ES2344253T3 - Vacuna contra el virus de la hepatitis c. - Google Patents

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Andrew J. Bett
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Riccardo Cortese
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Abstract

Ácido nucleico que comprende: (a)una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85%, con la condición de que dicho polipéptido presente actividad de proteasa suficiente para procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B, y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente activa, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión que puede expresar dicho polipéptido a partir de dicha secuencia de nucleótidos en una célula humana; o (b)un casete de expresión génica que puede expresar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85% en una célula humana, con la condición de que dicho polipéptido pueda procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente inactiva, comprendiendo dicho casete de expresión: a)un promotor acoplado transcripcionalmente a una secuencia de nucleótidos codificante de dicho polipéptido; b)un sitio 5'' de unión ribosómica acoplado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos, c)un terminador unido al extremo 3'' de dicha secuencia de nucleótidos, y d)una señal 3'' de poliadenilación acoplada funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.

Description

Vacuna contra el virus de la hepatitis C.
Antecedentes de la invención
Las referencias citadas en la presente solicitud no son admitidas como técnica anterior respecto a la invención reivindicada.
Aproximadamente 3% de la población mundial se encuentra infectada por el virus de la hepatitis C (VHC) (Wasley et al., Semin. Liver Dis. 20:1-16, 2000). La exposición al VHC resulta en una enfermedad aguda manifiesta en un pequeño porcentaje de los casos, mientras que en la mayoría de casos, el virus establece una infección crónica que provoca inflamación del hígado y que progresa lentamente hasta la insuficiencia cardiaca y cirrosis (Iwarson, FEMS Microbiol. Rev. 14:201-204, 1994). Además, los estudios epidemiológicos indican que el VHC presenta un papel importante en la patogénesis del carcinoma hepatocelular (Kew, FEMS Microbiol. Rev. 14:211-220, 1994; Alter, Blood 85:1681-1695, 1995).
Antes de la implementación del cribado rutinario de sangre para el VHC en 1992, la mayoría de las infecciones se contraían por la exposición involuntaria a sangre contaminada, productos sanguíneos u órganos trasplantados. En aquellas áreas en las que se ha llevado a cabo el cribado de la sangre para el VHC, el VHC se contrae mediante la exposición percutánea directa a sangre infectada, es decir, la utilización intravenosa de drogas. Entre los métodos menos frecuentes de transmisión se incluyen la exposición perinatal, la hemodiálisis y el contacto sexual con una persona infectada por VHC (Alter et al., N. Engl. J. Med. 341(8):556-562, 1999; Alter, J. Hepatol. 31 supl. 88-91, 1999; Semin. Liver Dis. 201:1-16, 2000).
El genoma del VHC consta de un ARN de una cadena de aproximadamente 9,5 kb codificante de una poliproteína precursora de aproximadamente 3.000 aminoácidos (Choo et al., Science 244:362-364, 1989; Choo et al., Science 244:359-362, 1989; Takamizawa et al., J. Virol. 65:1105-1113, 1991). La poliproteína del VHC contiene las proteínas víricas en el orden siguiente: C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.
Las proteínas víricas individuales se producen mediante proteolisis de la poliproteína del VHC. Las proteasas de la célula huésped liberan las proteínas estructurales putativas C, E1, E2 y p7, y crean el extremo N-terminal de NS2 en el aminoácido 810 (Mizushima et al., J. Virol. 68:2731-2734, 1994; Hijikata et al., P.N.A.S. USA 90:10773-10777, 1993).
Las proteínas no estructurales NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B presumiblemente forman la maquinaria replicativa del virus y resultan liberadas de la poliproteína. Una proteína dependiente de cinc asociada a NS2 y el extremo N-terminal de NS3 son responsables del corte entre NS2 y NS3 (Grakoui et al., J. Virol. 67:1385-1395, 1993; Hijikata et al., P.N.A.S. USA 90:10773-10777, 1993). Una serina proteasa determinada que se localiza en el dominio N-terminal de NS3 es responsable de los cortes proteolíticos en las uniones NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NSSA y NS5A/NS5B (Bartenschlager et al., J. Virol. 67:3835-3844, 1993; Grakoui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10583-10587, 1993; Tomei et al., J. Virol. 67:4017-4026, 1993). NS4A proporciona un cofactor para la actividad de NS3 (Failla et al., J. Virol. 68:3753-3760, 1994; De Francesco et al., patente US nº 5.739.002).
La NS5A es una proteína altamente fosforilada que proporciona resistencia al interferón (De Francesco et al., Semin. Liver Dis. 20(1):69-83, 2000; Pawlotsky, Viral Hepat. Supl. 1:47-48, 1999).
La NS5B proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN (De Francesco et al., publicación internacional número WO 96/37619; Behrens et al., EMBO 15:12-22, 1996; Lohmann et al., Virology 249:108-118, 1998).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende:
(a)
una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos con la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85%, con la condición de que dicho polipéptido presente suficiente actividad de proteasa para procesarse a sí misma y producir una proteína NS5B, y dicha proteína NS5B se encuentre enzimáticamente inactiva, en la que dicho ácido nucleico es un vector de expresión que puede expresar dicho polipéptido a partir de dicha secuencia de nucleótidos en una célula humana, o (b) un casete de expresión génica que puede expresar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85% en una célula humana, con la condición de que dicho polipéptido pueda procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B y dicha proteína NS5B se encuentre enzimáticamente inactiva, comprendiendo dicho casete de expresión:
a)
un promotor acoplado transcripcionalmente a una secuencia de nucleótidos codificante de dicho polipéptido,
b)
un sitio de unión ribosómica 5' acoplado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos,
c)
un terminador unido al extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos, y
d)
una señal de poliadenilación 3' funcionalmente acoplada a dicha secuencia de nucleótidos.
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El ácido nucleico resulta particularmente útil como componente de un adenovector o vacuna de plásmido de ADN que proporciona un amplio abanico de antígenos para generar una respuesta inmunológica contra el VHC mediada por células (CMI) específica para el VHC.
Una respuesta CMI específica para el VHC se refiere a la producción de linfocitos T citotóxicos y células T ayudante que reconocen un antígeno del VHC. La respuesta CMI también puede incluir efectos inmunológicos no específicos del VHC.
La referencia a una "secuencia sustancialmente similar" indica una identidad de por lo menos aproximadamente 85% respecto a una secuencia de referencia. De esta manera, por ejemplo, los polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia SEC ID nº 1 presentan una identidad de secuencia global de por lo menos aproximadamente 85% respecto a la secuencia SEC ID nº 1.
Los polipéptidos correspondientes a NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B presentan una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 85% respecto a la región correspondiente en la secuencia SEC ID nº 1. Dichos polipéptidos correspondientes también se denominan en la presente memoria polipéptidos NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B.
La expresión en el interior de una célula humana presenta aplicaciones terapéuticas para el tratamiento activo de una infección por VHC y para el tratamiento profiláctico contra una infección por VHC.
Un vector de expresión contiene una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido conjuntamente con elementos reguladores para la transcripción y procesamiento correctos. Entre los elementos reguladores que pueden encontrarse presentes se incluyen los asociados naturalmente a la secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido, y elementos reguladores exógenos no asociados naturalmente a la secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores exógenos, tales como un promotor exógeno, pueden resultar útiles para la expresión en un huésped particular, tal como en una célula humana. Entre los elementos reguladores que resultan útiles para la expresión funcional se incluyen un promotor, un terminador, un sitio de unión ribosómica y una señal de poliadenilación.
La expresión "acoplado transcripcionalmente" se refiere a que el promotor se encuentra situado de manera que la transcripción de la secuencia de nucleótidos puede resultar inducida por la unión de la ARN polimerasa al promotor. El acoplamiento transcripcional no requiere que la secuencia que se transcribe sea contigua al promotor.
La expresión "funcionalmente acoplado" se refiere a la capacidad de mediar en un efecto sobre la secuencia de nucleótidos. El acoplamiento funcional no requiere que las secuencias acopladas sean contiguas entre sí. Una señal de poliadenilación 3' funcionalmente acoplada a la secuencia de nucleótidos facilita el corte y poliadenilación del ARN transcrito. Un sitio de unión ribosómica 5' funcionalmente acoplado a la secuencia de nucleótidos facilita la unión ribosómica.
El ácido nucleico es un vector de plásmido de ADN o un adenovector adecuado para la aplicación terapéutica en el tratamiento del VHC o como intermediario en la producción de un vector terapéutico. El tratamiento del VHC incluye tratar activamente una infección por VHC y el tratamiento profiláctico contra una infección por VHC.
Otro aspecto de la presente exposición se refiere a un adenovector que comprende un ácido nucleico tal como se ha indicado anteriormente que es producido mediante un procedimiento que implica: (a) la recombinación homóloga, y (b) el rescate del adenovector. La etapa de recombinación homóloga produce un plásmido de genoma de adenovirus. La etapa de rescate del adenovector produce el adenovector a partir del plásmido de adenogenoma.
Los plásmidos de genoma de adenovirus indicados en la presente memoria contienen un genoma de adenovirus recombinante que presenta una deleción en la región E1 y opcionalmente en la región E3 y un casete de expresión génica insertado en una de las regiones de deleción. El genoma de adenovirus recombinante está constituido por regiones sustancialmente similares a uno o más serotipos de adenovirus.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un adenovector que consta de una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una identidad de secuencia respecto a la secuencia SEC ID nº 4 de por lo menos 65%, o un derivado de la misma, en el que dicho derivado de la misma presenta la secuencia codificante de la poliproteína del VHC presente en la secuencia SEC ID nº 4 sustituida por la secuencia codificante de la poliproteína del VHC de secuencia SEC ID nº 3, SEC ID nº 10 ó SEC ID nº 11.
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También se da a conocer una célula recombinante en cultivo que comprende un ácido nucleico de la invención indicado anteriormente. La célula recombinante presenta una diversidad de usos, tales como la utilización para replicar un ácido nucleico codificante del polipéptido en métodos de construcción de vectores.
Otro aspecto de la presente exposición describe un método de preparación de un adenovector que comprende un ácido nucleico de la invención indicado anteriormente. El método implica las etapas siguientes: (a) producir un plásmido de genoma de adenovirus que contiene un genoma de adenovirus recombinante con deleciones en las regiones E1 y E3 y un casete de expresión génica insertado en una de las regiones de deleción, y (b) recuperar el adenovector del plásmido de genoma de adenovirus.
Otro aspecto de la presente invención describe una composición farmacéutica que comprende un vector para expresar un ácido nucleico de la invención tal como se ha indicado anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. El vector resulta adecuado para la administración y la expresión del polipéptido en un paciente.
El término "paciente" se refiere a un mamífero que puede resultar infectado por el VHC. Un paciente puede resultar infectado o no por el VHC. Son ejemplos de pacientes, seres humanos y chimpancés.
Se da asimismo a conocer un método de tratamiento de un paciente que comprende la etapa que consiste en administrar al paciente una cantidad efectiva de un vector que expresa un ácido nucleico de la invención tal como se ha indicado anteriormente. El vector resulta adecuado para la administración y expresión del polipéptido en el paciente.
El paciente sometido a tratamiento puede resultar infectado o no por el VHC. Para un paciente infectado por el VHC, una cantidad efectiva resulta suficiente para alcanzar uno o más de los efectos siguientes: reducción de la capacidad de replicación del VHC, reducción de la carga de VHC, incremento de la eliminación vírica e incremento de una o más respuestas CMI específicas para el VHC. Para un paciente no infectado por VHC, una cantidad efectiva resulta suficiente para conseguir uno o más de los siguientes: una capacidad incrementada de producir uno o más componentes de una respuesta CMI específica para el VHC frente a una infección por VHC, una susceptibilidad reducida a la infección por VHC y una capacidad reducida del virus infeccioso de establecer una infección persistente productora de una enfermedad crónica.
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Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B representan la secuencia SEC ID nº 1.
Las figuras 2A, 2B, 2C y 2D representan la secuencia SEC ID nº 2. La secuencia SEC ID nº 2 proporciona una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia SEC ID nº 1 conjuntamente con un sitio de entrada ribosómica interno optimizado y la terminación TAAA. Los nucleótidos 1 a 6 proporcionan un sitio de entrada ribosómica interno optimizado. Los nucleótidos 7 a 5.961 codifican un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC en el que los nucleótidos en las posiciones 5.137 a 5.145 proporcionan una secuencia AlaAlaGly en las posiciones aminoácidas 1.711 a 1.713 que inactiva NS5B. Los nucleótidos 5.962 a 5.965 proporcionan una terminación TAAA.
Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D representan la secuencia SEC ID nº 3. La secuencia SEC ID nº 3 una versión de codones optimizados de la secuencia SEC ID nº 2. Los nucleótidos 7 a 5.961 codifican un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC.
Las figuras 4A a 4M representan MRKAd6-NSmut (SEC ID nº 4). La secuencia SEC ID nº 4 es un adenovector que contiene un casete de expresión en el que el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1 se encuentra codificado por la secuencia SEC ID nº 2. Los pares de bases 1 a 450 corresponden a Ad5 pb 1 a 450; los pares de bases 462 a 1.252 corresponden al promotor humano del CMV; los pares de bases 1.258 a 1.267 corresponden a la secuencia Kozak; los pares de bases 1.264 a 7.222 corresponden a los genes NS; los pares de bases 7.231 a 7.451 corresponden a la señal de poliadenilación de BGH; los pares de bases 7.469 a 9.506 corresponden a los pares de bases de Ad5 3.511 a 5.548; los pares de bases 9.507 a 32.121 corresponden a los pares de bases de Ad6 5.542 a 28.156; los pares de bases 32.122 a 35.117 corresponden a los pares de bases de Ad6 30.789 a 33.784; y los pares de bases 35.118 a 37.089 corresponden a los pares de bases de Ad5 33.967 a 35.935.
Las figuras 5A a 5O representan las secuencias SEC ID nº 5 y 6. La secuencia SEC ID nº 5 codifica un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC con una ARN polimerasa dependiente de ARN activa. La secuencia SEC ID nº 6 proporciona la secuencia de aminoácidos para el polipéptido.
Las figuras 6A a 6C proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de pV1JnSA (SEC ID nº 7).
Las figuras 7A a 7N proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos para el genoma de Ad6 (SEC ID nº 8).
Las figuras 8A a 8K proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos para el genoma de Ad5 (SEC ID nº 9).
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La figura 9 representa diferentes regiones del genoma de Ad6. El genoma de ADN ds lineal (35.759 pb) se encuentra indicado por dos líneas paralelas y se encuentra dividido en 100 unidades de mapa. Se muestran la posición y orientación en el genoma de las unidades de transcripción. Los genes tempranos (E1A, E1B, E2A/B, E3 y E4) se indican mediante flechas grises. Los genes tardíos (L1 a L5), indicados mediante flechas negras, son producidos mediante procesamiento alternativo de un transcrito producido a partir del promotor tardío mayor (MLP) y todos contienen el líder tripartito (1, 2, 3) en sus extremos 5'. La región E1 se encuentra localizada aproximadamente entre las unidades de mapa 1,0 y 11,5; la región E2, entre las unidades de mapa 75,0 y 11,5; E3, entre las unidades de mapa 76,1 y 86,7, y E4 entre 99,5 y 91,2. La unidad de transcripción tardía mayor se encuentra localizada entre las unidades de mapa 16,0 y 91,2.
La figura 10 representa la recombinación homóloga para recuperar regiones de Ad6 y de Ad5 que contienen pAdE1^{-}E3^{+}.
La figura 11 representa un recombinante homólogo para recuperar regiones de Ad6 que contienen pAdE1^{-}E3^{+}.
La figura 12 representa una transferencia western de extractos de células completas procedentes de células 293 con plásmido de ADN que expresa diferentes casetes NS del VHC. Se extrajeron los productos maduros de N53 y de NS5A utilizando anticuerpos específicos. El término "pV1Jns-NS" se refiere a un plásmido pV1JnsA en el que un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B se encuentra codificado por la secuencia SEC ID nº 5, y la secuencia SEC ID nº 5 se inserta entre las bases 1.881 y 1.912 de la secuencia SEC ID nº 7. El término "pVIJns-NSmut" se refiere a un plásmido pV1JnsA en el que la secuencia SEC ID nº 2 se inserta entre las bases 1.881 y 1.925 de la secuencia SEC ID nº 7. El término "pV1Jns-NSOPT" se refiere a un plásmido pV1JnsA en el que la secuencia SEC ID nº 3 se inserta entre las bases 1.881 y 1.905 de la secuencia SEC ID nº 7.
Las figuras 13A y 13B ilustran las respuestas de células T mediante ELIspot de IFN\gamma inducidas en ratones C57black6 (a) y en ratones BalbC (B) mediante dos inyecciones de 25 \mug y 50 \mug, respectivamente, de plásmido de ADN codificante de los diferentes casetes de NS del VHC con electrotransferencia génica (GET).
La figura 14 ilustra la expresión de proteínas de diferentes adenovectores tras la infección de células HeLa. MRKAd5-NSmut es un adenovector basado en una secuencia de Ad5 (SEC ID nº 9), en la que el genoma de Ad5 presenta una deleción E1 de los pares de bases 451 a 3.510, una deleción E3 de los pares de bases 28.134 a 30.817, y presenta el casete de expresión NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B tal como se proporciona en los pares de bases 451 a 7.468 de la secuencia SEC ID nº 4 insertados entre las posiciones 450 y 3.511. Ad5-NS es un adenovector basado en un esqueleto de Ad5 con una deleción E1 de los pares de bases 342 a 3.523 y una deleción E3 de los pares de bases 28.134 a 30.817, y que contiene un casete de expresión codificante de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B procedente de la secuencia SEC ID nº 5. El término "MRKAd6-NSOPTmut" se refiere a un adenovector que presenta una secuencia SEC ID nº 4 modificada, en la que los pares de bases 1.258 a 7.222 de la secuencia SEC ID nº 4 han sido sustituidos por la secuencia SEC ID nº 3.
La figura 15 ilustra las respuestas de células T mediante ELIspot de IFN\gamma inducidas en ratones C57black6 mediante dos inyecciones de 10^{9} vp de adenovectores que contienen diferentes casetes de genes no estructurales del VHC.
Las figuras 16A-16D ilustran las respuestas de células T mediante ELIspot de IFN\gamma inducidas en monos Rhesus mediante una o dos inyecciones de 10^{10} vp (A) o de 10^{11} vp (B) de adenovectores que contienen diferentes casetes de genes no estructurales del VHC.
Las figuras 17A y 17B ilustran las respuestas de células T CD8+ mediante ICS de IFN\gamma inducida en monos Rhesus mediante dos inyecciones de 10^{10} vp (A) o de 10^{11} vp (B) de adenovectores codificantes de los diferentes casetes de genes no estructurales del VHC.
