ES2344926T3 - Antigeno sintetico para la deteccion de anticuerpos inmunoreactivos con el virus vih. - Google Patents
Antigeno sintetico para la deteccion de anticuerpos inmunoreactivos con el virus vih. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar la presencia de anticuerpos de VIH en un fluido corporal, incluyendo: (a) contacto en condiciones que permitan la unión inmunoespecífica para formar una mezcla de reacción del fluido corporal con una composición que contenga por lo menos un polipéptido seleccionado del grupo consistente en las secuencias de aminoácidos: **(Ver fórmula)** donde W es un H del grupo amino terminal NH2 del polipéptido, o uno o más aminoácidos adicionales ligados al grupo amino terminal NH2 del polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora o a un soporte; X está ausente, Cys-Gly-Gly; o Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más aminoácidos añadidos para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o NH; (b) detectar si se ha producido unión inmunoespecífica entre el polipéptido y un componente anticuerpo del fluido corporal formando un complejo inmune e indicando la detección del complejo inmune la presencia de anticuerpos de VIH en el fluido corporal.
Description
Antígeno sintético para la detección de
anticuerpos inmunoreactivos con el virus VIH.
Esta invención se refiere a polipéptidos
sintéticos, polipéptidos recombinantes y secuencias de
polinucleótidos recombinantes codificando las mismas, útiles para
la detección de anticuerpos asociados al virus de inmunodeficiencia
humana tipo 1 (VIH-1) y/o tipo 2
(VIH-2) (en lo sucesivo, "VIH" utilizado sin
referencia al tipo significará cualquiera de ambos tipos), y se
refiere en especial a polipéptidos sintéticos que imitan epítopos
antigénicos de los productos de gen de la región de la polimerasa
VIH.
Se sabe que los virus de la inmunodeficiencia
humana tipos 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2)
causan el síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA).
Aparentemente, ambos virus presentan formas similares de
transmisión. El VIH-1 y el VIH-2
fueron aislados al principio de la década de 1980 en pacientes
africanos con SIDA. Desde entonces se han identificado casos en la
mayoría de países del mundo. Como los virus VIH presentan una rápida
deriva genética, están surgiendo cepas ampliamente divergentes. Por
ello, se ha demostrado que la detección y el tratamiento de las
cepas variantes resulta problemático y difícil.
Los individuos con anticuerpos reactivos al
VIH-1 y/o VIH-2 se determinan
mediante inmunoensayos del formato sándwich ELISA convencional.
Estos ensayos comprenden un antígeno viral inmovilizado, que puede
incluir lisado viral, proteínas de retrovirus o polipéptidos
naturales o sintéticos, que entran en contacto con sangre o
componentes séricos sospechosos de contener anticuerpos HTV. Si bien
los tests comerciales existentes parecen haber reducido
significativamente la transmisión de virus VIH en productos
hematológicos, la configuración de cada test puede presentar
algunos inconvenientes.
Los posibles inconvenientes de los tests de
lisado viral incluyen: la necesidad de cultivar y manipular grandes
cantidades de virus infecciosos vivos; la posibilidad de que los
virus vivos puedan incorporarse a los materiales del test; la
naturaleza variable del lisado viral resultante; y el importante
número de resultados falsos positivos y falsos negativos, que
requieren pruebas adicionales de confirmación. Estos inconvenientes
pueden ir también asociados al uso de proteínas virales aisladas
como antígenos.
El uso de polipéptidos sintéticos, (en lo
sucesivo, "polipéptido sintético" y "polipéptido"
significará cualquiera, todos o una combinación de lo siguiente:
polipéptido sintético, polipéptido recombinante, o polipéptido) que
puede ser manipulado para imitar inmunológicamente epítopos
antigénicos de los virus VIH, puede evitar algunos de los
inconvenientes antes mencionados. Un área de preocupación con el uso
de polipéptidos sintéticos (menos de o igual a 60 residuos de
longitud) en ensayos diagnósticos es la consideración de que la
deriva antigénica viral podría hacer que no se detectaran sueros
infectados con VIH-1 o VIH-2
utilizando esos ensayos, posiblemente debido a la limitada
presentación de epítopos virales. Un método para evitar tal cosa es
incluir polipéptidos de distintas regiones inmunodominantes del
genoma viral. Por tanto, polipéptidos sintéticos que imiten
inmunológicamente regiones inmunodominantes de los productos del
gen pol de VIH-1 y VIH-2 son
importantes adiciones a los ya descritos polipéptidos que imitan
las proteínas env, gag y pol de VIH-1 y
VIH-2. Las patentes de los Estados Unidos Nº
4.629.783 y 5.075.21 1 describen polipéptidos sintéticos que imitan
determinantes antigénicos de VIH-1. La Patente
Cosand de Estados Unidos 5.075.211 describe polipéptidos sintéticos
que imitan inmunológicamente epítopos antigénicos de proteínas de
VIH-1 de la región pol, incluyendo dos polipéptidos
que son similares a los polipéptidos de esta invención. En ensayos
de cribado de sangre, cuanto mayor es la inmunorreactividad de los
antígenos utilizados en el método de ensayo, es menos probable que
no se detecten anticuerpos de una nueva variante o subtipo de
HTV-1 o VIH-2, presentes en la
muestra de un paciente.
La Patente de Estados Unidos 5.306.466 describe
un "retrovirus VIH-3" del que se creyó
inicialmente que era algo aparte y distinto de
VIH-1 y VIH-2. Posteriormente, los
investigadores han establecido que el retrovirus
VIH-3 es simplemente un subtipo especial del
VIH-1, al que se denomina ahora subtipo O, o Grupo O
(R. De Leys, et al., J. Virol.: 1207-1216
(1990); L.G Gürtler, et al. J. Virol.:
1581-1585 (1994)).
Comparando diversos aislados de
VIH-1, los investigadores han demostrado que algunas
regiones del genoma son altamente variables, mientras que otras se
conservan razonablemente bien. Se han observado polimorfismos
similares también en el VIH-2.
A pesar de las aparentes similitudes en el
estado de la enfermedad y la transmisión de los virus
VIH-1 y VIH-2, los tipos de virus
se han diferenciado en base a su divergencia genética. En base a
análisis genéticos, los aislados virales pueden ser agrupados de
acuerdo con su homología genética con aislados previos. Hoy
VIH-1 y VIH-2 conforman las dos
principales ramas de árbol genético del VIH. Los estudios de
hibridación de ADN sugieren que mientras existen algunas regiones
de amplia homología entre VIH-1 y
VIH-2, otras regiones parecen muy divergentes.
