ES2344689T3 - Composicion antimicrobiana. - Google Patents
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Abstract
Un cultivo biológicamente puro de una cepa Mia de Streptococcus salivarius en depósito en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124, Braunschweig, Alemania, número de acceso DSM 14685.
Description
Composición antimicrobiana.
Esta invención se refiere a una nueva cepa Mia
de Streptococcus salivarius, a composiciones que la
contienen, y al uso de la cepa Mia de Streptococcus
salivarius como un agente antimicrobiano, particularmente en la
prevención o tratamiento de caries dentaria.
La caries dentaria es una enfermedad
caracterizada por la disolución de la porción mineral del diente. A
medida que la caries progresa, se produce la destrucción del
esmalte y dentina del diente, seguido de la inflamación de la pulpa
y de los tejidos periapicales.
Los estreptococos mutantes (MS) son un racimo de
especies estreptocócicas acidogénicas, que habitan la placa
dentaria, que se consideran los agentes patógenos principales de la
caries. Actualmente, se reconocen siete especies de MS diferentes
(conocidas como S. mutans, S. rattus, S. cricetus. S.
sobrinus, S. ferus, S. macacae, y S. downei). De estas
siete especies, principalmente las que tienen importancia son S.
mutans y S. sobrinus en términos de caries humana.
A lo largo de los años se han desarrollado e
intentado diversos métodos, con resultados variables, para prevenir
o al menos aliviar el problema de la caries dentaria. Se han
sugerido tratamientos con antibióticos, tales como penicilina, y
son eficaces, pero destruyen indiscriminadamente tanto las bacterias
útiles como las dañinas en la boca, conduciendo a desequilibrios
microbianos.
A fin de minimizar la destrucción de la
microflora bucal, se han investigado organismos productores de
antibióticos en busca de su capacidad para inhibir la caries. Un
grupo de organismos identificados como potenciales a este respecto
son los microorganismos productores de sustancias inhibidoras
similares a bacteriocina (BLIS). Se han identificado productores de
BLIS de los géneros Streptococcus, Staphylococcus y
Enterococcus en busca de la aplicación potencial para la
prevención de la caries dentaria (Balakrishnan, M. et al.,
Caries Res. 2001; 35:75-80).
Lo que se busca es un análogo no virulento de la
S. mutans que provoca la enfermedad, o una cepa denominada
efectora. Para servir como cepa efectora en terapia de sustitución
en infección bacteriana, el microorganismo debe ser no virulento
por sí mismo, y debe ser capaz de competir con éxito con el
microorganismo patógeno vía acción competitiva y/o acción
antibiótica. Se han identificado cepas efectoras de S. mutans
(Hillman et al., J Dent Res. 1987;
66:1092-4; James y Tagg, N Z Dent J. 1991;
87:80-3), y muestran una fuerte actividad
anti-S. mutans. Una desventaja del uso de las cepas efectoras
de S. mutans es el potencial cariogénico de estas cepas.
S. salivarius es una especie
estreptocócica alternativa que evita esta desventaja. En el
documento WO 01/27143 se identifican cepas de S. salivarius
que tienen utilidad en el tratamiento de caries dentaria provocada
al menos en parte por S. sobrinus. No se registró ninguna
actividad frente a MS generalmente, o frente a S. mutans en
particular. De forma similar, en Balakrishnan (más arriba), se
identificó S. salivarius K3 como activo frente a S.
sobrinus cuando se hacen crecer en medio de agar con caldo de
tripticasa de soja más extracto de levadura y carbonato de calcio,
pero no tuvo ningún efecto sobre S. mutans.
TOVE-R de S. salivarius
(Tanzer, J.M. et al.; Infect Immun., 1985,
48:44-50) es una cepa antagonista, que provocó una
reducción de la caries dentaria. No ha habido informes de producción
de BLIS por esta cepa.
El documento WO 01/27143 (Universidad de Otago)
se refiere a una proteína antibacteriana que se puede aislar de la
cepa K12 de S. salivarius, en depósito en Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania,
número de acceso DSM 13084.
Se ha repasado el uso de sustancias inhibidoras
similares a bacteriocina (BLIS) para la eliminación de estreptococos
mutantes de la placa (James y Tagg (1991) New Zealand Dental
Journal 87:80-83).
A partir del estudio de un gran número de cepas
bacterianas de los géneros streptoccocus, enterococcus y
staphylococcus, se ha sugerido que hay una diversidad en el
intervalo de acción inhibidora frente a estreptococos mutantes y
otras especies estreptocócicas orales por las sustancias inhibidoras
similares a bacteriocina (Balakrishnan et al. (2001) Caries
Res 35-75-80).
El documento
US-A-3.925.160 se refiere a un
procedimiento para producir una sustancia antibiótica cultivando la
cepa K58 de Streptococcus salivarius.
Kurasz et al, (1986; J Dent Res
65(9):1149-1153) han investigado el
crecimiento y competición entre TOVE-R de S.
salivarius y los estreptococos mutantes.
Se ha estudiado la capacidad de la cepa
TOVE-R de Streptococcus salivarius para
inhibir la aparición ecológica de representantes virulentos de los
estreptococos mutantes humanos más predominantes en los dientes de
ratas libres de patógenos específicos (Tanzer et al. (1985)
Infection and Immunity 49:76-83; y Tanzer et
al. (1985) Infection and Immunity
48:44-50).
Los Solicitantes han identificado ahora cepas de
S. salivarius productoras de BLIS con un amplio espectro de
actividad frente a organismos que provocan la caries dentaria por
MS, incluyendo S. mutans.
La presente invención se refiere de forma amplia
a estas nuevas cepas de S. salivarius, y al uso de cepas de
S. salivarius anti-MS en el tratamiento de la
caries dentaria, o al menos proporciona al público una elección
útil.
En consecuencia, en un aspecto, se puede afirmar
de forma amplia que la presente invención consiste en un cultivo
biológicamente puro de una cepa Mia de Streptococcus
salivarius en depósito en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124,
Braunschweig, Alemania, número de acceso DSM 14685.
