ES2344982T3 - Anticuerpos para identificacion y/o aislamiento de al menos una poblacion celular que se selecciona del grupo que comprende celulas troncales hematopoyeticas, c. troncales neuronales, c. precursoras neuronales, celulas troncales mesenquimatosas y c. precursoras mesenquimatosas. - Google Patents
Anticuerpos para identificacion y/o aislamiento de al menos una poblacion celular que se selecciona del grupo que comprende celulas troncales hematopoyeticas, c. troncales neuronales, c. precursoras neuronales, celulas troncales mesenquimatosas y c. precursoras mesenquimatosas. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal anti-CDCP1, o un fragmento del mismo, capaz de aislar y/o identificar al menos una población celular que se selecciona del grupo de células troncales hematopoyéticas, células troncales neuronales, células progenitoras neuronales, células troncales mesenquimatosas y células progenitoras mesenquimatosas, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento del mismo, se une a un antígeno que es el mismo que se une a un anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma CUB1 (DSM ACC2569), CUB2 (DSM ACC2566), CUB3 (DSM ACC2565) o CUB4 (DSM ACC2551).
Description
Anticuerpos para la identificación y/o
aislamiento de al menos una población celular que se selecciona del
grupo que comprende células troncales hematopoyéticas, células
troncales neuronales, células precursoras neuronales, células
troncales mesenquimatosas y células precursoras mesenquimatosas.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal anti-CDCP1, o a un fragmento del mismo,
para aislar y/o identificar al menos una población celular que se
selecciona del grupo que comprende células troncales
hematopoyéticas, células troncales neuronales, células precursoras
neuronales, células troncales mesenquimatosas y células precursoras
mesenquimatosas, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento
del mismo, se une a un antígeno que es el mismo al que se une un
anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma CUB1 (DSM
ACC2569), CUB2 (DSM ACC2566), CUB3 (DSM ACC2565) o CUB4 (DSM
ACC2551). La invención se refiere además a un anticuerpo monoclonal
anti-CDCP1, o a un fragmento del mismo,
caracterizado porque se une a la misma estructura antigénica a la
que se une un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma
CUB1 (DSM ACC2569), CUB2 (DSM ACC2566), CUB3 (DSM ACC2565) o CUB4
(DSM ACC2551), en donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de
aislar y/o identificar al menos una población celular que se
selecciona del grupo de células troncales hematopoyéticas, células
troncales neuronales, células progenitoras neuronales, células
troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas.
El término "célula troncal" significa, de
una manera general, cualquier célula que aún no se ha diferenciado
y que posee la capacidad tanto de producir descendientes idénticos
como de diferenciarse a líneas de desarrollo específico.
Las células troncales adultas tienen la función
de mantener la homeostasis del número de células en el tejido
correspondiente, es decir, de reemplazar las células que han muerto.
Por esta razón, las células troncales se encuentran particularmente
en tejidos que están sometidos a grandes agresiones. Se han
encontrado células troncales adultas en una gran variedad de
tejidos y órganos, tales como, por ejemplo, médula ósea, cerebro,
hígado, piel, intestino, córnea, etc.
En la médula ósea, las células troncales
hematopoyéticas producen nuevas células de forma continua ya que
estas últimas células se requieren constantemente en la sangre
debido al tiempo de vida limitado de la mayoría de las células.
El punto de partida para la formación de células
sanguíneas es la célula troncal pluripotente sin diferenciar, que
aún no está determinada para una función específica. Cuando las
células troncales se diferencian, en primer lugar se forman células
precursoras, que son incapaces de replicarse ellas mismas y sólo
producen un tipo de células especializado hasta la madurez. Ni la
célula troncal pluripotente ni las diferentes fases intermedias son
capaces de llenar las funciones hematopoyéticas específicas de
célula; son sólo las células que han madurado las que son capaces
de hacer esto. Las células progenitoras que han entrado en una vía
de diferenciación particular también se mantienen luego en esta vía
hasta que se alcanza la maduración (compromiso).
Además de las células troncales para células
hematopoyéticas, también están presentes en la médula ósea células
similares a células troncales que son progenitores de tejidos no
hematopoyéticos. Estos progenitores de tejidos no hematopoyéticos
se denominaron originalmente, entre otros, células adherentes a
plástico en cultivo celular y más recientemente se han denominado
bien células troncales mesenquimatosas o células de estroma de
médula ósea (MSC).
