ES2344796T3 - Metodo de puntuacion para determinar la aptitud del pancreas para el aislamiento de islotes. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar si un páncreas aislado será una fuente de islotes terapéuticamente útiles, que comprende: (i) determinar el tiempo de isquemia caliente de dicho páncreas aislado y al menos dos de: (ii) determinar el color de dicho páncreas aislado, (iii) determinar el contenido de grasa de dicho páncreas aislado, (iv) determinar la demarcación de islotes en dicho páncreas, y (v) determinar el tamaño promedio de islotes en dicho páncreas antes del aislamiento de éste: (a) en (i) a un tiempo de isquemia caliente de menos de aproximadamente 15 minutos se le asigna una puntuación de +1, y uno mayor que aproximadamente quince minutos se le asigna una puntuación de -1; (b) a una relación de reflectancia para dicho color por encima de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de +1, y una por debajo de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de -1; (c) a un contenido de grasa por debajo de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de +1, y por encima de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de -1; (d) a una demarcación por encima de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de +1, y por debajo de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de -1, y (e) a un diámetro promedio para islotes iguales o mayor que el valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de +1, y por debajo del valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de -1, en el que si, después de realizar tres de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), se obtiene una puntuación de +1 o -1, se realiza un cuarto miembro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), y si, después de realizar cuatro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v) se obtiene una puntuación de 0, se realiza el quinto miembro.

Description

Método de puntuación para determinar la aptitud del páncreas para el aislamiento de islotes.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para mejorar el rendimiento de islotes en calidad y cantidad. Los islotes se encuentran en el páncreas de los animales y la invención se refiere a métodos para determinar si un páncreas dará un buen rendimiento de islotes.

Antecedentes y técnica anterior

Actualmente se ha establecido que la terapia de reemplazo de islotes es un enfoque viable para el tratamiento de pacientes con diversos trastornos. Éstos incluyen a pacientes con cáncer que se someten a una exenteración abdominal superior (Tzakis, et al., Lancet, 336: 402-405 (1990)); pancreatitis (Clayton, et al., Trasplantation, 76: 92-98 (2003); Farney, et al., Surgery. 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant Proc. 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation, 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes, 50: 47-50 (2001)) y pacientes dependientes de insulina, para los que el transplante de islotes es una opción terapéutica (Goss, et al., Transplantation, 74: 1761-1766 (2002); Ricordi, et al., Transplantation, 75: 1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes. 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al., N. Engl. J. Med. 343:230-238 (2000)).

Debido a la utilidad de los islotes en terapia, según se indica, supra, hay, por supuesto interés en el desarrollo de modos para aislarlos. Mientras que hay muchas publicaciones sobre el aislamiento de islotes usando métodos automatizados (Brandhorst, et al., Exp. Clin. Endocrinol Diabetes. 103 Supl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation, 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant, 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Comp. Med. 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Immunnol. 62: 73 9-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant 9: 297-305 (2000); Wennberg, et al., Transplant. Proc. 33: 2537 (2001)), el aislamiento de islotes aún es bastante difícil. Por ejemplo, Bosta, et al., J. Investig Med. 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant, 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant 6: 48-54 (2001), O'Neil, et al., Cell Transplant 10: 235-246 (2001) y White, et al., Horm. Metab. Res. 31: 579-524 (1999), todos hablan de problemas relacionados con esto.

La invención que se expone en la descripción que sigue se refiere a un método para maximizar la probabilidad del rendimiento de islotes con éxito. Se ha determinado que mediante el uso del sistema de puntuación expuesto en este documento, se puede maximizar la oportunidad de asegurar un buen rendimiento de islotes a partir de cualquier aislamiento de islotes pancreáticos dado.

