ES2345075T3 - Endoglucanasas y preparaciones de celulasa que las contienen. - Google Patents

Abstract

Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: que tiene actividad endoglucanasa.

Description

Endoglucanasas y preparaciones de celulasa que las contienen.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a endoglucanasas y a preparaciones de celulasa que las contienen, así como a métodos para tratar con las preparaciones de celulasa tejidos que contienen celulosa, papel, pasta papelera o alimentos para animales.

Antecedentes de la técnica

El tratamiento con celulasa de tejidos que contienen celulosa tiene el fin de proporcionar a los tejidos las propiedades deseadas. Por ejemplo, en la industria de las fibras el tratamiento con celulasa se lleva a cabo con el fin de mejorar el tacto y el aspecto de los tejidos que contienen celulosa o para dar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un aspecto de material de "lavado a la piedra", es decir un cambio de color parcial (Patente Europea Nº 307.564).

Por otra parte, recientemente el liocel, que es una fibra de celulosa regenerada preparada a partir de celulosa derivada de pasta papelera mediante un proceso de hilatura con disolventes orgánicos, ha llamado la atención por sus propiedades (tal como alta resistencia, absorción del agua) y por el proceso de producción, que provoca una menor contaminación ambiental. Sin embargo, debido a que el liocel genera pelusas durante su producción, se considera desde el punto de vista comercial que el liocel en esta forma tienen un valor bajo como tejido. Por ello, se han propuesto métodos para eliminar la pelusa que se genera durante la producción utilizando celulasas.

El término "tejidos que contienen celulosa" empleado aquí incluye tejidos preparados a partir de materiales de fibra celulósica tales como celulosa natural (por ejemplo algodón, lino), celulosa regenerada (por ejemplo liocel, rayón, rayón polinósico, de cupramonio); telas tejidas o de punto a partir de estas fibras; y artículos de vestir preparados cosiendo estas telas. Además, estos tejidos, telas y artículos de vestir cosidos que comprenden el o los materiales de fibra celulósica y otro u otros materiales, como fibra sintética, lana o seda, están incluidos también en este término.

Actualmente, se utilizan principalmente celulasas derivadas de Trichoderma y Humicola (ambos son hongos de la pudrición de la madera) en el tratamiento de los tejidos que contienen celulosa. Estas celulasas son mezclas de varios componentes celulasas. El uso práctico de estas celulasas se ve impedido por la dificultad de necesitar una gran cantidad de preparación de celulasa para lograr el efecto deseado sobre el tejido que contiene celulosa.

El inconveniente descrito anteriormente de estas preparaciones de celulosa está siendo mejorado por el desarrollo de preparaciones que contienen gran cantidad de endoglucanasas. Por ejemplo, se describen diversas preparaciones de celulasa enriquecidas con endoglucanasa en WO 89/09259, WO 91/17243, WO 98/03640, EP 0633311A y WO 94/21801. En particular, la WO 91/17243 describe que un componente purificado de endoglucanasa de 43 kD derivada de Humicola (EGV) muestra una actividad decolorante en pantalones vaqueros aproximadamente 100 veces mayor que la actividad de aquellas preparaciones convencionales de celulasa que son mezclas de varios componentes celulasa. La WO 98/03640 describe que un componente de endoglucanasa derivado de Humicola NCE4 muestra una actividad decolorante en pantalones vaqueros y una actividad eliminadora de pelusa en liocel que son respectivamente 25 veces y 100 veces más importantes que aquellas de las preparaciones convencionales de celulasa. Sin embargo, para eliminar la intensa pelusa generada en los tejidos de celulosa regenerada, tales como liocel, se necesitan preparaciones de celulasa que contengan componentes de endoglucanasa de actividad todavía mayor para utilizarlas en la práctica a escala industrial. La EP 0 843 041 A1 describe el uso de una celulosa monocomponente, preferentemente una endoglucanasa monocomponente, que se obtiene a partir de Thielavia terrestris, para la decoloración de pantalones
vaqueros.

Generalmente, el procesamiento de tejidos que contienen celulosa incluye el refinado, blanqueo, teñido y mercerización; todos ellos se llevan a cabo bajo condiciones alcalinas. Sin embargo, en las preparaciones convencionales de celulosa descritas anteriormente y que contienen gran cantidad de endoglucanasa, aquellas que derivan de Trichoderma tienen un pH óptimo en un rango ácido y aquellas que derivan de Humicola tienen un pH óptimo en un rango neutro. Por tanto, cuando se utilizan estas preparaciones de celulasa, el tratamiento de la celulasa debe llevarse a cabo separadamente de las etapas de procesamiento de tejido mencionadas anteriormente, después de ajustar el pH mediante la adición de tampones, etc.

En consecuencia, si se dispusiera de un componente de endoglucanasa que funcionara bajo condiciones alcalinas, el tratamiento de la celulasa se podría llevar a cabo según las etapas de procesamiento de tejidos mencionadas anteriormente. Así, se podrían acortar las etapas de producción. Como consecuencia, se cree que se podría lograr una reducción importante del coste.

Se describe que las celulasas derivadas de Rhizopus son capaces de conservar su actividad bajo condiciones alcalinas (Publicaciones Japonesas de Patentes No Examinadas Nº 60-226599, 64-40667, 64-26779 y 7-90300). En todos estas descripciones, las preparaciones de cultivos de Rhizopus se utilizan con el propósito de proporcionar detergentes para su uso en el lavado/aclarado de las telas. Sin embargo, la actividad de estas preparaciones de cultivos de Rhizopus es extremadamente baja y, con diferencia, por debajo del nivel necesario para su uso práctico.

