantiene la misma actividad biológica, es decir, capacidad para unirse a anticuerpos contra el parásito.
El término "hibridación" como se usa aquí se refiere a la asociación de dos moléculas de ácido nucleico con otra mediante enlace de hidrógeno. Típicamente, una molécula se fijará a un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Después, las dos moléculas se pondrán en contacto entre sí en condiciones que favorezcan el enlace de hidrógeno. Los factores que afectan a esta unión incluyen: el tipo y volumen de disolvente; temperatura de reacción; tiempo de hibridación; agitación; agentes para bloquear la unión no específica de la molécula en fase líquida al soporte líquido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las moléculas; uso de compuestos para incrementar la tasa de asociación de moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y las condiciones de rigurosidad y de lavado después de la hibridación.
Las condiciones de rigurosidad son una función de la tempetatura usada en el experimento de hibridación, la molaridad de los cationes monovalentes y el porcentaje de formamida en la solución de hibridación. Para determinar el grado de rigurosidad implicada con cualquier establecimiento de condiciones dado, uno primero usa la ecuación de Meinkoth et al. (1984) para determinar la estabilidad de híbridos del 100% identidad expresada como temperatura de fusión Tm del híbrido ADN-ADN: Tm = 81,5ºC + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% de forma) - 500/L, donde M es la molaridad de cationes monovalentes,%GC es el porcentaje de nucleótidos G y C en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud de híbrido en pares de base. Por cada 1ºC que se reduce la Tm de la calculada para un 100% de identidad de híbrido, la cantidad de falta de coincidencia permitida se incrementa en aproximadamente 1%. De este modo, si la Tm usada para cualquier experimento de hibridación dado a las concentraciones de sal y formamida especificadas es 10ºC por debajo de la Tm calculada para un 100% de híbrido de acuerdo con la ecuación de Meinkoth, la hibridación se producirá incluso si existe hasta aproximadamente 10% falta de coincidencia.
Como se usa en el presente documento, las condiciones altamente rigurosas son las que son tolerantes hasta aproximadamente 15% de divergencia de secuencia, mientras que las condiciones moderadamente rigurosas son las que son tolerantes hasta aproximadamente 20% de divergencia de secuencia. Sin limitación, los ejemplos de condiciones de alta (12-15ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido) y moderada rigurosidad (15-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido) usan una solución de lavado de 2 X SSC (citrato salino estándar) y 0,5% de SDS a la temperatura apropiada por debajo de la Tm calculada del híbrido. La rigurosidad fundamental de las condiciones se debe principalmente a las condiciones de lavado, en particular si las condiciones de hibridación usadas son las que permiten híbridos menos estables para formarse junto con híbridos estables. Las condiciones de lavado a mayor rigurosidad eliminan después los híbridos menos estables. Una condición de hibridación común que se puede usar con las condiciones de lavado de altamente rigurosas a moderadamente rigurosas descritas anteriormente la hibridación en una solución de 6 X SSC (o 6 X SSPE), 5 X reactivo de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado a una temperatura aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm. Si se usan sondas mixtas, es preferible usar cloruro de tetrametil amonio (TMAC) en lugar de SSC (Ausubel, 1987 -
1998).
El término "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, tales como los que contienen estructuras centrales modificadas.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención también incluyen moléculas no codificantes que son parcialmente complementarias con las moléculas ácido nucleico que codifican antígenos de la presente invención y que por lo tanto se hibridan a las moléculas de ácido nucleico codificantes (hibridación). Tales moléculas no codificantes, tales como oligonucleótidos, se pueden diseñar para reconocer, unirse de manera específica a y evitar la transcripción de un ácido nucleico diana que codifica un polipéptido de la invención, como conocerán los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Cohen, J.S., Trends en Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooneyetal., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991).
De acuerdo con la terminología usada en el presente documento, una composición que contiene un compuesto [X] está "sustancialmente libre de" impurezas [en el presente documento, Y] cuando al menos 85% en peso del total X+Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende al menos aproximadamente 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 98% o incluso 99% en peso.
Otro aspecto de la invención es el uso de antígenos quiméricos descritos anteriormente como medicamentos. En particular, uno de los principales objetos de la invención es el uso de antígenos quiméricos como ingredientes activos para la preparación de medicamentos para la prevención o tratamiento de infecciones por Toxoplasma gondii.
En el caso de terapia génica otro objeto de la invención es el uso de las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos de la invención como medicamentos, en particular para la preparación de medicamentos útiles para el tratamiento y prevención de infecciones por Toxoplasma gondii.
Las composiciones farmacéuticas deben comprender preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz de los antígenos quiméricos de la invención o la secuencia de nucleótidos correspondiente. Los antígenos quiméricos de la invención pueden de esta manera actuar como vacunas para la prevención o el tratamiento de infección por Toxoplasma gondii.
Para la aplicación terapéutica, cuando la preparación de medicamentos o vacunas comes está dentro del sistema del conocimiento general, para referencia adicional el lector se puede referir otra vez a la bibliografía de patentes citada en la presente descripción y, en particular, a Beghetto et al., The Journal of Infectious Diseases, 2005, 191: 637 - 645.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesitado para tratar, mejorar, o prevenir una enfermedad o afección diana, o que muestra un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en ensayos de cultivos de células, por ejemplo, de células, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos.
El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración y vía de administración apropiado. Tal información se puede después usar para determinar las dosis y vías de administración útiles en seres humanos.
La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado patológico, salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación (es) de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar mediante experimentación de rutina y está dentro del juicio del médico. En general, una dosis eficaz estará entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferiblemente 0,05 mg/kg y 10 mg/kg. Las composiciones se pueden administrar de manera individual a un paciente o se puede administrar en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.
Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Tales vehículos incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, siempre que el vehículo no induzca él mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que se puede administrar sin toxicidad excesiva.
Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, ligeramente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, poli ácidos lácticos, poli ácidos glicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.
Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden usar en el presente documento, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de los ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Una descripción completa de los vehículos farmacéuticamente aceptable está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J.1991).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden de manera adicional contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. De manera adicional, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponación de pH, y similares, pueden estar presentes en tal composiciones. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, y similares, para ingestión por el paciente.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, se pueden tratar sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención mediante cualquier número de vías incluyendo, pero sin limitación a, aplicaciones oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica o transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), medios subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, entéricos, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Las pistolas génicas o hipopulverizaciones también se pueden usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar en forma de inyectables, o bien como soluciones o suspensiones líquidas; formas
sólidos adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección también se pueden preparar.
La administración directa de las composiciones en general se llevarán a cabo mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o distribuirse al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión.
El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de dosis múltiple.
El procedimiento de tratamiento de un mamífero que sufre infección por Toxoplasma gondii, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna como se ha descrito anteriormente representa uno de los aspectos de la presente invención. Un objeto adicional de la presente invención es el uso de antígenos quiméricos como se ha descrito anteriormente como agentes activos para la diagnosis de infecciones por Toxoplasma gondii, en particular para la diagnosis del tiempo de infección.
También los kits para la diagnosis de infección por Toxoplasma gondii, que contienen al menos un antígeno quimérico de acuerdo son parte de la presente invención. Tales kits amy son útiles para la diagnosis de una infección aguda y/o crónica por Toxoplasma gondii.
El antígeno quimérico de la invención se pueden emplear virtualmente en cualquier formato de ensayo que emplea un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se pone en contacto con el componente del cuerpo sospechoso de contener anticuerpos en condiciones que permiten que el antígeno se una a tal cualquier anticuerpo presente en el componente. Tales condiciones típicamente serán temperatura fisiológica, pH resistencia iónica usando un exceso de antígeno. A la incubación del antígeno con el espécimen sigue la detección de complejos inmunes que comprenden el antígeno.
El diseño de inmunoensayos se somete a una gran cantidad de variaciones, y se conocen muchos formatos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos, o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpo o polipéptido marcado; las marcas pueden, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, o de tintes. Los ensayos que amplifican las señales del complejo inmune son también conocidos; los ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina, en inmunoensayos marcados y mediados por enzima, tales como ensayos de ELISA.
El inmunensayo puede estar, sin limitación, en un formato heterogéneo u homogéneo y de un tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido está típicamente unido a una matriz o soporte sólido para facilitar la separación del polipéptido después de la incubación.
Los ejemplos de soportes sólidos que se pueden usar son nitrocelulosa (por ejemplo, en membrana o pocillo de microvaloración (forma), poli (cloruro de vinilo) (por ejemplo, en hojas o pocillos de microvaloración), látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microvaloración, poli (fluoruro de vinilidino) (conocido como Immulon^{TM}), papel diazotizado, membranas de nylon, perlas activadas, y perlas de Proteína A. Por ejemplo, placas de microvaloración Dynatech Immulon^{TM}1 o Immulon^{TM}2 o perlas de poliestireno de 0,25 pulgadas (0,635 cm) (Bola de Plástico de Precisión) se pueden usar en el formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra de ensayo, y antes de la detección de anticuerpos unidos. Tanto los formatos estándar como competitivo se conocen en la técnica.
En un formato homogéneo, la muestra de ensayo se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, pueden ser en condiciones que precipitarán cualesquiera complejos antígeno-anticuerpo que se forman. Tanto los formatos estándar como competitivo para estos ensayos se conocen en la técnica.
En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos que forman el complejo antígeno-anticuerpo se controla directamente. Esto se puede llevar a cabo mediante la determinación de si los anticuerpos anti-xenogénicos (por ejemplo, anti-humano) que reconocen un epítope anticuerpos anti-Toxoplasma gondii se unirán debido a la formación de un complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos en la muestra se deduce mediante control del efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando de competición) en el complejo.
Los complejos formados que comprenden anticuerpo anti-Toxoplasma gondii (o, en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo de competición) se detectan mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, anticuerpos no marcados en el complejo se pueden detectar usando un conjugado de Ig antixenogénica Ig que forma complejo con una marca, (por ejemplo, una marca de enzima).
En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación la reacción entre los antígenos quiméricos y el anticuerpo forma un retículo que precipita en la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no está presente ningún anticuerpo anti-Toxoplasma gondii en el espécimen de ensayo, no se forma precipitado visible.
Los antígenos quiméricos de la invención típicamente se envasarán en la forma de un kit para uso en estos inmunoensayos. El kit contendrá en diferentes recipientes la combinación de antígenos (o bien ya unidos a una matriz sólida o separado con reactivos para unirlos a la matriz), las formulaciones de anticuerpo de control (positivo y/o negativo), el anticuerpo marcado cuando el formato de ensayo requiere los mismos reactivos y generadores de señal (por ejemplo, sustrato de enzima) si la marca no genera una señal directamente. Las instrucciones.(por ejemplo, escritas, grabadas en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo usualmente estarán incluidas en el kit.
Los kits de diagnóstico, que serán el objeto de la presente invención, por lo tanto son conocidos por los expertos en la técnica. A modo de ejemplo, el lector se puede remitir a la bibliografía del paciente citada anteriormente, a la que se pueden añadir los documentos US 6.265.176, WO 01/63283, y WO 03/080839 como referencias adicionales.
La invención se ilustrará ahora en gran detalle por medio de los ejemplos y figuras.
Descripción de las figuras
Figura 1. Mapa de plásmido del vector de expresión bacteriano pGEX-SN.
Figura 2. Representación esquemática de los antígenos quiméricos.
Las secuencias de ADN de los clones Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx- 11.b, respectivamente que codifican fragmentos de proteína de los genes de T. gondii MIC2, MIC3, SAG1, GRA3, GRA7 y M2AP se usarán para la construcción de las proteínas de fusión GST- EC2, GST-EC3 y GST-EC4.
Figura 3. Expresión de antígenos quiméricos de T. gondii en células de E. coli. Análisis de SDS-PAGE de proteínas de fusión GST-EC2, GSTEC3 y GST-EC4. Las proteínas recombinantes se sometieron a electroforesis (0,003 mg/calle) sobre gel de acrilamida al 12%. Marcadores de peso molecular MW.