Estas células tienen interés no sólo debido a su
multipotencia con respecto a la diferenciación; también tienen
interés, por ejemplo, por su posible uso en terapia celular y
terapia génica.
El hecho de que, en ciertas condiciones, las
células troncales mesenquimatosas también se puedan diferenciar a
células nerviosas significa que, entre otros, hay una necesidad de
ser capaz de distinguir estas células troncales mesenquimatosas de
las células progenitoras neuronales.
Estas células progenitoras neuronales
(denominadas más adelante NPC) se encuentran en el sistema nervioso
central. También expresan nestina y son capaces de diferenciarse a
neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
Las células progenitoras neuronales con
positivas para CD133; este marcador de superficie celular se
encontró originalmente en células troncales hematopoyéticas. Sin
embargo, recientemente se ha mostrado que este marcador también se
expresa en tejido nervioso y tejido de músculo esquelético. Por
estas razones, este marcador no es adecuado para distinguir entre
diferentes células troncales o células progenitoras por sí
mismo.
Puesto que, como ya se ha mencionado, las
células troncales hematopoyéticas generan continuamente nuevas
células en la médula ósea, las células troncales coexisten con las
células progenitoras al mismo tiempo en la médula ósea. En la
médula ósea, estas células están presentes en una disposición
compleja, haciendo por ello difícil identificar células raras. Las
células troncales y sus descendientes directos expresan un fenotipo
que es virtualmente idéntico. Por estas razones, no es posible
tampoco identificar una célula troncal final simplemente en base a
características visibles.
La frecuencia de células troncales en la médula
ósea es desde 1 x 10^{-5} hasta 1 x 10^{-6}. Además, las
células troncales como regla están muy diseminadas en el tejido
determinado, lo que significa que son difíciles de detectar.
Como se ha mencionado anteriormente, las células
troncales hematopoyéticas se dividen, en ciertas condiciones, a
células progenitoras cuya diferenciación adicional ya está en algún
grado determinada. Dependiendo de la naturaleza y cantidad de las
citoquinas que están presentes, estas células progenitoras mieloides
y linfoides pueden a su vez generar una variedad de otras células
progenitoras que, sin embargo, ya no son capaces de replicarse
ellas mismas. Ejemplos de citoquinas que regulan la hematopoyesis
son el factor estimulante de colonias de granulocitos
(G-CSF), el factor estimulante de colonias de
macrófagos (M-CSF), varias interleuquinas, el
factor de células troncales (SCF), eritropoyetina (EPO), etc.
Para investigar el potencial hematopoyético
(formación de células sanguíneas) de las células troncales, se
trasplantan poblaciones relevantes de células humanas en ratones
inmunodeficientes (ratones NOD/SCID). Si las células trasplantadas
son células troncales, es posible detectar hematopoyesis humana
además de la hematopoyesis murina. Este ensayo in vivo se
usa para caracterizar e identificar células troncales analizando de
hecho la progenie de células individuales.
Como se puede ver por lo anterior, las células
troncales hematopoyéticas poseen un gran potencial terapéutico y se
usan en paciente en los que el sistema inmune está dañado o
destruido por completo.
Se puede usar FACS (separador celular activado
por fluorescencia), por ejemplo, para purificar células troncales
hematopoyéticas de la médula ósea. Esta purificación depende de la
presencia, en las células troncales, de proteínas de superficie
celular particulares que distinguen las células troncales
hematopoyéticas y las células progenitoras de otros tipos de
células y de la ausencia de otras proteínas de superficie celular,
estas últimas proteínas son características de células
hematopoyéticas diferenciadas. Cada una de las proteínas de
superficie se une a un anticuerpo monoclonal diferente, estando
conjugado cada uno estos anticuerpos a un colorante fluorescente
diferente, haciendo de esta manera posible usar FACS para separar
las células.
En el pasado se ha usado el marcador de
superficie celular CD34, en particular, para el aislamiento de
células troncales hematopoyéticas.
Además, recientemente se han usado anticuerpos
dirigidos contra el antígeno CD133 para caracterizar células
troncales hematopoyéticas. Miraglia et al., "A novel
five-transmembrane hematopoietic stem cell antigen:
isolation, characterization and molecular cloning", Blood 90:
5013-5021, (1997) han mostrado que este antígeno es
una glicoproteína de 120 kDa que posee cinco dominios transmembrana
y que se expresa no sólo en células troncales hematopoyéticas y sus
progenitores sino también en células troncales neuronales y
endoteliales.
