ES2344957T3 - Modelos de ratones con envejecimiento prematuro destinados a la definicion del papel del daño del adn derivado del envejecimiento e intervencion en una patologia relacionada con el envejecimiento. - Google Patents

Abstract

Un método para la selección de un compuesto, o una mezcla de compuestos, comprendiendo dicho método los pasos de: - proporcionar un ratón alterado genéticamente, donde dicho ratón tiene al menos una mutación en un gen que codifica una proteína de la ruta de Reparación de Escisión de Nucleótido (NER), provocando dicha mutación un fenotipo de envejecimiento prematuro en comparación con un ratón que carece de dicha mutación; - exponer dicho ratón alterado genéticamente, o una parte derivada de este, a un compuesto, o a una mezcla de compuestos; - determinar el efecto del compuesto, o la mezcla de compuestos, en el fenotipo de envejecimiento prematuro de dicho ratón alterado genéticamente; y - seleccionar el compuesto, o la mezcla de compuestos, que evita, inhibe, retrasa o reduce dicho fenotipo de envejecimiento prematuro en dicho ratón alterado genéticamente, donde dicha mutación es en un gen seleccionado del grupo consistente en: Xpa, Xpb, Xpc, Xpd, Xpe, Xpf, Xpg, Xpv, Csa, Csb, Ttda, HR23A, HR23B y Ercc1, y donde dicho fenotipo de envejecimiento prematuro es un lapso de vida acortado, osteoporosis incrementada y/o degeneración incrementada de la retina en comparación con un ratón que carece de dicha mutación.

Description

Modelos de ratones con envejecimiento prematuro destinados a la definición del papel del daño del ADN derivado del envejecimiento e intervención en una patología relacionada con el envejecimiento.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del envejecimiento, en particular a la relación entre envejecimiento y mantenimiento del genoma (GM); inducción y respuesta al daño del ADN. Más específicamente la invención se refiere al envejecimiento y a los sistemas de reparación/respuesta al daño del ADN, que tienen efectos significativos en la supervivencia de la célula y en la resistencia celular a las genotoxinas.

La presente invención se refiere a un método de identificación y descubrimiento de compuestos capaces de inhibir, prevenir, retrasar o reducir trastornos del mantenimiento del genoma y sus consecuencias. En particular éste proporciona un método de identificación de compuestos que inhiben, reducen o eviten síntomas y condiciones relacionados con el envejecimiento en mamíferos, tales como aquellos provocados por trastornos al mantenimiento del genoma o aquellos provocados por procesos normales, naturales de envejecimiento durante el lapso de vida normal de un mamífero. La presente invención proporciona estrategias de intervención en trastornos de mantenimiento del genoma y proporciona métodos para la identificación, dirigidos al descubrimiento de nuevos tratamientos para síntomas relacionados con el envejecimiento. Estos síntomas relacionados con el envejecimiento a tratar con estos compuestos pueden ser síntomas relacionados con el envejecimiento provocado por deficiencias y trastornos genéticos, en particular deficiencias genéticas en los NER/TCR/XLR/DSBR, pero también pueden ser síntomas relacionados con el envejecimiento y enfermedades observadas en el envejecimiento normal. En particular la invención proporciona un método para el desarrollo y uso de modelos de ratón deficientes en mantenimiento del genoma y que exhiben fenotipos de envejecimiento prematuro, los cuales son particularmente apropiados para el examen de compuestos, sustancias y composiciones que prevengan, inhiban, reduzcan o retrasen un parámetro relacionado con el envejecimiento o varios parámetros relacionados con el envejecimiento y/o fenotipos en mamíferos.

Antecedentes de la invención

El envejecimiento puede definirse como el deterioro progresivo de células, tejidos, órganos y un cuerpo mamífero, asociado con el aumento de la edad de un organismo. Las teorías evolutivas del envejecimiento se basan en la observación de que la eficacia de la selección natural disminuye con la edad. Esto se debe a que, aún sin envejecer, los individuos morirán de causas ambientales, tales como la depredación, la enfermedad y los accidentes. El proceso de envejecimiento funcionaría para eliminar individuos deteriorados y envejecidos, para evitar que estos compitan con su progenie con respecto a los recursos. El envejecimiento se piensa por tanto que evolucionó como el resultado de la optimización de la idoneidad desde temprano en la vida.

La acumulación progresiva de daño con efectos posteriores en la vida es ampliamente entendido como una causa principal de los síntomas relacionados con el envejecimiento, aunque también se han planteado muchas otras teorías, tales como la inducción hormonal del envejecimiento. La idoneidad de un organismo que envejece y la longevidad de una especie parecen estar al menos parcialmente determinadas por el equilibrio del daño causado intrínseca y ambientalmente a las biomoléculas celulares por una parte y a la actividad de los sistemas de mantenimiento y de resistencia al estrés por otra. La naturaleza de cuales biomoléculas son el(os) objetivo(s) principal(es): lípidos, membranas,
organelas (tales como la mitocondria), proteínas, ARN o ADN o una combinación sigue siendo materia de debate.

Hay cuatro sistemas principales de modelos para estudiar la genética del envejecimiento; el brote de levadura Saccharomyces cerevisiae, el nemátodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, y de mayor importancia el ratón Mus musculus como un modelo mamífero. Estos modelos han sido ampliamente utilizados para evaluar teorías con respecto a los mecanismos de envejecimiento.

El examen de variantes comunes de genes o de factores ambientales, tales como por ejemplo insumo de alimentos, debido a su influencia en la mortalidad humana y en la enfermedad, ha contribuido al entendimiento del envejecimiento al nivel celular. La búsqueda de rutas genéticas y el desarrollo de modelos animales, que influyen en el envejecimiento y en las enfermedades relacionadas con el envejecimiento o fenotipos, y que permiten el estudio en detalle del proceso de envejecimiento, progresan rápidamente debido a los últimos descubrimientos en genética y genómica.

La investigación de enfermedades humanas poco frecuentes como los síndromes progeroides segmentados que exhiben algunas características de envejecimiento prematuro y/o acelerado, han llevado al descubrimiento de algunos de los mecanismos genéticos subyacentes de envejecimiento (acelerado, segmentado). Esto ha permitido el desarrollo de modelos animales específicos, tales como ratones modificados genéticamente, para estudiar los fenómenos asociados al envejecimiento. Más particularmente, esto ha llevado al desarrollo de modelos animales tales como modelos de ratones genéticamente modificados deficientes en sistemas de mantenimiento del genoma, que exhiben fenotipos de envejecimiento segmentado acelerado o mejorado (Boer J, et al., Science. 2002 Mayo 17; 296(5571): 1276-9, de Waard H, et al., Mol Cell Biol. 2004 Sep; 24(18):7941-8., reseñado en Hasty P, Campisi J, Hoeijmakers J, van Steeg H, Vijg J., Science. 2003 Feb 28; 299(5611):1355-9).

Los modelos animales deficientes en mantenimiento del genoma y que exhiben fenotipos segmentados de envejecimiento acelerado y/o mejorado, y el uso de tales modelos animales para estudiar el envejecimiento han confrontado amplio escepticismo por parte de la comunidad científica. Existe un debate permanente (Hasty P, Vijg J., Ageing Cell 2004 vol 3, pp 55-65 y Hasty P., Vijg J., Ageing Cell 2004 vol 3 pp. 67-69) con respecto a, y en que medida, los modelos animales que exhiben características de envejecimiento acelerado proporcionan un modelo útil con respecto al proceso de envejecimiento normal. Muchos científicos y expertos en el tema sostienen que tales modelos animales simplemente exhiben los efectos de una alteración, en particular mutaciones que afectan los sistemas de mantenimiento del genoma. En su opinión, la mayoría de estos efectos fenotípicos cuando más, simplemente se asemejan a síntomas de envejecimiento natural y a deterioro del desarrollo en el peor de los casos, y tienen poca relevancia con respecto al envejecimiento normal (Miller R.A., Ageing Cell 2004 vol 3, pp 47-51, Miller R. A. Ageing Cell 2004 vol 3, pp 52-53, Miller RA. Science. 2005 Oct; 310(5747):441-3).

Aunque se han discutido muchos usos potenciales de estos modelos animales en la literatura antes mencionada, la gran dificultad concerniente a la validez de estos modelos animales se mantiene como un problema ampliamente reconocido en la técnica, siendo la técnica el campo del envejecimiento y la investigación del envejecimiento.

La presente invención proporciona un método para la identificación y descubrimiento de compuestos capaces de inhibir, prevenir, retrasar o reducir trastornos en el mantenimiento del genoma y las consecuencias de éstos. La invención explora modelos animales que contienen deficiencias en sus sistemas de mantenimiento del genoma y exhiben fenotipos de envejecimiento prematuros, mejorados, acelerados o segmentados. La presente invención muestra por primera vez que el uso de estos modelos animales que exhiben características dramáticamente aceleradas, prematuras y/o mejoradas de fenotipos de envejecimiento es de hecho válido y puede aplicarse de manera ventajosa para identificar compuestos y por tanto desarrollar esquemas de intervención para tratar, retrasar, inhibir, prevenir o curar síntomas relacionados con la edad. Los ejemplos aquí mostrados ilustran el método y proporcionan evidencia clara de que tales compuestos pueden identificarse positivamente utilizando el método de identificación según la presente invención. La presente invención proporciona por tanto una herramienta nueva y poderosa para identificar y descubrir compuestos capaces de contrarrestar síntomas relacionados con el envejecimiento que comprenden compuestos profilácticos y/o terapéuticamente activos.

El método de identificación de compuestos según la presente invención tiene varias ventajas con respecto a métodos similares conocidos en la técnica, las cuales comprenden el uso de animales que no están alterados genéticamente y no exhiben un fenotipo de envejecimiento mejorado, acelerado y/o prematuro.

En primer lugar, la presente invención proporciona métodos de identificación que son más eficientes, ya que se requiere mucho menos tiempo antes de que el animal muestre síntomas de envejecimiento o características que pueden estar influidas por los compuestos a identificar. Algunos modelos animales muestran síntomas relacionados con el envejecimiento aún en el útero, tal como se ilustra en los ejemplos de la presente invención, mientras que los ratones normales exhiben tales síntomas relacionados con el envejecimiento solo después de año y medio, y hasta dos o más años.

En segundo lugar, el método según la presente invención posibilita la identificación de compuestos que tienen un efecto sobre fenotipos específicos que son mucho más pronunciados en un animal genéticamente modificado en comparación con animales naturales, donde solo una pequeña fracción de animales mostrará un síntoma relacionado con la edad, y solo después de dos años o más. Particularmente, el método puede utilizarse para identificar la influencia de compuestos específicos sobre el fenotipo específico al nivel de órganos individuales y tejidos. Por tanto, el método según la presente invención puede ser aplicado de manera ventajosa para identificar compuestos y desarrollar estrategias de intervención para síntomas o enfermedades particulares relacionadas con el envejecimiento.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones generales

"Gen" o "secuencia codificadora" se refiere a una región del ADN o ARN (la región trascrita) la cual "codifica" una proteína particular. Se trascribe una secuencia codificadora (ADN) y se traduce (ARN) a un polipéptido cuando se coloca bajo el control de una región regulatoria apropiada, tal como un promotor. Un gen puede ser una secuencia genómica que comprende intrones no codificadores y exones codificadores, o puede ser una secuencia complementaria de ADN (ADNc). Un gen puede comprender varios fragmentos operables vinculados, tales como un promotor, secuencias reguladoras de trascripción, una secuencia líder 5', una secuencia de codificación y una secuencia 3' no traducida, que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen quimérico o recombinante es un gen que no se encuentra normalmente en la naturaleza, tal como un gen en el cual por ejemplo el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o la totalidad de la región del ADN trascrito. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el cual un gen se trascribe a un ARN y/o traduce a una proteína activa.

Tal como se utiliza aquí, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la trascripción de uno o más genes, situados en sentido ascendente respecto a la dirección de trascripción del sitio de inicio de trascripción del gen, y se identifica estructuralmente mediante la presencia de un sitio de enlace para polimerasa ARN dependiente del ADN, sitios de inicio de trascripción y cualesquiera otras secuencias de ADN, incluyendo pero no limitadas a sitios de enlace de factor de trascripción, sitios de enlace de proteína represores y activadores, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas por parte de los especialistas en la técnica para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de trascripción desde el promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos bajo condiciones muy fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o desde el punto del desarrollo. Un promotor de "tejido específico" está activo solo en tipos específicos de tejidos o células.

Tal como se utiliza aquí, el término "vinculado operacionalmente" se refiere a dos o más elementos de secuencia de ácido nucleico o aminoácido que están vinculados físicamente de tal manera que estén en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor esta vinculado operacionalmente a una secuencia de codificación si el promotor es capaz de iniciar o en su defecto de controlar/regular la trascripción y/o expresión de una secuencia de codificación, en cuyo caso la secuencia de codificación debe entenderse que está "bajo el control del" promotor. Generalmente, cuando dos secuencias de ácido nucleico se vinculan operacionalmente, estarán en la misma orientación y usualmente también en el mismo marco de lectura. También estarán usualmente esencialmente contiguas, aunque esto puede que no se requiera.

"Alimentación de genes" o "transferencia de genes" se refiere a métodos para la introducción segura de ADN recombinante o foráneo en células hospederas. El ADN transferido puede mantenerse no integrado o preferiblemente se integra al genoma de la célula hospedera. La alimentación de genes puede realizarse por ejemplo mediante transducción, utilizando vectores virales, o mediante la transformación de células, utilizando métodos conocidos, tales como electroporación, bombardeo de células y similares. Adicionalmente, los genes pueden alimentarse directamente (y en una manera de tejido específico) al ratón vivo, por ejemplo mediante vectores virales o mediante el uso de vehículos liposomales (Current protocols in molecular biology, Ausubel et al. Wiley Interscience, 2004).

"Vector" se refiere generalmente a constructos de ácido nucleico apropiados para clonación y expresión de secuencias de nucleótidos. El término vector pueden también referirse a vehículos de transporte que comprenden al vector, tales como virus, viriones o liposomas, los cuales son capaces de transferir el vector dentro y entre las células hospederas.

Un "transgen" se define aquí como un gen que ha sido introducido por primera vez dentro de una célula, i.e. reintroducción de un gen endógeno, un gen mutado, un gen inactivado o un gen que no ocurre normalmente en la célula. El transgen puede comprender secuencias que son nativas a la célula, secuencias que no ocurren en la naturaleza en la célula y puede comprender combinaciones de ambos. Un transgen puede contener secuencias que codifican para una o más proteínas que pueden estar vinculadas operacionalmente a secuencias reguladoras apropiadas para la expresión de las secuencias de codificación en la célula. Preferiblemente, el transgen se integra dentro del genoma de la célula hospedera, en una forma aleatoria o se integra en un locus específico mediante recombinación homóloga. La alimentación puede ocurrir in vitro (células ocito/ES) o in vivo (ratón vivo) vía métodos conocidos en la técnica.

"Sujetos" significa cualquier miembro de la clase mamíferos, incluyendo sin límite a humanos, primates no humanos, animales de granja, animales domésticos y animales de laboratorio.

El término "identidad sustancial" significa que dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos, cuando se alinean óptimamente, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando parámetros preestablecidos, comparten al menos el80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia o más (e. g., 99 por ciento de identidad de secuencia). El GAP utiliza el algoritmo global de alineación Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias a lo largo de su longitud total, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de espacios vacíos. Generalmente, se utilizan los parámetros GAP preestablecidos, con una penalización de creación de espacio vacío = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y penalización de extensión de espacio vacío = 3 (nucleótidos)/2 (proteínas). Para los nucleótidos la matriz de puntaje preestablecida utilizada es nwsgapdna y para las proteínas la matriz de puntaje preestablecida es Blosum62/Henikoff & Henikoff, 1992).

El término "comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las partes declaradas, pasos o componentes, pero no excluye la presencia de una o más partes adicionales, pasos o componentes. Una secuencia de ácido nucleico que comprende la región X, puede por tanto comprender regiones adicionales, i.e. la región X puede estar enclavada en una región mayor de ácido nucleico.

El término "sustancia" comprende compuestos y composiciones que comprenden dos o más compuestos.

B. Descripción detallada de la invención

Los sistemas de mantenimiento del genoma abarcan reparación de escisión de nucleótido (NER; incluyendo NER global del genoma global (GG-NER) y NER de trascripción acoplada (TC-NER), reparación de trascripción acoplada (TCR), reparación de diferenciación asociada (DAR), reparación de escisión de base (BER), así como reparación de ruptura de hebra doble (DSBR) y reparación de rutas de ADN de vínculo cruzado (XLR) y sistemas de tolerancia y señalización (DT&S) asociados al daño del ADN y a las proteínas aquí involucradas. A los efectos de brevedad esta área se designará aquí como GM (mantenimiento de genoma).

La presente invención proporciona un nuevo uso de modelos animales genéticamente modificados (así como tejidos, células cultivadas y sistemas libres de células derivadas de estos) para evaluar fenotipos relacionados con el envejecimiento. Los modelos animales comprenden mutaciones en los sistemas GM especificados anteriormente. Varios de estos "animales GM" imitan cercanamente síndromes GM humanos y los animales exhiben una multitud de síntomas resultantes de un mantenimiento defectuoso del ADN e involucran signos múltiples de envejecimiento prematuro incluyendo osteoporosis, cifosis, caquexia, aparición temprana de infertilidad, degeneración neuro-hemato y muscular acelerada, fallo renal y hepática, involución del timo, cambios hormonales relacionados con la edad, como se indicó anteriormente y demostrado en los ejemplos en esta especificación. Los paralelos con el envejecimiento normal también son aparentes a partir de la impresionante similitud de amplios perfiles de expresión de genoma de diversos mutantes progeroides de ratón y animales normalmente envejecidos (ver ejemplo 9). La presente invención proporciona un método para la selección de compuestos o mezclas capaces de inhibir, retrasar, prevenir o curar fenotipos de envejecimiento prematuro en mamíferos. A la vez el método brinda también -además de la caracterización del propio proceso de envejecimiento- la identificación de compuestos o mezclas (tales como medicamentos o agentes químicos conocidos/desconocidos) que mejoran el proceso de envejecimiento. En un aspecto adicional de la presente invención el uso de estos animales GM (y las células derivadas de estos) tiene como objetivo la identificación de compuestos que mejoren las condiciones de órganos y tejidos con propósito de transplantes para evitar o reducir daño de reperfusión de oxígeno. En otro aspecto de la presente invención el método se aplica a la optimización del uso de agentes quimioterapéuticos que inducen daño del ADN y de esta manera mejoran el envejecimiento. En otro aspecto el método de la presente invención abarca el uso de los modelos animales GM (y las células de estos) para evaluar compuestos cosméticos y tratamientos en el contexto del envejecimiento. En otro aspecto aún de la presente invención el método comprende el uso de modelos animales GM con envejecimiento acelerado para transplante de células madre para uso de renovación de órganos. En un aspecto final de la presente invención, los métodos y modelos animales GM descritos aquí se utilizan para la derivación de signaturas relacionadas con el envejecimiento al nivel de expresión de gen o proteína, por ejemplo en biochips, y/o al nivel de SNPs, y/o al nivel de metabolitos (metabolómica), los cuales son indicativos en caso de estatus de envejecimiento del órgano específico o tejido y el efecto de (mezclas de) compuestos y aplicaciones con respecto al estatus de envejecimiento. Algunos de los compuestos/aplicaciones anteriormente señalados proporcionarán tratamientos noveles y terapias para condiciones relacionadas con el envejecimiento, más en particular condiciones relacionadas con el envejecimiento prematuro provocadas por sistemas GM defectuosos, así como síntomas de envejecimiento natural en animales y en humanos. La presente invención abarca particularmente el uso de la capacidad de descendientes de mutantes GM específicos (combinaciones de estos) para superar el estrés del nacimiento, su desarrollo pre y postnatal temprano (comportamiento peso/talla), aparición de osteoporosis, cifosis y lapso de vida más allá de un período de tres semanas como lectura rápida confiable con respecto al envejecimiento en general, incluyendo osteoporosis, envejecimiento de los sistemas neuronales, musculares y hematopoyéticos, disfunción renal, hepática y de otros órganos, cambios hormonales asociados con la edad, caquexia, aparición de infertilidad. Por tanto este modelo rápido, válido permite la identificación eficiente, confiable y rápida de compuestos/tratamientos que influyen en patologías específicas y generales del envejecimiento, relacionadas con el envejecimiento, quimioterapia y transplante de órgano/tejido y células madre.

El ADN está expuesto continuamente a una miríada de agentes dañinos ambientales y producidos de manera endógena, incluyendo (pero no limitados a) metabolitos oxidantes, radiación ionizante y ultravioleta (UV) y numerosas toxinas químicas naturales o fabricadas. El daño resultante del ADN puede comprometer procesos celulares esenciales tales como trascripción y replicación, o puede causar mutaciones que pueden desencadenar carcinogénesis o (en el caso de células de gérmenes) trastornos innatos. Adicionalmente, el daño del ADN puede provocar interrupción del ciclo celular de manera permanente o transitoria, senescencia celular (replicativa) o muerte de la célula (directamente o mediante desencadenamiento de apoptosis) y contribuyendo por tanto al envejecimiento.

Para evitar estas consecuencias desastrosas, todos los organismos están equipados con una red sofisticada de mecanismos complementarios y parcialmente solapados de reparación del ADN teniendo que ver cada uno de ellos con una clase específica de lesiones del ADN. Esta red de sistemas de mantenimiento del genoma altamente entretejidos es esencial para mantener sus genomas intactos. Para una reseña con respecto a los sistemas de reparación y respuesta de daños del ADN descritos más adelante ver Hoeijmakers, Genome maintenance mechanisms for preventing cancer, Nature 2001, May 17:411(6835):366-74.

La reparación de la escisión de base (BER) elimina tipos de daño más sutiles tales como un número de lesiones oxidantes en el ADN. Un número de glicosilasas del ADN, cada una con un espectro estrecho de lesiones que se reconoce inician una incisión de múltiples pasos, reacción de escisión de la lesión que involucra la síntesis de reparación de parches cortos o largos.

El daño del ADN puede comprender también rupturas de la hebra sencilla o aún la hebra doble (e.g. inducida por rayos X o gamma o radiación ionizante), las cuales se reparan mediante recombinación homóloga o unión de terminales no homólogas, los dos tipos principales de Reparación de Ruptura de Hebra Doble (DSBR). Otro sistema de reparación que está estrechamente relacionado con la recombinación homóloga pero es pobremente entendido elimina los vínculos cruzados entre hebras muy tóxicos inducidos naturalmente como subproducto de peroxidación lípida (malondialdehído) o intencionalmente mediante agentes quimioterapéuticos tales como cis-Platino. Este proceso se denomina reparación de vínculo cruzado, referida aquí como XLR.

Un sistema de mantenimiento de genoma bien conocido y bien estudiado es la ruta de reparación de escisión de nucleótido (NER) altamente conservada que requiere la acción concertada de al menos 25 proteínas para reconocer y eliminar el daño en una compleja reacción "corte y pega". NER es una de las rutas más versátiles de reparación de ADN ya que elimina una gran variedad de lesiones que distorsionan las hélices del ADN, referidas en lo adelante como "lesiones NER clásicas" incluyendo heridas mayores inducidas por UV y aductores químicos voluminosos, en adición a algunas formas de daño oxidante. NER está compuesto por dos subrutas, NER de genoma global (GG-NER) y NER de trascripción acoplada (TC-NER); el último funciona específicamente para eliminar daño a partir de la hebra trascrita de genes activos permitiendo de esta manera la recuperación de la síntesis del ARN y la supervivencia celular. La reacción TC-NER es desencadenada ante el atasco de una polimerasa alargada de ARN en una lesión del ADN, con reclutamiento del núcleo de la maquinaria NER luego de la remoción o desplazamiento de la polimerasa bloqueada. Es más, existe evidencia de que un número de lesiones que son sustratos típicos de la ruta de reparación de la escisión de base (BER), y que causa un bloqueo de la maquinaria de trascripción, también se reparan en una forma de trascripción acoplada. Nos referiremos a TC-NER para la reparación de trascripción acoplada de lesiones tipo NER y a TCR cuando se signifique reparación de trascripción acoplada de todos los tipos de daños del ADN de bloqueo a la trascripción. Hay un aumento de la evidencia con respecto a que las células no replicantes (i.e. células terminalmente diferenciadas tales como las neuronas)atenúan la reparación del genoma global, pero mantienen un mecanismo para preservar la hebra no trascrita (NTS) de genes activos, que sirve como la plantilla para TCR, libre de lesiones vía una reparación asociada a la diferenciación designada mediante mecanismo (DAR) de reparación (Nouspikel T, Hanawalt PC (2002) DNA repair in terminally differentiated cells. DNA Repair Jan 22; 1(1):59-75).