Figura 4. Caracterización bioquímica del análisis HPLC de los antígenos quiméricos de la GST-EC2 purificada realizada mediante filtración en gel usando la columna TSK G4000 SW-XL.
Figura 5. Propiedades antigénicas de fragmentos de proteínas individuales dentro de los antígenos quiméricos.
Inmunorreactividad de fragmentos de antígeno individuales Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx-11.b, y de los antígenos quiméricos EC2, EC3 y EC4 con muestras de suero de individuos infectados con T. gondii. Los sueros se usaron o bien como especímenes enteros (suero) o después de la supresión de anticuerpos específicos contra combinaciones de fragmentos de antígeno (supresión Tx-1.16/Tx- 4.18, supresión Tx-2:a/Tx-4.18, etc.).
Figura 6. Inmunorreactividad de los antígenos quiméricos con anticuerpos de IgM específicos de Toxoplasma .
A) Análisis Rec-ELISA de IgM realizado con muestras de suero de IgM-positiva (C+) e IgM-negativa (C-) específicas de Toxoplasma (dilución de sueros, 1:100) variando la concentración de los antígenos de GST-EC2 y GST-EC3 marcados con biotina.
B) Análisis Rec-ELISA de IgM realizado con diluciones en serie de muestras de suero IgM-positiva específica de Toxoplasma (desde 1:100 a 1:6400) e IgM-negativa (el suero de control, diluido 1:100), ensayadas con la GST-EC2 marcada con biotina y la mezcla de GST-EC2/GST-EC3.
Figura 7. Estabilidad a largo plazo de los antígenos quiméricos.
Análisis Rec-ELISA de IgM realizado con los antígenos de GST-EC2 y GST-EC3 marcados con biotina, que se han mantenido a +4ºC durante diferentes intervalos de tiempo (días). Los resultados se expresan como la relación de las Densidades Ópticas medidas con las muestras de suero de IgM-positiva (DO C+) e IgM-negativa (DO C-) específicas de Toxoplasma.
Ejemplos
La siguiente Tabla 1 proporciona, a modo de ejemplos, las secuencias de ADN usadas para la construcción de antígenos quiméricos de Toxoplasma gondii recombinantes
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TABLA 1
1
2
La secuencia Tx-15.11 constituye un fragmento del gen GRA3 (Bermudes et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1994, 68:247 - 257). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos AALGGLAADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQEATA PGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPG (SEQ ID 2) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
La secuencia Tx-1.11 constituye un fragmento del antígeno GRA7 (Bonhomme et al., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46:1411 - 1421). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos ATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRR EPLETEPDEQEEVHF (SEQ ID 4) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
La secuencia Tx-1.16 constituye un fragmento del gen MIC3 (Garcia-Réguet et al., Cellular Microbiol., 2000, 2:353 - 364). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos RRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKE FGISASSCKCD(SEQ ID 6) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
La secuencia Tx-4.18 constituye un fragmento del antígeno SAG1 (Burg et al., J. Immunol., 1988, 141: 3584 - 3591). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos PSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCS GTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGC TGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSA (SEQ ID 8) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
La secuencia Tx-2.a representa un fragmento del gen MIC2 (Wan et al, Mol. Biochem.Parasitol., 1997, 84: 203 - 214). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos PQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRT CVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWV (SEQ ID 10) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
La secuencia Tx-11.b representa un fragmento distinto del gen M2AP (Rabenau et al., Mol. Microbiol., 2001, 41:537-547). Dicho clon tiene la secuencia de aminoácidos NEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYV TRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKE VSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVS PDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPE NSGSATPAEESPSESES (SEQ ID 12) y su uso en antígenos quiméricos está cubierto por la presente invención.
Construcción de antígenos quiméricos
El producto de proteína EC2 es una molécula quimérica que contiene las secuencias de ADN Tx-2.a, Tx-1.16 y Tx-4.18.
SEQ ID 9 se usó como molde para amplificación de ADN del clon Tx-2.a mediante el uso de oligonucleótidos K551 (5'-GGACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCC-3') y K553 (5'-CATCCAGTCCTGCTACCGCCACCAG
ACCAGACGCCACATCCAGC-3'). El oligonucleótido K553 contiene una secuencia que codifica el engarce SGGGS, que une las secuencias Tx-2.a y Tx-1.16. La condición de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 50ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
SEQ ID 5 se usó como molde para ADN del clon Tx-1.16 mediante el uso de oligonucleótidos K552 (5'-GTGGC
GTCTGGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCC-3') y K555(5'-TGACGACCGAGCTACCGCCAC
CAGAGTTATCGCATTTGCAGGATG-3'). El oligonucleótido K555 contiene una secuencia que codifica el engarce SGGGS, que une las secuencias Tx-1.16 y Tx-4.18. La condición de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 50ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
SEQ ID 7 se usó como molde para Amplificación de ADN del clon Tx-4.18 mediante el uso de oligonucleótidos K554 (5'-ATGCGATAACTCTGGTGGCGGTAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGC-3') y K556 (5'-CCGCGGCC
GCTAGCCGATTTTGCTGACCCTG-3'). La condición de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 50ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
Los productos de la PCR se purificaron mediante el "Kit de Purificación Qiagen" (Qiagen, CA, Estados Unidos). 25 ng de productos de Amplificación de ADN de la SEQ ID 9 y SEQ ID 5 se mezclaron conjuntamente y se usaron como moldes en la reacción de la PCR mediante el uso de oligonucleótidos K551 y K555. La condición de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 50ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificó con "Kit de Purificación Qiagen" (Qiagen, CA, Estados unidos) y después se mezclaron con 25 ng de producto de Amplificación de ADN de la SEQ ID 4. Finalmente, la mezcla de ADN se usó como molde para la Amplificación de ADN mediante el uso de oligonucleótidos K551 y K556, siguiendo la condición de la PCR de 30'' a 94ºC, 30'' a 50ºC y 90'' a 72ºC durante 20 ciclos.
El producto de proteína EC3 es una molécula quimérica que contiene las Secuencias de ADN Tx-15.11, Tx-1.11 y Tx-11.b.