Los anticuerpos de CD133 se usan, además de los
anticuerpos convencionales contra CD34, para seleccionar de forma
positiva células troncales hematopoyéticas y células progenitoras a
escala clínica. CD133 sólo se expresa en células troncales y
células progenitoras CD34^{bright} (intensidad de fluorescencia
alta). Las células positivas para CD34^{bright} y CD133 son en
general negativas para otros marcadores de células progenitoras
eritroides tales como CD36 y glicoforina A. Además de células
troncales que inducen hematopoyesis humana en el modelo de ratón
NOD/SCID, también se han encontrado la mayoría de las células
progenitoras de granulocitos/macrófagos en las fracciones positivas
para CD133 derivadas de médula ósea humana y sangre periférica.
En vista de lo anterior, es un objeto de la
presente invención proporcionar un nuevo anticuerpo monoclonal que
se puede usar para aislar y/o caracterizar selectivamente
poblaciones celulares particulares, en particular células troncales
hematopoyéticas y también células troncales y progenitoras
neuronales y mesenquimatosas.
Según la invención, este objeto se alcanza por
medio de un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, con el
anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une al mismo antígeno que
un anticuerpo producido por las líneas celulares de hibridoma CUB1,
CUB2, CUB3 y CUB4, que se depositaron en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen [colección alemana de
microorganismos y cultivos celulares] (DSMZ), según el tratado de
Budapest, con los números DSM ACC2569, DSM ACC2566 y DSM AC2565, el
14/08/2002, y DSM ACC2551, el 12/07/2002.
El objeto subyacente de la presente invención se
alcanza completamente de esta manera.
Los inventores fueron capaces de demostrar, en
sus propios experimentos, que es posible usar los nuevos anticuerpos
según la invención para aislar y caracterizar células troncales
hematopoyéticas, células troncales y células progenitoras
mesenquimatosas y células troncales y células progenitoras
neuronales. Además de esto, se encontró que la selectividad de los
nuevos anticuerpos era similar a la de un anticuerpo dirigido contra
CD133.
La invención se refiere, en particular, a
anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que están
producidos por las líneas de células de hibridoma CUB1, CUB2, CUB3 y
CUB4.
Los inventores fueron sorprendentemente capaces
de aislar los anticuerpos usando el antígeno CDCP1.
CDCP1 es una proteína de membrana plasmática que
posee tres potenciales dominios "CUB". Estos dominios son
dominios similares a inmunoglobulina que se designan con las letras
iniciales de las tres primeras moléculas que se identificaron que
poseen tales dominios. Se sabe que las proteínas que poseen estos
dominios se expresan preferentemente en la fase embrionaria y las
fases iniciales del desarrollo.
El gen CDCP1 que codifica esta proteína
("proteína que contiene dominios CUB") ha sido descrito por
Scherl-Mostageer et al., "Identification
of a novel gene, CDCP1, overexpressed in human colorectal
cancer", Oncogene 20: 4402-4408, (2001). Este
grupo de investigación mostró que esta proteína, o su ARNm, se
sobreexpresan fuertemente en tipos de cánceres o tumores tales como
cáncer de intestino y cáncer de pulmón. En base a su estructura
tridimensional, se identificó como que era una proteína
transmembrana que poseía tres dominios CUB en el dominio
extracelular y los autores propusieron que estaría implicada, en
particular, en adhesión celular o interacción con la matriz
extracelular (véase Scherl-Mostageer et
al.).
Sin embargo, la posibilidad de que esta proteína
se pudiera expresar también, en particular, en células troncales
hematopoyéticas primitivas en la médula ósea y sangre periférica y
también en células troncales y células progenitoras mesenquimatosas
o neuronales ni se describe ni se sugiere en esta publicación.
En lugar del anticuerpo que se menciona en cada
caso, también es posible, dentro del contexto de la presente
invención, usar un fragmento del anticuerpo sin que esto se mencione
expresamente en cada caso. En relación a esto, se entiende que
"fragmento" significa cualquier fragmento del anticuerpo que
retiene la función de unión al antígeno del anticuerpo. Ejemplos de
tales fragmentos son F_{ab}, F_{(ab')2}, F_{v} y otros
fragmentos tales como fragmentos CDR ("región determinante de
complementariedad", región hipervariable). Dichos fragmentos
muestran la especificidad de unión del anticuerpo y también se
pueden preparar de forma recombinante, por ejemplo usando métodos
conocidos.