En la descripción que sigue se verá cómo se lleva esto a cabo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra una micrografía de un páncreas que, usando el método de la invención, tiene una puntuación de +3 y así aprueba como un páncreas útil, y la figura 1B muestra una micrografía de uno con una puntuación de -1, que no aprueba.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Ejemplo 1

Los animales usados en los ejemplos que siguen eran crías, de unos dos años, con paridades múltiples. Los animales fueron aturdidos eléctricamente y desangrados. Las vísceras se retiraron entonces para su disección pancreática. El tiempo entre el aturdimiento eléctrico y la colocación del páncreas en Solución Salina Equilibrada de Hank ("HBSS") fría fue generalmente de 10-15 minutos. Los tiempos de isquemia fría estuvieron en el intervalo de 15-20 minutos.

Es decir en este procedimiento, se sacó el páncreas entero y luego se cortó el anillo anular alrededor de la vena porta, transversalmente en la unión entre los lóbulos derecho e izquierdo, a fin de proporcionar una sección de tejido de biopsia de aproximadamente 2-5 mm de espesor.

Las secciones de tejido sometidas a biopsia se cortaron por la mitad y se colocaron en HBSS o en solución de ditizona ("DTZ"), de acuerdo con Ricordi, et al., en Ricordi, et al., ed. Pancreatic Islet Cell Transplantation (Austin: R.G. Landes Company, 1992), 132-142.

El páncreas se colocó entonces en HBSS al cual se había añadido suero porcino ("PS") desactivado al 2% caliente, y luego se llevó a un laboratorio para el aislamiento de islotes.

Las biopsias de páncreas se evaluaron entonces para determinar si eran adecuadas para el aislamiento de islotes. Se evaluaron cinco variables. En cada caso, se asignó una puntuación de +1 ó -1 a la variable, como se explica infra.

Primero, se determinó el tiempo de isquemia caliente. Esto se define como el tiempo entre la iniciación del desangrado y la colocación del páncreas en una solución conservante fría. Si esto se llevaba a cabo en 15 minutos, o menos, se asignaba una puntuación de +1. Si transcurrían más de 15 minutos, se asignaba una puntuación de -1. Aunque un tiempo de isquemia caliente de hasta 20 minutos producirá a veces un buen rendimiento de islotes, hay posibilidades de que haya una caída después de un tiempo de isquemia caliente de 15 minutos.

Para el segundo criterio, se observó el color del páncreas. La variación en el color entre páncreas puede ser la consecuencia de varios factores. Por ejemplo, si un páncreas muestra congestión venosa, como consecuencia, p.ej, de una electrocución de animales, o de una respuesta al estrés, entonces dicho páncreas no muestra calidades que lo hagan deseable como un donante de islotes. Ambas condiciones pueden conducir a una acumulación de sangre dentro del páncreas, liberación de hemoglobina y su difusión en el espacio extracelular. A su vez, esto conduce a un cambio en el color del órgano, por lo general, marrón o morado.

El color pancreático puede observarse subjetivamente, y el experto en la técnica puede identificar un páncreas de color oscuro (que es indeseable, y marca un -1), y uno de color claro (que es deseable, y puntúa un +1); sin embargo, una prueba más objetiva usa un colorímetro que detecta el color según la proporción de luz reflejada e incidente, "proporción de reflectancia" Si es menos de aproximadamente 60, se asigna una puntuación de -1, mientras que a uno por encima de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de +1.

El tercer criterio usado para los órganos fue el contenido de grasa. Para determinar esto, se sumergió una muestra de biopsia, de aproximadamente 2x2x0,5 cm de espesor en DTZ, durante aproximadamente 5 minutos. Después de la tinción, el tejido fue visto en un microscopio de disección con un aumento de 10x. Los islotes aparecieron rojos y el tejido lipídico verde. Se eligió un campo de visión, y se estimó el tanto por ciento del área total que aparecía verde. Si el contenido de grasa total estuviera por encima de aproximadamente el 25%, al órgano se le asignaba una puntuación de -1, mientras que a un contenido de grasa de menos de aproximadamente el 25% se le asignó un +1.

Se sobrentiende, por supuesto, que otras metodologías están disponibles para determinar el contenido de grasa de un órgano y que pueden usarse todas en esta invención.