Las figuras 18A a 18F ilustran respuestas de células T mediante ensayo CTL en masa inducidas en monos Rhesus mediante dos inyecciones de 10^{11} vp de Ad5-NS (A), MRKAd5-NSmut (B) o MRKAd6-NSmut (C).
La figura 19 ilustra el plásmido pE2.
La figura 20A-D ilustra la secuencia parcial de codones optimizados NSsuboptmut (SEC ID nº 10). La secuencia codificante del polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B se encuentra comprendida entre las bases 7 y 5.961.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona vectores Ad6 y un ácido nucleico codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B tal como se ha indicado anteriormente, que contiene una región NS5B inactiva. La provisión de una región NS5B inactiva suministra antígenos de NS5B, reduciendo simultáneamente la posibilidad de efectos secundarios adversos debidos a una ARN polimerasa vírica activa. Entre los usos del ácido nucleico proporcionado se incluyen la utilización como un componente de vacuna para introducir en una célula un polipéptido del VHC que proporciona un amplio abanico de antígenos para generar una respuesta de CMI contra el VHC, y como intermediario para producir dicho componente de vacuna.
La respuesta inmunológica celular adaptativa puede funcionar reconociendo antígenos víricos en las células infectadas por el VHC en todo el cuerpo debido a la distribución ubicua de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, induciendo memoria inmunológica, y manteniendo la memoria inmunológica. Estas funciones se atribuyen a células T CD4+ específicas de antígeno (Th) y células T CD8+ citotóxicas (CTL).
Tras la activación mediante sus receptores de células T específicos, las células Th específicas de VHC cumplen una diversidad de funciones inmunorreguladoras, la mayoría de ellas mediadas por las citoquinas Th1 y Th2. Las células Th específicas de VHC asisten en la activación y diferenciación de las células B y en la inducción y estimulación de las células T citotóxicas específicas de virus. Conjuntamente con las CTL, las células Th también pueden secretar IFN-\gamma y TNF-\alpha que inhiben la replicación y la expresión génica de varios virus. Además, las células Th y las CTL, las células efectoras principales, pueden inducir apoptosis y la lisis de las células infectadas por virus.
Las CTL específicas de VHC se generan a partir de antígenos procesados por células presentadoras de antígenos profesionales (pAPC). Los antígenos pueden sintetizarse dentro de las pAPC o introducirse en las mismas. La síntesis de antígenos en una pAPC puede llevarse a cabo mediante la introducción en la célula de un casete de expresión codificante del antígeno.
Una vía preferida de administración de vacuna de ácidos nucleicos es una vía intramuscular. La administración intramuscular aparentemente resulta en la introducción y expresión de ácidos nucleicos en las células somáticas y en las pAPC. Los antígenos del VHC producidos en las células somáticas pueden transferirse a las pAPC para la presentación en el contexto de moléculas del MHC de clase I (Donnelly et al., Annu. Rev. Immunol. 15:617-648, 1997).
Las pAPC procesan antígenos de mayor longitud en antígenos peptídicos más pequeños en el complejo del proteasoma. Se traslocan los antígenos a la ruta de secreción del retículo endoplasmático/complejo de Golgi para la asociación a proteínas del MHC de clase I. Los linfocitos T CD8+ reconocen antígenos asociados al MHC de clase I mediante el receptor de células T (TCR) y la proteína de superficie de las células CD8.
La utilización de un ácido nucleico codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B como componente de vacuna permite la producción de un amplio abanico de antígenos capaces de generar respuestas CMI a partir de un único vector. El polipéptido debe ser que puede procesarse a sí mismo suficientemente para producir por lo menos una región correspondiente a NS5B.
Un polipéptido sustancialmente similar a la secuencia SEC ID nº 1 con suficiente actividad de proteasa para procesarse a sí mismo en una célula proporciona a la misma epítopos de células T que se encuentran presentes en varias cepas diferentes del VHC. Las proteínas NS3 y NS3/NS4A proporcionan la actividad de proteasa mediante la digestión del polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B en los sitios de corte apropiados, liberando polipéptidos correspondientes a NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B. El autoprocesamiento de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B genera polipéptidos que son similares a los polipéptidos naturales del VHC.
Basándose en las directrices proporcionadas en la presente memoria, puede generarse una respuesta inmunológica suficientemente fuerte para conseguir efectos beneficiosos para el paciente. Las directrices proporcionadas incluyen información referente a la selección de secuencias del VHC, la selección del vector, la producción del vector, el tratamiento en combinación y la administración.
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I. Secuencias del VHC
Puede utilizarse una diversidad de diferentes secuencias de ácidos nucleicos como componente de vacuna para suministrar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC a una célula, o como intermediario para producir componentes de vacuna. El punto de partida para obtener secuencias de ácidos nucleicos adecuadas son preferentemente las secuencias de polipéptidos NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B naturales modificadas para producir una región NS5B inactiva.
La utilización de una secuencia de ácidos nucleicos del VHC para proporcionar antígenos no estructurales del VHC para generar una respuesta de CMI se menciona en Cho et al., Vaccine 17:1136-1144, 1999; Paliard et al., publicación internacional WO 01/30812 (no admitida como antecedente de la técnica de la invención reivindicada), y Coit et al., publicación internacional WO 01/38360 (no admitida como antecedente de la técnica de la invención reivindicada). Dichas referencias no describen, por ejemplo, un polipéptido que se procesa a sí mismo produciendo un NS5B inactivo, y las combinaciones particulares de secuencias del VHC y vehículos de administración utilizados en la presente invención.
Pueden realizarse modificaciones de la secuencia del polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC mediante la alteración del ácido nucleico codificante. Pueden llevarse a cabo alteraciones para crear deleciones, inserciones y sustituciones.
Puede realizarse pequeñas modificaciones en NS5B para producir una polimerasa inactiva mediante el reconocimiento de motivos esencialmente destinados a la replicación. Se describen ejemplos de motivos que resultan críticos para la actividad de NS5B y modificaciones que pueden llevarse a cabo para producir un NS5B inactivo en Lohmann et al., Journal of Virology 71:8416-8426, 1997, y Kolykhalov et al., Journal of Virology 74:2046-2051, 2000.
Entre los factores adicionales que se deben considerar durante la producción de modificaciones del polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de HCV se incluyen mantener la capacidad de autoprocesamiento y el mantenimiento de los antígenos de las células T. La capacidad del polipéptido de VHC de procesarse a sí mismo está determinada en gran medida por la presencia de una proteasa de NS3 funcional. Pueden obtenerse modificaciones que mantengan la actividad de la proteasa de NS3 mediante la consideración de la proteína NS3, de NS4A, que sirve de cofactor para NS3, y de los sitios de reconocimiento de proteasa de NS3 presentes dentro del polipéptido NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.
Pueden realizarse diferentes modificaciones de las secuencias naturales del polipéptido NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B para producir polipéptidos capaces de inducir un amplio abanico de respuestas de células T. Entre los factores que influyen sobre la capacidad de un polipéptido de inducir una amplia respuesta de células T se incluyen la conservación o la introducción de regiones antigénicas de células T específicas del VHC y la prevalencia de diferentes regiones antigénicas de células T en diferentes aislados de VHC.
Son conocidos en la técnica numerosos ejemplos de aislados de VHC naturales. Los aislados de VHC pueden clasificarse en los seis genotipos principales siguientes, que comprenden uno o más subtipos: VHC-1/(1a,1b,1c), VHC-2/(2a,2b,2c), VHC-3/(3a,3b,10a), VHC-4/(4a), VHC-5/(5a) y VHC-6/(6a,6b,7b,8b,9a,11a) (Simmonds, J. Gen. Virol. 693-712, 2001). Se han depositado ejemplos de secuencias particulares del VHC, tales como VHC-BK, VHC-J, VHC-N, VHC-H, en GenBank, y se han descrito en diversas publicaciones (ver, por ejemplo, Chamberlain et al., J. Gen. Virol. 1341-1347, 1997).
Los antígenos de células T del VHC pueden identificarse mediante, por ejemplo, experimentación empírica. Una manera de identificar los antígenos de células T implica generar una serie de péptidos cortos solapantes a partir de un polipéptido de mayor longitud y después cribar las poblaciones de células T de pacientes infectados para los clones positivos. Los clones positivos se activan/ceban con un péptido particular. Pueden utilizarse técnicas tales como IFN\gamma-ELISPOT, tinción intracelular de IFN\gamma y ensayos CTL en masa para medir la actividad peptídica. De esta manera, puede considerarse que los péptidos identificados representan epítopos de células T del patógeno respectivo.
Las regiones antigénicas de células T del VHC de diferentes aislados del VHC pueden introducirse en una única secuencia mediante, por ejemplo, la producción de un polipéptido NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B híbrido que contenga regiones de dos o más secuencias naturales. Este híbrido puede contener modificaciones adicionales, que preferentemente no reduzcan la capacidad del polipéptido de producir una respuesta CMI contra el VHC.
La capacidad de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B modificado de procesarse a sí mismo y de producir una respuesta de CMI puede determinarse utilizando técnicas descritas en la presente memoria o bien conocidas en la técnica. Entre estas técnicas se incluyen la utilización de IFN\gamma-ELISPOT, la tinción intracelular de IFN\gamma y los ensayos de CTL en masa para medir una respuesta de CMI específica del VHC.
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A. Secuencias Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B
La secuencia SEC ID nº 1 proporciona una secuencia Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B preferida. La secuencia SEC ID nº 1 contiene un gran número de antígenos de células T específicos de VHC que se encuentran presentes en varios aislados de VHC diferentes. La secuencia SEC ID nº 1 es similar a la parte NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la secuencia de nucleótidos de la cepa BK de VHC (número de acceso de GenBank M58335).
En la secuencia SEC ID nº 1, las posiciones de anclaje importantes para el reconocimiento por parte de las moléculas del MHC de clase I se encuentran conservadas y representan sustituciones conservadoras para 18 de entre 20 epítopos de células T conocidos en la parte NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de las poliproteínas de VHC. Con respecto a los dos epítopos de células T conocidos restantes, uno presenta una sustitución no conservadora de anclaje en la secuencia SEC ID nº 1 que todavía puede ser reconocida por un supertipo de HLA diferente y un epítopo presenta un residuo de anclaje no conservado. Se describen epítopos de células T del VHC en Chisari et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242:299-325, 2000, y Lechner et al., J. Exp. Med. 9:1499-1512, 2000.
Entre las diferencias entre la secuencia de nucleótidos de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC-BK y la secuencia SEC ID nº 1 se incluyen la introducción de una metionina en el extremo 5' y la presencia de residuos de sitio activo de NS5B modificado en la secuencia SEC ID nº 1. La modificación sustituye GlyAspAsp por AlaAlaGly (residuos 1.711 a 1.713) para inactivar NS5B.
El polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC codificado preferentemente presenta una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia SEC ID nº 1 con una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85%, de por lo menos 95%, de por lo menos 99%, o del 100%, o difiere de la secuencia SEC ID nº 1 en 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19 ó 1-20 aminoácidos.
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Las diferencias de aminoácidos entre un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B y la secuencia SEC ID nº 1 se calculan determinando el número mínimo de modificaciones de aminoácidos en el que difieren las dos secuencias. Las modificaciones de aminoácidos pueden ser deleciones, adiciones, sustituciones o cualquier combinación de las mismas.
La identidad de secuencias de aminoácidos se determina mediante métodos bien conocidos en la técnica que comparan la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido y generan una alineación de secuencias. Se calcula la identidad de aminoácidos a partir de la alineación mediante el recuento del número de parejas de residuos alineados que presentan aminoácidos idénticos.
Entre los métodos para determinar la identidad de secuencia se encuentran aquellos descritos por Schuler G.D. en: Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Baxevanis A.D. y Ouelette B.F.F., editores, John Wiley & Sons, Inc., 2001; Yona et al., en: Bioinformatics: Sequence, structure and databanks, Higgins D. y Taylor W., editores, Oxford University Press, 2000, y Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D.W., editor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Los métodos para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos se encuentran codificados en programas informáticos públicamente disponibles, tales como GAP (Wisconsin Package versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.), BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-10, 1990) y FASTA (Pearson, Methods in Enzymology 183:63-98, 1990, R.F. Doolittle, editor).
Se determinó la identidad de secuencias entre dos polipéptidos utilizando el programa GAP (Wisconsin Package versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.). GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). GAP considera todas las posibles alineaciones y posiciones de hueco entre dos secuencias y crea una alineación global que maximiza el número de residuos correspondientes y minimiza el número y tamaño de los huecos. Se utiliza una matriz de puntuaciones para asignar valores para las correspondencias de símbolos. Además, resulta necesaria una penalización por creación de hueco y una penalización por extensión de hueco para limitar la inserción de huecos en la alineación. Los parámetros por defecto del programa para las comparaciones entre polipéptidos utilizando GAP son la matriz de puntuaciones de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992) (MATrix=blosum62.cmp), un parámetro de creación de hueco (GAPweight=8) y un parámetro de extensión de hueco (LENgthweight=2).
Los polipéptidos Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC más preferidos, además de ser sustancialmente similares a la secuencia SEC ID nº 1 en toda su longitud, producen regiones NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B individuales que son sustancialmente similares a las regiones correspondientes presentes en la secuencia SEC ID nº 1. Las regiones correspondientes en la secuencia SEC ID nº 1 se proporcionan a continuación: aminoácidos 1 a 632 de Met-NS3, aminoácidos 633 a 686 de NS4A, aminoácidos 687 a 947 de NS4B, aminoácidos 948 a 1.394 de NS5A y aminoácidos 1.395 a 1.985 de NS5B.
Una región NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B presenta una identidad de aminoácidos respecto a la región correspondiente en la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 65%, por lo menos 75%, por lo menos 85%, por lo menos 95%, por lo menos 99% o del 100%, o una diferencia de aminoácidos de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19 ó 1-20 aminoácidos, con la condición de que la identidad global de la secuencia sea de por lo menos 85% respecto a la secuencia SEC ID nº 1.
Las modificaciones de aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 1 preferentemente mantienen o la totalidad o la mayoría de las regiones antigénicas de las células T. Las diferencias en los aminoácidos naturales se deben a diferentes cadenas laterales de aminoácidos (grupos R). Un grupo R afecta a diferentes propiedades del aminoácido, tales como el tamaño físico, la carga y la hidrofobicidad. Los aminoácidos pueden clasificarse de la manera siguiente: neutros e hidrofóbicos (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina), neutros y polares (glicina, serina, treonina, tirosina, cisteína, asparagina y glutamina), básicos (lisina, arginina e histidina) y ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico).
Generalmente, al sustituir diferentes aminoácidos, resulta preferido intercambiar aminoácidos que presenten propiedades similares. La sustitución de diferentes aminoácidos dentro de un grupo particular, tal como la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina y asparagina por glutamina, forma buenos candidatos para no provocar un cambio de la estructura terciaria del polipéptido.
Partiendo de una secuencia particular de aminoácidos y la conocida degeneración del código genético, puede obtenerse un gran número de diferentes secuencias de ácidos nucleicos codificantes. La degeneración del código genético surge debido a que prácticamente la totalidad de los aminoácidos se encuentran codificados por diferentes combinaciones de tripletes de nucleótidos, o "codones". La traducción de un codón particular en un aminoácido particular es bien conocida de la técnica (ver, por ejemplo, Lewin, Genes IV, página 119, Oxford University Press, 1990). Los aminoácidos se encuentran codificados por codones de la manera siguiente:
A=Ala=Alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU
C=Cys=Cisteína: codones UGC, UGU
D=Asp=Ácido aspártico: codones GAC, GAU
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E=Glu=Ácido glutámico: codones GAA, GAG
F=Phe=Fenilalanina: codones UUC, UUU
G=Gly=Glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU
H=His=Histidina: codones CAC, CAU
I=Ile=Isoleucina: codones AUA, AUC, AUU
K=Lys=Lisina: codones AAA, AAG
L=Leu=Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M=Met=Metionina: codón AUG
N=Asn=Asparagina: codones AAC, AAU
P=Pro=Prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU
Q=Gln=Glutamina: codones CAA, CAG
R=Arg=Arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S=Ser=Serina: codones AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T=Thr=Treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU
V=Val=Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU
W=Trp=Triptófano: codón UGG
Y=Tyr=Tirosina: codones UAC, UAU.
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Las secuencias de ácidos nucleicos pueden optimizarse en un esfuerzo por incrementar la expresión en un huésped. Entre los factores que deben considerarse se incluyen: contenido de C:G, codones preferidos y la evitación de la estructura secundaria inhibidora. Estos factores pueden combinarse de diferentes maneras en un intento por obtener secuencias de ácidos nucleicos que presenten una expresión incrementada en un huésped particular (ver, por ejemplo, Donnelly et al., publicación internacional WO 97/47358).
La capacidad de una secuencia particular de presentar una expresión incrementada en un huésped particular implica cierta experimentación empírica. Esta experimentación implica medir la expresión de una secuencia prospectiva de ácidos nucleicos y, en caso necesario, alterar la secuencia.
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B. Secuencias de nucleótidos codificantes
Las secuencias SEC ID nº 2 y 3 proporcionan dos ejemplos de secuencias de nucleótidos codificantes de una secuencia met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. La secuencia codificante SEC ID nº 2 es similar (identidad de secuencia de nucleótidos de 99,4%) a la región NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la secuencia VHC-BK natural (número de acceso GenBank M58335). La secuencia SEC ID nº 3 es una versión de codones optimizados de la secuencia SEC ID nº 2. Las secuencias SEC ID nº 2 y 3 presentan una identidad de secuencia de nucleótidos de 78,3%.
Entre las diferencias entre el nucleótido VHC-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B (número de acceso GenBank M58335) y la secuencia SEC ID nº 2 se incluyen la secuencia SEC ID nº 2 que presenta un sitio de unión ribosómica, un codón de ATG de metionina, una región codificante de un dominio catalítico NS5B modificado, una señal de parada TAAA y una diferencia adicional de 30 nucleótidos. El dominio catalítico modificado codifica AlaAlaGly (residuos 1.711 a 1.713) en lugar de GlyAspAsp para inactivar NS5B.
Una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC preferentemente es sustancialmente similar a la región codificante SEC ID nº 2. La secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC presenta una identidad de secuencia de nucleótidos respecto a la región codificante de SEC ID nº 2 de por lo menos 65%, de por lo menos 75%, de por lo menos 85%, de por lo menos 95%, de por lo menos 99% o del 100%, o difiere de la secuencia SEC ID nº 2 en 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ó 1-50 nucleótidos.
