ES2344641T3 - Ensayo de diagnostico para determinar inhibidor de fibrinolisis activable por trombina (tafi). - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar TAFIa y TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI, en una muestra, comprendiendo dicho método: (i) poner en contacto dicha muestra con un inhibidor de la carboxipeptidasa (PTCI) en condiciones que permiten la unión de PTCI a TAFIa y TAFIai; y (ii) detectar la unión de TAFI y TAFIai a PTCI.
Description
Ensayo de diagnóstico para determinar inhibidor
de fibrinólisis activable por trombina (TAFI).
La invención se refiere a un ensayo de
diagnóstico para medir selectivamente niveles de la forma de 35 kD
del inhibidor de fibrinólisis activable por trombina
(abreviadamente en lo sucesivo TAFIa y TAFIai por las expresiones
inglesas Thrombin-Activatable Fibrinolisis
Inhibitor) pero no la pro-enzima TAFI ni
el péptido por activación N-terminal de TAFI.
Se necesita un equilibrio adecuado entre las
actividades de coagulación y las cascadas fibrinolíticas tanto para
proteger a los organismos de una excesiva pérdida de sangre por
lesiones como para mantener el flujo sanguíneo dentro del sistema
vascular. Se reconoce que las dos cascadas opuestas, la de
coagulación y la fibrinolítica, comprenden una serie de
conversiones de zimógenos en enzimas que terminan en las dos enzimas
proteolíticas respectivas trombina y plasmina. Estas enzimas
catalizan la formación y eliminación de fibrina dentro del sistema
circulatorio. Los desequilibrios se caracterizan por tendencias
hemorrágicas o trombóticas que pueden dar como resultado ataques
cardiacos o ictus en el organismo.
El inhibidor fibrinolítica activable por
trombina (TAFI) es un glicoproteína de 60 kD presente en plasma
humano que modula la fibrinolisis in vivo. El TAFI presente
en plasma es una forma de pro-enzima que es más
eficazmente activada por escisión proteolítica en la
Arg-92 con un complejo de
trombina-trombomodulina. La forma
pro-enzima de TAFI también puede ser activada por
escisión proteolítica por otras enzimas proteolíticas incluyendo,
pero sin limitación, trombina o plasmina. Por activación de la
pro-enzima TAFI mediante escisión proteolítica con
trombina-trombomodulina, se forma una enzima activa
(TAFIa) de 35 kD con actividad similar a carboxipeptidasa. Esta
molécula también ha sido denominada en la literatura científica como
carboxipeptidasa B del plasma (abreviadamente PCPB por la expresión
inglesa Plasma CarboxiPeptidase B ), o
plasma-carboxipeptidasa U (PCPU). El TAFIa pierde
rápidamente su actividad enzimática a través de un proceso de
inactivación dependiente de la temperatura (t_{1/2} = 10 min. a
37ºC). La inactivación de TAFIa no se debe a un proceso
proteolítico, sino más bien un cambio
\alpha-conformacional en la estructura de la
proteína que puede ir seguido por un cambio en el espectro de
fluorescencia de la proteína. La enzima TAFIa inactivada se denomina
TAFIai (35 kD). La inactivación espontánea de TAFIa a TAFIai, que
es dependiente de la temperatura, se cree que es el principal
mecanismo mediante el cual la actividad de TAFIa se modula durante
la fibrinólisis.
La modulación de la fibrinolisis ocurre cuando
TAFIa escinde los residuos de arginina y lisina
C-terminales de fibrina parcialmente degradada,
inhibiendo con ello la estimulación de la activación del
plasminógeno modulada por activador de plasminógeno tisular
(abreviadamente t-PA por la expresión inglesa
Tisular-Plaminogen Activator). El
sistema fibrinolítico se activa principalmente por el
t-PA que es proporcionado por las células dañadas
en la pared de los vasos sanguíneos. El t-PA
convierte el plasminógeno circulante en plasmina que es una proteasa
activa y puede producir un lento aumento de la fibrinolisis o,
cuando se combina con la fibrina, un rápido aumento de la
fibrinolisis. El efecto del t-PA sobre la
fibrinolisis puede ser bloqueado por una clase de inhibidores
denominados inhibidores del activador de plasminógeno
(abreviadamente PAI por la expresión inglesa Plasminogen
Activator Inhibitor), de los cuales se han
identificado varios.
La trombomodulina es un componente de la pared
de los vasos sanguíneos que se une a la trombina y cambia su
especificidad desde fibrinógeno a proteína C, dando como resultado
una molécula que posee actividad anticoagulante, en lugar de
pro-coagulante. El complejo
trombina-trombomodulina cataliza la escisión de
proteína C a proteína C activada, que da como resultado una
sub-regulación de la cascada de coagulación
inactivando proteolíticamente los co-factores
esenciales, Factor Va y VIIIa. De este modo, el cuerpo regula la
cascada de coagulación.
Estudios tales como los de Taylor et al.,
Thromb. Res. 37:639 (1985) han sugerido que la proteína C
activada no sólo es un anticoagulante, sino también un
pro-fibrinolítico, tanto in vivo como in
vitro. Subsiguientemente, se determinó que la proteína C sólo
parece pro-fibrinolítica porque impide la activación
catalizada por trombina de un inhibidor de la fibrinolisis
previamente desconocido, cuyo precursor se aisló del plasma y se
denominó TAFI.
El TAFI se descubrió independientemente en tres
diferentes laboratorios. Inicialmente apareció como una molécula
inestable similar a la carboxipeptidasa B en suero humano y fue
descrita por Hendriks et al., Biochim. Biophys. Acta
1034:86 (1990). Un año después se clonó el cDNA para la molécula, se
describió su secuencia de aminoácidos, y se describió su activación
por tripsina y sus propiedades enzimáticas para sustratos sintéticos
de carboxipeptidasa B (véase la patente de EE.UU. 5.206.161). En
1994, Wang et al., (J. Biol. Chem. 269:15937 (1994))
aislaron la molécula activada y la denominaron carboxipeptidasa U
("U" aludiendo la letra U al término inglés unstable =
inestable). Subsiguientemente, Nesheirn et al., (J. Biol.
Chem. 270:14477 (1995)) mostraron que la proteína era a la vez
activada por trombina e inhibía la fibrinolisis, y denominaron TAFI
a esta molécula. La co-identidad de PCPB, PCPU y
TAFI se ha establecido por su comportamiento cromatográfico
independiente en plasminógeno-Sepharose® y las
secuencias de aminoácidos que están presentes en el sitio escisión
para la activación.
El mecanismo de inhibición por TAFI de la
fibrinolisis se puede describir esquemáticamente como se representa
en la Figura 1.
La conversión de TAFI en TAFIa y
subsiguientemente a TAFIai indica un proceso fibrinolítico en curso.
Por lo tanto, la presencia de TAFIa y TAFIai en plasma es un
marcador del proceso fibrinolítico. Las alteraciones de los niveles
de TAFI han sido identificadas en cierto número de estados
patológicos que incluyen enfermedades vasculares y cardíacas,
enfermedades hepáticas, hemofilia, cáncer, leucemia e ictus. Por
tanto, la cuantificación precisa de los niveles de TAFI, TAFIa y
TAFIai en plasma proporciona información para la comprensión y
diagnosis de muchas enfermedades en las que la fibrinolisis
desempeña una función.
Están comercialmente disponibles diversos
ensayos ELISA (ensayos con inmunosorbentes unidos a enzimas) que
están diseñados para medir el nivel total de todas las formas de
TAFI en plasma (por ejemplo, Imuclone TAFI 873 de American
Diagnostica, Inc.; ELISA para TAFI de Affinity Biologicals). Se ha
descrito un ensayo ELISA que solo mide la
pro-enzima de TAFI de 60 kD (Stromquist et
al., Thromb. Hemost 85:12-17 (2001)).
Está comercialmente disponible un ensayo cromógeno basado en un
ensayo funcional que sólo mide la forma pro-enzima
de 60 kD de TAFI (Actichrome 874 de American Diagnostica, Inc.).
La forma pro-enzima de TAFI de
60 kD comparte epítopos antigénicos comunes con TAFIa y TAFIai. No
se han descrito anticuerpos que sean específicos para TAFIa y
TAFIai pero tampoco para la forma pro-enzima de 60
kD de TAFI. Por consiguiente, no se ha desarrollado un ensayo ELISA
que específicamente mida TAFIa y TAFIai en presencia de la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI.
Serían útiles ensayos de diagnóstico selectivos
para TAFIa y TAFIai en presencia de la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI para identificar y
monitorizar cambios en el proceso fibrinolítico. Dichos cambios son
indicativos de enfermedades en las cuales está implicado el proceso
fibrinolítico tales como, enfermedades vasculares y cardíacas,
enfermedades hepáticas, hemofilia, cáncer, leucemia e ictus. Por
consiguiente, en la técnica existe la necesidad de ensayos eficaces
selectivos para detectar y cuantificar niveles de TAFIa y TAFIai en
presencia de la forma pro-enzima de 60 kD de
TAFI.