El cuarto criterio empleado fue la demarcación de los islotes. Para este parámetro, se empleó la misma metodología de observación y de tinción. Aquellos islotes que tenían diámetros mayores de 50 \mum, se evaluaron según la demarcación. Es decir, si 2 o más grupos de células de islote teñidas con DTZ se proyectaban radialmente desde el centro de un islote, más allá de lo que es normalmente un borde/plano de islote externo bruscamente demarcado liso, esto causaba una pobre determinación de la demarcación. Si más del 50% de los islotes estaban bien demarcados, a este criterio le fue dado una puntuación de +1, y si estaban menos del 50%, -1.

El criterio final era el tamaño del islote, que fue determinado en términos de diámetro, con relación al diámetro promedio de islotes para las especies del animal en consideración. Lo que es determinativo para los fines de puntuación es si el diámetro promedio de los islotes en el órgano en consideración era mayor que el promedio. Para muchas especies, el diámetro promedio de islotes tiene aproximadamente 100 micrones. Esto es verdadero para islotes murinos, porcinos y humanos, así como para muchas otras especies. Si la mayoría de los islotes examinados como se describe supra tenían un tamaño de más de 100 \mum de diámetro, se asignaba una puntuación de +1, mientras que se asignaba una puntuación de -1 en los otros casos. Si, por otra parte, el diámetro promedio de un islote se diferencia del de un cerdo, entonces será usado el diámetro promedio para aquella especie como referente. Por ejemplo, es conocido que los tilapia, una variedad de pez, tienen islotes que son muy grandes, en un promedio de aproximadamente 5 mm de diámetro. Si un páncreas de tilapia está bajo consideración, entonces el punto de corte sería 5 mm, y sería asignado una puntuación positiva si el diámetro promedio de los islotes fuera mayor que 5 mm.

Las puntuaciones para estos cinco criterios fueron tabulados para cada páncreas que fue examinado. Si el resultado total era +1 o más alto, el órgano era evaluado como un donante de islote adecuado.

Los resultados ejemplares para diez órganos que tenían puntuaciones totales de +1 o más alto son representados en la tabla que sigue.

TABLA 1 Puntuaciones de biopsias de páncreas de donantes individuales

1

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En las fotografías de las figuras 1A y 1B, se representan micrografías de un páncreas con una puntuación de +3, (figura 1A), y un páncreas con una puntuación de -1 (figuras 1B), con fines comparativos. En la figura 1A, los islotes grandes (> 100 \mum) son evidentes, ya que su demarcación es buena. En contraste, el páncreas representado en la figura 1B muestra islotes pequeños mal demarcados.

Bajo los estándares de los protocolos descritos en este documento, el páncreas representado en la figura 1B no sería tratado más; sin embargo, fue tratado con fines comparativos, como se comenta en los ejemplos que siguen.

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Ejemplo 2

Después de la evaluación expuesta en el ejemplo 1, se trataron después páncreas con una puntuación de +1 o más alta así como el páncreas comparativo con una puntuación de -1. Las glándulas se recortaron de grasa y del tejido conjuntivo y después el conducto pancreático principal se canuló con una aguja de final romo de 16 g de acero inoxidable. Una solución de HBSS que contenía colagenasa P, a una concentración de 1,5-2,0 g/l, se perfusó a una velocidad de 50 ml/mm, a 30ºC, para proporcionar 2 ml de solución por gramo de peso del páncreas.

El páncreas fue cubierto entonces con 500 ml de HBSS y PS al 2%, junto con una solución de colagenasa de 200 ml a 30ºC. La circulación externa de agua a 39ºC calentó despacio el órgano a 37ºC, y mantuvo la temperatura del digestato a 36-37ºC. Cuando los órganos aparecieron disociados, y ofrecieron poca resistencia a la presión manual (después de un tiempo total de aproximadamente 10-20 minutos, y 5-10 minutos después de alcanzar 37ºC), la digestión fue parada.

