ES2343571T3 - Glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (gfat) que comprende una etiqueta de purificacion interna, y su utilizacion para el cribado de compuestos. - Google Patents
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Abstract
Proteína que posee una actividad GFAT que comprende: una secuencia de GFAT y por lo menos una secuencia de una etiqueta de purificación, siendo la secuencia de la etiqueta de purificación insertada entre dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos comprendidos en: - una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de Escherichia coli, o - una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de Escherichia coli.
Description
Glutamina:fructosa-6-fosfato
amidotransferasa (GFAT) que comprende una etiqueta de purificación
interna, y su utilización para el cribado de compuestos.
La presente invención se refiere a una
glutamina:fructosa-6-fosfato
aminotransferasa modificada, purificable rápidamente y en
cantidades suficientes para el cribado de compuestos que modifican
su actividad.
Las
glutamina:fructosa-6-fosfato
aminotransferasas (GFAT), EC 2.6.1.16, denominadas asimismo
glucosamina-6-fosfato sintasas o
2-desoxi-glucosa-6-fosfato
cetol isomerasas, están implicadas en la vía de biosíntesis de las
hexosaminas. La GFAT cataliza la primera etapa, limitante, de esta
vía de biosíntesis según la reacción:
- L-glutamina + fructosa-6-fosfato \rightarrow L-glutamato + glucosamina-6-fosfato mediante transferencia del nitrógeno amídico de la L-glutamina sobre la función cetona del fructosa-6-fosfato. Las GFAT controlan por lo tanto el flujo de glucosa en la vía de las hexosaminas, a través del fructosa-6-fosfato, y por consiguiente la formación de las hexosaminas producidas.
Una forma bacteriana recombinante de la GFAT, la
glucosamina-6-fosfato sintasa de
Escherichia coli, ha sido purificada hasta homogeneidad y
estudiada de manera exhaustiva. Las propiedades y el mecanismo
enzimático de la transferencia de la amida han sido en particular
ampliamente descritas (para revisión Teplyakov et al., Nat.
Prod. Rep. (2002) 19:60). En particular, esta enzima, cuya
estructura cristalina ha sido resuelta (Teplyakov et al., J.
Mol. Biol. (2001) 313:1093), está formada por dos dominios, uno que
tiene una actividad hidrolasa (glutaminasa) y el otro una actividad
isomerasa.
Por otro lado, se han secuenciado unas GFAT de
eucariotas, incluyendo en particular la de hígado de rata (Huynh
et al., Arch. Biochem. Biophys. (2000) 379:307) y la de la
levadura Candida albicans (Milewsky et al., J. Biol.
Chem. (1999) 274:4000).
En el ser humano, unos estudios preliminares han
mostrado la presencia de una actividad GFAT en el hígado (Ghosh
et al., J. Biol. Chem. (1960) 235:1265). A partir de entonces
se conocen varias GFAT. GFAT1, la forma principal, GFAT2, que se
expresa preferentemente en el sistema nervioso central, y GFAT1Alt,
una isoforma de GFAT1, expresada esencialmente en los músculos
estriados. Las secuencias peptídicas de GFAT1 y GFAT2 poseen 75% de
identidad de secuencias entre sí, y las de GFAT1 y GFAT1Alt son
idénticas salvo para una inserción de 18 aminoácidos en la secuencia
de GFAT1Alt. Las secuencias de GFAT están por lo tanto muy
conservadas en el ser humano, pero igualmente entre las especies,
puesto que las secuencias peptídicas de la GFAT1 humana y de la GFAT
de E. coli o de la GFAT1 de ratón presentan respectivamente
35% y 99% de identidad.
El gen de la GFAT1 humana ha sido clonado en
1992 (McKnight et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:25208).
Codifica una proteína de 77 kDa formada por dos dominios distintos
(Teplyakov et al., Nat. Prod. Rep. (2002) 19:60).
El aumento de la producción de
UDP-NAc-GIcNH_{2}, el producto
final de la vía de biosíntesis de las hexosaminas, y su acumulación
en los tejidos han estado recientemente implicados en el desarrollo
de la resistencia a la insulina (Marshall et al., FASEB J.
(1991) 5:3031, Yki-Jarvinen et al., Diabetes
(1996) 45:302, Thompson et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:
7759, Hawkins et al., J. Clin. Invest. (1997) 99:2173,
Robinson et al., Diabetes (1993) 42:1333, Daniels et
al., J. Clin. Invest. (1995) 96:1235, Baron et al., J.
Clin. Invest. (1995) 96:2792).
Así, se ha mostrado que un aumento del nivel
celular de UDP-NAc-GIcNH_{2}
mediante una modesta sobreexpresión de GFAT1, o una aportación de
glucosamina exógena, puede inducir una resistencia a la insulina al
mismo tiempo in vivo y en unos adipocitos en cultivo
(Robinson et al., Diabetes (1993) 42:1333, Daniels et
al., J. Clin. Invest. (1995) 96:1235, Baron et al., J.
Clin. Invest. (1995) 96:2792, Hebert et al., J. Clin. Invest.
(1996) 98:930).
En efecto, la insulina activa su vía de
transducción fijándose a su receptor, lo que induce la translocación
de los vehículos de glucosa, tales como el receptor GLUT4,
almacenados en la célula, hacia la membrana, y aumenta el aflujo de
glucosa. La glucosa entra así en la vía de la glicolisis y se
convierte en glucosa-6-fosfato y
después en fructosa-6-fosfato.
Cuando el aflujo de glucosa es excesivo, el
fructosa-6-fosfato entra en la vía
de biosíntesis de las hexosaminas y se convierte en
glucosamina-6-fosfato por la GFAT.