SEQ ID 1 se usó como molde para Amplificación de ADN del clon Tx-15.11 mediante el uso de oligonucleótidos K563 (5'-GGACTAGTCGGCTGGCTGCCTTGGGAGGCCTTG-3') y K565 (5'-GCCGCGGTAGCACTACCGCCA
CCAGACAAACCAGGGCGATCTGTG-3'). El oligonucleótido K565 contiene una secuencia que codifica el engarce SGGGS, que une las secuencias Tx-15.11 y Tx-1.11. El protocolo de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 48ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
SEQ ID 3 se usó como molde para la Amplificación de ADN del clon Tx-1.11 mediante el uso de oligonucleótidos K564 (5'-GCCCTGGTTTGTCTGGTGGCGGTAGTGCTACCGCGGCCACCGCG-3') y K567 (5'-CCGGTTCGT
TACTACCGCCACCAGAGAAATGAACTTCTTCTTGTTC-3'). El oligonucleótido K567 contiene una secuencia que codifica el engarce SGGGS, que une las secuencias Tx-1.11 y Tx-11.b. El protocolo de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 48ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
SEQ ID 11 se usó como molde para la Amplificación de ADN del clon Tx-11.b mediante el uso de oligonucleótidos K566 (5'-GAAGTTCATTTCTCTGGTGGCGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAG-3') y K568 (5'-CCGCGGCCGCAGATTCAGACTCAGACGGAC-3'). El protocolo de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 45ºC y 60'' a 72ºC durante 20 ciclos.
Los productos de la PCR se purificaron mediante el "Kit de Purificación Qiagen" (Qiagen, CA, Estados Unidos). 25 ng de productos de amplificación de ADN de la SEQ ID 1 y SEQ ID 3 se mezclaron y se usaron como moldes en la reacción de la PCR mediante el uso de oligonucleótidos K563 y K567. El protocolo de la PCR era 30'' a 94ºC, 30'' a 45ºC y 60'' a 72ºC durante 30 ciclos. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificó y después se mezcló con 25 ng de producto de amplificación de ADN de la SEQ ID 11. Finalmente, la mezcla de ADN se usó como molde para la amplificación de ADN mediante el uso de los oligonucleótidos K563 y K568, siguiendo la condición de la condición de la PCR de 30'' a 94ºC, 30'' a 45ºC y 180'' a 72ºC durante 30 ciclos.
El producto de la proteína EC4 es una molécula quimérica que contiene las secuencias de ADN Tx-2.a, Tx-1.16 y Tx-11.b.
SEQ ID 9 se usó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-2.a usando los oligonucleótidos K551 y K553.
SEQ ID 5 se usó como molde para Amplificación de ADN del clon Tx-1.16 mediante el uso de oligonucleótidos K552 y K572 (5'-CGTTACTACCGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATGA-3'). El oligonucleótido K572 contiene una secuencia que codifica el engarce SGGGS, que une las secuencias Tx-1.16 y Tx-11.b.
SEQ ID 11 se usó como molde para la amplificación de ADN del clon Tx-11.b mediante el uso de oligonucleótidos K571 (5'-TAACTCTGGTGGCGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAGC-3') y K568.
Los productos de la PCR se purificaron mediante el uso de "Kit de Purificación Qiagen" (Qiagen, CA, Estados Unidos). 25 ng de los productos de amplificación de ADN de la SEQ ID 9 y SEQ ID 5 se mezclaron conjuntamente y se usaron como moldes en la reacción de la PCR mediante el uso de los oligonucleótidos K551 y K572. 25 ng de la amplificación de ADN resultante se purificó y después se mezcló con 25 ng del producto de amplificación de ADN de la SEQ ID 11. Finalmente, la mezcla de ADN se usó como molde para la amplificación de ADN mediante el uso de los oligonucleótidos K551 y K568. Las condiciones de la PCR para la construcción de EC4 eran las mismas que las usadas para las construcciones EC2 y EC3.
La siguiente Tabla 2 proporciona, a modo de ejemplos, las secuencias de ADN de los antígenos quiméricos EC2, EC3 y EC4:
TABLA 2
4
5
6 
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La proteína EC2 quimérica tiene la secuencia de aminoácidos TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIR TRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGC HAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISAS SCKCDNSGGGSSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVK VPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAF PAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSASGR (SEQ ID 28) y su uso como antígeno recombinante, que contiene fragmentos de proteína múltiples de Toxoplasma gondii, está cubierto por la presente invención.
La proteína quimérica EC3 tiene la secuencia de aminoácidos TSRLAALGGLADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQE ATAPGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPGL SGGGSATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLT TSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFSGGGSNEPVALAQLSTFLELVE VPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLA SIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCS SNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLGVSVSPDLAFGLTADGVKVKKL YASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESES AAA (SEQ ID 30) y y su uso como antígeno recombinante, que contiene fragmentos de proteína múltiples de Toxoplasma gondii, está cubierto por la presente invención.
La proteína quimérica EC4 has la secuencia de aminoácidos TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGG LEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCRPGRCIDDASHENGYTCECPTWYS REVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISAS SCKCDNSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFY VTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNF SGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGW KVNTVDLDVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSP PAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESESAAA (SEQ ID 32) y su uso como antígeno recombinante, que contiene fragmentos de proteína múltiples de Toxoplasma gondii, está cubierto por la presente invención.