De este modo, la invención proporciona un
cultivo biológicamente puro de una cepa Mia de Streptococcus
salivarius que es una productora de Salivaricina
A_{2} y muestra actividad anti-MS.
Para el metabolismo de hidratos de carbono, la
cepa es positiva para el uso de cada uno de
L-arabinosa, inulina, glucógeno, xilitol, y
\beta-gentobiosa, o para la producción de
\beta-galactosidasa; y es negativa para el uso de
cada uno de glicerol,
\alpha-metil-D-manósido,
o para la producción de fosfatasa alcalina.
La invención también proporciona un extracto
obtenible de la cepa Mia de S. salivarius, extracto el cual
tiene actividad anti-MS. En particular, el extracto
tiene actividad anti-S. mutans.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona una composición bacteriana que incluye una cepa Mia de
S. salivarius como se define anteriormente.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona una formulación terapéutica que comprende una
cepa Mia de S. salivarius o extracto como se define
anteriormente, junto con un diluyente, vehículo y/o excipiente.
En una realización, la composición o formulación
comprende además un agente antibacteriano secundario.
En una realización, las formulaciones
terapéuticas están en forma de alimentos o bebidas, preferiblemente
en forma de un alimento o bebida a base de un producto lácteo.
Formas alternativas son medicamentos, pastillas para chupar y
dulces.
La invención proporciona además un método para
al menos inhibir el crecimiento de bacterias sensibles a S.
salivarius de la invención, comprendiendo el método poner en
contacto las bacterias sensibles con una cantidad inhibidoramente
eficaz de una cepa Mia de S. salivarius, extracto o
composición o formulación de la invención.
Preferiblemente, las bacterias sensibles son MS,
y más preferiblemente S. mutans.
En otro aspecto la invención proporciona un
método para al menos inhibir el crecimiento de MS o S.
mutans, comprendiendo el método poner en contacto los MS o
S. mutans con una cantidad inhibidoramente eficaz de una
cepa Mia de S. salivarius, extracto, composición o
formulación de la invención.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona el uso de una cepa Mia de S. salivarius o
extracto de la invención en la preparación de una composición o
formulación para uso en un método de tratamiento profiláctico o
terapéutico de caries dentaria provocada al menos en parte por S.
mutans en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método
administrar a dicho individuo la composición o formulación que se
administra en una cantidad eficaz para al menos inhibir el
crecimiento de S. mutans en la cavidad oral del
individuo.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona el uso de una cepa Mia de S. salivarius o
extracto de la invención en la fabricación de una composición o
formulación para uso en un método para controlar la incidencia o
gravedad de caries dentaria, que comprende introducir la composición
o formulación en la cavidad oral de un individuo susceptible a
caries dentaria.
En una realización, la caries dentaria es
provocada por MS.
Preferiblemente, S. salivarius se
administra como parte de un alimento, bebida o nutracéutico.
Los métodos de la invención pueden incluir la
etapa preliminar de pretratar el individuo para al menos reducir la
microflora normal ya presente.
La invención también se refiere al uso de la
cepa Mia de S. salivarius o extractos de la invención en las
composiciones y métodos explicados anteriormente.
En otro aspecto, la invención también se refiere
al uso de la cepa Mia de S. salivarius y extractos activos
en los métodos explicados anteriormente, para inhibir, controlar,
prevenir o tratar caries dentaria provocada al menos en parte por
S. mutans, y más habitualmente por MS.
Aunque la invención se describe ampliamente
según lo anterior, se apreciará por las personas expertas en la
técnica que la invención no está limitada a ello, sino también
incluye realizaciones de las cuales la siguiente descripción da
ejemplos.
Como se señala anteriormente, la presente
invención se refiere en un primer aspecto a la cepa Mia de
Streptococcus salivarius que produce Salivaricina A_{2} y
que muestra actividad anti-MS. Cuando se hace crecer
en agar TSBCaYE, la cepa de S. salivarius muestra de forma
deseable actividad frente a un espectro amplio de MS, incluyendo
S. mutans. En el documento WO 01/27143, incorporado aquí como
referencia, se describe por ejemplo Salivaricina A_{2} y
una cepa de S. salivarius productora de A_{2} (cepa
K12).
En una realización, la invención se refiere a
una cepa Mia de S. salivarius y a cepas de S.
salivarius que tienen las características identificativas de la
misma.
La cepa Mia es diferente de la cepa K12 en sus
características bioquímicas según se determina usando el kit API 20
Strep (bioMérieux) y API 50 CH (bioMérieux) que permite el estudio
de metabolismo de hidratos de carbono. Las diferencias se resumen
en lo siguiente:
Preferiblemente, las cepas para uso en la
invención muestran al menos una, preferiblemente al menos tres, más
preferiblemente al menos seis, e incluso más preferiblemente todas
las características bioquímicas distintivas de la cepa Mia.
Mia también muestra una actividad
anti-MS más potente, y en particular una actividad
anti-S. mutans más potente que K12.
La cepa Mia de S. salivarius es una cepa
productora de BLIS con actividad frente a otras bacterias,
particularmente estreptococos, y particularmente MS, incluyendo
S. mutans. La cepa Mia de S. salivarius se depositó
en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1 b, D-38124, Braunschweig,
Alemania, el 12 de diciembre de 2001, y se le ha asignado el número
de acceso DSM 14685.
Como se señala anteriormente, los MS son
considerados los agentes patógenos principales en caries dentaria,
teniendo S. mutans particular importancia. Aunque se han dado
a conocer previamente cepas de S. salivarius productoras de
BLIS activas frente a estreptococos, esta es la primera vez que se
ha identificado S. salivarius productora de BLIS activa
frente a MS, y frente a S. mutans en particular.
Las cepas de S. salivarius de la
invención muestran una actividad antibacteriana de amplio espectro,
particularmente cuando se hacen crecer en medios de agar TSBCaYE.