Varias observaciones indican que los metabolitos del
glucosamina-6-fosfato impiden la
translocación de los receptores a la glucosa hacia la membrana
celular, disminuyendo así el aflujo de la glucosa celular (Marshall
et al., FASEB J. (1991) 5:3031, Giacarri et al.,
Diabetologia (1995) 38:518, Marshall et al., J. Biol. Chem.
(1991) 266:4706, Paterson et al., Endocrinology (1995)
136:2809).
El mecanismo mediante el cual los metabolitos
del glucosamina-6-fosfato ejercen
sus efectos fisiológicos no está claro. Se ha propuesto sin embargo
una hipótesis: una concentración citosólica elevada de
UDP-NAc-GIcNH_{2} provocaría la
hiperglicosilación de los sitios de fosforilación Ser o Thr,
conduciendo de esta manera a la detención de la vía de señalización
de la insulina (Comer et al., J Biol. Chem (2000)
275:29179).
La actividad GFAT se considera por lo tanto como
una de las causas de los altos niveles de glucosa en sangre; por
otro lado, se conoce por ser elevada en los pacientes que padecen
diabetes azucarada
no-insulino-dependiente o diabetes
de tipo II (Yki-Jarvinen et al., Diabetes
(1996) 45:302).
La obtención de inhibidores de la GFAT
permitiría reducir la glicemia en particular en los individuos que
padecen patologías relacionadas con una hiperglicemia, tales como la
diabetes de tipo II, la acidosis y/o la cetosis diabética, por
ejemplo.
Unos inhibidores de la GFAT de planta o de hongo
podrían asimismo permitir obtener respectivamente unos fungicidas y
unos herbicidas.
Sin embargo, a pesar de la obtención de formas
recombinantes de GFAT, la inestabilidad de las preparaciones
enzimáticas obtenidas, su baja cantidad, y su nivel de purificación
insuficiente, no han permitido obtener unos inhibidores eficaces de
GFAT.
Un objetivo de la invención es por lo tanto
proporcionar una GFAT modificada cuya actividad es estable y que se
puede obtener en gran cantidad, con un alto nivel de pureza y de
actividad.
La presente invención se refiere a una proteína
enzimáticamente activa que comprende:
- -
- una secuencia de GFAT y por lo menos una secuencia de una etiqueta de purificación, siendo la secuencia de la etiqueta de purificación insertada entre dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de GFAT,
- estando dichos aminoácidos comprendidos en:
- \bullet
- una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de Escherichia coli, o
- \bullet
- una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de Escherichia coli, o
- -
- una secuencia que se deriva de la secuencia anterior por supresión, inserción o mutación de por lo menos un aminoácido, con la condición de que dicha proteína presente una actividad enzimática, o
- -
- una secuencia que presenta por lo menos 35%, en particular por lo menos 90%, de identidad de secuencia y/o por lo menos 44%, en particular por lo menos 95%, de similitud de las secuencias con una de las secuencias anteriores, con la condición de que dicha proteína presente una actividad enzimática.
Se designa por el término GFAT una enzima de la
clase E.C. 2.6.1.16 que cataliza la reacción siguiente:
- L-glutamina + fructosa-6-fosfato \rightarrow L-glutamato + glucosamina-6-fosfato en particular en las condiciones experimentales tales como las descritas en el ejemplo siguiente o en Broschat et al., J. Biol. Chem. (2002) 277:14764.
GFAT se designa con el nombre de
glutamina:fructosa-6-fosfato
aminotransferasa, o también
glucosamina-6-fosfato sintasa o
2-desoxi-glucosa-6-fosfato
cetol isomerasa.
Mediante la expresión "proteína
enzimáticamente activa" se designa una proteína que tiene una
acción catalítica.
Ventajosamente, la proteína enzimáticamente
activa posee una actividad GFAT.
Mediante la expresión "etiqueta de
purificación" se designa una secuencia peptídica susceptible de
unirse específicamente a un ligando determinado. Ventajosamente, la
unión de dicho ligando a la etiqueta de purificación permite formar
un complejo entre la proteína que contiene la etiqueta de
purificación y dicho ligando, pudiendo dicho complejo ser aislado
específicamente.
Ventajosamente, las etiquetas de purificación
según la invención no están dispuestas en final de cadena peptídica,
en el extremo N-terminal o
C-terminal, sino en el interior de la cadena
peptídica.
Mediante la expresión "identidad de
secuencia" se designa el porcentaje de aminoácidos idénticos
entre dos secuencias alineadas, en particular con la ayuda de
algoritmos tales como el definido por Altschul et al.,
Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389, por ejemplo.
Mediante la expresión "similitud de
secuencia" se designa el porcentaje de aminoácidos similares, es
decir, de aminoácidos cuyas cadenas laterales poseen unas
propiedades fisicoquímicas parecidas, entre dos secuencias
alineadas, en particular con la ayuda de algoritmos tales como el
definido por Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997)
25:3389, por ejemplo.
La presente invención se refiere en particular a
una proteína tal como se ha definido anteriormente, en la que la
secuencia de GFAT corresponde a una secuencia de GFAT de bacteria o
de eucariota, en particular de planta, de hongo o de animal, en
particular de insecto o de mamífero, más particularmente de ser
humano.
La invención se refiere más particularmente a
una proteína tal como se ha definido anteriormente, en la que la
secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre dos
aminoácidos consecutivos de la secuencia de GFAT, estando dichos
aminoácidos comprendidos en:
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende entre la hoja \beta2 y la hoja \beta3 de la GFAT de Escherichia coli, o
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende entre la hoja \beta13 y la hoja \beta14 de la GFAT de Escherichia coli.