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Construcción de vectores de ADN que dirigen la expresión de antígenos quiméricos como productos de fusión con GST en el citoplasma de células de E. coli
Fragmentos de ADN que codifican las proteínas quiméricas EC2, EC3 y EC4 se clonaron como productos de fusión con la proteína Glutation Sulfo Transferasa (GST) y se expresó como proteínas solubles en el citoplasma de células bacterianas, para el propósito de la determinación de su selectividad específica. Las secuencias de ADN de EC2, EC3 y EC4 (SEQ ID 27, 29 y 31, respectivamente) se digirieron con las enzimas de restricción SpeI y NotI. El ADN digerido se clonó en el vector pGEX-SN (Minenkova et al., International Journal of Cancer, 2003, 106:534 - 44), que se digirió previamente con SpeI y NotI endonucleasas, para generar los productos de fusión en el extremo carboxi de la proteína GST. Los plásmidos resultantes se usaron para transformar las células E.coli competentes siguiendo los protocolos convencionales (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
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Caracterización bioquímica de los antígenos quiméricos recombinantes
Las proteínas recombinantes GST-EC2, GST-EC3 y GST-EC4 se expresaron en el citoplasma de células de E. coli transformadas y se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando resina Glutation-Sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia), siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de la proteína y concentración se determinaron mediante análisis de SDS-PAGE (Electroforesis en Gel de Sodio Dodecil Sulfato-Poliacrilamida) y ensayo de Bradford, respectivamente. Los productos recombinantes purificados por afinidad se dializaron contra PBS, se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml con PBS y se almacenó a -20ºC hasta uso. El campo de los productos purificados era de 8 mg/litro de cultivo bacteriano, 5 mg/litro y 4 mg/litro para los antígenos quiméricos GST-EC2, GST-EC3 y GST-EC4, respectivamente. Las proteínas recombinantes se sometieron posteriormente a análisis de cromatografía de alta resolución (HPLC). Para este propósito se realizó una filtración en gel usando una columna TSK G4000 SW-XL HPLC-, mediante inyección de 30 ml de cada una de estas muestras (concentración de proteína, 2 mg/ml) en la columna con un caudal de 1 ml/min (fase móvil:KH2PO4 0,05 M; NaCl 0,3 M pH7,0). Los resultados de análisis de HPLC demostraron que los antígenos quiméricos GST EC2, GST EC3 y GST-EC4 se purificaron como productos homogéneos de en formas diméricas (véase la Figura 4 donde el análisis de HPLC de GST-EC2 se muestra como un ejemplo), con un peso molecular respectivo de 110,4, 152,6 y 130 kDa (Da, Dalton). Los agregados de proteína de alto peso molecular no estaban en todas las preparaciones de proteína purificadas.
Inmunorreactividad de los antígenos quiméricos recombinantes con anticuerpos de IgG de suero de individuos infectados por T. gondii Rec-ELISA de IgG
El comportamiento de ELISA de los productos de GST de fusión se realizó mediante recubrimiento de placas de multipocillos Maxisorp (Nunc) con fragmentos de antígeno individuales o proteínas quiméricas a una concentración de 5 mg/ml en tampón de recubrimiento (50 mM NaHCO_{3}, pH 9,6). Después de la incubación durante toda una noche a 4ºC se incubaron las placas durante 1 h a 37ºC sin tampón de bloqueo (5% de leche en polvo no grasa, 0,05% de Tween-20 en PBS) y posteriormente se incubaron durante 1 h a 37ºC con suero de individuos seropositivos y seronegativos de T. gondii, se diluyeron 1:200 en solución de bloqueo. Las placas se lavaron de manera extensiva con 0,05% de Tween-20 en PBS y conjugado de anticuerpos anti-humano-IgG peroxidasa de rábano picante (1 mg/ml; Sigma-Aldrich, Estados Unidos), se diluyeron 1:10000 en solución de bloqueo, después se añadió a cada pocillo. Finalmente, las placas de incubación con el sustrato cromogénico de tetrametilbenzidina (TMB; Sigma-Aldrich, Estados Unidos) reveló la actividad enzimática. Los resultados se reseñaron como la diferencia entre la absorbancia (Densidad Óptica, DO) a 450 y 620 nm, detactada mediante un lector automatizado de ELISA (Labsystem Multiskan, Finlandia). Para cada muestra de suero el ensayo se realizó por triplicado y se calcularon los valores medios.
La siguiente Tabla 3 muestra la reactividad de IgG de los fragmentos de antígenos individuales y antígenos quiméricos de EC2, EC3 y EC4, expresados como proteínas de fusión de GST, mediante el uso de sueros de 36 (T1-T36) T. gondii-seropositivos y 27 (N1-N27) T. gondii-seronegativos seres humanos. Se reseñan los niveles de IgG específicos de Toxoplasma, calculados como Unidades Internacionales (IU) usando un ensayo comercial (sistema VIDAS, bioMerieux, Marcy-l'Etoile, Francia). Para cada producto de fusión de GST el valor de corte se determinó como la media más dos veces la desviación estándar de las lecturas de absorbancia obtenidas de los sueros Toxoplasma IgG negativos. El tipo normal, corte de DO; tipo negrita, corte de DO. El valor numérico reseñado en cada célula se calculó como la relación de la DO de corte del antígeno correspondiente (nd, no determinado). Los valores mayores de 1 indican una respuesta positiva.
La Tabla 3 muestra claramente que algunos de los sueros que son de resultados positivos son negativos cuando se usan fragmentos antigénicos individuales mientras que resultan ser positivos, (de manera correcta) cuando se usan los antígenos quiméricos de la presente invención. Por favor, hay que hacer notar que los valores numéricos de las concentraciones de IgG obtenidas con el ensayo estándar no se pueden comparar con los otros, debido a que se han calculado con referencia al Estándar Internacional, que no se puede usar para otros ensayos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
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8 
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La siguiente Tabla 4 resume los ersultados de los ensayos de ELISA basados en las proteínas recombinantes, que emplean muestras de suero de seres humanos T. gondii seropositivos y seronegativos. En cada columna se reseñan el número y los porcentajes correspondientes de sueros reactivos. A partir de la Tabla 4 se observa claramente que la sensibilidad del ensayo (véase la 2ª columna que reseña la aparición de negativos falsos) se mejora cuando se usan antígenos quiméricos de la invención. Esta mejora es evidente con respecto tanto el uso de fragmentos quiméricos individuales como el uso de una colección o mezclas (Mix-Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2.a, Mix- Tx-1.16/Tx-4.18/Tx-2.a, Mix-Tx-1.16/Tx-2.a/Tx=11.b) de los diferentes fragmentos antigénicos individuales.