Es importante enfatizar que un gran número de componentes GG-NER y TC-NER tales como TFIH (compuesto de 10 subunidades de proteínas), XPG, CSB y CSA son a la vez factores clave para el TCR. Adicionalmente, el complejo de la multi subunidad TFIH es un factor esencial en la iniciación de trascripción de todos los genes estructurales trascritos mediante la polimerasa II de ARN así como los genes rARN, trascritos por polimerasa I ARN. Es más, al menos uno de los complejos de proteínas GG-NER y TC-NER, ERCC1/XPF está implicado simultáneamente en la reparación de los vínculos cruzados interhebra muy tóxicos (XLR) y en algunas formas de reparación de recombinación (DSBR). Adicionalmente, se ha reportado evidencia de la participación del factor XPG del NER/TCP que está también involucrado en BER. Esta multifuncionalidad extensiva implica que los mecanismos GM correspondientes están fuertemente entretejidos y deben ser considerados en estrecha relación entre sí. Consecuentemente, las mutaciones en los diferentes factores NER antes descritos ya sea en pacientes, ratones transgénicos o mutaciones somáticas adquiridas en células individuales tienen efectos principales no solo en el contexto NER estricto sino también tienen importantes implicaciones con respecto a muchos otros sistemas GM que se extienden dentro de BER, DSBR, XLR, iniciación de trascripción y alargamiento y -con ello-, en rutas principales DT&S (tolerancia y señalización del daño del ADN). Afectando por tanto a componentes NER con mutaciones tales como XPB, XPD, XPG, CSB, CSA y ERCC1/XPF como
es el sujeto en esta aplicación de patente, a la vez tiene efectos considerables con respecto a muchos mecanismos GM.

Cuando la reparación falla, las células pueden abortar su capacidad de proliferación ejecutando un bloqueo permanente del ciclo celular denominado senescencia, (Campisi, J. (2001) Trends Cell Biol 11:S27-31) o apoptosis (Bernstein, C, H. et al., 2002, Mutat. Res. 511:145-78). Las células perdidas vía la apoptosis u otras formas de muerte de la célula necesitan ser reemplazadas por progenitoras para evitar la pérdida de funcionamiento del órgano. Es más, aún cuando se compense suficientemente una alta proporción apoptósica mediante nuevas células, el organismo puede sufrir el efecto de la apoptosis, en forma de niveles elevados de apoptosis y de regeneración de tejidos que pueden llevar al agotamiento del compartimiento de la célula madre específica. Como tales, tanto la apoptosis como la senescencia se espera que finalmente quebranten la homeostasis del tejido, y por tanto la función del tejido. El deterioro de la función finalmente alcanza un umbral en el cual aparecen síntomas (e. g. dolor en articulaciones, pérdida de funciones sensoriales, osteoporosis, fallo de órganos, degeneración mental). La mayor parte de las teorías sobre envejecimiento coinciden en que tales cambios se deben a la acumulación de una diversidad de biomoléculas celulares dañadas (lípidos, proteínas, ácidos nucleicos) y organelas (e. g. mitocondria). Algunas teorías incluyen el aumento de daño no reparado del ADN entre otros en células de tejidos y órganos. El escenario para el mecanismo principal del envejecimiento fuertemente apoyado por los hallazgos de investigaciones del Instituto de Genética apunta específicamente a la acumulación de daño del ADN como la fuente principal de envejecimiento. Este escenario involucra daño del ADN que conduce al bloqueo a la trascripción y replicación, pérdida de potencial metabólico y replicativo de células individuales, inducción de senescencia y muerte celular o inducción de mutaciones y aberraciones cromosómicas. Lo último puede desencadenar la aparición de cáncer. Lo primero al final culminará en enfermedades relacionadas con el envejecimiento, fundamentalmente debido a fallas de órganos/tejidos y declinación funcional general incluyendo reducción de la resistencia a la tensión (reseñado por Hasty, et al., 2003, Science 299:1355-9 y Mitchell, J. R., J. H. Hoeijmakers, y L. J. Niedernhofer, 2003, Curr Opin Cell Biol 15:232-40).

En este escenario son relevantes dos factores clave para el proceso de envejecimiento: primeramente factores que influyen en la inducción de daño del ADN, principalmente -pero no exclusivamente- de origen endógeno (incluyendo radicales libres, decaimiento químico del ADN, pero también sistemas limpiadores que evitan inducción de lesiones) y en segundo lugar la maquinaria de mantenimiento de genoma (GM) que intenta contrarrestar los efectos de daño del ADN.

Una fuente importante de daño del ADN son los radicales libres o especies reactivas al oxígeno (ROS), las cuales son moléculas químicamente altamente reactivas producidas como subproductos del metabolismo celular y por tanto afectan los tejidos corporales, los cuales están activos metabólicamente. El nivel de formación de radicales depende no solo del grado de actividad metabólica sino también de los parámetros de funcionamiento mitocondrial y de la cadena respiratoria. La magnitud del problema es evidente a partir del hecho de que ya han sido descritas más de 100 tipos diferentes de lesiones oxidantes del ADN, que van desde modificaciones base hasta varios tipos de ruptura de ADN de hebra sencilla y doble y de vínculos cruzados interhebras (J.H. Hoeijmakers, Nature, 2001 supra). Adicionalmente, ciertos enlaces químicos en el ADN pueden sufrir hidrólisis espontánea, conduciendo a sitios abásicos. E. g. exposición a toxinas, infecciones, el hábito de fumar y la elevada asimilación de grasas saturadas en la dieta que aumentan la producción y daño por efecto de radicales libres y esto acelera el proceso de envejecimiento. En contraste, la restricción de insumo calórico disminuirá la producción de radicales libres y se asocia con un incremento en el lapso de vida en una amplia gama de organismos, incluyendo mamíferos.

Un componente final importante en la defensa contra la inducción de daño del ADN es el elaborado sistema de limpieza, incluyendo limpiadores enzimáticos tales como superóxido de dismutasa (SOD), glutatión-S-strasferasa (GST) y glutatión sintetasa (GSS), limpiadores de bajo MW así como limpiadores naturales o artificiales en e. g. alimentos. En términos del escenario de envejecimiento antes descrito todos los factores antes mencionados incluyendo el espectro de sistemas GM constituyen objetivos relevantes para la intervención en particular para mejorar enfermedades y limitaciones relacionadas con el envejecimiento. El vínculo del envejecimiento con la maquinaria de mantenimiento del genoma ha sido resaltado por una serie de síndromes humanos que todavía se están extendiendo y en particular la generación de modelos animales con rutas comprometidas de mantenimiento del genoma (modelos GM, sujetos de esta solicitud).

Los estudios de síndromes de reparación de escisión de nucleótidos en humanos han proporcionado las primeras indicaciones de que los sistemas GM, más específicamente los sistemas de reparación del ADN, son no solo imprescindibles para evitar mutaciones y reordenamientos cromosómicos impidiendo por tanto el cáncer, sino que también pueden estar involucrados en la prevención de al menos algunos fenotipos y condiciones relacionadas con el envejecimiento contrarrestando la acumulación de daño del ADN, asegurando la trascripción y replicación sin afectación ni impedimento. Son conocidos varios síndromes progeroides humanos que exhiben una aparición acelerada de múltiples fenotipos y características de envejecimiento. Muchos de estos son provocados por mutaciones que afectan a los sistemas de reparación del ADN y al metabolismo del ADN (i.e. trascripción de ARN desde la plantilla de ADN y replicación correcta de ADN); referidos de conjunto como mantenimiento del genoma. A medida que los pacientes exhiben una temprana aparición de un subconjunto, pero no todas las características del envejecimiento normal, estos trastornos se consideran síntomas progeroides "segmentados". La existencia de una posible correlación entre el mantenimiento del genoma y el envejecimiento y la enfermedad relacionada con el envejecimiento se enfatiza aún más por el hallazgo de que muchos (si no la mayoría) de otros síndromes progeroides conocidos son provocados por mutaciones en genes involucrados en el metabolismo del ADN. Los ejemplos están entre otros síndromes tales como el síndrome de Werner (WS), la ataxia telangiectasia (AT) y el síndrome de progeria Hutchinson-Gliford (HGPS). El WS es provocado por un defecto en la helicasa del gen WRN RecQ. El AT es provocado por un defecto en el proceso de reconocimiento/señalización de daño del ADN mediante mutaciones en el gen ATM, mientras que el HGPS se debe a mutaciones de punto específico en una lámina nuclear que juega un papel en la organización de la cromatina.

Son conocidos desde hace mucho tres síndromes humanos de sensibilidad UV pero más recientemente han sido asociados explícitamente a algunas características distintivas del envejecimiento prematuro, xeroderma pigmentosum (XP), síndrome Cockayne (CS) y tricotiodistrofia (TTD). Estos tres síndromes son trastornos NER (para una reseña, ver Bootsma et al, 2001). La identificación de estas deficiencias genéticas conllevó al descubrimiento de genes y productos de genes involucrados en NER.

La Xeroderma pigmentosum (XP) es una enfermedad multigénica, multialélica autosomal recesiva que ocurre a una frecuencia de alrededor de 1:250,00 (EE. UU.) pero con una frecuencia más elevada en Japón y en áreas mediterráneas. Los individuos con XP pueden clasificarse en al menos siete grupos de escisión deficiente de complementación (XP-A a XP-G) en adición a un grupo denominado variante XP en el cual ocurre un defecto en el bypass replicante de lesiones específicas UV mediante una polimerasa especial de translesión (tolerancia del ADN al daño). Los aspectos sobresalientes de la lesión son, hipersensibilidad UV (sol), y hasta un incremento en mil veces en cáncer de piel inducido por UV-B (carcinomas celulares basales y escamosos y melanomas), así como un foto-envejecimiento acelerado de la piel y en algunos pacientes neurodegeración. Los heterocigotos aparecen generalmente no afectados.

Los genes afectados en XP se designan como XPA, APB, XPC, XPD, APE, XPF y XPG. Los genes XPC y XPE codifican proteínas de reconocimiento de la lesión que operan en todo el genoma, mientras que el producto del gen XPA se piensa que verifica la lesión en una etapa posterior de la reacción NER. Las proteínas XBP y XPD son componentes de la helicasa del complejo del factor de trascripción basal TFIIH, el cual está involucrado en la apertura de la doble hélice de ADN para ambas la iniciación basal y la activada de la trascripción del ARN de polimerasa I y II y con el objeto de procesos de reparación del ADN antes de la incisión de la hebra dañada mediante el complejo ERCC1-XPF, una endonucleasa de estructura específica 5' que funciona en múltiples rutas de reparación del ADN (Niedernhofer et al, EMBO Journal, 2001) y XPG una endonucleasa complementaria de estructura específica que hace una incisión 3' a fotoproductos del ADN Tian et al, Mol Cell Biol. 2004 Mar: 24(6):2237-42).

El síndrome de Cockayne (CS) es una enfermedad autosomática, recesiva caracterizada por enanismo caquéctico, retinopatía, microcefalia, sordera, defectos neurales y retraso en el crecimiento y del desarrollo después del nacimiento. El término promedio de vida de pacientes CS reportados en la literatura se limita a 12 años indicando la severidad del trastorno. La causa de muerte es frecuentemente una infección oportunista relacionada con el deterioro físico general, debido a problemas de alimentación y déficit inmunológico. Los pacientes tienen una apariencia facial típica con ojos hundidos, nariz afilada y mandíbula protuberante. Los pacientes CS son sensibles al sol pero increíblemente no se reporta que desarrollen cánceres, excluyendo esta enfermedad del XP. El CS clásico comprende dos grupos de complementación, CS-A y CS-B, el último el más común, y es provocado por mutaciones en el gen CSA o CSB. Las células con deficiencia de CSA y CSB son específicamente defectuosas en la ruta TC-NER (NER de trascripción acoplada), mientras que la ruta del genoma global NER (GG-NER) se mantiene funcional. Aunque en el CS solo se afecta una subruta del NER, los pacientes CS tienen un fenotipo más complejo que los pacientes XP-A, los cuales carecen totalmente de ambas subrutas de NER. Las proteínas CSA y CSB afectadas en CS son ambas componentes de complejos asociadas con el ARN polimerasa II o indirectamente desencadenados por el ARN polimerasa II, y su papel se piensa que radica en asistir a la polimerasa en el enfrentamiento a los bloques de trascripción de daño inducido del ADN. Por tanto, el defecto en estos pacientes no se limita a TC-NER sino que se extiende a TCR en general. Interesantemente, las mutaciones en XPB, XPD o XPD pueden provocar una combinación XP y CS (Bootsma, 2001). Los pacientes con XPCS combinados presentan síntomas CS, y encima de eso sufren de predisposición al cáncer de piel UV. También estas proteínas no parecen estar involucradas en GG-NER y TC-NER, pero a la vez en TCR y en las helicasas TFIIH XPB y XPD están implicadas adicionalmente en la trascripción basal y activada de virtualmente todos los genes.

La Tricotiodistrofia (TTD) es un trastorno recesivo autosomático poco común caracterizado por cabello quebradizo deficiente en azufre e ictiosis. Las hebras de cabello se quiebran longitudinalmente en forma de pequeñas fibras, y esta condición quebradiza se asocia con niveles de cisteína/cistina en las proteínas del cabello que son de un 15 a un 50% con relación a las de individuos normales. El cabello tiene una ondulación característica de "cola de tigre" visible bajo la luz polarizada. Los pacientes con frecuencia tienen una apariencia facial inusual, con orejas protuberantes y un mentón recesivo. Las capacidades mentales oscilan de normales bajas a retraso severo. Pueden reconocerse diversas categorías de la enfermedad sobre la base de respuesta celular a daño UV y al gen afectado. Los casos severos tienen baja actividad NER y mutaciones en los genes XPB, XPD o TTDA. Este último gen ha sido clonado recientemente y codifica un polipéptido 76 kD muy pequeño que es importante en las funciones de reparación de TFIIH y que estabiliza el complejo de 10 subunidades (Giglia-Mari et al, Nature Genetics, 2004). Los pacientes TTD no exhiben incidencia incrementada de cáncer de piel. Los ratones correspondientes con noqueo de entrada con una mutación de punto TTD en el gen Xpd exhiben cáncer de piel moderadamente incrementado ante exposición UV, sin embargo puede reducirse el cáncer espontáneo, consistente con el síndrome humano (de Boer et al, Cancer Res. 1998). El XPB es parte del núcleo de TFIIH y tiene un papel central en trascripción, mientras que el XPD conecta el núcleo al subcomplejo CAK, y puede tolerar muchas mutaciones diferentes. Las diferencias sutiles en los efectos de estas mutaciones individuales con respecto a las muchas actividades del TFIIH (GG-NER, TC-NER, TCR e iniciación de trascripción) y con respecto a su estabilidad determinan los resultados clínicos, que pueden ser XP, TTD, XP con CS y XP con TTD.

Un síndrome progeroide novel adicional muy poco común que involucra un complejo NER fue descubierto recientemente por el equipo del solicitante. Esta condición autosómica recesiva, provisionalmente designada como síndrome XPF/ERCC1 (XFE), ha sido observada en dos casos, los cuales exhiben paralelos sorprendentes con los modelos de ratón previamente establecidos. Un caso se debe a una mutación severa en el gen XPF, que provoca un envejecimiento acelerado multi sistémico desde la edad de aproximadamente 10 años involucrando síntomas de desarrollo, dermatológicos, hematológicos, hepáticos, renales y neurológicos severos que conllevaron a muerte temprana a los 16 años de edad. El otro caso se debió a una severa mutación en el gen ERCC1, que causó fallo multi sistémica y muerte alrededor del primer año de vida. Este síndrome y el correspondiente mutante de ratón Ercc1 tienen varias características distintivas con respecto a los síndromes NER/TCR antes mencionados. Estos surgen posiblemente de la participación adicional de la endonucleasa ERCC1/XPF en XLR y en partes de las rutas DSBR. Esto de nuevo enfatiza la fuerte naturaleza entretejida de los diversos mecanismos GM y su enlace con el envejecimiento (acelerado).

Una revisión de los genes involucrados en NER y los cuales se mutan en humanos se muestra en la tabla I a continuación. Una lista amplia y frecuentemente actualizada de más de 360 mutaciones XP, TTD y CS en humanos pueden encontrarse en www.xpmutations.org. El ratón con su lapso de vida relativamente corto, fácil accesibilidad genética y cercana relación genética y fisiológica con humanos, puede proporcionar una herramienta apropiada para modelar fenotipos de envejecimiento acelerado y prematuro. Un número de modelos de ratones con defectos provocados en mantenimiento de genoma (ratones GM) eliminando por noqueo genes NER (Weeda et al, van der Horst et al., DNA Repair 2002) o mediante la introducción de mutaciones que imitan (cercanamente) a las mutaciones XP, CS, XPCS o TTD en genes relacionados con NER se han generado y parcialmente caracterizado, incluyendo aquellos de los autores de la presente invención. Por ejemplo van der Short et al, Cell, 1997, de Boer et al, Cancer Research 1999, Niedernhofer et al., EMBO Journal 2001, de Boer et al., Science 2002, todos proporcionan modelos de ratón con defectos NER, algunos de los cuales exhiben un fenotipo que comprende contraste de envejecimiento acelerado o prematuro. Para una reseña ver Hoeijmakers, Nature 2001, Hasty et al, Science 2003, Hasty and Vijg, Aging Cell, 2004.

La amplia gama de mutaciones en pacientes XP, CS y TTD provoca diferentes genotipos, con características específicas y una severidad variable del trastorno. La investigación reciente en humanos deficientes en NER/TCR/XLR y modelos de ratón NER/TCR/XLR/DSBR por parte de los inventores presentes ha conllevado a la observación de que las mutaciones en genes GM que afectan fundamentalmente a los sistemas de reparación global del genoma (tales como GG-NER, VER) llevan a grosso modo a un fenotipo proclive al cáncer. De otra parte, las mutaciones en genes GM que afectan específicamente los TCR u otros sistemas (de reparación) que promueven la supervivencia celular del daño del ADN, tales como el procesamiento de reparación y daño de los vínculos cruzados interhebras y rupturas de doble hebra muy citotóxicos dan surgimiento principalmente a un fenotipo de envejecimiento prematuro y mejorado. Estos últimos sistemas XLR, DSBR, DT&S son particularmente relevantes para células proliferantes.

La presente invención se basa en este concepto y vincula por tanto el envejecimiento con cualquier ruta relevante con respecto a muerte celular o senescencia celular mediante daño inducido del ADN. Adicionalmente pretende explotar la diferencia sorprendente en el efecto biológico de GG-NER/VER y las otras deficiencias GM tales como TCR/XLR/DSBR y DT&S para explorar la naturaleza del proceso de envejecimiento y medios para influir en ello al interferir mediante la inducción o procesamiento de daño del ADN.

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TABLA 1

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Realizaciones de la invención

Las mutaciones en los genes que afectan al genoma global NER primariamente conducen a fenotipos proclives al cáncer, mientras que las mutaciones que afectan específicamente a la reparación de trascripción acoplada (TCR) y -como parte de esta invención- todos los otros mecanismos relevantes a los efectos de la protección del genoma para evitar muerte celular por daño inducido del ADN o paralización del ciclo de la célula (mecanismos GM tales como los antes definidos) dan cabida primariamente a fenotipos de envejecimiento prematuro y mejorado. Es más, tales fenotipos de envejecimiento prematuro y mejorado relacionados con TCR pueden impulsarse aún más vía un defecto adicional en GG-NER, como es evidente a partir del fenotipo de modelos de ratones de doble mutación en los cuales el defecto TCR se combina con un defecto Xpa o Xpc. La presente invención busca desarrollar y explorar nuevos modelos animales con deficiencias TCR/XLR/DSBR/DT&S con o sin mutaciones adicionales en los genes Xpa u otros genes GM, que resultan en un mantenimiento inadecuado del genoma, y un aumento en la muerte de la célula o senescencia replicativa que dan lugar a fenotipo de envejecimiento segmentado, prematuro, acelerado y mejorado.

La presente invención se refiere a un método para identificar y descubrir compuestos o mezclas de compuestos capaces de evitar, retrasar, inhibir o curar trastornos GM, más específicamente los trastornos intervinculados NER/TCR/XLR/DSBR. En particular proporciona un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos capaces de inhibir, prevenir, retrasar o reducir en alguna medida los síntomas NER/TCR/XLR/DSBR y otros trastornos GM, en particular síntomas y condiciones relacionadas con el envejecimiento en mamíferos producidas por tales trastornos. Adicionalmente, en virtud de los hallazgos de investigaciones presentados en esta solicitud proporciona un método para identificar (mezclas de) compuestos que inhiban, eviten, retrasen, o reduzcan en alguna medida los síntomas relacionados con el envejecimiento y patologías en mamíferos con envejecimiento normal. Mediante la aplicación o administración de estos compuestos así seleccionados la presente invención también proporciona estrategias de intervención terapéutica para los síntomas de envejecimiento o condiciones relacionadas con el envejecimiento, en trastornos o enfermedades GM, así como en el envejecimiento natural. La intervención terapéutica puede comprender la administración del compuesto o compuestos seleccionados como una composición farmacéutica, nutricional o cosmética.

El método de identificación de compuestos según la presente invención está dirigido al descubrimiento y utilización de a) nuevos compuestos o composiciones o b) nuevos usos de compuestos conocidos y composiciones, como nuevos tratamientos para aliviar defectos o aberraciones ligeras en GM (tales como variantes polimórficas, con deficiencias sutiles) y síntomas relacionados con la edad. El tratamiento comprende la prevención, reducción, ralentización o progresión y/o aparición de síntomas relacionados con el envejecimiento. Los síntomas relacionados con el envejecimiento a ser tratados con estos compuestos seleccionados o de nueva identificación pueden ser síntomas relacionados con el envejecimiento provocados por defectos genéticos poco frecuentes y trastornos o por variantes naturales de ocurrencia frecuente en los sistemas GM, tales como preferiblemente pero no limitadas a NER/TCR/XLR/DSBR/DT&S, pero pueden también ser síntomas y enfermedades relacionadas con el envejecimiento observadas durante el envejecimiento normal en un sujeto. Por tanto los compuestos o composiciones identificados y/o seleccionados mediante el método de identificación de la presente invención proporcionarán nuevos tratamientos y terapias tanto para condiciones relacionadas con el envejecimiento prematuro como normal en animales y en humanos.

En otro aspecto la presente invención proporciona métodos para desarrollar modelos animales, preferiblemente modelos de ratón, que contienen una o más mutaciones en genes que afectan la capacidad GM y, en particular combinados de TCR con otros sistemas GM, así como células derivadas de éstos. Preferiblemente, pueden utilizarse los mutantes GG-NER y TCR, o los mutantes dobles o aún triples que muestran un fenotipo de envejecimiento prematuro, el cual es particularmente apropiado para el método de identificación de compuestos y/o sustancias o composiciones según la presente invención, que evitarán, inhibirán, retrasarán o reducirán un parámetro relacionado con el envejecimiento en el modelo animal. Más preferiblemente, tales modelos animales exhiben patología de envejecimiento de tejidos específicos a través de la desactivación de sistemas GM en uno solo o en un número limitado de tejidos u órganos incluyendo, pero no limitados a piel, huesos, cerebro o retina. Los mamíferos mutantes GM pueden ser heterocigóticos y preferiblemente homocigóticos para las mutaciones en los sistemas respectivos.

En una primera realización la presente invención proporciona un método para determinar el efecto de una sustancia, la cual puede ser un solo compuesto y/o composiciones que comprenden dos o más compuestos, con respecto a niveles de daño del ADN y mantenimiento del genoma en un mamífero, comprendiendo el método los pasos de exposición de un mamífero no humano (o células aisladas de éste) al compuesto(s), donde el mamífero exhibe al menos una mutación que provoca una deficiencia en los sistemas intervinculados NER y/o TCR/XLR/DSBR, o que dicha mutación afecta al mantenimiento del genoma provocando una acumulación acelerada de daño del ADN y/o niveles incrementados de estado estable de daño del ADN, determinando el efecto de la sustancia(s), compuesto(s) o composiciones con respecto al mantenimiento del genoma y niveles de daño del ADN.

Preferiblemente el efecto del (mezcla de) compuesto(s) con respecto al nivel de daño del ADN y mantenimiento del genoma se determina o mide por su efecto cualitativo y cuantitativo sobre los parámetros relacionados con el envejecimiento en el mamífero. Los parámetros relacionados con el envejecimiento pueden estudiarse en un mamífero que exhibe envejecimiento normal. Preferiblemente, el parámetro relacionado con el envejecimiento se estudia en un mamífero NER y/o TCR/XLR/DSBR deficiente que exhiba un fenotipo de envejecimiento (segmentado) prematuro, mejorado o acelerado.