Los inventores fueron capaces de demostrar que
es inesperadamente posible usar los anticuerpos que están dirigidos
contra la proteína de membrana plasmática CDCP1 para caracterizar y
aislar de forma selectiva células troncales hematopoyéticas y
células troncales y células progenitoras mesenquimatosas y
neuronales.
Cuando se usaron estos nuevos anticuerpos para
identificar células troncales hematopoyéticas, se encontró que los
anticuerpos mostraron una selectividad que era superior a la de los
anticuerpos que estaban dirigidos contra CD34 y que es similar a la
del anticuerpo que está dirigido contra CD133.
Por esta razón, los nuevos anticuerpos, o
fragmentos de los mismos, proporcionan alternativas ventajosas al
anticuerpo de CD34 cuando se identifican o aíslan células troncales
hematopoyéticas.
Tales anticuerpos monoclonales se pueden
preparar usando métodos convencionales (véase, Köhler y Milstein,
"Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specifity", Nature 256:495-497,
(1975)). Según este método, se inmuniza un animal con un antígeno,
se aíslan las células productoras de anticuerpo del animal y estas
células productoras de anticuerpo se fusionan con una línea celular
inmortal. Las líneas de células de hibridoma resultantes se criban
para determinar si son capaces de producir un anticuerpo contra el
antígeno que se usó para la inmunización.
Los anticuerpos según la invención también hacen
ahora posible preparar anticuerpos adicionales que se unen al mismo
antígeno. Usando los anticuerpos según la invención, es posible
emplear métodos bien conocidos para aislar las estructuras
antigénicas correspondientes y desarrollar anticuerpos monoclonales
adicionales contra las mismas estructuras antigénicas, empleando
los métodos conocidos en este caso también.
La invención se refiere además a líneas
celulares de hibridoma que son capaces de producir y liberar este
tipo de anticuerpo, en particular las líneas celulares de hibridoma
CUB1, CUB2, CUB3 y CUB4.
Al proporcionar los anticuerpos nuevos, los
inventores, por primera vez, han facilitado anticuerpos
monoclonales, así como líneas de células de hibridoma que producen
y liberan estos anticuerpos, lo que hace posible detectar de forma
selectiva poblaciones celulares que expresan el antígeno CDCP1. Por
lo tanto, los anticuerpos constituyen un medio, que es hasta ahora
único y tiene muchos usos, para el médico y el investigador para
detectar estos tipos de células, por una parte, y, por otra parte,
para manipular estas células, donde sea apropiado, bien mediante el
uso de los anticuerpos mismos o mediante el uso de reactivos que
están acoplados a ellos.
La invención se refiere además a un método para
aislar y/o identificar al menos una población celular que se
selecciona del grupo que comprende células troncales
hematopoyéticas, células troncales neuronales, células progenitoras
neuronales, células troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas, usando un anticuerpo o un fragmento del mismo, con
el anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une al mismo antígeno
que un anticuerpo producido por las líneas celulares de hibridoma
CUB1, CUB2, CUB3 y CUB4, que se depositaron en el DSMZ, según el
tratado de Budapest, con los números DSM ACC2569, DSM ACC2566 y DSM
ACC2565, el 14/08/2002, y DSM ACC2551, el 12/07/2002.
En otra forma de realización, el método según la
invención usa un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo,
producido por las líneas de células de hibridoma CUB1, CUB2, CUB3 y
CUB4.
La invención se refiere además a un método para
aislar y/o identificar al menos una población celular, que se
selecciona del grupo que comprende células troncales
hematopoyéticas, células troncales neuronales, células progenitoras
neuronales, células troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas, usando un anticuerpo, con el método que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto una muestra de una suspensión celular que contiene al menos una población celular con el anticuerpo monoclonal nuevo, o un fragmento del mismo, y
- (b)
- aislar y/o identificar las células que se unen al nuevo anticuerpo monoclonal o al fragmento del mismo.
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La invención se refiere además a un método para
aislar y/o identificar al menos una población celular, que se
selecciona del grupo que comprende células troncales
hematopoyéticas, células troncales neuronales, células progenitoras
neuronales, células troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas, usando un anticuerpo, con el método que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- poner en contacto una muestra de una suspensión celular que contiene al menos una población celular con el anticuerpo monoclonal nuevo, o un fragmento del mismo, y con al menos un anticuerpo adicional que se une a al menos una de las poblaciones celulares, y
- (b)
- aislar y/o identificar las células que se unen al anticuerpo monoclonal, o al fragmento del mismo, y al anticuerpo adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación a esto, el poner en contacto una
mezcla celular con el anticuerpo se puede realizar en solución como
es el caso, por ejemplo, cuando se usa un citómetro de flujo (=
separador celular activado por fluorescencia (FACS)).