(Clavel et al., Science 233:343 (1986)). De hecho, se ha
comprobado que el VIH-2 tiene, en general, sólo una
homología aproximada del 40% con el VIH-1, y los
estudios han demostrado escasa reactividad inmunológica cruzada
entre las glicoproteínas de la envoltura. La limitada reactividad
serológica cruzada entre esos virus hace que los ensayos de cribado
basados en antígenos de VIH-1 sean insuficientes
para el cribado o diagnóstico de infección por
VIH-2 en sueros
humanos.
humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se define en las reivindicaciones
que se anexan. Se han identificado secuencias de polipéptido
denominadas ROD 124E1, ROD124C2X, RODC1X, RODC3X y ROD 124C5X,
capaces de imitar regiones inmunodominantes de proteínas
VIH-2, codificadas en la región polimerasa. Esos
polipéptidos pueden usarse en varios ensayos específicos de unión
para la detección de anticuerpos del virus
VIH-2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pGEX/pol23.
La Fig. 2 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pGEX/pol7.
La Fig. 3 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pQE/pol23.
La Fig. 4 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pQE/pol7.
La Fig. 5 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pThioHis/pol23.
La Fig. 6 muestra un mapa de plásmidos de una de
las estructuras recombinantes de la presente invención, más
específicamente la de pThioHis/pol7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan nuevos polipéptidos que imitan
inmunológicamente proteínas incluidas en los retrovirus
VIH-2.
En general, el término "polipéptido" o
"péptido" utilizado aquí significará una cadena de moléculas de
aminoácidos con actividad biológica. Los términos no se refieren a
un producto de una longitud específica.
Además, uno o más aminoácidos pueden añadirse a
los extremos de un oligopéptido o polipéptido, para el acoplamiento
a un soporte o portador.
Se prefiere en especial la cisteína para
facilitar el acoplamiento covalente a otros polipéptidos o, por
ejemplo, para formar dímeros por oxidación. Para formar polímeros,
se prefiere tener por lo menos dos residuos de cisteína presentes
en las moléculas que se están uniendo, de preferencia utilizando
residuos de cisteína añadidos a las porciones terminales de los
polipéptidos. También son útiles las combinaciones de cisteína con
espaciadores de aminoácidos intervinientes. Por ejemplo, dos
residuos de cisteína pueden ser separados por uno o más residuos de
aminoácidos. Los residuos de glicina son especialmente útiles, y
pueden emplearse de uno a tres residuos de glicina entre
aminoácidos. También se ha comprobado que los residuos de lisina
son útiles como uniones, y se pueden usar de uno a tres residuos de
lisina para acoplar los polipéptidos a una fase sólida sola o en
combinación con otros aminoácidos.
Además, las secuencias del polipéptido sujeto
pueden ser distintas de la secuencia natural tras ser modificadas
por acetilación del terminal-NH_{2}, ej.
acetilación o amidación del ácido tioglicólico, amidación de
terminal-carboxi, ej. con amoniaco o metilamina,
para proporcionar estabilidad, mayor hidrofobicidad para enlace o
unión a un soporte u otra molécula, o para polimerización.
Los polipéptidos derivados de la región
polimerasa del VIH-1 se describen más abajo. La
familia de los polipéptidos de VIH-1 está
codificada por las secuencias de polinucleótidos genómicos (aislado
LAI o BRU), comprendiendo los pares de base (pb) 4448 a (pb) 4585
(numeración de Genbank HIVBRUCG; Accesión K02013, aislado BRU) o
está codificada en el marco de lectura abierta pol de los residuos
de aminoácido del número 940 a aproximadamente el 985.
\newpage
El polipéptido I tiene la siguiente secuencia de
polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
El polipéptido II, designado también como
BRU124EX, tiene la siguiente secuencia de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
El polipéptido III, designado también como
BRU124F3X, tiene la siguiente secuencia de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
El polipéptido IV, designado también como
BRU124F3X, tiene la siguiente secuencia de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
Los polipéptidos de la invención, derivados de
la región polimerasa del VIH-2 se describen más
abajo. El polipéptido V, designado también como ROD124E1, es
codificado por la secuencia de polinucleótidos del genoma del
VIH-2, comprendiendo los pares base (pb) 4694 a
(pb) 4861 (numeración del Genbank HIV2ROD; Accesión M15390, aislado
HTV-2ROD) o está codificado en el marco de lectura
abierta pol de los residuos de aminoácidos números 956 a 1001
aproximadamente.
\newpage
El polipéptido V tiene la siguiente secuencia de
polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
El polipéptido VI, designado también como
ROD124EX, tiene la siguiente secuencia de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
Otro polipéptido de la invención, el Polipéptido
VII, designado también como ROD124C2X, tiene la siguiente secuencia
de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
Otro polipéptido de la invención, el Polipéptido
VIII, designado también como ROD124C1X, tiene la siguiente secuencia
de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Otro polipéptido de la invención, el Polipéptido
IX, designado también como ROD 123 C3X, tiene la siguiente secuencia
de polipéptidos:
donde X es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; Y está ausente, Cys o uno o más aminoácidos se
añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
El polipéptido X, designado también como POL2A1,
tiene la siguiente secuencia de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
Otro polipéptido de la invención, el Polipéptido
XI, designado también como ROD124C5X, tiene la siguiente secuencia
de polipéptidos:
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
Tiene particular interés el uso del grupo
mercaptano de cisteínas de ácidos tioglicólicos utilizados para
acilar los grupos terminal amino, o de forma semejante, para enlazar
dos de los polipéptidos u oligopéptidos o combinaciones de los
mismos con un enlace bisulfuro o uno más largo. Para conseguir esto,
se deben utilizar compuestos que tengan grupos
bis-haloacetil, nitroarilhaluros o semejantes donde
los reactivos sean específicos para grupos tio. Así, el enlace
entre los dos grupos mercapto de los distintos polipéptidos u
oligopéptidos puede ser un enlace simple o un grupo de enlace de
por lo menos 2 átomos de carbono, generalmente por lo menos 4, y no
más de unos 16, habitualmente no más de unos 14.
Alternativamente, la región del genoma viral que
codifica el polipéptido de la invención puede ser clonada mediante
técnicas convencionales de ADN recombinante y expresada. Estas
técnicas incluyen la clonación mediada por PCR, así como la
síntesis de cadenas de polinucleótidos de cadena única codificando
el polipéptido en cuestión. Ver en general, Maniatis et
al.., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982.
Para su expresión, la secuencia de codificación
irá provista con codones de inicio y de terminación, regiones
promotoras y de terminación y habitualmente una sistema de
replicación para proporcionar un vector de expresión para la
expresión en un huésped celular, ej. procariota o eucariota,
bacteriano, levadura, mamífero, etc.