El digestato recuperado se centrifugó entonces, los sobrenadantes se aspiraron y el pelete resultante se suspendió en PS al 10% y una solución conservante de órgano. Los islotes se purificaron entonces en Ficoll discontinuo, con gradientes de densidad de 1,105, 1,095, 1,085 y 1,05 g/cm^{3}, BBSS más PS al 2%, en tubos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 650 g a 4ºC, y se recogieron las capas que contenían islote, y se lavó tres veces, en HBSS más PS al 10%, después de lo cual se purificaron a mano del tejido sin islote con la ayuda de un microscopio de disección. Los islotes se suspendieron de nuevo, y dos muestras de 0,5 ml se usaron para contar el rendimiento de los
islotes.

Para los páncreas mostrados en las figuras 1A y 1B, por ejemplo, el rendimiento para el páncreas con un valor +3 era de aproximadamente 105.000 NIE (Número de Islote Equivalente, como se define por Ricordi, et al. supra), a una pureza del 98,8%. En contraste, el rendimiento del órgano de la figura 1B fue 44.000 NIE.

El rendimiento promedio de los diez páncreas de la tabla 1, de hecho, fue 130.000 NIE, con un promedio de 1,101 NIE por gramo de tejido digerido. La pureza, en todos los casos fue más del 90%. Para 9 de los órganos, la viabilidad del islote era mayor que el 89%. Las metodologías para estas determinaciones son descritas, infra.

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Ejemplo 3

Después de aislamiento de los islotes, se determinaron varios parámetros, incluyendo la pureza y la viabilidad, como se menciona supra.

La pureza se evaluó tiñendo aproximadamente 500 NIE con DTZ, durante diez minutos, y luego se realizó un análisis de imagen estándar usando un microscopio de disección y una cámara digital.

La viabilidad se determinó tiñendo una muestra con diacetato de fluoresceína (FDA) y bromuro de etidio (EB). Es decir, se añadieron aproximadamente 500 NIE a 1 ml de RPM1, PS al 10%, y antibiótico/antimitótico ("A/A") al 1%. Entonces, se añadieron 20 \mul de la tinción de FDA que había sido hecha con 10 mg de FDA y 1 ml de acetona, y 200 \mul de EB que había sido hecha con 30 \mul de EB y 1 ml de PBS. Los islotes se tiñeron, en la oscuridad, durante siete minutos, y luego se vieron muestras aleatorias de 10-50 islotes con un microscopio fluorescente y se fotografiaron, para determinar la viabilidad usando un análisis de imagen estándar.

El contenido de insulina de los islotes también fue medido, colocando aproximadamente 500 NIE en la solución de extracción de alcohol ácido (7,2 ml de HCl 1N, 400 ml de etanol desnaturalizado al 100%). Las muestras se almacenaron a -20ºC y se realizó un RIA de insulina.

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TABLA 2

2

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Ejemplo 4

Este, y los ejemplos que siguen, se refieren a la pregunta de si pueden usarse en macroperlas los islotes identificados como útiles y aislados según se describen.

Los islotes purificados se suspendieron de nuevo en RPMI1640 + PS al 10% + A/A al 1%, en un volumen de 2000 NIE/ml. Los islotes se distribuyeron regularmente en tubos, de modo que cada tubo contuviera 1 ml de la suspensión a 2000 NIE.

Después de sedimentar por gravedad, los sobrenadantes se retiraron, y se añadieron a cada muestra 0,5 ml de agarosa al 1,5%, a 50ºC, se prepararon en medio esencial mínimo más tampón HEPES al 2,5% y se mezclaron cuidadosamente. La suspensión se expulsó entonces por debajo de aceite mineral estéril, para preparar cuatro perlas con superficies lisas y distribuciones de islote iguales.

Las macroperlas se retiraron, y se lavaron dos veces (RPMI + PS al 5% + A/A al 1%). Estas macroperlas se cultivaron en la misma disolución, en una atmósfera de CO_{2} al 5% humedecida, durante 5-7 días, después de lo cual se lavaron, tres veces, en RPMI + A/A al 1%, seguido de la aplicación de una segunda capa de agarosa. Para esto, se transfirieron 0,5 ml de agarosa al 5% en MEM, más tampón HEPES a 60ºC, vía una pipeta, a una cuchara de plástico estéril, y cada macroperla se enrolló 3-5 veces para producir una segunda capa uniforme de agarosa. Después de la transferencia al aceite mineral estéril para producir una superficie lisa, las macroperlas se retiraron, se lavaron dos veces en RPMI + PS al 2,5% + A/A al 1%, y se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% humedecido más aire.