A menudo se proporcionan preparaciones de celulasa altamente activas como preparaciones que contienen gran cantidad de endoglucanasa tal como se ha descrito anteriormente. Para preparar dicha endoglucanasa, se conocen métodos en los que un componente de interés de la endoglucanasa se expresa de forma recombinante y en gran cantidad en una célula huésped, tal como se describe en WO 91/17243, WO 98/03667 y WO 98/111239. Ejemplos de células huésped preferentes en estos métodos incluyen hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina, por ejemplo Aspergillus, Humicola y Trichoderma. Si se considera la producción de enzimas a escala industrial, estos hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina son excelentes huéspedes.

Sin embargo, cuando un gen heterogéneo se expresa en estos hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina, con frecuencia la alta expresión se ve impedida por razones tales como la diferencia en el uso del codón. En particular, no se ha informado sobre la alta expresión de un gen derivado del género Rhizopus que pertenece a Zygomycotina en los hongos filamentosos mencionados anteriormente que pertenecen a Deuteromycotina. Por tanto, se desea una tecnología de alta expresión.

Recientemente y en estas circunstancias, se viene elaborando una tecnología que consigue la alta expresión de un gen de interés en una célula huésped mediante la optimización de los codones del gen conforme a la frecuencia de los codones de la célula huésped. Se presupone un uso óptimo de los codones para la alta expresión de un gen de interés en un huésped mediante un examen de la frecuencia de los codones en aquellos genes expresados de forma relativamente abundante en el huésped en su entorno natural. Esto se apoya en el informe de Lloyd y col., (Andrew T. Lloyd y Paul M. Sharp, 1991, Mol. Gen. Genet. 230, 288-294) con respecto a la frecuencia de los codones en Aspergillus nidulans, hongo filamentoso que pertenece a Deuteromycotina. Sin embargo, aunque se ha obtenido información sobre el uso apropiado de los codones a partir de secuencias conocidas de ADN, tal información no resulta necesariamente en una alta expresión de un gen de interés inmediatamente. Especialmente, en hongos filamentosos, cuyo control es complejo, es necesaria la selección de una sola secuencia que sea la más adecuada para la expresión de un número de secuencias con el uso adecuado de codones.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han aislado endoglucanasas altamente activas y genes de las mismas procedentes de hongos Zygomycotina, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides y Phycomyces nitens. Los inventores han descubierto que estas enzimas muestran actividades extremadamente importantes en la eliminación de la pelusa de tejidos de celulosa regenerada y que conservan actividades muy importantes bajo condiciones alcalinas. Estas endoglucanasas tienen actividades notablemente elevadas, de 10 a 20 veces más altas en el rango neutro y de 20 a 50 veces más altas en el rango alcalino, que las actividades de EGV (WO 91/17243) y NCE4 (WO 98/03640) derivadas de Humicola, que son conocidas por tener altas actividades en la eliminación de pelusas de los tejidos que contienen celulosa.

Además, incluso cuando estas endoglucanasas se utilizan en forma de composición para detergentes para su uso a bajas temperaturas y en condiciones alcalinas en general, se ha descubierto que tienen importantes actividades en la eliminación de la pelusa del algodón. Por ejemplo, estas endoglucanasas altamente activas tienen importantes actividades, de 2 a 20 veces más altas, que las actividades de EGV derivada de Humicola (WO 91/17243) y NCE4 (WO 98/03640), que son conocidas por tener importantes actividades en la eliminación de la pelusa cuando se utilizan como detergentes.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que estas endoglucanasas tienen secuencias de aminoácidos completamente nuevas y características. Brevemente, la secuencia consenso conservada Gln-Cys-Gly-Gly en sus dominios de unión a la celulosa es seguida de Lys; o el residuo consenso conservado Asn en el dominio es seguido de Lys.

Además, los presentes inventores han descubierto una secuencia completamente nueva y característica que se cree es necesaria para eliminar la pelusa de tejidos de celulosa regenerada, en una parte de sus dominios enlazadores localizados cerca del N-terminal de sus dominios catalíticos.

Asimismo, los presentes inventores han descubierto también que estas endoglucanasas tienen una estructura completamente nueva como endoglucanasas derivadas de hongos filamentosos que pertenecen a la familia 45, en el sentido de que sus dominios de unión a la celulosa están localizados en el lado N-terminal.

Un objeto de la invención consiste en proporcionar enzimas que muestren una actividad endoglucanasa muy alta en la celulosa regenerada y conserven alta actividad bajo condiciones alcalinas, así como los genes que codifican las enzimas.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar preparaciones de celulasa con buenas propiedades.

Todavía otro objeto de la invención consiste en proporcionar métodos eficaces y baratos para tratar tejidos, papel, pasta papelera y alimento para animales que contienen celulosa con las enzimas descritas anteriormente.

La enzima de acuerdo con la presente invención posee las siguientes propiedades:

a)

muestra actividad de endoglucanasa, y

b)

es capaz de eliminar completamente la pelusa de un tejido de celulosa regenerada a una concentración de 1 mg de proteína/l ó inferior.

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En otro aspecto de la invención, la enzima que tiene la actividad endoglucanasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:1.

Además, el gen de la invención para la enzima que tiene actividad de endoglucanasa comprende una secuencia nucleotídica que codifica la enzima anterior (por ejemplo la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO:2).

Asimismo, la preparación de celulasa de la invención comprende la enzima descrita anteriormente que muestra la actividad endoglucanasa.

Además, el método de la invención para tratar tejidos que contienen celulosa o similares comprende la puesta en contacto del tejido que contiene celulosa o similar con la enzima de la invención que muestra la actividad endoglucanasa o con la preparación de celulasa de la invención.

Breve descripción de la invención

Fig. 1: gráfico que muestra la relación entre el pH de la reacción y la actividad relativa en la eliminación de pelusa en liocel sobre las endoglucanasas RCE I, MCE I, PCE I y NCE4.

Fig. 2: gráfico que muestra la relación entre el pH de la reacción y la actividad relativa en la eliminación de pelusa en liocel sobre las endoglucanasas mutantes RCE I, MCE I y endoglucanasa NCE4.