La cita o la identificación de cualquier
referencia bibliográfica en este apartado no han de entenderse en
el sentido de que dicha cita sea una técnica anterior a la presente
solicitud.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de que el inhibidor de carboxipeptidasa de la patata
(abreviadamente PTCI por la expresión inglesa Potato
Carboxypeptidase Inhibitor) se une tanto a TAFIa
como a TAFIai, pero no a la forma pro-enzima de 60
kD de TAFI ni al péptido por activación N-terminal
de TAFI. En pocas palabras, la invención se refiere a un ensayo útil
para medir niveles de TAFIa y TAFIai (o uno de sus derivados o
variantes) que comprende detectar un complejo constituido por un
resto de unión específica (tal como, pero sin limitación, PTCI)
para TAFIa o TAFIai y la proteína TAFIa o TAFIai (o uno de sus
derivados o variantes). En una realización, el ensayo es útil para
medir específicamente niveles de TAFIa o TAFIai (es decir, detectar
las formas TAFIa y/o TAFIai de TAFI pero no detectar la forma
pro-enzima de 60 kD o el péptido por activación
N-terminal de TAFI) en una muestra que también
contiene (o que contiene potencialmente) la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI y/o el péptido por
activación N-terminal de TAFI, donde el resto de
unión es PTCI. En una realización particular, se detecta el
complejo TAFIa/PTCI o el complejo TAFIai/PTCI con un anticuerpo
anti-TAFI.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un ensayo similar a un ensayo con
inmunosorbente unido a una enzima (ELISA) útil para medir niveles
de la proteína TAFI y TAFIai (o uno de sus derivados o variantes)
(antígeno) en soluciones que pueden contener o no contener la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido por
activación N-terminal de TAFI. El ensayo es útil
para fines de diagnóstico relacionados con la medida de niveles de
TAFIa y TAFIai.
La presente invención también se refiere a un
método de analizar soluciones biológicas que incluyen, pero sin
limitación, sangre, plasma, orina, suero, semen y fluido cerebral o
espinal para detectar y cuantificar niveles de TAFIa o TAFIai (o
uno de sus derivados o variantes). El ensayo también se puede usar
para diagnosticar si un paciente sufre una enfermedad o trastorno
particular relacionado con niveles alterados de TAFIa o TAFIai o
niveles alterados o actividad de TAFIa o TAFIai o para monitorizar
un paciente al que previamente se le ha diagnosticado dicha
enfermedad o trastorno. El ensayo se puede usar además para
monitorizar un paciente que recibe tratamiento para una enfermedad
o trastorno particular relacionado con niveles alterados o actividad
de TAFIa o TAFIai y/o para monitorizar un paciente que recibe un
tratamiento que altera los niveles o la actividad de TAFIa o
TAFIai. En ciertas realizaciones, el tratamiento es una terapia
anti-coagulante. En otras realizaciones, el
tratamiento es una terapia pro-coagulante. En otras
realizaciones, el tratamiento es anti-fibrinolítico
o pro-fibrinolítico.
En una realización particular, el paciente tiene
o es susceptible de tener una enfermedad o trastorno hemorrágico.
En una realización particular, la enfermedad o trastorno hemorrágico
está asociado a un estado hiperfibrinolítico. En una realización
específica, el estado hiperfibrinolítico es hemofilia A o hemofilia
B.
\newpage
En otra realización, el paciente tiene o es
susceptible (es decir, tiene una predisposición causada por factores
genéticos o medioambientales o en virtud de tener una cierta
enfermedad, trastorno o estado, asociado con, o de sufrir o haber
sufrido una terapia que pueda dar como resultado la enfermedad) de
tener efectos secundarios de hemorragia asociados con la
administración de activador de plasminógeno tisular
(t-PA), o uno de sus análogos, aspirina
(particularmente una sobredosis de aspirina) y/o otros
anti-coagulantes.
En otra realización, el paciente tiene o es
susceptible de tener una enfermedad o trastorno trombótico.
En otra realización, el paciente experimentará,
experimenta o ha experimentado cirugía. En una realización
particular, la cirugía es un trasplante de órganos. En otra
realización particular la cirugía es cardiovascular.
En otra realización, la invención se refiere a
un kit que comprende los componentes para el ensayo TAFIa/TAFIai
(es decir, PTCI, patrones de TAFIa/TAFIai, agente capaz de unirse al
complejo TAFIa/PTCI o al complejo TAFIai/PTCI, un sustrato de dicho
agente, tampón, reactivo de extinción).
Estos y otros aspectos de esta invención serán
evidentes con referencia a la descripción detallada siguiente y a
los dibujos anexos. Para tal fin, se citan en la presente memoria
ciertas patentes y otros documentos para exponer más
específicamente diversos aspectos de esta invención. Cada uno de
estos documentos se incorpora en la presente memoria como
referencia en su totalidad. La cita de las referencias en la
presente memoria de ningún modo ha de considerarse como la admisión
de que constituyen técnica anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "análogo", "polimorfismo"
y "variante" como se emplean en la presente memoria se refieren
a un polipéptido que posee una función similar o idéntica a la de
una proteína particular (por ejemplo, TAFI, TAFIa o TAFIai), o uno
de sus fragmentos, pero no necesariamente comprenden una secuencia o
estructura de aminoácidos similar o idéntica de ese complejo de
proteínas o uno de sus fragmentos. Un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos similar se refiere a un polipéptido que
satisface al menos uno de los siguientes: (a) un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 30%, al menos
35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al
menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%,
al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% idéntica a
la secuencia de aminoácidos de la proteína o complejo de proteínas
o uno de sus fragmentos como se ha descrito en la presente memoria
(por ejemplo, TAFI, TAFIa procedente de TAFIai humano o múrido);
(b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que
se hibrida en condiciones estrictas con una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína o complejo de proteínas de la
invención, o uno de sus fragmentos, como se describe en la presente
memoria, de al menos 20 residuos de aminoácidos, al menos 25
residuos de aminoácidos, al menos 40 residuos de aminoácidos, al
menos 50 residuos de aminoácidos, al menos 60 residuos de
aminoácidos, al menos 70 residuos de aminoácidos, al menos 80
residuos de aminoácidos, al menos 90 residuos de aminoácidos, al
menos 100 residuos de aminoácidos, al menos 125 residuos de
aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos; y (c) un
polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que es al
menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%,
al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos
75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al
menos 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína o complejo de proteínas de la invención o uno de sus
fragmentos como se describe en la presente memoria. Un polipéptido
con estructura similar a una proteína o complejo de proteínas de la
invención o uno de sus fragmentos como se describe en la presente
memoria se refiere a un polipéptido que tiene una estructura
secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la de dicha proteína
o complejo de proteínas o uno de sus fragmentos como se describe en
la presente memoria. La estructura de un polipéptido puede ser
determinada por métodos conocidos por los expertos en la técnica,
incluyendo pero sin limitación, cristalografía de rayos X,
resonancia magnética nuclear y microscopía electrónica
cristalográfica.
La expresión "resto de unión" como se usa
en la presente memoria se refiere a un sustrato químico o biológico
capaz de unirse específicamente a, o ser unido específicamente por,
TAFIa o TAFIai (es decir, una proteína u otro resto que no compite
significativamente por la unión con un resto específico). Dichas
sustancias químicas o biológicas incluyen, pero sin limitación,
inhibidores de bajo peso molecular de de TAFIa o TAFIai, péptidos,
pequeñas proteínas, plasminógeno y PTCI.
El término "derivado" como se usa en la
presente memoria se refiere a un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de una proteína (por ejemplo, TAFI, TAFIa
o TAFIai) o complejo de proteínas de la invención o uno de sus
fragmentos como se describe en la presente memoria que ha sido
alterado mediante la introducción de sustituciones, deleciones o
adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado"
como se usa en la presente memoria también se refiere a una
proteína o complejo de proteínas de la invención o uno de sus
fragmentos que ha sido modificado, es decir, por la unión covalente
de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero sin
limitación, una proteína o complejo de proteínas o uno de sus
fragmentos puede ser modificado, por ejemplo, por glicosilación,
acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización
por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión
proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un
derivado de una proteína o complejo de proteínas o uno de sus
fragmentos puede ser modificado por modificaciones químicas usando
técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero
sin limitación escisión química específica, acetilación,
formilación; o síntesis metabólica de tunicamicina. Además, un
derivado de una proteína o complejo de proteínas o uno de sus
fragmentos puede contener uno o más aminoácidos no
clásico(s). Un derivado de polipéptido posee una función
similar o idéntica como una proteína o complejo de proteínas o uno
de sus fragmentos descritos en la presente memoria.