La propia secuencia de ADN, fragmentos de ella o
secuencias mayores, en general por lo menos 15 bases, de
preferencia por lo menos 18 bases, pueden ser utilizadas como sondas
para la detección de ARN retroviral o ADN proviral. Se describen
numerosas técnicas, como la de Grunstein-Hogness, la
Southern, la Northern, la dot-blot y mejoras de las
mismas, así como otra metodología. Ver, por ejemplo, WO 83/02277 y
Berent et al., Biotechniques (1985) 3:208.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El polipéptido puede ser preparado
convenientemente como una proteína fundida, donde el polipéptido
puede ser el N o C-terminal del polipéptido
fundido. Generalmente, el polipéptido considerado viene expresado
como una "fusión translacional", lo que significa que la
proteína expresada tendrá su terminal amino unido a una proteína
"asociada" que viene fácilmente expresada en E. coli, o
en otros sistemas de expresión bien conocidos. La fusión puede
incluir también una etiqueta o "asa" de purificación.
Un ejemplo de tal sistema de fusión es el uso de
una porción del gen glutatión S-transferasa, que
codifica una proteína que puede ser usada en la purificación por
afinidad en resina de glutatión agarosa. Este sistema de fusión se
encuentra en el plásmido pGEX (Pharmacia), disponible en el
comercio. Un segundo ejemplo es el uso de una porción del gen
dihidrofolato reductasa como asociado de fusión, y una secuencia
codificando seis residuos de histidina como asa. El
"His-tag" permite que la proteína de fusión
resultante sea purificada por cromatografía Ni-NTA
(níquel). Este sistema de fusión se encuentra en el plásmido pQE42
(QIAGEN), disponible en el comercio. De forma similar, una porción
del gen de la tiorredoxina de E. coli con un
"His-patch" consistente en tres residuos de
histidina tratados en la secuencia de codificación de la
tiorredoxina permite la purificación de proteínas expresadas por
cromatografía de Ni-NTA. Este sistema de fusión se
encuentra en el plásmido pThioHisA (Invitrogen), disponible en el
comercio.
Una proteína fundida resultante puede ser
utilizada por sí misma como el reactivo, o el polipéptido sujeto
puede ser separado del todo o de una parte de la secuencia restante
de la proteína fundida. Con un polipéptido que no contenga
metioninas internas, introduciendo una metionina en el punto de
fusión el polipéptido puede ser hendido empleando bromuro de
cianógeno. Donde exista metionina interna, sería necesario
proporcionar un punto de hendidura protiolítica, ej. polilisina y/o
arginina o combinaciones de ellas. Alternativamente, la metionina
interna puede ser sustituida por un aminoácido como la leucina, y
añadir una metionina N-terminal para la hendidura
de bromuro de cianógeno. Es bien conocida una amplia variedad de
proteasas, incluyendo las dipeptidasas, y se puede introducir en el
punto adecuado la apropiada señal de procesado. La señal de
procesado puede tener repeticiones en tándem para asegurar la
hendidura, puesto que la presencia de uno o más aminoácidos
externos no interferirá en la utilidad de los polipéptidos
sujeto.
A continuación se describen secuencias de
polinucleótidos recombinantes codificando varios polipéptidos,
derivadas de la región polimerasa del VIH-1. Las
secuencias derivan de las secuencias genómicas de polinucleótido de
VIH-1 (aislado LAI), comprendiendo los pares base
(pb) 2549 a (pb) 3139, y los pares base 4391 (pb) a (pb) 4648, como
se encuentra en el lisado viral VIH-1.
La secuencia de Polinucleótido 1, conocida
también como pol23, tiene la siguiente secuencia:
Esta secuencia codifica la siguiente secuencia
de aminoácido. (Sin intención de que esto constituya una limitación,
se cree que los aminoácidos en cursiva representan residuos
especialmente importantes para la inmunorreactividad del
polipéptido resultante).
\hskip0,6cm (XII) Polipéptido
pol23-aa Codificado por Secuencia de
Polinucleótido (I) pol23
Otra secuencia de polinucleótido de la
invención, la Secuencia de Polinucleótido II, designada también
pol7, tiene la siguiente secuencia:
Esta secuencia codifica la siguiente secuencia
de aminoácido. (Los aminoácidos en cursiva representan el
polipéptido BRU124F3X estudiado también aquí).
\hskip0,6cm (XIII) Polipéptido
pol7-aa Codificado por Secuencia de
Polinucleótido (II) pol7
Los polipéptidos sujeto pueden ser empleados
ligados a un portador macromolecular soluble (ej. no menos de 5
kDal). Si se prefiere, el portador puede ser un poli (aminoácido),
natural o sintético, anticuerpos del cual es poco probable que se
encuentren en el suero humano. Los polipéptidos ilustrativos
incluyen poli-L-lisina, albúmina de
suero bovino, hemocianina de Megathura crenulata, gammaglobulina
bovina, etc. La elección depende básicamente de la conveniencia y
la disponibilidad.
\newpage
Con tales conjugados habrá por lo menos una
molécula de al menos un polipéptido sujeto por macromolécula, y no
más de aproximadamente 1 por 0,5 kDal, habitualmente no más de
aproximadamente 1 por 2 kDal de la macromolécula. Uno o más
polipéptidos distintos pueden ir ligados a la misma
macromolécula.
La forma de enlace es convencional, empleando
reactivos tales como ácido p-maleimidobenzoico,
p-metilditiobenzoico, anhídrido de ácido maleico,
anhídrido de ácido succínico, glutaraldehido, etc. El enlace puede
producirse en el N-terminal, el
C-terminal o en un punto intermedio entre los
extremos de la molécula. El polipéptido sujeto puede ser
derivatizado por enlace, puede ser enlazado mientras está unido a un
soporte, o algo similar.
Los polipéptidos de la invención pueden ser
usados como reactivos en ensayos para detectar anticuerpos del
VIH-2 o antígenos de ellos. Los polipéptidos pueden
ser utilizados como reactivos marcados o no marcados dependiendo de
su uso (por marcador se entiende una molécula que proporciona,
directa o indirectamente, una señal detectable). Pueden emplearse
varios marcadores, tales como radionúclidos, enzimas, fluorescentes,
quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos, cofactores o
inhibidores, partículas, ej., partículas magnéticas, combinaciones
de ligandos y receptores, ej. biotina y avidina o semejantes.