Descrito de una manera general, las células se
cargan, en citometría de flujo, con anticuerpos que por una parte
son específicos para un marcador de superficie y por otra parte
están acoplados a un colorante fluorescente. Las células que son
positivas para el marcador fluorescen mientras que las células
negativas permanecen oscuras. Por lo tanto es posible determinar
qué proporción de una población celular es positiva para el
marcador. Al mismo tiempo, un citómetro de flujo hace posible
registrar el tamaño y granularidad de las células.
También es posible usar un método para
separación magnética de células (MACS, separación magnética de
células). En este método las células se marcan con bolas
magnéticas, siendo posible acoplar estas bolas a los anticuerpos,
por ejemplo.
Además, el poner en contacto también se puede
llevar a cabo inmovilizando el anticuerpo monoclonal en un soporte
como es el caso, por ejemplo, en la cromatografía en columna.
La suspensión celular puede ser cualquier
solución que contenga células de médula ósea, células sanguíneas o
células de tejidos.
Después de haber mezclado la suspensión celular
con el anticuerpo, las células que expresan el antígeno CDCP1 se
unen al anticuerpo, después de lo cual estas células se pueden, al
contrario de las células que no se han unido al anticuerpo,
identificar y/o aislar usando los métodos descritos.
En el método divulgado el último, se hace uso
además de un anticuerpo adicional que también reconoce al menos una
de las poblaciones celulares descritas aquí. Este anticuerpo puede,
por ejemplo, ser un anticuerpo que está dirigido contra el marcador
CD90, en el caso de células progenitoras neuronales, y ser un
anticuerpo anti-CD34, por ejemplo, en el caso de
células hematopoyéticas. Usar un anticuerpo adicional hace posible
aislar/identificar subpoblaciones específicas, que por consiguiente
se unen tanto al anticuerpo nuevo como a los anticuerpos
adicionales, en particular anticuerpos que ya son conocidos. Este
método se puede usar, por ejemplo, para caracterizar las células de
forma más precisa con respecto a sus marcadores de superficie.
Las poblaciones celulares que se han aislado
mediante los métodos se pueden usar para repoblar, por medio de
trasplante, la médula ósea en pacientes inmunosuprimidos o
inmunodeficientes.
La invención se refiere además al uso de los
nuevos anticuerpos, o fragmentos de los mismos, para aislar y/o
identificar al menos una población celular que se selecciona del
grupo que comprende células troncales hematopoyéticas, células
troncales neuronales, células progenitoras neuronales, células
troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas.
Se da preferencia particular al uso de los
anticuerpos nuevos, o fragmentos de los mismos, en relación con el
análisis de muestras de pacientes, en particular biopsias de
tejidos, biopsias de médula ósea y/o muestras de sangre, y, en
particular, cuando se clasifican leucemias.
En el caso presente, ha sido posible usar los
nuevos anticuerpos para detectar expresión del antígeno
correspondiente en hemoblastos de leucemia como, por ejemplo, en el
caso de leucemia linfática agua (LLA), leucemia mieloide aguda
(LMA) y leucemia mieloide crónica (LMC).
La invención se refiere además al uso de la
proteína CDCP-1 y/o del ácido nucleico que codifica
la proteína CDCP-1 para preparar anticuerpos, o
fragmentos de los mismos, para aislar y/o identificar células
troncales hematopoyéticas.
La invención se refiere además a una composición
farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo nuevo, o
fragmentos del mismo.
Además del anticuerpo, que representa el
compuesto activo en la composición, esta composición también puede
comprender tampones, diluyentes o aditivos adecuados. Los tampones
adecuados incluyen, por ejemplo, Tris-HCl, glicina
y fosfato, mientras que los diluyentes adecuados incluyen, por
ejemplo, soluciones acuosas de NaCl, lactosa o manitol. Los
aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, detergentes, solventes,
antioxidantes y conservantes. Se da una revisión de las sustancias
que se pueden usar para composiciones de esta naturaleza, por
ejemplo en: A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients",
3ª Ed., 2000, American Pharmaceutical Association y Pharmaceutical
Press.
La invención se refiere además a un kit que
comprende al menos un anticuerpo nuevo, o fragmentos del mismo.