Las frases "complejo TAFIa/PTCI",
"complejo TAFIai/PTCI" o "complejo TAFIa o TAFIai/PTC"
significan un complejo formado entre TAFIa y PTCI o TAFIai y
PTCI.
La frase "modulación de la fibrinolisis"
significa inhibición, reducción, aumento o activación de la cascada
fibrinolítica que puede tener un efecto
anti-coagulante o
pro-coagulante.
"Inhibidor de TAFIa" o "inhibidores de
TAFIa" significa cualquier molécula que bloquee, reduzca o
retarde la escisión de fibrina u otros sustratos por TAFIa.
La expresión "agente profiláctico"
significa un agente capaz de evitar (prevenir) o reducir los
riesgos, incidencias o recidivas de una enfermedad o trastorno en
un paciente. En una realización, el agente profiláctico es uno que
es capaz de evitar un trastorno hemorrágico o trombótico.
La expresión "agente terapéutico" significa
un agente capaz de modificar, controlar, retrasar o invertir el
curso de una enfermedad o trastorno o mejorar los síntomas de una
enfermedad o trastorno en un paciente. En una realización, el
agente terapéutico es uno que es capaz de modificar, controlar,
retrasar, invertir o mejorar los síntomas de un trastorno
hemorrágico o trombótico.
Los términos "sujeto" y "paciente" se
refieren a un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas,
cerdos, caballos, gatos, perros; ratones, ratas etc.) o un primate
(por ejemplo, monos y seres humanos). Preferiblemente el sujeto o
paciente es un mamífero, más preferiblemente, un ser humano.
Los términos "evitar", "evitación" o
"prevención" se refieren a la evitación de la recurrencia,
extensión o comienzo de la enfermedad o trastorno hemorrágico o
trombótico, o síntomas asociados con la enfermedad o trastorno, en
un paciente por la administración de un agente profiláctico o
terapéutico.
Los términos, "tratar" y "tratamiento"
se refieren a la modificación, control, reversión o mejora de los
síntomas de una enfermedad o trastorno hemorrágico o trombótico. En
ciertas realizaciones, dichos términos se refieren a la
minimización o retraso de enfermedad o trastorno hemorrágico.
La frase "en combinación" se refiere al uso
de más de uno o varios agentes profilácticos y/o terapéuticos para
tratar, evitar o manejar una enfermedad o trastorno hemorrágico. Los
agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación
de la presente invención se pueden administrar concomitantemente o
secuencialmente. Los agentes profilácticos o terapéuticos de las
terapias de combinación de la presente invención también se pueden
administrar cíclicamente. La terapia cíclica implica la
administración de un primer agente durante un periodo de tiempo,
seguida por la administración de un segundo agente durante un
periodo de tiempo y repetir esta administración secuencial, es
decir, el ciclo, para reducir el desarrollo de la resistencia a una
de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de
las terapias, y/o mejorar la eficacia del tratamiento.
Los términos "manejar" y "manejo" se
refieren a los efectos beneficiosos que un paciente obtiene de un
agente profiláctico o terapéutico, que no dan como resultado la
curación del trastorno. En ciertas realizaciones, se le administra
a un paciente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos para
"manejar" una enfermedad o trastorno, o síntomas asociados con
el trastorno o enfermedad, de modo que impidan la progresión o
empeoramiento de la enfermedad o trastorno.
El término "t-PA" se
refiere a t-PA natural t-PA
recombinante, así como a homólogos, derivados y polimorfismos de
t-PA que retienen la actividad catalítica del
t-PA natural.
Las frases "se une específicamente TAFIa o
TAFIai" o "es unido específicamente por TAFIa o TAFIai".
como se usan para describir la unión a un resto químicamente o
biológico significan que el resto químico o biológico se une a, o
es unido por no más de 10%, más preferiblemente no más de 5%, más
preferiblemente no más de 2%, más preferiblemente no más de 1%, más
preferiblemente no más de 0,5%, más preferiblemente no más de 0,1%,
más preferiblemente no más de 0,01% y más preferiblemente no más de
una cantidad indetectable en el ensayo particular que se usa, de la
forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido por
activación N-terminal de TAFI.
La frase "que mide específicamente el nivel de
TAFIa o TAFIai" significa detectar la cantidad de TAFIa o TAFIai
en una muestra sin detectar una cantidad significativa (por ejemplo,
no más de 10%, más preferiblemente no más de 5%, más
preferiblemente no más de 2%, más preferiblemente no más de 1%, más
preferiblemente no más de 0,5%, más preferiblemente no más 0,1%,
más preferiblemente no más de 0,01% de la cantidad presente en la
muestra) de la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o
el péptido por activación N-terminal de TAFI.
La frase "TAFIa estabilizado" significa
TAFIa que tiene una semivida de al menos una hora a temperatura
ambiente, más preferiblemente de al menos dos horas, más
preferiblemente de al menos cuatro horas, más preferiblemente de al
menos ocho horas, más preferiblemente de al menos doce horas, más
preferiblemente de al menos veinte horas y como máximo
preferiblemente de al menos cuarenta y ocho horas, todas a
temperatura ambiente.
La Figura 1 es una ilustración esquemática del
mecanismo de la inhibición de fibrinolisis por TAFI.
La Figura 2 muestra una correlación lineal entre
el desarrollo de color y el nivel de TAFIa en patrones diluidos en
serie.
La Figura 3 muestra la especificidad del ensayo
ELISA para TAFIa y TAFIai en presencia de TAFI
(pro-enzima de 60 kD).
La Figura 4 ilustra la cuantificación de
antígeno TAFIa/TAFIai en plasma de plasma normal mezclado
(abreviadamente PNP por la expresión inglesa Pooled Normal
Plasma) y de pacientes hemofílicos.
La Figura 5 muestra los niveles totales de TAFI
(TAFI + TAFIa + TAFIai) en plasma normal mezclado (PNP) y plasmas
de pacientes hemofílicos.
La Figura 6 muestra los porcentajes de niveles
de TAFI total (TAFI + TAFIa + TAFIai) aportados por TAFIa TAFIai en
plasma normal mezclado (PNP) y plasmas de pacientes hemofílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se dirige a un ensayo útil
para medir niveles TAFIa/TAFIai (o a uno de sus derivados o
variantes) en una muestra, que puede contener o no contener la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido por
activación N-terminal de TAFI, para detectar TAFIa y
TAFIai. pero no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI
ni el péptido por activación N-terminal de TAFI. La
presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que el
inhibidor de carboxipeptidasa de la patata (PTCI) es capaz de unirse
al TAFIai, así como al TAFIa, pero no a la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI ni al péptido por
activación N-terminal. El ensayo es útil para fines
de diagnóstico relacionados con la medida específica de niveles de
TAFIa y TAFIai (o uno de sus derivados o variantes), pero no
niveles de la forma pro-enzima de 60 kD ni el
péptido por activación N-terminal de TAFI, en una
muestra que puede contener o no contener la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido por
activación N-terminal de TAFI.
En una realización preferida, el ensayo mide el
nivel de TAFIa y TAFIai en una solución. Preferiblemente, el ensayo
se usa para medir el nivel de TAFIa y TAFIai en una solución
biológica (por ejemplo, sangre, plasma, orina, suero, semen y
fluido cerebral o espinal). El ensayo también se puede usar para
cuantificar los niveles de TAFIa y TAFIai en muestras de tejidos,
así como en sistemas enzimáticos purificados y fluidos de cultivos
celulares.
En ciertas realizaciones, la invención se dirige
a cualquier ensayo que use un resto de unión que específicamente se
una a TAFIa y/o TAFIai, pero no a la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI ni al péptido por
activación N-terminal de TAFI, y en donde se
detecta luego el complejo TAFIa/resto de unión o el complejo
TAFIai/resto de unión. En una realización, el resto de unión es un
inhibidor de bajo peso molecular. En otra realización, el resto de
unión es una pequeña proteína. En otra realización, el resto de
unión es plasminógeno. En otra realización, el resto de unión es un
anticuerpo específico de TAFIa o TAFIai. En una realización
preferida, el resto de unión es PTCI o uno de sus derivados o
análogos.
La formación de complejos se detecta
directamente, es decir, cuando el resto de unión está marcado
detectablemente (por ejemplo, un marcador colorimétrico,
fluorescente, quimioluminescente, enzimático, radioactivo o
magnético), o por un reactivo que se unen al complejo, estando
dicho reactivo marcado detectablemente.