Por lo tanto, las S. salivarius son útiles como agentes
antibacterianos per se, así como terapéuticamente. En este
contexto, "terapéutico" incluye el tratamiento profiláctico.
Los usos terapéuticos incluyen el tratamiento o prevención de
infecciones microbianas, especialmente infecciones estreptocócicas.
Las salivarius de la invención son particularmente adecuadas
para uso frente a MS y S. mutans. Las afecciones
susceptibles al tratamiento con las cepas o extractos de la invención incluyen caries dentaria, amigdalitis, y halitosis.
susceptibles al tratamiento con las cepas o extractos de la invención incluyen caries dentaria, amigdalitis, y halitosis.
La invención también se refiere a extractos
obtenibles a partir de cepas de S. salivarius productoras de
salivaricina A_{2}, y especialmente de cepas de la
invención. Estos extractos activos se pueden usar de forma similar
en formulaciones y métodos terapéuticos. Los extractos se pueden
obtener usando protocolos conocidos en la técnica, convenientemente
mediante cultivo celular y centrifugación.
Una "formulación terapéutica" es una
formulación apropiada para la administración de una cepa de S.
salivarius o extracto de la invención a un individuo que la
necesite, particularmente un individuo susceptible a caries
dentaria. En general, las formulaciones terapéuticas de la invención
están compuestas de una cepa de S. salivarius o extracto de
la invención, y un vehículo, diluyente y/o excipiente aceptable.
Un "vehículo, diluyente y/o excipiente
aceptable" significa un vehículo para el suministro de una cepa
de S. salivarius o extracto de la invención al individuo, en
el que el vehículo es compatible con la viabilidad de la célula
bacteriana, o actividad del extracto. Los vehículos aceptables
adecuados para uso en la administración de cepas de S.
salivarius viables de la invención y extractos son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos adecuados
son generalmente inertes y pueden ser sólidos o líquidos.
En una realización, el vehículo es un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables adecuados para uso aquí con las cepas de S.
salivarius incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones
salinas tamponadas (por ejemplo, disolución salina tamponada con
fosfato), medios de cultivo farmacéuticamente aceptables (por
ejemplo BACa, agar TSBCaYE), u otras disoluciones que mantienen la
viabilidad de la bacteria. Adicionalmente, tales vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden ser disoluciones, suspensiones
y emulsiones acuosas o no acuosas. En la técnica se conoce bien una
variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para
la administración oral de bacterias viables o liofilizadas (véase,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Gennaro,
ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., incorporado aquí como
referencia; y la composición farmacéutica LACTINEX^{TM}, una
formulación comercialmente disponible para administración oral de
lactobacilos viables). Los vehículos sólidos adecuados conocidos en
la técnica incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio; estearato
de magnesio; celulosas; talco; azúcares tales como fructosa,
sacarosa, manitol, lactosa; almidones; harinas; y leche desnatada, y
polvos comestibles similares, pero no se limitan a ellos. De forma
similar, los vehículos para administración de extractos son bien
conocidos.
Los diluyentes típicos, a título de ejemplo,
son: almidones; lactosa; manitol; caolín; fosfato o sulfato de
calcio; sales inorgánicas tales como cloruro de sodio; y azúcares o
celulosas en polvo.
Las composiciones también pueden incluir
excipientes tales como auxiliares para la compresión; resinas;
cargas; aglutinantes; lubricantes; disolventes; agentes
deslizantes; disgregantes; conservantes; tampones; saborizantes;
colorantes; edulcorantes; y fragancias, según sea apropiado. Un
excipiente preferido para la capacidad de fluidez y compactabilidad
del comprimido es ProSolv^{TM} (Penwest, NY, USA). Un edulcorante
preferido es isomalta.
Los aglutinantes típicos incluyen almidón;
gelatina; azúcares, tales como lactosa, fructosa, y glucosa; y
similares. También son convenientes las gomas naturales y
sintéticas, incluyendo goma arábiga, alginatos; metilcelulosa;
polivinilpirrolidona; tragacanto; y similares. También pueden servir
como aglutinantes el polietilenglicol; la etilcelulosa; y ceras. Un
aglutinante actualmente preferido es Emdex^{TM} (Penwest, NY,
USA).
Los lubricantes para evitar la adhesión a la
matriz durante la formación incluyen sólidos resbaladizos tales
como talco, sílice, estearato de magnesio y de calcio,
polietilenglicol, ácido esteárico, y aceites vegetales
hidrogenados.
Los disgregantes son sustancias que se hinchan
cuando se humedecen, para romper la pastilla y liberar la S.
salivarius o el extracto. Los disgregantes incluyen almidones;
arcillas; celulosas; alginas y gomas; más particularmente,
almidones de maíz y de patata; metilcelulosa; agar; bentonita;
celulosa maderera; resinas de intercambio catiónico; ácido
algínico; goma guar; pulpa de cítrico; carboximetilcelulosa; esponja
en polvo; y laurilsulfato de sodio.
Las cepas de S. salivarius o extractos de
la invención se pueden formular en cualquiera de una variedad de
composiciones adecuadas para la administración oral. Por ejemplo,
las cepas de S. salivarius se pueden formular para
administración como un liófilo o pasta celular preparada a partir de
un cultivo de S. salivarius, o se pueden administrar
directamente a la cavidad oral. La cepa o extracto también se pueden
administrar en forma de un colutorio, enjuague bucal, pasta de
dientes, pulverización bucal, gárgaras, cápsula, pastilla para
chupar, jarabe, hilo dental, goma de mascar, o comprimido
masticable, pero las formas no se limitan a estas.
Las formulaciones terapéuticas pueden incluir
alimento, dulce o bebida. En una realización, la materia alimentaria
o bebida es un alimento o bebida a base de un producto lácteo,
incluyendo, a título de ejemplo, yogur, queso, leche, leche en
polvo, bizcochos de leche, y leches con sabores. En el caso de
confitería, la formulación puede ser una goma de mascar tal como se
describe en el documento WO 00/05972. Una formulación preferida
emplea S. salivarius liofilizada de la invención en
formulaciones de leche en polvo de una manera similar a lo dado a
conocer previamente para la preparación de leche en polvo con
bífidus (Nagawa et al. (1988); J. Dairy Sci.