De las figuras adjuntas y la descripción
resultan ventajas adicionales.
Las formas de realización se representan en las
figuras adjuntas y se explican en más detalle en la descripción, en
la que:
La figura 1a muestra la reactividad de los
anticuerpos según la invención con células de tipo salvaje;
La figura 1b muestra la reactividad de los
anticuerpos según la invención con transfectantes;
La figura 2a muestra la coexpresión de CD34 y
CDCP1 en poblaciones de células de médula ósea (células marcadas
con CD34-FITC) y CDCP1-PE (CUB
1));
La figura 2b muestra células de médula ósea en
un gráfico de CD34 contra CD38 y la selección en la población de
células troncales (poblaciones de células de médula ósea marcadas
con CD38-FITC, CDCP1-PE,
CD34-PerCP y CD133-APC);
La figura 2c muestra la coexpresión de CDCP1 y
CD133 en células troncales de médula ósea CD34^{+}/CD38^{-};
La figura 3 muestra la expresión de CDCP1 en
células troncales mesenquimatosas;
La figura 4a muestra la expresión de CDCP1 en
células troncales neuronales; y
La figura 4b muestra la coexpresión de CDCP1 y
CD90 en células troncales neuronales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Empezando con el vector de clonación pBluescript
II SK(+), en el que se había clonado la región codificante de CDCP1
humana (obtenido de Boehringer Ingelheim/Viena), la secuencia
codificante se subclonó en un vector pRK (PharMingen, San Diego,
EE. UU.) y, al mismo tiempo, se unió en extremo
C-terminal un epítopo myc de cinco veces (13
aminoácidos de la proteína c-myc). Se cotransfectó
el ADN de pRK-CDCP1-myc5 junto con
un plásmido de resistencia a puromicina (pSVpac\Deltap: de la
Luna et al., "Efficient transformation of mammalian cells
with constructs containing a puromycin-resistance
marker", Gene, 62(1): 121-126, 1988) en
células de ratón NIH-3T3 usando el método del
CaCl_{2}.
Después de haber clonado células individuales
resistentes a puromicina, se detectó la expresión de la proteína
CDCP1-myc5 en las células transfectadas mediante
inmunotransferencia usando un antisuero anti-myc.
Posteriormente se seleccionó el clon
NIH-3T3/huCDCP1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron dos ratones Balb/c cuatro veces
por vía intraperitoneal con aprox. 5-10 x 10^{6}
células NIH-3T3/huCDCP1 usando un protocolo
estándar. De tres a cuatro días después de la última inmunización,
se retiró el bazo y las células del bazo se fusionaron con células
de melanoma SP2/0 usando un protocolo estándar. Se probaron los
sobrenadantes de cultivo de células de hibridoma en crecimiento,
resistentes a HAT mediante análisis por FACS tanto en los
transfectantes como en las líneas celulares de tipo salvaje
(NIH-3T3).
Se juzgó que los sobrenadantes que reaccionaron
selectivamente con los transfectantes pero no con la línea celular
de tipo salvaje NIH-3T3 eran específicos para CDCP1.
Se clonaron las células de hibridoma correspondientes (dilución
limitante) y se seleccionaron clones positivos. Se obtuvieron cuatro
clones (CUB1, CUB2, CUB3 y CUB4) que reaccionaban selectivamente
con las células NIH-3T3/huCDCP1 (isotipos: uno IgG2b
[CUB1] y tres IgG2a
[CUB2-4]).
[CUB2-4]).
Los histogramas en la figura 1a muestran que los
cuatro anticuerpos no reaccionaron con la células de tipo salvaje.
La figura 1b muestra histogramas en los que se representa claramente
la reactividad de los cuatro anticuerpos CUB1, CUB2, CUB3 y CUB4
con los transfectantes mediante el segundo pico oscuro que está
presente en cada caso.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se probó la reactividad de los
anticuerpos en células de sangre periférica. Los resultados de
estas investigaciones se muestran en la tabla 1 a continuación.
Se encontró que los linfocitos T CD3^{+},
linfocitos B CD20^{+}, células NK CD56^{+}, monocitos
CD14^{+}, granulocitos neutrofílicos, granulocitos eosinofílicos
Siglec-8^{+}, eritrocitos CD235a^{+} y plaquetas
CD61^{+} eran negativos para CDCP1.