Los métodos de la presente invención se pueden
aplicar a cualquier formato de ensayo conocido en la técnica, o sus
variaciones. En una realización, el ensayo es un inmunoensayo basado
en anticuerpos, en las donde las proteínas interactúan con TAFIa o
TAFIai o un complejo TAFIa o TAFIai/resto de unión. Los
inmunoensayos para detectar antígenos son bien conocidos en la
técnica, e implican la formación de complejos
antígeno-anticuerpo. El antígeno se puede añadir en
forma líquida, cuando se realiza en placas de inmunodifusión o
inmovilizado en una superficie, cuando se realiza usando ensayo con
inmunosorbente unido a enzima ("ELISA") en el popular formato
de 96 pocillos. En un ensayo de inmunodifusión, el complejo
antígeno-anticuerpo se puede detectar como una
línea de precipitación. En un radioinmunoensayo ("RIA"), se usa
un isótopo radioactivo para detectar la presencia del antígeno. En
un inmunoensayo enzimático, se usa un marcador detectable producido
por actividad enzimática (por ejemplo, por un sustrato cromógeno,
fluorógeno o radioactivo) para detectar la presencia del antígeno
(Engvalt and Perlmann, 1972, "Enzyme-linked
immunosorbent assay, Elisa 3. Quantitation of specific antibodies
by enzyme-labeled
anti-immunoglobulin in
antigen-coated tubes" J. Immunol.
109:129-35). En una realización preferida, el
anticuerpo usado en el inmunoensayo se une específicamente a TAFIa o
TAFIai y se une a no más de 10%, más preferiblemente no más de 5%,
más preferiblemente no más de 2%, más preferiblemente no más de 1%,
más preferiblemente no más de 0,5%, más preferiblemente no más de
0,1%, más preferiblemente no más de 0,01% y lo más preferiblemente
no más de una cantidad indetectable (es decir, indetectable en el
método de ensayo particular) de la forma pro-enzima
de 60 kD de TAFI o el péptido por activación
N-terminal de TAFI. Alternativamente, dicho
inmunoensayo se usa para detectar TAFIa o un complejo TAFIai/resto
de unión. Por ejemplo se usa un anticuerpo que reconoce TAFIa o
TAFIai (y también puede reconocer la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI cuando el complejo ha
sido aislado de la muestra).
Un tipo de inmunoensayo es la técnica
"sándwich". Los ensayos sándwiches usan comúnmente un
dispositivo lector de ELISA e implican el uso de al menos dos
anticuerpos. Típicamente, una muestra que contiene potencialmente
el antígeno se pone en contacto con un primer anticuerpo en un
soporte sólido. Después de retirar la muestra no unida (por
ejemplo, la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el
péptido por activación N-terminal de TAFI), un
segundo anticuerpo conjugado con enzima se pone en contacto con el
antígeno unido al primer anticuerpo se pone en contacto con el
complejo
anticuerpo-antígeno-anticuerpo sobre
el sustrato. Después de retirar el segundo anticuerpo no unido un
sustrato (por ejemplo, por un sustrato colorimétrico, fluorescente,
quimioluniscente, radiactivo o magnético) de la enzima. La
producción de un marcador detectable indica la presencia del
antígeno en la muestra, y la cantidad de marcador detectable
producido o la velocidad de producción de un marcador detectable se
pueden usar para determinar la cantidad del antígeno. En esta
realización, el anticuerpo u otra proteína de unión sobre el sobre
el soporte sólido se une específicamente a TAFIa o TAFIai. El
segundo anticuerpo no necesita necesariamente unirse
específicamente a TAFIa o TAFIai porque una etapa de lavado
eliminará cualquier proteína no unida antes de la adición del
segundo anticuerpo.
En una variación de la técnica sándwich, un
resto no de anticuerpo que específicamente se une a, o es unido
específicamente por, TAFIa o TAFIai es inmovilizado sobre un soporte
sólido. En una realización, el ensayo comprende PTCI que está
inmovilizado sobre un soporte sólido. En otra realización, el ensayo
comprende un inhibidor de bajo peso molecular, una proteína pequeña
o plasminógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. En una
realización particular, el soporte sólido es una placa de
microtitulación o una tira con micropocillos. En realizaciones en
donde se usa un formato de ensayo ELISA, se puede usar un lector
estándar de placas ELISA para analizar los resultados del ensayo y
cuantificar la cantidad de TAFIa o TAFIai presente en la
muestra.
En otra realización, el soporte sólido usado en
el ensayo es una perla o micropartícula. En esta realización, un
anticuerpo u otro resto que específicamente se une a, o es unido
específicamente por, TAFIa o TAFIai es inmovilizado sobre la perla
o micropartícula. En una cierta realización la perla o
micropartícula está en una suspensión (por ejemplo, para uso en
citometría de flujo o en un ensayo citométrico). Luego se detecta
la interacción entre TAFIa o TAFIai y el anticuerpo u otro resto que
específicamente se une a, o es unido específicamente por, TAFIa o
TAFIai o se cuantifican las perlas con TAFIa o TAFIai unidos. Dichos
métodos de detección son bien conocidos en la técnica. En
realizaciones específicas, la perla o micropartícula puede estar
modificada con poliestireno, resina acrílica, material magnético,
colorante, carboxilato o modificada con estreptavidina.
En otra realización, el soporte sólido es un
biochip. En esta realización, el anticuerpo u otro resto que
específicamente se une a, o es unido específicamente por, TAFIa o
TAFIai está inmovilizado en un biochip y se detecta
subsiguientemente la unión de TAFIa o TAFIai.
En otra realización, el ensayo comprende usar
PTCI para detectar TAFIa o TAFIai en un gel o TAFIa o TAFIai que ha
sido resuelto por electroforesis (por ejemplo, análisis por
transferencia Western, PAGE o SDS-PAGE).
En una realización, el ensayo comprende PTCI que
está libre en solución. En una realización particular, el ensayo
comprende PTCI que está libre en solución para detectar TAFIa o
TAFIai que está inmovilizado sobre un soporte sólido. En esta
realización, el TAFIa o TAFIai pueden estar inmovilizados en una
placa de 96 pocillos tal como en un ensayo ELISA, sobre una perla o
micropartícula, o en un biochip como en los formatos de ensayo
antes indicados.
En otra realización, el ensayo comprende el uso
de un agente capaz de unirse a, o ser unido por, un complejo de
TAFIa o TAFIai/PTCI. No es necesario que este agente sea específico
para TAFIa o TAFIai si se ha realizado una etapa de lavado después
de la formación del complejo TAFIa o TAFIai/PTCI. Sin embargo, si el
protocolo del ensayo particular que se usa permite que estén
presentes otras formas de TAFI (por ejemplo, la forma
pro-enzima de 60 kD), se prefiere que el agente sea
específico para el complejo TAFIa o TAFIai/PTCI. En particular, este
agente es cualquier resto que se una a, o es unido por, un complejo
TAFIa/PTCI. En una realización, el agente se une a la región de
TAFIa o TAFIai del complejo TAFIa o TAFIai/PTCI. En otra
realización, el agente se une a la región PTCI del complejo TAFIa o
TAFIai/PTCI, pero preferiblemente no se une al PTCI libre, a no ser
que el PTCI libre haya sido retirado antes de la adición del resto
que se une al complejo TAFIa/PTCI o al complejo TAFIai/PTCI. En
otra realización, el agente se une tanto a la región TAFIa o TAFIai
como a la región PTCI del complejo TAFIa o TAFIai/PTCI. En una
realización preferida, el agente es un anticuerpo que se une a
TAFIa y/o TAFIai. En una realización, el agente (por ejemplo,
anticuerpo) se marca de modo que su presencia sea detectable (por
ejemplo, tal como con un marcador colorimétrico, fluorescente,
quimioluminescente, enzimático, radioactivo o magnético). En una
realización preferida, el anticuerpo anti-TAFIa o
anti-TAFIai está conjugado con una enzima, a otro
anticuerpo o a cualquier otro resto detectable (por ejemplo, un
marcador o sonda detectable, tal como uno que sea colorimétrico,
fluorescente, quimioluminescente, radioactivo o magnético). En una
realización preferida, el anticuerpo anti-TAFIa o
anti-TAFIai está conjugado con peroxidasa de rábano
silvestre (HRP). En otra realización, el anticuerpo
anti-TAFIa o anti-TAFIai esta
conjugado con fosfatasa alcalina.
En todavía otra realización, el ensayo comprende
el uso de un sustrato para el marcador detectable unido al agente
capaz de unirse a, o ser unido por, el complejo TAFIa o TAFIai/PTCI.
En una realización particular el sustrato es cromógeno,
fluorescente, quimioluminescente o radioactivo. En una realización
el sustrato es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB).
En otra realización, el sustrato es
3,3'-diaminobencidina (DAB). En otra realización,
el sustrato es
4-cloro-1-naftol. En
otra realización, el sustrato es o-fenilendiamina
(OPD). En otra realización, el sustrato es
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC). En otra realización el sustrato es fluorescente (por
ejemplo, Amplex Red).
En los ensayos descritos anteriormente, existen
métodos de detección bien conocidos que dependen del formato de
ensayo elegido. Por ejemplo, los lectores de placas ELISA son bien
conocidos en la técnica para estos tipos de inmunoensayos. Los
epectrofotómetros y fluorómetros son bien conocidos y útiles para
ensayos con una sonda cromógena o fluorescente. Los contadores de
centelleo de líquidos son bien conocidos y útiles para ensayos que
emplean una sonda radioactiva.