Las diferencias de nucleótidos entre una secuencia codificante de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B y la región codificante de la secuencia SEC ID nº 2 se calculan determinando el número mínimo de modificaciones de nucleótidos en que difieren las dos secuencias. Las modificaciones de nucleótidos pueden ser deleciones, adiciones, sustituciones o cualquier combinación de las mismas.
La identidad de secuencia de nucleótidos se determina mediante métodos bien conocidos en la técnica que comparan la secuencia de nucleótidos de una secuencia con la secuencia de nucleótidos de una segunda secuencia y generan una alineación de las secuencias. La identidad de secuencia se determina a partir de la alineación mediante el recuento del número de posiciones alineadas que presentan nucleótidos iguales.
Entre los métodos para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos entre dos polinucleótidos se incluyen aquellos descritos por Schuler, en: Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Baxevanis A.D. y Ouelette B.F.F., editores, John Wiley & Sons, Inc., 2001; Yona et al., en: Bioinformatics: Sequence, structure and databanks, Higgins D. y Taylor W., editores, Oxford University Press, 2000; y Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D.W., editor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Los métodos para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos se encuentran codificados en programas informáticos disponibles públicamente, tales como GAP (Wisconsin Package versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.), BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-10, 1990) y FASTA (Pearson W.R., Methods in Enzymology 183:63-98, 1990, R.F. Doolittle, editor).
La identidad de secuencia entre dos polinucleótidos se determina mediante la aplicación de GAP (Wisconsin Package versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.). GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). GAP considera todas las posibles alineaciones y posiciones de hueco entre dos secuencias y crea una alineación global que maximiza el número de residuos correspondientes y minimiza el número y tamaño de los huecos. Se utiliza una matriz de puntuaciones para asignar valores para las correspondencias de símbolos. Además, resulta necesaria una penalización por creación de hueco y una penalización por extensión de hueco para limitar la inserción de huecos en la alineación. Son parámetros por defecto del programa para las comparaciones entre polinucleótidos utilizando GAP, la matriz de puntuaciones nwsgapdna.cmp (MATrix=nwsgapdna.cmp), un parámetro de creación de hueco (GAPweight=50) y un parámetro de extensión de hueco (LENgthweight=3).
Las secuencias de nucleótidos de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC más preferentes, además de ser sustancialmente similares a lo largo de su longitud completa, producen regiones NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B individuales que son sustancialmente similares a las regiones correspondientes presentes en la secuencia SEC ID nº 2. Las regiones codificantes correspondientes en la secuencia SEC ID nº 2 se proporcionan a continuación: Met-NS3, nucleótidos 7 a 1.902; NS4A, nucleótidos 1.903 a 2.064; NS4B, nucleótidos 2.065 a 2.847; NS5A, nucleótidos 2.848 a 4.188; NS5B, nucleótidos 4.189 a 5.661.
Una región codificante de NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B presenta una identidad de secuencia de nucleótidos respecto a la región correspondiente en la secuencia SEC ID nº 2 de por lo menos 65%, de por lo menos 75%, de por lo menos 85%, de por lo menos 95%, de por lo menos 99% o del 100%, o una diferencia de nucleótidos respecto a la secuencia SEC ID nº 2 de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ó 1-50 nucleótidos, con la condición de que la identidad de secuencia global respecto a la secuencia SEC ID nº 2 sea de por lo menos 65%.
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C. Casetes de expresión génica
Un casete de expresión génica contiene elementos necesarios para la expresión polipeptídica. La referencia al término "polipéptido" no proporciona una limitación de tamaño e incluye "proteína". Entre los elementos reguladores presentes en un casete de expresión génica generalmente se incluyen: (a) un promotor transcripcionalmente acoplado a una secuencia de nucleótidos codificante del polinucleótido, (b) un sitio de unión ribosómica 5' funcionalmente acoplado a la secuencia de nucleótidos, (c) un terminador unido al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos, y (d) una señal de poliadenilación 3' funcionalmente acoplada a la secuencia de nucleótidos. También pueden encontrarse presentes elementos reguladores adicionales que resultan útiles para incrementar o regular la expresión génica o el procesamiento de polipéptidos.
Los promotores son elementos genéticos reconocidos por una ARN polimerasa y que median en la transcripción de regiones situadas cadena abajo. Los promotores preferidos son los promotores fuertes que proporcionan niveles incrementados de transcripción. Son ejemplos de promotores fuertes el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV), y el intrón A del CMV (Chapman et al., Nucl. Acids Res. 19:3979-3986, 1991). Entre los ejemplos adicionales de promotores se incluyen los promotores naturales, tales como el promotor alfa EF1, el promotor del CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, y los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de la \beta-actina, y promotores artificiales, tales como un promotor sintético específico de músculo y un promotor quimérico específico de músculo/de CMV (Li et al., Nat. Biotechnol. 17:241-245, 1999; Hagstrom et al., Blood 95:2536-2542, 2000).
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El sitio de unión ribosómica se encuentra situado en el codón de inicio o en una posición próxima al mismo. Entre los ejemplos de sitios de unión ribosómica preferidos se incluyen CCACCAUGG, CCGCCAUGG y ACCAUGG, en los que AUG es el codón de inicio (Kozak, Cell 44:283-292, 1986). Otro ejemplo de un sitio de unión ribosómica es GCCACCAUGG (SEC ID nº 12).
La señal de poliadenilación es responsable de cortar el ARN transcrito y de la adición de una cola poli(A) al ARN. La señal de poliadenilación en eucariotas superiores contiene una secuencia AAUAAA situada a una distancia aproximada de entre 11 y 30 nucleótidos del sitio de adición de poliadenilación. La secuencia AAUAAA se encuentra implicada en la señalización del corte del ARN (Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY, 1990). La cola poli(A) resulta importante para el procesamiento del ARNm.
Entre las señales de poliadenilación que pueden utilizarse como parte de un casete de expresión génica se incluyen la señal mínima de poliadenilación de la \beta-globina de conejo y la poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH, Xu et al., Gene 272:149-156, 2001; Post et al., patente US nº 5.122.458). Entre los ejemplos adicionales se incluyen la señal sintética de poliadenilación (SPA) y la señal de poliadenilación de SV40. La secuencia de SPA es la siguiente: AAUAAAAGAUCUUUAUUUUCAUUAGAUCUGUGUGUUGG UUUUUUGUGUG (SEC ID nº 13).
Entre los ejemplos de elementos reguladores adicionales que pueden encontrarse presentes que resultan útiles para incrementar o regular la expresión génica o el procesamiento de los polipéptidos se incluyen un intensificador, una secuencia líder y un operador. Una región de intensificador incrementa la transcripción. Entre los ejemplos de regiones intensificadoras se incluyen el intensificador de CMV y el intensificado de SV40 (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995; Xu et al., Gene 272:149-156, 2001). Una región intensificadora puede encontrarse asociada a un promotor.
Una secuencia líder es una región de aminoácidos en un polipéptido que dirige al polipéptido hacia el interior del proteasoma. El ácido nucleico codificante de la secuencia líder se encuentra situado 5' respecto a un gen estructural y se transcribe conjuntamente con el gen estructural. Un ejemplo de una secuencia líder es tPA.
Puede utilizarse una secuencia de operador para regular la expresión génica. Por ejemplo, la secuencia del operador Tet puede utilizarse para reprimir la expresión génica.
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II. Vectores terapéuticos
El ácido nucleico codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B según la invención puede introducirse en un paciente utilizando vectores adecuados para la administración terapéutica. Los vectores adecuados pueden administrar un ácido nucleico en una célula diana sin provocar un efecto secundario inaceptable.
La expresión celular se consigue utilizando un casete de expresión génica codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención. El casete de expresión génica contiene elementos reguladores para producir y procesar una cantidad suficiente de ácido nucleico en el interior de una célula diana para conseguir un efecto beneficioso.
Entre los ejemplos de vectores que pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas se incluyen adenovectores de primera y segunda generación, adenovectores dependientes de ayudante, vectores víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores de virus alfa, vector del virus de la encefalitis equina venezolana, y vectores plásmido (Hitt et al., Advances in Pharmacology 40:137-206, 1997; Johnston et al., patente US nº 6.156.588, y Johnston et al., publicación internacional WO 95/32733).
Los vectores preferidos para introducir un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención en un sujeto son vectores adenovíricos de primera generación y vectores plásmido de ADN.
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A. Adenovectores de primera generación
El adenovector de primera generación para expresar un casete de expresión génica contiene el casete de expresión en un genoma de adenovirus recombinante con deleción de E1 y opcionalmente de E3. La deleción en la región E1 es suficientemente grande para eliminar elementos necesarios para la replicación adenovírica.
Los adenovectores de primera generación para expresar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención contienen un genoma de adenovirus recombinante con deleción en E1 y en E3. La deleción en la región E1 es suficientemente grande para eliminar los elementos necesarios para la replicación adenovírica. Las combinaciones de deleciones en las regiones E1 y E3 son suficientemente grandes para permitir la inserción de un casete de expresión génica codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención.
El adenovirus presenta un genoma lineal de doble cadena con repeticiones terminales invertidas en ambos extremos. Durante la replicación vírica, el genoma se empaqueta en el interior de una cápside vírica para formar un virión. El virus entra en la célula diana mediante unión vírica seguido de internalización (Hitt et al., Advances in Pharmacology 40:137-206, 1997).
Los adenovectores pueden basarse en diferentes serotipos de adenovirus, tales como los que se encuentran en el ser humano o en animales. Entre los ejemplos de adenovirus animales se incluyen los bovinos, porcinos, de chimpancé, murinos, caninos y aviares (CELO). Los adenovectores preferidos se basan en serotipos humanos, más preferentemente en los serotipos de grupo B, C o D. Entre los ejemplos de adenovirus humanos de serotipos de grupo B, C, D o E se incluyen los tipos 2 ("Ad2"), 4 ("Ad4"), 5 ("Ad5"), 6 ("Ad6"), 24 ("Ad24"), 26 ("Ad26"), 34 ("Ad34") y 35 ("Ad35"). Los adenovectores pueden contener regiones de un único adenovirus o de dos o más adenovirus.
Los adenovectores se basan en Ad5, Ad6 o en una combinación de los mismos. Ad5 se describe en Chroboczek et al., J. Virology 186:280-285, 1992. Ad6 se describe en las figuras 7A-7N. Se describe un vector basado en Ad6 que contiene regiones de Ad5 en la sección de Ejemplos, proporcionada posteriormente.
No resulta necesario que se eliminen por completo de los adenovectores sus regiones E1 y E3. Por el contrario, se elimina una cantidad suficiente de la región E1 para que el vector resulte de replicación incompetente en ausencia de un suministro de proteínas E1 en trans, y la deleción en E1 o la combinación de deleciones en E1 y E3, resulte suficientemente grande para permitir la inserción de un casete de expresión génica.
Las deleciones en E1 pueden obtenerse partiendo de aproximadamente el par de bases 342, subiendo hasta aproximadamente el par de bases 3.523 de Ad5, o una región correspondiente de otros adenovirus. Preferentemente, la región delecionada implica eliminar una región entre aproximadamente el par de bases 450 y aproximadamente el par de bases 3.511 de Ad5, o una región correspondiente de otros adenovirus. Las deleciones más grandes en la región E1 partiendo de aproximadamente el par de bases 341 eliminan elementos que facilitan el empaquetamiento del virus.
Las deleciones en E3 pueden obtenerse partiendo de aproximadamente el par de bases 27.865 hasta aproximadamente el par de bases 30.995 de Ad5, o la región correspondiente de otros adenovectores. Preferentemente la región de deleción implica eliminar una región entre aproximadamente el par de bases 28.134 y aproximadamente el par de bases 30.817 de Ad5, o la región correspondiente de otros adenovectores.
La combinación de deleciones en la región E1 y opcionalmente en la región E3 debería resultar suficientemente grande para que el tamaño global del genoma recombinante que contiene el casete de expresión génica no exceda aproximadamente 105% del genoma del adenovirus de tipo salvaje. Por ejemplo, a medida que los genomas de Ad5 adenovíricos recombinantes se incrementan de tamaño por encima de aproximadamente 105%, el genoma se convierte en inestable (Bett et al., Journal of Virology 67:5911-5921, 1993).
Preferentemente, el tamaño del genoma de adenovirus recombinante que contiene el casete de expresión génica presenta un tamaño entre aproximadamente 85% y aproximadamente 105% del tamaño del genoma del adenovirus de tipo salvaje. El tamaño del genoma de adenovirus recombinante que contiene el casete de expresión es de entre aproximadamente 100% y aproximadamente 105,2%, o aproximadamente 100%, del tamaño del genoma de tipo salvaje.
Pueden insertarse aproximadamente 7.500 kb en un genoma de adenovirus con una deleción en E1 y en E3. Sin ninguna deleción, el genoma de Ad5 presenta 35.935 pares de bases, y el genoma de AD6 presenta 35.759 pares de bases.
La replicación de los adenovectores de primera generación puede llevarse a cabo suministrando los productos del gen E1 en trans. El producto génico E1 puede suministrarse en trans, por ejemplo mediante la utilización de líneas celulares que han sido transformadas con la región E1 adenovírica. Son ejemplos de células y líneas celulares transformadas con la región E1 adenovírica, las células HEK 293, las células 911, las células PERC.6^{TM} y aminocitos humanos primarios transfectados (Graham et al., Journal of Virology 36:59-72, 1977; Schiedner et al., Human Gene Therapy 11:2105-2116, 2000; Fallaux et al., Human Gene Therapy 9:1909-1917, 1998; Bout et al., patente US nº 6.033.908).
Debería insertarse un casete de expresión Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B en un genoma de adenovirus recombinante en la región correspondiente a la región E1 delecionada o a la región E3 delecionada. El casete de expresión puede presentar una orientación paralela o antiparalela. En una orientación paralela, la dirección de transcripción del gen insertado es la misma dirección que el gen E1 o E3 delecionado. En una transcripción en orientación antiparalela, la cadena contraria actúa como molde y la dirección de transcripción es la dirección contraria.
En una forma de realización de la presente invención, el adenovector presenta una inserción de un casete de expresión génica en la región E1 que presenta una deleción. El vector contiene:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6,
b)
un casete de expresión génica en una orientación paralela a E1 o antiparalela a E1, unido a la primera región,
c)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unida al casete de expresión,
d)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a la segunda región,
e)
una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unida a la tercera región; y
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a la cuarta región.
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En otra forma de realización de la presente invención el adenovector presenta un casete de expresión insertado en la región E3 con deleción. El vector contiene:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o Ad6,
b)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unida a la primera región,
c)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a la segunda región,
d)
un casete de expresión génica en una orientación paralela a E3 o antiparalela a E3, unido a la tercera región,
e)
una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unida al casete de expresión génica, y
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a la cuarta región.
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En diferentes formas de realización preferidas referidas a regiones adenovíricas que se encuentran presentes: (1) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad5, (2) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad6, y (3) la primera región corresponde a Ad5, la segunda región corresponde a Ad5, la tercera región corresponde a Ad6, la cuarta región corresponde a Ad6, y la quinta región corresponde a Ad5.
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B. Vectores plásmido de ADN
Los vectores plásmido de vacuna de ADN contienen un casete de expresión génica conjuntamente con elementos que facilitan la replicación y preferentemente la selección del vector. Los elementos preferentes permiten la replicación en células no de mamífero y proporcionan un marcador seleccionable.
Los vectores no deben contener elementos que permitan la replicación en células humanas o la integración en ácidos nucleicos humanos.
El marcador seleccionable facilita la selección de los ácidos nucleicos que contienen el marcador. Son marcadores seleccionables preferidos los que proporcionan resistencia a antibióticos. Entre los ejemplos de genes de selección con antibióticos se incluyen los ácidos nucleicos que codifican resistencia a ampicilina, a neomicina y a canamicina.
Pueden producirse vectores de vacuna de ADN adecuados partiendo de un plásmido que contenga un origen bacteriano de replicación y un marcador seleccionable. Entre los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación que proporcionan rendimientos más altos se incluyen el origen bacteriano de replicación derivado del plásmido ColE1 (Donnelly et al., Annu. Rev. Immunol. 15:617-648, 1997).
La presencia del origen bacteriano de replicación y del marcador seleccionable permite la producción del vector de ADN en una cepa bacteriana tal como E. coli. El marcador seleccionable se utiliza para eliminar bacterias que no contienen el vector de ADN.
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III. Ácido nucleico recombinante AD6
El ácido nucleico recombinante Ad6 comprende una región de Ad6 sustancialmente similar a una región de Ad6 presente en la secuencia SEC ID nº 8, y una región no presente en el ácido nucleico de Ad6. El ácido nucleico recombinante que comprende regiones de Ad6 presentan diferentes usos, tales como en la producción de diferentes regiones de Ad6, como intermediarios en la producción de vectores basados en Ad6, y como vector para la administración de un gen recombinante.
Tal como se ilustra en la figura 9, la organización genómica de Ad6 es muy similar a la organización genómica de Ad5. La homología entre Ad5 y Ad6 es aproximadamente del 98%.
El ácido nucleico recombinante Ad6 comprende una región de nucleótidos sustancialmente similar a E1A, E1B, E2B, E2A, E3, E4, L1, L2, L3 o L4, o cualquier combinación de los mismos. Una región de ácido nucleico sustancialmente similar a una región de Ad6 presenta una identidad de secuencia de nucleótidos de por lo menos 65%, de por lo menos 75%, de por lo menos 85%, de por lo menos 95%, de por lo menos 99% o del 100%, o una diferencia de nucleótidos de 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ó 1-50 nucleótidos. Se describen técnicas para determinar secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares en la Sección I.B., supra.
El ácido nucleico Ad6 recombinante contiene un casete de expresión codificante de un polipéptido de la
invención.
Pueden producirse diferentes tipos de vectores adenovíricos que incorporen diferentes cantidades de Ad6, tales como adenovectores de primera y segunda generación. Tal como se indica en la Sección II.A., supra, los adenovectores de primera generación son defectivos en E1 y pueden replicarse al suministrar E1 en trans.
Los adenovectores de segunda generación contienen menos genoma adenovírico que los vectores de primera generación y pueden utilizarse en conjugación con líneas celulares complementarias y/o vectores adyuvantes que suministren proteínas adenovíricas. Los adenovectores de segunda generación se describen en diferentes referencias, tales como Russell, Journal of General Virology 81:2573-2604, 2000; Hitt et al., Human Ad vectors for Gene Transfer, Advances in Pharmacology, vol. 40, Academic Press, 1997.
El ácido nucleico Ad6 recombinante es un vector adenovirus defectivo en E1 que es que puede replicarse al suministrar E1 en trans. Pueden insertarse casetes de expresión en una región E1 delecionada y/o en una región E3 delecionada.