El mamífero que exhibe un fenotipo de envejecimiento prematuro y mejorado contendrá al menos uno, pero puede preferiblemente contener dos o más mutaciones o alteraciones en genes GM y puede ser heterocigótico pero preferiblemente homocigótico para la mutación, o alternativamente puede ser heterocigótico compuesto para uno, dos o más genes relacionados con GM. Las mutaciones en genes relacionados con NER pueden provocar deficiencias ligeras o severas en los sistemas GM preferiblemente NER del genoma global y/o reparación de trascripción acoplada o una combinación de ambas.

El método para identificación de (mezclas de) compuesto(s) que evitan, inhiben, retrasan o reducen el envejecimiento en un mamífero pueden estudiarse en el mamífero vivo in vivo o post mortem o utilizando (partes de) explantadas de órganos/tejidos, o sistemas de células derivados de éstos. Por tanto los efectos de los (mezcla de) compuestos con respecto a los niveles de daño del ADN, al mantenimiento del genoma o al envejecimiento puede estudiarse también con partes derivadas del animal examinado. Las partes pueden ser órganos recolectados, tejidos, biopsias, fluidos corporales tales como sangre, suero, orina, heces, células aisladas, explantes de tejidos o células cultivas in Vitro o material biológico, tal como proteína aislada, metabolitos, muestras de ARN o ADN de células cultivadas o biopsias o fluidos corporales y metabolitos de estos.

El mamífero que exhibe una mutación que provoca una deficiencia en los sistemas GM del mamífero (como se especificó anteriormente) a ser utilizado por el método de identificación según la presente invención, contiene preferiblemente una mutación que afecta la capacidad de reparación de la escisión del nucleótido del mamífero, preferiblemente del genoma global NER. Más preferiblemente la mutación provoca una deficiencia en la capacidad de reparación de trascripción acoplada (TCR) del mamífero. De mayor preferencia la mutación provoca una deficiencia en la reparación de trascripción acoplada o reparación de la ruptura de hebra de vínculo cruzado/doble y hace que el animal exhiba un fenotipo con características de envejecimiento acelerado, mejorado y/o prematuro. Es también un aspecto de la presente invención el uso de mamíferos (y partes de las células de estos) que tengan combinaciones de mutaciones en los sistemas GM o mutaciones que provoquen inhibiciones simultáneas de los sistemas de reparación de ADN, por ejemplo mutaciones que afectan tanto al GG-NER como a la capacidad TCR. Es más, pueden utilizarse mamíferos que comprendan combinaciones de 2, 3 o 4 mutaciones, que pueden ser homocigóticos, heterocigóticos o alelos mutantes heterocigóticos de genes relacionados con GM, que afectan a iguales o diferentes sistemas GM. Más preferiblemente, la combinación de mutaciones provoca un fenotipo de envejecimiento mejorado, prematuro o acelerado en el mamífero.

Las mutaciones que afectan el mantenimiento del sistema GM y más específicamente la capacidad de reparación de daño del ADN en el mamífero que son utilizadas para identificar compuestos que inhiban, retrasen o eviten acumulación de daño del ADN y/o síntomas de envejecimiento, se seleccionan preferiblemente entre un grupo de genes que codifican proteínas estructurales o enzimas involucradas en el proceso NER así como ICL y DSRBR y otras rutas GM relevantes. Más preferiblemente la mutación es en al menos uno o más genes del siguiente grupo de genes: Xpa, Xpb, Xpc, Xpd, Xpf, Xpg, Csa, Csb, Ttda, HR23a, HR23B, Ercc1, Ku70, Ku70 y DNa-PKcs.

Las mutaciones en genes involucrados en NER, TCR, XLR, DSBR o DT/S, combinaciones de estos o GM comprenden sustituciones, eliminaciones, inversiones, inserciones, alelos sensibles a la temperatura, alelos de empalme, alelos dominante negativos, alelos de sobre o baja expresión o inserción de codones de detención (alelos mutiladores). Las mutaciones pueden ser de alelos nulos, o mutaciones sutiles que afectan solo parcialmente la función del producto del gen o que pueden ser alelos dominantes negativos que interfieren o bloquean la función de la proteína de tipo natural que también está presente en una célula. Las estrategias de interferencia del ARN (ARNi), incluyendo el uso de micro ARNs que ocurren de manera natural, pueden utilizarse también para inactivar sistémicamente, localmente o parcialmente genes involucrados en sistemas GM. En aún otras realizaciones, pueden utilizarse combinaciones de mutaciones y antecedentes genéticos, por ejemplo el uso de mutantes condicionales, animales heterocigóticos compuestos o animales quiméricos consistentes en diferentes linajes de células donde al menos un linaje de célula es deficiente o alterado y/o mutado en un sistema GM, pueden utilizarse ventajosamente en el método de identificación según la presente invención.

Las combinaciones preferidas de NER y o mutaciones TCR para uso en la presente invención son mutaciones de desactivación de Xpa y Xpd, donde los alelos Xpd pueden ser homocigóticos para XP, XPCS, TTD, TTD-XP o COFS (síndrome cerebro óculo facio esquelatal) produciendo alelos, o heterocigotos compuestos para estos alelos así como diferentes mutantes en los genes Ercc1/Xpf NER/XLR/DSBR.

Otras combinaciones preferidas son mutaciones de desactivación Xpa y Xpb, Xpa y Csb, Xpc y Csb, Xpa y Csa, Xpc y Csa, Xpb y Xpd. Cada una de estas combinaciones preferidas de mutaciones en los genes de los NER y/o TCR exhibe un fenotipo diferente, que comprende diferentes aspectos de envejecimiento y característicos de patologías de envejecimiento segmentado o relacionado con el envejecimiento con un tiempo diferente de aparición y/o severidad, y pueden utilizarse para identificar compuestos que afectan estas condiciones o trastornos. Son particularmente preferidas aquellas mutaciones y combinaciones de mutaciones que producen fenotipos de envejecimiento prematuro dramáticamente acelerado presentes y que pueden ser registradas in utero, en o alrededor del nacimiento, o 1, 2, o 3 meses después del nacimiento del animal. En vista de la naturaleza multifuncional de las proteínas involucradas, su participación simultánea en múltiples rutas y los estrechos vínculos con otros sistemas GM es importante enfatizar que el alcance de la presente invención no se limita a las combinaciones anteriores.

El uso de mamíferos (preferiblemente ratones) mutantes con uno y preferiblemente dos o más defectos en los sistemas de mantenimiento del genoma, frecuentemente (en la mayoría de los casos donde se estudió hasta ahora por parte de los inventores una combinación de dos mutaciones) exhiben al menos algunas características de envejecimiento prematuro en menos de tres meses después del nacimiento. Estos modelos son muy apropiados para la identificación de compuestos que influyen en el ritmo de envejecimiento, con el objetivo de transplantes de células madres y órganos/tejidos y para delinear biomarcadores de envejecimiento a partir de ARN, proteínas y metabolitos.

Las mutaciones de desactivación pueden ser cualquier mutación que interfiera con la expresión de una proteína funcional, tal como pero no limitada a la introducción de supresiones parciales o totales, inserciones, cambios de marco y codones de detención. La introducción de la inhibición de mutación de la expresión o traslación correcta de una proteína funcional es bien conocida en la técnica, por ejemplo en (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004). Preferiblemente las mutaciones se introducen mediante técnicas de recombinación homóloga conocidas por la técnica.

También es un aspecto de la invención el uso de animales mutantes condicionales para el método de identificación, donde (uno o más de) la alteración(s) genética se limita a un tejido u órgano específico o en el cual el defecto pueda introducirse en una etapa de desarrollo posterior del mamífero, ya sea de manera sistémica o en una forma restringida de tejido. Los mutantes condicionales pueden generarse por ejemplo con los sistemas Cre/Lox o FLP/FRT conocidos en la técnica (Ejemplo 5) y pueden comprender la introducción de mutaciones de genes involucrados en los sistemas NER, TCR o GM en una forma de tejido específico, dependiendo de donde se exprese la recombinasa, localmente (Ejemplo 6) o sistémicamente por ejemplo utilizando el sistema de fusión de Receptor de Estrógeno/tamoxifeno, en el cual Cre (u otra) recombinasa se expresa constitutivamente, pero solo puede importarse en el núcleo (y por tanto solo puede cortar o en su defecto desactivar el alelo condicional) mediante tratamiento con este análogo de estrógeno. Alternativamente, puede utilizarse el ADNc expresado a partir de un promotor TetON o TetOff (en un contexto de noqueo de ese mismo gen) que permite la trascripción en la presencia/ausencia de doxiciclina. Los animales transgénicos de tejido específico pueden ser utilizados para sobre expresar alelos mutados de GM restringidos a tejidos específicos, o que expresen por ejemplo alelos dominantes negativos o moléculas ARNi de desactivación (tecnología de noqueo), restringidos por ejemplo a órganos o tejidos específicos, preferiblemente pero no limitados al hígado, riñón, piel, cerebro, retina o al compartimiento linfoide.

El uso de mamíferos (y partes o células de estos) que exhiben una mutación en los genes Xpb, Xpd o Ttda es particularmente preferido, donde la mutación es idéntica o con imitación muy cercana al alelo que provoca Tricotiodistrofia en humanos. Se proporciona en la tabla 1 de esta solicitud una lista no limitante de mutaciones que provocan TTD en humanos. De las mutaciones que provocan TTD, son particularmente preferidas aquellas mutaciones o combinaciones de mutaciones que provocan un fenotipo de envejecimiento prematuro, mejorado y/o acelerado, tales como, pero no limitadas a Xpd^{RT722W/RT22W}. Los ejemplos de otras mutaciones preferidas asociadas a TTD en el gen humano XPD y que provocan el fenotipo de envejecimiento mejorado/acelerado son: G47R, R112H, D234N, C259Y, S541R, Y542C, R601L, R658C, R658H, D673G, R683W, R683Q, G713R, A725P, Q726 ter, K751Q (Cleaver et al., (1999) Human Mutation 14:9-22; Mn et al., 2001, J Am Acad Dermatol 44:891-920). Los ejemplos de mutaciones asociadas a TTD en el gen XPB humano incluyen T119P (Itin et al., 2001, J Am Acad Dermatol 44:891-920). Aquellas en el gen humano TTDA, MIT, L21P, R57ter, han sido determinadas por el equipo del solicitante (Giglia-Mari G et al., Nat Genet. 2004 Jul: 36(7):714-9.).

En otra realización preferida de la invención, se utilizan mamíferos que exhiben una mutación en los genes Csa, Csb, Xpb, Xpd y Xpg, donde la mutación es idéntica o imita cercanamente a un alelo humano que provoca el Síndrome Cockayne (CS) o la combinación de Síndrome de Cockayne y Xeroderma Pigmentosum (XPCS) o una condición muy severa relacionada descubierta recientemente denominada síndrome cerebro óculo facio esquelético (COFS). Una lista no limitante de XP, CS, XPCS y COFS que provocan mutaciones en humanos se proporciona en la tabla 1 de esta solicitud. De los CS que provocan mutaciones NER, son particularmente preferidas aquellas mutaciones o combinaciones de mutaciones que provocan un fenotipo de envejecimiento prematuro, mejorado y/o acelerado, tales como pero no limitadas a: Csa^{nulo/nulo}, Csb^{G744ter/G744ter} (imitando al alelo a CS1AN). Otras mutaciones preferidas asociadas al Síndrome Cockayne en el gen humano Csb son: Q184ter (terminación de mutaciones de traslación; introducción de un codón de detención y/o mutación de cambio de marco), R453ter, W517ter, R670W, R735ter, W851R, Q854ter, R947ter, P1042L, P1095R, P1213G. Una mutación preferida en el gen humano Csa para las realizaciones de la presente invención es la Y322ter. De las mutaciones que provocan XPCS, son preferidas particularmente aquellas mutaciones que provocan un fenotipo de envejecimiento prematuro, mejorado y/o acelerado, tales como pero no limitadas a Xpd^{G602D/G602D}, Xpb^{FS740/FS740}. Otras mutaciones asociadas preferidas para las realizaciones de la presente invención son (i) para el gen humano Xpb: F99S; (ii) para el gen humano Xpd: G675R, 669fs708ter; (iii) para el gen humano Xpg: R263ter, 659ter (Cleaver et al, (1999) Human Mutation 14:9-22 y www.xpmutations.org).

En una realización muy preferida de la presente invención, los mamíferos que exhiben una mutación que provoca TTD, CS, COF y/o XPCS en los genes antes mencionados también contienen una mutación en el gen Xpa u otro
gen(es) que afectan al NER del genoma global. Son particularmente preferidas aquellas combinaciones de mutaciones que provocan un incremento en la severidad y/o disminución en la edad de instalación de los fenotipos de envejecimiento prematuro, mejorado y/o acelerado tal como se observa en los modelos de ratón CS, XPCS, COFS o TTd, tales como, pero no limitados a: Csa^{nulo/nulo}/Xpa^{nulo/nulo}, Csa^{nulo/nulo}/Xpc^{nulo/nulo}, Csb^{G744ter/G744ter/}Xpa^{nulo/nulo}, Csb^{674ter/G744ter/}Xpc^{nulo/nulo}, Xpd^{G602D/G602D}/Xpa^{nulo/nulo}, Xpd^{R722w/R722W}/Xpa^{nulo/nulo}, Xpd^{G602D/R722W/}Xpa^{nulo/nulo}, o cualquier otra mutación en estos genes GM que produzca el fenotipo especificado anteriormente. Esto incluye también mutantes simples y múltiples en los cuales uno de los genes se hace condicionado como se describió anteriormente para inducción específica de tejido o de etapa de desarrollo de fenotipos de envejecimiento (el ejemplo 7 demuestra un mutante Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{condicionado/nulo}).

El mamífero que exhibe una mutación que afecta el NER u otras rutas de reparación del ADN y de los sistemas de mantenimiento del genoma la cual preferiblemente afecta también el envejecimiento del mamífero, y que se utiliza en el método de identificación para compuestos según la presente invención, es preferiblemente un roedor, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias, cerdos y es de mayor preferencia un ratón.

El método de identificación de compuestos según la presente invención, que utiliza mamíferos que exhiben un defecto en los NER, TCR y otros sistemas de reparación del ADN y del GM que provocan una acumulación acelerada de daño del ADN y preferiblemente un fenotipo de envejecimiento prematuro, mejorado y acelerado, puede utilizarse para identificar compuestos y composiciones que sean capaces de inhibir, prevenir o retrasar dicho fenotipo. El efecto del compuesto(s) a identificar puede determinarse cualitativamente y cuantitativamente mediante un número de lecturas fenotípicas en el mamífero in vivo o in Vitro. Las lecturas fenotípicas tal como se definen aquí pueden ser un parámetro cualitativo o cuantitativo relacionado con el envejecimiento que identifica una condición o trastorno relacionado con el envejecimiento. Las lecturas fenotípicas del método de identificación según la presente invención pueden realizarse en el propio animal, tales como su comportamiento y/o desempeño en exámenes. Otras lecturas fenotípicas puede realizarse en o con respecto a sus órganos, biopsias de tejido, células, o en muestras de proteínas, ADN o ARN derivadas del mamífero o en su explantes de tejido cultivados in Vitro, células o extractos libres de células y subsecuentemente utilizados para examen o análisis. Las lecturas preferidas sobre los mamíferos expuestos a compuestos o composiciones a identificar con respecto a su efecto sobre los niveles de daño del ADN y/o a síntomas relacionados con el envejecimiento son parámetros tales como, pero no limitados a, lapso de vida, supervivencia al estrés perinatal (como se ilustra en el ejemplo 4), muerte juvenil, cifosis, peso corporal, porcentaje de grasas (como se determina mediante la relación tejido graso vs. peso corporal total), caquexia, pérdida de cabello, encanecimiento, disfunción neuronal y sensorial (pérdida de vista, oído, olfato, habilidades de aprendizaje y memoria), temblores, convulsiones, ataxia, comportamiento sexual, fertilidad, función muscular coordinación (extremidades), función cardiaca, parámetros hormonales, inmunológicos o hematológicos, acortamiento de telómeros, osteoesclerosis, degeneración de retina, pérdida de células fotorreceptoras, función hepática, función renal, involución del tiempo, pérdida de células de Purkinje, anemia, disfunción inmune (incluyendo enfermedad autoinmune), disfunción cardiovascular, diabetes, patrones de expresión de genes, niveles de expresión de ARN, niveles de expresión de proteínas, niveles de metabolitos y hormonas. Las lecturas fenotípicas en el método de identificación según la presente invención pueden registrarse como diferencias estadísticamente significativas (a valores p<0,05, 0,02, 0, 0,01 o 0,001) entre individuos o grupos comparables y mutantes de ratones de tipo natural que no exhiban la mutación o mutaciones en un sistema de mantenimiento GM. Para el registro de parámetros en las lecturas fenotípicas antes mencionadas, pueden utilizarse métodos conocidos en el arte, los cuales serán obvios para el experto en la técnica.

A nivel del órgano o tejido, los parámetros preferidos relacionados con el envejecimiento a utilizar son la osteoporosis (como se ilustra en el ejemplo 8), degeneración de la retina y pérdida de fotorreceptores (como se demuestra en el ejemplo 3), desgaste linfoide (en bazo o timo), involución del timo, pérdida de grasa hipodérmica, dilatación tubular renal, deposición de lipofuscina en el hígado, glomerulopatía hialina en el riñón, inclusiones intranucleares hepáticas, atrofia de la piel, anemia, neoplasias y tumores. Estos parámetros se proporcionan solamente a modo de ilustración y no limitan las lecturas potenciales de mantenimiento del genoma y del envejecimiento en el método de identificación según la presente invención.

En otra realización de la presente invención, las lecturas preferidas en el método de identificación de compuestos están al nivel celular y molecular, en realizaciones más preferidas están los análisis de expresión de genes en muestras de ARN (trascriptómica), análisis de expresión de proteínas de muestras de proteína (proteómica) y acumulación de daño del ADN y análisis de lesión en muestras genómicas de ADN. Otra realización preferida comprende los parámetros relacionados con el envejecimiento a ser determinados vía metabolómica, í. e. medición de efectos de compuestos en el método según la presente invención en metabolitos y rutas metabólicas en el mamífero examinado. Las muestras de ARN, ADN y muestras de proteínas de mamíferos o células cultivadas, tratadas y no tratadas con compuestos o composiciones en el método de identificación según la presente invención pueden compararse, inter alia, con mamíferos o células relativamente más jóvenes o de mayor edad, para evaluar el efecto en los niveles de daño del ADN y a los procesos de envejecimiento que tienen los compuestos sobre el mamífero o células derivadas de éste. Las diferencias en patrones de expresión de genes pueden determinarse mediante biochips de ADN hechas a la medida o disponibles comercialmente, hibridizadas con muestras de ARN o ADNc obtenidas de mamíferos utilizados para experimentación (trascriptómica, ilustrada más adelante en los ejemplos 1 y 2). Las diferencias en los niveles de expresión de proteínas pueden determinarse utilizando anticuerpos; en experimentos inmunes de precipitación, técnicas de inmunomarcado 1D o 2D, (micro) chips de proteínas y otras técnicas proteómicas o técnicas metabolómicas. El efecto de compuestos en el mantenimiento del genoma en el método de identificación según la presente invención puede determinarse también directamente en la acumulación de daño del ADN en el ADN genómico directamente. Los análisis de ADN pueden comprender secuenciación, análisis de mutación del ADN, especialmente detección de sitios calientes de mutación. El daño del ADN puede por ejemplo determinarse mediante los métodos de H. Poulsen para medir daño oxidante del ADN (Riss, B., L. Risom, S. Loft, y H.E. Poulsen. 2202, DNA Repair 1:419-24).

Se han descrito más de 100 modificaciones diferentes mediadas de radicales libres en el ADN. Sin embargo, el parámetro más preferido de daño del ADN y al mantenimiento del genoma es una sola modificación, la 8-hidroxilación de guanina (8oxoG), la cual es uno de los tipos más abundantes de daño oxidante de base del ADN. Una metodología que utiliza una sodiomiodida basada en extracción de ADN, digestión enzimática de ADN y análisis con espectrometría de masas seriada de cromatografía líquida (LC-MSMS) es una lectura preferida a aplicar en el método de identificación de compuestos según la presente invención. La misma proporciona alta sensibilidad e indicaciones de verdaderos valores de 8-oxodG en ADN genómico en respuesta a tratamiento de mamíferos con compuestos según el método de la presente invención.

Otra técnica preferida para la rápida y eficiente identificación de mutación y acumulación de año del ADN en el método de la presente invención es el modelo de ratón reportero lacZ como se describe en Vijg, J. et al., Mech Ageing Dev. 1997 Dec; 98(3):189-202 u otras variantes de este método. Este método permite el estudio de acumulación de mutación en el ADN de células somáticas y tejidos durante el envejecimiento in vivo en modelos animales utilizados con respecto al método de identificación de compuestos según la presente invención. El modelo de ratón reportereolacZ alberga vectores plásmidos, que contienen el gen reportero lacZ, preferiblemente integrado de pies a cabeza en varias locaciones cromosómicas. Se han desarrollado procedimientos para recuperar eficientemente los plásmidos en células hospederas E. coli. Un sistema de selección positiva, que permite que solo las células de E. coli con plásmido lacZ mutado puedan crecer, permite la determinación precisa de frecuencias de mutación como la proporción de colonias mutantes versus el número total de transformantes, i.e. el número total de copias de plásmido recuperadas. Los resultados obtenidos de un estudio de lapso de vida de ratones portadores de plásmido con clústeres de vectores en el cromosoma 3 y 4 indicaron acumulación de mutación relacionada con la edad en células del animal, por ejemplo células del hígado. El efecto de compuestos a identificar según el método de la presente invención puede determinarse eficientemente utilizando este ensayo con respecto al hígado (u otro tipo de células) de ratones tratados (y no tratados para la comparación) con compuestos ensayados en el método de identificación según la presente invención.

Un método aún más preferido es el uso de genes reporteros en los modelos antes mencionados de envejecimiento prematuro de ratones. Tales genes reporteros están compuestos por un promotor, el nivel de expresión del cual se ha mostrado que incrementa con el envejecimiento y correlacionarlo con la aparición y severidad de patologías relacionadas con la edad, acoplado con genes reporteros bioluminiscentes (e. g. luciferasa) o fluorescente (e. g. proteína fluorescente verde), permitiendo la identificación no invasiva longitudinal del envejecimiento y de patologías relacionadas con el envejecimiento en el ratón vivo así como la identificación del efecto de interferencia de compuestos en la aparición y severidad de envejecimiento y de patologías relacionadas con el envejecimiento. Alternativamente, los genes reporteros pueden estar compuestos de un gen que codifica una proteína de la cual se enriquece el nivel de expresión con el envejecimiento (e.g. vía expresión enriquecida, estabilización incrementada o degradación reducida), en un marco fundido a una proteína bioluminiscente o fluorescente.

El método de identificación de compuestos según la presente invención puede mejorarse exponiendo adicionalmente los mamíferos a tratamientos de daño del ADN, para mejorar el poder discriminante del método. Los tratamientos de daño del ADN pueden aplicarse mediante tratamientos físicos, tales como exposición a UV, rayos X o radiación gamma, o mediante medios químicos, tales como exposición a especies reactivas de oxígeno (ROS), estrés oxidante y exposición a compuestos que dañan el ADN. Los compuestos que dañan el ADN que pueden utilizarse favorablemente comprenden, pero no se limitan a: paraquat, H_{2}O_{2}, DMBA, AAF, aflatoxina, Benzopireno, EMS, ENU, MMS; MNNG, bleomicina, illudinS, mostaza de nitrógeno, PUVA, mitomicina C, cisplatino y taxol.

Alternativamente, el método de identificación de compuestos que tengan un efecto sobre los niveles de daño del ADN y a los síntomas de envejecimiento según la presente invención y como se describió anteriormente, puede mejorarse aún más y hacerse más sensitivo y/o más versátil, introduciendo los NER, TCR, XLR, DSBR u otras rutas relacionadas con el GM que comprometen las mutaciones, en mamíferos que exhiben un antecedente genético específico. Por ejemplo pudiera utilizarse un antecedente genético que preferiblemente sea proclive a, o con sensibilidad específica a, la acumulación de daño del ADN y/o a síntomas de envejecimiento. Por ejemplo pueden utilizarse mamíferos que portan oncogenes activados o genes inactivados supresores de tumores, o por mutaciones, supresiones, o inserciones dentro del genoma, como por ejemplo en, pero no limitado a animales transgénicos o de noqueo, mutantes de ocurrencia natural, animales transgénicos ARNi con genes ARNi silenciados (supresores de tumores). Una amplia gama de genes supresores de tumores y oncogenes son bien conocidos y estudiados por la técnica. Los ejemplos de genes que puedan utilizarse favorablemente como un antecedente genético para los mamíferos a utilizar en el método de identificación de compuestos según la presente invención son, pero no se limitan a p53, p16, pl9arf, Ras, c-Myc, Rb, ciclinD, telomerasa, oncogenes virales tales como adenovirus E1A, E1B, HPV E6 o E7, SV40 T larga. Alternativamente, pueden utilizarse defectos genéticos adicionales en desintoxicación celular o rutas antioxidantes de defensa para sensibilizar los modelos de ratones de envejecimiento prematuro.