En una realización, el ensayo tiene un límite de
detección inferior de 0,1 \mug/mL, preferiblemente 0,02
\mug/mL, más preferiblemente 0,002 \mug/mL y más preferiblemente
0,001 \mug/mL de TAFIa o TAFIai.
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En una realización preferida la presente
invención se refiere a un ensayo similar al de inmunosorbente con
enzima unida (ELISA) útil en medir niveles de TAFIa y TAFIai (o uno
de sus derivados o variantes) en soluciones que pueden contener o
no contener la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o
el péptido por activación N-terminal de TAFI. El
ensayo es útil para fines de diagnóstico relacionados con la medida
de niveles de TAFIa y TAFIai (o uno de sus derivados o variantes)
en una solución que puede contener o no puede contener la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido por
activación N-terminal de TAFI.
El ensayo similar a ELISA de acuerdo con la
presente invención es un ensayo que utiliza un resto capaz de
unirse específicamente a, o ser unido por, TAFIa y/o TAFIai. En
ciertas realizaciones el resto capaz de unirse específicamente a, o
ser unido específicamente por, TAFIa y/o TAFIai es un inhibidor de
bajo peso molecular, una pequeña proteína, plasminógeno o un
anticuerpo específico de TAFIa o TAFIai (es decir, se une a TAFIa o
TAFIai pero no se une específicamente la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI o al péptido por
activación N-terminal de TAFI).
En una realización preferida el resto capaz de
unirse específicamente a, o ser unido específicamente por, TAFIa
y/o TAFIai es el inhibidor PTCI de TAFI. Preferiblemente, el PTCI se
usa como un agente de unión inmovilizado al cual se unen
específicamente TAFIa y/o TAFIai en una muestra.
En una realización el ensayo comprende revestir
un soporte sólido (por ejemplo, una placa de microtitulación, una
tira de micropocillos, una perla o una micropartícula) con PTCI
seguido por exposición del soporte sólido revestido con PTCI a una
muestra para determinar los niveles de TAFIa o TAFIai en dicha
muestra. Solamente TAFIa y TAFIai se unirán al PCTI inmovilizado y
serán detectados en la muestra. Preferiblemente, hay una etapa de
lavado en este momento del protocolo de ensayo para retirar las
formas no unidas de TAFI. El soporte sólido revestido con PTCI se
expone subsiguientemente a un agente capaz de unirse a, o ser unido
por, TAFIa o TAFIai (por ejemplo, un anticuerpo
anti-TAFIa o anti-TAFIai,
preferiblemente conjugado con un marcador detectable, tal como, por
ejemplo peroxidasa de rábano silvestre (HRP)), pero no es
necesariamente específico de TAFIa o TAFIai (es decir, puede unirse
a la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI, tal como
Imuclone TAFI 873 de American Diagnostica, Inc.). Finalmente, se
añade un sustrato (preferiblemente de HRP, por ejemplo,
tetrametilbencidina (TMB)) para detectar la presencia del agente
anti-TAFIa o anti-TAFIai.
En otra realización, el ensayo comprende
revestir un soporte sólido (por ejemplo, una placa de
microtitulación, una tira de micropocillos, una perla o una
micropartícula) con PTCI seguido por exposición del soporte sólido
revestido con el PTCI a una muestra para determinar los niveles de
TAFIa o TAFIai en dicha muestra. Solamente TAFIa y TAFIai se unirán
al PTCI inmovilizado y serán detectados en dicha muestra.
Preferiblemente, hay una etapa de lavado en este momento del
protocolo de ensayo para retirar las formas no unidas de TAFI. El
soporte sólido revestido con PTCI se expone subsiguientemente a un
agente capaz unirse a, o ser unido por, TAFIa o TAFIai (por
ejemplo, un anticuerpo anti-TAFIa o
anti-TAFIai, en una realización un anticuerpo
monoclonal, en otra realización un anticuerpo monoclonal humano, en
todavía otra realización AHTAFI-5024 o
AHTAFI-5026), pero no necesariamente específico de
TAFIa o TAFIai (es decir, puede unirse a la forma
pro-enzima de 60 kD de TAFI, tal como Imuclone TAFI
873 de American Diagnostica, Inc.). Esta etapa va seguida
preferiblemente por una etapa de lavado y luego por la adición de
un segundo anticuerpo que tiene un marcador detectable, tal como un
conjugado marcado con IgG- HRP anti-ratón (por
ejemplo, conjugado IgG-HRP
anti-ratón de asno). Finalmente, se añade un
sustrato (preferiblemente de HRP, por ejemplo, tetrametilbencidina
(TMB)) para detectar la presencia de agente
anti-TAFIa o anti-TAFIai.
La adición de sustratos de TMB da como resultado
la producción de un producto cromógeno (azul) que se vuelve
amarillo por extinción de la reacción con ácido sulfúrico. La
absorbancia de la solución se mide a 450 nm y es directamente
proporcional a la cantidad de TAFIa/TAFIai presente en la
solución.
En una realización preferida el ensayo similar a
ELISA mide el nivel de TAFIa y TAFIai en una solución.
Preferiblemente, el ensayo se usa para medir el nivel de TAFIa y
TAFIai en una solución biológica (por ejemplo, sangre, plasma,
orina, suero, semen, esputos y fluido cerebral o espinal). El ensayo
también se puede usar para cuantificar los niveles de TAFIa y
TAFIai en muestras de tejidos, así como sistemas enzimáticos
purificados y fluidos de cultivos celulares.
En una realización el ensayo comprende el
inhibidor PTCI de TAFI; un patrón de TAFIa; un inmunoconjugado
anti-humano de TAFI-HRP; un
sustrato cromógeno de HRP, tal como OPD o TMB; un tampón apropiado,
por ejemplo, Tris-HCl 200 mM, tampón de pH 7,4; y
un reactivo de extinción, por ejemplo, H_{2}SO_{4} 0,45 M.
En otra realización el ensayo comprende el
inhibidor PTCI de TAFI; un patrón de TAFIa; un anticuerpo monoclonal
anti-humano de TAFI (por ejemplo, AHTAFI.5024 o
AHTA.FI-5026, comercialmente disponibles de
Haematological Technologies, Essex Junction, CT); conjugado marcado
con IgG-HRP anti-ratón de asno
(comercialmente disponible en Jackson Laboratories, Jackson, ME);
un sustrato cromógeno de HRP, tal como OPD o TMB; un tampón
apropiado, por ejemplo, Tris-HCI 200 mM, tampón de
pH 7,4; y un agente de extinción, por ejemplo, H_{2}SO_{4} 0,45
M.
En todavía otra realización, el anticuerpo
monoclonal anti-humano de TAFI está presente en una
concentración que varía desde aproximadamente 0,25 \mug/mL hasta
aproximadamente 1,0 \mug/mL. En todavía otra realización, el
conjugado marcado con IgG-HRP
anti-ratón de asno se usa en una dilución de
aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1:5000 en un tampón
apropiado (por ejemplo, Tris-HCl 200 mM, tampón de
pH 7,4).
En una realización el ensayo de acuerdo con la
presente invención utiliza pequeños volúmenes de solución
(aproximadamente 25 \muL) en volúmenes totales de reacción de
aproximadamente 250 \muL, que hace que la lectura del ensayo sea
la ideal para uso con lectores de placas de
micro-ensayos de 96 pocillos. En otra realización el
ensayo de acuerdo con la presente invención también se puede
adaptar fácilmente a volúmenes mayores (aproximadamente 1 mL) de
solución para leer en cubetas de tamaño estándar en espectrómetros
convencionales de mesa de trabajo
(bench-top). En otra realización el ensayo de
acuerdo con la presente invención se puede adaptar fácilmente a
volúmenes más pequeños (menos de 25 \muL) para lectura en
aplicaciones de escrutinio de alta productividad. El ensayo de
acuerdo con la presente invención es bastante rápido, siendo el
tiempo total de ensayo entre 30 y 60 minutos.
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La presente invención se refiere también a un
método de analizar soluciones biológicas, tales como, pero sin
limitación, sangre, plasma, orina, suero, semen y fluido cerebral o
espinal de un paciente específicamente en cuanto a los niveles de
TAFIa/TAFIai. El ensayo puede ser usado para diagnosticar una
enfermedad o trastorno particular o monitorizar un sujeto al que
previamente se le ha diagnosticado una enfermedad o trastorno
particular. El ensayo se puede usar también para monitorizar un
sujeto que recibe tratamiento para una enfermedad o trastorno
particular. En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es
cualquiera de dichas enfermedades o trastornos asociados con la
hiperfibrinolisis. En una realización, la enfermedad o trastorno es
causada por hiperfibrinolisis. En otra realización, la
hiperfibrinolisis es causada por la enfermedad o trastorno.