71:1777-1782).
Una formulación oralmente administrable de S.
salivarius es una mezcla de cepas de S. salivarius
liofilizadas con leche en polvo desnatada o similar, que se ha
aromatizado para potenciar su sabor agradable.
La formulación oralmente administrable
actualmente preferida de S. salivarius, o extractos de la
invención, son pastillas para chupar, comprimidos masticables, o
cápsulas. Se prefieren particularmente las pastillas para chupar.
Una pastilla para chupar según la invención comprende una cepa de
S. salivarius o extracto de la invención, isomalta y emdex.
La pastilla para chupar se puede preparar mediante compresión
directa, granulación en húmedo, o granulación en seco. Las
pastillas para chupar se pueden revestir según la práctica
farmacéutica bien conocida.
La formulación terapéutica puede contener
adicionalmente nutrientes para mantener la viabilidad de la bacteria
en la formulación. Como se señala anteriormente, la formulación
puede contener también agentes saborizantes, agentes colorantes,
fragancias, u otros compuestos que aumentan el sabor agradable de la
composición y/o potencian la aceptación del paciente sin
comprometer la eficacia de la formulación. Los métodos para la
preparación de formulaciones para administración oral son bien
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., más arriba, incorporado aquí como
referencia).
Para uso antimicrobiano general, las
formulaciones también se pueden producir para otros métodos de
administración, incluyendo formulaciones tópicamente
administrables, pero no se limitan a esto.
K12 y sus extractos activos explicados
anteriormente se pueden preparar de forma similar como antes,
incluyendo en las composiciones y formulaciones discutidas.
Las formulaciones y composiciones de la
invención pueden comprender además uno o más agentes antibacterianos
secundarios. Estos agentes secundarios pueden ser, por ejemplo,
antibióticos, u otro agente antibacteriano o microorganismos
productores de agentes antibacterianos. Los antibacterianos útiles
incluyen nisina, u otra BLIS, por ejemplo. Preferiblemente, el
agente antibacteriano secundario es una BLIS o un microorganismo
productor de BLIS. La BLIS puede ser una o más de salivaricinas A,
A_{1}, A_{2} y B. Otros microorganismos antibacterianos
incluyen S. salivarius conocido tal como K12 y K30.
Las cepas de S. salivarius de la
invención se encuentran principalmente en la superficie de la
lengua. Las combinaciones con S. salivarius que crecen en la
placa dental, tal como TOVE-R (más arriba), serían
útiles.
Las formulaciones y composiciones de la
invención pueden comprender además otros agentes anticariogénicos,
por ejemplo xilitol, fluoruro, miel de Manuka, y taninos.
En el tratamiento de la caries dentaria, las
cepas de S. salivarius o extractos de la invención se pueden
administrar a cualquier individuo susceptible a caries dentaria,
habitualmente un individuo en el que S. mutans o MS
colonizan la cavidad oral de forma que la caries dentaria está
provocada, al menos en parte, por S. mutans, y más
habitualmente por MS.
El término "individuo", como se usa aquí,
incluye seres humanos, caballos, perros, gatos, cerdos, ovejas,
ganado vacuno, cabras, pero no se limita a estos. Preferiblemente,
el individuo es un ser humano. Las cepas de S. salivarius se
pueden administrar al individuo a cualquier edad, por ejemplo en la
niñez, adolescencia, o madurez.
La S. salivarius de la invención o K12 se
puede administrar oralmente en una variedad de formas. Por ejemplo,
en forma de composiciones o formulaciones explicadas anteriormente,
o como suspensiones, fórmulas de liberación sostenida (por ejemplo
un implante oral que contiene la cepa de S. salivarius) o
polvos liófilos. Las cepas de S. salivarius también se
pueden administrar mediante aplicación directa de un liófilo,
cultivo, o pasta celular al diente o a la lengua del individuo.
Cualquier modo de administración es adecuado en tanto que la
formulación terapéutica se aplique a la cavidad oral. En una
realización, la S. salivarius o extractos se administran
aplicando directamente a los dientes del individuo, por ejemplo
cepillando y/o usando hilo dental.
En general, la cantidad de S. salivarius
administrada al individuo será una cantidad eficaz para la
sustitución de las cepas de MS que provocan la caries dentaria, o
al menos S. mutans, en la cavidad oral del huésped. "Una
cantidad eficaz para la sustitución de las cepas de MS que provocan
la caries dentaria, o al menos S. mutans, en la cavidad oral
del huésped" significa una cantidad eficaz para la colonización
de la cavidad oral por la cepa de S. salivarius, y una
reducción significativa de S. mutans o cepas de MS residentes
que provocan la caries dentaria (por ejemplo mediante competición
entre las bacterias por los nutrientes, y/o mediante la producción
de BLIS por la cepa de S. salivarius).
La expresión "dosis unitaria", cuando se
usa con referencia a una formulación terapéutica de la presente
invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas
como dosificación unitaria para el individuo, conteniendo cada
unidad una cantidad predeterminada de material activo (S.
salivarius viable o extracto activo de la misma), calculada
para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el
diluyente, vehículo o excipiente requerido.
Las dosificaciones específicas pueden variar
ampliamente según diversas variables individuales, incluyendo el
tamaño, peso, edad, gravedad de la enfermedad (por ejemplo la
tenacidad y/o número de MS residentes que provocan la caries
dentaria) y sensibilidad a la terapia (por ejemplo, la
susceptibilidad de la cavidad oral del individuo a la
colonización). Los métodos para determinar la ruta apropiada de
administración y la dosis se pueden determinar por el consumidor
según se consideren apropiados, o en una base de caso por caso por
el dentista u otro médico. Tales determinaciones son habituales para
una persona de pericia normal en la técnica (véase, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, 8ª ed., Gennaro, ed., Mack
Publishing Company, Easton, Pa., 1990).