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El método de identificación de compuestos que tienen un efecto en el mantenimiento del genoma y en el envejecimiento según la presente invención, tal como se determina por el efecto de los compuestos en mamíferos con capacidad NER, TCRT, XLR, DSBR o GM comprometida, puede llevarse a cabo para identificar los efectos de compuestos o composiciones noveles, por ejemplo extractos crudos de fuentes naturales/biológicas, tales como pero no limitadas a microorganismos, plantas o animales. El método puede también utilizarse favorablemente en compuestos que se conoce tienen propiedades específicas y pueden por tanto tener un efecto sobre los niveles de daño del ADN y al envejecimiento, tales como compuestos con propiedades antioxidantes que pueden eliminar o desintoxicar los radicales libres, las especies reactivas de oxígeno o los radicales N. También los compuestos que tienen un efecto sobre la progresión de la célula, el metabolismo, la muerte de la célula o apoptosis, reparación de ADN, desintoxicación y/o función hepática, función cardiovascular y/o circulación y desempeño inmunológico pueden examinarse para probar su efecto sobre el mantenimiento del genoma y los síntomas de envejecimiento según la presente invención. Los compuestos particularmente preferidos para su uso según la presente invención para inhibir, retrasar o reducir los síntomas relacionados con la edad y para mejorar o restaurar el mantenimiento del genoma son antioxidantes y limpiadores de radicales seleccionados del grupo que comprende: catequina-\beta, N-acetil-cisteína, cisteína, \alpha-tocoferol, retinol, D-manitol, proline, N-tert-butil-a-fenilnitrona (PBN), vitamina C/ascorbato, ácido úrico/urato, albúmina, bilirrubina, vitamina E, ubiquinol, carotenoides (tales como licopeno, caroteno, astaxantin, cantaxantin) flavonoides, catequizas, 4-nitrofenol, 4-hidroxibenzoato, fenol, tirosina, 4-metilfenol, 4-metoxifenol, serotonina, \alpha-,\beta-, \gamma-, \zeta-tocoferol, hidroquinona, DOPA, 4-aminofenol, 4-demetilaminofenol, allopurinol, deferritiacina, fenantrolina, ergotioneina.

Las enzimas involucradas en actividades de limpieza antioxidantes/radicales que pueden utilizarse en los métodos según la presente invención son limpiadores enzimáticos radicales (tales como peroxidasa, superóxido de dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX), enzimas involucradas en reducción de antioxidantes (tales como: reductasa GSH, glutatión-S-transferasa, reductasa de dehidroascorbato) y proteínas celulares que ayudan al mantenimiento de un entorno de reducción (tales como ejemplo glucosa-6-fosfato dehidrogenasa) y proteínas involucradas en el secuestro de iones de metales tales como ejemplo apoferritina, transferrina, lactoferrina, ceruloplasmina y otros limpiadores pequeños de radicales. Basado en los conceptos presentados en este trabajo las deficiencias natales o adquiridas en cualquiera de estos componentes pueden también disparar un fenotipo acelerado y como tales son parte de esta solicitud. Los genes para estas proteínas son relevantes en términos de transgénesis (sobre expresión como expresión reducida) preferiblemente en combinación con los mutantes GM antes descritos.

En otra realización el método para identificar compuestos según la presente invención puede utilizarse también como un método para identificar efectos colaterales de compuestos que pueden promover el envejecimiento, y en particular de productos farmacéuticos y alimentarios.

En adición a la identificación de compuestos que influyen en el envejecimiento y en las características relacionadas con el envejecimiento, los modelos GM de ratón y las líneas de células (partes de) órganos y tejidos derivados de estos son también relevantes para un número de otros procesos relacionados con el envejecimiento y otros fenómenos. Esto incluye el uso de los ratones GM para análisis influyendo el daño de reperfusión al genoma en el contexto de transplante de órganos, particularmente para la identificación de compuestos que reduzcan el daño de reperfusión, el cual acorta el lapso de vida del órgano o tejido transplantado. En un escenario similar los modelos de ratón GM y las líneas de células (partes de) órganos y tejidos derivados de estos también son relevantes para el análisis de y la influencia en isquemias.

El uso de mutantes de reparación del ADN y de inestabilidad del genoma que exhiben fenotipos de envejecimiento acelerado según esta invención pueden utilizarse también para otras varias intervenciones, tales como transplantes y en particular transplantes de célula madre.

Dentro del mismo marco conceptual la invención se refiere al uso de ratones GM mutantes y líneas de células derivadas de estos con el propósito de reducir el efecto negativo de quimio y radioterapia de tejidos normales, o mejorar el efecto en el tumor para aumentar la ventana terapéutica en el tratamiento del cáncer. Con este propósito pueden utilizarse los mismos o diferentes compuestos similares a los listados anteriormente para evaluar el efecto sobre el envejecimiento.

De manera similar, el método también puede emplearse para la identificación de agentes y compuestos que influyen en el envejecimiento de la piel con propósitos cosméticos y cosmocéuticos.

Como otra aplicación relacionada los antes descritos modelos de ratón GM son también relevantes para el análisis y utilización de transplantes de células madre para órganos y tejidos específicos que exhiben envejecimiento acelerado.

Una aplicación final en el mismo dominio es el uso de los modelos de ratón GM y líneas de células derivadas de estos para definir huellas digitales relacionadas con el envejecimiento para expresión de gen, expresión de proteína y modificación y enlaces con polimorfismos genéticos (SNPs) y su uso en diagnóstico, prognosis y tratamiento de enfermedades relacionadas con el envejecimiento.

La presente invención y sus realizaciones se ilustran aún más y se explican mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Descripción de las figuras

Figura 1. El paciente con una progeria novel. (A) Fotografía a los tres años de edad. Era fundamentalmente asintomático hasta la edad de 10 años, con la excepción de fotosensibilidad y una ligera discapacidad de aprendizaje. (B) Fotografía del paciente a los 16 años de edad, en cuyo momento era marcadamente enano, caquéctico y tenía una apariencia envejecida, marchita.

Figura 2. Caracterización de fibroblastos primarios del paciente (XFE1RO). (A) Sensibilidad UV de peso (\blacksquare), XFE1RO (\medbullet) y fibroblastos primarios XP del paciente (XP-F, O; XP-C;

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XP-A, O). Las células se sembraron de manera esparcida sobre platos de 6 cm y después de 48 horas fueron expuestas a dosis aumentadas de UV-C (254 nm). Una semana después de la irradiación, las células se fijaron, marcaron y las colonias se contaron mediante microscopía. (B). Cuantificación de UDS para medir reparación de ADN inducida por UV. Los cultivos del paciente con fibroblastos primarios XP se expusieron a 10 J/m^{2} UV-C en presencia de ^{3}H-timidina. La síntesis del ADN inducida por UV se medió como el número de granos radioactivos por núcleo contados después de autoradiografía y se plotearon como un porcentaje del número de granos detectados en células wt (de tipo natural) (C). La recuperación de la síntesis de ARN después de radiación UV de líneas de células del paciente. La síntesis de ARN se midió mediante cintilación líquida contando la cantidad de ^{3}H-deoxiuridina incorporada dentro de las células y se ploteó como el porciento de la etiqueta incorporada en células no irradiadas. (D) Análisis de complementación. Fibroblastos XFE1RO se funden con un panel genéticamente definido de líneas de células XP del paciente (grupo de complementación A-G) utilizando virus Sendai desactivado. Después de la fusión, las células son irradiadas con UV (20 J/m^{2}) e incubadas en presencia de ^{3}H-deoxiuridina y se midió el UDS como se describió en la Figura 2B. La complementación positiva se registró cuando el nivel de UDS se restauró desde el porciento indicado en la carta al 100% o niveles wt. (E) Análisis de secuencia de XFE1RO XPF ADNc demostrando una mutación de punto en la secuencia codificadora de XPF. (F) Diagrama esquemático de la proteína XPF. Los dominios conservados se resaltan en colores: el amarillo indica motivos de helicaza no funcionales, el gris representa dominios ricos en leucina; el naranja indica secuencia putativa de localización nuclear; el azul claro indica el dominio requerido para interacción de la proteína ERCC1. La región central azul oscuro está pobremente conservada. Los cambios de codificación identificados en pacientes XP se indican con flechas. \Delta indica supresión; fs indica un cambio de marco resultante en truncado de proteína. Las mutaciones identificadas en azul no fueron confirmadas como vinculadas a enfermedad humana. La posición del cambio R^{142} en XFE1RO se indica mediante resaltado en negritas. La secuencia del segmento de proteína hXPF que contiene residuo 142 se alinea con los homólogos de ratón y hámster (Ercc4), así como homólogos de Drosophila melanogaster (mei-9), Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae (RAD1) y Schizosacharomyces pombe (RAD16). Los aminoácidos conservados se indican en negro, los cambios conservativos en verde y los residuos no conservados en rojo. La flecha vertical indica el sitio de la mutación del paciente en un residuo de arginina altamente conservado. (G) Inmunodetección de XPF en extractos de célula entera (Ices) derivados de fibroblastos del paciente (C5RO normal, paciente XP ligero XP42RO y paciente XFE1RO). Bandas de reacción cruzada demuestran carga igual de proteína (H) inmunodetección de ERCC1 en los mismos WCEs. (I) Ensayo de supervivencia clonogénica después de tratamiento de fibroblastos inmortalizados (wt\medbullet; XP-A \blacksquare; XP-F \Delta ligero y XPFE1RO X) con el agente de vínculo cruzado mitomicina C. Los fibroblastos inmortalizados con telomerasa humana se utilizaron para este ensayo, con la excepción de la línea de célula XP-A del paciente las cuales fueron fibroblastos primarios de pasaje temprano.

Figura 3. Características progeroides de ratones Ercc1^{-1}. (A). El ratón Ercc1^{-1-} comparado con un compañero de camada de wt de una semana de edad. El noqueado es bien desarrollado y es solo fraccionariamente menor que su hermano. (B) El ratón Ercc1^{-1-}.comparado con un compañero de camada wt a las tres semanas de edad. El ratón noqueado es enano y caquéctico. (C) Análisis de la pisada del ratón de tres semanas de edad. Las patas delanteras se pintaron de rosado y las traseras de verde. Los animales se liberaron hacia un túnel estrecho con un refugio oscuro al final después de tres días de pruebas de práctica. Las flechas blancas se colocan equidistantes entre las impresiones de la pata izquierda y derecho e indican la trayectoria de la marcha. El panel superior ilustra el patrón de un ratón wt. El panel inferior ilustra la marcha de un ratón Ercc1^{-1-}. Un asterisco amarillo indica los pasos en los cuales las huellas de la pata trasera no están superimpuestas sobre las huellas de la pata delantera en el ratón Ercc1^{-1-}, un criterio diagnóstico de ataxia (53). (D) Radiografías de ratones. A la izquierda hay una radiografía de un ratón wt envejecido naturalmente que demuestra cifosis severa. En el centro hay un Ercc1^{-1-} de tres semanas también con cifosis. A la derecha hay un ratón wt de igual edad que demuestra la curvatura normal vertebral a las tres semanas. (E) Inmunoblot de extractos de proteína derivados del hígado de ratones wt, Ercc1^{-1-} y heterocigóticos. El blot se sondeó con un anticuerpo que reconoce la proteína XPF de ratón. (F) Ensayo clonogénico de supervivencia para comparar respuesta de wt \blacklozenge, Ercc1^{-1-} \ding{115} y MEFs primarios Xpa ^{-1-} \blacksquare deficientes en NER al agente MMC de vínculo
cruzado.

Figura 4. Perfiles diferenciales solapados de expresión de gen entre hígado de ratón ERCC1 deficiente e hígado de ratón normalmente envejecido. (A) El ploteo esparcido que representa cada uno de los ADNc incluidos en el biochip con un círculo individual. Se Plotea la proporción entre ARN de hígado de ratón Ercc1^{-1-} y el aislado de controles de compañeros de camada wt. "M" representa la proporción del log2 (verde/rojo) y "A" es el valor de la intensidad total calculada como log2 (rojo x verde). Los genes expresados diferencialmente se calcularon utilizando Análisis Significativo de biochips (SAM) y están representados como (manchas rojas) sobreexpresados y subexpresados (manchas verdes). (B) Sumario de los genes sobre o subexepresados más significativos en hígado de ratón Ercc1^{-1-}. tal como se identifica por SAM, listados en orden de rango de cambio de expresión, derivado del experimento que utiliza ARN de hígado acumulado de múltiples animales en un antecedente genético FVB/n; C57B1/6. La astringencia se estableció tal que la lista incluye cuando más un punto de datos falso positivo. Los datos se comparan a la diferencia en veces en expresión provocada por el envejecimiento natural (última columna), n.d. indica un gen para el cual no se detectó diferencia significativa en niveles de expresión en la comparación entre hígado de ratón wt joven y
viejo.

Figura 5. Confirmación de datos de biochip mediante inmunodetección. (A) Detección de IGFBP-1 en hígado de ratón incrustado en parafina proveniente de un ratón Ercc1^{-1-} prematuramente envejecido pero no moribundo y un compañero de camada wt comparado con el hígado de un ratón de dos años de edad. (B) Ensayo TUNEL en secciones fijas de hígado de los mismos ratones. Núcleos apópticos contentivos de ADN fragmentado se detectaron mediante microscopía fluorescente. (C) Inmunoblot de extractos de proteínas derivados de hígado aislado de un ratón deficiente en ERCC1, un compañero de camada wt o un ratón wt viejo. Los genotipos se indican sobre cada carril, y la identidad y masa molecular de la proteína detectada a la derecha. La inducción en veces comparada con niveles de proteína en hígado de ratón wt joven se indica debajo de cada carril.

Figura 6. (A) Modelo para el mecanismo de envejecimiento prematuro como consecuencia de un defecto de reparación del ICL de ADN. Los ICLs de ADN se forman de manera endógena como un resultado del metabolismo normal, igualmente secundarios a peroxidación de lípido. En la ausencia de reparación de vínculo cruzado, se acumulan estos daños. Debido a su química, estas lesiones constituyen un bloqueo absoluto al metabolismo del ADN tales como replicación y trascripción. La incapacidad de replicar ADN o transcribir genes esenciales resulta en muerte de la célula. Si el tejido tiene capacidad regenerativa, tal como el hígado, entonces la muerte de la célula se compensa mediante un aumento en la proliferación subsiguiente de células mitóticamente activas. Si el ciclo del daño, citotoxicidad y proliferación persisten, o si las células proliferantes son un objetivo directo del daño del ADN, entonces la capacidad proliferante total de un tejido se reduce con el tiempo. Esto resulta en una función reducida del tejido y puede contribuir a características de envejecimiento segmentado y finalmente a muerte prematura. (B) Detección de células proliferantes utilizando \alpha-BrdU. El nucleótido sintético se inyectó a ratones 30 minutos antes de sacrificarlos y se incorporó del ADN de células replicantes. Los núcleos que contenían BrdU se detectaron mediante inmunohistoquímica y actividad de peroxidasa de rábano como se describe.

Figura 7. Perfil trascriptivo de hígados de ratón Csb^{G744ter/G744ter}/Xpd^{nulo/nulo}.

Figura 8. Verificación PCR en tiempo real de objetivos seleccionados de gen en hígados de ratón Csb^{G744ter/G744ter}/
Xpa^{nulo/nulo}, Csb^{G744ter/G744ter} y Xpa^{nulo/nulo}.

Figura 9A. Efecto de manitol en porcentaje de Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo} en recién nacidos. B. Efecto de manitol en la supervivencia en semanas después del nacimiento para cachorros Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo}.

Figura 10. Cambios espontáneos con la edad en la retina de ratones Csb^{-1-}. A) Se tomaron micrográficos en la parte central de la retina de Csb-l- de tres meses de edad (panel a), Csb-l- de 18 meses (panel b) y ratones Csb +/+ de 18 meses (panel c). Noten la pérdida de núcleos ONL y distorsión de la capa del segmento externo en los ratones Csb-l- de 18 meses. Bar 25 \mu. (B) Conteos de núcleos ONL (\pm desviación estándar) demuestran una pérdida de células fotorreceptoras en ratones Csb-l- con la edad. (ANOVA, seguido de Prueba T, P<0,05). Ratones Xpa-l- a 6,5 meses no difieren del tipo natural en número fotorreceptor. (C) Secciones de parafina de ratones de tipo natural de tres meses y Csb deficientes teñidos con un tinte nuclear (DAPI) a la izquierda y teñidos FITC para células TUNEL-positivas a la derecha. Las flechas apuntan a núcleos TUNEL-positivos en el ONL de la retina de los ratones Csb-l-.

Figura 11. Apunte al constructor condicional del ratón XPA. A) La representación esquemática de parte de la estructura genómica del gen del ratón XPA. Las partes codificadoras de exones XPA 2 a 6 se indican con cuadros abiertos. En el constructo de noqueo objetivo, exones 3 y 4 se reemplazaron con casete marcador elegible de Neomicina (NEO). En el constructor condicional objetivo, el exón 4-6 de XPA ADNc de ratón se fundió con el exón genómico 4. Al lado del ADNc, se colocó un casete marcador elegible de Higromicina (HYGRO) para la selección del constructo en células ES. Entre el exón 3 y 4 y detrás del casete HYGRO se colocaron secuencias LoxP para permitir la recombinación mediante Cre recombinasa. Detrás de la segunda secuencia LoxP, se añadieron un marcador de fusión LacZ-GFP, acompañado de un aceptador de empalme, un casete de inserción de marco de lectura múltiple (Murfi) y un sitio de entrada Interno de ribosoma (IRES). De esta manera, después de la recombinación mediante Cre recombinasa, se expresará el marcador LacZGFP, permitiendo la visualización tanto in vivo e in Vitro. Se describieron importantes sitios de restricción: R: EcoRI, RV = EcoRV. Se indicaron dos sondas; sonda exón 6 y sonda LacZ, que fueron utilizadas para realizar el genotipo. B) Análisis Southern blot de células Xpa^{-l-} es objetivo con el constructor condicional. Se realizó la digestión con EcoRI e hibridización con sonda exón 6. Esta sonda hibridizó externa al constructo objetivo con fragmento 16 kb noqueado EcoRI y un fragmento 12 kb mutante EcoRI. C) Supervivencia de wt, células ES Xpa^{-l-} y Xpa^{cl-} después de daño UV. Las células fueron expuestas a dosis aumentadas de UV-C (254 nm). Después de 7 días, el número de células proliferantes se estimó a partir de la cantidad de formación del clon. D) Análisis Southern blot de clones de células objetivo ES. La digestión se realizó con EcoRI e hibridización con sonda exón 6. Esta sonda hibridizó externa al constructo objetivo con un fragmento 16 kb WT EcoRI y un fragmento mutante 12 kb EcoRI. E) Análisis Southern blot de clones de célula ES cl+ transfectadas con Cre recombinasa. La digestión se realizó con EcoRV e hibridización con sonda LacZ. Esta sonda hibridizó con un fragmento condicional 2,4 kb EcoRV antes de la Cre recombinación y un fragmento condicional 10 kb EcoRI después de la recombinación Cre.

Figura 12. Funcionalidad y recombinación Cre del alelo condicional XPA. A) Fotografía de un ratón Xpa^{-l-}Csb^{m/m} de 8 semanas, que muestra rescate del fenotipo de envejecimiento prematuro Xpa^{-l-}Csb^{m/m} mediante introducción de un alelo condicional XPA. B) Análisis Southern blot de embrión de ADN Xpa^{+l-}, Xpa^{cl}-, Xpa^{clcr} y Xpa^{cr/cr} al día 10,5 y 13,5. La digestión se realizó con EcoRV e hibridización con sonda LacZ. Esta sonda se hibridizó con un fragmento EcoRV condicional 2,4 kb antes de Cre recombinación y un fragmento EcoRI condicional 10 kb después de Cre recombinación. El alelo condicional XPA se recombinó con CagCre, una Cre recombinasa no inducible, expresada de manera ubicua. C) Teñido LacZ Xpa^{+l}-, Xpa^{cl-}, Xpa^{c/cr} y Xpa^{cr/cr}, de embriones, día 10,5 y 13,5. D) Teñido LacZ de wt y Xpa^{crl-} MEFS. E) Supervivencia de MEFs wt y Xpa^{crl-} después de daño UV. Las células se expusieron a dosis incrementadas de UV-C (254 nm). Después de siete días, el número de células proliferantes se estimó a partir de la cantidad de clones formada.

Figura 13. Recombinación Cre de alelo condicional XPA en el ratón A) Análisis Southern blot de ADN de cola de ratón Csb^{m/m} Xpa^{+/-}, Csb^{m/m} Xpa^{c/-}, Csb^{m/m}Xpa^{cr/+} y Csbm/mXpa^{c/cr}. La digestión se realizó con EcoRV e hibridización con sonda LacZ. Esta sonda se hibridizó con un fragmento EcoRV condicional 2,4 kb antes de Cre recombinación y un fragmento EcoRI condicional 10 kb después de Cre recombinación. El alelo condicional XPA se recombinó con CagCre, no inducible, expresado de manera ubicua, con expresión en la concepción. B) Fotografía de un compañero de camada de control Csb^{m/m}Xpa^{crl-} y un Csb^{m/m} Xpa^{crl+} de 16 días. El fenotipo de este ratón Csb^{m/m}Xpa^{crl-} es igual al publicado previamente de ratón Csb^{m/m}Xpa^{-/-} lo que prueba que la recombinación total del alelo condicional XPA da surgimiento a un nocaut funcional.

Figura 14. Recombinación Cre específica de cerebro de alelo condicional XPA en un entorno Csb deficiente. A) Fotografía de un animal Csb^{m/m} Xpa^{cl-}Camkll\alpha-Cre+ a los seis meses de edad. B) Curva de peso corporal de Wt, Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ y Csb^{m/m} Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+. Más allá de los ocho meses el peso del animal Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ comienza a diferir sustancialmente de sus compañeros de camada de control, incluyendo animales Csb^{m/m}. C) Gráficos de barras mostrando la proporción la proporción de ansiedad (AR), calculada como distancia del centro dividida entre la distancia total, de animales Wt, Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ y Csb^{m/m} Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ a la edad de tres y seis meses. Un bajo AR es indicativo de comportamiento similar al ansioso. A los tres meses el AR de los animales Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ es significativamente menor que los de los grupos de control (p<0,05), lo que se hace más significativo a la edad de seis meses (p<0,001). D) Fotografías específicas de teñido LacZ en los cerebros de animales Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+ y Csb^{m/m} Xpa^{cl-}CamKll\alpha-Cre+. El teñido se encontró solo en el Septum Lateral conectado con el hipocampo y relacionado con el comportamiento ansioso.

Figura 15. Distribución de grosor en hembras envejecidas de tipo natural (A) y machos (B), las hembras TTD envejecidas (C) y machos (D) y ratones TTd de 52 semanas comparados con hembras de tipo natural de 91 semanas (E) y machos (F).

Figura 16. Parámetros óseos en el envejecimiento. Las hembras de tipo natural (triángulos cerrados), hembras TTD (triángulos abiertos), machos de tipo natural (cuadrados cerrados) y machos TTD (cuadrados abiertos). Volumen óseo (A, B), espesor cortical (C,D) y perímetro (E,F). Los ratones TTD comparados con animales de tipo natural: # p<0,05, \alm{2} p<0,01, \alm{3} p<0,001; ratones TTD y animales de tipo natural comparados en el punto de 26 semanas: *p<0,05; ** p<0,01, ***p<0,001; barras de error: SEM

Figura 17. Similitud de transcriptoma de hígado de cachorros Csb^{m/m}/Xpa^{-/-} y ratones envejecidos de manera natural. Correlación r de Pearson de ratones de 16, 96 y 130 semanas con ratones Csb^{m/m}/Xpa^{-/-} de quince días de edad.