La estructura de la GFAT de Escherichia
coli está descrita en particular por Teplyakov et al., J.
Mol. Biol. (2001) 313:1093 (proteína entera), por lsupov et
al., Structure (1996) 4:801 (dominio glutaminasa) y por
Teplyakov et al. Structure (1998) 6:1047 (dominio isomerasa).
La estructura de la proteína completa se puede consultar en
particular con la ayuda del fichero de coordenadas atómicas 1JXA
depositado en Protein Data Bank (http://www.pdb.org).
La secuencia peptídica de la GFAT de E.
coli se define mediante la SEC ID nº 13.
La secuencia que se extiende entre la hoja
\beta2 y la hoja \beta3 corresponde a la secuencia que se
extiende aproximadamente entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de
E. coli, situados en el dominio glutaminasa.
La secuencia que se extiende entre la hoja
\beta13 y la hoja \beta14 corresponde a la secuencia que se
extiende aproximadamente entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT
de E. coli, situados en el dominio glutaminasa.
Según un modo de realización particular, la
invención se refiere por lo tanto a una proteína tal como se ha
definido anteriormente, en la que la secuencia de la etiqueta de
purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos de la
secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos comprendidos en:
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende aproximadamente entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de Escherichia coli, o
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende aproximadamente entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de Escherichia coli,
La identificación de las partes de secuencias de
una GFAT que corresponde y/o que es homóloga a unas estructuras
secundarias de la GFAT de E. coli se puede obtener alineando
la secuencia de dicha GFAT con la de la GFAT de E. coli, en
particular con la ayuda de un algoritmo tal como el definido por
Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389 o con la
ayuda del programa Clustal W, bien conocido por el experto en la
técnica y descrito por Thompson et al., Nucleic Acids Res.
(1994) 22 4673-4680, por ejemplo.
En particular, dos secuencias o partes de
secuencias se denominan homólogas si el porcentaje de identidad
entre estas dos secuencias o partes de secuencias es superior a
aproximadamente 35%, y/o si el porcentaje de identidad entre estas
dos secuencias o partes de secuencias es superior a aproximadamente
44%.
Más particularmente, dos secuencias o partes de
secuencias se denominan homólogas si son susceptibles de hibridarse
en unas condiciones astringentes, tales como las condiciones
siguientes: formamida 50%, NaCl 0,75 mol/1, citrato de sodio 0,75
mmol/1, dodecilsulfato de sodio 1%, pH 7, 42ºC.
Según otro modo de realización preferido, la
invención se refiere a una proteína tal como se ha definido
anteriormente, en la que la secuencia de la etiqueta de
purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos de la
secuencia de una GFAT humana, estando dichos aminoácidos
comprendidos entre los aminoácidos 40 a 50 y/o 290 a 330, de dicha
secuencia de GFAT humana.
Los aminoácidos 40 a 50 de dicha secuencia de
GFAT humana corresponden y/o son homólogos a la parte de la
secuencia de la GFAT de E. coli que se extiende entre la hoja
\beta2 y la hoja \beta3, es decir, la secuencia que se extiende
aproximadamente entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de E.
coli.
Los aminoácidos 290 a 330 de dicha secuencia de
GFAT humana corresponden y/o son homólogos a la parte de la
secuencia de la GFAT de E. coli que se extiende entre la hoja
\beta13 y la hoja \beta14, es decir, la secuencia que se
extiende aproximadamente entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT
de E. coli.
La invención se refiere en particular a una de
las proteínas anteriores, en la que la secuencia de GFAT corresponde
a:
- -
- SEC ID nº 2, que corresponde a la secuencia de la GFAT1 humana,
- -
- SEC ID nº 4, que corresponde a la secuencia de la GFAT2 humana,
- -
- SEC ID nº 6, que corresponde a la secuencia de la GFAT1Alt humana.
La secuencia de la GFAT1 humana se describe en
particular en McKnight et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:
25208, y corresponde a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 1.
La secuencia de la GFAT2 humana se describe en
particular en Oki et al., Genomics (1999) 57:227, y
corresponde a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 3.
La secuencia de la GFAT1Alt humana se describe
en particular en DeHaven et al., Diabetes (2001) 50:2419, y
corresponde a la secuencia nucleotídica SEC ID nº 5.
La invención se refiere en particular a una de
las proteínas anteriores, en la que la secuencia de la etiqueta de
purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos, estando
dichos aminoácidos comprendidos entre los aminoácidos:
- -
- 43 a 47 y/o 298 a 306, de SEC ID nº 2,
- -
- 42 a 45 y/o 299 a 307, de SEC ID nº 4,
- -
- 42 a 45 y/o 299 a 307, de SEC ID nº 4,
- -
- 43 a 47 y/o 316 a 324, de SEC ID nº 6,
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos 43 a 47 de SEC ID nº 2, 42 a 45
de SEC ID nº 4 y 43 a 47 de SEC ID nº 6 corresponden, a saber son
homólogos, a la parte de la secuencia de la GFAT de E. coli
que se extiende entre la hoja \beta2 y la hoja \beta3, es decir,
a la secuencia que se extiende aproximadamente entre los aminoácidos
30 a 80 de la GFAT de E. coli.
Los aminoácidos 298 a 306 de SEC ID nº 2, 299 a
307 de SEC ID nº 4 y 325 a 330 de SEC ID nº 6 corresponden, a saber
son homólogos, a la parte de la secuencia de la GFAT de E.
coli que se extiende entre la hoja \beta13 y la hoja
\beta14, es decir, a la secuencia que se extiende aproximadamente
entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de E. coli.