En general, el número de S. salivarius
administradas al individuo oscilará desde alrededor de 10^{2}
hasta 10^{15} bacterias, preferiblemente desde alrededor de
10^{3} hasta 10^{14} bacterias, más preferiblemente desde
alrededor de 10^{5} hasta 10^{12} bacterias, normalmente
alrededor de 10^{9} a 10^{10} unidades formadoras de colonias
(CFU) por dosis. Una formulación de pastilla para chupar emplea 3,8
x 10^{9} CFU/ml.
Se pueden administrar múltiples dosis de la cepa
de S. salivarius para lograr la colonización de la cavidad
oral y la sustitución de las cepas residentes de MS que provocan la
caries dentaria, particularmente S. mutans, del individuo.
Puede ser necesario que la cepa de S. salivarius o extracto
se administre al paciente una vez solamente, o repetidamente. Los
tratamientos repetidos pueden ser una vez al mes, una vez a la
semana, una vez al día, dos veces al día, o como se pueda requerir
de otro modo. Convenientemente, la administración se puede efectuar
como parte del cuidado dental habitual del paciente, por ejemplo
como un componente de una pastilla para chupar, goma de mascar,
pasta de dientes, hilo dental, o colutorio.
Para facilitar la colonización, en una
realización, el método de tratamiento de la invención incluye una
etapa preliminar de tratar previamente al individuo para al menos
reducir la microflora normal presente en la cavidad oral,
incluyendo organismos que provocan caries dentaria. Este
pretratamiento comprende la etapa de administrar un agente
antimicrobiano tal como clorhexidina, lactoperoxidasa, té verde, o
zumo de piña (liofilizado), pero no se limita a ellos; o puede
seguir un tratamiento prescrito de antibióticos, tales como
penicilina, eritromicina, o amoxicilina, administrado a dicho
individuo. Entonces se administra S. salivarius de la
invención o K12 de S. salivarius al entorno despoblado para
repoblarlo.
Un protocolo de tratamiento actualmente
preferido para la caries dentaria comprende el pretratamiento
mediante cepillado de los dientes con gel de clorhexidina durante 2
a 5 días, preferiblemente 3 días. Se administra una pastilla
1-4 horas, preferiblemente 2 horas después del gel.
A esto le sigue la administración de otras 2-5,
preferiblemente 3 pastillas a lo largo del día, a intervalos de
1-4 horas, preferiblemente cada 2 horas. Este
protocolo se sigue durante 2-4 días para facilitar
la colonización. Para los fines de mantenimiento, se toman 1, 2, ó
3 pastillas, habitualmente 1 a 2 pastillas, cada día tras el
cepillado normal de los dientes. El régimen se continúa tanto como
se requiera.
La colonización con éxito de la cavidad oral del
individuo por la cepa de S. salivarius se puede establecer
cultivando las bacterias de la cavidad oral del individuo, e
identificando la cepa de S. salivarius, por ejemplo,
mediante la producción de BLIS u otros métodos bien conocidos en la
técnica para la identificación de cepas bacterianas.
Los métodos y usos de la invención pueden
comprender además el uso de uno o más agentes antibacterianos
secundarios, y/o agentes anticariogénicos como se explica
anteriormente.
Cuando el término comprender, comprende,
comprendido o que comprende se usan en esta memoria descriptiva, se
interpretarán como que especifican la presencia de las
características, entidades, etapas o componentes señalados citados,
pero no excluye la presencia o adición de una o más características,
entidades, etapas, componentes o grupos de los mismos
adicionales.
Ahora se ilustrarán a título no limitativo,
mediante referencia a la siguiente sección experimental, diversos
aspectos de la invención.
La cepa Mia se aisló de la cavidad oral de un
sujeto humano adulto sano. Crece en agar de Mitis salivarius a
37ºC, 5% de CO_{2} con morfología típica de S. salivarius
según lo siguiente:
- Forma y tamaño de la colonia: redonda, 1-2 mm de diámetro
- Margen (borde): completo (liso)
- Elevación: convexa
- Color: azul
- Textura: mucoide
\global\parskip0.950000\baselineskip
En agar sangre [Columbia Agar Base (GIBCO) con
5% de sangre humana] a 37ºC, 5% de CO_{2} no es hemolítica, y
muestra la siguiente morfología:
- Forma y tamaño de la colonia: redonda, <1 mm de diámetro
- Margen (borde): completo (liso)
- Elevación: convexa
- Color: blanco
- Textura: mucoide
Cuando se cultiva en agar sangre o en caldo de
tripticasa de soja (BBL) + agar de Davis al 1,5% suplementado con
carbonato de calcio al 0,1%, el crecimiento bacteriano parece
relativamente más firmemente adherente a la superficie de agar que
lo que es típico de la mayoría de S. salivarius. El código de
identificación de API 20 Strep para la cepa es 5050451, que
corresponde a Streptococcus salivarius (98,4% de
identidad).
El análisis de secuencias de 16s ARNr con
referencia a la base de datos de GENEBANK estableció que la cepa
era Streptococcus salivarius (99,9% de homología).
\vskip1.000000\baselineskip
La caracterización bioquímica de MIA de S.
salivarius se llevó a cabo usando el kit API 20 Strep kit
(bioMérieux) y API 50 CH (bioMérieux), que permite el estudio del
metabolismo de hidratos de carbono.