Figura 18. Cambios fisiológicos en ratones Ercc1^{-/-} debido a defecto de reparación de ADN. (A) Niveles de suero IGF1 en ratones de 15 días wt y Ercc1^{-/-} medidos mediante inmunoensayo de enzima. (B) Detección de células proliferantes utilizando -BrdU. El nucleótido sintético se inyectó a ratones durante 30 min antes de sacrificarlos y se incorporó del ADN de células replicantes. Los núcleos contentivos de BrdU se detectaron mediante inmunohistoquímica y actividad de peroxidasa de rábano como se describe (flechas). Hay largos núcleos poliploides aparentes en los hígados de ratones Ercc1^{-/-} y ratones envejecidos (asterisco). (C) Niveles de glucosa en sangre de ratones Ercc1^{-/-} de 15 y 21 días y compañeros de camada wt. Valores promedio de 8-21 animales por grupo ploteados \pm desviación estándar. (D) Secciones de hígado congelado de ratones Ercc1^{-/-} y wt de edad indicadas teñidas con Oil Red O para detectar acumulación de triglicéridos. (E) Correlación de Pearson entre transcriptoma de hígado de ratón Ercc1^{-/-} y un compañero de camada wt comparado con el hígado de ratón de 2 años (magnificación 100x). Inmunoblot de niveles de IGFBP1 en extractos de hígado de ratones Ercc1^{-/-} de 21 días y compañeros de camada de control. (G) Medición de núcleos apópticos mediante ensayo TUNEL en secciones seriadas de las mismas muestras de hígado (magnificación 20X). (H) Correlación de Pearson entre transcriptomas de hígado de ratones Ercc1^{-/-}, Csb^{m/m} y Xpa^{-/-} y mutantes Csb^{m/m} y Xpa^{-/-}.

Sección de Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la aplicación de análisis de biochips como una lectura preferida para mantenimiento de genoma y parámetros relacionados con la edad en el método de la presente invención. Las biochips son una forma preferida de determinación del efecto de compuestos en mamíferos utilizadas en el método de identificación según la presente invención. En este ejemplo, los perfiles de expresión del ARNm de hígado se comparan entre ratones wt jóvenes (15 días) y viejos (dos años) y se comparan con los perfiles de ARNm de ratones Ercc^{nulo/nulo} (en este ejemplo referidos en lo adelante como ratones Ercc1^{-/-}) a los 15 días que exhiben un defecto combinado NER/XLR/DSBR y muestran un fenotipo pronunciado segmentado de envejecimiento prematuro que se asemeja al de pacientes con síndrome severo XPF/ERCC1 (XFE).

La XPF-ERCC1 es una endonucleasa requerida en múltiples rutas de reparación del ADN. Las mutaciones sutiles del XPF provocan el síndrome proclive a cáncer xeroderma pigmentosum. Nosotros caracterizamos un paciente con una progeria novel y descubrimos una mutación severa en XPF, demostrando que dos enfermedades diferentes pueden surgir de defectos en esta única proteína. Para ganar en claridad con respecto al mecanismo de una deficiencia en la reparación del ADN inducida por progeria y su relación con el envejecimiento natural, comparamos el perfil de expresión del gen de ratón de ratones genéticamente modificados para que fuera deficiente en XPF.ERCC1 en ratones jóvenes y viejos de tipo natural. Había un solapamiento significativo en los perfiles de ratones progeroides y envejecidos indicando procesos genotóxicos y regenerativos. Los resultados apoyan fuertemente un papel significativo de la reparación del ADN para atenuar el envejecimiento, el daño citotóxico del ADN implicado en la promoción del envejecimiento y aportar racionalidad para la pleiotropía observada entre progerias provocada por defectos en la reparación del ADN y el envejecimiento natural.

Introducción

La progeria abarca un conjunto diverso de enfermedades espontáneas o heredadas caracterizada por la aparición prematura de signos y síntomas de envejecimiento. La relación entre progerias y el envejecimiento natural no se conoce, pero es importante para el entendimiento de las causas de envejecimiento y el desarrollo de modelos prácticos para estudiar el proceso de envejecimiento. Sin embargo las progerias son a menudo segmentadas, o de tejidos específicos, haciendo insatisfactoria una comparación directa con el envejecimiento humano. Existen pocas comparaciones directas entre progeria y envejecimiento natural a nivel trascriptivo o de proteína, (1), pero la comparación de células cultivadas indica paralelos entre los dos.

Diversas progerias heredadas se vinculan a defectos en la respuesta celular al daño del ADN, incluyendo el síndrome Cockayne (CS), Werner, Rothmund Thomson, ataxia telangectasia y tricotiodistrofia (TTD) (2). Este enlace sugiere que una respuesta inapropiada al daño del ADN acelera el envejecimiento. Dos de las progerias humanas CS y TTD, son causadas por un defecto en la reparación de escisión de nucleótido (NER). NER es un mecanismo multipasos, multiproteína, responsable de la eliminación de lesiones grandes y abultadas del ADN que distorsionan la estructura helicoidal del ADN. Los sustratos NER se identifican en el genoma o mediante el complejo de proteína XPC-hHRad23B de reconocimiento de daño del ADN o durante la trascripción si el ARN Po1ll se atasca en el sitio de daño. CS y TTD son defectos provocados específicamente en el NER de trascripción acoplada (3). En contraste, los defectos en el mecanismo general NER provocan el síndrome proclive al cáncer xeroderma pigmentosum (XP). Los pacientes con XP tienen >1000 veces elevado el riesgo de desarrollar cáncer de piel en áreas de la piel expuestas al sol a menudo en la primera década de la vida (4). Sin embargo, los pacientes XP tienen un envejecimiento prematuro menos pronunciado en comparación con pacientes de igual edad con CS y TTD. Estos fenotipos contrastantes sugieren que daños idénticos del ADN (sustratos para NER) pueden contribuir al cáncer y al envejecimiento, implicando la respuesta celular a ese daño como crítica para determinar el resultado final.

La XP-ERCC1 es una de las endonucleasas de estructura específica requerida para el NER (5). Ambas proteínas, así como su interacción heterodimérica, están altamente conservadas entre eucariotas (5,6). Los humanos con mutaciones sutiles en XPF tienen XP ligera con desarrollo de cáncer, como promedio, en la cuarta década de vida (7) y los pacientes con mutaciones en Ercc1 no se conocen (8). Esto implica que la XPF-ERCC1 es esencial para la viabilidad humana y por tanto demanda funciones adicionales para la endonucleasa más allá de NER, ya que el NER no detectable no es incompatible con la vida (9). De hecho, la XPF-ERCC1 se requiere para una segunda ruta de reparación del ADN; reparación de vínculo cruzado de interhebra (ICL) (10, 11) y algunos tipos de recombinación mitótica (12-14). Los ICLs son una clase única de daño del ADN que involucra vínculo covalente de las dos hebras de ADN, requiriendo un mecanismo de reparación distinto del NER (15). Se descubrió una progeria novel que atribuimos a una mutación severa en XPF provocando hipersensibilidad al ICL. La comparación de esta progeria con el envejecimiento natural implica daño citotóxico del ADN como contribuyente a ambas.

Materiales y Métodos

Caracterización de fibroblastos XFE1RO de pacientes. Los cultivos de fibroplastos primarios de piel se establecieron a partir de biopsia de piel de pacientes. Las células se cultivaron en medio Hams F10 suplementado con 15% de suero fetal de becerro y antibióticos. Se estudiaron las cepas de las células incluyendo C5RO (normal), XFE1RO (nuevo paciente XP-F), XP42RO (típico paciente XP-F con XP ligero) así como células derivadas de un paciente XP-C y un paciente XP-A completamente NER deficiente. Las líneas de células se inmortalizaron mediante infección con un retrovirus defectuoso expresando trascriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) como se describe (54). Los niveles de expresión de hTERT se determinaron mediante RT-PCR (55). La supervivencia celular se midió después de exposición de fibroblastos primarios a UV (UV-C, 254 nm) o fibroblastos inmortalizados al agente de vínculo cruzado MMC y se midió el exceso de crecimiento clonogénico, como se describió previamente (56). Las supervivencias clonogénicas en MEFs se realizaron con líneas de células primarias establecidas a partir de embriones de ratón cultivados a 3% O_{2} (57). La capacidad para NER y la reparación de trascripción acoplada después del daño UV se determinó mediante síntesis no programada de ADN (UDS) y recuperación de síntesis de ARN, respectivamente, también como se describió previamente (58). El ARN total se aisló de los fibroblastos del paciente y se aplicó trascripción inversa utilizando cebadores hexámeros aleatorios. El gen hXPF se amplificó en dos fragmentos solapados del ADNc y secuenció directamente mediante protocolos estándar. La secuencia de codificación del gen hXPF se amplificó a partir de ADN genómico aislado de fibroblastos utilizando cebadores específicos de exón y secuenciada. Inmunodetección de XPF-ERCC1. La expresión de proteínas XPF y ERCC1 se detectó mediante inmunoblotting de 10 \mug de extracto de célula entera (WCE) a partir de cultivos inmortalizados de fibroblasto utilizando \alpha-hKPF monoclonal de ratón (Neomarcadores; 1:1000) y anticuerpos policlonales \alpha-hERCC1 purificados por afinidad (59). Generación de ratones Ercc1^{-/-}. El establecimiento de ratones Ercc1^{-/-} genéticamente objetivo se describió previamente (22). Ratones homocigóticos mutantes se generaron en un entorno genético mixto FVB y C57B1/6 mediante entrecruzamiento innato de ratones Ercc1^{-/-}. Después de dos días del nacimiento, las camadas se entresacaron a un tamaño promedio de 5 cachorros para reducir la competencia de alimentación. Se aisló el ADN genómico de tejido de la cola y sometió a genotipo mediante PCR (15). Análisis de la marcha. La ataxia se evaluó mediante análisis de pisadas de ratones Ercc1^{-/-} de tres semanas y compañeros de camada wt como se describió (60). Brevemente, las patas anteriores de los animales se pintaron con pintura de agua púrpura, las traseras con verde. Los ratones se liberaron hacia un pasaje cerrado 7 x 30 cm y se les permitió escapar a un refugio oscurecido al final. Los datos se registraron después de 3 corridas de prueba en días consecutivos. Autoradiografía. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketalina y xilacina (120 y 7,5 \mug/g de peso corporal, respectivamente). Se tomaron películas laterales a magnificación 2X utilizando un instrumento de rayos X CGR Senograph 500% operado a 30 kV y 32 mAS. Un foco de molibdeno (0,1 mm) se utilizó con una distancia al foco de la película de 65 cm y 32,5 cm de distancia al objetivo del foco. Se utilizó película Kodax de rayos X (MIN-RMA 18 x 24 cm) y una pantalla Dupont Cronex de intensificación de mamografía de dosis baja.

Aislamiento de ARN y análisis de biochip de ADNc. Los controles de Ercc1^{-/-} y de compañeros de camada en dos entornos genéticos se obtuvieron a partir de nuestra colonia en el Centro Médico Erasmus. Los ratones C57B1/6 jóvenes (seis meses) y viejos (26 meses) se obtuvieron del Instituto Nacional de Envejecimiento y se embarcaron a la instalación central de biochip en el Centro de Ciencia de Salud de la Universidad de Texas, donde se hospedaron durante al menos dos semanas antes del experimento. Se les aplicó eutanasia a los ratones por dislocación cervical, se cortó el hígado y se examinó mediante patología superficial antes de congelación súbita en nitrógeno líquido antes del procesamiento. Se aisló el ARN total utilizando TriReagente (Sigma) y kits RNeasy (Qiagen). La pureza del ARN se determinó mediante mediciones espectrométricas (A_{260}/A_{280} > 1,8) así como su integridad mediante electroforesis de gel denaturalizante. El ARN se precipitó con 4M acetato de amonio y etanol. Los sustratos de ADNc etiquetados de manera fluorescente para hibridización de biochip se produjeron mediante etiquetado indirecto. Brevemente, los ADNcs amino-alilo modificados se sintentizaron en trascripción inversa utilizando 15 \mug de ARN total, cebadores oligo-dT (Invitrogen), Superscript RT (Invitrogen) y dNTP conteniendo una proporción 1:1:1:0:1:0:9 de dATP:dCTP:dGTP:dTTP:amino-alilo-dUTP. Los cDNAs de la mezcla de reacción se purificaron utilizando filtros Micron YM-30 y acoplaron con tintes de cianina (Cy3 o Cy5, Amersham Biosciences). Los cDNAs apropiados etiquetados Cy3 (rojo) y Cy5 (verde) se combinaron y repurificaron utilizando kit de purificación Qiaquick PCR (Qiagen) y concentraron mediante secado de velocidad al vacío. Las muestras se resuspendieron en búfer DIG Easy Hyb (Roche) conteniendo 0,5 \mug/\mul de ADN de esperma cortada de salmón luego hibridizada a chips de biochips de ADNc. Los chips se prehibridizaron durante 1 h en un búfer conteniendo 15% formamida, 5X citrato salino de sodio, 0,1% sulfato dodecil de sodio y 10 mg/ml de albumina de suero bovino. La hibridizaciones se hicieron a 48º durante 16, después de lo cual se lavaron las placas con diferentes astringencias, secaron y escanearon utilizando un escáner Axon de láser dual.

Los chips de ADNc de ratón conteniendo 1912 características (Tabla Suplementaria 1; http://microarray.stcbmlab. uthsc-sa.edu/mouse1912c.gal) en duplicado se imprimieron en placas CMT-GAPS (Comino) en la Microarray Core Facility, del Centro de Ciencia de Salud de la Universidad de Texas, San Antonio, TX de la biblioteca GEM-1 de ADNc de ratones (Incyte). Los valores de intensidad se cuantificaron utilizando Spot (CSIRO) y normalizaron utilizando las Estadísticas de Análisis de Biochips (SMA; http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarra/) herramientas de software del Dr. Terry Speed, Universidad de Berkeley, Berkeley, C.A., listadas bajo "R" (http://www.r-project.org/). El promedio de los datos normalizados se representa como un ploteo distribuido de la proporción de la intensidad calculada como log2(rojo/verde) vs el valor de la intensidad total calculado como log2(rojo x verde)^{1/2}. Se realizó prueba de significación utilizando software SAM de la Universidad de Stanford (http://www.stanford.edu/-tibs/SAM/ y SMA.

Inmunoanálisis y ensayo de TUNEL. Se sacrificaron ratones de 3 semanas mediante dislocación cervical. El hígado se diseccionó, se fijó en paraformaldehído al 4% en búfer de fosfato de solio, pH 7,4 a 4ºC durante la noche, deshidrató e incrustó en parafina. Las secciones seriadas 5 \mum se recolectaron en placas Superfrost Plus (Fisher), secaron a 37ºC durante la noche y procesaron mediante inmunohistoquímica utilizando recuperación cítrica mediante antígeno de base cítrica como se describió (61). Se detectó IGFBP-1 con IgC policlonal de cabra (\alpha-IGFBP-1 (Santa Cruz); 1:100) seguido de \alpha-fluoresceina-cabra-ITC de conejo (Sigma; 1:500). La fracción de hepatocitos proliferantes se midió inyectando los ratones con 50 mg/kg de bromodeoxiuridina (BrdU) en solución salina con búfer de fosfato 30 minutos antes del sacrificio. La incorporación de BrdU en el ADN celular se detectó utilizando a-BrdU monoclonal de ratón (Abcam; 1:50) y conjugado \alpha-ratón IgG (Sigma; 1:1000). Se detectó apoptosis mediante ensayo TUNEL utilizando sistema de detección Promega Apoptosis según instrucciones del fabricante. Para los inmunoblots, se disecaron los hígados de los animales y sumergieron en 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA con 0,5% Triton en hielo. Las muestras se sonicaron utilizando un Soniprep 150 (Sanyo) equipado con una microsonda a máxima amplitud durante 10 seg. El contenido de proteína se midió utilizando kit de ensayo de proteína Coomassie Plus (Pierce) y 10 \mug de cada muestra se sometieron a electroforesis, tiñeron y sondearon con: \alpha-catepsina S (CalBiochem # 219384, 1:1000); \alpha-IGFBP-1 (Santa Cruz # sc-6000; 1:1000), \alpha-p53 (Signet, #CM1; 1:1000); (\alpha-CYR61 (IGFBP.10), Abcam # ab2026; 1:100); \alpha-citocromo P450 4A (Gene Tex, #ab3573; 1:1500) o \alpha-catepsina L (Abcam # ab7454; 1:1000) mediante procedimiento estándar. La intensidad de banda se midió utilizando software Quantity One (Bio-Rad).

Resultados y Discusión Un paciente con un síndrome progeroide novel y deficiencia XPF-ERCC1

Nos fue referido un muchacho joven de 15 años de edad con queja de quemaduras de sol frecuentes y envejecimiento prematuro. (Fig. 1; Reporte de caso suplementario material en línea S1). Debido a su fotosensibilidad, se obtuvieron fibroblastos de piel (línea de célula XFE1RO) y su sensibilidad a luz UV se comparó con la de células derivadas de pacientes con XP debido a NER defectuoso de fotodímeros UV (ver Material y Métodos; material suplementario en línea S2). Las células XFE1RO eran aproximadamente 6 veces más sensibles a UV en términos de supervivencia que las células de tipo natural, células (wt). Esto era intermediario a la sensibilidad de células de pacientes con XP ligero (grupos de complementación XP-C y -F) y XP severo (XP-A) (Fig. 2A). La reparación del ADN con daño UV se determinó midiendo la cantidad de ^{3}H-timidina radioetiquetada incorporada a las células (síntesis no programada de ADN o UDS) después de exposición a UV (Fig. 2B). UDS en células XFE1RO fue solo aproximadamente 5% del nivel normal, lo cual es solo ligeramente superior con respecto a los pacientes con XP más severo con una completa ausencia de NER (grupo A de complementación). La recuperación de la síntesis del ARN después de daño UV se midió como un indicador de reparación de trascripción acoplada del ADN (Fig. 2C). Esto también se afectó severamente en células XFE1RO, en igual medida que las células NER deficientes de un paciente XP-A y células de trascripción acopladas NER deficientes de un paciente CS. En resumen, las células XFE1RO demostraron una casi total ausencia de reparación del ADN por UV inducida, lo cual es una característica de XP, independientemente del hecho de que su historia clínica sea inconsistente con este diagnóstico.

A pesar de los síntomas inusuales del paciente, la profunda sensibilidad a UV de sus fibroblastos indicaban un defecto en NER. Por lo tanto se realizó un análisis de complementación fundiendo células XFE1RO con fibroblastos de todos los grupos XP-A a G- midiendo UDS inducido por UV (Fig. 2D). Las células XFE1RO corrigieron el daño del ADN de todos los grupos excepto el XP-F. Este resultado fue inesperado porque pacientes XP-F previamente reportados todos tenían NER residual sustancial y, como consecuencia, solo síntomas ligeros de XP (16, 17). Para confirmar la asignación de XFE1RO al grupo de complementación XP-F se aisló ARNm de los fibroblastos del paciente, se realizó trascripción inversa y secuenciación, revelando una trasversión G\rightarrowC en la posición 478 en Xpf (Fig. 2E). Esta mutación predijo una sustitución no conservativa aminoácida de arginina 142 a proline (R^{142}P). El análisis de secuencia del ADN genómico del paciente demostró que él era homocigótico para esta mutación, consistente con herencia recesiva y consanguinidad paterna.

El R^{142} se conserva en todos los eucariotas con la excepción de Arabidopsis thaliana, la cual tiene un residuo de lisina psicoquímicamente relacionado en esa posición (Fig. 2F). El R^{142} reside en un dominio altamente conservado de la proteína que alberga motivos conservados de helicasas que se piensa están involucrados en el enlace del ADN (18) y una serie de motivos ricos en leucina, los cuales están involucrados con frecuencia en interacciones proteína=proteína (19). La mutación R^{142}P es única y la más terminal-N de las mutaciones Xpf reportadas (Fig. 2F). Para determinar si la mutación impactaba el tamaño o estabilidad de la proteína XPF, se les hizo immunoblotting a extractos enteros de células de fibroblastos XFE1RO y se identificaron con anticuerpos levantados contra hXPF completo. El nivel de proteína XPF se redujo significativamente (aproximadamente 1X) en células XFE1RO en comparación con wt o células de un paciente con XP ligero debido a una mutación en Xpf (Fig 2G). De manera similar, los niveles de proteína ERCC1 se redujeron en células XFE1RO, aunque no en igual medida (Fig 2H). Estos hallazagos sustancian reportes previos de que los niveles de proteína ERCC1 se reducen en células ováricas mutantes Xpf de hámster chino y viceversa, indicando que se requiere la interacción de la proteína XPF-ERCC1, al menos en alguna medida, para la estabilización de ambas proteínas (20). De manera importante, se detectó una traza de XPF residual completo en células XFE1RO del paciente, consistentes con la noción de que una ausencia total de XPF-ERCC1 es incompatible con la vida humana. En total, estos datos revelan que los niveles muy bajos de XPF-ERCC1 provocan progeria en humanos.

Aunque las células XFE1RO mostraron una ausencia casi total de reparación a daño del ADN inducido por UV o NER, las células derivadas de pacientes XP se comportaron de manera igualmente pobre en los ensayos de reparación de ADN (Fig. 2). Sin embargo estos pacientes (grupo A de complementación XP) tenían XP severo sin progeria multi órgano. Por tanto concluimos que la progeria en nuestro paciente no fue causada por un defecto en NER. Porque el XPF-ERCC1 también está implicado en la reparación ICL de ADN (10), medimos la supervivencia de células XFE1RO después de exposición a mitomicina C (MMM; Fig. 2I). Los fibroblastos XFE1RO eran significativamente más sensibles a daño ICL que las células wt, células de un paciente XP-F con XP ligero o células de un paciente XP-A con XP severo y niveles no detectables de NER. Por tanto, una característica de las células humanas con niveles severamente reducidos de XPF-ERCC1 es la hipersensibilidad a ICLs de ADN, lo cual puede ser la base mecanicista para la progeria. Sin embargo, las características progéricas pueden estar influidas por factores adicionales genéticos y ambientales, los cuales no tenemos bajo control aquí, ya que hemos visto un solo caso ligero de XPF que también muestra tal sensibilidad exagerada ICL in Vitro (datos no se muestran). Estas características inusuales de reparación del ADN, la constelación única de síntomas y las características progeroides prominentes definen un síndrome novel que denominamos síndrome progeroide XPF-ERCC1 (XFE1).

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Comparación de paciente XFE1Ro con ratones Ercc1^{-l-}. A diferencia de los humanos los ratones deficientes en Ercc1 y XPF son viables (21-23). Sin embargo, el fenotipo de los ratones es extremadamente severo y al igual que el paciente XFE1RO, muy diferente de la deficiencia NER (24). Los ratones Ercc1 deficientes desarrollan normalmente, son ligeramente enanos al nacimiento (Fig. 3A), entonces mueren en la tercera semana de vida (Fig. 3b) de fallo hepático (25). Caquexia, atrofia epidérmica, disfunción renal y hepática progresiva así como poliploidización hepatocelular e inclusiones intranucleares en ratones Ercc1^{-l-} se reportaron previamente y son síntomas que pueden asociarse con avanzada edad en mamíferos, sugiriendo que los ratones envejecen prematuramente (22). Identificamos características adicionales de ratones Ercc1^{-l-} consistentes con progeria. A los 10 días de nacidos los ratones eran distónicos, manifestado con temblores y una postura anormal (flexión en lugar de extensión) cuando se suspendían por la cola (datos no se muestran). La distonia secundaria puede ser causada por neurodegeneración, un fenómeno común dependiente de la edad en mamíferos. Adicionalmente, los ratones Ercc1^{-l-} tienen ataxia progresiva, indicando aún más neurodegeneración (Fig. 3C), sarcopenia (datos no se muestran), eritropoyesis de estrés disminuido (26) y cifosis, sugerente de osteoporosis (Fig. 3D), todos los cuales son síntomas frecuentemente asociados con envejecimiento en mamíferos (27-29). De manera importante, al igual que las células XFE1RO, los ratones Ercc1^{-l-} son deficientes en XPF (Fig. 3E) y significativamente más sensibles a medicamentos que causan ICLs de ADN que otros fibroblastos embrionarios de ratón NER deficiente (MEFs, Fig. 3F), demostrando la similitud no solo entre el fenotipo del paciente y el modelo de ratón, sino también la base mecanicista para el fenotipo.