Según otro modo de realización particular, la
invención se refiere más particularmente a una proteína tal como se
ha definido anteriormente, en la que la secuencia de la etiqueta de
purificación se inserta entre dos aminoácidos consecutivos de la
secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos comprendidos en:
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende aproximadamente entre los aminoácidos 43 a 47 de la GFAT1 humana,
- -
- una parte de la secuencia de la GFAT que corresponde y/o que es homóloga a la secuencia que se extiende aproximadamente entre los aminoácidos 298 a 306, en particular 299 a 300, de la GFAT1 humana,
La invención se refiere más particularmente a
una de las proteínas anteriores, en la que la secuencia de la
etiqueta de purificación se inserta entre los aminoácidos:
- -
- 299 y 300 de SEC ID nº 2,
- -
- 300 y 301 de SEC ID nº 4,
- -
- 317 y 318 de SEC ID nº 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere en particular a una de
las proteínas anteriores, en la que la etiqueta de purificación
corresponde a una secuencia de aproximadamente 2 a aproximadamente
10 aminoácidos, en particular de aproximadamente 4 a aproximadamente
8 aminoácidos.
Unas etiquetas de purificación preferidas según
la invención se refieren en particular a unas etiquetas denominadas
FLAG (Sigma-Aldrich, Francia). Estas etiquetas se
unen específicamente a un paratope determinado, pudiendo dicho
paratope pertenecer a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo
por ejemplo. Un ejemplo particular de etiqueta FLAG está
constituido por la secuencia peptídica
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEC ID nº 18), por ejemplo.
Otras etiquetas preferidas según la invención
son unas etiquetas formadas por varias histidinas. Estas etiquetas
pueden formar unos complejos con unos cationes metálicos divalentes
tales como Ni^{2+} o Co^{2+} por ejemplo.
La invención se refiere en particular a una
proteína tal como se ha definido anteriormente, en la que la
etiqueta de purificación es una hexa-histidina.
Se designa por el término
"hexa-histidina" la secuencia
His-His-His-His-His-His
(SEC ID nº 19).
La invención se refiere más particularmente a
una proteína tal como se ha definido anteriormente, que corresponde
a las secuencias:
- -
- SEC ID nº 8, que corresponde a las secuencia SEC ID nº 2 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 299 y 300,
- -
- SEQ ID nº 10, que corresponde a la secuencia SEC ID nº 4 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 300 y 301, y
- -
- SEQ ID nº 12, que corresponde a la secuencia SEC ID nº 6 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 317 y 318.
La presente invención se refiere asimismo a un
ácido nucleico que comprende o que está constituido por una
secuencia que codifica para una proteína tal como se ha definido
anteriormente.
La invención se refiere más particularmente a un
ácido nucleico que comprende o que está constituido por la
secuencia nucleotídica:
- -
- SEC ID nº 7 que codifica para la proteína SEC ID nº 8, o
- -
- SEC ID nº 9 que codifica para la proteína SEC ID nº 10, o
- -
- SEC ID nº 11 que codifica para la proteína SEC ID nº 12,
o por su complementario, o que se
deriva de dicha secuencia por mutación, inserción o deleción de por
lo menos un nucleótido, con la condición de que dicha secuencia
nucleotídica codifique para una proteína enzimáticamente
activa.
Según otro modo de realización, la presente
invención se refiere asimismo a un vector eucariota o procariota que
comprende un ácido nucleico tal como se ha definido
anteriormente.
Estos vectores permiten en particular sintetizar
las proteínas según la invención en un organismo eucariota o
procariota.
Ventajosamente, la invención se refiere a un
vector de expresión de tipo baculovirus que permite la síntesis de
las proteínas según la invención en unas células de insecto.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de purificación de una proteína tal como se ha
definido anteriormente, a partir de una disolución que comprende
dicha proteína, que comprende una etapa de puesta en presencia de
dicha disolución con un compuesto que se une específicamente a la
etiqueta de purificación de dicha proteína, y una etapa de
separación del complejo formado por la unión de dicha proteína a
dicho compuesto de los demás constituyentes de la disolución.
El compuesto puede ser fijado sobre un soporte
sólido de manera que el complejo formado entre dicho compuesto y
dicha proteína pueda ser recuperado mediante centrifugación o
mediante filtración. Opcionalmente, dicho compuesto fijado sobre su
soporte puede ser dispuesto en una columna a través de la cual se
eluye dicha disolución.
Ventajosamente, el procedimiento anterior puede
comprender asimismo una etapa de disociación del complejo formado
por la unión de dicha proteína a dicho compuesto con el fin de
recuperar la proteína purificada.
La invención se refiere más particularmente a un
procedimiento de purificación tal como se ha definido anteriormente,
que comprende una etapa de puesta en presencia de una disolución que
comprende una proteína tal como se ha definido anteriormente con un
compuesto que comprende un catión metálico divalente seleccionado de
entre el Ni^{2+} o el Co^{2+}, en particular el Ni^{2+}, y una
etapa de separación del complejo formado por la unión de la proteína
a dicho compuesto de los demás constituyentes de la disolución.
Ventajosamente, el procedimiento anterior puede
comprender asimismo una etapa de disociación del complejo formado
por la unión de dicha proteína a dicho compuesto que comprende un
catión metálico divalente, en particular con la ayuda de imidazol,
con el fin de recuperar la proteína purificada.
Según otro modo de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento de conservación de una
proteína tal como se ha definido anteriormente, en una forma
enzimáticamente activa, en particular a -80ºC o a 4ºC, que comprende
la adición de dicha proteína a una disolución que comprende:
- -
- aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM de fructosa-6-fosfato, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de glicerol, en particular aproximadamente 10%.