El resultado del ensayo de diagnóstico se puede
interpretar por comparación con controles o en relación con un
parámetro establecido a través de análisis estadístico de resultados
de ensayos previos. En una realización la cantidad de TAFIa/TAFIai
en una muestra de un sujeto se compara con el del (de)
sujeto(s) conocido(s) que no tienen un enfermedad o
trastorno particular (véase por ejemplo, el Ejemplo 6.4). En otra
realización, el nivel (o intervalo de valores) de TAFIa/TAFIai en
una muestra es indicativo de la presencia o ausencia de una
enfermedad particular se ha determinado mediante un análisis
estadístico de una población adecuada de sujetos. La determinación
de dicho parámetro puede ser conseguida por un experto en la técnica
usando métodos conocidos.
En una realización, la enfermedad o trastorno
hemorrágico incluye, pero sin limitación, hemofilia A, hemofilia B,
anemia hemolítica autoinmune, enfermedades del colágeno, enfermedad
de von Willebrand (VWD), púrpura de
Henoch-Schonlein, hemorragias agudas ampliamente
generalizadas, hiperfibrinolisis primaria, equistomatosis
hepatoesplénica, deficiencias de Factores sanguíneos y
hemostasis.
En otra realización, la enfermedad o trastorno
trombótico incluye, pero sin limitación, ataque cardiaco, ictus,
enfermedad tromboembólica, infarto de miocardio agudo (AMI),
trombosis venosa profunda, ataque isquémico agudo, embolismo
pulmonar masivo, coagulación intravascular diseminada (DIC),
síndrome anti-fosfolípidos, trombofilia familiar,
sepsis por púrpura trombocitopénica trombótica, artritis, hepatitis
fulminante y trombosis.
Las enfermedades y trastornos hemorrágicos y
trombóticos ocurren, en parte, porque el equilibrio normal entre la
coagulación y las cascadas fibrinolíticas ha sido afectado, alterado
o cambiado. Los métodos de la presente invención permiten que sea
detectado el cambio del equilibrio de las cascadas, facilitando por
tanto la diagnosis o monitorización del tratamiento para
enfermedades o trastornos hemorrágicos o trombóticos.
En otra realización la enfermedad o trastorno
hemorrágico es un efecto secundario de hemorragia asociado a la
administración de activador de plasminógeno tisular
(t-PA), activador de plasminógeno de uroquinasa
(t-PA), estreptoquinasa, estafiloquinasa,
plasminógeno o sus análogos, heparina, heparina de bajo peso
molecular, aspirina (por ejemplo, sobredosis) o cualquier otro
anti-coagulante (por ejemplo, sobredosis). En
ciertas realizaciones los efectos secundarios incluyen pero sin
limitación, transformación hemorrágica (HT).
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En ciertas realizaciones la invención
proporciona métodos para cuantificar niveles de TAFIa y TAFIai (o
sus derivados y variantes) en un sujeto. El sujeto es
preferiblemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo,
vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratones, ratas, etc.) o un
primate (por ejemplo, monos, tales como monos cinomolgos y seres
humanos). En una realización preferida el sujeto es un ser
humano.
En una realización, el sujeto tiene o es
susceptible de tener una enfermedad o trastorno hemorrágico y/o
trombótico, o cualquier otro asociado a niveles aberrantes de TAFIa
o TAFIai, o una enfermedad o trastorno que puede ser tratado,
impedido o manejado por modulación (por ejemplo, aumento o
disminución) de la actividad de TAFI, TAFIa o TAFIai.
En ciertas realizaciones el sujeto tiene o es
susceptible de tener una enfermedad o trastorno asociado con la
hiperfibrinolisis. En una realización, la enfermedad o trastorno
está causada por hiperfibrinolisis. En otra realización, la
hiperfibrinolisis es causada por la enfermedad o trastorno.
La invención también abarca métodos para
cuantificar niveles de TAFIa y TAFIai (o sus derivados o variantes)
en un sujeto que está recibiendo o ha recibido cualquier tratamiento
útil para la prevención de enfermedades o trastornos hemorrágicos
y/o trombóticos. En una realización preferida, la enfermedad o
trastorno hemorrágico y/o trombótico incluye, pero sin limitación,
hemofilia A, hemofilia B, anemia hemolítica autoinmune, enfermedades
del colágeno, enfermedad de von Willebrand (VWU), púrpura de
Henoch-Schonlein, hemorragia aguda ampliamente
generalizada, hiperfibrinolisis primaria, esquistosomiasis
hepatoesplénica, deficiencias de Factores sanguíneos, hemostasis,
ataque cardiaco, ictus, enfermedad tromboembólica, infarto de
miocardio agudo (AMI), trombosis de vena profunda, ataque isquémico
agudo, embolismo pulmonar masivo, coagulación intravascular
diseminada (DIC), síndrome anti-fosfolípidos,
trombofilia familiar, sepsis por púrpura trobocitopénica trombótica,
artritis, hepatitis fulminante y trombosis, enfermedad hepática;
cirrosis hepática aguda o crónica, anemia hemolítica autoinmune o
cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una excesiva
hemorragia o coagulación.
En una realización preferida el sujeto tiene o
es susceptible de tener hemofilia A o hemofilia B.
En otra realización el sujeto estará
experimentando o ha experimentado recientemente una operación
quirúrgica. En una realización el procedimiento quirúrgico es
cardiovascular tal como cirugía de colocación de un bypass o
injerto en la aorta. En otra realización la operación quirúrgica es
un trasplante de órgano. En realizaciones específicas el trasplante
de órgano es un trasplante de hígado o trasplante de corazón.
El ensayo también se puede usar para determinar
los niveles de TAFIa y TAFIai (o sus derivados o variantes) en un
sujeto que recibe terapias convencionales o experimentales que se
usan para prevenir, tratar o manejar enfermedades o trastornos
hemorrágicos y/o trombóticos.
En una realización, la invención proporciona
métodos para cuantificar los niveles de TAFIa y TAFIai en un sujeto
que habitualmente experimenta tratamiento para una enfermedad o
trastorno hemorrágico o trombótico.
En otra realización la invención proporciona
métodos parar cuantificar los niveles de TAFIa y TAFIai en un
sujeto que previamente ha experimentado tratamiento para una
enfermedad o trastorno hemorrágico.
En otra realización, la invención proporciona
métodos para cuantificar los niveles de TAFIa y TAFIai en un sujeto
que nunca ha experimentado tratamiento para una enfermedad o
trastorno hemorrágico o trombótico.
En una realización el tratamiento para la
enfermedad o trastorno hemorrágico es una terapia
pro-coagulante. En ciertas realizaciones la terapia
pro-coagulante es la administración de ácido
aminocaproico, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor VIIa,
Factor IXa, proteína C activada, trombina, fibrinógeno o plasma
crio-fraccionado.
En una realización el tratamiento para el
trastorno trombótico es terapia anti-coagulante. En
ciertas realizaciones la terapia anti-coagulante es
activador de plasminógeno (t-PA), activador de
plasminógeno uroquinasa (u-PA) o uno de sus
análogos estreptoquinasa, estafiloquinasa, plasminógeno o sus
análogos, heparina, heparina de bajo peso molecular o aspirina.
En otra realización el sujeto le ha sido
administrado TAFIa estabilizado (véase la solicitud de patente de
EE.UU. Nº 10/116.095, presentada el 4 de abril de 2002, incorporada
en la presente memoria como referencia), un inhibidor de TAFIa o
una de sus composiciones farmacéuticas. En una realización
particular el TAFIa estabilizado, el inhibidor de TAFIa o una de
sus composiciones farmacéuticas se administró concurrentemente con
uno o más agentes terapéuticos o profilácticos en la misma
composición farmacéutica. En otra realización el TAFIa estabilizado,
el inhibidor de TAFIa, o su composición farmacéutica se administró
concurrentemente con uno o más de otros agentes terapéuticos o
profilácticos en composiciones farmacéuticas separadas. En ciertas
realizaciones el otro agente terapéutico o profiláctico es útil
para el tratamiento, prevención o manejo de un trastorno hemorrágico
y/o trombótico. En otras realizaciones el agente terapéutico o
profiláctico no es útil para el tratamiento, prevención o manejo de
un trastorno hemorrágico y/o trombótico. En ciertas realizaciones el
agente terapéutico o profiláctico incluye, pero sin limitación,
t-PA, heparina, aspirina, Factor VII, Factor VIII,
Factor IX, ácido aminocaproico, proteína C activada, trombina,
fibrinógeno, plasma crio-fraccionado, actotrombina,
heparina de bajo peso molecular, hirudina, plasminógeno,
estreptoquinasa, estafiloquinasa, uroquinasa o hirulong.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización la invención proporciona un
ensayo para medir específicamente TAFIa y TAFIai en un paquete o
kit que comprende en uno o más envases un agente que se une al
complejo TAFIa/PTCI o al complejo TAFIai/PTCI y un patrón de TAFIa
o TAFIai.