Los resultados de API 20 Strep son los
siguientes:
- Producción de acetona
- positivo
- Hidrólisis
- negativo
- \beta-glucosidasa
- positivo
- Pirrolidonil arilamidasa
- negativo
- \alpha-galactosidasa
- negativo
- \beta-glucuronidasa
- negativo
- \beta-galactosidasa
- positivo
- fosfatasa alcalina
- negativo
- Leucina arilamidasa
- positivo
- Arginina dihidrolasa
- negativo
- Ribosa
- negativo
- L-arabinosa
- negativo
- Manitol
- negativo
- Sorbitol
- negativo
- Lactosa
- positivo
- Trehalosa
- positivo
- Inulina
- negativo
- Rafinosa
- positivo
- Almidón
- positivo débil
- Glucógeno
- negativo
- \beta-hemolítico
- negativo
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de API 50 CH son los
siguientes:
- Glicerol
- negativo
- Eritritol
- negativo
- D-Arabinosa
- negativo
- L-Arabinosa
- positivo (anaeróbico solo)
- Ribosa
- negativo
- D-Xilosa
- negativo
- Adonitol
- negativo
- B Metil-xilósido
- negativo
- Galactosa
- positivo
- D-Glucosa
- positivo
- D-Fructosa
- positivo
- D-Manosa
- positivo
- L-Sorbosa
- negativo
- Ramnosa
- negativo
- Dulcitol
- negativo
- Inositol
- negativo
- Manitol
- negativo
- Sorbitol
- negativo
- \alpha Metil-D-manósido
- negativo
- \alpha Metil-D-glucósido
- positivo (anaeróbico sólo)
- N-Acetil glucosamina
- positivo
- Amigdalina
- positivo
- Arbutina
- positivo
- Esculina
- positivo
- Salicina
- positivo
- Celobiosa
- positivo
- Maltosa
- positivo
- Lactosa
- positivo
- Melibiosa
- positivo (aeróbico sólo)
- Sacarosa
- Positivo
- Trehalosa
- Positivo
- Inulina
- positivo (anaeróbico sólo)
- Melezitosa
- Negativo
- D-Rafinosa
- positivo
\global\parskip1.000000\baselineskip
- Almidón
- positivo
- Glicógeno
- positivo (anaeróbico sólo)
- Xilitol
- positivo (aeróbico sólo)
- \beta Gentiobiosa
- positivo
- D-Turanosa
- negativo
- D-Lixosa
- negativo
- D-Tagatosa
- positivo (anaeróbico sólo)
- D-Fucosa
- negativo
- L-Fucosa
- negativo
- D-Arabitol
- negativo
- L-Arabitol
- negativo
- Gluconato
- negativo
- 2 ceto-gluconato
- negativo
- 5 ceto-gluconato
- negativo
\vskip1.000000\baselineskip
MIA de S. salivarius es positiva a ureasa
cuando se hace crecer en agar con urea de Christenens.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se ensaya para determinar la producción
de sustancia inhibidora similar a bacteriocina (BLIS) en el medio a
base de agar sangre, base de agar Columbia (GIBCO) + 0,1% de
CaCO_{3} + 5% de sangre humana (BACa) según el ensayo de
antagonismo diferido de Tagg y Bannister, la designación del tipo P
de la cepa Mia es 677.
El tipo productor (tipo P) describe la actividad
antimicrobiana de bacterias frente a un conjunto de indicadores
estándar. El procedimiento se describió en primer lugar por Tagg y
Bannister (J. Med. Microbiol. 1979; 12:
397-411).
Para determinar el tipo P, se hizo crecer MIA de
S. salivarius como un cultivo en estría diamétrico en una
placa con agar sangre + 0,1% de carbonato de calcio, o agar con
tripticasa de soja-extracto de
levadura-carbonato de calcio (caldo de tripticasa
de soja, 30; extracto de levadura, 20 g; carbonato de calcio, 2,5 g;
agar, 15 g; agua destilada, 1000 ml), se incubó a 37ºC, 5% de
CO_{2} durante 18 h. El crecimiento se retiró entonces, y la
superficie de la placa se esterilizó con cloroformo. Después se
inocularon de forma cruzada nueve cepas indicadoras. Tras la
incubación a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 18 h, se registró la
inhibición del crecimiento. Los patrones de inhibición se
registraron en forma de código considerando los nueve indicadores
como tres tripletes (por ejemplo, I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8,
I9). A las reacciones positivas frente a cada indicador se les dio
una puntuación de 4, 2 ó 1 dependiendo de si el indicador fue,
respectivamente, el primer, segundo o tercer miembro del triplete.
La falta de inhibición se registró como cero. La puntuación total de
cada triplete especificó así de forma única las reacciones frente a
los tres indicadores. El código completo de tipo P se escribe como
una secuencia de tres números, que definen consecutivamente las
reacciones en los tres tripletes.
MIA de S. salivarius tiene un tipo P 677
en agar sangre + carbonato de calcio, y un tipo P 777 en agar con
tripticasa de soja-extracto de
levadura-carbonato de calcio.
Esto corresponde a la inhibición de las 9
bacterias en el panel de 9 cepas indicadoras, excepto para el
indicador 3. Este patrón es típico del dado por S.
salivarius productora de salivaricina A, tal como la cepa 20P3
(Ross et al., Appl. Envir. Microbiol. 1993; 59; 2014). Sin
embargo, cuando se ensaya en caldo de tripticasa de soja (BBL) +
agar Davis (1,5%) + 0,25% de carbonato de calcio + extracto de
levadura (2%) [TSBCaYE], el tipo P es 777 (es decir, se inhiben los
9 indicadores). Asociada con esta actividad incrementada frente al
indicador 3, también hay actividad adicional frente a una variedad
de otras bacterias cuando se ensayan como indicadores (Tabla
1).
El espectro de actividad inhibidora
anti-S. mutans de cepas productoras de salivaricina
A_{2} se estableció mediante el uso de un ensayo de antagonismo
diferido, esencialmente como se describe por Tagg y Bannister [J.