Además, los polipéptidos pueden ser modificados de diversos modos
para ligarlos a una superficie, ej. placa microwell, cuentas de
vidrio, superficie cromatográfica, ej, papel, celulosa, gel de
sílice, o similares. La forma especial por la que los polipéptidos
se unen a otro compuesto o superficie es convencional y está
ampliamente ilustrada en la literatura. Ver, por ejemplo, Pat.
norteamericana Nº 4.371.515; 4.487.715; y patentes citadas en
ellas.
Se pueden emplear diversos protocolos de ensayo
para detectar la presencia de anticuerpos de proteínas retrovirales
o las propias proteínas retrovirales. Especial interés tiene el uso
del polipéptido como reactivo marcado, donde el marcador permite
una señal detectable, o ligar el polipéptido, directa o
indirectamente, a una superficie, donde el anticuerpo o el
polipéptido de la muestra se unirán al polipéptido en la superficie.
La presencia de anticuerpo humano unido al polipéptido puede
detectarse entonces empleando un anticuerpo xenogénico específico
para inmunoglobulina humana, normalmente IgM e IgC humana, o una
proteína marcada específica para complejos inmunes, ej. factor RF
o Proteína A de S. aureus.
Pueden emplearse varios protocolos heterogéneos,
competitivos o no competitivos. El polipéptido puede ligarse a una
superficie o soporte ("soporte") y permitir que el anticuerpo
marcado compita con el anticuerpo en la muestra por la cantidad
limitada de polipéptido ligado. La cantidad de marcador ligado al
soporte estará relacionada con la cantidad de anticuerpo
competitivo en la muestra.
Anticuerpos antihumanos xenogénicos, ej.
anticuerpos de la región Fc de IgG e IgM (inmunoglobulinas) pueden
ligarse a un soporte. La muestra entrará en contacto con las
inmunoglobulinas y el polipéptido marcado, siendo la cantidad de
polipéptido marcado ligado al soporte indicador de la presencia de
los anticuerpos cognados.
Alternativamente, pueden emplearse ensayos
homogéneos donde el polipéptido esté ligado a un enzima,
fluorescente u otro marcador, donde la unión del anticuerpo al
polipéptido da como resultado poder discriminar entre el marcador
involucrado con un complejo específico de par de unión, y marcador
que no está involucrado en el complejo. Para ensayos que comprenden
tales técnicas, ver, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos Nº
3.817.837; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345;
4.034.074; y 4.098.876.
Como ilustración de la invención sujeto, el
polipéptido sujeto puede ser conjugado a una molécula fluorescente,
como fluoresceina, rodamina o umbeliferona. En este ensayo, la
polarización de la fluorescencia es distinta entre el conjugado de
polipéptido complejado y no complejado. Existen aparatos para medir
los cambios en la polarización de la fluorescencia, ej. TDX
suministrado por Abbott Laboratories, Chicago, Illinois.
Es ilustrativo de una técnica de ensayo el uso
de un recipiente de muestra, ej. pocillos de placa microwell, donde
el polipéptido sujeto o conjugados de él se adhieren al fondo y/o
las paredes del recipiente de forma covalente o no covalente. La
muestra, normalmente sangre o suero humanos diluidos en un medio
apropiadamente tamponado, se añade al recipiente y se deja
transcurrir tiempo suficiente para la formación de complejo entre
el(los) polipéptido(s) y cualquier anticuerpo cognado
en la muestra. El sobrenadante se elimina y el recipiente se lava
para eliminar las proteínas ligadas inespecíficamente.
Se emplea para la detección una proteína ligada
específicamente marcada, que se una específicamente al complejo. Al
recipiente se le pueden añadir antisueros xenogénicos de
inmunoglobulina humana, en especial anti- (IgM e IgG humanas) en un
medio apropiadamente tamponado. Los antisueros xenogénicos estarán
normalmente marcados con un marcador detectable, ej. peroxidasa de
rábano. El marcador puede entonces ser detectado. Por ejemplo, con
un enzima, tras la eliminación de un marcador enzimático ligado
inespecíficamente, se añade solución de revelado. La solución de
revelado contendrá un sustrato enzimático y posiblemente cofactores
enzimáticos, cromógenos, etc. que, al reaccionar, proporcionan un
producto coloreado, fluorescente o quimioluminiscente, que puede
ser detectado por colorimetría, fluorimetría o recuento de fotones,
respectivamente.
El polipéptido puede prepararse de una amplia
variedad de modos. El polipéptido, debido a su longitud
relativamente corta, puede ser sintetizado en solución o sobre un
soporte sólido de acuerdo con protocolos conocidos. Ver, por
ejemplo, Stewart and Young, Solid Phase polypeptide Synthesis, 2º
ed:, Pierce Chemical Co., 1984; y Tam et al, J. Am. Chem.
Soc. (1983) 105:6442.
Alternativamente, como se comenta aquí, puede
emplearse tecnología de ADN recombinante cuando pueda prepararse
una secuencia de polinucleótido recombinante utilizando cadenas
únicas que codifican el polipéptido o cadenas substancialmente
complementarias de las mismas. (Ver, por ejemplo, Maniatis, más
arriba).
Dependiendo de la naturaleza del ensayo, la
muestra fisiológica, ej. saliva, sangre, plasma o suero, puede ser
pretratada por dilución en un medio de ensayo, que habitualmente
será un medio acuoso tamponado empleando uno o varios tampones,
tales como fosfato, tris o semejantes. Un diluyente preferido es
leche en polvo no grasa al 5% p/v, Proclin 300, 01%, Antifoam A
,005% en 150 mM de citrato sódico. Generalmente el pH se situará
en el rango de aprox. 6 a 9. La muestra se combinará entonces con el
reactivo de acuerdo con un protocolo apropiado y se dejará
transcurrir tiempo suficiente para la unión. Cuando se utilice un
sistema heterogéneo, habitualmente las fases de la unión irán
seguidas de lavados para minimizar la unión inespecífica. Al final
del procedimiento, el marcador se detectará según métodos
convencionales.
Aparte del uso del polipéptido sujeto y sus
análogos en ensayos, el polipéptido sujeto puede ser también usado
por sí sólo o en combinación en vacunas. Los polipéptidos pueden
ser formulados de forma conveniente, generalmente a concentraciones
del orden de 1 ug a 20 mg/kg de huésped. Como portadores pueden
utilizarse medios fisiológicamente aceptables, como agua estéril,
salina, salina con tampón fosfato y semejantes. Pueden emplearse
adyuvantes, tales como gel de hidróxido de aluminio o semejantes.
La administración puede ser por inyección, ej. intramuscular,
intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, etc. La administración
puede ser única o múltiple, habitualmente a intervalos de una a
cuatro semanas.