En otra realización el kit comprende tiras de
micropocillos que contienen PTCI inmovilizado.
En otra realización el kit comprende una placa
de microtitulación revestida con PTCI inmovilizado.
En otra realización el kit comprende perlas
revestidas con PTCI inmovilizado.
En otra realización, el kit comprende un patrón
de TAFIa o TAFIai, un agente que se une a, o es unido por, el
complejo TAFIa o TAFIai/PTCI, una solución tampón, un sustrato del
agente que se une a, o es unido por, el complejo TAFIa o
TAFIai/PTCI y un agente de extinción.
En una realización el agente que se une a, o es
unido por, el complejo TAFIa o TAFIai/PTCI es un anticuerpo
anti-TAFIa o anti-TAFIai conjugado
con peroxidasa de rábano silvestre (HRP).
En una realización el sustrato del agente que se
une a, o es unido por, TAFIa o TAFIai es TMB.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, no de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una solución de 2 \mug/mL de PTCI
disolviendo 1 mg de PTCI en 500 mL de un tampón de ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOP). A
cada pocillo de la placa de microtitulación (por ejemplo, una placa
de microtitulación Immulon 4 (de alta unión) de 96 pocillos) se
añaden 100 mL de la solución de 2 \mug/mL de PTCI y se incuba a
4ºC durante una noche en una cámara húmeda. La placa se vacía luego
y se lava una vez con tampón de PBS/Tween al 1% y se añaden 100 mL
de solución de bloqueo (por ejemplo, SuperBloc, de Pierce Chemicals,
IN) a cada pocillo de la placa de microtitulación seguido por
incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se
vacían luego, se lavan 2 veces con tampón de PBS/Tween al 1% y se
secan al aire.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el patrón de TAFIa/TAFIai añadiendo
TAFI, trombina y trombomodulina en tampón. La mezcla se incuba a
37ºC durante una hora. El TAFIa/TAFIai se puede conservar congelado
o liofilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcaron con la enzima peroxidasa de rábano
silvestre (HRP) por métodos conocidos (Karnbegawa, Nippon
Rinsho 53:2160-7 (1995)500 \mug/mL de
anticuerpo monoclonal anti-humano TAFI. El
inmunoconjugado anti-humano
TAFI-HRP se diluye hasta 100 \mug/mL en tampón y
luego se diluye a 1 \mug/mL en tampón PBS/Tween para uso en el
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo para TAFIa, TAFIai, o uno de sus
derivados o variantes se puede realizar directa o
indirectamente.
Para el ensayo directo, el plasma se diluye 1:25
con tampón BSA/PBS/Tween al 0,5% para uso en el ensayo. El plasma
de ensayo diluido se añade a micropocillos revestidos con PTCI
(preparados como se ha descrito anteriormente en el apartado 6.1.1)
y se incuba a 37ºC durante dos horas. La placa se vacía y se lava
con tampón PBS/Tween. Se añaden 100 mL de inmunoconjugado de 1
mg/mL TAFI-HRP anti-humano
(preparado como se ha descrito antes el apartado 6.1.2) a cada
pocillo y se incuba a 37ºC durante una hora. La placa se vacía y se
lava dos veces con tampón PBS/Tween. Se añaden 100 mL del sustrato
TMB para la enzima (Moss, PA) a cada pocillo y se deja que se
desarrolle el color en cada pocillo durante aproximadamente 5 a
aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se
detiene por adición de 100 mL de H_{2}SO_{4} 0,45 M. Se lee la
absorbancia a 450 nm.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Para el ensayo indirecto, se diluye el plasma
1:25 con tampón BSA/PBS/Tween al 0,5% para uso en el ensayo. El
plasma de ensayo diluido se añade a micropocillos revestidos con
PTCI (preparados como se ha descrito anteriormente en el apartado
6.1.1) y se incuba a 37ºC durante dos horas. La placa se vacía y se
lava con tampón PBS/Tween. Se añaden 100 \muL de anticuerpo
monoclonal de TAFI anti-humano de
0,25-1,0 \mug/mL (tal como
AHTAFI-5024 o AHTAFI.5026, comercialmente
disponible en Haematological Technologies, Essex Junction, VT) a
cada pocillo y se incuba a 37ºC durante una hora. La placa se vacía
y se lava dos veces con tampón PBS/Tween. Se añaden 100 \muL de
conjugado IgG-HRP anti-ratón de asno
(comercialmente disponible en Jackson Laboratories, Jackson, ME) y
se incuba a 37ºC durante una hora. Se añaden 100 mL del sustrato TMB
para la enzima HRP (Moss, PA) a cada pocillo y de deja desarrollar
el color durante aproximadamente 5 a aproximadamente 15 minutos a
temperatura ambiente. La reacción se detiene por adición de 100 mL
de H_{2}SO_{4} 0,45 M. Se lee la absorbancia a 450 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
El patrón de TAFIa/TAFIai (preparado como se ha
descrito anteriormente en el apartado 6.1.2) se diluye formando una
serie (1:2) partiendo de 125 \mug/mL y se aplica a una placa de
microtitulación revestida con PTCI. El ensayo similar a ELISA se
realiza luego como se ha descrito en el apartado 6.1.4. Hay una
correlación lineal entre el desarrollo de color y el antígeno
TAFIa/TAFIai (véase la Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó TAFIa por incubación de TAFI con
trombina/trombomodulina. Se preparó TAFIai como se ha descrito
anteriormente en el apartado 6.1.2. Se analizaron soluciones que
contenían TAFI, TAFIa y TAFIai (0,001 - 1 \mug/mL) en un ensayo
similar a ELISA como se ha descrito anteriormente en el apartado
6.1.4. Los resultados como se muestran en la Figura 3 ilustran que
el ensayo similar a ELISA mide específicamente TAFIA y TAFIai pero
no TAFI.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron muestras de plasma de pacientes a
los que se les había diagnosticado hemofilia A o hemofilia B (n=20)
y de gente normal (plasma normal mezclado (PNP); n=2) para detectar
y cuantificar el antígeno TAFIa/TAFIai usando el ensayo similar a
ELISA como se ha descrito anteriormente en el apartado 6.1.4. Los
resultados se ilustran en la Figura 4. Se determinó que las dos
muestras de PNP tenían 7-10 \mug/mL de
TAFIa/TAFIai, mientras que el plasma de los pacientes con hemofilia
variaba desde 3 a 17 \mug/mL de antígeno TAFIa/TAFIai. Los
niveles de TAFIa/TAFIai eran elevados por encima de los niveles de
PNP en 12/20 muestras de plasma de pacientes con hemofilia.
Estos resultados muestran que los niveles de
TAFIa/TAFIai son elevados en sueros de pacientes con hemofilia y
sugieren que los pacientes que padecen hemofilia tienen una estado
hiperfibrinolítico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron muestras de plasma de pacientes a
los que les había diagnosticado hemofilia A o hemofilia B (n=20) y
de gente normal (plasma normal mezclado (PNP); n=2) para detectar y
cuantificar los niveles de pro-enzima TAFI usando
un ensayo cromógeno funcional (Actichrome 874 de American
Diagnostica, Inc.). Luego se calculó la cantidad total de proteína
TAFI en cada muestra de plasma (pro-enzima TAFI +
TAFIa/TAFIai) usando los datos de TAFIa/TAFIai del Ejemplo 6.3 y
los resultados del ensayo para TAFI Actichrome. Los resultados se
ilustran en la Figura 5. El nivel de TAFI total en el grupo de PNP
(valor medio = 28 \mug/mL) era significativamente mayor que el
nivel de TAFI total en todas las muestras de suero de pacientes con
hemofilia (valor medio 16,9 \mug/mL). Estos resultados muestran
que los niveles de TAFI en las muestras de suero de pacientes con
hemofilia eran significativamente reducidos y sugiere que TAFI se
metaboliza más fácilmente en suero de pacientes con hemofilia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calculó el porcentaje de proteína TAFI total
que está representado por el antígeno TAFIa/TAFIai que está
presente en muestras de plasma de pacientes a los que se les había
diagnosticado hemofilia A o hemofilia B (n=20) y de gente normal
(plasma normal mezclado (PNP); n=2) usando los datos de los Ejemplos
6.3 y 6.4. Los resultados se ilustran en la Figura 6. El antígeno
TAFIa/TAFIai representa aproximadamente 25% del TAFI total presente
en PNP, mientras que el antígeno TAFIa/TAFIai representa más del 50%
del TAFI total presente en el suero de pacientes con hemofilia. En
18/20 de las muestras de suero de hemofílicos, el porcentaje de
total TAFI correspondiente al antígeno TAFIa/TAFIai era
significativamente mayor que en las muestras de PNP. Esto indica
que el porcentaje de TAFI total que
corresponde al antígeno TAFIa/TAFIai puede ser un marcador útil para la diagnosis y/o monitorización de la hemofilia.
corresponde al antígeno TAFIa/TAFIai puede ser un marcador útil para la diagnosis y/o monitorización de la hemofilia.