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TABLA 4
9 
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Inmunorreactividad de dominios antigénicos individuales dentro de los antígenos recombinantes quiméricos con anticuerpos IgG de sueros de individuos infectados por T. gondii
Para verificar que los antígenos quiméricos retienen la inmunorreactividad de los fragmentos de antígenos individuales usados para su construcción, sueros humanos que reaccionan de manera específica, en ensayos de ELISA, con fragmentos de antígenos individuales, se adsorbieron con diferentes combinaciones de antígenos individuales y después se ensayaron con proteínas quiméricas. Para este propósito, distintas combinaciones de los fragmentos de antígeno, expresados como productos de fusión de GST, se recubrieron sobre placas de multipocillos Maxisorb (Nunc) a una concentración de 10 mg/ml en tampón de recubrimiento (50 mM NaHCO_{3}, pH 9,6) y después se incubaron durante toda una noche a 4ºC. Las placas se lavaron de manera abundante y posteriormente se incubaron durante 30 min. a 37ºC con muestras de suero (20 ml/pocillo) en solución de bloqueo (5% de leche en polvo no grasa, 0,05% de Tween-20 en PBS). Se recuperaron los sueros sin anticuerpo específicos de los fragmentos de cada pocillo, se añadieron a un nuevo pocillo, se incubaron durante 30 min., y se repitió el mismo procedimiento 6 veces más. Las muestras que no tenían anticuerpos específicos contra fragmentos individuales o múltiples de antígeno se analizaron finalmente mediante ensayos de ELISA sobre los antígenos quiméricos. Para este propósito, los antígenos quiméricos EC2, EC3 y EC4, como productos de fusión de GST, se recubrieron durante toda una noche a 4ºC sobre placas multipocillos Maxisorb a una concentración de 5 \mug/ml. Las placas recubiertas se bloquearon y posteriormente se incubaron durante 1 h a 37ºC con los sueros humanos sin anticuerpos diluidos 1:100 en solución de bloqueo. Las placas se lavaron de manera abundante y anticuerpos conjugados a IgG anti-humana fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), se diluyeron 1:7500 en solución de bloqueo, se añadieron después a cada pocillo. Finalmente, el sustrato cromogénico p-nitrofenil fosfato (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) reveló la actividad enzimática. Se reseñaron los resultados como la diferencia entre la absorbancia a 405 y 620 nm, detectada mediante un lector automático de ELISA (Labsystem Multiskan, Finlandia). Para cada muestra el ensayo se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios.
Modificación bioquímica de antígenos quiméricos EC2 y EC3
Para analizar la inmunorreactividad de los antígenos quiméricos EC2 y EC3 con anticuerpos específicos anti-Toxoplasma IgM en sueros de pacientes, las proteínas recombinantes se modificaron químicamente mediante biotinilación. Para este propósito, la GST-EC2 y GST-EC3 purificadas, diluidas a una concentración de 1 mg/ml en PBS se incubaron en presencia de un exceso molar de cinco veces de sulfosuccinimidil-6-(biotin-amido)hexanoato (Sulfo-NHS-LC-Biotin de Pierce, Estados Unidos) durante 3 horas sobre hielo. Las proteínas se dializaron después durante toda una noche contra PBS para eliminar el exceso de reactivos de biotina que no han reaccionado e hidrolizados. Los niveles de incorporación de biotina en antígenos quiméricos se determinó mediante el uso de "EZ Biotin Quantitation Kit" (Pierce, Estados Unidos), que da como resultado 1.4 biotina/molécula para GST-EC2 y 1.3 biotina/molécula para GST-EC3. Los productos marcados con biotina se diluyeron finalmente a una concentración de 0,5 mg/ml y se almacenaron a -20ºC hasta uso.
Inmunorreactividad de los EC2 y EC3 marcados con biotina con anticuerpos IgM específicos de Toxoplasma: IgM Rec-ELISA
Para investigar la inmunorreactividad de antígenos recombinantes con inmunoglobulinas M específicas de Toxoplasma, se empleó un inmunoensayo de doble sándwich (IgM Rec-ELISA). Placas Maxisorb (Nunc, Estados Unidos) se recubrieron con anticuerpos antihumanos IgM (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) a una concentración de 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento (50 mM NaHCO_{3}, pH 9,6). Las placas se bloquearon con 3% de albúmina sérica bovina en PBS (solución de bloqueo) durante 1 h a 37ºC y posteriormente se incubaron durante 1 h a 37ºC con muestras de suero en solución de bloqueo. Las placas se lavaron y después se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con las proteínas de fusión GST marcadas con biotina, se diluyeron en solución de bloqueo. Después de lavarse de manera abundante las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con conjugado de peroxidasa de rábano picante- estreptavidina (Pierce, Estados Unidos) a una concentración de 1 \mug/ml in solución de bloqueo. Finalmente, se reveló la actividad enzimática incubando las placas durante 30 min. a temperatura ambiente con el sustrato tetrametilbenzidina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos). Los resultados se registraron como la diferencia entre la absorbancia a 450 y 620 nm, detectada mediante un lector automático de ELISA (Labsystem Multiskan, Finlandia). Para cada muestra el ensayo se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios.
Estabilidad térmica de los antígenos quiméricos marcados con biotina
Con el fin de determinar la estabilidad térmica de las GST-EC2 y GST-EC3 marcadas con biotina, se diluyeron los productos recombinantes a una concentración de 5 \mug/ml en el tampón comercial "Stabilzyme" (SurModics, Estados Unidos) y se almacenó a +4ºC hasta uso. Después de diferentes intervalos de tiempo (hasta 80 días), la inmunorreactividad de proteínas recombinantes en el análisis IgM Rec-ELISA se determinó y se compararon los resultados obtenidos mediante análisis de los productos correspondientes mantenidos congelados a -20ºC. El IgM Rec-ELISA se realizó como se ha descrito anteriormente, usando los antígenos GST-EC2 y GSTEC3 marcados con biotina a una concentración final de 500 ng/ml en solución de bloqueo (3% BSA en PBS) y sueros humanos diluidos 1:100 en solución de bloqueo. Para cada muestra el ensayo se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios. El valor de IDI50, calculado como el límite del día cuando el 50% de inmunorreactividad de IgM especifica de toxoplasma, fueron 189 días y 97 días para GST-EC2 y GST-EC3, respectivamente. Estos hallazgos claramente indican que los antígenos quiméricos de la invención son estables en soluciones diluidas durante un largo tiempo, que es un requisito fundamental para la utilidad comercial de un producto recombinante.