La inmunorreactividad de los polipéptidos
I-IV antes mencionados, que inmunológicamente imitan
a antígenos de VIH-1, a ocho sueros positivos
VIH-1 conocidos (es decir GS91-[034, 037, 042, 046,
049, 052, 056, y 067], 11230, 11424, 11527, 11532 y 11535; todos
positivos en Western-blot en todas las bandas) fue
examinada, y los resultados se presentan en la Tabla 1A del Ejemplo
2. Todos los polipéptidos señalados más arriba fueron altamente
reactivos a esas muestras.
De forma análoga, se examinó la
inmunorreactividad de cada uno de los polipéptidos antes
mencionados, que imitan inmunológicamente los antígenos de
VIH-2, a cinco sueros positivos a
VIH-2 conocidos (es decir, 92099,92100,
P-83, P-84, y P-86;
positivos en todas las bandas de Western-blot), y
los resultados se presentan en la Tabla IB del Ejemplo 2. El
polipéptido glicoproteína (gp),
41-2-3GC, un polipéptido no
glicosilado fue altamente reactivo a las cinco muestras. Todos los
polipéptidos indicados antes - fueron reactivos a por lo menos dos
de esos cinco ejemplos. Los polipéptidos más reactivos fueron ROD
124C2X y ROD 124C5X; fueron reactivos a las cinco muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Series de polipéptidos pol de VIH fueron
sintetizadas por el acoplamiento secuencial de aminoácidos
protegidos por t-butiloxicarbonil en 0,35 mml de
resina p-metilbenzhidrilamina (Applied Biosystems
Inc., Foster City, CA). La protección de cadena lateral de
aminoácidos se realizó por grupos con base bencilo estándar. El
residuo triptófano fue protegido por la fracción formil. Los
polipéptidos completados fueron desprotegidos y hendidos de la
resina por el procedimiento "high HF" estándar o el
procedimiento "low-high HF" de Tarn et
al. (J. Amer. Chem. Soc. 105:6442, 1983). El polipéptido
hendido fue extraído de la resina en ácido acético al 50% y sometido
a cromatografía Sephadex G-25, utilizando ácido
acético al 20% como disolvente de elución. Las fracciones
conteniendo polipéptido fueron reunidas y liofilizadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Polipéptidos de la invención fueron comprobados
en cuanto a reactividad inmunológica con ELISA, como descrito
previamente en la Patente de Estados Unidos Nº 4.629.783.
Brevemente, soluciones stock de polipéptidos de la invención a 0,5
mg/ml se prepararon en urea 2 M/ácido acético al 5%. Se colocaron 12
mililitros de ácido acético al 1,2% en un tubo de polipropileno de
15 mililitros y se añadieron 48 microlitros de la solución stock de
polipéptido al tubo y se mezclaron (la "solución de
cobertura"). Se llenaron pocillos de placas microwell con 100 ul
de la solución de cobertura de los polipéptidos y 100 ul/pocillo de
0,24 M carbonato/ 0,2N NaOH se añadieron para elevar la solución de
cobertura a un pH alcalino. Se cubrió la placa y se dejó reposar
durante la noche a temperatura ambiente. La solución de cobertura
fue eliminada por aspiración y se añadieron 300 ul/pocillo de
solución Plate Blocking (conteniendo por litro; 25 g de leche en
polvo sin grasa, 14,7 g de citrato sódico dihidratado, 8,47 g de
cloruro sódico y 0,05 ml de Antifoam A, 1,0 ml de Kathon GC/ICP) y
se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La solución
bloqueante fue eliminada por aspiración, y las placas fueron
utilizadas inmediatamente o se dejó que se secaran al aire y se
almacenaron para su posterior uso. Para llevar a cabo el
inmunoensayo, las muestras de plasma fueron diluidas 20 veces en
Specimen Diluent (conteniendo por litro; 44. lg de citrato sódico
dihidratado, 1,2 ml de Tween 20, 50 g de leche en polvo sin grasa,
0,05 ml de Antifoam A, 50 ml de suero de cabra, 58,6 g de ácido
2-[N-morfolino]etano sulfónico, 92,9 g de
hidrocloruro de trietanolamina, 1 ml de Proclin 300) y se añadieron
100 ul a pocillos individuales. Las muestras fueron incubadas
durante 30 minutos a 37ºC, y luego extraídas, y los pocillos fueron
lavados cinco veces con 0,1 M NaCl/ Tween 20 0,05% (350 ul/lavado).
Cien microlitros de conjugado de peroxidasa de rábano - Ig
antihumana de cabra diluido en tampón citrato, pH 7.0, conteniendo
suero de cabra normal al 1% se añadieron a cada pocillo durante 30
minutos a 37ºC antes de lavar cinco veces como más arriba. El
ensayo ELISA fue desarrollado añadiendo 100 ul/pocillo de solución
sustrato (80 ug/ml de tetrametilbencidina, peróxido de hidrógeno
0,0015% en tampón citrato/fosfato, pH 6.0) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Las reacciones se detuvieron con la adición
de 100 ul de IN H_{2}SO_{4} por pocillo, y el ratio de la
densidad óptica de 450 nm a 630 nm fue determinado por un lector de
ELISA automático. El valor de corte para un resultado positivo se
estableció en 0,200 Unidades de Absorbancia sobre la absorbancia
media obtenida de por lo menos tres muestras negativas
conocidas.