El
fructosa-6-fosfato es un sustrato de
dicha proteína.
La
tris(2-carboxietil)fosfina es un
compuesto reductor que permite ventajosamente mantener las
propiedades de resinas que contienen unos iones Ni^{2+} o
Co^{2+}.
Ventajosamente, el glicerol es un agente
crioprotector.
A este respecto, la presente invención se
refiere asimismo a una composición que comprende una proteína GFAT
activa unida a una etiqueta de purificación tal como una proteína
tal como se ha definido anteriormente, siendo dicha proteína
susceptible de poder ser conservada en una forma enzimáticamente
activa, durante por lo menos 8 días a una temperatura de 2ºC a
10ºC, en particular aproximadamente 4ºC, y durante por lo menos 12
meses a una temperatura de -100ºC a -20ºC, en particular
aproximadamente -80ºC, estando dicha proteína en asociación
con:
- -
- aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM de fructosa-6-fosfato, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de glicerol, en particular de aproximadamente 10%.
La presente invención se refiere asimismo a la
utilización de una proteína tal como se ha definido anteriormente,
para el cribado de compuestos que modifican la actividad de dicha
proteína, en particular para el cribado de inhibidor de dicha
proteína.
La actividad de las proteínas según la invención
se puede medir en particular con la ayuda de los métodos
siguientes:
- -
- el método radiométrico descrito por Broschat et al., Analytical Biochem. (2002) 305:10-15,
- -
- el método denominado con Nitro Bleu Tétrazolium descrito por Nakata et al., J. Antibio. (2001) 54:737-743.
- -
- el método Morgan-Elson descrito por Ghosh et al., Method. Enzymol. (1960) 5:414 y detallado en el ejemplo siguiente.
- -
- el método APAD descrito por Badet et al., Biochemistry (1987) 26:1940 y detallado en el ejemplo siguiente.
Ventajosamente, estos métodos se pueden utilizar
para el cribado, en particular de alto caudal, de compuestos que
modifican la actividad de las proteínas según la invención.
La invención se refiere en particular a la
utilización tal como se ha definido anteriormente, para el cribado
de compuestos útiles en el marco del tratamiento o de la prevención
de la diabetes, en particular de la diabetes de tipo II, de la
obesidad, de la acidosis, de la cetosis, de la artritis, de los
cánceres o de la osteoporosis.
La figura 1 representa el plásmido
pFastBac-gfat-His6 de peso molecular
6,89 kb. El casete "Ampr" representa un gen de resistencia a
la ampicilina, el casete "ori" representa un origen de
replicación bacteriana, el casete "Gmr" representa un gen de
resistencia a la gentamicina, el casete "Polh Pr" representa el
promotor de la polihedrina, el casete gfat-his6
representa el gen gfat1 modificado mediante la inserción de una
secuencia que codifica para una etiqueta hexahistidina. Están
representados asimismo los sitios de restricción XbaI en
posición 4,11 kb, y EcoRI en posiciones 4,56 kb y 6,60
kb.
El fragmento EcoRI de un ADNc que
corresponde al gen gfat1 humano ha sido clonado en el sitio
EcoRI I del vector pCRII (Invitrogen) para formar el
plásmido pCRII-gfat1. La secuencia nucleotídica de
una etiqueta de purificación interna compuesta por 6 restos de
histidina ha sido introducida en la posición 898 de la secuencia
del gen gfat1 clonado en pCRII mediante PCR con la
platinum pfx polymerase (Roche) y el par de cebadores
apropiados:
- -
- Start Aat II-His6:
- 5'TGGACGTCTTTCTATCCATCGAATTAAACGAACTGCAGGACATCACCATCACCATCACGATCACCCCGGACG3' (SEC ID nº 14)
- -
- End Hinc Il:
- 5'CAAAGTTGACTCTTCCTCTCATTGTGTTCACGACAGACTCTGGC3' (SEC ID nº 15)
según el protocolo siguiente: 94ºC, durante 2
min. y después 30 ciclos (94ºC durante 45 s, 55ºC durante 1 min.,
72ºC durante 5 min.) seguidos de una polimerización de 5 min. a 72ºC
y vuelta a 4ºC.
Después de la digestión por AatII y
HincII y después purificación sobre gel de agarosa Seaplaque
1,5% (Tebu), el amplicón (170 pb) ha sido insertado a nivel de los
sitios de restricción correspondientes en la construcción
pCRII-gfat1. El inserto de 170 pb ha sido
introducido mediante ligación en la construcción con una relación
3:1 a 16ºC durante la noche en presencia de T4 DNA ligase (Nebs). La
mezcla de ligación (20 \mul) así obtenida ha permitido
transformar una cepa de E. coli JM109. A continuación, el
fragmento XbaI-HindII del plásmido recombinante
pCRII-gfat1-His6 ha sido clonado en
el plásmido donante pFastBac1 (Life Technologies Ltd). El plásmido
pFastBac-gfat-His6 así generado
(figura 1) ha sido verificado mediante múltiples digestiones:
SmaI, AccI/DraI, PstEI/XbaI, y
mediante secuenciación. Con vistas a mejorar la construcción, la
secuencia corriente arriba del codón de partida ha sido mutada sobre
dos posiciones mediante PCR, con el par de cebadores siguiente, con
el fin de retirar dos fases de lectura abiertas corriente arriba del
gen gfat1:
- -
- Start Xbal
- 5'AATCTAGATTCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATTGATATC3' (SEC ID nº 16)
- -
- End Afel
- 5'ATTTTTATCAGAGCGCTGGGGGTGGCTATTGACAGG3' (SEC ID nº 17)
según el protocolo: 94ºC durante 2 min., después
30 ciclos (94ºC durante 15 s, 55ºC durante 30 s, 68ºC durante 1
min.) seguidos de una polimerización de 1 min. a 68ºC y vuelta a
4ºC.