Un ejemplo de un vector adenovírico basado en Ad6 con un casete de expresión proporcionado en una región E1 delecionada comprende o consta de:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6,
b)
un casete de expresión génica en una orientación paralela a E1 o antiparalela a E1 unido a la primera región,
c)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unida al casete de expresión,
d)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a la segunda región,
e)
una cuarta región opcionalmente presente entre aproximadamente el par de bases 28.134 y aproximadamente el par de bases 30.817, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 28.157 y aproximadamente el par de bases 30.788, correspondiente a Ad6, unida a la tercera región,
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, en la que la quinta región se encuentra unida a la cuarta región en caso de encontrarse presente la cuarta región, o la quinta se une a la tercera región en el caso de que no se encuentre presente la cuarta región, y
g)
una sexta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a la quinta región,
en la que se encuentra presente por lo menos una región de Ad6.
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En diferentes formas de realización de la invención, todas las regiones proceden de Ad6; la totalidad de las regiones excepto la primera y segunda proceden de Ad6, y 1, 2, 3 ó 4 regiones seleccionadas de entre la segunda, tercera, cuarta y quinta regiones proceden de Ad6.
Un ejemplo de un vector adenovírico basado en Ad6 con un casete de expresión proporcionado en una región E3 con deleción comprende o consiste de:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o Ad6,
b)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548 correspondiente a Ad5 o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541 correspondiente a Ad6, unida a la primera región,
c)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a la segunda región,
d)
un casete de expresión génica en una orientación paralela a E3 o antiparalela a E3, unido a la tercera región,
e)
una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unida al casete de expresión génica, y
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, y entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a la cuarta región,
en la que se encuentra presente por lo menos una región Ad6.
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En una forma de realización diferente de la invención, la totalidad de las regiones proceden de Ad6; la totalidad de las regiones excepto la primera y segunda proceden de Ad6; y 1, 2, 3 ó 4 regiones seleccionadas de entre la segunda, tercera, cuarta y quinta regiones proceden de Ad6.
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IV. Producción de vector
Pueden producirse vectores utilizando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, tales como aquéllas que implican la utilización de enzimas de restricción, la ligación de ácidos nucleicos y la recombinación homóloga. Las técnicas de ácidos nucleicos recombinantes son bien conocidas en la técnica (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998, y Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Se utilizan vectores intermediarios para derivar un vector terapéutico o para transferir un casete de expresión o parte del mismo de un vector a otro. Entre los ejemplos de vectores intermediarios se incluyen plásmidos de genoma adenovírico y vectores lanzadera.
Entre los elementos útiles en un vector intermediario se incluyen un origen de replicación, un marcador seleccionable, regiones de recombinación homóloga, y sitios de restricción convenientes. Los sitios de restricción convenientes pueden utilizarse para facilitar la clonación o la liberación de una secuencia de ácidos nucleicos.
Las regiones de recombinación homóloga proporcionan regiones de secuencia de ácidos nucleicos que son homólogas a una región diana en otra molécula de ácidos nucleicos. Las regiones homólogas flanquean la secuencia de ácidos nucleicos que se está insertando en la región diana. En diferentes formas de realización, las regiones homólogas presentan preferentemente una longitud de aproximadamente entre 150 y 600 nucleótidos, o de aproximadamente entre 100 y 500 nucleótidos.
Un vector lanzadera contiene un ácido nucleico Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B, un marcador seleccionable, un origen de replicación bacteriano, una primera región adenovírica de homología y una segunda región homóloga de adenovirus con diana en el casete de expresión para insertarse o sustituir una región E1. Las primera y segunda regiones de homología flanquean el casete de expresión. La primera región de homología contiene por lo menos aproximadamente 100 pares de bases sustancialmente homólogas a por lo menos el extremo derecho (el extremo 3') de una región de adenovirus de tipo salvaje entre aproximadamente las parejas de bases 4 y 450. La segunda homología contiene por lo menos aproximadamente 100 pares de bases sustancialmente homólogas a por lo menos el extremo izquierdo (el extremo 5') de Ad5 entre aproximadamente los pares de bases 3.511 y 5.792, o la región correspondiente de otro adenovirus.
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La expresión "sustancialmente homólogo" indica un grado suficiente de homología para recombinarse específicamente con una región diana. La expresión "sustancialmente homólogo" se refiere a por lo menos 85%, por lo menos 95%, o 100% de identidad de secuencias. La identidad de secuencias puede calcularse tal como se ha descrito en la Sección I.B., supra.
Un método para producir adenovectores es mediante la creación de un plásmido de genoma de adenovirus que contiene un casete de expresión. El plásmido preadenovirus contiene la totalidad de las secuencias adenovíricas necesarias para la replicación en la línea celular complementaria deseada. El plásmido preadenovirus seguidamente se digiere con un enzima de restricción para liberar las ITR víricas y se transfecta en una línea celular complementaria para el rescate del virus. Las ITR deben liberarse de las secuencias de plásmido para permitir que se produzca la replicación. El rescate del adenovector resulta en la producción en un adenovector que contiene el casete de expresión.
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A. Plásmidos de genoma de adenovirus
Los plásmidos de genoma de adenovirus contienen una secuencia de adenovector en el interior de un plásmido de mayor longitud (que puede ser un cósmido). El plásmido de mayor longitud puede contener elementos adicionales, tales como aquellos que facilitan el crecimiento y selección en células eucarióticas o bacterianas, dependiendo del procedimiento utilizado para producir y mantener el plásmido. Entre las técnicas para producir plásmidos de genoma de adenovirus se incluyen aquellos que implican la utilización de vectores lanzadera y la recombinación homóloga, y aquellos que implican la inserción de un casete de expresión génica en un cósmido adenovirus (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995; Danthinne et al., Gene Therapy 7:1707-1714, 2000).
Los plásmidos de genoma de adenovirus preferentemente presentan un casete de expresión génica insertado en una región con una deleción de E1 o de E3. El plásmido de genoma de adenovirus contiene un casete de expresión génica insertado en la región con deleción de E1, un origen de replicación, un marcador seleccionable, y la región de adenovirus recombinante está constituida por:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6,
b)
un casete de expresión génica en una orientación paralela a E1 o antiparalela a E1 unido a la primera región,
c)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unido al casete de expresión,
d)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unido a la segunda región,
e)
una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5 o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unido a la tercera región,
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unido a la cuarta región, y
g)
una región E3 opcionalmente presente correspondiente a la totalidad o parte de la región E3 presente en Ad5 o en Ad6, que puede encontrarse presente para inserciones más pequeñas considerando el tamaño global del adenovector deseado.
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En otro ejemplo, el plásmido de genoma de adenovirus recombinante presenta el casete de expresión génica insertado en la región con deleción de E3. El vector contiene un origen de replicación, un marcador seleccionable, y lo siguiente:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6,
b)
una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unido al casete de expresión,
c)
una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unido a la segunda región,
d)
el casete de expresión génica en una orientación paralela a E3 o antiparalela a E3 unido a la tercera región,
e)
una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unido al casete de expresión génica, y
f)
una quinta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 33.967 y aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unido a la cuarta región.
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En diferentes ejemplos referentes a regiones adenovíricas que se encuentran presentes: (1) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad5, (2) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad6, y (3) la primera región corresponde a Ad5, la segunda región corresponde a Ad5, la tercera región corresponde a Ad6, la cuarta región corresponde a Ad6 y la quinta región corresponde a Ad5.
Un ejemplo describe un método para preparar un adenovector que implica una etapa de recombinación homóloga para producir un plásmido de genoma adenovírico y una etapa de rescate de adenovirus. La etapa de recombinación homóloga implica la utilización de un vector lanzadera que contiene un ácido nucleico Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención flanqueado por regiones de homología de adenovirus. Las regiones de homología de adenovirus dirigen el casete de expresión insertándolo en la región E1 o E3 con deleción.
En un ejemplo referente a la producción de un plásmido de genoma de adenovirus, el ácido nucleico de la invención se inserta en un vector que comprende una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 y aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6; una segunda región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 3.511 y aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 3.508 y aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unido a la segunda región; una tercera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 5.549 y aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 5.542 y aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unido a la segunda región; una cuarta región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 30.818 y aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 30.789 y aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unido a la tercera región; y una quinta región adenovírica entre aproximadamente 33.967 y aproximadamente 35.935, correspondiente a Ad5, o entre aproximadamente el par de bases 33.785 y aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unido a la cuarta región. El plásmido de genoma de adenovirus debe contener un origen de replicación y un marcador seleccionable, y puede contener la totalidad o parte de la región E3 de Ad5 o de Ad6.
En diferentes ejemplos referentes a regiones adenovíricas que se encuentran presentes: (1) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad5, (2) la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta regiones corresponden a Ad6, y (3) la primera región corresponde a Ad5, la segunda región corresponde a Ad5, la tercera región corresponde a Ad6, la cuarta región corresponde a Ad6, y la quinta región corresponde a Ad5.
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B. Rescate del adenovector
Puede rescatarse un adenovector de un plásmido de genoma de adenovirus recombinante utilizando técnicas conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria. Se proporcionan ejemplos de técnicas bien conocidas en la técnica para el rescate de adenovectores en Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7:13-30, 1995, y en Danthinne et al., Gene Therapy 7:1707-1714, 2000.
Un método preferido de rescate de adenovectores descrito en la presente memoria implica reforzar la replicación adenovírica. El refuerzo de la replicación adenovírica puede llevarse a cabo, por ejemplo, suministrando funciones adenovíricas tales como proteínas E2 (polimerasa, proteína preterminal y proteína de unión a ADN), así como E4 orf6 en un plásmido separado. El Ejemplo 10, infra, ilustra el refuerzo de la replicación adenovírica para rescatar un adenovector que contiene un ácido nucleico Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención de codones optimizados.
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V. Secuencias codificantes de VHC parcialmente optimizadas
La optimización parcial de ácido nucleico codificante de poliproteína de VHC proporciona una cantidad inferior de codones optimizados para la expresión en un ser humano que la optimización completa. El objetivo global consiste en proporcionar los beneficios de una expresión incrementada debido a la optimización de los codones, facilitando simultáneamente la producción de un adenovector que contiene ácido nucleico codificante de poliproteína de VHC que presenta codones optimizados.
La optimización completa de una secuencia codificante de poliproteína de VHC proporciona el codón humano más frecuentemente observado para cada aminoácido. La optimización completa puede llevarse a cabo utilizando tablas de frecuencias de codones bien conocidas en la técnica, y utilizando programas tales como el programa BACKTRANSLATE (Wisconsin Package versión 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wisc.).
La optimización parcial puede llevarse a cabo en una secuencia codificante de poliproteína de VHC entera que se encuentra presente (por ejemplo NS3-NS5B) o una o más regiones locales que se encuentran presentes. En diferentes formas de realización, el contenido de GC para la poliproteína codificada de VHC entera que se encuentra presente no es superior a por lo menos aproximadamente 65%, y el contenido de GC para una o más regiones locales no es superior a aproximadamente 70%.
Las regiones locales son regiones presentes en el ácido nucleico codificante del VHC y pueden presentar diferentes tamaños. Por ejemplo, las regiones locales pueden presentar una longitud de aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 nucleótidos.
La optimización parcial puede llevarse a cabo mediante la construcción inicial de una secuencia codificante de poliproteína de VHC que debe optimizarse parcialmente basada en una secuencia natural. Alternativamente, puede utilizarse una secuencia codificante de VHC optimizada como base para las comparaciones para producir una secuencia parcialmente optimizada.
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VI. Tratamiento combinado de VHC
Puede utilizarse la vacuna Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B del VHC por sí sola para tratar un paciente, conjuntamente con otros terapéuticos de VHC, y puede utilizarse conjuntamente con agentes con diana en otros tipos de enfermedad. Entre los terapéuticos adicionales se incluyen agentes terapéuticos adicionales para tratar el VHC y enfermedades que presentan una prevalencia elevada en personas infectadas por el VHC. Entre los agentes con diana en otros tipos de enfermedad se incluyen vacunas dirigidas contra VIH y VHB.
Entre los terapéuticos adicionales para tratar el VHC se incluyen vacunas y agentes no de vacuna (Zein, Expert Opin. Investig. Drugs 10:1457-1469, 2001). Entre los ejemplos de vacunas de VHC adicionales se incluyen vacunas concebidas para inducir una respuesta inmunológica contra un antígeno nuclear del VHC y la región E1, E2 o p7 del VHC. Los componentes de vacuna puede ser polipéptidos del VHC naturales, polipéptidos mimotopos del VHC o ácidos nucleicos codificantes de dichos polipéptidos.
Los polipéptidos mimotopos del VHC contienen epítopos de VHC, aunque presentan una secuencia diferente de la del antígeno de VHC natural. Puede fusionarse un mimotopo de VHC con un antígeno del VHC natural. Las referencias que describen técnicas para producir mimotopos en general y que describen diferentes mimotopos de VHC se proporcionan en Felici et al., patente US nº 5.994.083 y en Nicosia et al., solicitud de patente internacional nº WO 99/60132.
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VII. Administración farmacéutica
Las vacunas del VHC pueden formularse y administrarse en un paciente utilizando las guías proporcionadas en la presente memoria conjuntamente con técnicas bien conocidas en la técnica. Las guías para la administración farmacéutica en general se proporcionan en, por ejemplo, Modern Vaccinology, editor Kurstak, Plenum Med. Co., 1994; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, editor Gennaro, Mack Publishing, 1990; y Modern Pharmaceutics 2nd Edition, editores Banker y Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia.
Las vacunas del VHC pueden administrarse mediante diferentes vías, tales como intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intradérmica, la impresión a través de la piel, o la vía nasal. Una vía preferida es la vía intramuscular.
La administración intramuscular puede llevarse a cabo utilizando diferentes técnicas, tales como mediante inyección con o sin utilización de uno o más pulsos eléctricos. La transferencia mediada eléctricamente puede asistir en la inmunización genética mediante la estimulación de repuestas inmunológicas tanto humorales como celulares.
La inyección de vacuna puede llevarse a cabo utilizando diferentes técnicas, tales como la utilización de una aguja o de un sistema de inyección sin aguja. Un ejemplo de un sistema de inyección sin aguja es un dispositivo de inyección por proyección (Donnelly et al., publicación de patente internacional nº WO 99/52463).
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A. Transferencia mediada eléctricamente
La transferencia mediada eléctricamente o electrotransferencia génica (GET) puede llevarse a cabo mediante la administración de pulsos eléctricos adecuados tras la inyección de ácidos nucleicos (ver Mathiesen, publicación de patente internacional WO 98/43702). La inyección de plásmido y la electroporación pueden llevarse a cabo utilizando agujas de acero inoxidable. Pueden utilizarse agujas en parejas, tripletes o en patrones más complejos. En una configuración, las agujas se sueldan sobre una placa de circuitos impresos que es un soporte mecánico que conecta las agujas al generador de campo eléctrico por medio de cables adecuados.
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El estímulo eléctrico se proporciona en forma de pulsos eléctricos. Los pulsos pueden presentar diferentes formas (cuadrados, sinusoidales, triangulares, de caída exponencial) y de diferente polaridad (monopolares de polaridad positiva o negativa, bipolares). Los pulsos pueden administrarse a voltaje constante o en la modalidad de corriente constante.
Pueden utilizarse diferentes patrones de tratamiento eléctrico para introducir vacunas de ácidos nucleicos, incluyendo vacunas de VHC y de otros ácidos nucleicos, en un paciente. Entre los patrones posibles de tratamiento eléctrico se incluyen los siguientes:
Tratamiento 1: 10 trenes de 1.000 pulsos bipolares cuadrados administrados cada dos segundos; duración del pulso: 0,2 ms/fase, frecuencia: 1.000 Hz, modo de voltaje constante: 45 voltios/fase, corriente flotante.
Tratamiento 2: 2 trenes de 100 pulsos bipolares cuadrados administrados cada dos segundos; duración del pulso: 2 ms/fase, frecuencia: 100 Hz, modo de corriente constante: 100 mA/fase, voltaje flotante.
Tratamiento 3: 2 trenes de pulsos bipolares a una duración de pulso de aproximadamente 2 ms/fase, durante un periodo total de aproximadamente 3 segundos, en el que la corriente real que atraviesa el tejido se fija en aproximadamente 50 mA.
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Los pulsos eléctricos se administran mediante un generador de campo eléctrico. Un generador adecuado puede estar compuesto de tres elementos del equipo informático físico independientes ensamblados en un cuerpo común y controlados por un PC portátil que ejecuta el programa de control. El programa controla funciones tanto básicas como accesorias. Los elementos del dispositivo son: (1) generador de señales controlado por un microprocesador, (2) amplificador de potencia, y (3) osciloscopio digital.
El generador de señales administra señales que presentan una frecuencia y forma arbitrarios dentro de un intervalo dado bajo el control del programa informático. El mismo programa presenta un editor interactivo para administrar la forma de onda. El generador presenta un dispositivo limitador de corriente controlado digitalmente (una característica de seguridad para controlar la salida máxima de corriente). El amplificador de potencia puede amplificar la señal generada hasta +/- 150 V. El osciloscopio es digital y es que puede muestrear tanto voltaje como corriente suministrados por el amplificador.
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B. Portadores farmacéuticos
Los portadores farmacéuticamente aceptables facilitan el almacenamiento y la administración de una vacuna en un sujeto. Se describen en la presente memoria ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables. Son bien conocidos en la técnica portadores farmacéuticamente aceptables adicionales.
Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes, tales como un tampón, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, sales y polisorbato. Un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable es el siguiente: tampón TRIS 2,5 a 10 mM, preferentemente tampón TRIS aproximadamente 5 mM, NaCl 25 a 100 mM, preferentemente NaCl 75 mM; sacarosa al 2,5%-10%, preferentemente sacarosa a aproximadamente 5%, MgCl_{2} 0,01-2 mM, y polisorbato 80 al 0,001%-0,01% (derivado vegetal). El pH preferentemente se encuentra comprendido entre 7,0 y 9,0, más preferentemente es de aproximadamente 8,0. Un ejemplo específico de un portador contiene TRIS 5 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5%, MgCl_{2} 1 mM, polisorbato 80 al 0,005% a pH 8,0.
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C. Regímenes de dosificación
Pueden determinarse regímenes de dosificación adecuados considerando la eficacia de una vacuna particular y factores tales como la edad, peso, sexo y estado médico de un paciente; la vía de administración, el efecto deseado, y el número de dosis. La eficacia de una vacuna particular depende de diferentes factores, tales como la capacidad de una vacuna particular de producir polipéptido que se expresa y se procesa en una célula y que se presenta en el contexto de complejos de MHC de clase I y de clase II.