Fig. 3: tabla que muestra la frecuencia de los codones en el gen que codifica RCE I.

Fig. 4: tabla que muestra la frecuencia de los codones en el gen que codifica NCE 1.

Fig. 5: tabla que muestra la frecuencia de los codones en el gen que codifica NCE 2.

Fig. 6: tabla que muestra la frecuencia de los codones en el gen que codifica NCE 4.

Descripción de la invención Definiciones

Los aminoácidos se expresan mediante abreviaturas de tres letras.

El término "cualquier residuo aminoácido" empleado aquí incluye Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.

El término "secuencia de nucleótidos" empleado aquí incluye no solamente secuencias de ADN, sino también secuencias de ARN.

Depósito del Microorganismo

La cepa de Rhizopus oryzae CP96001 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología) (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Pref., Japón) con el Nº de Acceso FERM BP-6889 a 21 de abril de 1997.

Se depositó la cepa Mucor circinelloides CP99001 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología) con el Nº de Acceso FERM BP-6890 a 2 de julio de 1999.

Se depositó la cepa Phycomyces nitens CP99002 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología) con el Nº de Acceso FERM BP-6891 a 2 de julio de 1999.

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Enzimas que muestran la actividad endoglucanasa

La enzima de la invención tiene una actividad más elevada que las endoglucanasas altamente activas conocidas hasta la fecha en la eliminación de pelusa de tejidos de celulosa regenerada tal como liocel, y tiene la ventaja de que es operativa incluso bajo condiciones alcalinas. La alta actividad de la enzima de la invención permite el uso práctico de la enzima, ya que se necesita sólo una pequeña cantidad de preparación de celulasa que contiene la enzima para producir los efectos deseados sobre tejidos de celulosa regenerada. Además, la ventaja de que la enzima trabaje incluso bajo condiciones alcalinas permite el procesamiento de eliminación de pelusa de tejidos de celulosa regenerada en condiciones alcalinas, que se estima ahora imposible. Por tanto, de acuerdo con la enzima de la invención, se pueden acortar las etapas de procesamiento de tejidos y se puede obtener una reducción en el coste.

Liocel es un término para un tejido de celulosa regenerada designado anteriormente por el Comité International de la Rayonne et des Fibres Synthétiques (CIRFS). Como producto común se llama Tencel^{TM} (marca comercial de Acordis Fibers). Como el liocel es una fibra preparada a partir de celulosa derivada de pasta papelera mediante un proceso de hilatura con disolvente orgánico, está clasificado dentro del grupo fibra de celulosa regenerada. Las demás fibras de celulosa regenerada, tales como viscosa, rayón y polinósico, se preparan también a partir de celulosa derivada de pasta papelera y tienen la misma estructura cristalina que el liocel. Por tanto, cuando se aplica a estas fibras de celulosa regenerada, la enzima de acuerdo con la invención es capaz de producir efectos similares a los producidos cuando se aplica al liocel.

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporcionan enzimas que tienen las propiedades a) y b) descritas anteriormente.

Se describen a continuación los detalles de las propiedades de la enzima de acuerdo con la invención.

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(i) Función y Especificidad del Sustrato

La enzima de la invención es una enzima que muestra actividad endoglucanasa, es decir endo-1,4-\beta-glucanasa EC3.2.1.4. De forma específica, la enzima de la invención hidroliza el enlace \beta-1,4-glucopiranosil del \beta-1,4-glucano. Esta enzima actúa específicamente sobre un tejido de celulosa regenerada tal como liocel como sustrato y es capaz de eliminar completamente la pelusa de Tencel^{TM} a una concentración extremadamente baja (0,2-1,0 mg de la proteína/l).

El término "actividad de eliminación de pelusa de un tejido de celulosa regenerada" empleado aquí indica la actividad, que se evalúa por medio del método descrito en el Ejemplo A4 o A5.

La expresión "capaz de eliminar completamente la pelusa de un tejido de celulosa regenerada" empleada aquí se refiere a un estado en el que el ojo no puede detectar ninguna pelusa cuando una tela de punto de liocel que ha sido teñida de marrón y ha experimentado un tratamiento de producción de pelusa se trata con una enzima para eliminar la pelusa. Específicamente, la expresión se refiere a un estado de la tela sin pelusa en la que el valor L* (luminosidad) del sistema de color L*a*b* según se determina con un espectrofotómetro (Minolta; modelo CM525i) en las condiciones descritas en el Ejemplo A6 es de 24,5 o inferior. La tela teñida de marrón antes del tratamiento de producción de pelusa se refiere a una tela cuyo valor L* se sitúa en el rango de 24 a 26; el valor a* (cromaticidad) se encuentra en el rango de 4,7 a 5,1; y el valor b* se sitúa en el rango de 7,2 a 7,9. Esta tela de liocel es una tela lisa de punto preparada con un Nº 40/1 de estambres y de calibre 30'' *24G y teñida después de marrón con Sumifix (Sumitomo Chemical). Como ejemplo específico de producto de tela liocel de punto se puede citar OT7440 Knit Smooth (Toshima Co., Ltd.). En el tratamiento de producción de pelusa mencionado anteriormente, se debe generar pelusa hasta que el valor L* alcance aproximadamente 30 cuando se utiliza una tela con este color (marrón).

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(ii) pH Óptimo y pH al que la Enzima es Estable

La actividad de eliminación de pelusa de la endoglucanasa de la invención cuando actúa sobre tejidos de celulosa regenerada a un pH de 8,5 se encuentra en un 50% o más de su actividad de eliminación de pelusa al pH óptimo.

La endoglucanasa derivada de Rhizopus oryzae tiene alta actividad CMCasa a un pH 4-8, aunque el pH óptimo para esta actividad es aproximadamente 5. Asimismo, posee alta actividad de eliminación de pelusa en liocel a un pH de 5-9, aunque el pH óptimo para esta actividad es de aproximadamente 5.