Los resultados de la reactividad de los
anticuerpos en varias líneas celulares, que se enumeran
horizontalmente, se muestran en la tabla 2 posteriormente. Los
cuatro anticuerpos probados, es decir CUB1 a CUB4, se enumeran
verticalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
K-562: eritroleucemia;
WERI-RB-1: retinoblastoma;
BV-173: leucemia de células pro-B;
HEL: eritroleucemia; HL-60: leucemia
promielocítica; KU-812: leucemia basofílica; HepG2:
carcinoma hepatocelular; MOLT-4: leucemia de
linfocitos T).
Se encontró que todas las líneas celulares
probadas eran negativas para CDCP1 aparte de K-562.
Scherl-Mostageer y col. ya han mostrado que
K-562, una línea celular eritroleucémica, expresa el
ARNm de CDCP1.
Se llevaron a cabo investigaciones adicionales
en la expresión correlacionada de CDCP1 y los otros marcadores de
células troncales CD34 y CD133 en varios subconjuntos de hemoblastos
de leucemia. Los resultados obtenidos en estas investigaciones se
resumen en la tabla 3 posteriormente. Los patrones de expresión se
obtuvieron por medio de marcajes estándar de inmunofluorescencia,
usando los anticuerpos, y después llevando a cabo análisis por
FACS.
El análisis mostró que CDCP1 es un marcador
independiente en relación a los otros marcadores de células
troncales ya que su expresión no se correlaciona necesariamente con
la de los otros marcadores. La coexpresión frecuente de los tres
marcadores de células troncales se puede ver, en particular, en el
caso de leucemias mieloides (LMA y LMC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla, LLA significa leucemia linfática
aguda mientras que LMA significa leucemia mieloide agua y LMC
significa leucemia mieloide crónica (las designaciones adicionales
son designaciones de clasificación y caracterización que se usan
normalmente para las leucemias agudas).
Por consiguiente, los anticuerpos nuevos se
pueden usar, por ejemplo, en diagnósticos de rutina en relación con
leucemias.
\vskip1.000000\baselineskip
Posteriormente se investigó la reactividad de
los anticuerpos con poblaciones de células de médula ósea. Resultó
que CDCP1 se expresa exclusivamente en células troncales CD34^{+}
y no en otras poblaciones (véase la figura 2a). La fracción
CDCP1^{+} separada por FACS consistía casi completamente en
hemoblastos inmaduros y colonias inmaduras: CFU-GM
(unidad formadora de colonias de macrófago granulocito),
BFU-E (unidad formadora de brotes eritroides),
CFU-GEMM (unidad formadora de colonias
granulocito-eritroide-macrófago-megacariocito).
Las figuras 2b y 2c muestran los resultados de
un análisis de cuatro colores de células de médula ósea.
Para llevar a cabo el análisis de cuatro colores
las células se marcaron con los siguientes conjugados de
anticuerpo: CUB1-PE (ficoeritrina),
CD133-APC (aloficocianina),
CD38-FITC (isotiocianato de fluoresceína) y
CD34-PerCP (proteína peridina clorofila A).
En el gráfico en la figura 2b, se representa
CD34 contra CD38. Las células troncales se encuentran en la fracción
rara CD34^{+}/CD38^{-} (Terstappen y Huang "Analysis of bone
marrow stem cell", Blood Cells 20(1):
45-61, 1994). En el gráfico en la figura 2b, esta
población se muestra en la "región R2".
En el gráfico en la figura 2c, se represente
CDCP1 contra CD133. Este gráfico representa las células que se han
visto en la región "R2" en el gráfico de la figura 2b. La
figura 2c muestra que esencialmente todas las células troncales
CD34^{+}/CD38^{-} coexpresan CDCP1 y CD133.
En otros experimentos, los inventores fueron
capaces de demostrar que, 6 semanas después de haber trasplantado
células positivas para CDCP1 en ratones NOD/SCID, se habían formado
células CD45+ humanas en la médula ósea de los ratones. (CD45^{+}
es un marcador para células hematopoyéticas). Por consiguiente esto
demuestra que las células que se aíslan usando los anticuerpos
nuevos son capaces de llevar a cabo hematopoyesis.
\vskip1.000000\baselineskip
En otros experimentos, se investigó la
reactividad de los anticuerpos hacia células troncales neuronales y
mesenquimatosas.
Para este fin se usaron células progenitoras
neuronales fetales (en lo siguiente NPC) y células troncales
mesenquimatosas comercialmente disponibles, obtenidas de
Cell-Systems, St. Katharinen, Alemania.