Se determinó que las macroperlas que contenían los islotes encapsulados permanecían viables durante más de 6 meses, en cuyo tiempo los radioinmunoensayos revelaron que siguieron produciendo buenos niveles de insulina.

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Ejemplo 5

Este ejemplo describe experimentos que se refieren a la cuestión de si los islotes aislados, según se describe, funcionarán in vivo.

Se usaron ratones CB17-PrKdc <scid>/J diabéticos machos, no obesos, de 7-9 semanas. Después de una semana de aclimatación, los animales recibieron 275 mg/kg de estreptozotocina, que induce la diabetes. Nueve días más tarde, cuando sus niveles de glucosa en sangre tenían un promedio de más de 480 mg/dl, se comenzó con la terapia de insulina.

El día 34-35 después de la administración de estreptozotocina, los animales recibieron aproximadamente 1000 NIE de islotes porcinos, que se trasplantaron en un coágulo de sangre, según las instrucciones de Bowen, et al., Aust J. Exp. Biol. Med. Sci. 58:441-447 (1980), incorporada como referencia. Brevemente, se granularon los islotes de la suspensión y se aspiraron los medios. Entonces, se tomaron aproximadamente 5-10 \mul de sangre del animal, se añadieron a los islotes y se permitió que se coagulara. Los animales receptores se anestesiaron con volúmenes iguales de quetamina (167 mg/dl), xilazina (33 mg/ml) y solución salina. La mezcla se administró subcutáneamente, a una dosis de 0,5 ml/100 g. Se hizo una pequeña incisión en el lado izquierdo para exponer el riñón y se usó un microscopio de disección para hacer una pequeña incisión en la cápsula del riñón. La cápsula se separó entonces del riñón, los islotes/coágulo se colocaron bajo la cápsula, se cerró la incisión y se dejó que los animales se recuperaran.

Se realizaron nefrectomías en los animales, 38-39 días después del trasplante. Brevemente, después de la anestesia, se expuso el riñón que llevaba el injerto, los vasos sanguíneos renales se ligaron y se quitó el riñón de cada animal. Cinco días más tarde, los animales se sacrificaron, y los páncreas se recogieron para una confirmación histológica de la destrucción completa de células beta de islote.

Las muestras de tejido se colocaron en formación tamponada neutra al 10%, durante 24 horas, y luego fueron transferidas a alcohol etílico al 70%.

Después de esto, los tejidos se embebieron en parafina y se tiñeron secciones de 5 \mum con hematoxilina y eosina. El páncreas y las secciones de riñón injertadas se tiñeron para la insulina y las células que contenían glucagón, usando métodos estándares y fueron estudiados después.

Todos los ratones se volvieron no diabéticos después del injerto del islote. Después de la nefrectomía, todos los ratones se hicieron hiperglucémicos a los cuatro días.

Los anteriores ejemplos expuestos caracterizan la invención, que es un método para evaluar un páncreas para determinar si los islotes de éste son terapéuticamente útiles. El método implica analizar al menos tres de cinco criterios especificados, y asignar un valor a cada criterio. Las opciones del valor, como se dice supra son +1 o -1. Si, después de tres ensayos, el órgano tiene una puntuación de +3, entonces la prueba puede ser terminada, ya que aunque si los dos criterios finales tuvieran valores de -1, no es posible para el órgano tener una puntuación total menor de +1.

Si, después de que sean determinados tres criterios de los cinco, y el órgano es evaluado con +1, entonces se realiza una cuarta prueba, porque una puntuación de +1 después de tres pruebas no garantiza un valor final de +1 o mayor. Si el cuarto criterio para el órgano produce una puntuación de +1, entonces la prueba puede ser considerada completa, porque, otra vez, no es posible para el órgano tener una puntuación de menos de +1 si tiene una puntuación de +2 después de cuatro pruebas.