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(iii) Temperatura Óptima y Estabilidad Térmica

La endoglucanasa derivada de Rhizopus oryzae tiene alta actividad CMCasa a 45-65ºC, aunque el rango óptimo de temperaturas para esta actividad es de 55-60ºC. Asimismo, posee alta actividad de eliminación de pelusa en liocel a 45-60ºC, aunque la temperatura óptima para esta actividad es de aproximadamente 55ºC.

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(iv) Peso Molecular

La endoglucanasa derivada de Rhizopus oryzae puede tener un peso molecular de aproximadamente 40 kDa, según se determina por SDS-PAGE.

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(v) Secuencia N-Terminal

La endoglucanasa derivada de Rhizopus oryzae tiene una secuencia N-terminal representada por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:14.

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(vi) Dominio de Unión a Celulosa

Se conoce que las celulasas generalmente tienen un dominio de unión a celulosa (CBD) en el que se unen a la celulosa. Además, se ha confirmado que los dominios de unión a la celulosa derivados de hongos filamentosos tienen la siguiente secuencia consenso conservada (Hoffren, A.M. y col., Protein Engineering 8:443-450, 1995):

1

donde Xaa es, independientemente, cualquier aminoácido; y Xaa's en las posiciones 20, 21, 22, 23, 24, 30 y 31 pueden estar, independientemente, ausentes.

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En la secuencia anterior, la secuencia consenso conservada Gln-Cys-Gly-Gly es seguida habitualmente de Ile, Gln, Ala, Ser o Asn; no se ha encontrado esta secuencia consenso seguida de Lys. Asimismo, el residuo consenso conservado Asn en la secuencia descrita anteriormente es seguido normalmente de Asp, Pro, Gln, Tyr o Ala; no se ha encontrado este residuo consenso seguido de Lys. Los presentes inventores han descubierto que la secuencia consenso Gln-Cys-Gly-Gly es seguida de Lys en los dominios de unión a la celulosa de RCE I, RCE II, RCE III y PCE I, y que el residuo consenso Asn es seguido de Lys en los dominios de unión a la celulosa de MCE I y MCE II. Estas son secuencias de aminoácidos completamente nuevas.

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(vii) Región Enlazante y Dominio Catalítico

Se sabe que las endoglucanasas tienen un dominio catalítico que segmenta la celulosa. La región de aminoácidos que une un dominio catalítico a un dominio de unión a celulosa se denomina región enlazante. Se confirma que las endoglucanasas que pertenecen a la familia 45 tienen una secuencia consenso conservada (Ser o Thr o Ala)-Thr-Arg-Tyr-(Trp o Tyr o Phe)-Asp-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-(Cys o Ala) (SEQ ID NO:29) en una región aguas arriba dentro de sus dominios catalíticos. Los presentes inventores han descubierto que la deleción de una región específica aguas arriba de esta secuencia consenso (es decir, de una parte específica de la región enlazante) elimina la actividad de eliminación de pelusa en liocel (Ejemplo D9), y han descubierto también que una nueva secuencia Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Gly-Gly-Xaa-Ser-Gly (SEQ ID NO:30) común en 6 endoglucanasas derivadas de Zygomycotina está presente dentro de la región.

La enzima de acuerdo con la invención se caracteriza por incluir un dominio de unión a la celulosa, una región enlazante y un dominio catalítico, localizados en este orden, en la dirección desde el N-terminal hasta el C-terminal.

La "parte de la región enlazante" utilizada aquí significa una parte localizada dentro de la región enlazante y situada cerca del N-terminal del dominio catalítico. Específicamente, el aminoácido C-terminal de esta parte de la región enlazante está localizado 9 aminoácidos aguas arriba del residuo Asp en la secuencia consenso (Ser o Thr o Ala)-Thr-Arg-Tyr-(Trp o Tyr o Phe)-Asp-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-(Cys o Ala) (SEQ ID NO:29) conservada en el dominio catalítico.

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(viii) Fuente de Origen

Las enzimas de acuerdo con la invención se pueden obtener a partir de Zygomycotina. Específicamente, se pueden obtener a partir de microorganismos del género Rhizopus (por ejemplo Rhizopus oryzae).

Según la invención, se proporciona una endoglucanasa que posee las siguientes características:

i) pertenece a la familia 45;

ii) deriva de un hongo filamentoso, y

iii) tiene un dominio de unión a celulosa localizado en su lado N-terminal.

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Una endoglucanasa "que pertenece a la familia 45" se refiere a una endoglucanasa que tiene la secuencia consenso conservada (Ser o Thr o Ala)-Thr-Arg-Tyr-(Trp o Tyr o Phe)-Asp-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-(Cys o Ala) (SEQ ID NO:29) en su dominio catalítico (NiceSite View of PROSITE: PDOC00877 o PS01140, Base de Datos PROSITE de familias y dominios proteicos).

Como endoglucanasa "derivada de un hongo filamentoso y que pertenece a la familia 45", se conocen enzimas tales como EGV, NCE4 y eg15 (Saloheimo, A. y col., Molecular Microbiology 13:219-228, 1994). En todas estas enzimas, el dominio de unión a la celulosa se sitúa en su lado C-terminal (Schulein, M., Biochemical Society Transactions 26:164-167, 1998). Sin embargo, 6 endoglucanasas derivadas de Zygomycotina de acuerdo con la invención pertenecen a la familia 45 y tienen una estructura completamente nueva en la que el dominio de unión a celulosa está localizado en su lado N-terminal.

Un ejemplo específico de una endoglucanasa "que pertenece a la familia 45" de acuerdo con la invención es una enzima que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1 y que muestra la actividad endoglucanasa. Ejemplos específicos de fuentes de origen pueden incluir las fuentes originales descritas anteriormente.

Según la invención, se proporciona una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO:1 como enzima que muestra la actividad endoglucanasa. A continuación, las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 y 11 se denominan endoglucanasas RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I respectivamente.