Med. Microbiol. 1979; 12:397]. De forma breve, se inoculó un cultivo
en estría diamétrico de 1 cm de ancho de cada cepa productora sobre
medios TSBCa y BACa, con o sin suplementación con extracto de
levadura (YE). Tras la incubación en una atmósfera anaerobia
durante 24 horas a 37ºC, el crecimiento celular macroscópico se
eliminó con un portaobjetos, y las células residuales sobre la
superficie del agar se exterminaron mediante exposición a vapores
de cloroformo durante 30 minutos. La superficie del agar se aireó
entonces durante 30 minutos, y la cepa indicadora se inoculó a
partir de cultivos de caldo Todd Hewitt (THB) de 18 horas a lo
largo de la línea del cultivo en estría original con el uso de
algodones. Tras la incubación durante 18 horas en 5% (v/v) de
CO_{2} a 37ºC, se registró el grado de inhibición de cada cepa
indicadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El fluido de saliva se preparó según lo
siguiente:
Se recogió saliva estimulada, se calentó a 60ºC
durante 0,5 h, y después se centrifugó a 12000 x g durante 10 min.
El sobrenadante se suplementó con 0,5% de maltosa, 0,5% de
CaCO_{3} y 0,25 \mug/ml de cisteína (concentraciones
finales).
El sobrenadante suplementado se usó como un
medio fluido basal para el crecimiento de la cepa Mia a 37ºC. El
inóculo fue de un cultivo en TSBYECa de 18 h a una relación de 100
\mul por 2 ml de sobrenadante. Se suplementaron alícuotas
diferentes como se indica.
Tras la incubación durante 24 h en una atmósfera
anaerobia, las muestras de los cultivos de saliva se ensayaron para
determinar la actividad inhibidora frente a los indicadores OMZ175,
MutII, e I1 ya sea puros o tras una concentración 10x mediante
evaporación giratoria. El sobrenadante concentrado 10x procedente
del cultivo que se hizo crecer en saliva suplementada con maltosa,
cisteína y CaCO_{3} tuvo actividad inhibidora frente a la cepa
OMZ175 de S. mutans como se muestra en la tabla a
continuación. Por lo tanto, Mia de S. salivarius produce
actividad anti-S. mutans cuando se hace crecer en saliva.
La actividad inhibidora se determinó mediante
valoración de punto final usando un método de mancha de superficie
en el que se colocan gotas de 20 \mul de diluciones en serie de
dos veces de la preparación de ensayo en disolución salina sobre la
superficie del medio agar sangre. Cuando las gotas se secaron en el
agar, la superficie del medio se esterilizó mediante exposición a
vapor de cloroformo durante 30 minutos, se aireó y después se
inoculó frotando con un algodón de forma uniforme a partir de un
cultivo de THB de 18 horas de la cepa indicadora. Tras la
incubación, el título de la actividad inhibidora en Unidades
Arbitrarias (UA) por ml se tomó como el recíproco de la dilución
más elevada para mostrar la actividad inhibidora precisa. Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Un sujeto cepilló sus dientes con gel de
clorhexidina al 2% durante 2 minutos en el primer día y después
chupó un comprimido que contiene 3,8 x 10^{9} unidades formadoras
de colonias de MIA de S. salivarius, dos horas después del
tratamiento con clorhexidina, y después otros tres comprimidos a
intervalos de dos horas. En el segundo día, el sujeto repitió el
mismo procedimiento como el día uno. Durante los 25 días restantes
del ensayo, el sujeto chupó un comprimido después de cepillar sus
dientes con una pasta de dientes comercial, en la mañana y en la
noche.
Los sujetos del control limpiaron sus dientes
una vez al día durante tres días con gel de clorhexidina al 2% y,
durante el resto del tiempo, cepillaron sus dientes con una pasta de
dientes comercial.
Se recogieron muestras de saliva de todos los
sujetos antes de comenzar el ensayo y a intervalos durante el
ensayo, para determinar el número de MS (unidades formadoras de
colonias (cfu) por ml de saliva). La muestra de saliva se diluyó en
disolución salina estéril y se colocó en placas en espiral sobre
agar selectivo para Mutans, y las placas se incubaron en
condiciones anaerobias a 37ºC durante 2 días. También se determinó
para el sujeto que toma los comprimidos el número de MIA de S.
salivarius en la muestra de saliva. La muestra de saliva
diluida se colocó en placas en espiral sobre agar
Mitis-salivarius, y las placas se incubaron a 37ºC,
5% de CO_{2} durante 18-24 horas. Entonces se
contó el número de colonias de S. salivarius. Para
determinar el porcentaje de colonización con MIA de S.
salivarius, se usó el siguiente protocolo. Se extienden
separadamente cultivos recientes de THB de Micrococcus luteus
y OMZ175 de S. mutans sobre la parte superior de una placa
de agar sangre/calcio. Entonces se recogieron colonias de S.
salivarius en ambas placas. Las placas se incuban a 37ºC, 5% de
CO_{2} durante 18-24 horas. Las colonias de MIA de
S. salivarius producen zonas de inhibición alrededor de los
cultivos de punzamiento en ambas placas. El porcentaje de
colonización se determina como el número de colonias positivas,
dividido entre el número total de colonias
recogidas.
recogidas.
El cepillado de los dientes con un gel de
clorhexidina al 2% dio como resultado una reducción de
1,7-2,4 del log en los recuentos de MS tanto en el
control (Tabla 4) como en el sujeto colonizante (Tabla 5). Los
recuentos de células de MS en los sujetos del control incrementaron
hasta niveles previos al tratamiento, entre uno a seis días tras
cepillarse con el gel. El sujeto de ensayo fue colonizado al 100%
después del pretratamiento con el gel, y siguió estando muy
colonizado durante el resto del período de ensayo (Tabla 5). Los
números de MS todavía fueron 1,7 log menores que los niveles del
pretratamiento a 27 días. Esto muestra que la colonización con MIA
de S. salivarius es capaz de evitar el reestablecimiento de
niveles elevados de MS.