El fragmento de PCR obtenido, que contiene las
dos mutaciones, ha sido purificado sobre gel Seaplaque (Tebu) a
0,7%, y después digerido por XbaI y AfeI para
sustituir a su homólogo en
pFastBac-gfat-His6 con el fin de
proporcionar el plásmido donante
pFastBac-gfat-His6-orf
que sirve para la transposición en las células DH10Bac (Life
Technologies Ltd). La construcción ha sido verificada mediante
digestiones SmaI, XbaI/PstEI,
XbaI/HindIII, y mediante secuenciación.
Un bácmido recombinante ha sido aislado después
de la transposición en las células DH19Bac y utilizado para
transfectar unas células de insecto Sf9 en presencia de Lipofectin
(Life Technologies Ltd). Los baculovirus obtenidos han sido
amplificados en las células Sf9 y el título vírico ha sido medido a
5.10^{7} pfu/ml.
Unas células de insectos Sf9 han sido cultivadas
a 28ºC en presencia de medio SF900II (Life Technologies Ltd) en
frascos de 5 l bajo agitación a 100 rpm. Las células con una
densidad de 2.10^{9} células/l han sido infectadas por el
baculovirus recombinante obtenido anteriormente con una
multiplicidad de infección de 2 (pfu/célula), y después cultivadas
durante 72 h.
Las células y el sobrenadante han sido separados
por centrifugación (2.500 g, 10 min a 4ºC). Los residuos celulares
se han lavado en presencia de tampón Tris-HCl 20 mM,
pH 7, centrifugado (4.000 g. 45 min a 4ºC) y congelado a -80ºC.
El residuo celular (20 g) ha sido recogido en 50
ml de tampón de lisis (NaPO_{4} 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM,
imidazol 10 mM, fructosa-6-fosfato
(fructosa-6P) 1 mM, TCEP
(Tris(2-carboxietil)fosfina) 1 mM,
PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), 10% de glicerol y 1
tableta de mezcla de inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche
Applied Sciences) y sometido a una trituración con DynoMill a 4.500
rpm. (4 ciclos durante 30 s) en presencia de 40 g de microbolas de
0,2 mm de diámetro. El conjunto ha sido enfriado mediante
circulación de etilenglicol/agua regulado a -15ºC. El extracto
bruto obtenido (100 ml, 445 mg de proteínas totales) ha sido
centrifugado a 4ºC durante 20 min. a 12.000 rpm. El sobrenadante ha
sido sometido a una ultracentrifugación a 4ºC (350.000 rpm, 1 h).
El sobrenadante así obtenido ha sido mezclado con 5 ml de matriz 50%
Ni-NTA (Qiagen) durante 2 h a 4ºC. La mezcla ha
sido vertida en una columna vacía y después aclarada con 40 ml de
tampón de lavado (NaPO_{4} 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 40
mM, fructosa-6P 1 mM, TCEP 1 mM, PMSF 1 mM y 1
tableta de mezcla de inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche
Applied Sciences). La elución ha sido realizada por etapas
sucesivas a 125 y 500 mM de imidazol en el mismo tampón que
anteriormente. Se han obtenido así 12 mg de
GFAT1-His6 funcional (dosificación proteica según el
método de Bradford).
La enzima se almacenó entonces en fracciones de
100 \mul en presencia de 1 mM de fructosa-6P, 1 mM
de TCEP y 10% de gliceril a -80ºC. La estabilidad de la enzima es
de varios meses a -80ºC y superior a 8 días a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han usado diferentes ensayos de dosificación
de la actividad enzimática de la GFAT1-His6. Estos
ensayos pueden ser utilizados asimismo con el fin de cribar unos
compuestos que modifican, y en particular que inhiben, la actividad
de la GFAT1-His6. Es posible adaptarlos fácilmente a
un cribado de alto caudal.
\vskip1.000000\baselineskip
En este caso, la actividad enzimática se sigue
mediante un ensayo colorimétrico cuyo principio es el siguiente: la
D-glucosamina-6P liberada por la
enzima es N-acetilada por el anhídrido acético en
medio alcalino (Ghosh et al., Method Enzymol. (1962) 5:414),
y después la disolución se trata mediante el agente reactivo de
Ehrlich
(para-dimetil-amino-benzaldehído,
PDAB) en medio ácido concentrado; el compuesto rosa formado absorbe
a 585 nm.
La reacción enzimática se desarrolla durante 30
minutos a 37ºC en presencia de:
- -
- 0,2 ml de fructosa-6P a 100 mM
- -
- 0,25 mM de L-glutamina a 60 mM
- -
- 0,25 ml de tampón KPO_{4} a 150 mM pH 7
- -
- 0,1 ml de EDTA (tetra-acetato de etilendiamina) a 25 mM, pH 7
- -
- hasta 200 \mul de muestra (a completar con H_{2}O si es necesario)
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción se detiene mediante inmersión
durante 4 minutos en un baño de agua a 100ºC y después se
centrifuga. Se extraen 0,8 ml del sobrenadante para la dosificación
de la glucosamina-6P según el protocolo
siguiente:
- -
- adición de 0,1 ml de NaHCO_{3} saturado,
- -
- adición de 0,1 ml de una disolución de anhídrido acético al 5% en agua preparada extemporáneamente,
- -
- agitación e incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente,
- -
- incubación durante 5 minutos en un baño a 100ºC,
- -
- adición de 0,2 ml de borato de potasio 0,8 M pH 9,1 (a ajustar con KOH 10 N),
- -
- agitación e incubación durante 7 minutos en un baño a 100ºC,
- -
- adición de 3 ml de agente reactivo de Ehrlich diluido 10 veces en ácido acético, preparado extemporáneamente, sobre la disolución enfriada en hielo,
- -
- incubación durante 20 minutos a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la GFAT ha sido determinada en
comparación con una curva patrón establecida utilizando la
D-glucosamina como estándar en una gama de
concentración de 0 a 200 nmoles. La actividad específica de la
GFAT1-His6 obtenida ha sido así medida a 1,7 U/mg.