Las localizaciones (es decir las posiciones de los aminoácidos) del dominio de unión a la celulosa (CBD), la parte de la región enlazante y el dominio catalítico (CAD) en cada una de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 y 11 se muestran en la tabla que figura a continuación.

2

La enzima de la invención se puede aislar y purificar a partir de un microorganismo tal como se describe en los Ejemplos A1-3.

Alternativamente, la enzima de la invención se puede obtener mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima en un huésped apropiado por medio de la tecnología de genes recombinantes y aislamiento/purificación de la proteína resultante.

La enzima de la invención también incluye una enzima recombinante que consiste en el dominio de unión a la celulosa descrito anteriormente, la parte específica de la región enlazante y cualquier dominio catalítico. Dichas enzimas recombinantes se pueden producir, por ejemplo, de acuerdo con el método de Tomme, P. y col., J. Bioteriol. 177:4356-4363, 1995.

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Genes de Endoglucanasa

De acuerdo con la invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO:1. Cuando se da una secuencia de aminoácidos de una proteína, las secuencias de ADN que codifican la misma se determinan fácilmente. Por tanto, se pueden seleccionar varias secuencias de nucleótidos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO:1.

La secuencia de nucleótidos según la presente invención puede ser una secuencia de origen natural o una secuencia totalmente sintética. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia sintetizada utilizando una parte de una secuencia de origen natural. Típicamente, la secuencia de nucleótidos de la invención se obtiene a partir de una librería cromosómica o de ADN derivada de un microorganismo, tal como Mucor circinelloides o Phycomyces nitens, por medio de métodos convencionales en la técnica de la ingeniería genética, por ejemplo mediante screening con una sonda de ADN apropiada preparada en base a la información referente a una secuencia parcial de aminoácidos.

A continuación se describen de forma más detallada las endoglucanasas RCE I, RCE II, RCE III, MCE I, MCE II y PCE I, así como los genes de las mismas.

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(1) Endoglucanasa RCE I y Genes de la Misma

La endoglucanasa RCE I de la invención es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 315 de la SEQ ID NO:1 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:1 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia forma parte de la invención como péptido modificado de la endoglucanasa RCE I. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 es un péptido señal para la secreción, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la actividad del péptido señal, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan genes de la endoglucanasa RCE I que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1015-1017. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 70-72 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente, compuesta por 315 residuos.

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(2) Endoglucanasa RCE II y Genes de la Misma

La endoglucanasa RCE II es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 343 de la SEQ ID NO:3 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:3 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia es un péptido modificado de la endoglucanasa RCE II. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 es un péptido señal, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la señal, la actividad peptídica, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

Se proporcionan genes de la endoglucanasa RCE II que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1099-1101. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 70-72 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente compuesta de 343
residuos.

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(3) Endoglucanasa RCE III y Genes de la Misma

La endoglucanasa RCE III es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 337 de la SEQ ID NO:5 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:5 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia es un péptido modificado de la endoglucanasa RCE III. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -23 hasta la posición -1 es un péptido señal, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la actividad del péptido señal, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

Se proporcionan genes de la endoglucanasa RCE III que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1081-1083. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 70-72 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente compuesta de 337 residuos.

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(4) Endoglucanasa MCE I y Genes de la Misma

La endoglucanasa MCE I es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 316 de la SEQ ID NO:7 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -22 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:7 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia es un péptido modificado de la endoglucanasa MCE I. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -22 hasta la posición -1 es un péptido señal para la secreción, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la actividad del péptido señal, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

Se proporcionan genes de la endoglucanasa MCE I que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1015-1017. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 67-69 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente compuesta de 316 residuos.

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(5) Endoglucanasa MCE II y Genes de la Misma

La endoglucanasa MCE II es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 365 de la SEQ ID NO:9 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -22 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:9 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia es un péptido modificado de la endoglucanasa MCE II. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -22 hasta la posición -1 es un péptido señal, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la actividad del péptido señal, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

Se proporcionan genes de la endoglucanasa MCE II que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:10. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:10 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1162-1164. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 67-69 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente compuesta de 365 residuos.

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(6) Endoglucanasa PCE I y Genes de la Misma

La endoglucanasa PCE I es una enzima cuya secuencia de aminoácidos abarca desde la posición 1 hasta la posición 327 de la SEQ ID NO:11 y que tiene actividad endoglucanasa. La secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -19 hasta la posición -1 de la SEQ ID NO:11 o una parte de la misma se puede añadir al N-terminal de la proteína anterior. El polipéptido al que se añade esta secuencia es un péptido modificado de la endoglucanasa PCE I. Como se cree que esta secuencia de aminoácidos que abarca desde la posición -19 hasta la posición -1 es un péptido señal, una parte de la secuencia significa una secuencia parcial que conserva la actividad del péptido señal, así como una secuencia que permanece en el N-terminal como consecuencia de alguna diferencia que tuvo lugar en el sitio de procesamiento dependiendo del tipo de huésped.

Se proporcionan genes de la endoglucanasa PCE I que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11. Una secuencia típica de estos genes comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:12. La secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:12 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 1-3 y termina con TAA en las posiciones 1039-1041. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 58-60 corresponde al aminoácido N-terminal en la proteína madura descrita anteriormente compuesta de 327 residuos.

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Vectores de Expresión y Microorganismos Transformados

De acuerdo con la invención, se proporciona un vector de expresión replicable en un microorganismo huésped, el cual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1. Este vector de expresión es un vector de replicación autónoma y se puede construir en base, por ejemplo, a un plásmido que existe como entidad extracromosómica y se replica independientemente del cromosoma. Como alternativa, el vector de expresión puede ser un vector que se integra en el genoma del microorganismo huésped al ser introducido en el mismo y se replica junto con el cromosoma en el que se ha incorporado. Para la construcción del vector de la invención se pueden utilizar procedimientos y métodos convencionales empleados en el campo de la ingeniería genética.