Claims (42)
1. Un método para detectar TAFIa y TAFIai, pero
no la forma pro-enzima de 60 kD de TAFI o el péptido
de activación N-terminal de TAFI, en una muestra,
comprendiendo dicho método:
(i) poner en contacto dicha muestra con un
inhibidor de la carboxipeptidasa (PTCI) en condiciones que permiten
la unión de PTCI a TAFIa y TAFIai; y
(ii) detectar la unión de TAFI y TAFIai a
PTCI.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el
inhibidor de la carboxipeptidasa de la patata (PTCI) está
inmovilizado en un soporte sólido.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el
soporte sólido es una placa de microtitulación.
4. El método de la reivindicación 2, en donde el
soporte sólido es una perla o micropartícula.
5. El método de la reivindicación 1, en donde
dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha muestra
con un agente que se une a, o es unido por, un complejo TAFIa/PTCI o
un complejo TAFIai/PTCI.
6. El método de la reivindicación 5, en donde
dicho agente es un anticuerpo monoclonal anti-TAFIa
o anti-TAFIai.
7. El método de la reivindicación 1, en donde
dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha muestra
con un agente que se une al anticuerpo monoclonal
anti-TAFIa o anti-TAFIai, estando
dicho agente conjugado con HRP.
8. El método de la reivindicación 7, en donde
dicho agente es conjugado IgG-HRP
anti-ratón de asno.
9. El método de la reivindicación 1, en donde la
muestra es un fluido biológico de un paciente.
10. El método de la reivindicación 9, en donde
el fluido biológico es plasma.
11. El método de la reivindicación 9, en donde
el fluido biológico es sangre, orina, suero, semen o fluido
cerebral o espinal.
12. El método de la reivindicación 9, en donde
el paciente tiene un trastorno trombolítico.
13. El método de la reivindicación 9, en donde
el paciente tiene un trastorno hemorrágico.
14. El método de la reivindicación 9, en donde
el paciente está sometido a terapia
anti-coagulante.
15. El método de la reivindicación 14, en donde
la terapia anti-coagulante es administración de
activador de plasminógeno tisular (t-PA), activador
de plasminógeno de uroquinasa (u-PA) o uno de sus
análogos.
16. El método de la reivindicación 14, en donde
dicha terapia anti-coagulante es administración de
aspirina.
17. El método de la reivindicación 14, en donde
dicha terapia anti-coagulante es administración de
estreptoquinasa, estafiloquinasa, plasminógeno o sus análogos,
heparina o heparina de bajo peso molecular.
18. El método de la reivindicación 9, en donde
el paciente está sometido a terapia
pro-coagulante.
19. El método de la reivindicación 18, en donde
la terapia pro-coagulante es administración de ácido
aminocaproico, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor VIIa,
Factor IXa, proteína C activada, trombina, fibrinógeno o plasma
crio-fraccionado.
20. El método de la reivindicación 9, en donde
el paciente es susceptible de padecer un trastorno trombótico.
21. El método de la reivindicación 9, en donde
es paciente es susceptible de padecer un trastorno hemorrágico.
22. El método de la reivindicación 1, en donde
el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es
aproximadamente 0,1 \mug/mL.
23. El método de la reivindicación 1, en donde
el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es
aproximadamente 0,02 \mug/mL.
24. El método de la reivindicación 1, en donde
el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es
aproximadamente 0,002 \mug/mL.
25. El método de la reivindicación 1, en donde
el límite inferior de detección de TAFIa y TAFIai en la solución es
aproximadamente 0,001 \mug/mL.
26. Un kit que comprende en uno o más envases un
soporte sólido revestido con PTCI inmovilizado, un patrón de TAFIa
o TAFIai y un agente que se une a, o es unido por, un complejo
TAFIa/PTCI o un complejo TAFIai/PTCI.
27. El kit de la reivindicación 26, que
comprende sustrato del agente, una solución tampón y un agente de
extinción.
28. El kit de la reivindicación 26, en donde el
soporte sólido es una tira para un micropocillo.
29. El kit de la reivindicación 26, en donde el
soporte sólido es una placa de microtitulación.
30. El kit de la reivindicación 26, en donde el
soporte sólido es una perla o macropartícula.
31. El kit de la reivindicación 29, en donde el
sustrato del agente que se une a, o es unido por, el complejo
TAFIa/PTCI o un complejo TAFIai/PTCI es TMB.
32. Un método de diagnosticar un trastorno
asociado a la fibrinólisis en un paciente, comprendiendo dicho
método usar PTCI para medir específicamente el nivel de TAFIa y
TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de
TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI
en una muestra biológica de dicho paciente.
33. El método de la reivindicación 32, en donde
el trastorno es un trastorno trombótico.
34. El método de la reivindicación 32, en donde
el trastorno es un trastorno hemorrágico.
35. Un método de monitorizar un trastorno
asociado con la fibrinólisis en un paciente, comprendiendo dicho
método usar PTCI para medir específicamente el nivel de de TAFIa y
TAFIai, pero no la forma pro-enzima de 60 kD de
TAFI o el péptido de activación N-terminal de TAFI
en una muestra biológica de dicho paciente.
36. El método de la reivindicación 35, en donde
el trastorno es un trastorno trombótico.
37. El método de la reivindicación 35, en donde
el trastorno es un trastorno hemorrágico.
38. El método de la reivindicación 5 o el kit de
la reivindicación 28, en donde dicho agente es un anticuerpo
anti-TAFIa o anti-TAFIai conjugado
con peroxidasa de rábano silvestre (HRP).
39. El método de la reivindicación 8 o el kit de
la reivindicación 29, en donde dicha etapa de detección comprende
poner en contacto dicha muestra con un sustrato de peroxidasa de
rábano silvestre (HRP).
40. El método de la reivindicación 39, en donde
dicho sustrato de peroxidasa de rábano silvestre (HRP) es
3,3',5,5'-tetrametillencidina (TMB).
41. El método de las reivindicaciones 12, 20, 33
o 36, en donde el trastorno trombótico es un ataque cardiaco,
ictus, enfermedad tromboembólica, infarto de miocardio agudo (AMI),
trombosis venosa profunda, ataque isquémico agudo, embolismo
pulmonar masivo, coagulación intravascular diseminada (DIC),
síndrome anti-fosfolipídico, trombofilia familiar,
sepsis púrpura trombocitopénica trombótica, artritis, hepatitis
fulminante o trombosis.
42. El método de la reivindicación 13, 21, 34 o
37, en donde el trastorno hemorrágico es hemofilia A, hemofilia B,
anemia hemolítica autoinmune, un enfermedad del colágeno, la
enfermedad de von Willebrand (VWD), púrpura de
Henoeh-Schonlein, hemorragia extendida generalizada
aguda, hiperfibrinolisis primaria, esquistosomiasis
hepatoesplénica, deficiencias de Factores o hemostasis.
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Families Citing this family (5)
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|---|---|---|---|---|
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| CN102183635A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-09-14 | 辽宁迈迪生物科技有限公司 | Tafi含量的体外检测试剂盒 |
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| CN107629117B (zh) * | 2017-09-26 | 2020-10-30 | 辽宁迈迪生物科技股份有限公司 | 用于结合TAFIa/ai的蛋白质及其应用和用于检测TAFIa/ai含量的试剂盒 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206161A (en) | 1991-02-01 | 1993-04-27 | Genentech, Inc. | Human plasma carboxypeptidase B |
| US5972990A (en) | 1992-04-10 | 1999-10-26 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods for reducing risk of repeat myocardial infarction and increasing survival in heart attack victims |
| US5993815A (en) * | 1996-11-08 | 1999-11-30 | University Of Vermont | Methods and compositions for inhibiting the activation of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) |
| US5985562A (en) | 1997-06-03 | 1999-11-16 | Schering Aktiengesellschaft | Method of detecting thrombotic disease risk associated with plasma carboxypeptidase B polymorphisms |
| KR100523112B1 (ko) | 1997-10-17 | 2005-10-19 | 유로진 리미티드 | 레닌-안지오텐신계 억제제의 사용 |
| EP1383885A4 (en) * | 2001-04-04 | 2005-11-30 | American Diagnostica Inc | METHOD FOR PRODUCING A STABILIZED THROMBIN-ACTIVATED FIBRINOLYSE INHIBITOR (TAFI) AND METHOD FOR THE USE THEREOF |
| FR2826962B1 (fr) * | 2001-07-06 | 2003-10-31 | Stago Diagnostica | Nouveaux substrats chromogenes et leur utilisation pour le dosage de l'activite de carboxypeptidases |
| CN111650813B (zh) | 2019-03-04 | 2024-04-16 | 东京毅力科创株式会社 | 基板处理装置、基板检查装置及方法、以及记录介质 |
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2003
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