Lo que es superior al valor de 0,4 U/mg obtenido por Broschat et
al., J. Biol. Chem. (2002) 277:14764, para la purificación de
una GFAT1 humana recombinante. Esto traduce una actividad superior
de la GFAT1-His6 y/o una pureza más importante de la
preparación enzimática según la invención.
Los parámetros cinéticos de la
GFAT1-His6 han sido caracterizados frente a la
glutamina (K_{m}^{Gln} = 0,2 M) y a la
fructosa-6P (F6P) (K_{m}^{F6P} = 0,006 mM)
mediante una dosificación espectrofotométrica acoplada con la
glutamato deshidrogenasa según el ensayo APAD. Lo que está de
acuerdo con los valores citados en la técnica anterior
(K_{m}^{Gln} = 0,26 mM y K_{m}^{F6P} = 0,007 mM por Broschat
et al., J. Biol. Chem. (2002) 277:14764).
\newpage
Se trata de una dosificación espectrofotométrica
en el ultravioleta de la actividad GFAT. Se basa en la
determinación, en continuo, de la cantidad de
L-glutamato formado con la ayuda de la GFAT y de un
análogo del NAD (nicotinamida adenina dinucleótido), la APAD
(3-acetilpiridina adenina dinucleótido), según la
reacción siguiente (catalizada por la glutamato deshidrogenasa
(GDH)):
La medición se efectúa a 365 nm, a 37ºC. En
estas condiciones, una unidad de absorbancia corresponde a 0,11
\mumoles de ADADH formado.
El ensayo comprende:
- -
- 100 \mul de ADAP 3 mM (2 mg/ml)
- -
- 25 \mul de KCl 2M
- -
- 100 \mul de tampón KPO_{4} 1 M pH 7,2
- -
- 100 \mul de fructosa-6P 100 mM (30,41 mg/ml)
- -
- 100 \mul de L-glutamina 60 mM purificada (8,77 mg/ml)
- -
- H_{2}O csp 1 ml (teniendo en cuenta los volúmenes a añadir a continuación)
- -
- 50 \mul de GDH
- -
- muestra a dosificar: 0,5 \mug
Es posible utilizar asimismo otros
procedimientos de dosificación, tales como la dosificación
radiométrica descrita por Broschat et al., Analytical
Biochem. (2002) 305:10-15 o la dosificación
denominada Nitro Bleu Tétrazolium descrita por Nakata et
al., J. Antibio. (2001) 54:737-743.
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120>
GLUTAMINA:FRUCTOSA-6-FOSFATO
AMIDOTRANSFERASA (GFAT) QUE COMPRENDE UNA ETIQUETA DE PURIFICACIÓN
INTERNA, Y SU UTILIZACIÓN PARA EL CRIBADO DE COMPUESTOS
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<130> WOB 03 BP CNR GFAT
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<160>19
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210>1
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<211> 2046
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2046)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (170)..(170)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210>2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 681
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en posición 57
representa Thr o Ile.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2049
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2049)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 682
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2100
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2100)
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<223>
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<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (170)..(170)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t ou c
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en posición 57
representa Thr o Ile.
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<400> 6
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2064
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GFAT1 modificada por una etiqueta de
purificación interna
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2064)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (170)..(170)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 687
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (57)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en posición 57
representa Thr o Ile.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GFAT1 modificada por una etiqueta de
purificación interna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
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<211> 2067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GFAT2 modificada por una etiqueta de
purificación interna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2067)
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 688
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GFAT2 modificada por una etiqueta de
purificación interna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 2118
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GPAT1Alt modificada por una etiqueta
de purificación interna
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2118)
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<223>
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<221> misc_feature
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<222> (170)..(170)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t o c
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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<210> 12
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<211> 705
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El "Xaa" en posición 57
representa Thr o Ile.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> GFAT1Alt modificada por una etiqueta
de purificación interna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 608
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
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<211> 72
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagttgac tcttcctctc attgtgttca cgacagactc tggc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400>16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatctagatt catgctcgag cggccgccag tgtgattgat atc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttttatca gagcgctggg ggtggctatt gacagg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>18
\hskip0,7cm51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta
hexa-histidina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>19
\hskip0,2cm52
Claims (18)
1. Proteína que posee una actividad GFAT que
comprende:
una secuencia de GFAT y por lo menos una
secuencia de una etiqueta de purificación, siendo la secuencia de
la etiqueta de purificación insertada entre dos aminoácidos
consecutivos de la secuencia de GFAT, estando dichos aminoácidos
comprendidos en:
- \bullet
- una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 30 a 80 de la GFAT de Escherichia coli, o
- \bullet
- una secuencia de GFAT que corresponde a la secuencia que se extiende entre los aminoácidos 220 a 230 de la GFAT de Escherichia coli.