Evaluación expandida de IgM Rec-ELISA
Los antígenos quiméricos de GST-EC2 y GST-EC3 marcados con biotina se ensayaron con anticuerpos IgM en sueros de individuos infectados con T. gondii y los resultados del IgM Rec-ELISA se compararon con los ensayos comerciales que emplean antígeno lisado, de células enteras de Toxoplasma (sistema VIDAS de bioMerieux, Francia; ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS de DiaSorin, Italia). Para este propósito, se ensayaron muestras de suero de mujeres que adquirieron toxoplasmosis primaria durante la gestación y referidos post-natal se les hizo un seguimiento en el Centro para Infección de la Región de Campania, Italia. Los ensayos bioMerieux VIDAS Toxo IgG e IgM se usaron para seleccionar tres grupos de muestras de suero para la evaluación del comportamiento de Toxoplasma IgM Rec-ELISA. Grupo A (n = 22) estaba compuesto de muestras negativas para IgM específica de T. gondii y anticuerpo como se mide por los ensayos VIDAS Toxo IgM y IgG. Grupo B (n = 18) estaba compuesto de muestras con un perfil serológico consistente con una infección crónica (presencia de anticuerpo de IgG específica de T. gondii y ausencia de IgM específica de T. gondii como se mide por los ensayos VIDAS Toxo IgM y IgG, respectivamente). Grupo C (n = 50) estaba compuesto de muestras con un perfil serológico consistente con una infección aguda (presencia de anticuerpos IgM y IgG específicos de T. gondii como se mide por los ensayos VIDAS Toxo IgM e IgG). IgM Rec ELISA se realizó como se ha descrito anteriormente y para cada muestra de suero el ensayo se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios.
La siguiente Tabla 5 muestra la reactividad de IgM de los antígenos quiméricos de GST-EC2 y GST-EC3 marcados con biotina, comparada con los resultados obtenidos con ensayos comerciales (VIDAS y ETI-TOXO-K), mediante el uso de sueros del grupo A (A1-A22), grupo B (B1-B18) y grupo C (C1-C50). Los niveels específicos de IgG específicos de Toxoplasma-specific, calculados como Unidades Internacionales (IU) también se reseñan. Para cada producto de fusión de GST se determine el corte como la media más dos veces la desviación estandar de las lecturas de absorbancia obtenidas de los sueros negativos de IgM específicos T. gondii (grupos A y B, n = 40). Los valores de corte para VIDAS IgM, ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS, GST-EC2 y GST-EC3 eran 0,650, 0,500, 0,343 y 0,378, respectivamente. Los valores en negrita indican una respuesta positiva.
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TABLA 5
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11
12
La siguiente Tabla 6 muestra las características de comportamiento de los ensayos comerciales (VIDAS IgM y ETITOXOK-M Reverse PLUS), comparadas con los resultados obtenidos con antígenos quiméricos EC2 y EC3 marcados con biotina (IgM Rec-ELISA). De la Tabla 6 se observa claramente que tanto los valores de especificidad como positivos de los ensayos (véase la 3ª columna que indica la aparición de falsos positivos) alcanzaron el máximo de (100%) cuando se usan los antígenos quiméricos de la invención. Con referencia a la sensibilidad de y conformidad, tanto el ensayo comercial ETI-TOXOK-M que emplea antígeno lisado, de células enteras de Toxoplasma como IgM rec-ELISA con el antígeno quimérico EC2 muestran características de comportamiento idénticas, con ambos valores muy cerca del 100%.
TABLA 6
13
Finalmente, se investigó la inmunorreactividad de los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 marcados con biotina con anticuerpos IgM en sueros de niños con toxoplasmosis congénita. En un estudio retrospectivo, se analizaron sueros de 30 niños de madres con infección primaria por infección por T. gondii durante el embarazo. Veinte niños tenían toxoplasmosis congénita y diez estaban infectados como se demuestra por la persistencia o desaparición de anticuerpos de IgG específicos de Toxoplasma después de 12 meses de edad, respectivamente. Dentro de la cohorte de pacientes infectados, la edad de gestación en el tiempo de infección maternal fue en el segundó trimestre en 6 madres y el tercer trimestre en 14 madres. 30 muestras de suero de niños infectados y no infectados se analizaron mediante IgM Rec-ELISA, y se compararon los resultados obtenidos con ensayos comerciales que emplean el antígeno Toxoplasma de células enteras (ELFA-IgM y ETI-TOXOK-M Reverse PLUS). Los niveles específicos de anti-Toxoplasma IgG variaban entre 28 y 1147 IU/ml para los sueros infectados de niños y entre 19 y 170 IU/ml para sueros de sujetos no infectados. Para cada producto de fusión GST el valor de corte se determinó como la media más 2SD de las lecturas de absorbancia obtenidas con sueros de niños no infectados. En la Tabla 7 se resumen los resultados de IgM Rec-ELISAs con sueros individuales de niños infectados. Sobre todo, el número de sueros reactivos a IgM- variaban entre 70% (14/20) y 50%(10/20) usando los antígenos GST-EC2 y GST-EC3, respectivamente. Por el contrario, solamente 7 de 20 niños infectados (35%) tenían resultados positivos cuando se emplearon ensayos ELFA-IgM o ETI-TOXOK-M. Entre los niños infectados, ninguno de los sueros reconocieron los antígenos GST-EC2 y GST-EC3 en el IgM Rec-ELISA o resultó que era positivo usando los ensayos comerciales.
En conclusión, estos resultados demuestran que el uso de antígenos quiméricos recombinantes es eficaz en la distinción de individuos infectados con T. gondii de los no infectados, que tienen comportamiento comparable o incluso mejor con respecto al uso de antígeno de aquiozita de células enteras, y podría proporcionar la base pata los inmunoensayos para la serodiagnosis de toxoplasmosis.