Para la expresión de una proteína con la actividad deseada cuando se introduce en el microorganismo huésped es conveniente que el vector de expresión de la invención contenga secuencias de ADN para regular los marcadores de expresión y de los genes, etc., para la selección del microorganismo transformado, además de la secuencia de ADN de la invención. Ejemplos de secuencias de ADN reguladoras de la expresión incluyen promotores, terminadores y secuencias de ADN que codifican péptidos señal. El promotor que se puede utilizar en la invención no está particularmente limitado, siempre que muestre actividad de transcripción en el microorganismo huésped. Se puede obtener como una secuencia de ADN que controla la expresión de un gen que codifica una proteína homogénea o heterogénea del microorganismo huésped. El péptido señal que se puede utilizar en la invención no está particularmente limitado, siempre que contribuya a la secreción de la proteína en el microorganismo huésped. Se puede obtener a partir de secuencias de ADN derivadas de un gen que codifica una proteína homogénea o heterogénea del microorganismo huésped. El marcador genético que se puede utilizar en la invención se selecciona de forma apropiada dependiendo del método de selección de los transformantes. Por ejemplo, se pueden utilizar genes que codifican una resistencia a medicamentos o genes que complementan la auxotrofia.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona además un microorganismo transformado con el vector de expresión. Este sistema vector-huésped no está particularmente limitado. Ejemplos de sistemas vector-huésped útiles incluyen un sistema que utiliza un microorganismo tal como Escherichia coli, actinomicetos, levaduras u hongos filamentosos; así como un sistema de expresión de proteínas de fusión que utiliza dicho microorganismo.

La transformación de microorganismos con el vector de expresión de la invención se puede llevar a cabo por métodos convencionales en la técnica.

Además, el transformante resultante se puede cultivar en un medio apropiado, seguido de aislamiento de la proteína de la invención del caldo de cultivo resultante. Por tanto, según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir la nueva proteína de la invención. Las condiciones de cultivo del transformante pueden ser esencialmente las mismas que las del microorganismo utilizado como huésped. En cuanto al método de recuperación de la proteína de interés del caldo de cultivo del transformante, se pueden emplear los métodos convencionales en la técnica.

De acuerdo con un aspecto preferente de la invención, se proporcionan células de levadura capaces de expresar la endoglucanasa codificada por la secuencia de ADN de la invención. Ejemplos de células de levadura que se pueden utilizar en la invención incluyen microorganismos que pertenecen al género Saccharomyces, al género Hansenula o al género Pichia (por ejemplo, Saccaromyces cerevisiae).

Además, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar una endoglucanasa producida por una levadura transformada con el vector de expresión de la invención cuando la endoglucanasa no muestra una actividad disponible para un uso apropiado en la invención. Ejemplos de actividades disponibles para usos apropiados de acuerdo con la invención incluyen la actividad que se puede emplear en la eliminación de pelusa de tejidos que contienen celulosa.

Van Arsdell, J.N. y col. informaron que cuando una proteína heterogénea se expresa en células de levadura, a veces, tiene lugar una sobre-glicosilación (es decir, la adición excesiva de cadenas de azúcar) (Van Arsdell, J.N., 1987, Bio Technology, 5, 60-64). Por tanto, con el fin de expresar una proteína con la actividad deseada en dichas células de levadura, puede resultar necesario el control de la adición por glicosilación.

Para el control de la glicosilación, tal como se describe anteriormente, es posible utilizar células huésped de levadura cuya capacidad de glicosilación ha sido limitada (o incluso suprimida) por técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Como método más adecuado para la producción de la endoglucanasa de la invención se proporciona un método en el que la endoglucanasa se expresa en hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina. Cuando la enzima se expresa en hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina, conviene utilizar un gen optimizado por codones en el que los codones han sido optimizados conforme al uso de codones en hongos filamentosos huésped. En la presente invención, un "gen optimizado por codones" se refiere a un gen que tiene una secuencia de ADN tal como la que se obtiene mediante la sustitución de los codones de una secuencia de ADN que codifica una proteína basada en la información de los codones de uso frecuente en un hongo filamentoso huésped.

Ejemplos de genes optimizados por codones más adecuados en la invención incluyen genes que no contienen secuencias de reconocimiento de intrones o que apenas las contienen. El término "secuencia de reconocimiento de intrones" empleado aquí se refiere a una secuencia de ADN que puede ser reconocida por hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina como intrón. De forma más específica, la secuencia de reconocimiento de intrones se refiere a una secuencia de ADN tal como GTAGN, GTATN, GTAAN, GTACGN, GTGTN, GCACGN o GTTCGN. La ausencia de estas secuencias de ADN conduce a una mejora en la estabilidad del ARNm que es el producto de la transcripción de un gen de interés.

De acuerdo con la presente invención, es posible obtener un rendimiento industrialmente preferente de la endoglucanasa mediante sintetización total del gen optimizado por codones descrito anteriormente, integrándolo en un vector de expresión y transformando un hongo filamentoso huésped con el vector. El hongo filamentoso huésped de la invención puede pertenecer al género Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Acremonium o Fusarium. Ejemplos preferentes de éstos incluyen Humicola insolens, Aspergillus niger y Trichoderma viride.

Un ejemplo de genes optimizados por codones utilizados en la invención es el gen RCE I optimizado por codones de la endoglucanasa. Este gen es un gen optimizado por codones que codifica la endoglucanasa RCE I que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1. Una secuencia típica de este gen comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO:13. La secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO:13 contiene un marco de lectura abierto que empieza por ATG en las posiciones 16-18 y termina con TAA en las posiciones 1030-1032. La secuencia de nucleótidos de las posiciones 85-87 corresponde al aminoácido N-terminal de la proteína madura mencionada anteriormente de 315 residuos.