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que
la secuencia de GFAT corresponde a una secuencia de GFAT de
bacteria o de eucariota, en particular de planta, de hongo o de
animal, en particular de insecto o de mamífero, más particularmente
del ser humano.
3. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la
que la secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre
dos aminoácidos consecutivos de la secuencia de una GFAT humana,
estando dichos aminoácidos comprendidos entre los aminoácidos 40 a
50 y/o 290 a 330 de dicha secuencia de GFAT humana.
4. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 3, en la que la secuencia de GFAT corresponde a:
- -
- SEC ID nº 2, que corresponde a la secuencia de la GFAT1 humana, o
- -
- SEC ID nº 4, que corresponde a la secuencia de la GFAT2 humana, o
- -
- SEC ID nº 6, que corresponde a la secuencia de la GFAT1Alt humana.
5. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 4, en la que la secuencia de la etiqueta de purificación se
inserta entre dos aminoácidos consecutivos, estando dichos
aminoácidos comprendidos entre los aminoácidos:
- -
- 43 a 47 y/o 298 a 306, de SEC ID nº 2, o
- -
- 42 a 45 y/o 299 a 307, de SEC ID nº 4, o
- -
- 43 a 47 y/o 316 a 324, de SEC ID nº 6,
6. Proteína según la reivindicación 5, en la que
la secuencia de la etiqueta de purificación se inserta entre los
aminoácidos:
- -
- 299 y 300 de SEC ID nº 2, o
- -
- 300 y 301 de SEC ID nº 4, o
- -
- 317 y 318 de SEC ID nº 6.
7. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 6, en la que la etiqueta de purificación corresponde a una
secuencia de 2 a 10 aminoácidos, en particular de 4 a 8
aminoácidos.
8. Proteína según una de las reivindicaciones 1
a 7, en la que la etiqueta de purificación es una
hexa-histidina.
9. Proteína según las reivindicaciones 6 y 8,
que corresponde a las secuencias:
- -
- SEC ID nº 8, que corresponde a la secuencia SEC ID nº 2 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 299 y 300,
- -
- SEQ ID nº 10, que corresponde a la secuencia SEC ID nº 4 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 300 y 301, y
- -
- SEQ ID nº 12, que corresponde a la secuencia SEC ID nº 6 en la que una hexa-histidina se inserta entre los aminoácidos 317 y 318.
10. Ácido nucleico que comprende o que está
constituido por una secuencia que codifica para una proteína según
una de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Ácido nucleico que comprende o que está
constituido por la secuencia nucleotídica:
- -
- SEC ID nº 7 que codifica para la proteína SEC ID nº 8, o
- -
- SEC ID nº 9 que codifica para la proteína SEC ID nº 10, o
- -
- SEC ID nº 11 que codifica para la proteína SEC ID nº 12.
12. Vector eucariota o procariota que comprende
un ácido nucleico según la reivindicación 10 u 11.
13. Procedimiento de purificación de una
proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9, a partir de una
disolución que comprende dicha proteína, que comprende una etapa de
puesta en presencia de dicha disolución con un compuesto que se une
específicamente a la etiqueta de purificación de dicha proteína, y
una etapa de separación del complejo formado por la unión de dicha
proteína a dicho compuesto de los demás constituyentes de la
disolución.
14. Procedimiento de purificación según la
reivindicación 13, que comprende una etapa de puesta en presencia
de una disolución que comprende una proteína según la reivindicación
9, con un compuesto que comprende un catión metálico divalente
seleccionado de entre el Ni^{2+} o el Co^{2+}, en particular el
Ni^{2+}, y una etapa de separación del complejo formado por la
unión de la proteína a dicho compuesto de los demás constituyentes
de la disolución.
15. Procedimiento de conservación de una
proteína según una de las reivindicaciones 1 a 9 en forma
enzimáticamente activa, en particular a -80ºC o a 4ºC, que
comprende la adición de dicha proteína a una disolución que
comprende:
- -
- 1 mM a 10 mM de fructosa-6-fosfato, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- 1 mM a 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina, en particular aproximadamente 1 mM,
- -
- 5% a 20% de glicerol, en particular aproximadamente 10%.
16. Composición que comprende una proteína GFAT
activa unida a una etiqueta de purificación según una de las
reivindicaciones 1 a 9, siendo dicha proteína susceptible de poder
ser conservada en una forma enzimáticamente activa, durante por lo
menos 8 días a una temperatura de 2ºC a 10ºC, en particular 4ºC, y
durante por lo menos 12 meses a una temperatura de -100ºC a -20ºC,
en particular -80ºC, estando dicha proteína en asociación con:
- -
- 1 mM a 10 mM de fructosa-6-fosfato, en particular 1 mM,
- -
- 1 mM a 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina, en particular 1 mM,
- -
- 5% a 20% de glicerol, en particular 10%.
17. Utilización de una proteína según una de las
reivindicaciones 1 a 9, para el cribado de compuestos que modifican
la actividad de dicha proteína, en particular para el cribado de un
inhibidor de dicha proteína.
18. Utilización según la reivindicación 17, para
el cribado de compuestos útiles en el marco del tratamiento o de la
prevención de la diabetes, en particular de la diabetes de tipo II,
de la obesidad, de la acidosis, de la cetosis, de la artritis, de
los cánceres, o de la osteoporosis.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0308350 | 2003-07-08 | ||
| FR0308350A FR2857374B1 (fr) | 2003-07-08 | 2003-07-08 | Glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase(gfat) comprenant une etiquette de purification interne, et son utilisation pour le criblage de composes |
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|---|---|
| ES2343571T3 true ES2343571T3 (es) | 2010-08-04 |
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