Los resultados de la Tabla 1A muestran la
reactividad de los polipéptidos con muestras VIH-1
positivas y negativas, donde las muestras VIH-1
positivas son GS91-(034, 037,042,046, 049, 052, 056,067), 11230,
11424, 11527, 11532 y 11535, y las muestras negativas son PS
1059-PS1062, PS 1068, PS 1071, y
D21-D25.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la Tabla 1B
muestran la reactividad de los polipéptidos de la invención con
muestras VIH-2 positivas y negativas, siendo las
muestras VIH-2 positivas las 92099, 92100,
P-83, P-84 y P-86,
y las muestras negativas NBD1, NBD2, NBD3, y NBD4.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mejora en la especificidad de la detección
de anticuerpos VIH-1 y VIH-2 por la
incorporación de polipéptidos pol (BRU124F3X y ROD124C5X) viene
ilustrada por los resultados del estudio que se presentan en la
Tabla 1C. En este estudio, los polipéptidos pol fueron recubiertos
en la placa microwell individualmente o juntos con polipéptidos
específicos de envoltura, como se menciona en la Patente de Estados
Unidos Nº 5.439.792. Para la cobertura de la placa con polipéptidos
pol individuales, el polipéptido fue recubierto a 1,0 ug/ml. Para
la cobertura de placa de la mezcla de polipéptidos
VIH-1 y VIH-2, los polipéptidos se
mezclaron juntos a las siguientes concentraciones en el tampón de
cobertura: 1,23 ug/ml para el polipéptido de envoltura
VIH-1 (designado como MNGC), 0,64 ug/ml para el
polipéptido de envoltura VIH-2 (designado como
41-2-3GC), 0,25 ug/ml para BRU124F3X
y 0,125 ug/ml para ROD124C5X. El procedimiento de cobertura del
polipéptido fue el mismo que el descrito anteriormente en la
sección de "inmunorreactividad". Las muestras comprobadas son
muestras VIH-1 conocidas (Western blot positivo en
todas las bandas) (es decir, SAL040, SAL041, SAL059, SAL063,
SAL064), muestras VIH-2 conocidas (Western blot
positivo en todas las bandas) (es decir 52, GB92000128, GB92000152,
GB92000154, GB92000158), muestras VIH-1
indeterminadas (es decir, B3113, B5813, B5885, B7045, C000127,
C000214, C000455) y muestras VIH-2 indeterminadas
(es decir B3123, B5605, B5810, B5826, B5832, B5875, B6312). También
se incluyen las muestras de control utilizadas en el kit Genetic
Systems® HIV-1/HIV-2 Peptide E1A
(obtenible de Sanofi Diagnostics Pasteur, Inc., Redmond,
Washington), es decir control positivo VIH-1
(PC-1), control positivo VIH-2
(PC-2) y control negativo (NC). Tanto las muestras
positivas conocidas como las indeterminadas fueron también
comprobadas con una prueba a base de lisado viral disponible en el
comercio, la Genetic Systems®
HIV-l/HIV-2 EIA (Sanofi Diagnostics
Pasteur, Inc., Redmond, Washington).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 1C muestra que todas las muestras
VIH-1 y BIH-2 positivas conocidas
dieron resultados positivos utilizando una placa con cobertura de
polipéptido pol único o la placa recubierta con los cuatro
polipéptidos. Todas las muestras VIH-1 y
VIH-2 indeterminadas presentaron resultados
negativos al utilizar una placa recubierta con polipéptido pol
único o la placa recubierta con los cuatro polipéptidos. Las
muestras indeterminadas presentaron resultados altamente positivos
(falsos positivos) al comprobarlas utilizando el
HIV-1/HIV-2 EIA basado en lisado
viral. Estos resultados demuestran muy claramente que el EIA basado
en polipéptidos que incorpora los polipéptidos pol de la invención
es altamente sensible y específico para la detección de muestras VIH
positivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los recombinantes pol23 y pol7
fueron clonados inicialmente en el sistema pGEX (Pharmacia). Las
inserciones clonadas fueron entonces trasladadas a otros vectores
de expresión que proporcionan "asas de purificación" para
simplificar el análisis de la expresión génica.
Se generó un producto de PCR utilizando ADN
viral VIH-1 aislado de lisado viral de la cepa LAI
de VIH-1 como plantilla, y el par de primers 5'
AGCACCATGGGGATCCCAGGGATTAGATATCAGTACAATG 3' y 5'
AGTCAGAATTCATTGGCCTTGCCCCTGCTT 3'. Las reacciones PCR utilizaron ADN
polimerasa UITma (Perkin-Elmer) para minimizar la
posibilidad de mutación debida a un error de polimerasa. El
producto de PCR fue digerido con los enzimas de restricción
BamHI y EcoRI e insertado en Bam HI,
pGEX5X-l digerido con EcoRI (Pharmacia). La mezcla
de ligación fue transformada en E. coli DH11S y colonias
seleccionadas resistentes a la ampicilina (ver Maniatis, más
arriba).
Las colonias conteniendo inserciones fueron
identificadas inicialmente por PCR de colonia. Esto fue seguido por
crecimiento, aislamiento de plásmidos^{1}, y análisis de restricción para demostrar que los
clones candidato contenían los puntos de restricción previstos
(ver Maniatis, más arriba). En la Figura 1 se presenta un
mapa de plásmidos del clon resultante.
Como se ha descrito antes, se generó un producto
de PCR utilizando una plantilla de ADN viral VIH-1,
y el par de primers 5' AGCACCATGGGGATCCCCTACAGTGCAGGGGAAAGAATA 3' y
5' GACTAGTCGACTCAATCATCACCTGCCATCTG 3'. Las reacciones PCR
utilizaron ADN polimerasa UITma
(Perkin-Elmer) para minimizar la posibilidad de
mutación debida a un error de polimerasa. El producto de PCR fue
digerido con los enzimas de restricción BamHI y SalI
e insertado en pGEX 5X-1 digerido con BamHI,
SalI I. La mezcla de ligación fue transformada en E.
coli DH1 1S y colonias seleccionadas resistentes a la
ampicilina.
Las colonias conteniendo inserciones fueron
identificadas inicialmente por PCR de colonia. Esto fue seguido por
crecimiento, aislamiento de plásmidos^{2}, y análisis de
restricción para demostrar que los clones candidatos contenían los
puntos de restricción previstos. En la Figura 2 se presenta un mapa
de plásmidos del clon resultante.
El ADN insertado fue preparado a partir de
pGEX/pol23 y pGEX/pol7.0 por digestión con los
enzimas BamHl y Sal1. Los vectores de expresión
comerciales pThioHisA (Invitrogen) y pQE42 (QIAGEN) fueron
digeridos con los enzimas Bgl II^{2}
y SalI. En reacciones de ligación
separadas, cada inserción fue unida a cada vector, (ver Maniatis,
más arriba). Nuevamente, transformantes resistentes a la
ampicilina fueron seleccionados en la cepa huésped DH11S de E.
coli. La identidad de los clones fue comprobada por PCR de
colonia y análisis de restricción de ADN plásmido purificado. Los
recombinantes resultantes fueron designados como pQE/pol23,
pQE/pol7.0, pThioHis/pol23, y pThioHis/pol7.0.
(Los mapas de plásmidos de los clones resultantes se presentan en
las Figuras 3 a 6 respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Los tres sistemas de expresión de plásmidos,
pGEX, pThioHisA, y pQE42, empleando el promotor tac son
regulados negativamente (desconectados) por la glucosa, y regulados
positivamente (conectados) por el análogo IPTG de la lactosa.