El ácido nucleico codificante de VHC administrado en un paciente puede ser parte de diferentes tipos de vectores, incluyendo vectores víricos tales como adenovectores y vacunas de plásmido de ADN. En diferentes ejemplos referentes a la administración de un plásmido de ADN, se administra aproximadamente 0,1 a 10 mg de plásmido en un paciente, y se administra aproximadamente 1 a 5 mg de plásmido en un paciente. En diferentes ejemplos referentes a la administración de un vector vírico, preferentemente un vector vírico, se administran en un paciente aproximadamente entre 10^{5} y 10^{11} partículas víricas, y se administran en un paciente aproximadamente entre 10^{7} y 10^{10} partículas víricas.
Las vacunas de vector vírico y las vacunas de plásmido de ADN pueden administrarse por sí solas, o pueden formar parte de un régimen de administración de sensibilización y refuerzo. Una inoculación de modalidad mixta de sensibilización y refuerzo implica la sensibilización con una vacuna de ADN y el refuerzo con una vacuna de vector vírico, o la sensibilización con una vacuna de vector vírico y el refuerzo con una vacuna de ADN.
Puede utilizarse la sensibilización múltiple, por ejemplo aproximadamente hasta 2-4 ó más. El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo típicamente puede variar entre aproximadamente cuatro meses y un año, aunque pueden utilizarse otros periodos de tiempo. La utilización de un régimen de sensibilización con una vacuna de ADN puede resultar preferente en situaciones en las que una persona presenta una respuesta inmunológica antiadenovirus preexistente.
Se administran directamente en tejido muscular entre 1x10^{7} y 1x10^{12} partículas, y preferentemente entre aproximadamente 1x10^{10} y 1x10^{11} partículas de adenovector. Tras la vacunación inicial, se lleva a cabo un refuerzo con un adenovector o con una vacuna de ADN.
Alternativamente, la vacunación inicial se lleva a cabo con una vacuna de ADN directamente en el tejido muscular. Tras la vacunación inicial, se lleva a cabo un refuerzo con un adenovector o una vacuna de ADN.
Pueden coadministrarse vectores tales como la interleuquina-12, GM-CSF, B7-1, B7-2, IP10, Mig-1 para reforzar la respuesta inmunológica. Los agentes pueden coadministrarse como proteínas o mediante la utilización de vectores ácidos nucleicos.
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D. Sensibilización-refuerzo heteróloga
La sensibilización-refuerzo heteróloga es una modalidad mixta que implica la utilización de un tipo de vector vírico para la sensibilización y otro tipo de vector vírico para el refuerzo. La sensibilización-refuerzo heterólogo puede implicar vectores relacionados, tales como vectores basados en diferentes serotipos adenovíricos y virus más distantemente relacionados, tales como adenovirus y virus de viruela. La utilización de vectores virus de viruela y adenovirus para proteger los ratones frente al paludismo se ilustra en Gilbert et al., Vaccine 20:1039-1045, 2002.
Algunos ejemplos diferentes referentes a la sensibilización y el refuerzo implican los tipos de vectores siguientes que expresan el polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de la invención: vector Ad5 seguido de vector Ad6; vector Ad6 seguido de vector Ad5; vector Ad5 seguido de vector virus de viruela; vector virus de viruela seguido de vector Ad5; vector Ad6 seguido de vector virus de viruela; y vector virus de viruela seguido de vector Ad6.
El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo típicamente varía entre aproximadamente cuatro meses y un año, aunque pueden utilizarse otras escalas de tiempo. El periodo de tiempo mínimo debe ser suficiente para dejar un reposo inmunológico. Este reposo se realiza durante un periodo de por lo menos 6 meses. La sensibilización puede implicar la sensibilización múltiple con un tipo de vector, tal como 2 a 4 sensibilizaciones.
Los casetes de expresión presentes en un vector virus de viruela deben contener un promotor nativo o derivado del virus de viruela de interés o de otro elemento de virus de viruela. Son bien conocidas en la técnica estrategias para construir y utilizar diferentes tipos de vectores basados en virus de viruela, incluyendo aquéllas basadas en virus Vaccinia, virus Vaccinia modificado, virus de viruela aviar, virus de viruela de mapache, virus Vaccinia Ankara modificado, virus de viruela del canario (tales como ALVAC), virus de viruela de aves de corral, virus de viruela bovina y NYVAC (Moss, Current Topics in Microbiology and Immunology 158:25-38, 1982; Earl et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., editores, New York: Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, 1991:16.16.1-16.16.7; Child et al., Virology 174(2):625-9, 1990; Tartaglia et al., Virology 188:217-232, 1992; patentes US nº 4.603.112, nº 4.722.848, nº 4.769.330, nº 5.110.587, nº 5.174.993, nº 5.185.146, nº 5.266.313, nº 5.505.941, nº 5.863.542 y nº 5.942.235.
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E. Adyuvantes
Las vacunas del VHC pueden formularse con un adyuvante. Los adyuvantes resultan particularmente útiles para las vacunas de plásmido de ADN. Son ejemplos de adyuvantes, alúmina, AlPO_{4}, alhidrogel, lípido A y derivados o variantes de los mismos, adyuvante incompleto de Freund, liposomas neutros, liposomas que contienen la vacuna y citoquinas, copolímeros en bloque no iónicos y quimoquinas.
Pueden utilizarse polímeros en bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polixilpropileno (POP), tales como copolímeros en bloque POE-POP-POE como adyuvante (Newman et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142, 1998). La respuesta inmunológica de un ácido nucleico puede incrementarse mediante la utilización de un copolímero en bloque no iónico en combinación con un surfactante aniónico.
Un ejemplo específico de una formulación adyuvante es una que contiene CRL-1005 (CytRx Research Laboratories), ADN y cloruro de bencilalconio (BAK). La formulación puede prepararse mediante la adición de polímero puro a una solución fría (<5ºC) de ADN de plásmido en PBS utilizando una pipeta de desplazamiento positivo. A continuación, la solución se agita con vórtex para solubilizar el polímero. Tras la solubilización completa del polímero, se obtiene una solución transparente a temperaturas inferiores al punto de turbidez del polímero (\sim6ºC a 7ºC). A continuación, se añadió BAK aproximadamente 4 mM a la solución de ADN/CRL-1005 en PBS, mediante la adición lenta de una solución diluida de BAK disuelta en PBS. La concentración de ADN inicial era aproximadamente de 6 mg/ml antes de la adición de polímero y BAK, y la concentración final de ADN es de aproximadamente 5 mg/ml. Tras la adición de BAK, la formulación se agitó con vórtex extensivamente, mientras que se dejó que la temperatura se incrementarse de -2ºC hasta una temperatura superior al punto de turbidez. A continuación, la formulación se introduce en hielo para reducir la temperatura por debajo del punto de turbidez. A continuación, la formulación se agitó con vórtex, dejando que la temperatura se incrementarse de \sim2ºC a una temperatura superior al punto de turbidez. Se repitió varias veces la operación de enfriamiento y mezcla, dejando que la temperatura se incrementase de \sim2ºC a una temperatura superior al punto de turbidez, hasta que el tamaño de partícula de la formulación es de entre aproximadamente 200 y 500 nm, según medición mediante dispersión lumínica dinámica. A continuación, la formulación se almacenó en hielo hasta que la solución se clarificó, y después se almacenó a -70ºC. Antes de la utilización, se dejó que la formulación se descongelase a temperatura ambiente.
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F. Almacenamiento de la vacuna
Pueden almacenarse vacunas de adenovector y de ADN utilizando diferentes tipos de tampón. Por ejemplo, el tampón A105 indicado en el Ejemplo 9, infra, puede utilizarse para el almacenamiento de vector.
El almacenamiento de ADN puede mejorarse mediante la eliminación o la quelación de iones de metal traza. Pueden utilizarse vectores tales como ácido succínico o málico, y quelantes para incrementar la estabilidad de la vacuna de ADN. Entre los ejemplos de quelantes se incluyen múltiples ligandos de fosfato y el EDTA. La inclusión de secuestradores de radicales libres no reductores, tales como etanol o glicerol, también puede resultar útil para impedir el daño al plásmido de ADN debido a la producción de radicales libres. Además, el tipo de tampón, el pH, la concentración salina, la exposición a la luz, así como el tipo de procedimiento de esterilización utilizado para preparar los viales, puede controlarse en la formulación para optimizar la estabilidad de la vacuna de ADN.
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VII. Ejemplos
A continuación, se proporcionan ejemplos para ilustrar adicionalmente diferentes características de la presente invención. Los ejemplos también ilustran metodología útil para la práctica de la invención.
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Ejemplo 1 Casetes de expresión de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B
Se construyeron diferentes casetes de expresión génica codificantes de NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de VHC en una cepa BK del VHC de subtipo 1b. Las secuencias codificadas presentaban: (1) una secuencia NS5B activa ("NS"), (2) una secuencia NS5B inactiva ("NSmut"), (3) una secuencia de codones optimizados con una secuencia NS5B inactiva ("NSOPTmut"). Los casetes de expresión también contenían un promotor/intensificador de CMV y la señal de poliadenilación de BGH.
La secuencia de nucleótidos de NS (SEC ID nº 5) difiere de la cepa BK de VHC, número de acceso GenBank M58335, en 30 de entre 5.952 nucleótidos. La secuencia de aminoácidos del NS (SEC ID nº 6) difiere de la cepa BK de VHC de genotipo 1b correspondiente en 7 de entre 1.984 aminoácidos. Para permitir el inicio de la traducción, se encuentra presente un codón ATG en el extremo 5' de la secuencia de NS. Una secuencia TGA de terminación se encuentra presente en el extremo 3' de la secuencia de NS.
La secuencia de nucleótidos de NSmut (SEC ID nº 2, figura 2) es similar a la secuencia de NS. Las diferencias entre NSmut y NS incluyen que NSmut presente un sitio NS5B catalítico alterado; un sitio de unión ribosómica óptimo en el extremo 5', y una secuencia de terminación TAAA en el extremo 3'. Las alteraciones de NS5B comprenden las bases 5.138 a 5.146, que codifican los aminoácidos 1.711 a 1.713. Las alteraciones resultan en un cambio de los aminoácidos GlyAspAsp a AlaAlaGly, y crea una forma inactiva de la ARN polimerasa NS5B dependiente de ARN de NS5B.
La secuencia de NSOPTmut (SEC ID nº 3, figura 3) se ha diseñado basándose en la secuencia de aminoácidos codificada por NSmut. La secuencia de aminoácidos de NSmut se tradujo inversamente para formar una secuencia de nucleótidos con el programa BACKTRANSLATE de la GCG (Wisconsin Package versión 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wisc.). Para generar una secuencia de nucleótidos de NSOPTmut en la que cada aminoácido se encuentra codificado por el codón humano más frecuentemente observado correspondiente, se ejecutó el programa seleccionando como parámetro la generación de la secuencia de nucleótidos más probable y especificando la tabla de frecuencias de los codones de genes humanos altamente expresados (human_high.cod) disponible en el paquete de la GCG como esquema de traducción.
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Ejemplo 2 Generación del plásmido pV1Jns con secuencias de NS, NSmut o NSOPTmut
Se generaron y se caracterizaron plásmidos pV1Jns que contenían la secuencia de NS, la secuencia de NSmut o la secuencia de NSOPTmut, de la manera siguiente:
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Plásmido pV1Jns con la secuencia de NS
Se clonó la región codificante Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A y la región codificante Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B de una cepa de tipo BK de VHC (Tomei et al., J. Virol. 67:4017-4026, 1993) en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen), generando los vectores pcD3-5a y pcD3-5b, respectivamente. Se digirió PcD3-5A con HindIII, se generaron extremos romos mediante rellenado con Klenow y se digirió posteriormente con XbaI, generando un fragmento correspondiente a la región codificante de Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A. El fragmento se clonó en pV1Jns-poly, se digirió con BgI II se generaron extremos romos mediante rellenado con Klenow y se digirió posteriormente con XbaI, generando pV1JnsNS3-5A.
El plásmido pV1Jns-poly es un derivado del plásmido pV1JnsA (Montgomery et al., DNA and Cell Biol. 12:777-783, 1993), modificado mediante inserción de un polilínker que contiene sitios de reconocimiento para XbaI, PmeI, PacI en los sitios de restricción únicos BgIII y NotI. Se obtuvo el plásmido pV1Jns con la secuencia de NS (pV1JnsNS3-5B) mediante recombinación homóloga en la cepa bacteriana BJ5183, cotransformando pV1JNS3-5A linearizado con XbaI y digestión con NotI y un fragmento de PCR que contenía aproximadamente 200 pb de NS5A, secuencia codificante de NS5B y aproximadamente 60 pb de la señal de poliadenilación de BGH. El plásmido resultante representa pV1Jns-NS.
El plásmido pV1Jns-NS puede resumirse de la manera siguiente:
Bases
1 a 1.881 de pV1JnsA
adicionalmente
AGCTT
después la secuencia
Met-NS3-NS5B (SEC ID nº 5)
después de la señal de parada
TGA de tipo salvaje
adicionalmente
TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG (SEC ID nº 14)
Bases
1.912 a 4.909 de pV1JnsA
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Plásmido pV1Jns con la secuencia de NSmut
El plásmido V1JnsNS3-5A se modificó en el extremo 5' de la secuencia codificante de NS3 mediante la adición de una secuencia Kozak completa. El plásmido (V1JNS3-5Akozak) se obtuvo mediante recombinación homóloga en la cepa bacteriana BJ5183, cotransformando V1JNS3-5A linearizado mediante digestión con AflII y un fragmento de PCR que contenía la parte proximal del intrón A, el sitio de restricción BgIII, una secuencia de Kozak de inicio de traducción completa y parte de la secuencia codificante de NS3.
El plásmido resultante (V1JNS3-5Akozak) se linearizó mediante digestión con XbaI y se cotransformó en la cepa bacteriana BJ5183 con un fragmento de PCR, que contenía aproximadamente 200 pb de NS5A, la secuencia mutada de NS5B, el terminador de traducción fuerte TAAA y aproximadamente 60 pb de la señal de poliadenilación BGH. El fragmento de PCR se obtuvo mediante ensamblaje de dos fragmentos solapantes de 22 pb, en los que se introdujeron mutaciones mediante los oligonucleótidos utilizados para su amplificación. El plásmido resultante representa pV1Jns-NSmut.
El plásmido pV1Jns-NSmut puede resumirse de la manera siguiente:
Bases
1 a 1.882 de pV1JnsA
después la secuencia
de kozak met-NS3-NS5N(mut) TAAA (SEC ID nº 2)
adicionalmente
TCTAGA
Bases
1.925 a 4.909 de pV1JnsA
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Plásmido pV1Jns con la secuencia NSOPTmut
Se digirieron el gen sintético humano de codones optimizados (NSOPTmut) con NS5B mutado para eliminar la actividad enzimática, una secuencia de Kozak de inicio de traducción completa y un terminador de traducción fuerte, con BamHI y SalI, estando los sitios de restricción presentes en los extremos 5' y 3' del gen. A continuación, se clonó el gen en los sitios de restricción BgIII y SalI, presentes en el polilínker del plásmido pV1JnsA, generando pV1Jns-NSOPTmut.
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El plásmido pV1Jns-NSOPT puede resumirse de la manera siguiente:
Bases
1 a 1.881 de pV1JnsA
adicionalmente
C
después la secuencia
de Kozak met-NS3-NS5N(optmut) TAAA (SEC ID nº 3)
adicionalmente
TTTAAATGTTTAAAC (SEC ID nº 15)
Bases
1.905 a 4.909 de pV1JnsA
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Caracterización de los plásmidos
Se sometió a ensayo la expresión de proteínas de NS del VHC mediante la transfección de células HEK 293 cultivadas en FCS al 10%/DMEM suplementado con L-glutamina (conc. final: 4 mM). Veinticuatro horas antes de la transfección, las células se sembraron en placa en una placa de 35 mm de diámetro de 6 pocillos para alcanzar una confluencia de entre 90% y 95% el día de la transfección. Se cotransfectaron cuarenta nanogramos de ADN de plásmido (previamente evaluado como cantidad de ADN no saturante) con 100 ng de plásmido pRSV-Luc que contenía el gen informador luciferasa bajo el control del promotor del virus del sarcoma de Rous utilizando el reactivo LIPOFECTAMINE 2000. Las células se mantuvieron en un incubador de CO_{2} durante 48 horas a 37ºC.
Se prepararon extractos celulares en tampón de Triton al 1%/TEN. Los extractos se normalizaron para la actividad de luciferasa y se corrieron en dilución en serie en un gel de SDS-acrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a ensayo con anticuerpos dirigidos contra NS3, NS5A y NS5B para evaluar la intensidad de expresión y el corte proteolítico correcto. Se utilizaron células falsamente transfectadas como control negativo. Los resultados de experimentos representativos que sometían a ensayo a pV1JnsNS, pV1JnsNSmut y pV1JnsNSOPTmut se muestran en la figura 12.
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Ejemplo 3 Inmunización de ratones con vectores plásmido de ADN
Se inyectaron los plásmidos de ADN pV1Jns-NS, pV1Jns-NSmut y pV1Jns-NSOPTmut en diferentes cepas de ratón para evaluar su potencial para inducir respuestas inmunológicas anti-VHC. Se inyectaron intramuscularmente 25 ó 50 \mug de ADN en dos cepas diferentes (Balb/C y C57Black6, N=9 a 10), seguido de pulsos eléctricos. Cada animal recibió dos dosis en un intervalo de tres semanas.
Se midió la respuesta inmunológica humoral inducida en ratones C57Black6 contra la proteína NS3 en dos sueros posteriores a la dosificación mediante ELISA en el dominio de proteasa NS3 expresado en bacterias. Los anticuerpos específicos para el antígeno sometido a ensayo se detectaron en animales inmunizados con los tres vectores, con medias geométricas de los títulos (GMT) comprendidas entre 94.000 y 133.000 (Tablas 1 a 3).
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TABLA 1 pV1Jns-NS
1 
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TABLA 2 pV1jns-NSmut
2
TABLA 3 pV1jns-NSOPTmut
3 
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Se midió una respuesta de células T en ratones C57Black6 inmunizados con dos inyecciones intramusculares a intervalos de tres semanas de 25 \mug de plásmido de ADN. Se llevó a cabo un ensayo cuantitativo ELIspot para determinar el número de células T secretoras de IFN\gamma en respuesta a cinco grupos de péptidos 20meros solapantes en diez residuos que comprendían la secuencia NS3-NS5B. Se analizó la respuesta específica de CD8+ en el mismo ensayo, utilizando un péptido 20-mero que comprendía un epítopo de CD8+ para ratones C57Black6 (pep1480).