Tanto el paciente como los ratones Ercc1^{-l-} fueron fenotípicamente normales durante el desarrollo temprano (Fig. 1A y 3A); el envejecimiento prematuro comenzó en la prepubertad temprana y progresó rápidamente (Fig 1B y 3B), resultando en muerte prematura prior a maduración sexual. Adicionalmente a la apariencia envejecida, arrugada de XFE1RO (Fig. 1B), los síntomas progeroides incluían atrofia de la epidermis, pérdida de oído y vista, ataxia, atrofia cerebral, hipertensión, disfunción renal y hepática, anemia, osteopenia, cifosis, sarcopenia y pérdida de peso (para una comparación detallada ver Tabla I). Entre los síntomas rápidamente medidos en ratones, la única característica progeroide observada en XFE1RO no observada en los ratones Ercc1^{-l-}, fue anemia, aunque previamente notamos deposición de hierro en el bazo sugerente de una alta transferencia de glóbulos rojos (22) y eritropoyesis disminuída de estrés (26), haciendo posible que la anemia periférica ocurriera si los ratones hubieran vivido más. Por tanto, tanto el paciente XFE1RO como los ratones Ercc1^{-l-} mostraron progeria de los sistemas neurológico, dermatológico, músculoesquelatal, hematopoyético, renal y hepatobiliar como consecuencia de endonucleasa XPF-ERCC1 disminuida de reparación del ADN.

Análisis de biochips de hígado de ratón Ercc1^{-l-}. Habiendo validado el ratón Ercc1^{-l-} como un modelo bona fide del síndrome progeroide XFE1RO, buscamos aclaración de la causa de las características de envejecimiento prematuro examinando el perfil de expresión del gen en uno de los tejidos más severamente afectados en comparación con compañeros de camada de control. Seleccionamos el hígado porque estaba afectado tanto en el paciente como en el modelo de ratón y la disfunción en el hígado en el ratón se acompaña de características bien definidas de envejecimiento prematuro (poliploidización nuclear (30), ocurrencia de inclusiones intranucleares (22) así como indicaciones de acumulación de daño del ADN (estabilización p53 (21)).

El ARN total aislado del hígado de ratones Ercc1^{-l-} de 21 días se comparó con el de compañeros de camada wt en dos experimentos diferentes (Chip definido en la Tabla Suplementaria 1). Primero, se combinaron muestras de ARN de 3 Ercc1^{-l-} y se compararon con 3 compañeros de camada de control, con dos antecedentes genéticos mezclados (FVB/n:C57B/6 y 129/OLA:C57B/6) utilizando al menos 4 chips, incluyendo permuta de tinte, para cada comparación de combinación (Fig. 4 y Tabla 2; respectivamente). En el segundo experimento comparamos animales Ercc1^{-l-} individuales (en un entorno 50:50 C57B1/6:FVB/n) con compañeros de camada de control, en 3 pares aleatorios (Tabla Suplementaria 3). Había un grado significativo de similitud entre los resultados obtenidos por los dos antecedentes genéticos diferentes: 50% de los genes expresados diferencialmente de manera más significativa parecieron idénticos en ambos antecedentes. Esto indica que el perfil de expresión del Ercc1^{-l-} no es único con respecto a una cepa particular de ratón. Tampoco detectamos una diferencia significativa en los resultados entre los dos diseños experimentales. 65% de los genes identificados como más diferencialmente expresados de manera significativa eran idénticos a los genes identificados en el experimento con muestras combinadas. Finalmente, desarrollamos un perfil de expresión de gen que representaba envejecimiento normal de hígado haciendo una comparación de pareja de 6 ratones C57B1/6 jóvenes (seis meses) y 6 viejos (26 meses) en dos experimentos separados (Tabla 4).

La Figura 4 muestra un ejemplo de los resultados obtenidos para la comparación combinada de Ercc1^{-l} versus compañeros de camada de control. Utilizando SAM, identificamos catorce genes que estaban significativamente sobre expresados en hígado de ratón Ercc1^{-l-} en comparación con animales de control y tres genes que estaban significativamente sub expresados (Fig. 4B). Más del 50% de los genes identificados en ratones Ercc1^{-l-} estuvieron significativamente expresados diferencialmente en ratones envejecidos (Fig. 4B). La probabilidad de ocurrencia aleatoria de este solapamiento es < 10^{-4}. Estos hallazgos indican que los cambios a nivel del genoma en su conjunto en los perfiles de expresión observados en el envejecimiento natural son reproducidos en un grado significativo en el hígado de ratones Ercc1^{-l-} de tres semanas, estableciendo el paralelo entre su progeria y el envejecimiento natural al nivel fundamental de expresión de gen. Adicionalmente estos resultados invocan un papel sustancial con respecto a la reparación del ADN en la atenuación del envejecimiento y validan el uso de ratones con síndromes progeroides debido a un defecto en el metabolismo del ADN como excelentes herramientas de estudio para entender aspectos del envejecimiento de mamíferos.

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Análisis de perfil de expresión de gen. Varios de los genes expresados diferencialmente en hígado envejecido y Ercc1^{-l-} pudieran estar funcionalmente vinculados. La proteína de enlace del factor de crecimiento 1 (IGFBP.1) tipo insulina, su ligando factor de crecimiento 1 (IGF-1) tipo insulina y los niveles del ácido graso amida hidrolasa (FAAH) se regulan mediante la hormona de crecimiento (GH)/eje glucocorticoide. El IGFBP-1 es producido y segregado primariamente por hepatocitos y secuestradores circulantes de IGF-1, humedeciendo su actividad mitogénica. Los niveles elevados de IGFBP-1, acoplados con niveles bajos de IGF-1 y FAAH, como se demuestra mediante el análisis de biochip e inmunodetección (Fig. 5A y G), indican señalización GH disminuida en ratones mutantes y envejecidos (31). Los niveles de GH declinan con la edad (32) proporcionando corroboración fisiológica de los resultados de los biochips. Los niveles de suero de GH eran normales en nuestro paciente progeroide a pesar de su enanismo (leyenda Fig. 1), indicando que la deficiencia GH no es la causa primaria de la progeria del paciente. La observación de que el eje GH está quebrado en la deficiencia XPF-ERCC1 crea un vínculo entre rutas catabólicas y deficiencias de reparación de ADN, las cuales se conoce que influyen negativamente en la longevidad de
mamíferos.

El análisis posterior de los datos de biochips arrojaron tres clústeres de genes diferencialmente expresados en hígado de ratón envejecido y Ercc1^{-l-} que proporcionaron pistas interesantes con respecto al mecanismo de quebrantamiento del eje GH sugiriendo un escenario plausible para la aparición del envejecimiento. El primer grupo tenía efectores en sentido descendente del receptor proliferante de peroxisoma \alpha activado (PPAR\alpha), incluyendo: IGFBP-1, citocromo P450 4A10, citocromo P450 4A14 y esterasa 31. Como los niveles IGFBP-1 son sobre regulados por PPAR\alpha (33), el quebrantamiento del eje GH puede ser una consecuencia directa de la activación PPAR\alpha, reflejando un fuerte vínculo entre estos dos señalando cascadas en la mediación del envejecimiento.

PPAR\alpha es un factor de trascripción que cuando se activa aumenta la oxidación-\beta de ácido graso regulando la expresión de transporte de lípido y metabolizando proteínas (34). La expresión mejorada de efectores PPAR\alpha en hígado de ratones Ercc1^{-l-} y envejecidos indica por tanto un estado elevado de peroxidación lípida (LPO) (35). Los ligandos endógenos de PPAR\alpha son ácidos grasos libres de cadena recta, largos. Por tanto esta cascada puede ser disparada mediante ruptura de membranas de células durante toxicidad de hepatocito. Este escenario es sostenido por el segundo clúster de genes diferencialmente expresados en hígado de ratones Ercc1^{-l-} y envejecidos, i.e. genes indicativos de toxicidad de hepatocitos incluyendo angiogenina, ATPase transportadora de Ca^{2+} y molécula de adhesión I de célula CEA relacionada. La toxicidad hepatocelular es sostenida aún más por la presencia de enzimas hepáticas en el suero del paciente y del ratón (Tabla I y (21) así como poliploidización de núcleos hepatocelulares, los cuales son característicos de hígado Ercc1^{-l-} y wt envejecido (Fig. 6B) (21, 36, 37).

De manera importante, la activación de PPAR\alpha y la expresión elevada de IGFBP-1 se induce en ratas o hepatocitos cultivados tratados con el agente ICL de ADN cisplatino (38). A la luz del hecho de que el defecto único en ambos ratones Ercc1^{-l-} y células XFE1RO es una inhabilidad para reparar ICLs de ADN, es posible que los ICLs endógenos no reparados inicien los eventos que culminan en envejecimiento prematuro espontáneo. Los ICLs de ADN son en sí mismos extremadamente citotóxicos (15). Por tanto un escenario posible es que los ICLs no reparados causen muerte hepatocelular, se liberan ácidos grasos de membranas de las células moribundas, los cuales activan PPAR\alpha y conducen a la supresión de actividad mitótica causando envejecimiento del tejido. Interesantemente, el LPO inducido por PPAR\alpha puede actuar también como una fuente de ICLs endógenos de ADN (39), proporcionando un mecanismo mediante el cual la acumulación de daño al tejido pueda auto perpetuarse. La similitud general en el perfil de expresión del hígado de ratón wt envejecido y Ercc1^{-l-}, implica un papel importante para los ICLs endógenos de ADN en la promoción de envejecimiento no solo en el caso de deficiencia de reparación del ADN sino también en organismos responsables de la reparación.

El tercer clúster mayor de genes que se expresaron diferencialmente en Ercc1^{-l-} y en menor medida en hígado de ratón envejecido wt, son marcadores de regeneración de hígado y remodelación de tejido, incluyendo S-adenosil sintetasa metionina, angiogenina, tubulina \alpha4, \alpha-mannosidasa II, catepsina L y amido hidrolasa ácido graso (40-43). La proteína 27 específica de grasa es un marcador de diferenciación de adipocito (44). El cambio graso es un interventor bien reconocido de fallo hepático provocado por hepatotoxinas o desregulación de metabolismo lípido (45) como resultaría de activación crónica de la ruta PPAR\alpha. IGFBP-10 y CBFA2T3 se expresan altamente en células senescentes terminalmente diferenciadas (46, 47). Estos datos apoyan aún más el cuadro clínico de daño crónico hepático y regeneración.

Inmunoanálisis y ensayo TUNEL. Para todos los productos de genes indicados como sobre expresados mediante análisis de biochip y para los cuales estaban disponibles anticuerpos comercialmente, los niveles de proteína se compararon en hígado de ratón wt joven y viejo y Ercc-1 deficientes. IGFBP-1 se detectó exclusivamente en el citoplasma de hepatocitos y en eritrocitos dentro de las sinusoides del hígado (48). Los niveles de IGFBP-1 eran significativamente elevados en el hígado de ratón Ercc1^{-l-} comparado con el ratón wt joven (Fig. 5A y C). Los niveles de IGFBP-1 también eran elevados en el ratón wt viejo. Estos resultados se corresponden con los datos de biochip, que indicaban un 3,7 - y 1,9 veces de incremento en el ratón wt Ercc1^{-l-} y viejo relativo al ratón wt joven y proporciona apoyo a la validez del perfil del gen a nivel de la proteína. Esto se confirmó aún más mediante inmunodetección de IGFBP-10, citocromo P450 4A y catepsina S, todos los cuales estaban sobre expresados en hígado de ratón wt Ercc1^{-l-} y/o envejecido en comparación con ratón wt joven, tal como se predijo mediante el perfilado de expresión de gen (Fig. 5C).

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El ensayo TUNEL se utilizó para evaluar ritmos de apoptosis en las secciones de hígado de ratón (Fig. 5B). Los núcleos apópticos son poco comunes en el hígado de ratón joven wt. Sin embargo, la fluorescencia nuclear era común en el hígado Ercc1^{-l-}, consistente con un alto grado de apoptosis. Los niveles también estaban modestamente elevados en el hígado de ratón envejecido wt. Estos datos apoyan la contribución de muerte celular de hepatocito al fenotipo de envejecimiento e implica rutas apópticas como mediador de muerte celular. Interesantemente, el daño del ADN comúnmente dispara muerte celular a través de apoptosis p53 dependiente (49) y los niveles p53 son elevados en núcleos de hepatocito en Ercc1^{-l-} (Fig. 5C y (21).)

Modelo para envejecimiento como consecuencia de daño no reparado del ADN. En total, los datos de biochip sugieren un mecanismo generalizado mediante el cual el envejecimiento pudiera surgir como consecuencia de un defecto en XPF-ERCC1 (Fig. 6A). Proponemos que los ICLs endógenos de ADN se acumulan intensamente en células con deficiencias de reparación o crónicamente con el envejecimiento. Las lesiones citotóxicas del ADN disparar la muerte celular o senescencia (poliploidización). En los tejidos que no son post-mitóticos, e. g. hígado, la respuesta a la lesión es un intento de regenerar tejido funcional a través de proliferación celular, diferenciación y remodelación de tejido. La regeneración excesiva puede contribuir además a senescencia prematura de células proliferantes y conllevar a una incapacidad para responder a señales mitogénicas. La exposición a genotoxinas endógenas es perpetua, por tanto el ciclo persiste y la capacidad regenerativa de un tejido se deteriora eventualmente, llevando a una función de pérdida de tejido y a la aparición de síntomas de envejecimiento.

Medimos la fracción proliferante de células en el hígado de ratones como un índice de su capacidad regenerativa relativa (Fig. 6B). Los ratones se inyectaron con bromodeoxiuridina (BrdU), la cual se incorpora dentro del ADN genómico de células que replican al momento de la inyección. Diez porciento de los hepatocitos de ratones wt jóvenes se tiñeron positivamente para BrdU, consistente con los ritmos de proliferación medidos en otros modelos de roedores (30). En fuerte contraste, los núcleos BrdU positivos disminuyeron grandemente en el Ercc1^{-l-} y en los hígados de ratones wt envejecidos, reflejando ritmos altamente atenuados de proliferación. Esto es consistente con nuestro modelo en el cual el envejecimiento de un tejido está directamente correlacionado con una capacidad disminuida de regeneración. En apoyo a nuestro modelo el perfilado de genes músculo esqueléticos de ratones wt viejos demuestra sobre expresión de genes involucrados en respuesta al estrés y apoptosis, la cual llevó a la propuesta de que el envejecimiento es provocado por una respuesta al daño al tejido inducido de forma oxidante (50). De manera similar, Cao, et. al., reportó datos de biochips sobre tejido de ratón envejecido en el cual había evidencia de estrés celular, fibrosis de tejido con capacidad de proliferación disminuida (51).

Nuestro modelo también ofrece una explicación al por qué los síndromes progeroides debidos a defectos en el metabolismo del ADN son pleyotrópicos y segmentados. El principio clave del modelo es que el daño citotóxico provoca envejecimiento. Las lesiones citotóxicas del ADN incluyen ICLs, rupturas de doble hebra de ADN y lesiones de bloqueo de trascripción. Las diferencias relacionadas con órganos en el metabolismo resultan en espectros de órganos específicos de lesiones espontáneas del ADN. Consecuentemente diferentes mecanismos de reparación del ADN (reparación ICL, reparación de ruptura de doble hebra y reparación de trascripción acoplada) son más o menos esenciales para defender el envejecimiento en cada tejido. Los defectos en la reparación de trascripción acoplada se asocian primariamente con síntomas neurológicos, e. g. CS y tricotiodistrofia. En contraste, la epidermis, pero no el sistema nervioso central, se afecta en ratones con defectos genéticos en la unión no homóloga de terminales en rupturas de doble hebra (52).

En resumen, hemos identificado un síndrome progeroide novel en el hombre y los ratones, el cual es consecuencia de una mutación en el Xpf o Ercc1, resultando en profunda sensibilidad a ICLs de ADN. Los datos de biochips e inmunohistoquímicas apoyan un mecanismo de envejecimiento como una consecuencia de una respuesta citotóxica al daño del ADN y subsiguiente pérdida de capacidad de regeneración de tejido. El perfilado de genes de hígado de ratones wt viejos produjo solapamiento significativo con el perfil obtenido de ratones Ercc1^{-l-} indicando que este mecanismo puede aplicarse al envejecimiento natural en mamíferos proporcionando la oportunidad de intervención. Estos modelos de ratón son por tanto extremadamente apropiados para uso en el método de identificación de compuestos según la presente invención y como se ejemplifica en el siguiente ejemplo 4.

TABLA 1 Comparación de las características clínicas de un paciente con grupo de complementación F de xeroderma pigmentosum leve con paciente progeroide con una mutación severa en Xpf (XFE1RO) y ratones Ercc1^{-l-}. Los síntomas que pueden asociarse con edad avanzada están indicados en bastardilla

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TABLA 2 Genes que se determinan como diferencialmente expresados de manera significativa en hígado de ratón Ercc-1 deficiente comparado con compañeros de camada de control en un entorno genético mixto 129/Ola:C57Bl/6. El ARN se combinó a partir de tres ratones de cada genotipo y una sola comparación entre combinaciones mutantes y de control con trueque recíproco de tinta. Los nombres de los genes, su número de Acceso al Banco de Genes y la cantidad de veces de diferencia en expresión se indican. Los genes indicados con # estaban expresados diferencialmente de manera similar cuando se hacía una comparación idéntica, pero con ratones en un entorno genético mixto FVB/n:C57Bl/6 (Fig. 4). El asterisco * indica genes que también fueron identificados como expresados diferencialmente de manera significativa cuando se comparaba hígado de ratón Ercc1^{-l-} con compañeros de camada de control en una comparación apareada

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TABLA 3 Genes identificados como expresados diferencialmente de manera significativa en hígado de ratón Ercc-1 deficiente comparado con controles de compañeros de camada wt, utilizando una comparación apareada de animal único. Los genes marcados con un asterisco * se encontró que eran expresados diferencialmente de manera similar cuando el hígado de ratón Ercc-1 deficiente se comparaba con compañeros de camada de control utilizando muestras combinadas representando animales múltiples (Figs. 4)

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TABLA 4 Análisis biochip de ARN de hígado de ratón envejecido. La tabla indica la identidad de genes expresados diferencialmente de manera significativa en hígado de ratón envejecido wt (26 meses) comparados con hígado de ratón joven wt (6 meses). El experimento incluyó una comparación apareada de seis animales de cada grupo de edades. Se indican los nombres de los genes, su número de Acceso al Banco de Genes y la diferencia en veces en expresión. Los genes indicados con un asterisco* se expresaban diferencialmente de manera similar en hígado de ratón de tres semanas Ercc-1 deficiente en comparación con compañeros de camada wt. Los genes indicados con A también se expresaron diferencialmente en hígado de ratón de tres semanas Ercc-1 deficiente, pero en la dirección opuesta. Para productos de gen con anticuerpos disponibles comercialmente, los niveles de proteína en extractos de hígado de ratón de envejecimiento natural se compararon con hígado de ratón joven de tipo natural mediante inmunoblot y los resultados se indican en paréntesis en la última columna

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Referencias para el ejemplo 1

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Ejemplo 2 Disminución postnatal temprana de señalización IGF-1/GH-R en ratones con deficiencia de reparación de ADN

Como se mencionó en la solicitud los ratones Xpa^{nulo/nulo}/Csb^{G744ter/G744ter} (en este ejemplo en lo adelante referidos como ratones Xpa^{-l-}/Csb^{-l-}), en contraste con los mutantes únicos para estos genes, mostraron severo retraso en el crecimiento, cifosis, ataxia, y disfunción motora durante el desarrollo postnatal temprano (4). Hemos aplicado análisis funcional genómico en Wt, Xpa^{-l-}, Csb^{-l-} y Xpa^{-l-}/Csb^{-l-} en hígados de ratones de 15 días de nacidos para entender las rutas moleculares subyacentes. Luego de aislamiento total del ARN de cuatro hígados de ratones individuales (de cada genotipo) y subsiguiente hibridización a formaciones de genoma completo de ratón Affymetrix (Affymetrix A versión 2.0), nuestro análisis reveló en ratones Xpa^{-l-}/Csb^{-l-}, pero de manera importante no en los compañeros de camada de control, la desregulación significativa de genes asociados con señalización de crecimiento IGF-1/GH-R (Gh-r, IGF-1, IGFBP3, IGFBP4) así como las funciones lactotrofas (PrR) y tirotrofas) (Dio1 y Dio2) (Figura 7). Este declive marcado se acompañó además de una expresión aumentada significativa de un número de genes asociados con una respuesta antioxidante de defensa (Gstt3, Gsr, Sodl, Hmox1, Ephox1) (Figura 1) y la expresión significativamente disminuida de genes asociados con citocroma P450 y metabolismo oxidante NADPH (Figura 7). Entre un número de genes significativamente regulados aquí expuestos, los perfiles de expresión del receptor de la hormona de crecimiento (Gh-R), el factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1), la proteína de enlace 3 IGF (IGFBP3), el receptor de prolactina (PrR), la glutatotión transferasa (GSTT3), Heme oxigenasa 1 (Hmox1), Epoxido hidrolasa 1 (Ephox1) y Apolipoproteína A4 (ApoA4) se sometieron a verificación en tiempo real PCR (Figura 8).

La señalización GH/IGF-1 es conocido que disminuye con el avance de la edad y se ha mostrado que aumenta la resistencia al estrés, retrasa la declinación funcional dependiente de la edad y aumenta el tiempo de vida de nemátodos, moscas y ratones (5). De manera interesante, de los diversos modelos genéticos que retrasan el envejecimiento múrido, cuatro involucraban deficiencias de la acción pituitaria endocrina. Las mutaciones Prop1^{df} (6) y Pit^{1dw} impiden producción pituitaria de hormona de crecimiento (GH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y prolactina; reduce el ritmo de crecimiento y tamaño corporal adulto; e incrementa el tiempo de vida en un 40 a 60% (7,8). Los adultos pequeños con mejora similar en la longevidad también se producen mediante noqueo del receptor de la hormona de crecimiento (GHR-KO) (9). Sin GH, la síntesis de IGF-1 circulante y la insulina en plasma también son suprimidas como resultado de una sensibilidad aumentada en el hígado (10). Se aportó evidencia poderosa del papel directo de señalización IGF-1 en el control del envejecimiento mamífero mediante ratones mutantes para el receptor IFG-1 Igf1r (11). Los ratones mutantes hembras Igf1r^{+/...} exhiben reducción mínima en crecimiento sin alteraciones en la edad de maduración sexual, fertilidad, metabolismo, absorción de alimento, o temperatura. De manera importante, la extensión de vida observada aquí descrita también se asoció con tolerancia incrementada a estrés oxidante. La relevancia fisiológica de estos resultados se ilustra marcadamente por el hecho de que Hormona de Crecimiento (Gh) y el Factor de Crecimiento tipo Insulina I (IGF-1) disminuyen con el avance de la edad en ratones y humanos (12, 13).

A pesar de los efectos de deterioro del metabolismo ROS en el ADN, los radicales libres participan en procesos fisiológicos importantes que benefician el buen estado de salud, tales como la señal de transducción del factor de crecimiento (14). Las células, deben por tanto, equilibrar la producción óptima de energía contra los efectos deletéreos de ROS. Este intercambio sutíl se subraya por parte de los diversos ratones mutantes deficientes en hormonas con lapso de vida extendido así como en la disminución concomitante dependiente de la edad en la expresión de genes asociados con los procesos somatotrofos, tirotrofos y lactotrofos.

Los ratones Xpa^{-l-}/Csb^{-l-} son totalmente NER deficientes y por tanto sobrecargados con daño endógeno del ADN, un evento que está presente normalmente en las etapas posteriores de la vida. La señalización GH/IGF1 disminuida (conjuntamente con el resto de las hormonas anabólicas descritas en la Figura 1), puede por tanto reflejar una respuesta adaptiva para minimizar los efectos deletéreos de un metabolismo activamente sostenido, posponiendo el crecimiento hasta que prevalezcan condiciones normóxicas mientras intenta a la vez incrementar la respuesta antioxidante. No obstante, al hacerlo prematuramente, la homeostasis completa del organismo se perturba rápidamente. Como resultado los ratones Xpa^{-l-}/Csb^{-l-} sufren de defectos severos de crecimiento y eventualmente mueren.

Aquí, nuestros datos demuestran que el daño del ADN es el instigador primario de la respuesta hormonal observada, sugiriendo que, en mamíferos, la declinación relacionada con la edad en señalamiento del crecimiento GH/IGF-1 puede comprender una respuesta adaptiva a la acumulación continua de daño endógeno del ADN. Adicionalmente, debido a las características impactantes de envejecimiento acelerado de los ratones Xpa^{-l-}/Csb^{-l-} a ambos los niveles moleculares y de organismo, el modelo de ratón Xpa^{-l-}/Csb^{-l-} puede ser una herramienta invaluable para explorar aún más la base molecular del envejecimiento. Estos modelos de ratón, y en particular los transcriptos/genes identificados expresados diferencialmente, son por tanto extremadamente apropiados para uso en el método de identificación de compuestos según la presente invención y como se ejemplifica en el siguiente ejemplo 4.