\newpage
Cultivos de 25 ml de cada uno de los
recombinantes pQE/pol23, pQE/pol7.0.
pThioHis/pol23. y pThioHis/pol7.0 se cultivaron
en caldo T completo más 100 mg/ml de ampicilina, glucosa al 1,0% a
37ºC (agitado) hasta que la densidad óptica a 600 nm fue entre 2 y
6. Las células se pelletearon entonces y resuspendieron en medio
fresco sin glucosa que contenía ImM IPTG para inducir la expresión
de la proteína de fusión recombinante. Tras 2 horas adicionales de
incubación, los cultivos inducidos fueron recolectados por
centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos. El medio sobrenadante
resultante fue desechado y los pellets de células congelados a
-70ºC.
Los pellets congelados fueron descongelados y
resuspendidos en 2,0 ml de un medio acuoso de 20 mM de fosfato
sódico, pH 7.8 y 500 mM de NaCl. Las células fueron lisadas por dos
ciclos de congelación en un baño de hielo seco/etanol, seguidos de
descongelación en agua caliente y 10 ráfagas cortas de sonicación.
El lisado resultante fue centrifugado entonces en una microfuge
Eppendorf a velocidad máxima hasta que estuvo pelleteado. Los
sobrenadantes del lisado y los pellets fueron usados para la
posterior purificación.
Para estos recombinantes, los pellets de lisado
fueron disueltos en un tampón acuoso comprendiendo 20 mM de fosfato
sódico, pH 7.8 y 8 M de urea. Esta suspensión fue ligada a agarosa
Ni-NTA (Q1AGEN) que fue preequilibrada en el mismo
tampón. El material no ligado fue eliminado por lavado con el mismo
tampón. La proteína ligada fue entonces eluida con un tampón acuoso
conteniendo 20 mM de fosfato sódico, 6,4 M de urea y 100 mM EDTA.
Las proteínas de fusión purificadas resultantes fueron analizadas
por SDS-PAGE.
Los sobrenadantes de lisado fueron también
purificados, utilizando los métodos que se detallan más abajo, pero
en los pellets de lisado se encontraron niveles más altos de
proteína recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estos recombinantes, los sobrenadantes de
lisado se ligaron a Ni-NTA que había sido
preequilibrado en un tampón acuoso conteniendo 20 mM de fosfato
sódico, pH 7.8 y 500 mM de NaCl. El material no ligado fue eliminado
por lavado con el mismo tampón, y después nuevamente con un tampón
de lavado acuoso (20 mM de fosfato sódico, pH 6.0, 500 mM de
NaCl).
La proteína ligada fue eluida en cuatro pasos
sucesivos utilizando concentraciones crecientes de imidazol en el
tampón de lavado (50 mM, 200 mM, 350 mM, 500 mM). El análisis de
SDS-PAGE demostró que 350 mM de imidazol era la
condición de elución óptima para estos recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando procedimientos de laboratorio
estándar, se separaron por SDS-Page muestras de las
proteínas de fusión parcialmente purificadas resultantes. Se
utilizaron geles de gradiente Novex al 4-20% de
poliacrilamida.
Se observó en todos los casos que las proteínas
de fusión recombinantes migraban a aproximadamente los tamaños
previstos como se ve en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas separadas fueron también
transferidas a un soporte de nitrocelulosa para su análisis por
Western blot. Se utilizó el método de transferencia electroforética
semiseco (Harlow y Lane, Antibodies, a laboratory manual pp.
488-489) para transferir proteínas electroforizadas
a membranas de nitrocelulosa.
\newpage
Tras la transferencia, las membranas fueron
bloqueadas con Blotto ((50 mM de Tris pH7.5, 150 mM de NaCl, leche
en polvo sin grasa 5,0%, Tween-20 0,1%) durante la
noche a 4ºC, o una hora a temperatura ambiente. Tras eliminar el
agente bloqueante, la membrana fue incubada con el anticuerpo
primario^{3} diluido
en Blotto, durante una hora a temperatura ambiente. La solución de
anticuerpo primaria se desecha entonces y el blot es lavado cuatro
veces durante 5 minutos, cada vez con Blotto. El conjugado
anticuerpo-enzima secundario^{4} se añade entonces
para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al cabo
de 30 minutos, el anticuerpo secundario se desecha y el blot se
lava de nuevo cuatro veces como antes. A esto le sigue un aclarado
con agua y luego la adición de la solución sustrato de
color^{5}.
El desarrollo de color fue detenido mediante
lavado con agua tras la aparición de bandas. Las bandas de proteína
pQE/pol23 y pThioHis/pol23 reaccionaron en Western
blots utilizando uno de los anticuerpos monoclonales de ratón,
mientras que las bandas de proteína pQE/pol7.0 y
pThioHis/pol7.0 reaccionaron con el otro. Las cuatro bandas
fueron detectadas con el suero humano VIH-1
positivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cubrieron placas de EIA con las proteínas de
fusión recombinantes parcialmente purificadas. Cada muestra fue
recubierta a una dilución de 1:500 en tampón de recubrimiento 15 mM
de carbonato/35 mM de bicarbonato pH 9.6 durante la noche a
temperatura ambiente. Las placas recubiertas fueron entonces
bloqueadas "ON/OFF" (leche en polvo sin grasa 2,5%),
recubiertas "ON/OFF" con una solución de sucrosa 4%, y secadas
con aire durante la noche. Preparadas así, las placas pueden ser
almacenadas en una bolsa sellada con desecante.
Cada proteína de fusión recombinante fue
comprobada en cuanto a reactividad con 16 muestras
VIH-1 positivas, 8 muestras de donante normal, y 4
muestras reactivas a E. coli. Las muestras reactivas a E.
coli son muestras que han demostrado previamente poseer una
elevada reactividad a proteínas de lisado de E. coli. Estas
se incluyeron para asegurar que la reactividad que observamos con
muestras VIH-1 positivas es específica para el
polipéptido recombinante, y no dirigida hacia proteínas E.
coli contaminantes.
Brevemente, las muestras fueron diluidas 1:101
en un diluyente muestra (conteniendo por litro; 44,1 g de citrato
sódico dihidratado, 1,2 ml de Tween 20, 50 g de leche en polvo sin
grasa, 0,05 ml. de Antifoam A, 50 ml de suero de cabra, 58,6 g de
ácido 2-[N-morfolino]etano sulfónico, 92.9 g
de hidrocloruro de trietanolamina, 1 ml de Proclin 300) y 200
\mul de las mezclas resultantes se añadieron a cada pocillo de las
placas preparadas previamente. Las placas fueron cubiertas e
incubadas a 37 \pm 1ºC durante 60 minutos. Se aspiró el líquido
de cada pocillo y se lavó la placa un mínimo de 5 veces con una
solución de lavado (0,1 M NaCl/Tween 20 0,05%).