Se detectaron las células secretoras de IFN\gamma de una manera específica de antígeno utilizando un ensayo ELIspot estándar. La respuesta de células T en ratones C57Black6 inmunizados con dos inyecciones intramusculares a intervalos de tres semanas con 50 \mug de plásmido de ADN se analizaron mediante el mismo ensayo ELIspot, midiendo el número de células T secretoras de IFN\gamma en respuesta a cinco grupos de péptidos 20-meros solapantes en diez residuos que comprendían la secuencia NS3-NS5B.
Se prepararon células de bazo a partir de ratones inmunizados y se resuspendieron en medio R10 (RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, 50 U/ml-50 \mug/ml de penicilina/estreptomicina, Hepes 10 mM, 2-mercaptoetanol 50 \muM). Se recubrieron placas de filtración de 96 pocillos Multiscreen (Millipore nº de cat.
MAIPS4510, Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, MA) con anticuerpo IFN-\gamma de rata antiratón purificado (PharMingen, nº de cat. 18181D, PharmiMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, California 92121-1111 USA). Tras la incubación durante la noche, las placas se lavaron con PBS 1X/Tween al 0,005% y se bloquearon con 250 \mul/pocillo de medio R10.
Se prepararon esplenocitos de ratones inmunizados y se incubaron durante veinticuatro horas en presencia o en ausencia de 10 \muM de péptido a una densidad de 2,5x10^{5}/pocillo o de 5x10^{5}/pocillo. Tras un lavado extensivo (PBS 1X/Tween al 0,005%), se añadió anticuerpo IFN\gamma de rata antiratón biotinilado (PharMingen, nº de cat. 18112D, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, California 92121-1111 USA) y se incubó durante la noche a 4ºC. Para el revelado, se añadió estreptavidina-AKP (PharMingen, nº de cat. 13043E, PharMingen, 10975 Torreyana Road, San Diego, California 92121-111 USA) y solución de revelado 1-Step ^{TM} NBT-BCIP (Pierce, nº de cat. 34042, Pierce, P.O. Box 117, Rockford, IL 61105 USA).
Se utilizaron grupos de péptidos 20-meros solapantes que comprendían la secuencia completa de NS3 a NS5B de la cepa BK de VHC para revelar células T secretoras de IFN\gamma específicas de VHC. De manera similar, se utilizó un único péptido 20-mero que comprendía un epítopo de CD8+ para ratones C57Black6 para detectar la respuesta de CD8. Se muestran datos representativos de grupos de ratones C57Black6 y Balb/C (N=9 a 10) inmunizados con dos inyecciones de 25 ó 50 \mug de vectores plásmido pV1Jns-NS, pV1Jns-NSmut y pV1Jns-NSOPTmut en las figuras 13A y 13B.
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Ejemplo 4 Inmunización de macacos Rhesus
Se inmunizaron macacos Rhesus (N=3) mediante inyección intramuscular de 5 mg de plásmido pV1Jns-NSOPTmut en 7,5 mg/l de CRL1005, cloruro de benzalconio 0,6 mM. Cada animal recibió dos dosis en el músculo deltoides a las 0 y 4 semanas.
Se midió la CMI en diferentes puntos del tiempo mediante una ELISPOT de IFN-\gamma. Este ensayo mide las respuestas de linfocitos T CD8+ y CD4+ específicos de antígenos de VHC, y puede utilizarse para una diversidad de mamíferos, tales como seres humanos, monos Rhesus, ratones y ratas.
La utilización de un péptido específico o de un grupo de péptidos puede simplificar la presentación de antígenos en ensayos de citotoxicidad de CTL, ensayos ELISPOT de interferón gama y ensayos de tinción intracelular interferón-gamma. Los péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de diversas proteínas de VHC (nuclear, E2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) se prepararon para la utilización en dichos ensayos para medir las respuestas inmunológicas en monos Rhesus vacunados con ADN de VHC y con vector adenovirus, así como en seres humanos infectados por VHC. Los péptidos individuales son 20-meros solapantes, desplazados por 10 aminoácidos. Pueden utilizarse grupos grandes de péptidos para detectar una respuesta global contra proteínas del VHC, mientras que pueden utilizarse grupos más pequeños y péptidos individuales para definir la especificidad epitópica de una respuesta.
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Elispot de IFN\gamma
El ensayo ELISPOT de IFN\gamma proporciona una determinación cuantitativa de las respuestas de linfocitos T específicas del VHC. Se diluyen en serie PBMC y se introducen en pocillos de microplaca recubiertos con anticuerpo anti-IFN\gamma de mono Rhesus (MD-1 U-Cytech). Se cultivaron con un grupo de péptidos del VHC durante 20 horas, resultando en la reestimulación de las células precursoras y la secreción de IFN-\gamma. Se eliminaron las células mediante lavado, dejando unido el IFN secretado a los pocillos recubiertos de anticuerpo en áreas concentradas en las que se encontraban enganchadas las células. El IFN capturado se detectó con anticuerpo anti-IFN biotinilado de mono Rhesus (detector Ab de U-Cytech) seguido de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Pharmingen 13043E). La adición de sustrato fosfatasa alcalina insoluble resulta en manchas oscuras en los pocillos en los sitios en los que se encuentran localizadas las células, dejando una mancha por cada célula T que secretaba IFN-\gamma.
El número de manchas por pocillo está directamente relacionado con la frecuencia de precursores de células T específicas de antígeno. Se seleccionó el interferón gamma como la citoquina visualizada en este ensayo (utilizando anticuerpos monoclonales anti-interferón gamma específicos de especie) debido a que es la más común y una de las citoquinas más abundantes sintetizadas y secretadas por los linfocitos T activados. Para este ensayo, se determinó el número de células formadoras de mancha (SFC) por cada millón de PBMC para muestras en presencia y en ausencia (medio de control) de péptidos antígenos. En la Tabla 4 se muestran datos procedentes de monos Rhesus de PBMC de material de la dosificación posterior dos.
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TABLA 4
4
ELISPOT DE IFN\gamma en PBMC de monos Rhesus inmunizados con dos inyecciones de 5 mg de ADN/dosis en OPTIVAX/BAK del plásmido pV1Jns-NSOPTmut. Los datos se expresan como SFC7 por cada 10^{6} PBMC.
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Ejemplo 5 Construcción de plásmidos preadenovirus de Ad6
Se obtuvieron plásmidos preadenovirus de Ad6 de la manera siguiente:
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Construcción de plásmido preadenovirus pAd6 E1^{-}E3^{+}
Se construyó un plásmido preadenovirus basado en Ad6 que puede utilizarse para generar vectores de Ad6 de primera generación aprovechando la extensa identidad de secuencia (aproximadamente del 98%) entre Ad5 y Ad6, o que contienen únicamente regiones Ad6. Se utilizó la recombinación homóloga para clonar secuencias de Ad6 de tipo salvaje en un plásmido bacteriano.
En la figura 10 se ilustra una estrategia general utilizada para recuperar pAd6E1^{-}E3^{+} en forma de plásmido bacteriano que contenga regiones Ad5 y Ad6. La cotransformación de bacterias BJ5183 con ADN vírico de tipo salvaje de Ad6 y un segundo fragmento de ADN denominado casete de ITR de Ad5 resulta en la circularización del genoma vírico mediante recombinación homóloga. El casete de ITR contiene secuencias de los extremos derecho (pb 33.798 a 35.935) e izquierdo (pb 1 a 341 y pb 3.525 a 5.767) del genoma de Ad5 separadas por secuencias de plásmido que contienen un origen bacteriano de replicación y un gen de resistencia a la ampicilina. El casete de ITR contiene una deleción de secuencias de E1 entre las posiciones 342 y 3.524 de Ad5. Las secuencias de Ad5 en el casete de ITR proporcionan regiones de homología con el ADN vírico de Ad6 purificado en las que puede producirse la recombinación.
Se cribaron clones potenciales mediante análisis de restricción y se seleccionó un clon, denominado pAd6E1^{-}E3^{+}. A continuación, se secuenció este clon en su totalidad. El plásmido pAd6E1^{-}E3^{+} contiene las secuencias de Ad5 entre pb 1 y 341, y entre pb 3.525 y 5.548, de Ad6 entre pb 5.542 y 33.784, y de Ad5 entre pb 33.967 y 35.935 (los números de pb se refieren a la secuencia de tipo salvaje tanto para Ad5 como para Ad6). El plásmido pAd6E1^{-}E3^{+} contiene las secuencias codificantes para la totalidad de las proteínas estructurales del virión Ad6, que constituyen su especificidad de serotipo.
En la figura 11 se ilustra una estrategia general utilizada para recuperar pAd6E1^{-}E3^{+} en forma de plásmido bacteriano que contiene regiones de Ad6. La cotransformación de bacterias BJ5183 con ADN vírico de tipo salvaje de Ad6 purificado y un segundo fragmento de ADN denominado casete de ITR de Ad6 resulta en la circularización del genoma vírico mediante recombinación homóloga. El casete de ITR contiene secuencias de los extremos derecho (pb 35.460 a 35.759) e izquierdo (pb 1 a 450 y pb 3.508 a 3.807) del genoma de Ad6 separadas por secuencias de plásmido que contienen un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina. Estos tres segmentos se generan mediante PCR y se clonan secuencialmente en pNEB193, generando pNEBAd6-3 (el casete de ITR). El casete de ITR contiene una deleción de las secuencias de E1 entre Ad5 pb 451 a pb 3.507. Las secuencias de Ad6 en el casete de ITR proporcionan regiones de homología con el ADN vírico de Ad6 purificado en las que puede producirse la recombinación.
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Construcción de plásmidos preadenovirus pAd6 E1^{-}E3^{-}
Se construyeron vectores basados en Ad6 que contenían regiones A5 y con deleción en la región E3, partiendo de regiones Ad5 que contenían pAd6E1^{-}E3^{+}. Se subclonó un subfragmento de 5.322 pb de pAd6E1^{-}E3^{+} que contenía la región E3 (Ad6 pb 25.871 a pb 31.192) en pABS.3, generando pABSAd6E3. A continuación, se realizaron tres deleciones en E3 en dicho plásmido, generando tres nuevos plásmidos: pABSAd6E3 (1,8 kb) (deleción en Ad6 pb 28.602 a pb 30.440), pABSAd6E3 (2,3 kb) (deleción en Ad6 pb 28.157 a pb 30.437) y pABSAd6E3 (2,6 kb) (deleción en Ad6 pb 28.157 a pb 30.788). Seguidamente se utilizó la recombinación bacteriana para la sustitución de las tres deleciones en E3 retornándolas a pAd6E1^{-}E3^{+} y generando los plásmidos de genoma de Ad6 siguientes: pAd6E1^{-}E3^{-} (1,8 kb), pAd6E1^{-}E3^{-} (2,3 kb) y pAd6E1^{-}E3^{-} (2,6 kb).
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Ejemplo 6 Generación de plásmido de genoma de Ad5 con la secuencia de NS
Se digirió un plásmido pcDNA3 (Invitrogen) que contenía la región codificante NS3-NS4A-NS4B-NS5A en los sitios de restricción XmnI y NruI, y el fragmento de ADN que contenía el promotor del CMV, la secuencia codificante NS3-NS4A-NS4B-NS5A y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) se clonó en el sitio de restricción único EcorV del vector lanzadera pDeIE1Spa, generando el vector Sva3-5A.
Se digirió un plásmido pcDNA3 que contenía la región codificante NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B con XmnI y EcorI (digestión parcial) y el fragmento de ADN que contenía parte de los genes NS5A y NS5B y la señal de poliadenilación BGH se clonó en el vector Sva3-5A, se digirió con EcorI y BglII, y se generaron extremos romos con Klenow, generando el vector Sva3-5B.
El vector Sva3-5B finalmente se digirió en los sitios de restricción SspI y Bst1107I y el fragmento de ADN que contenía el casete de expresión (promotor de CMV, secuencia codificante NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B y la señal de poliadenilación BGH) flanqueado por secuencias adenovíricas se cotransformó con el plásmido genómico pAd5HVO (E1^{-}, E3^{-}) linearizado con ClaI, en la cepa bacteriana BJ5183, generando pAd5HVONS. El plásmido pAd5HVO contiene Ad5 pb 1 a pb 341, pb 3.525 a pb 28.133 y pb 30.818 a pb 35.935.
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Ejemplo 7 Generación de plásmidos de genoma de adenovirus con la secuencia NSmut
Se generaron plásmidos de genoma de adenovirus que contenían una secuencia NS-mut en un fondo de Ad5 o de Ad6. El fondo de Ad6 contenía regiones de Ad5, bases 1 a 450, 3.511 a 5.548 y 33.967 a 35.935.
Se digirió pV1JNS3-5Akozak con los enzimas de restricción BglII y XbaI, y el fragmento de ADN que contenía la secuencia de Kozak y la secuencia codificante NS3-NS4A-NS4B-NS5A se clonó en un vector lanzadera polypMRKpdelE1 digerido con BglII y XbaI. El vector resultante se denominó shNS3-5Akozak.
PolypMRKpdelE1 es un derivado de RKpdelE1 (Pac/pIX/pack450) + CMVmin + BGHpA(str.) modificado mediante la inserción de un polilínker que contiene los sitios de reconocimiento para BgIII, PmeI, SvaI, XbaI, SalI en los sitios de restricción únicos BgIII presentes cadena abajo del promotor de CMV. MRKpdelE1 (Pac/pIX/pack450) + CMVmin + BGHpA(str.) contiene las secuencias de Ad5 entre pb 1 y pb 5.792 con una deleción de secuencias de E1 entre pb 451 y pb 3.510. Se insertó el promotor de CMV humano y la señal de poliadenilación de la BGH en la deleción de E1 en una orientación paralela a E1 con un único sitio BgIII separando los mismos.
Se obtuvo mediante PCR de ensamblaje el fragmento NS5B, mutado para eliminar la actividad enzimática y con un terminador de traducción fuerte en el extremo 3', y se insertó en el vector shNS3-5Akozak mediante recombinación homóloga, generando polypMRKpdelE1NSmut. En polypMRKpdelE1NSmut, la secuencia codificante NS-mut se encuentra bajo el control del promotor de CMV y la señal de poliadenilación BGH se encuentra presente cadena abajo.
Se extrajo el casete de expresión génica y las regiones flanqueantes que contenían las secuencias de adenovirus que permiten la recombinación homóloga, mediante digestión con los enzimas de restricción PacI y BstI1071I, y se cotransformaron con los plásmidos genómicos pAd5HVO (E1^{-},E3^{-}) o pAd6E1^{-}E3^{-} (2,6 kb) que habían sido linearizados con ClaI, en la cepa bacteriana BJ5183, generando pAd5HVONSmut y pAd6E1^{-},E3^{-}NSmut, respectivamente.
pAd6E1^{-}E3^{-} (2,6 kb) contiene Ad5 pb 1 a pb 341 y pb 3.525 a pb 5.548, Ad6 pb 5.542 a pb 28.157 y pb 30.788 a pb 33.784, y Ad5 pb 33.967 a pb 35.935 (los números de pb se refieren a la secuencia de tipo salvaje tanto para Ad5 como para Ad6). En ambos plásmidos, las ITR víricas se encuentran unidas mediante secuencias de plásmido que contienen el origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a la ampicilina.
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Ejemplo 8 Generación de plásmidos de genoma de adenovirus con NSOPTmut
Se digirió con los enzimas de restricción BamHI y SalI el gen sintético de codones optimizados humano (NSOPTmut) proporcionado por la secuencia SEC ID nº 3 y clonado en un vector pCRBlunt (Invitrogen), y se clonó en los sitios de restricción BgIII y SalI presentes en el vector lanzadera polypMRKpdelE1. El clon resultante (polypMRKpdelE1NSOPTmut) se digirió con los enzimas de restricción PacI y Bst11107I, y se cotransformó con los plásmidos genómicos pAd5HVO (E1^{-},E3^{-}) o pAd6E1^{-}E3^{-} (2,6 kb) que habían sido linearizados con ClaI, en la cepa bacteriana BJ5183, generando pAd5HVONSOPTmut y pAd6E1^{-},E3^{-}NSOPTmut, respectivamente.
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Ejemplo 9 Rescate y amplificación de vectores adenovirus
Se rescataron adenovectores en células Per.C6. Se cultivaron las células Per.C6 en FCS al 10%/DMEM suplementado con L-glutamina (conc. final: 4 mM), penicilina/estreptomicina (conc. final: 100 IU/ml) y MgCl_{2} 10 mM. Tras la infección, las células se mantuvieron en el mismo medio suplementado con suero de caballo al 5% (HS). Para el rescate de los virus, se sembraron en placa 2,5x10^{6} Per.C6 en placas de Petri de 6 cm de diámetro.
Veinticuatro horas después de la siembra en placa, las células se transfectaron mediante el método del fosfato de calcio con 10 \mug del ADN adenovírico linearizado con PacI. Se dejó el precipitado de ADN sobre las células durante 4 horas. Se eliminó el medio y se añadió HS al 5%/DMEM.
Se mantuvieron las células en un incubador de CO_{2} hasta que resultó visible un efecto citopático (1 semana). Se recuperaron las células y el sobrenadante, y se sometieron a 3X ciclos de congelación/descongelación (nitrógeno líquido/baño de agua a 37ºC). Se centrifugó el lisado a 3.000 rpm a -4ºC durante 20 minutos y el sobrenadante recuperado (correspondiente a un lisado celular que contenía virus pasado por células únicamente una vez; P1), en una cantidad de 1 ml/placa, para infectar células Per.C6 confluentes al 80%-90% en placas de Petri de 10 cm de diámetro. Las células infectadas se incubaron hasta que resultó visible un efecto citopático, se recuperaron las células y el sobrenadante, y se preparó el lisado tal como se ha indicado anteriormente (P2).
Se utilizó lisado de P2 (4 ml) para infectar 2 placas de Petri de 15 cm de diámetro. El lisado recuperado de esta infección (P3) se almacenó en alícuotas a -80ºC a modo de reserva de virus para su utilización como punto de partida para preparaciones víricas grandes. En este caso, 1 ml de la reserva resultó suficiente para infectar 2 placas de Petri de 15 cm de diámetro, y el lisado resultante (P4) se utilizó para la infección de las placas de Petri destinadas a infecciones a gran escala.
Se realizó una amplificación adicional a partir del lisado P4 diluido en medio sin FCS y se utilizó para infectar 30 placas de Petri de 15 cm de diámetro (con Per-C6 confluyentes al 80%-90%) en una cantidad de 10 ml/placa. Las células se incubaron durante 1 hora en el incubador de CO_{2}, se mezclaron suavemente cada 20 minutos. Se añadieron 12 ml/placa de HS al 5%/DMEM y las células se incubaron hasta que resultó visible un efecto citopático (aproximadamente 48 horas).