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Se vertieron cien ml de agar con tripticasa de
soja fundido, que contiene 2% de extracto de levadura y 0,25% de
carbonato de calcio, en una botella de Schott de 1 l. A la botella
se añadió un ml de un cultivo nocturno de MIA de S.
salivarius, que se hizo crecer en caldo de Todd Hewitt a 37ºC en
5% de CO_{2} en aire. El cultivo se incubó anaeróbicamente a 37ºC
durante 18-24 horas. A la botella se añadieron cien
ml de caldo de soja con tripticasa que contiene 2% de extracto de
levadura y 0,25% de carbonato de calcio, caldo el cual se había
preincubado en condiciones anaerobias. El cultivo se incubó entonces
durante otras 24 horas anaeróbicamente a 37ºC. El caldo se
centrifugó para eliminar las células bacterianas, y después se
añadió sulfato de amonio hasta 50% (p/v) y se incubó a 4ºC durante
18 horas. La muestra se centrifugó entonces, y el pelete se
resuspendió en 1 ml de agua milli-Q. La actividad
anti-MS de la muestra se ensayó entonces usando un
ensayo de difusión en pocillo, en placas de agar sangre. Se
añadieron a cada pocillo cincuenta \mul de la muestra, y se
secaron al aire. Las placas se trataron entonces con cloroformo. Se
extendió un cultivo nocturno de la cepa indicadora sobre la parte
superior de la placa y se incubó a 37ºC, 5% de CO_{2} en aire,
durante 18-24 horas.
Las zonas de inhibición (distancia desde el
borde del pocillo al borde de inhibición del crecimiento celular)
se registraron frente a todas las cepas indicadoras (Tabla 6).
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Los ingredientes se mezclan, y los comprimidos
se producen usando compresión en seco.
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Los resultados anteriores demuestran el efecto
antibacteriano de las cepas de S. salivarius, particularmente
la cepa Mia, frente a un amplio espectro de microorganismos,
particularmente estreptococos. Estas cepas son las primeras S.
salivarius productora de BLIS en ser identificadas que tienen
actividad frente a MS, y más particularmente S. mutans. Por
lo tanto, las cepas y los extractos activos relacionados aquí tienen
aplicación en métodos para tratar terapéuticamente individuos
frente a los efectos dañinos de la infección por estreptococos,
especialmente en la cavidad oral. Estos métodos incluyen el
tratamiento de caries dentaria, en la que MS o S. mutans son
el agente patógeno principal. Los extractos y composiciones de S.
salivarius de la invención también tienen aplicación en el
tratamiento de la halitosis y amigdalitis.
Claims (24)
1. Un cultivo biológicamente puro de una cepa
Mia de Streptococcus salivarius en depósito en Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg
1 b, D-38124, Braunschweig, Alemania, número de
acceso DSM 14685.
2. Un extracto obtenido de la cepa Mia de
S. salivarius como se define en la reivindicación 1, que
tiene actividad anti-S. mutans.
3. Una composición antibacteriana que incluye
una cepa Mia de S. salivarius según la reivindicación 1, o
un extracto según la reivindicación 2.
4. Una formulación terapéutica que comprende
una cepa Mia de S. salivarius según la reivindicación 1, o
un extracto según la reivindicación 2, junto con un diluyente,
vehículo y/o excipiente.
5. Una composición o formulación según la
reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende además uno o
más agentes antibacterianos secundarios.
6. Una composición o formulación según la
reivindicación 5, en la que el agente antibacteriano secundario se
selecciona de nisina, sustancias inhibidoras similares a
bacteriocina (BLIS), y microorganismos productores de BLIS.
7. Una composición o formulación según la
reivindicación 6, en la que la BLIS es una o más BLIS seleccionadas
de salivaricina A, A_{1}, A_{2} y B.
8. Una composición o formulación según la
reivindicación 6, en la que el microorganismo productor de BLIS es
K12 y/o K30.
9. Una composición o formulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, que comprende además uno
o más agentes anticariogénicos secundarios.
10. Una composición o formulación según la
reivindicación 9, en la que el agente anticariogénico secundario se
selecciona de xilitol, fluoruro, miel de Manuka y tanino.
11. Una composición o formulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, que es una composición o
formulación administrable de forma oral.
12. Una composición o formulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en la que las
composiciones o formulaciones se incluyen en un alimento o
bebida.
13. Una composición o formulación según la
reivindicación 12, en la que dicho alimento o bebida es un alimento
o bebida a base de leche.
14. Una composición o formulación según la
reivindicación 13, en la que dicho alimento o bebida es leche en
polvo, galletas de leche, leche, leche con sabores, yogur o
queso.
15. Una composición o formulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en la que las
composiciones o formulaciones están en forma de medicamentos,
pastillas para chupar o dulces.
16. Una composición o formulación según la
reivindicación 15, que está en forma de una pastilla para
chupar.
17. Una composición o formulación según la
reivindicación 15, que es un colutorio, enjuague bucal, pasta de
dientes, gárgara, jarabe, pulverización bucal, cápsula, hilo dental,
goma de mascar, o comprimido.
18. Una composición o formulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, que está en forma de
dosificación unitaria.
19. Una composición o formulación según la
reivindicación 18, que contiene de alrededor de 10^{5} a
10^{12}, preferiblemente 10^{9} a 10^{10} CFU de la cepa Mia
de S. salivarius por dosis.
20. El uso de la cepa Mia de S.
salivarius según la reivindicación 1, o un extracto según la
reivindicación 2, en la preparación de una composición o
formulación para uso en al menos inhibir el crecimiento de bacterias
sensibles a la cepa Mia de S. salivarius según la
reivindicación 1.
21. El uso de la cepa Mia de S.
salivarius según la reivindicación 1, o un extracto según la
reivindicación 2, en la preparación de una composición o
formulación para uso en al menos inhibir el crecimiento de la
bacteria S. mutans.
22. El uso de la cepa Mia de S.
salivarius según la reivindicación 1, o un extracto según la
reivindicación 2, en la preparación de una composición o
formulación para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico
de caries dentaria provocada al menos en parte por S.
mutans.
23. El uso según la reivindicación 22, en el
que la caries dentaria está provocada por MS.
24. El uso de la cepa Mia de S.
salivarius según la reivindicación 1, o un extracto según la
reivindicación 2, en la preparación de una composición o
formulación para uso en el control de la incidencia y gravedad de
la caries dentaria.
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