Se añadieron a cada pocillo100 \mul de una
solución conjugada (conjugado de antihumano de cabra 1
g-peroxidasa de rábano diluido en tampón citrato,
pH 7.0, conteniendo suero de cabra normal 1%). Las placas fueron
luego cubiertas e incubadas durante 60 minutos a 37 \pm 1ºC. Tras
la incubación, el líquido fue aspirado de cada pocillo y la placa
lavada un mínimo de 5 veces con la solución de lavado.
Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una
solución cromógena (80 ug/ml de tetrametilbenzidina, peróxido de
hidrógeno al 0,0015% en tampón citrato/fosfato, pH 6.0). Las placas
fueron luego cubiertas e incubadas en la oscuridad durante 30
minutos a temperatura ambiente. Tras quitar la cubierta y añadir 100
\mul de un reactivo de detención (1N H_{2}SO_{4}) las placas
fueron leídas a una absorbancia de 450 nm con 615 nm a 630 nm como
referencia. Se calculó el ratio de las densidades ópticas en 450 a
630 nm. El valor de corte para un resultado positivo se estableció
en 0,200 Unidades de Absorbancia sobre la absorbancia media obtenida
de por lo menos tres muestras negativas conocidas. Los resultados
de esos procedimientos se presentan en la Tabla 3.
\newpage
De los anteriores resultados resulta evidente
que utilizando uno o una combinación de polipéptidos de la invención
sujeto se obtiene una prueba sensible y precisa de la presencia de
anticuerpos en HTV. Los polipéptidos sujeto pueden ser utilizados
solos o en combinación con un ensayo de cribado o de confirmación,
mientras que el lisado completo o antígenos completos pueden ser
usados como un procedimiento independiente. Los polipéptidos sujeto
pueden también combinarse con polipéptidos o proteínas derivados de
la envoltura o regiones gag de VIH-1 o
VIH-2 en un ensayo de cribado o confirmación.
Además, debido a las especificidades de los polipéptidos, podría
esperarse que las secuencias de ADN codificando los polipéptidos
encontrarían también una especificidad similar en un ensayo de
hibridación de ADN.
Claims (15)
1. Un método para determinar la presencia de
anticuerpos de VIH en un fluido corporal, incluyendo:
- (a)
- contacto en condiciones que permitan la unión inmunoespecífica para formar una mezcla de reacción del fluido corporal con una composición que contenga por lo menos un polipéptido seleccionado del grupo consistente en las secuencias de aminoácidos:
- \quad
- donde W es un H del grupo amino terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora o a un soporte; X está ausente, Cys-Gly-Gly; o Lys-Lys, Y está ausente, Cys o uno o más aminoácidos añadidos para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o NH;
- (b)
- detectar si se ha producido unión inmunoespecífica entre el polipéptido y un componente anticuerpo del fluido corporal formando un complejo inmune e indicando la detección del complejo inmune la presencia de anticuerpos de VIH en el fluido corporal.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método según la reivindicación 1 en el que
el polipéptido se conjuga a una macromolécula portadora.
3. El método según la reivindicación 1 en el que
el polipéptido es inmovilizado.
4. El método según la reivindicación 1 en el que
se detecta la unión inmunoespecífica por inmunoprecipitación.
5. El método según la reivindicación 1 en el que
la composición incluye por lo menos un polipéptido seleccionado de
una proteína polimerasa de VIH-2 y una seleccionada
de una proteína polimerasa de VIH-1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
6. El método según la reivindicación 1 en el que
se detecta la unión inmunoespecífica entre el polipéptido o la
proteína y el componente anticuerpo del fluido corporal por:
- (i)
- eliminación del componente no ligado de los complejos inmunes formados en la mezcla de inmunorreacción;
- (ii)
- adición de un anticuerpo marcado a la mezcla de inmunorreacción, siendo el anticuerpo marcado capaz de ligarse inmunoespecíficamente a un componente de los complejos inmunes y proporcionando el marcador una señal detectable; y
- (iii)
- determinación de si el anticuerpo marcado se liga a los complejos inmunes.
7. El método según la reivindicación 6 en la que
el marcador incluye un enzima que es detectado por la adición del
sustrato enzimático, un radiomarcador o un marcador
fluorescente.
8. El método para determinar la presencia de
anticuerpos de VIH-2 en un fluido corporal,
incluyendo:
- (a)
- contacto en condiciones que permitan la unión inmunoespecífica para formar una mezcla de reacción del fluido corporal con una composición que contenga por lo menos un polipéptido seleccionado del grupo consistente en las siguientes secuencias de aminoácidos:
- \quad
- donde W es un H del grupo amino terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora o a un soporte; X está ausente, Cys-Gly-Gly; o Lys-Lys, Y está ausente, Cys- o uno o más aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o NH;
- (b)
- detectar si se ha producido unión inmunoespecífica entre el polipéptido y un componente anticuerpo del fluido corporal indicando la detección del complejo inmune la presencia de anticuerpos de VIH en el fluido corporal.
\global\parskip1.000000\baselineskip
9. Una composición de polipéptidos,
inmunorreactiva a anticuerpos de VIH, una de las siguientes
secuencias de aminoácidos:
\hskip3,5cm28
donde W es un H del grupo amino
terminal NH_{2} del polipéptido, o uno o más aminoácidos
adicionales ligados al grupo amino terminal NH_{2} del
polipéptido, seleccionándose los aminoácidos adicionales para
facilitar el acoplamiento del polipéptido a una proteína portadora
o a un soporte; X está ausente,
Cys-Gly-Gly; o
Lys-Lys, Y está ausente, Cys- o uno o más
aminoácidos se añaden para facilitar el acoplamiento; y Z es OH o
NH_{2}.
10. La composición de polipéptido según la
reivindicación 9, donde el mencionado polipéptido tiene la fórmula
(V) ROD 124 E1.
11. La composición de polipéptido según la
reivindicación 9, donde el mencionado polipéptido tiene la fórmula
(VII) ROD 124C2X.
12. La composición de polipéptido según la
reivindicación 9, donde el mencionado polipéptido tiene la fórmula
(VIII) ROD C1X.
13. La composición de polipéptido según la
reivindicación 9, donde el mencionado polipéptido tiene la fórmula
(IX) ROD C3X.
14. La composición del polipéptido de la
reivindicación 9, donde el mencionado polipéptido tiene la fórmula
(XI) ROD 124C65X.
15. Un kit de prueba para la determinación de la
presencia de anticuerpos de VIH en un fluido corporal incluyendo un
antígeno y reactivos auxiliares adecuados para su uso en la
detección de la presencia de anticuerpos del antígeno en el
mencionado fluido; donde el mencionado antígeno es el polipéptido de
la reivindicación 9.
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