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Utilización de las Preparaciones de Celulasa/Celulasas

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan preparaciones de celulasa que comprenden la endoglucanasa de la invención. La preparación de celulasa de la invención se puede obtener mediante mezcla de la endoglucanasa de la invención con los componentes habitualmente contenidos en las preparaciones de celulasa, tales como excipientes (por ejemplo lactosa, cloruro de sodio, sorbitol), agentes tensioactivos y conservantes. La preparación de celulasa de la invención se puede preparar de forma adecuada, por ejemplo como una formulación en polvo o líquida, o en gránulos.

Según la presente invención, se proporciona además un método para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa se convierten en tejidos con pelusas o para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa se convierten en rígidos o para reducir la rigidez de dicha fibra. Cada uno de estos métodos comprende una etapa de tratamiento de los tejidos que contienen celulosa con la endoglucanasa o con la preparación de celulasa de la invención.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona además un método de clarificación del color de tejidos coloreados que contienen celulosa, el cual comprende una etapa de tratamiento de los tejidos coloreados que contienen celulosa con la endoglucanasa o con la preparación de celulasa, así como un método para proporcionar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un cambio parcial de color, es decir un método para dar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un aspecto de material de "lavado a la piedra", método que comprende una etapa de tratamiento de los tejidos coloreados que contienen celulosa con la endoglucanasa o con la preparación de celulasa de la invención.

Los métodos de la invención descritos anteriormente se pueden llevar a cabo mediante el tratamiento de los tejidos que contienen celulosa durante el lavado. Como alternativa, en algunas ocasiones, el tratamiento del tejido se puede realizar durante el remojo o el enjuague, mediante la adición de la endoglucanasa o de la preparación de celulasa de la invención en el agua donde se remoja o se debe remojar el tejido.

Se pueden determinar adecuadamente las condiciones, tales como temperatura de contacto o cantidad de endoglucanasa, teniendo en cuenta otras condiciones diferentes. Por ejemplo, en el tratamiento para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa se convierten en tejidos con pelusas o para reducir la rigidez de dicho tejido, el tejido se puede tratar con la endoglucanasa a una concentración proteica de 0,2-1 mg/l a aproximadamente 45-55ºC.

En el tratamiento de perdida de peso de los tejidos que contienen celulosa para mejorar su tacto y su aspecto, se pueden tratar los tejidos con la endoglucanasa a una concentración proteica de 5-100 mg/l a aproximadamente 45-55ºC.

Además, se pueden tratar los tejidos con la endoglucanasa a una concentración proteica de 2-10 mg/l a aproximadamente 45-55ºC para dotar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un cambio de color parcial.

Al utilizar la endoglucanasa o la preparación de celulasa de la invención en composiciones detergentes, se puede mejorar la eliminación de suciedad granular, la clarificación del color, la eliminación de pelusa, la eliminación de pelotillas y la reducción de la rigidez.

La composición detergente de la invención puede contener igualmente un agente tensioactivo (que puede ser un agente tensioactivo aniónico, no iónico, catiónico, anfótero o zwitteriónico, o una mezcla de los mismos). Además, la composición detergente de la invención puede contener otros componentes detergentes conocidos en la técnica, tales como aditivos alternativos, agentes blanqueantes, activadores de blanqueo, inhibidores de corrosión, agentes secuestrantes, polímeros disociadores de manchas, aromáticos, otras enzimas, estabilizadores de enzimas, asistentes de formulación, agentes abrillantadores fluorescentes, promotores de espuma, etc. Ejemplos de agentes tensioactivos aniónicos representativos incluyen sulfonato de alquilbenceno lineales (LAS), alquilsulfato (AS), sulfonato de \alpha-olefina (AOS), etoxi sulfato de alcohol (AES) y sales de metales alcalinos de ácidos grasos naturales. Ejemplos de agentes tensioactivos no iónicos incluyen alquil polietilenglicol éter, nonilfenol polietilenglicol éter, ésteres de ácido graso de sacarosa y glucosa y ésteres de alquilglucósido polietoxilado.

Se ha descubierto que el tratamiento de papel usado con la endoglucanasa o con la preparación de celulasa de la invención puede destintar el papel. Por tanto, la utilización de la endoglucanasa de la invención en el proceso de fabricación de papel reciclado a partir de papel usado puede reducir en gran medida la tinta que queda en la fibra, mejorando así la blancura del papel reciclado. Ejemplos de papel usado que se puede utilizar en la invención incluyen papel impreso usado, tal como papel de periódico usado, papel de revista usado y papel impreso usado de calidad inferior o de calidad intermedia que contiene pulpa mecánica y pulpa química; papel de pasta química usado compuesto de pulpa química; y papel estucado de la misma. El término "agente de destinte" empleado aquí significa aquellas drogas utilizadas comúnmente en el destinte de papel usado, incluyendo bases como NaOH o Na_{2}CO_{3}, silicato de sosa, peróxido de hidrógeno, fosfatos, agentes tensioactivos aniónicos o no iónicos, agentes secuestrantes tales como ácido oleico, estabilizadores de pH como auxiliares, agentes quelantes o dispersantes.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto asimismo que el tratamiento de la pulpa de papel con la endoglucanasa de la invención puede mejorar significativamente el refinado (desgote) de la pulpa sin notable reducción en su resistencia. Por tanto, la presente invención proporciona un método para mejorar el refinado de la pulpa de papel, el cual comprende una etapa de tratamiento de la pulpa de papel con la endoglucanasa o con la preparación de la celulasa de la invención. Ejemplos de pulpa que se puede tratar por medio del método de la invención incluyen pulpa de papel usado, pulpa de cartón reciclado, pulpa kraft, pulpa de sulfito o pulpa procesada/tratada térmicamente, y otras pulpas de alto rendimiento.

Además, la digestibilidad de los glucanos en los alimentos para animales puede mejorar mediante la utilización de la endoglucanasa de la invención en dicho alimentos. Por tanto, la presente invención proporciona un método para mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales, el cual comprende una etapa de tratamiento del alimento para animales con la endoglucanasa o con la preparación de celulasa de la invención.