Se recogieron las células y el sobrenadante, y se centrifugaron a 2K rpm durante 20 minutos a 4ºC. Se resuspendió el pellet en 15 ml de Tris 0,1 M, pH=8,0. Las células se lisaron mediante 3X ciclos de congelación/descongelación (nitrógeno líquido/baño de agua a 37ºC). Se añadieron 150 \mul de MgCl_{2} 2 M y 75 \mul de ADNasa (10 mg de desoxirribonucleasa pancreática bovina I en 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH=7,4, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM, albúmina de suero bovino 0,1 mg/ml, glicerol al 50%). Tras incubar durante 1 hora a 37ºC en un baño de agua (vórtex cada 15 minutos), el lisado se centrifugó a 4K rpm durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante recuperado se encontraba listo para aplicarse a un gradiente de CsCl.
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Se prepararon gradientes de CsCl en tubos Ultraclear SW40, de la manera siguiente:
0,5 ml de CsCl 1,5d
3 ml de CsCl 1,35d
3 ml de CsCl 1,25d
se aplicaron 5 ml/tubo de sobrenadante vírico
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En caso necesario, se enrasaron los tubos con Tris-Cl 0,1 M, pH=8,0. Los tubos se centrifugaron a 35K rpm durante 1 hora a -10ºC con el rotor SW40. Se recogieron las bandas víricas (localizadas en la interfaz 1,25/1,35) utilizando una jeringa.
Se transfirió el virus a un nuevo tubo Ultraclear SW40 y se añadió 1,35d CsCl hasta llenar el tubo. Tras centrifugar a 35K rpm durante 24 horas a 10ºC en el rotor SW40, se recogió el virus en el volumen mínimo posible y se dializó extensivamente frente a tampón A105 (Tris 5 mM, sacarosa al 5%, NaCl 75 mM, MgCl_{2} 1 mM, polisorbato 80 al 0,005%, pH=8,0). Tras la diálisis, se añadió glicerol hasta una concentración final de 10% y el virus se almacenó en alícuotas a -80ºC.
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Ejemplo 10 Rescate incrementado de adenovectores
Se descubrió que resulta difícil rescatar los vectores de primera generación de Ad5 y de Ad6 que portaban el transgén NSOPTmut de VHC. Un posible bloqueo del procedimiento de rescate podría atribuirse a una replicación ineficiente de ADN de plásmido que es un molde subóptimo para la maquinaria de replicación del adenovirus. La ausencia de la proteína terminal unida a los extremos 5' del ADN (normalmente presentes en el ADN vírico), asociados al contenido muy alto de G-C del transgén insertado en la región E1 del vector podría estar provocando una reducción sustancial de la tasa de replicación del adenovirus derivado de plásmido.
Para preparar un procedimiento más eficiente y reproducible para el rescate de vectores de Ad, se utilizó un vector de expresión (pE2, figura 19) que contenía la totalidad de las proteínas E2 (polimerasa, proteína preterminal y proteína de unión a ADN), así como el orf6 de E4 bajo el control del promotor inducible por Tet. La transfección de pE2 en combinación con un plásmido preadeno normal en células PerC6 y en 293 condujo a un fuerte incremento de la replicación del ADN de Ad y a una producción más eficiente de partículas adenovíricas infecciosas completas.
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Construcción de plásmidos
pE2 se basa en el vector de clonación pB1 (CLONTECH) con la adición de dos elementos para permitir la replicación episómica y la selección en cultivo celular: (1) la región OriP del EBV (EBV [nt] 7.421-8.042) que permite la replicación del plásmido en sincronía con el ciclo celular al expresarse EBNA-1, y (2) el gen de resistencia de la higromicina-B fosfotransferasa (HPH), permitiendo una selección positiva de las células transformadas. Las dos unidades transcripcionales para los genes adenovíricos E2 a y b, y E4-Orf6 se construyeron y se ensamblaron en pE2, tal como se indica posteriormente.
El fragmento ClaI/SphI de polimerasa de Ad5 y el fragmento Acc65/EcoRV de pTP-Ad5 se obtuvieron a partir de pVac-PoI y pVac-pTP (Stunnemberg et al., NAR 16:2431-2444, 1988). Ambos fragmentos se rellenaron con Klenow y se clonaron en los sitios SalI (rellenado) y EcoRV de pBI, respectivamente, obteniendo pBI-PoI/pTP.
En primer lugar se insertó el elemento OriP de EBV de pCEP4 (Invitrogen) dentro de dos dímeros aislantes de \beta-globina de pollo mediante clonación del mismo en el sitio BamHI de pJC13-1 (Chung et al., Cell 74(3):505-14, 1993). A continuación, se clonó el fragmento HS4-OriP de pJC13-OriP dentro de pSAImv (un plásmido que contiene el casete de expresión génica tk-resistencia a higroB, así como el origen de replicación de Ad5), las ITR dispuestas en forma de unión cabeza-con-cola, obtenidos mediante PCR a partir de pFG140 (Graham, EMBD J. 3:2917-2922, 1984) utilizando los cebadores siguientes: 5'-TCGAATCGATACGCGAACCTACGC-3' (SEC ID nº 16) y 5'-TCGACGTGTCGACTTCGAAGCGCACACCAAAAACGTC-3' (SEC ID nº 17), generando de esta manera pMVHS4Orip. A continuación, se insertó un fragmento de ADN procedente de pMVHS4Orip, que contenía el OriP aislado, la unión Ad5-ITR y el casete tk-HigroB, en el vector pBI-Pol/pTP cortado con AseI/IAatII, generando pBI-Pol/pTPHS4.
Para construir la segunda unidad transcripcional que expresa Ad5-Orf6, así como Ad5-DBP, en primer lugar se insertó E4orf6 (Ad5 [nt] 33.193 a 34.077) obtenido mediante PCR, en el vector pBI, generando pBI-Orf6, obteniendo el segundo vector de expresión bidireccional regulado por Tet (pBI-DBP/E4orf6). Las señales poliA originales presentes en pBI se sustituyeron por BGH y poliA de SV40.
A continuación, se modificó pBI-DBP/E4orf6 mediante inserción de un fragmento de ADN que contenía las ITR de Adeno5 dispuestas en una unión de cabeza-con-cola más el gen de resistencia a la higromicina B obtenido del plásmido pSA-1mv. A continuación, se utilizó el nuevo plásmido pBI-DBP/E4orf6lanzadera como plásmido donante para insertar la segunda unidad transcripcional regulada por tet en pBI-PoI/pTPHS4 mediante recombinación homóloga utilizando E. coli cepa BJ5183, obteniendo pE2.
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Líneas celulares, transfecciones y amplificación de virus
Se cultivaron células PerC6 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más suero de feto bovino (FBS) al 10%, MgCl_{2} 10 mM, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y glutamina 2 mM.
Todas las transfecciones transitorias se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se transfectaron placas de 6 cm con siembras de PERC-6^{TM} confluyentes al 90%, con 3,5 \mug de plásmidos preadeno Ad5/6NSOPTmut, se digirieron con acI, solas o en combinación con 5 \mug de pE2 más 1 \mug de pUHD52.1. El plásmido pUHD52.1 es el vector de expresión para el transactivador 2 de tet inverso (rtTA2) (Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968, 2000). Tras la transfección, se cultivaron células en presencia de 1 \mug/ml de doxiciclina para activar la expresión de pE2. Se recolectaron las células 7 días después de la transfección y se obtuvo el lisado celular mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Se utilizaron dos ml de lisado celular para infectar una segunda placa de 6 cm de PerC6. Se cultivaron las células infectadas hasta observar una CPE completa y seguidamente se recolectaron. El virus se subcultivó en serie cinco veces tal como se ha indicado anteriormente, después se purificó en un gradiente de CsCl. La estructura del ADN del virus purificado se controló mediante digestión con endonucleasa y análisis de electroforesis en gel de agarosa y se comparó con el patrón de restricción de plásmido preadeno original.
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Ejemplo 11 Optimización parcial del ácido nucleico codificante de poliproteína de VHC
La optimización parcial del ácido nucleico codificante de poliproteína del VHC se llevó a cabo para facilitar la producción de adenovectores que contuviesen codones optimizados para la expresión en un huésped humano. El objetivo global consistía en proporcionar la expresión incrementada debido a la optimización de los codones, facilitando simultáneamente la producción de un adenovector codificante de poliproteína de VHC.
Se encontraron varias dificultades al producir un adenovector codificante de poliproteína de VHC con codones optimizados para la expresión en un huésped humano. Se encontró que un adenovector que contuviese una secuencia optimizada (SEC ID nº 3) resultaba más difícil de sintetizar y rescatar que un adenovector que contuviese una secuencia no optimizada (SEC ID nº 2).
Las dificultades de producción de un adenovector que contuviese la secuencia SEC ID nº 3 se atribuyeron a un contenido elevado de GC. Una región particularmente problemática era la región en aproximadamente la posición 3.900 de NSOPTmut (secuencia SEC ID nº 3).
Se diseñaron versiones alternativas de la secuencia de ácidos nucleicos optimizada codificante de VHC, para facilitar su utilización en un adenovector. Se diseñaron versiones alternativas, en comparación con NSOPTmut, para que presentasen un contenido global más bajo de GC, para reducir/evitar la presencia de motivos potencialmente problemáticos de G o C consecutivas, manteniendo simultáneamente un nivel elevado de optimización de codones para permitir la expresión mejorada de la poliproteína codificada y los productos de corte individuales.
Un punto de partida para la generación de una secuencia de optimización subóptima de codones es la región codificante de la secuencia de nucleótidos NSOPTmut (bases 7 a 5.961 de la secuencia SEC ID nº 3). Los valores para las frecuencias de uso de codones (normalizadas respecto a un total de 1,0 para cada aminoácido) se obtuvieron del archivo human_high.cod disponible en el paquete informático Wisconsin Package versión 10.3 (Accelrys Inc., una filial propiedad completa de Pharmacopeia, Inc.).
Para reducir el contenido local y global de GC, se generó manualmente una tabla que definía las sustituciones preferidas de codones para cada aminoácido. Para cada aminoácido, se seleccionó el codón que presentaba 1) un contenido de GC más bajo en comparación con el codón más frecuente, y 2) se seleccionó una frecuencia de uso observado de codones relativamente elevada (según se define en human_high.cod) como el codón de sustitución. Por ejemplo, para Arg, el codón con la frecuencia más alta era CGC. De entre los otros cinco codones alternativos codificantes de Arg (CGG, AGG, AGA, CGT, CGA), tres (AGG, CGT, CGA) reducen el contenido de GC en 1 base, una (AGA) lo reduce en dos bases y una (CGG) en 0 bases. Debido a que el codón AGA se encuentra listado en human_high.cod como presentando una frecuencia de uso relativamente reducida (0,1), por lo tanto se seleccionó AGG, con una frecuencia relativa de 0,18, como el codón que debía sustituir a CGC. Se aplicaron criterios similares con el fin de establecer sustituciones de codones para los demás aminoácidos, resultando en la lista mostrada en la Tabla 5. Los parámetros aplicados en el procedimiento de optimización siguiente se determinaron empíricamente de manera que la secuencia resultante mantuviera un uso de codón considerablemente mejorado (para cada aminoácido) y se redujese el contenido de GC (globalmente y en forma de tramos locales de G y/o C consecutivas).
Se proporcionan dos ejemplos de secuencias codificantes de VHC parcialmente optimizadas en las secuencias SEC ID nº 10 y SEC ID nº 11. La secuencia SEC ID nº 10 proporciona una secuencia codificante de VHC que ha sido parcialmente optimizada en toda su longitud. La secuencia SEC ID nº 11 proporciona una secuencia codificante de HCV totalmente optimizada para el uso de codones, con la excepción de una región que había sido parcialmente optimizada.
Se llevó a cabo la optimización de codones mediante el procedimiento siguiente.
Etapa 1). Se analizó la región codificante de la secuencia NSOPTmut totalmente optimizada de entrada, utilizando una ventana deslizante de 3 codones (9 bases), desplazando la ventana en un codón tras cada ciclo. Al detectar un tramo que contuviese 5 o más C y/o G consecutivas en la ventana, se aplicaba la regla de sustitución siguiente: sea N el número de sustituciones de codones realizadas previamente. En el caso de que N sea impar, sustituir el codón intermedio en la ventana por el codón especificado en la Tabla 5; en el caso de que N sea par, sustituir el tercer codón terminal en la ventana por el codón especificado en una tabla de optimización de codones, tal como human_high.cod. En el caso de que Leu o Val se encuentren presentes en el segundo o tercer codón, no aplicar ninguna sustitución con el fin de no introducir codones de Leu o de Val con una frecuencia de uso de codones relativa muy baja (ver, por ejemplo, human_high.cod). En el siguiente ciclo, seguidamente se aplicó un análisis de la ventana deslizante a una secuencia que contenía las sustituciones del ciclo anterior.
Se descubrió empíricamente que la sustitución alternante de los codones intermedio y terminal en la ventana de 3 codones proporcionaba un mantenimiento global más satisfactorio del uso optimizado de codones, reduciendo simultáneamente el contenido de GC (juzgado a partir de la secuencia final tras el procedimiento). Sin embargo, en general la estrategia exacta de sustitución depende de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que se analiza y deberá determinarse empíricamente.
Etapa 2). La secuencia que contenía toda las sustituciones de codones realizadas en la etapa 1) seguidamente se sometió a un análisis adicional utilizando una ventana deslizante de 21 codones (63 bases) de longitud: de acuerdo con un parámetro ajustable, se determinó el contenido global de GC en la ventana. En el caso de que el contenido de GC en la ventana fuese superior a 70%, se aplicaba la estrategia de sustitución de codones siguientes: en la ventana se sustituían los codones para los aminoácidos Asn, Asp, Cys, Glu, His, Ile, Lys, Phe, Tyr por los codones proporcionados en la Tabla 5. La restricción de la sustitución a este conjunto de aminoácidos estaba motivada por el hecho de que: a) el codón de sustitución todavía presentaba una frecuencia de uso aceptablemente alta en human_high.cod, y b) el uso global medio de codones humanos en CUTG para el codón de sustitución era prácticamente igual de alto que para el codón más frecuente. En el ciclo siguiente, el análisis de la ventana deslizante seguidamente se aplicó a una secuencia que contenía las sustituciones del ciclo anterior.
Se determinó empíricamente el umbral 70% mediante el compromiso entre una reducción global del contenido de GC y el mantenimiento de una optimización de codones elevada para los aminoácidos individuales. Tal como en la etapa 1), la estrategia exacta de sustituciones (la elección de aminoácidos y el valor umbral de contenido de GC) nuevamente dependía de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que se analizaba y debía determinarse empíricamente.
Etapa 3). La secuencia generada en las etapas 1) y 2) seguidamente se editó manualmente y se modificaron codones adicionales según los criterios siguientes: las regiones que todavía presentaban un contenido de GC superior a 70% respecto a una ventana de 21 codones se examinaron manualmente y se sustituyeron unos cuantos codones, nuevamente siguiendo el esquema proporcionado en la Tabla 5.
Se llevaron a cabo etapas posteriores con los fines de: proporcionar sitios de restricción útiles, eliminar posibles marcos de lectura abiertos en la cadena complementaria, añadir regiones recombinantes homólogas, añadir una señal de Kozak y añadir un terminador. Estas etapas se numeran del 4 al 7.
Etapa 4). La secuencia generada en la etapa 3 se examinó para comprobar la ausencia de determinados sitios de restricción (BgIII, PmeI y XbaI) y la presencia de únicamente 1 sitio StuI, que permitiesen la utilización de una estrategia de clonación posterior utilizando un subconjunto de enzimas de restricción. Se eliminaron dos sitios (uno para BgIII y uno para StuI) de la secuencia mediante la sustitución de los codones que eran parte de los sitios de reconocimiento respectivos.
Etapa 5). La secuencia generada en las etapas 1) a 4) se modificó a continuación para que permitiese la generación posterior de una secuencia NSOPTmut modificada (mediante recombinación homóloga). En la secuencia obtenida en las etapas 1) a 4), el segmento que comprendía las bases 3.556 a 3.755, y el segmento que comprendía las bases 4.456 a 4.656 se sustituyeron por los segmentos correspondientes de NSOPTmut. El segmento que comprendía las bases 3.556 a 4.656 de la secuencia SEC ID nº 10 puede utilizarse para sustituir la región problemática en NSOPTmut (aproximadamente en la posición 3.900) mediante recombinación homóloga, creando de esta manera la variante de NSOPTmut que presenta la secuencia SEC ID nº 11.
Etapa 6). El análisis de la secuencia generada en las etapas 1) a 5) reveló un marco de lectura abierto potencial que comprendía prácticamente el fragmento completo en la cadena complementaria. La eliminación de todos los codones CTA y TTA (Leu) y TCA (Ser) de la cadena de sentido eliminó efectivamente todos los codones de parada en uno de los marcos de lectura en la cadena complementaria. Aunque la probabilidad de transcripción de este marco de lectura abierta de la cadena complementaria y la posterior traducción en proteína es muy reducida, para excluir una interferencia potencial con la transcripción y la traducción posterior de la secuencia codificada en la cadena de sentido, se introdujeron codones TCA para Ser en la cadena de sentido cada aproximadamente 500 bases. No se introdujeron cambios en los segmentos introducidos durante la etapa 5) para permitir la recombinación homóloga. El codón TCA para Ser resulta preferente sobre los codones CTA y TTA para Leu debido a la frecuencia relativa más alta para TCA (0,05) en comparación con CTA (0,02) y TTA (0,03) en human_high.cod. Además, el uso medio de codones humanos de CUTG favorecía TCA (0,14 frente a 0,07 para CTA y TTA).
Etapa 7). En una etapa final, se añadió GCCACC en el extremo 5' de la secuencia para generar un sitio interno optimizado de entrada al ribosoma (señal de Kozak) y se añadió una señal de parada TAAA en el extremo 3'. Para mantener las propiedades de inicio de traducción de NSsuboptmut, se mantuvieron iguales los primeros 8 codones de la región codificante a los de la secuencia de NSOPTmut. La secuencia resultante se analizó nuevamente para comprobar la ausencia de los sitios de reconocimiento BgIII, PmeI y XbaI y la presencia de únicamente un sitio StuI.
La secuencia de NSsuboptmut (SEC ID nº 10) presentaba un contenido de GC global reducido (63,5%) en comparación con NSOPTmut (70,3%) y mantenía un nivel correctamente optimizado de optimización de uso de los codones. La identidad de la secuencia de nucleótidos de NSsuboptmut era de 77,2% con respecto a NSmut.