Referencias para el ejemplo 2

1. J. H. Hoeijmakers, Nature 411, 366 (2001)

2. de Boer J, Hoeijmakers JH. Carcinogenesis 21, 453-60.(2000).

3. G. J. Lithgow and M. S. Gill, Nature 421, 125 (2003)

4. Machiko Murai, Yasushi Enokido, Naoko Inamura, Masafumi Yoshino, Yoshimichi Nakatsu, Gijsbertus T. J. van der Horst, Jan H. J. Hoeijmakers, Kiyoji Tanaka, and Hiroshi Hatanaka. PNAS, 98: 13379-13384 (2001).

5. Tatar M, Bartke A, Antebi A. Science 299:1346-51 (2003).

6. F. Muller, Ames Dwarf Mice. Science's SAGE KE 2001, tg11 (3 October 2001), http://sageke.sciencemag.org/ cgi/ content/full/sageke; 2001/1/tg11.

7. H. M. Brown-Borg, K. E. Borg, C. J. Meliska, A. Bartke, Nature 384, 33 (1996)

8. K. Flurkey, J. Papaconstantinou, R. A. Miller, D. E. Harrison, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6736 (2001).

9. K. T. Coschigano, D. Clemmons, L. L. Bellush, J. J. Kopchick, Endocrinology 141, 2608 (2000)

10. F. P. Dominici, S. J. Hauck, D. P. Argentino, A. Bartke, D. Turyn, J. Endocrinol. 173, 81 (2002)

11. M. Holzenberger, et al., Nature 421, 182 (2003)

12. Strasburger CJ, Bidlingmaier M, Wu Z, Morrison KM. Horm Res, 55 Suppl 2:100-5 (2001).

13. Longo VD, Finch CE. Science, 299:1342-6 (2003).

14. T. Finkel, IUBMB Life 52, 3 (2001)

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Ejemplo 3 Validez de otras características de envejecimiento acelerado exhibidas por ratones mutantes GM en el proceso normal de envejecimiento

El trastorno de reparación del ADN síndrome Cockayne (CS) abarca una amplia variedad de anormalidades neurológicas que no se encuentran en el trastorno relacionado xeroderma pigmentosum (XP). La retinopatía es una de estas características y es un valioso órgano modelo para estudiar la aparición de una condición específica relacionada con el envejecimiento en una forma cualitativa. La patología ocular del CS es considerada una marca distintiva de la enfermedad. El fenómeno de degeneración de la retina exhibido por los ratones CS es recordatorio de degeneración de mácula relacionada con la edad que ocurre en la población envejecida normal y puede ser un modelo valioso para esta enfermedad de los ancianos. Estrategias similares pueden llevarse a cabo en mamíferos para otros parámetros relacionados con la edad.

La reparación del ADN y el mantenimiento del genoma es esencial para la supervivencia de células fotorreceptoras, las cuales se exponen a ambos el estrés oxidante endógeno y la luz visible y radiación UV, como se ilustra más adelante. La retina de ratones Csb^{m/m} de diversas edades se analizó y comparó con la de un modelo de ratón XP. Los ratones Csb deficientes (Csb^{G744ter/G744ter}, TCR, deficientes) y Xpa deficientes (Xpa^{nulo/nulo}, ambos GG-NER y TC-NER-deficientes), así como los ratones de control, todos en un entorno genético C57B1/6 muestran una pérdida de células fotorreceptoras en la retina. A los tres meses de edad, no se notaba ninguna diferencia entre los genotipos, pero en ratones Csb^{m/m} más viejos, el ONL y la capa del segmento exterior claramente eran más delgados que en los ratones de tipo natural (Fig 10A). La cuantificación del número de núcleos ONL mostró que el número de células fotorreceptoras disminuía gradualmente con la edad en ratones Csb^{m/m} mientras que los ratones de tipo natural no mostraban pérdida de células (Fig 10B). Esta pérdida depende de la edad. Los ratones Csb deficientes nacen con un número normal de fotorreceptores, pero esto decrece en un 10% después de los cinco meses y hasta un 50% después de doce meses, en comparación con ratones de tipo natural C67B16/J. En ratones Xpa deficientes la disminución es más lenta y no significativa a los 9 meses, 15% de la pérdida a los 18 meses y 40% a los 30 meses, en comparación con ratones de tipo natural. La aparición tardía de pérdida celular en ratones Xpa deficientes es indicativa de la neurodegeneración que es típica para la deficiencia XPA en sujetos humanos. La pérdida de células se analizó aún más mediante ensayo TUNEL para apoptosis en secciones horizontales de retina de ratones de 3 y 11,5 meses. En los ratones de tipo natural casi no se detectaron perfiles positivos TUNEL. En los ratones Csb^{m/m} se observaron claramente más células positivas. Estas se localizaban casi exclusivamente en el ONL (Fig. 10C), pero no mostraban especificidad regional manifiesta, ocurrente en la retina central al igual que periférica.

En extrapolación: el escenario de degeneración de retina relacionado con daño del ADN observado en los ratones Csb y Xpa deficientes siguiendo una velocidad diferente es también relevante para el proceso de degeneración de mácula que ocurre a un ritmo aún más lento en el envejecimiento normal en personas ancianas. Este ejemplo por tanto ilustra y demuestra el valor y validez del envejecimiento acelerado en los modelos de ratón GM como herramientas para entender e influir en el proceso de envejecimiento normal en humanos.

Resultados esencialmente similares se obtuvieron por parte de los inventores estudiando los procesos de osteoporosis (para detalles, ver el ejemplo 8) y la cifosis y la aparición de caquexia en ratones TTD en comparación con mutantes normales de ratón. Lo mismo es válido para la aparición temprana de infertilidad observada en ratones TTD hembra cuando se comparan con ratones de control wt. Todos los fenotipos anteriores relacionados con el envejecimiento pueden aplicarse apropiadamente en el método de examen de compuestos según la presente invención. Los compuestos y estrategias de intervención farmacéutica para estos fenotipos, síntomas y trastornos pueden desarrollarse tratando o exponiendo estos ratones genéticamente modificados con compuestos o composiciones, por ejemplo para determinar su efecto en retinopatía y pérdida de células fotorreceptoras.

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Ejemplo 4 Examen de compuestos en ratones NER deficientes: efectos fenotípicos de antioxidantes en ratones doble mutantes Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo}

Este ejemplo muestra el esquema experimental para identificar compuestos que pueden inhibir, prevenir y/o retrasar síntomas inducidos de mantenimiento del genoma, en particular síntomas relacionados con el envejecimiento, en ratones que exhiben mutaciones en las rutas NER/TCR, ilustrando por tanto la utilidad del método de identificación de compuestos según la presente invención.

El modelo de ratón utilizado en este ejemplo fue un modelo de ratón CSB^{-l-}/XPA^{-l-} (doble noqueo, donde
Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo}) exhibiendo un defecto en GG-NER y TC-NER (XPA^{-l-}) y TCR en general (CSB^{-l-}). Los ratones CSB^{-l-} exhiben un fenotipo de envejecimiento ligero, una pérdida prematura de fotorreceptor en la retina (ejemplo 3) mientras que los ratones XPA son completamente NER defectuosos pero aparte de una fuerte predisposición al cáncer y un lapso de vida ligeramente más corto no exhiben un fenotipo que los distinga abiertamente de los ratones de tipo natural. El entrecruzamiento de ambos modelos de ratón sin embargo demuestra que los ratones CSB^{-l-}/XPA^{-l-} (doble mutantes) nacen en frecuencias sub-mendelianas, exhiben crecimiento deficiente, cifosis, ataxia, caquexia, osteoporosis y generalmente mueren en la tercera semana del nacimiento. Adicionalmente estos animales tienen un incremento en la pérdida de célula fotorreceptora. La acumulación de daño oxidante del ADN antes e inmediatamente después del nacimiento presumiblemente influye de manera negativa en la trascripción y provoca el fenotipo de envejecimiento prematuro.

Para investigar el efecto de limpiadores de radicales en los ratones CSB/XPA de doble noqueo, se monitoreó el efecto de varios compuestos y composiciones mediante la frecuencia de ratones CSA/XPA dKO (más cercana a la frecuencia mendeliana esperada del 25%) y de lapso de vida extendido (mayor que el promedio de tres semanas para ratones dKO no tratados) y una demora o en alguna medida inhibición del fenotipo de envejecimiento prematuro.

Para obtener ratones doble mutantes CSB/XPA se realizó el siguiente cruzamiento:

(M) CSB^{-/-}XPA^{+/-} x (F) CSB^{-/-}XPA^{+/-}

(M) CSB^{-/-}XPA^{+/-} x (F) CSB^{-/-}XPA^{+/-}

(M) CSB^{-/-}XPA^{+/-} x (F) CSB^{-/-}XPA^{+/-}

(M) CSB^{-/-}XPA^{+/-} x (F) CSB^{-/-}XPA^{+/-}

De estos cruces nacieron ratones CSB^{-l-}XPA^{-l-} con una frecuencia del 9%, mientras que la frecuencia Mendeliana esperada es del 25%.

16 hembras embarazadas recibieron una bomba osmótica, 7 x 30 mm, implantada de manera subcutánea bajo la piel sobre la espalda, para liberación continua de solución Salina de Búfer de Fosfato (control) o 5% manitol D disuelto en solución Salina de Búfer de Fosfato. Los hijos fueron clasificados según genotipo siguiendo procedimientos normales (corte de cola y análisis genómico de ADN mediante análisis Southern blot o amplificación PCR) y monitoreados durante su lapso de vida.

Las Figura 9A y 9B muestran el incremento en frecuencia de crecimiento de los ratones XPA/CSB doble KO después de tratamiento con limpiador hidroxilo manitol D (experimento 1) y el incremento en supervivencia después del nacimiento (lapso de vida) respectivamente. Se obtuvieron resultados comparables en experimentos en los cuales se administró 2% manitol D al agua para beber. Los resultados comparables se obtuvieron con otro limpiador: proline, el cual fue igualmente efectivo en el incremento de la frecuencia de supervivencia de los cachorros dKO después del nacimiento.

Por tanto el manitol y el proline pueden utilizarse para la producción de un medicamento para el tratamiento de las consecuencias del envejecimiento y/o trastornos de mantenimiento del genoma. Es más, el manitol o el proline pueden utilizarse para la producción de un medicamento para el tratamiento de las consecuencias de la isquemia, y daño de reperfusión a órganos (trasplantados) y tejidos. El medicamento puede comprender también composiciones alimenticias con niveles elevados de manitol, proline y otros antioxidantes o limpiadores de radicales.

Este experimento ilustra el uso del método de identificación de compuestos según la presente invención el cual usa modelos animales que comprenden mutaciones en genes NER y con capacidad limitada de mantenimiento del genoma, produciendo preferiblemente un fenotipo de envejecimiento prematuro e identifica positivamente compuestos capaces de inhibir, prevenir, o retrasar fenotipos de envejecimiento prematuro.

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Ejemplo 5 Generación de un ratón mutante condicional Xpa^{condicional/nulo}

El ejemplo 2 describe una caracterización fenotípica detallada de un modelo de ratón Xpa^{condicional/nulo}, incluyendo análisis de trascriptoma de hígado, el cual ha aportado nuevas revelaciones con respecto a como un defecto de reparación del ADN afecta el eje IGF/GH e induce una respuesta sistémica que también ocurre durante el envejecimiento natural. Estos animales proporcionan un buen modelo para la rápida identificación de compuestos. A la vez, los genes de noqueo en un tejido específico, harán posible el estudio de los efectos de compuestos en patologías de tejidos relacionadas con el envejecimiento. Aquí, describimos la generación de un ratón Xpa condicional que permite (mediado por Cre recombinasa) la inactivación de tejido y tiempo en específico del gen Xpa.

Para noquear el gen Xpa en una manera dependiente del tiempo y/o de tejido específico, hemos generado un constructo objetivo (Fig. 11A) en el cual el exón 4 se funde del ADNc del ratón (incluyendo una secuencia sintética poliA), seguido de un marcador elegible de higromicina (HYGRO) (Fig. 11A). Los sitios LxP se introdujeron en el exón 3 y en sentido descendente del marcador Hygro para permitar la escisión Cre-mediada del ADNc y del marcador elegible, que llevó finalmente a un alelo Xpa que carece del exón 4. Para poder visualizar la inactivación del alelo Xpa condicional, insertamos un gen marcador de fusión LacZ-GFP, precedido de un aceptor de empale (SA) y una secuencia interna de entrada de ribosoma (IRES) para permitir trascripción y traslación del marcador. Una inserción de marco de lectura múltiple (Murfi), que contiene codones de detención en tres marcos de lectura y colocado entre el SA e IRES, evita cualquier traslación de trascriptos potenciales de traspaso de lectura del gen marcador Hygro.

Primero, trasfectamos las células ES de noqueo del Xpa con el constructo condicional Xpa y obtuvimos clones ES con un noqueo y un alelo objetivo a una frecuencia objetivo del 20% (Fig 11). Las células Xpa^{-l-} ES son extremadamente sensibles a UV y como se muestra en la Fig. 11C, el reemplazo de un alelo de noqueo por un alelo condicional Xpa es capaz de restaurar la sensibilidad UV a niveles de tipo natural (wt), proporcionando funcionalidad del constructo condicional XPA. A continuación, trasfectamos células Xpa^{cl+} ES con un plásmido que contenía una Cre recombinasa. El análisis Southern blot de clones individuales reveló que, la Cre recombinasa es capaz de extirpar las secuencias Xpa purgadas (Fig 11D). Finalmente, trasfectamos la línea ES IB 10 con el constructo condicional Xpa y se obtuvieron células ES Xpa^{cl+} heterocigóticas a una frecuencia del 17% (Fig. 11E). Después de excluir anormalidades cromosómicas e integraciones aleatorias adicionales (datos no se muestran), se utilizaron dos clones de células Xpa^{cl+} ES diferentes para inyecciones de blastocistos. La transmisión de la línea de germen se obtuvo para ambos clones. El vástago heterocigótico (Xpa^{cl+}) de apareamientos entre machos quiméricos y ratones hembras C57BL/6 se utilizó para cruzamientos posteriores.

Cruzamos ratones Xpa^{cl+} con la línea de ratones CagCre, la cual expresa Cre recombinasa inmediatamente después de la concepción (1). El análisis Southern blot de ADN de embriones E10.5 y 13.5 reveló que la Cre recombinasa había reorganizado de manera eficiente y extirpado los Xpa de ADN purgados (Fig. 12A). Cuando la Cre recombinasa extirpa el XPA de ADN purgado, debemos ser capaces de detectar la expresión del marcador LacX. Los embriones Xpa^{cr/c}, Xpa^{cr/cr}, Xpa^{cl-} y Xpa^{+/-} aislados se sometieron a teñido LacZ. Como se esperaba, ambos embriones Xpa^{cr/c}, Xpa^{cr/cr}, mostraron tinte LacZ, mientras que ambos Xpa^{cl-} y Xpa^{+/-} no lo hicieron (Fig. 12C). Debe señalarse, sin embargo, que la expresión no era muy elevada. Pero, como el LacZ se expresa bajo el promotor endógeno del gen XPA y el propio XPA no está normalmente muy altamente expresado (2), no esperábamos que la expresión fuera extremadamente elevada. Estos resultados muestran que la Cre recombinasa es capaz de recombinar la pieza purgada de XPA de ADN, después de lo cual se expresa el marcador LacZ.

Entrecruzamos Csb^{+/m} Xpa^{+/-} con Xpa^{c/t}, de manera que después de múltiples cruzamientos se generaran los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-} (Figura 12A). En contraste a ratones Csb^{m/m}Xpa^{-/-}, estos animales eran viables y se desarrollaron normalmente, sin ningún fenotipo aberrante. El ratón Csb^{m/m} Xpa^{cl-} más viejo tiene ahora 121 semanas de edad. Estos resultados prueban que el constructo condicional XPA es también funcional in vivo. De los cruzamientos comparables antes descritos, aislamos blastocistos wt y Xpa^{cr/-} ES. Aún utilizando un microscopio confocal, no pudimos detectar ninguna señal GfP sobre niveles wt (datos no se muestran). Adicionalmente, aislamos tres líneas de células MEF Xpa^{cr/-} y wt de embriones de 13,5 días. Estos MEFs se sometieron a análisis FAKS y aquí también no fuimos capaces de detectar señal GFP (datos no se muestran). Realizamos teñido con LacZ en las mismas líneas de células, lo que mostró que aún cuando había una total recombinación de alelo condicional XPA, pudimos detectar solo alrededor del 10% de células positivas LacZ (Figura 12D). Estos resultados de conjunto muestran que hay expresión del marcador de fusión LacZGFP, pero no a niveles muy elevados y por tanto es difícil de detectar. Los Xpa^{cr/r} debían ser sensibles a UV, ya que son noqueo de XPA. Tres líneas independientes MEF Xpa^{cr/-} se mostraron muy sensibles a UV al compararlas con tres líneas independientes MEF wt (figura 12E). Los niveles de sensibilidad de las células Xpa^{cr/-} son similares a la sensibilidad a UV previamente mostrada en MEFs Xpa^{-/-}.

Uno de los chequeos finales, más importantes, fue la determinación de si los alelos recombinados dan lugar a un fenotipo de noqueo funcional en el ratón. Examinamos esto cruzando el ratón Xpa^{cr/r} en un entorno deficiente CSB. Como se mencionó en el ejemplo 2 los ratones Csb^{m/m} Xpa^{-l-} son enanos, incapaces de prosperar y mueren a las tres semanas. Los animales Csb^{m/m} Xpa^{crl-} deben tener exactamente el mismo fenotipo. Al realizar el genotipo confirmamos el estatus XPA de cada animal deficiente CSB (figura 13A). Como se predijo, los animales Csb^{m/m} Xpa^{crl-} tenían exactamente el mismo fenotipo que los animales Csb^{m/m} Xpa^{-l-} (Figura 13B). Registramos el peso, analizamos el patrón del andar y determinamos su lapso de vida. En cada uno de estos aspectos los ratones Csb^{m/m} Xpa^{crl-} eran iguales a los ratones Csb^{m/m} Xpa^{-l-} previamente observados (datos no se muestran), lo cual prueba que el alelo recombinado XPA da lugar a un alelo de noqueo funcional XPA in vivo.

Referencias para el ejemplo 5

1. Sakai, K. and J. Miyazaki (1997). "A transgenic mouse line that retains Cre recombinase activity in mature oocytes irrespective of the cre transgene transmission". Biochem Biophys Res Commun 237(2): 318-24.

2. Layher, S. K. and J. E. Cleaver (1997). "Quantification of XPA gene expression levels in human and mouse cell lines by competitive RT-PCR" Mutat Res 383(1): 9-19.

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Ejemplo 6 Fenotipo neurológico de un ratón doble mutante condicional cerebro específico Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo}

Como se muestra en el ejemplo 5, hemos generado un ratón XPA condicional. Combinando este ratón con el ratón de Cre recombinasa apropiada, podemos noquear el gen XPA en una forma dependiente del tiempo y de tejido específico. Previamente, Murai y colaboradores habían observado apoptosis incrementada en el cerebelo coincidiendo con la ataxia observada en estos animales. Es más, nuestro análisis de trascriptoma de hígados de 15 días de Csb^{m/m} Xpa^{cl-} reveló una respuesta sistémica, involucrando el eje IGF-1/GHR, el cual involucra al hipotálamo, que imitaba cercanamente el envejecimiento. Adicionalmente, habíamos encontrado apoptosis incrementada en la retina de estos animales. Por tanto, el tejido del cerebro es un candidato perfecto para el estudio.

Utilizamos ratones que expresaban la recombinasa CamKll\alpha-Cre (cortesía de S. Zeitlin). Esta Cre recombinasa está bajo el control del promotor CamKll\alpha y la línea transgénica que recibimos, L7ag#13m expresaba la Cre recombinasa a lo largo del cerebro adulto con niveles elevados en todas las estructuras del cerebro anterior y niveles moderados en el cerebelo (1). Los niveles más elevados de recombinación se detectaron después de 5 días de nacidos. Intercruzamos estos animales Cre recombinasa con animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-} para obtener animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+. Pesamos los animales cada mes conjuntamente con compañeros de camada Wt, Csb^{m/m} y Xpa^{cl--}-CamKllCre+. Inicialmente, los animales eran de tamaño y peso corporal normal (Figura 14A). Sin embargo, a los 6 meses, notamos una diferencia en el peso corporal entre los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ comparados con los compañeros de camada, lo que se hizo mas evidente a los 8 meses (figura 14B). Se conoce que los animales Csb^{m/m} tienen un peso corporal inferior que los animales Wt desde las 13 semanas de edad. Sin embargo, el peso de los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ era aún más bajo que el de los animales Csb^{m/m} mayores de 8 meses. Al principio habíamos hecho también análisis de pisadas al igual que en el caso de ratones Csb^{m/m} Xpa^{-l-} pero estos no revelaron anormalidades obvias. Sin embargo, observamos que durante la manipulación de los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+, ellos mostraban comportamiento de tipo ansioso. Para explorar esto aún más, los examinamos durante 30 minutos en un campo abierto conjuntamente con compañeros de camada Wt, Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}-CamKllCre+ a los tres y seis meses de edad, n:6. El ploteo de movimiento, derivado mediante la computadora después de 30 minutos en el campo abierto, muestra ya claramente que los Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ se mueven mucho menos en el centro. Calculamos la proporción de ansiedad (AR) dividiendo la distancia de demora en el centro entre la distancia total. El tiempo de movimiento era el mismo para cada ratón. Un AR bajo es indicativo de comportamiento de tipo ansioso. El AR de los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ fue mucho más lento que el de los grupos de control a los tres meses de edad (p<0,05) y se hizo aún más bajo a los seis meses de edad p<0,001) (Figura 14C). Esto de hecho muestra que los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ muestran un comportamiento de tipo ansioso que empeora con el tiempo. Para relacionar este fenotipo de tipo ansioso a una región específica del cerebro, teñimos los cerebros de animales, Wt, Csb^{m/m}, Xpa^{cl-}-CamKllCre+ y Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ para LacZ, ya que el marcador LacZ se expresa después de recombinación del gen XPA. Como se esperaba, solo observamos teñido en los cerebros de animales Xpa^{cl-}-CamKllCre+ y Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ (figura 14D) y no en los animales Wt, Csb^{m/m} (datos no se muestran). Este teñido se restringió puramente al Septum Lateral (LS) que está situado cerca del hipocampo y que tiene un papel en el comportamiento de tipo ansioso. Es más, el teñido pareció menor en los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ y el LS fue muy irregular, como si no hubiera células.

Repetimos el examen de Campo Abierto a una edad de 30-50 semanas y el AR se mantenía bajo como se esperaba (datos no se muestran) para la mayoría de los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+. Sin embargo tres de los animales más viejos Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ (alrededor de 15 meses) mostraban una motilidad general reducida y un comportamiento parecido a convulsiones. Aún más sorprendente, parecía que tenían priapismo (Fig 14E) y el lapso de vida máximo de estos animales se redujo a unos 16 meses. Actualmente seguimos a los animales Csb^{m/m} Xpa^{cl-}-CamKllCre+ en el tiempo y registramos el comportamiento aberrante y el lapso de vida.

Referencias para el ejemplo 6

1. Dragatsis, I. and S. Zeitlin (2000). "CaMKIIalpha-Cre transgene expression and recombination patterns in the mouse brain". Genesis 26(2): 133-5.

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Ejemplo 7 Validez del ratón TTD como un modelo para envejecimiento acelerado de hueso

La pérdida ósea relacionada con la edad en la población humana está bien documentada en mujeres postmenopáusicas, pérdida acelerada de hueso predominantemente trabeculado, debido a número incrementado y actividad de oestoclastos, seguida de una fase lenta continua de pérdida ósea en la cual la densidad del hueso trabeculado se reduce y el hueso cordial se afina, llevando a un riesgo incrementado de fractura (1-3). En los hombres la pérdida ósea asociada a la edad también está presente pero es menos pronunciada ya que la caída de los niveles de estrógenos responsables de la rápida pérdida ósea en las mujeres está ausente. Adicionalmente, los hombres tienen aposición perióstea más pronunciada, i. e. la formación ósea en la parte externa del hueso (periostio) (4)

La tricotiodistrofia (TTD) es un trastorno de reparación del ADN poco común, autosomático, recesivo, en el cual los pacientes presentan un conjunto de síntomas, incluyendo fotosensibilidad, ictiosis, uñas y pelo quebradizo, limitaciones a la inteligencia, fertilidad disminuida, baja estatura y apariencia envejecida y un lapso de vida reducido (5-7). Adicionalmente se han descrito las anormalidades del esqueleto, como osteopenia conjuntamente con osteosclerosis en el esqueleto axial y extremidades proximales y también osteosclerosis axial y craneana y desmineralización en los huesos distales (6, 8-15). Hemos generado un modelo de ratón en el cual hemos imitado una mutación de punto causante identificada en el gen XPD de un paciente TTD fotosensible (TTD1 Bel) (16). El trabajo previo ha mostrado que el fenotipo de ratón TTD se asemeja mucho a los síntomas de los pacientes, incluyendo la presencia de características de envejecimiento prematura como cambio esquelético es (17). Cuando se cruza un ratón XPA completamente NER deficiente (que no muestra características de envejecimiento prematuro en sí mismo), las características de envejecimiento prematuro del ratón TTD mejoran dramáticamente.