Si, después de cuatro pruebas, el órgano tiene una puntuación de 0, entonces la quinta prueba debería ser realizada para una puntuación del dispositivo.

A la inversa, si el órgano tiene una puntuación de -3 después de tres pruebas, no hay ninguna necesidad de seguir adelante, y una puntuación de -2 después de cuatro pruebas elimina la necesidad de una prueba final. (Nótese que, de acuerdo con la invención, las únicas puntuaciones posibles después de tres pruebas son +3, +1, -1 ó -3, y después de cuatro pruebas, +4, +2, 0 -2 y -4; sin embargo, puntuaciones de +4 y -4 eliminan la necesidad de realizar más pruebas. Por eso, aunque pueda ser deseable hacerla así, no es requerida.)

La opción de qué tres pruebas realizar primero se hace según el criterio del experto en la técnica; sin embargo, el criterio del tiempo de isquemia caliente es el que está dentro del control del investigador, y puede ser preferido como una de las tres primeras pruebas. El resto de las tres primeras pruebas será de la elección del experto en la técnica.

La metodología expuesta en este documento puede usarse en un páncreas de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitación, bovino, porcino, ovino, murino, primate, humano, pecuario u otras especies.

Pueden usarse los islotes que sean obtenidos de los páncreas que son seleccionados de acuerdo con la invención, "como tal", como se muestra en los ejemplos, o pueden usarse, p.ej, en forma encapsulada, de macroperla, como se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.643.569 y Re 38.027.

Otros aspectos de la invención serán evidentes para el experto en la técnica y no requieren más elaboración.

Claims (13)

1. Un método para determinar si un páncreas aislado será una fuente de islotes terapéuticamente útiles, que comprende:

(i) determinar el tiempo de isquemia caliente de dicho páncreas aislado y al menos dos de:

(ii) determinar el color de dicho páncreas aislado,

(iii) determinar el contenido de grasa de dicho páncreas aislado,

(iv) determinar la demarcación de islotes en dicho páncreas, y

(v) determinar el tamaño promedio de islotes en dicho páncreas antes del aislamiento de éste:

(a)

en (i) a un tiempo de isquemia caliente de menos de aproximadamente 15 minutos se le asigna una puntuación de +1, y uno mayor que aproximadamente quince minutos se le asigna una puntuación de -1;

(b)

a una relación de reflectancia para dicho color por encima de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de +1, y una por debajo de aproximadamente 60 se le asigna una puntuación de -1;

(c)

a un contenido de grasa por debajo de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de +1, y por encima de aproximadamente el 25% se le asigna una puntuación de -1;

(d)

a una demarcación por encima de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de +1, y por debajo de aproximadamente el 50% se le asigna una puntuación de -1, y

(e)

a un diámetro promedio para islotes iguales o mayor que el valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de +1, y por debajo del valor promedio para dichas especies se le asigna una puntuación de -1, en el que si, después de realizar tres de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), se obtiene una puntuación de +1 o -1, se realiza un cuarto miembro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v), y si, después de realizar cuatro de (i), (ii), (iii), (iv) y (v) se obtiene una puntuación de 0, se realiza el quinto miembro.

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2. El método de la reivindicación 1, que comprende (i) y al menos tres de (ii)-(v).

3. El método de reivindicación 1, que comprende todos de (i) a (v).

4. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (iii).

5. El método de reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (iv).

6. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (ii) y (v).

7. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iii) y (iv).

8. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iii) y (v).

9. El método de la reivindicación 1, que comprende (i), (iv) y (v).

10. El método de la reivindicación 2, que comprende (i)-(iv).

11. El método de la reivindicación 2, que comprende (i), (ii), (iii) y (v).

12. El método de la reivindicación 2, que comprende (i), (ii), (iv) y (v).

13. El método de la reivindicación 2, que comprende (i) y (iii)-(v).