TABLA 7 Reactividad de IgM específica de Toxoplasma de muestras de suero de 30 niños nacidos de madres con infección por T.gondii adquirida durante el embarazo ^{a}
14
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Notas a la Tabla 7
^{a} Muestras de suero de niños infectados (T1-T20) o no infectados (N1-N10) por T.gondii se analizaron mediante IgM Rec-ELISA con antígenos GST-EC2 y GST-EC3 o mediante ensayos comerciales (ELFA-IgM y ETI-TOXO-M).
^{b} Gravedad de la aparición clínica: S. grave; B. benigno; Sub. subclínico.
^{c} Los valores de corte para los ensayos ELFA-IgM y ETI-TOXO-M eran 0,65 y 0,41 como se indica por los fabricantes.
Respectivamente. Letra negrita, valores > corte.
^{d} Los valores de corte para el IgM Rec-ELISA usando antígenos GST-EC2 y GST-EC3 eran 0,25 y 0,26. Respectivamente. Letra negrita, valores > corte.
<110> Kenton s.r.l.
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<120> Antígenos recombinantes quiméricos de Toxoplasma gondii 
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<130> 501-EP
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<160> 42
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 297
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<212> ADN
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<213> Toxoplasma gondii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(297)
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<400> 1
16 
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<210> 2
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<211> 99
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<212> PRT
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<213> Toxoplasma gondii 
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<400> 2
17 
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<210> 3
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<211> 231
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<212> ADN
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<213> Toxoplasma gondii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(231)
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<400> 3
18 
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<210> 4
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<211> 77
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<212> PRT
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<213> Toxoplasma gondii 
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<400> 4
20 
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<210> 5
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<211> 219
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<212> ADN
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<213> Toxoplasma gondii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(219)
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<400> 5
21 
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<210> 6
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<211> 73
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<212> PRT
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<213> Toxoplasma gondii 
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<400> 6
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22 
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<210> 7
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<211> 393
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<212> ADN
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<213> Toxoplasma gondii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(393)
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<400> 7
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23 
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<210> 8
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<211> 131
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<212> PRT
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<213> Toxoplasma gondii 
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 237
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<212> ADN
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<213> Toxoplasma gondii 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(237)
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 678
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(678)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K551
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggactagtcg gctcccccag gatgcc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K553
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catccagtcc tgctaccgcc accagaccag acgccacatc cagc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K552
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggcgtctg gtctggtggc ggtagcagga ctggatgtca tgcc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K555
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgacgaccga gctaccgcca ccagagttat cgcatttgca ggatg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K554
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcgataac tctggtggcg gtagctcggt cgtcaataat gtcgc 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 556
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcggccgc tagccgattt tgctgaccct g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K563
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggactagtcg gctggctgcc ttgggaggcc ttg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K565
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgcggtag cactaccgcc accagacaaa ccagggcgat ctgtg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K564
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccctggttt gtctggtggc ggtagtgcta ccgcggccac cgcg 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K567
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggttcgtt actaccgcca ccagagaaat gaacttcttc ttgttc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K566
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagttcatt tctctggtgg cggtagtaac gaaccggtgg ccctag 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K568
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcggccgc agattcagac tcagacggac 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K572
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgttactacc gccaccagag ttatcgcatt tgcaggatga 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador K571
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taactctggt ggcggtagta acgaaccggt ggccctagc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 894
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(894)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
32
34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
35
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1257)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
37
38
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
40
41
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1182)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
43
44
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EC4
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
46
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gongii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
50 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
51 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
52 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
53 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
54 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
55 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
56
57 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Toxoplasma gondii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
58

Claims (27)

1. Un antígeno quimérico recombinante que contiene la fusión de al menos tres regiones antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii, en el que las tres regiones antigénicas diferentes tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12.
2. El antígeno quimérico of reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
3. El antígeno quimérico de acuerdo con reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
4. El antígeno quimérico de acuerdo con reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
5. Una secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
6. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende al menos tres secuencias diferentes de nucleótidos seleccionadas entre el grupo constituido por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11.
7. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27.
8. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29.
9. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31.
10. Una secuencia de nucleótidos que se hibrida con cualquier secuencia de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 9 en condiciones de hibridación rigurosas.
11. El antígeno quimérico recombinante codificado por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 10.
12. La secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones de 5 y 10, que es una secuencia de ADN.
13. Un vector que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 12.
14. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 13.
15. Un procedimiento para la producción del antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 y 4 u 11, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 14 y aislamiento del producto deseado.
16. Uso de antígenos quiméricos de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 y 4 u 11 como agentes activos para la diagnosis in vitro de infecciones por Toxoplasma gondii.
17. Uso de acuerdo con reivindicación 16 para la diagnosis de toxoplasmosis congénita en niños.
18. Uso de acuerdo con reivindicación 16 para la diagnosis del tiempo de infección.
19. Kits para la diagnosis de infección por Toxoplasma gondii, que contiene al menos un antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11.
20. Kits para la diagnosis de una infección aguda y/o crónica por Toxoplasma gondii que contiene al menos un antígeno quimérico de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11.
21. Antígenos quiméricos de acuerdo con cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11 para uso como medicamentos.
22. Uso de antígenos quiméricos de cualquier reivindicación de 1 a 4 u 11 como ingredientes activos para la preparación de medicamentos para la prevención o tratamiento de infecciones por Toxoplasma gondii.
23. La secuencia de nucleótidos de cualquier reivindicación de 5 a 10 para uso como medicamentos.
24. Uso de la secuencia de nucleótidos de cualquier reivindicación de 5 a 10 para la preparación de medicamentos útiles para el tratamiento o prevención de infecciones por Toxoplasma gondii.
25. Composición farmacéutica, en particular en la forma de una vacuna, que contiene al menos un antígeno quimérico para cualquier reivindicación 1 a 4 u 11.
26. Composición farmacéutica, en particular en la forma de una vacuna, que contiene al menos una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquier reivindicación de 5 a 10.
27. Composición de acuerdo con reivindicación 25 ó 26 adecuada para uso humano y/o veterinario.
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