Estudiamos los cambios en huesos con el envejecimiento tanto en ratones de tipo natural machos como hembras y el envejecimiento prematuro en ratones TTD para ganar en claridad con respecto a lo procesos de los cambios esqueléticos relacionados con el envejecimiento y para evaluar aquí el significado de reparación de ADN/trascripción basal. Este análisis detallado mostró que el modelo de ratón TTD es un muy buen modelo para estudiar osteoporosis.

Primero, el análisis cortical de hueso en ratones hembra de tipo natural reveló una declinación progresiva en la distribución de grosor 3D con la edad. Comparablemente, los ratones machos de tipo natural mostraron una disminución en la distribución de grosor 3D con la edad. Ya a las 52 semanas, las hembras TTD alcanzaron el nivel que las hembras de tipo natural solo alcanzaban a las 91 semanas. A las 52 semanas de edad, la tibia de machos TTD había adelgazado aún más que la tibia de machos de tipo natural de 91 semanas. Por tanto, el adelgazamiento cortical ocurre más tempranamente en ratones TTD que en ratones de tipo natural (Fig. 15).

Segundo, en hembras de tipo natural el volumen del hueso diafisial disminuyó gradualmente con la edad, alcanzando significación solo a las 104 semanas de edad al compararlo con ratones hembra de tipo natural de 26 semanas. En hembras TTD, después de 39 semanas el volumen óseo disminuyó rápidamente y era significativamente menor que los ratones de tipo natural de igual edad. Ya a las 52 semanas de edad las hembras TTD alcanzaron un volumen óseo similar al de las hembras de tipo natural de 91 y 104 semanas. En línea con el volumen óseo, la tibia de hembras de tipo natural mantuvo su grosor cortical hasta las 78 semanas y mostró una disminución de ahí en adelante mientras que la tibia de hembras TTD ya mostraba una rápida caída en grosor cortical después de 39 semanas. El volumen óseo en ratones machos de tipo natural mostró una clara caída después de 39 semanas de edad. De las 52 semanas en adelante el volumen óseo se mantuvo estable en ratones de tipo natural. A diferencia de las hembras, los machos de tipo natural no mostraron una disminución significativa en grosor cortical con el envejecimiento. Al igual que en animales de tipo natural, el grosor cordial fue inferior en ratones TTD entre 26 a 39 semanas de edad con respecto a las hembras TTD de igual edad. Con el envejecimiento, los machos TTD mostraron un patrón similar en volumen óseo y cambios en el grosor cortical con respecto a machos de tipo natural no obstante que tuvieran valores significativamente inferiores que los de tipo natural a las 78 semanas de edad (Fig. 16 A-D).

Tercero, las hembras de tipo natural mostraron un incremento progresivo en perímetro óseo a través de la vida que alcanza significación a las 91 y 104 semanas de edad en comparación con hembras de 26 semanas. En contraste, las hembras TTD carecían de este incremento en perímetro mostrando un perímetro constante en todas las edades. Después de 39 semanas el perímetro disminuyó tanto en ratones de tipo natural como TTD, pero solo los machos de tipo natural mostraron un incremento en perímetro en la vejez (Fig 16 E+F).

Tomado de conjunto, el ratón TTD es un modelo valioso de ratón para estudiar compuestos que pueden contrarrestar la osteoporosis. Aún más, como el doble mutante TTD/XPA tiene un fenotipo TTD acelerado, la supresión óseo específica del gen XPA en el ratón TTD resultará en osteoporosis acelerada, la cual puede ser contrarrestada mediante intervención química. Con este objetivo, hemos generado un modelo de ratón XPA condicional (XPAc) (para detalles, ver ejemplo 6). Cruzando este con ratón Cre recombinasa de tejido específico, podemos noquear el gen XPA en nuestro tejido de interés, después de lo cual un marcador LaczGFP se expresa para mostrar donde ha ocurrido la recombinación. Para estudiar la osteoporosis acelerada en ratones TTD/XPAc, los cruzaremos con ratones Cre osteoblasto específicos, en los cuales Cre está bajo el control del promotor colágeno la1 (18), o ratones Cre osteoclasto específicos, en los cuales Cre está bajo el control del promotor catepsina K (19). Adicionalmente quisiéramos utilizar el Cre condrocito específico, bajo control del promotor Co12a1 (20), expresado en el cartílago y grasa específica de ratones Cre, con Cre bajo el control del promotor aP2 (21), expresado en tejido adiposo blanco y carmelita. Juntos estos modelos de ratón nos ayudarán a ganar mayor claridad con respecto al mecanismo de la osteoporosis y brindarán métodos más rápidos de identificación para la medicina de la osteoporosis.

Referencias para el ejemplo 6

1. Riggs, B.L., S. Khosla, and L.J. Melton, 3rd, Sex steroids and the construction and conservation of the adult skeleton. Endocr Rev, 2002. 23(3): p. 279-302.

2. Seeman, E., Pathogenesis of bone fragility in women and men. Lancet, 2002. 359(9320): p. 1841-50.

3. Kawaguchi, H., et al., Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia. J Clin Invest, 1999. 104(3): p. 229-37.

4. Seeman, E., During aging, men lose less bone than women because they gain more periosteal bone, not because they resorb less endosteal bone. Calcif Tissue Int, 2001. 69(4): p. 205-8.

5. Bootsma, D., et al., Nucleotide excision repair syndromes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, in The genetic basis of human cancer, B. Vogelstein and K.W. Kinzler, Editors. 1998, McGraw-Hill: New York. p. 245-74.

6. Itin, P.H., A. Sarasin, and M.R. Pittelkow, Trichothiodystrophy: update on the sulfur-deficient brittle hair syndromes. J Am Acad Dermatol, 2001. 44(6): p. 891-920; quiz 921-4.

7. Botta, E., et al., Analysis of mutations in the XPD gene in Italian patients with trichothiodystrophy: site of mutation correlates with repair deficiency, but gene dosage appears to determine clinical severity. Am J Hum Genet, 1998. 63(4): p. 1036-48.

8. Wakeling, E.L., et al., Central osteosclerosis with trichothiodystrophy. Pediatr Radiol, 2004. 34(7): p. 541-6.

9. Toelle, S.P., E. Valsangiacomo, and E. Boltshauser, Trichothiodystrophy with severe cardiac and neurological involvement in two sisters. Eur J Pediatr, 2001. 160(12): p. 728-31.

10. Kousseff, B.G. and N.B. Esterly, Trichothiodystrophy, IBIDS syndrome or Tay syndrome? Birth Defects Orig Artic Ser, 1988. 24(2): p. 169-81.

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12. Civitelli, R., et al., Central osteosclerosis with ectodermal dysplasia: clinical, laboratory, radiologic, and histopathologic characterization with review of the literature. J Bone Miner Res, 1989. 4(6): p. 863-75.

13. Chapman, S., The trichothiodystrophy syndrome of Pollitt. Pediatr Radiol, 1988. 18(2): p. 154-6.

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16. de Boer, J., et al., A mouse model for the basal transcription/DNA repair syndrome trichothiodystrophy. Mol Cell, 1998. 1(7): p. 981-90.

17. de Boer, J., et al., Premature aging in mice deficient in DNA repair and transcription. Science, 2002. 296(5571): p. 1276-9.

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Ejemplo 8 Pérdida incrementada de fotorreceptor en el ratón Csb después de exposición a radiación ionizante

Como se muestra en el ejemplo 3, los ratones Csb^{m/m} tienen una pérdida asociada a la edad de células fotorreceptoras en la retina. Para examinar si el daño oxidante del ADN pudiera estar involucrado en la degeneración de la retina en ratones Csb^{m/m}, examinamos la sensibilidad IR que se conoce induce daño del ADN de varios tipos, incluyendo daño oxidante del ADN, en la retina de ratones Csb^{m/m}.

Realizamos irradiaciones de rayos gamma en todo el cuerpo a una dosis baja (10 Gy) y medimos los efectos contando las células apópticas en secciones teñidas mediante ensayos de apoptosis. Los efectos de irradiación sobre la apoptosis en la retina de ratones Csb^{m/m} y wt se resumen en la Tabla 1. En la retina de tipo natural los niveles de apoptosis eran bajos y no se notó incremento significativo después de la irradiación. En la retina de animales Csb^{m/m} la apoptosis en ONL e INL incrementó debido a la irradiación, indicando que estas células de la retina en ratones Csb^{m/m} son hipersensibles a la radiación ionizante. Los resultados en el ejemplo 3 y 9 muestran que la retina de ratones Csb^{m/m} es un sistema sensible de lectura para daño oxidante del ADN. Esto hace posible el estudio del efecto de la intervención en pérdida de fotorreceptor en la retina de ratones Csb^{m/m} tanto con o sin exposición a radiación ionizante. Como se mencionó en el ejemplo 4, los ratones doble mutantes CSB/XPA tienen pérdida acelerada de células fotorreceptoras, un fenotipo de envejecimiento prematuro, que indica que la retina de estos ratones proporciona un buen órgano modelo para estudiar el efecto de intervención capaz de prevenir o retrasar fenotipos de envejecimiento
prematuro.

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TABLA 1 Efecto de genotipo e irradiación en apoptosis en la retina

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Ejemplo 9 Similitud de envejecimiento acelerado en ratones mutantes Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} y Ercc1^{-l-} y envejecimiento natural

Se ha propuesto que, para mostrar si un mutante de ratón representa un modelo válido para el envejecimiento, uno debe listar esas características fenotípicas compartidas por el mutante y el ratón envejecido naturalmente o en su defecto determinar un conjunto de rasgos y determinar cuantos de estos también pueden verse en el ratón mutante (1). Aunque, los ratones de vida extremadamente breve muestran un número de características relacionadas con la edad, buscamos implementar un enfoque del genoma completo de ratón para ganar en claridad sin distorsión sobre su relevancia con respecto a ratones de envejecimiento natural:

Modelo de ratón Csb^{m/m/}Xpa^{-l-}

Para investigar si y en que medida los cambios en perfiles de expresión en el hígado de ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} se asemejan a los patrones de expresión en ratones de envejecimiento natural, clasificamos todos los cambios de expresión relevantes (aquellos conjuntos de probeta que representan los 1865 genes) que hayan tenido expresión incrementada o disminuida. A continuación pesamos este conjunto de datos contra conjuntos de datos obtenidos de una comparación del trascriptoma del genoma completo de ratón de 16, 96 y 130 semanas de edad de ratones wtC57B1/6 (n=4) con el de ratones wtCt7B1/6 de 8 semanas (n=4). Este enfoque asignaba un coeficiente de correlación (Pearson's r) directamente proporcional a la fracción de genes en el animal wt de 16, 96 y 130 semanas de edad que cambia en una dirección similar a la de los ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-}. De notar, no pudo identificarse similitud entre la reparación de ADN del ratón mutante y el ratón wt de 16 semanas (Pearson's r = \cdot0,26). De manera importante identificamos una correlación positiva entre ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} y ratones de 96 semanas (r = 0,15), que estaba sustancialmente pronunciada más allá cuando se hacía la comparación con el grupo de ratones wt de 130 semanas (r=0,40, ver intercalado Fig. 17). De manera importante, estos hallazgos eran equivalentes cuando aplicábamos el mismo enfoque a todo el trascriptoma del ratón incluyendo todos los conjuntos de probeta Affymetrix con señales por encima del valor de corte de detección, evitando por tanto cualquier preselección inicial o introducción de sesgo. Un cálculo de la probabilidad de observar una correlación aleatoria tan fuerte como la encontrada en el conjunto de datos actuales excluía la posibilidad de que la similitud observada entre ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} y ratones wt de 96 y 130 semanas fueran eventos aleatorios (texto exacto de Fisher p\leq 0,015).

La marcada similitud general entre el trascriptoma de hígados Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} de 15 días y de hígados wt de 130 días, nos llevó a examinar si los procesos biológicos previamente identificados estadísticamente significativos sobre representados en el hígado de ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} eran compartidos también por ratones con envejecimiento natural. Este enfoque nos llevó a identificar un alto grado de similitud asombroso entre los ratones de corta vida, deficientes en reparación de ADN y los ratones de 130 semanas en los perfiles trascriptivos de aquellos genes asociados con el eje GH/IGF, el metabolismo oxidante (i. e. glicólisis, fosforilación Krebs y antioxidante), el transporte de electrón del citocroma P450 y la biogénesis peroxismal (Tabla 1). De manera importante, sin embargo, la humectación de ambos el eje somatótrofo y el metabolismo oxidante era más pronunciada (en términos del número de genes identificados, Suppl Tabla S4) en ratones de 130 semanas que en los ratones de 96 semanas y ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-}, mientras que estaba virtualmente ausente en ratones de 16 semanas. La marcada similitud del trascriptoma a nivel de todo el genoma de ratones Csb^{m/m/}Xpa^{-l-} de 2 semanas en comparación con viejos (>90 semanas) en lugar de con jóvenes (8 semanas) en animales wt así como la temprana aparición de una respuesta trascriptiva asociada con el envejecimiento normal apunta sin lugar a dudas al envejecimiento prematuro en el modelo de ratón Csb^{m/m/}Xpa^{-l-}.

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TABLA 1 Análisis de trascriptoma de hígado Csb_{m/m/}Xpa_{-l-}. Cambios significativos de expresión de gen identificados en los hígados de ratones Csb_{m/m/}Xpa_{-l-}, Csb_{m/m/} y Xpa_{-l-} en comparación con hígados de compañeros de camada wt de control

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Modelo ratón Ercc1^{-l-}

Aunque el paciente XFE (ver ejemplo) y el modelo de ratón Ercc1^{-l-} mostraron signos claros de envejecimiento prematuro en una conjunto distinto de tejidos, quisimos determinar la magnitud de los paralelos con envejecimiento normal. El cambio en la totalidad del genoma en expresión observado en ratones Ercc1^{-l-} ofrece una lectura amplia para identificar cambios fisiológicos y aporta una plataforma poderosa para comparar con cambios de expresión en la totalidad del genoma en envejecimiento normal. Los experimentos de biochip de ADNc y Affymetrix iniciales indicaban un solapamiento sustancial entre las respuestas trascriptivas de ratones Ercc1^{-l-} de 20 días de nacidos (no moribundos) y ratones wt de dos años de edad (Tablas 2 y 3). Para confirmar, así como para extender estos hallazgos a lo largo de la plataforma Affymetrix de trascriptoma total de ratón, primero clasificamos el conjunto previamente identificado de 1675 genes como que habían incrementado o disminuido cambio de expresión relativo a los controles wt y los comparamos con los obtenidos cuando los hígados de ratones de 4 meses y 2,7 años se contrastaban contra los de adultos jóvenes de control de dos meses de edad (n=4). Este enfoque asignaba un coeficiente de correlación (Pearson's) que era proporcional al porcentaje de genes con el mismo cambio de dirección de expresión entre los Ercc1^{-l-}, los ratones de 4 meses y los de 2,7 años de edad. Sorprendentemente, este análisis reveló que los ratones Ercc1^{-l-} comparten un grado sorprendente de correlación con los ratones de 2,7 años pero no con los de 4 meses (Pearson's r. 0,32 vs. 0,003 p\leq0,05) demostrando que, a pesar de la dramática diferencia en edad y entorno genético, hay fuertes paralelos entre la progeria causada por la deficiencia en XPF-ERCC1 y el envejecimiento natural al nivel fundamental de expresión de genes (Fig. 18E). Aún más, la correlación en los perfiles trascripcionales de ratones Ercc1^{-l-} y naturalmente envejecidos era aún más pronunciada cuando el mismo enfoque se restringía a aquellos temas biológicos previamente identificados como significativamente sobre representados en el hígado de ratón Ercc1^{-l-} (Tabla 4) demostrando la comunalidad de las respuestas identificadas entre progeria Ercc1^{-l-} y el proceso de envejecimiento natural a nivel de los cambios de expresión en la totalidad del genoma.

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TABLA 2 Genes identificados como expresados diferencialmente de manera significativa en hígado de ratón Ercc1^{-l-} deficiente comparado con compañeros de camada wt de control, utilizando una comparación apareada de animal único. Los genes resaltados con un # se encontró que eran expresados diferencialmente de manera similar cuando se comparaba el hígado de ratón Ercc1^{-l-} con compañeros de camada de control utilizando muestras combinadas que representaban múltiples animales

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TABLA 3 Perfil de expresión de gen de ARN de hígado de ratón envejecido. La tabla indica la identidad de genes expresados diferencialmente de manera significativa en hígado de ratón wt envejecido (26 meses) comparado con hígado de ratón wt joven (6 meses) en un entorno C57B1/6. El experimento incluyó una comparación apareada de 6 animales de cada grupo de edades. Se indican los nombres de los genes, su número de acceso al banco de datos de genes y la diferencia en número de veces en expresión. Los genes resaltados con un # estaban expresados diferencialmente de manera similar en hígado de ratón Ercc1^{-l-} de tres semanas comparado con compañeros de camada wt. Los genes resaltados con ** también estaban expresados diferencialmente en hígado de ratón Ercc1^{-l-} de tres semanas, pero en la dirección opuesta

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Para confirmar las respuestas biológicas más importantes predichas a partir del análisis de biochip a compartir por envejecimiento natural y progeria XFE, utilizamos inmunodetección para comparar hígado de ratón Ercc1^{-l-} con el de compañeros de camada wt jóvenes (21 días de nacidos) y ratones envejecidos. Los niveles de IGFBP1 eran extremadamente elevados en el hígado de ratones Ercc1^{-l-} de 21 días y en los de los ratones envejecidos, (Fig 18F). La fracción de células proliferantes se redujo dramáticamente en hígado de ratón wt envejecido relativo a ratones jóvenes wt, similar al hígado de ratón Ercc1^{-l-} (Fig. 18B). Los hepatocitos con núcleos poliploides, una característica de hígado envejecido (2), eran comunes tanto en los Ercc1^{-l-} como en el ratón envejecido (Fig. 18B). Había una acumulación incrementada de triglicéridos en el hígado envejecido, demostrando almacenamiento de energía en lugar de utilización, como se vió en el hígado de ratón Ercc1^{-l-} (Fig. 18D). Finalmente, las células apópticas eran marcadamente elevadas en el hígado de ratón Ercc1^{-l-} comparado con compañeros de camada wt, y modestamente elevadas en hígado envejecido (Fig. 18G). Estos datos validan los resultados de biochip y enfatizan los fuertes paralelos fisiológicos y patológicos entre progreria XFE y el proceso de envejecimiento natural.

Comparación de modelos animales Ercc1^{-l-} y Csb^{m/m}/Xpa^{-l-}

Los animales Ercc1^{-l-} y Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} representan distintos modelos de ratón deficientes en reparación de ADN con un amplio espectro de características progeroides parcialmente solapadas así como distintas. Para examinar si, y en que medida, los paralelos fenotípicos y diferencias también se reflejan al nivel fundamental de expresión del gen, aplicamos el mismo enfoque que antes y comparamos el conjunto previamente identificado de 1675 genes expresados diferencialmente con los de ratones Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} obtenidos de la misma manera (manuscrito acompañante). Este enfoque reveló que los ratones Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} demostraron una similitud significativamente mayor con los ratones Ercc1^{-l-} (Pearson's r. 0,65, p<0,05, Fig. 18H y Tabla 5) que con mutantes sencillos Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} (Pearson's r. 0,26 y 0,31 respectivamente, Fig. 18H). Importantemente estos hallazgos eran también equivalentes cuando se comparó el trascriptoma total de ratón de ratones Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} con el de Ercc1^{-l-} (Pearson's r. 0,43, p<0,05), los compañeros de camada mutantes sencillos Csb^{m/m} o Xpa^{-l-} (Pearson's r: 0,29 y 0,30 respectivamente) a pesar de la diferencia en entorno genético (Ct7B1/6 puro, versus F1 híbrido con FVB) demostrando la uniformidad y significación fisiológica de la respuesta a daño no reparado en el ADN.

Aunque hubo paralelo significativos entre los perfiles de expresión de ratones de 15 días Ercc1^{-l-} y Csb^{m/m}/Xpa^{-l-} también hubo diferencias cuantitativas y cualitativas; por ejemplo los genes de sobre regulación prominente pro apóptica y la sub regulación de inhibidores de apoptosis en el perfil de expresión de hígado Ercc1^{-l-}, la sobre regulación robusta del IGFBP1, la cual es fuertemente inducida en modelos de roedores expuestos al agente de vinculación cruzada cisplatino (Fig. 18F; (3)) y la sobre regulación específica de genes de reparación del ADN (e. g. Rad51).

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TABLA 4

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TABLA 5

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1. R A. Miller, Science 310, 44 (21 october, 2005).

2. S. Gupta, Semin Cancer Biol 10, 161 (Jun, 2000)

3. Q. Huang et al., Toxicol Sci 63, 196 (2001).

Claims (6)

1. Un método para la selección de un compuesto, o una mezcla de compuestos, comprendiendo dicho método los pasos de:

-

proporcionar un ratón alterado genéticamente, donde dicho ratón tiene al menos una mutación en un gen que codifica una proteína de la ruta de Reparación de Escisión de Nucleótido (NER), provocando dicha mutación un fenotipo de envejecimiento prematuro en comparación con un ratón que carece de dicha mutación;

-

exponer dicho ratón alterado genéticamente, o una parte derivada de este, a un compuesto, o a una mezcla de compuestos;

-

determinar el efecto del compuesto, o la mezcla de compuestos, en el fenotipo de envejecimiento prematuro de dicho ratón alterado genéticamente; y

-

seleccionar el compuesto, o la mezcla de compuestos, que evita, inhibe, retrasa o reduce dicho fenotipo de envejecimiento prematuro en dicho ratón alterado genéticamente,

donde dicha mutación es en un gen seleccionado del grupo consistente en: Xpa, Xpb, Xpc, Xpd, Xpe, Xpf, Xpg, Xpv, Csa, Csb, Ttda, HR23A, HR23B y Ercc1, y donde dicho fenotipo de envejecimiento prematuro es un lapso de vida acortado, osteoporosis incrementada y/o degeneración incrementada de la retina en comparación con un ratón que carece de dicha mutación.

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2. El método según la reivindicación 1, donde dicha proteína es también parte de la ruta de Reparación de Trascripción Acoplada (TCR).

3. El método según la reivindicación 1, donde dicha mutación es equivalente o imita a un Síndrome Cockayne humano (CS), un Xeroderma pigmentosum (XP), un Xeroderma pigmentosum combinado con el Síndrome Cockayne (XPCS), tricodistrofia (TTD), un síndrome cerebro-óculo-facio-esquelético (COFS) o a un alelo que provoca síndrome XPF-ERCC1 en los genes Csa, Csb, Xpb, Xpd, Xpg, Xpf, Ttda o Ercc1.

4. El método según la reivindicación 3, donde el síndrome Cockayne humano, COFS o XPCS que provoca la mutación es seleccionado del grupo que consta de mutaciones asociadas al CS en; el gen humano Csa: Csa^{nulo/nulo}, Y322ter, el gen humano Csb: Csb^{nulo}, Q184ter, R453ter, W517ter, R670W, R735ter, G477ter, W851R, Q854ter, R947ter, P1042L, P1095R, R1213G, el gen humano Xpd: G602D, G675R, 669fs708ter, el gen humano Xpb: F99S, FS740, y para el gen humano Xpg: R263ter, 659ter.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho ratón alterado genéticamente tiene una mutación en al menos dos genes diferentes codificando cada uno una proteína de la ruta NER.

6. El método según la reivindicación 5, donde dicho ratón alterado genéticamente tiene una combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consta de: Csa^{nulo/nulo}/Xpa^{nulo/nulo}, Csa^{nulo/nulo}/Xpc^{nulo/nulo}, Csb^{G744ter/G744ter}/Xpa^{nulo/nulo}, Csb^{G744ter/G744ter}/Xpc^{nulo/nulo}, Xpd^{G602D/G602D}/Xpa^{nulo/nulo}, Xpd^{R722W/R722W}/Xpa^{nulo/nulo}, y Xpd^{G602D/R722W}/Xpa^{nulo/nulo}.