En la figura 3, el segundo pico oscuro en el
histograma muestra que el anticuerpo CUB2 reacciona con células
troncales mesenquimatosas. El histograma en la figura 4a muestra la
reactividad con NPC, en este caso con el anticuerpo CUB2 marcado
con PE (ficoeritrina).
Para llevar a cabo el análisis de coexpresión,
las células se marcaron con los siguientes conjugados de anticuerpo:
CUB1 + algG2bPE (ficoeritrina) y CD90-APC
(aloficocianina). Se sabe que CD90 se expresa en NPC (véase, por
ejemplo Vogel et al., "Heterogeneity among human bone
marrow-derived mesenchymal stem cells and neural
progenitor cells", Haematologica 88: 126-133,
(2003)).
En el gráfico en la figura 4b, se representa
CDCP1 contra CD90. Se puede ver que la mayoría de las células NPC
expresaban CDCP1 (además de CD90 como el "marcador de
confirmación").
En resumen, por lo tanto, estos datos muestran
que CDCP1 es un marcador nuevo para células troncales
hematopoyéticas y para células troncales/células progenitoras
mesenquimatosas o neuronales. Es posible usar el anticuerpo según
la invención que está dirigido contra este marcador para seleccionar
células troncales que expresan CDCP1 de una manera sencilla y
después, por ejemplo, trasplantarlas para el propósito de
repoblación. El anticuerpo según la invención es por consiguiente
de gran importancia para seleccionar células troncales
hematopoyéticas o mesenquimatosas y/o neuronales. Además,
constituye una alternativa destacada a los marcadores CD133 y CD34
que se usan normalmente para la selección de células troncales.
Claims (13)
1. Un anticuerpo monoclonal
anti-CDCP1, o un fragmento del mismo, capaz de
aislar y/o identificar al menos una población celular que se
selecciona del grupo de células troncales hematopoyéticas, células
troncales neuronales, células progenitoras neuronales, células
troncales mesenquimatosas y células progenitoras mesenquimatosas,
caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento del mismo,
se une a un antígeno que es el mismo que se une a un anticuerpo
producido por la línea de células de hibridoma CUB1 (DSM ACC2569),
CUB2 (DSM ACC2566), CUB3 (DSM ACC2565) o CUB4 (DSM ACC2551).
2. Un anticuerpo monoclonal
anti-CDCP1, o un fragmento del mismo,
caracterizado porque se une a la misma estructura antigénica
a la que se une un anticuerpo producido por la línea de células de
hibridoma CUB1 (DSM ACC2569), CUB2 (DSM ACC2566), CUB3 (DSM
ACC2565) o CUB4 (DSM ACC2551), en donde dicho anticuerpo o fragmento
es capaz de aislar y/o identificar al menos una población celular
que se selecciona del grupo de células troncales hematopoyéticas,
células troncales neuronales, células progenitoras neuronales,
células troncales mesenquimatosas y células progenitoras
mesenquimatosas.
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo está
producido por la línea de células de hibridoma CUB1 (DSM
ACC2569).
4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo está
producido por la línea de células de hibridoma CUB2 (DSM
ACC2566).
5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo está
producido por la línea de células de hibridoma CUB3 (DSM
ACC2565).
6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo está
producido por la línea de células de hibridoma CUB4 (DSM
ACC2551).
7. Una línea de células de hibridoma,
caracterizada porque produce el anticuerpo de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un método para aislar y/o identificar al
menos una población celular, que se selecciona del grupo de células
troncales hematopoyéticas, células troncales neuronales, células
progenitoras neuronales, células troncales mesenquimatosas y
células progenitoras mesenquimatosas, usando al menos un anticuerpo,
que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- poner en contacto una muestra de una suspensión celular, que contiene al menos una población celular, con un anticuerpo monoclonal o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y
- (b)
- aislar y/o identificar las células que se unen a dicho anticuerpo monoclonal o fragmento.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El método de la reivindicación 8 que
comprende además en la etapa (a):
- poner en contacto dicha muestra de una suspensión celular con al menos un anticuerpo adicional que se une al menos a una de las poblaciones celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El método de la reivindicación 8 ó 9 para el
análisis in vitro de muestras de pacientes, en particular de
biopsias de tejidos, biopsias de médula ósea y/o muestras de
sangre.
11. El método de la reivindicación 8 ó 9 para la
clasificación diagnóstica in vitro de leucemias.
12. Una composición farmacéutica que comprende
al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
13. Un kit, que comprende al menos un anticuerpo
monoclonal o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
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