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TABLA 5 Definición de las sustituciones de codones realizadas durante las etapas 1) y 2)
5 
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Ejemplo 12 Caracterización del virus
Los adenovectores se caracterizaron mediante: (a) la medición de las partículas físicas/ml, (b) el corrido de un ensayo de PCR TaqMan, y (c) la comprobación de la expresión de proteínas tras la infección de células HeLa.
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a) Determinación de las partículas físicas
Se diluyó 1/10 y 1/100 en SDS-PBS al 0,1% virus purificado en CsCl. A modo de control se utilizó tampón A105. Estas diluciones se incubaron durante 10 minutos a 55ºC. Tras agitar los tubos brevemente, se midió la D.O. a 260 nm. Se calculó la cantidad de partículas víricas de la manera siguiente: 1 DO 260 nm=1,1x10^{12} partículas físicas/ml. Los resultados típicamente eran de 5x10^{11} y 1x10^{12} partículas físicas/ml.
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b) Ensayo de PCR TaqMan
Se utilizó un ensayo de PCR TaqMan para la cuantificación del genoma de los adenovectores (partículas Q-PCR/ml). Se llevó a cabo un ensayo de PCR TaqMan utilizando el detector de secuencias ABI Prism 7700. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul en presencia de oligonucleótidos (concentración final: 200 nM) y sonda (concentración final: 200 \muM) específicos para el esqueleto adenovírico. El virus se diluyó 1/10 en SDS PBS al 0,1% y se incubó durante 10 minutos a 55ºC. Tras agitar el tubo brevemente, se prepararon diluciones 1/10 en serie (en agua). Se utilizaron 10 \mul de diluciones 10^{-3}, 10^{-5} y 10^{-7} como moldes en el ensayo de PCR.
Se calculó la cantidad de partículas presente en cada muestra basándose en una curva estándar en el mismo experimento. Típicamente los resultados se encontraban comprendidos entre 1x10^{12} y 3x10^{12} partículas Q-PCR/ml.
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c) Expresión de proteínas no estructurales del VHC
Se sometió a ensayo la expresión de proteínas NS de VHC mediante infección de células HeLa. Las células se sembraron en placa el día antes de la infección a una densidad de 1,5x10^{6} células/placa (placas de Petri de 10 cm de diámetro). Se diluyeron en medio (sin FCS) diferentes cantidades de virus purificado en CsCl correspondientes a m.o.i. de 50, 250 y 1.250 pp/célula, hasta un volumen final de 5 ml. El virus diluido se añadió sobre las células y se incubaron a 37ºC en una incubadora de CO_{2} (mezclando suavemente cada 20 minutos). Se añadieron 5 ml de HS-DMEM al 5% y las células se incubaron a 37ºC durante 48 horas.
Se prepararon extractos celulares en Triton al 1%/tampón TEN. Los extractos se corrieron en gel de SDS al 10%-acrilamida, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a ensayo con anticuerpos dirigidos contra NS3, NS5a y NS5b con el fin de comprobar que el corte de la poliproteína era correcto. Se utilizaron células falsamente transfectadas como control negativo. Los resultados de experimentos representativos analizando Ad5-NS, MRKAd5-NSmut, MRKAd6-NSmut y MRKAd6-NSOPTmut se muestran en la figura 14.
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Ejemplo 13 Inmunización de ratones con adenovectores codificantes de diferentes casetes de NS
Se inyectaron los adenovectores Ad5-NS, MRKAd5-NSmut, MRKAd6-NSmut y MRKAd6-NSOPTmut en cepas de ratón C57Black6 para evaluar su potencial de inducir respuestas inmunológicas anti-VHC. Se realizaron inyecciones intramusculares en grupos de animales (N=9 a 10) con 10^{9} pp de virus purificado en CsCl. Cada animal recibió dos dosis a intervalos de tres semanas.
Se midió la respuesta inmunológica humoral contra la proteína NS3 en sueros posteriores a la segunda dosificación de ratones C57Black6 inmunizados, mediante ELISA en dominio de proteasa NS3 expresado en bacterias. Se detectaron los anticuerpos específicos para el antígeno sometido a ensayo con medias geométricas de los títulos (GMT) comprendidas entre 100 y 46.000 (Tablas 6, 7, 8 y 9).
TABLA 6 Ad5-NS
6 
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TABLA 7 Ad5-NSmut
7
TABLA 8 MRKAd6-NSmut
8 
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TABLA 9 MRKAd6-NSOPTmut
9 
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La respuesta de células T en ratones C57Black6 se analizó mediante ensayo ELISPOT cuantitativo midiendo el número de células T secretoras de IFN\gamma en respuesta a cinco grupos (denominados F a L+M) de péptidos 20-meros solapantes en diez residuos, que comprendían la secuencia de NS3-NS5B. Se analizó la respuesta específica de CD8+ inducida en ratones C57Black6 mediante el mismo ensayo, utilizando un péptido 20mero que comprendía un epítopo de CD8+ para ratones C57Black6 (pep1480). Se detectaron las células que secretaban IFN\gamma de una manera específica de antígeno utilizando un ensayo ELIspot estándar.
Se produjeron y se trataron células de bazo, esplenocitos y péptidos tal como se describe en el Ejemplo 3, supra. En la figura 15 se muestran datos representativos de grupos de ratones C57Black6 (N=9 a 10) inmunizados con dos inyecciones de 10^{9} partículas víricas de los vectores Ad5-NS, MRKAd5-NSmut y MRKAd6-NSmut.
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Ejemplo 14 Inmunización de macacos Rhesus con adenovectores
Se inmunizaron macacos Rhesus (N=3 a 4) mediante la inyección intramuscular de virus Ad5-NS, MRKAd6-NSmut, MRKAd6-NSmut o MRKAd6-NSOPTmut purificados en CsCl. Cada animal recibió dos dosis de 10^{11} ó 10^{10} vp en el músculo deltoides a las 0 y 4 semanas.
Se midió la respuesta CMI en diferentes puntos del tiempo mediante: a) ELISPOT de IFN\gamma (ver el Ejemplo 3, supra), b) ICS de IFN\gamma, y c) ensayos CTL en masa. Estos ensayos miden las respuestas de linfocitos T CD8+ y CD4+ específicas de antígenos de VHC, y pueden utilizarse para una diversidad de mamíferos, tales como seres humanos, monos Rhesus, ratones y ratas.
La utilización de un péptido específico o de un grupo de péptidos, puede simplificar la presentación de los antígenos en los ensayos de citotoxicidad de CTL, los ensayos ELISPOT de interferón gamma y los ensayos de tinción intracelular de interferón gamma. Los péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de diversas proteínas del VHC (nuclear, E2, NS3, NS4A, NS4B, NS5a, NS5b) se prepararon para la utilización en dichos ensayos para medir las respuestas inmunológicas en monos Rhesus vacunados con ADN de VHC o con vector adenovirus, así como en seres humanos infectados por VHC. Los péptidos individuales eran 20-meros solapantes, con desplazamientos de 10 aminoácidos. Pueden utilizarse grupos grandes de péptidos para detectar una respuesta global frente a las proteínas del VHC, mientras que pueden utilizarse grupos más pequeños y péptidos individuales para definir la especificidad epitópica de una respuesta.
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ICS de IFN-\gamma
Para la ICS de IFN-\gamma, se estimularon 2x10^{6} PBMC en 1 ml de R10 (medio RPMI suplementado con FCS al 10%) con antígenos del grupo de péptidos. La concentración final de cada péptido era de 2 \mug/ml. Las células se incubaron durante 1 hora en un incubador de CO_{2} a 37ºC y después se añadió brefeldina A a una concentración final de 10 \mug/ml para inhibir la secreción de citoquinas solubles. Las células se incubaron durante 14 a 16 horas adicionales a 37ºC.
La estimulación se realizó en presencia de anticuerpos coestimuladores: CD28 y CD49d (anti-CD28 humano BD340975 y anti-CD49d humano BD340976). Tras la incubación, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo para antígenos de superficie: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 (CD3-APC Biosource APS0301, CD4-PE BD345769, CD8-PerCP BD345774).
Para detectar las citoquinas intracelulares, las células se trataron con tampón de permeabilización FACS 2
(BD340973), 2x concentración final. Tras la fijación y permeabilización, las células se incubaron con un anticuerpo contra IFN-\gamma humano, IFN-\gamma-FITC (Biosource AHC4338).
Las células se resuspendieron en formaldehído al 1% en PBS y se analizaron mediante FACS dentro de las 24 horas. Se llevó a cabo un análisis FACS de cuatro colores en un instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson) dotado de dos láseres. Se llevó a cabo la captación realizando la selección de entre la población de linfocitos en el gráfico de dispersión directa-dispersión lateral acoplado a poblaciones CD3, CD8-positivas. Se extrajeron por lo menos 30.000 sucesos de la selección. Las células positivas se expresaron como número de células que expresaban IFN-\gamma de entre 10^{6} linfocitos.
Los datos de ELISPOT de IFN-\gamma y de ICS de IFN-\gamma procedentes de monos inmunizados tras una o dos inyecciones de 10^{10} ó 10^{11} vp de los diferentes adenovectores se proporcionan en las figuras 16A-16D, 17A y 17B.
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Ensayos de CTL en masa
Una función efectora distintiva de los linfocitos T es la capacidad de subconjuntos de esta población celular de lisar directamente células que muestran péptidos antigénicos asociados al MHC apropiado. Esta actividad citotóxica se asocia con más frecuencia a los linfocitos T CD8+.
Se infectaron muestras de PBMC con virus de vacuna recombinante que expresaban antígenos del VHC in vitro durante aproximadamente 14 días para provocar la reestimulación de los antígenos y la expansión de las células T de memoria. Se sometió a ensayo la citotoxicidad contra líneas de células B autólogas tratadas con grupos de antígenos peptídicos.
Se midió la función lítica del cultivo como porcentaje de lisis específica resultante del cromo liberado de células diana durante 4 horas de incubación con células CTL efectoras. Se midió la citotoxicidad específica y se comparó con la de líneas de células B que presentaban un antígeno irrelevante o que habían sido tratadas con excipiente. Este ensayo es semicuantitativo y resulta un medio preferido para determinar si la vacuna ha inducido respuestas de CTL. En las figuras 18A-18F se proporcionan los datos tras dos inyecciones de monos inmunizados con 10^{11} vp/dosis de adenovectores Ad5-NS, MRKAd5-NSmut y MRKAd6-NSmut.
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<110> Merck & Co. Inc., e Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A.
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<120> Vacuna contra el virus de la hepatitis C
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<130> ITR0015Y
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/363,774 <151> 2002-03-13
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<150> 60/328,655 <151> 2001-10-11
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1985
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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10
11
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 5965
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc no optimizada que codifica SEC ID nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5965
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> ADNc optimizado que codifica SEC ID nº 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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18
19 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 37090
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de MRKAd6-NSmut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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20
21
22
23
24
25
26
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 5955
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cADN NS
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(5955)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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30
31
32
33
34
35
36
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1984
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia NS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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39
40
41
42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4909
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido nucleico de pV1J
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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44
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Serotipo de adenovirus 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Serotipo de adenovirus 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5965
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NSsuboptmut
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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68
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5965
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NSsuboptmut quimérica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
71
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de unión ribosómica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccaccaugg 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poliadenilación sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aauaaaagau cuuuauuuuc auuagaucug uguguugguu uuuugugug 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nucleótidos adicionales presentes en pVIJns-NS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctagagcgt ttaaaccctt aattaagg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nucleótidos adicionales presentes en pV1Jns-NSOPTmut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttaaatgtt taaac 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgaatcgat acgcgaacct acgc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgacgtgtc gacttcgaag cgcacaccaa aaacgtc 
\hfill
37

Claims (26)

1. Ácido nucleico que comprende:
(a)
una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85%, con la condición de que dicho polipéptido presente actividad de proteasa suficiente para procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B, y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente activa, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión que puede expresar dicho polipéptido a partir de dicha secuencia de nucleótidos en una célula humana; o
(b)
un casete de expresión génica que puede expresar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85% en una célula humana, con la condición de que dicho polipéptido pueda procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente inactiva, comprendiendo dicho casete de expresión:
a)
un promotor acoplado transcripcionalmente a una secuencia de nucleótidos codificante de dicho polipéptido;
b)
un sitio 5' de unión ribosómica acoplado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos,
c)
un terminador unido al extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos, y
d)
una señal 3' de poliadenilación acoplada funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende: una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 85%, con la condición de que dicho polipéptido presente actividad de proteasa suficiente para procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B, y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente inactiva, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión que puede expresar dicho polipéptido a partir de dicha secuencia de nucleótidos en una célula humana.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende: una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 95%, en la que la secuencia de dicho polipéptido mantiene la mayoría o la totalidad de las regiones antigénicas de células T de secuencia SEC ID nº 1, con la condición de que dicho polipéptido presente actividad de proteasa suficiente para procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B, y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente inactiva, en el que dicho ácido nucleico es un vector de expresión que puede expresar dicho polipéptido a partir de dicha secuencia de nucleótidos en una célula humana.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende: un ácido nucleico que comprende un casete de expresión génica que puede expresar un polipéptido Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B que presenta una identidad de aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 1 de por lo menos 95% en una célula humana, con la condición de que dicho polipéptido pueda procesarse a sí mismo para producir una proteína NS5B y dicha proteína NS5B sea enzimáticamente inactiva, comprendiendo dicho casete de expresión:
a)
un promotor acoplado transcripcionalmente a una secuencia de nucleótidos codificante de dicho polipéptido,
b)
un sitio 5' de unión ribosómica acoplado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos,
c)
un terminador unido al extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos, y
d)
una señal 3' de poliadenilación acoplada funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de nucleótidos presenta una identidad respecto a la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 2 de por lo menos 65%.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicho ácido nucleico es un plásmido adecuado para la administración en un ser humano y comprende además un origen de replicación procariótico y un gen codificante de un marcador seleccionable.
\newpage
7. Ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicho ácido nucleico es un adenovector constituido por lo siguiente:
a)
una primera región adenovírica entre aproximadamente el par de bases 1 a aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6;
b)
dicho casete de expresión génica en una orientación paralela a E1 o antiparalela a E1 unido a dicha primera región;
c)
una segunda región adenovírica de aproximadamente el par de bases 3.511 a aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 3.508 a aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unida a dicho casete de expresión;
d)
una tercera región adenovírica de aproximadamente el par de bases 5.549 a aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 5.542 a aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a dicha segunda región;
e)
una cuarta región adenovírica de aproximadamente el par de bases 30.818 a aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 30.789 a aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unida a dicha tercera región; y
f)
una quinta región adenovírica de aproximadamente el par de bases 33.967 a aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 33.785 a aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a dicha cuarta región.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Ácido nucleico según la reivindicación 7, en el que dicho casete de expresión se encuentra en una orientación antiparalela a E1.
9. Ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicho ácido nucleico es un adenovector constituido por lo siguiente:
a)
una primera región adenovírica de aproximadamente el par de bases 1 a aproximadamente el par de bases 450, correspondiente a Ad5 o a Ad6;
b)
una segunda región adenovírica de aproximadamente el par de bases 3.511 a aproximadamente el par de bases 5.548, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 3.508 a aproximadamente el par de bases 5.541, correspondiente a Ad6, unida a dicha primera región;
c)
una tercera región adenovírica de aproximadamente el par de bases 5.549 a aproximadamente el par de bases 28.133, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 5.542 a aproximadamente el par de bases 28.156, correspondiente a Ad6, unida a dicha segunda región;
d)
dicho casete de expresión génica en una orientación paralela a E3 o antiparalela a E3, unido a dicha tercera región,
e)
una cuarta región adenovírica de aproximadamente el par de bases 30.818 a aproximadamente el par de bases 33.966, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 30.789 a aproximadamente el par de bases 33.784, correspondiente a Ad6, unida a dicho casete de expresión génica, y
f)
una quinta región adenovírica de aproximadamente el par de bases 33.967 a aproximadamente el par de bases 35.935, correspondiente a Ad5, o de aproximadamente el par de bases 33.785 a aproximadamente el par de bases 35.759, correspondiente a Ad6, unida a dicha cuarta región.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Ácido nucleico según la reivindicación 7, 8 ó 9, en el que dicha primera región corresponde a Ad5, dicha segunda región corresponde a Ad5, dicha tercera región corresponde a Ad5, dicha cuarta región corresponde a Ad5, y dicha quinta región corresponde a Ad5.
11. Ácido nucleico según la reivindicación 7, 8 ó 9, en el que dicha primera región corresponde a Ad5 o a Ad6, dicha segunda región corresponde a Ad5 o a Ad6, dicha tercera región corresponde a Ad6, dicha cuarta región corresponde a Ad6, y dicha quinta región corresponde a Ad5 o a Ad6.
12. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en el que dicho promotor es el promotor intermedio-temprano de citomegalovirus humano, dicho sitio 5' de unión ribosómica está constituido por la secuencia SEC ID nº 12, y dicha señal 3' de poliadenilación es la señal de poliadenilación de BGH.
13. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que codifica el polipéptido de secuencia SEC ID nº 1.
14. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el polipéptido difiere de la secuencia SEC ID nº 1 en 1 a 20 aminoácidos.
15. Ácido nucleico según la reivindicación 14, en el que el polipéptido difiere de la secuencia SEC ID nº 1 en 1 a 5 aminoácidos.
16. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 2.
17. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 3.
18. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 10.
19. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 11.
20. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de nucleótidos es la secuencia codificante de la secuencia SEC ID nº 2 o difiere de la secuencia SEC ID nº 2 en 1 a 50 nucleótidos.
21. Ácido nucleico según la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico es un adenovector constituido por una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad respecto a SEC ID nº 4 de por lo menos 65%, o un derivado de la misma, en el que dicho derivado de la misma presenta la sustitución de la secuencia codificante de la poliproteína de VHC presente en SEC ID nº 4 por la secuencia codificante de la poliproteína de VHC de SEC ID nº 3, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 11.
22. Adenovector constituido por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID nº 4 o un derivado de la misma, en el que dicho derivado de la misma presenta la sustitución de la secuencia codificante de la poliproteína de VHC presente en SEC ID nº 4 por la secuencia codificante de la poliproteína de VHC de SEC ID nº 3, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 11.
23. Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 y 6 a 22, y un portador farmacéuticamente aceptable.
24. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 y 6 a 22, que es un adenovector para la utilización en un método de tratamiento de un ser humano mediante terapia.
25. Ácido nucleico según la reivindicación 24, para la utilización en el tratamiento o la prevención de VHC.
26. Utilización de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3 y 6 a 22 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o la prevención del VHC en un ser humano.
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