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Ejemplos

La presente invención se describe además de forma detallada por medio de los siguientes ejemplos, pero sin limitarse a los mismos.

Actividad de Endoglucanasa

En adelante, actividad endoglucanasa significa actividad CMCasa. Además, se define una unidad de "actividad CMCasa" como la cantidad de una enzima celulasa que produce azúcares reductores que corresponden a un \mumol de glucosa por minuto, tal como se determina mediante medida de la cantidad de azúcares reductores liberados por una solución de carboximetilcelulosa (CMC, Tokyo Kasei Kogyo, Japón) después de la incubación con la enzima durante cierto período de tiempo.

Ejemplo A1 Aislamiento y purificación de la enzima endoglucanasa procedente de Rhizopus oryzae

Se sometió la cepa CP96001 de Rhizopus oryzae (FERM BP-6889) a cultivo con agitación en un medio (6,0% de licor de maceración de maíz, 3,0% de salvado de trigo, 1,0% de glucosa, 0,5% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,15% de CaCO_{3}) a 28ºC. Después de la incubación durante 3 días, se retiraron las células para proporcionar un sobrenadante de cultivo como preparación de celulasa cruda.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,25M a partir de 80 ml de la preparación de celulasa cruda y se aplicó a un caudal de 3,4 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,25M. Después se fraccionó mediante elución a un caudal de 5,0 ml/min según un método de elución paso a paso en el que la concentración de sulfato de amonio en agua desionizada se redujo en cada paso en 0,25M a partir de 1,25M. Entre las fracciones, se descubrió que una porción de estas fracciones obtenidas a una concentración de sulfato de amonio de 0,75M tenía una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. Por tanto, se aislaron 50 ml de esta fracción. Mediante la repetición 150 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 121 ml del sobrenadante de cultivo para proporcionar 7,5 ml de fracciones activas.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,25M a partir de 7,5 ml de las fracciones activas. De entre ellas, se aplicaron 190 ml de las fracciones a un caudal de 2,8 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,25M. Luego se aplicaron paso a paso soluciones de sulfato de amonio 1,25M y 1,125M a un caudal de 5,0 ml/min. Se descubrió que las fracciones entonces eluidas con aproximadamente 20 ml de agua desionizada tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel y, por ello, se agruparon. Mediante la repetición 40 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 7,5 ml de las fracciones activas obtenidas en la etapa anterior para proporcionar 800 ml de fracciones activas.

Después, se diluyeron 800 ml de las fracciones activas 10 veces con un tampón de acetato 50 mM (pH 4,0) a 8,0 ml de una solución, de la cual 23 ml se aplicaron a un caudal de 0,9 ml/min a una cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia Biotech) que había sido equilibrada con el tampón de acetato 50 mM (pH 4,0). Luego, se eluyó con un gradiente lineal de Tampón A (tampón de acetato 50 mM, pH 4,0) y Tampón B (tampón de acetato 50 mM que contenía NaCl 1M, pH 5,2) a un caudal de 0,9 ml/min. Se aislaron estas fracciones, de las que se descubrió tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. La fraccionación por cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 se repitió 350 veces para aislar una enzima endoglucanasa purificada RCE I. Esta RCE I mostró una sola banda en la SDS-PAGE y tenía un peso molecular (MW) de aproximadamente 40 kD. La SDS-PAGE utilizó NPU-12,5L PAGEL (ATTO Japón) y se llevaron a cabo la migración y tinción de acuerdo con la especificación unida al gel. Los estándares de peso molecular utilizados fueron el rango inferior estándar de peso molecular en SDS-PAGE (BioRad Laboratories).

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Ejemplo A2 Aislamiento y purificación de la enzima endoglucanasa procedente de Mucor circinelloides

Se sometió la cepa CP99001 de Mucor circinelloides (FERM BP-6890) a cultivo con agitación en un medio (3,0% de licor de maceración de maíz, 3,0% de salvado de trigo, 3,0% de glucosa, 0,5% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,15% de CaCO_{3}) a 28ºC. Después de la incubación durante 3 días, se retiraron las células para proporcionar un sobrenadante de cultivo como preparación de celulasa cruda.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,5M a partir de 120 ml de la preparación de celulasa cruda y se aplicó a un caudal de 3,0 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,5M. Después, se fraccionó mediante elución a un caudal de 5,0 ml/min según un método de elución paso a paso en el que la concentración de sulfato de amonio en agua desionizada se redujo en cada paso en 0,3 M desde 1,5 M. Entre las fracciones, se descubrió que aquellas obtenidas a una concentración de sulfato de amonio 0,6M tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. Por tanto, se aislaron 64,3 ml de esta fracción. Mediante la repetición 14 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 1.710 ml del sobrenadante de cultivo para proporcionar 900 ml de fracciones activas.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,5M a partir de 300 ml de las fracciones activas y se aplicaron a un caudal de 3,0 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,5M. Luego se aplicaron paso a paso soluciones de sulfato de amonio 1,5M y 0,9 M a un caudal de 5,0 ml/min. Se descubrió que las fracciones entonces eluidas con aproximadamente 30 ml de agua desionizada tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel y, por ello, se agruparon. Mediante la repetición 3 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 900 ml de las fracciones activas obtenidas en la etapa anterior para proporcionar 90 ml de fracciones activas.

Después, se diluyeron 90 ml de las fracciones activas 10 veces con un tampón de acetato 50 mM (pH 4,0) a 900 ml de una solución, de la cual 150 ml se aplicaron a un caudal de 1,0 ml/min a cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia Biotech) que había sido equilibrada con el tampón de acetato 50 mM (pH 4,0). Luego, se eluyó con un gradiente lineal de Tampón A (tampón de acetato 50 mM, pH 4,0) y Tampón B (tampón de acetato 50 mM que contenía NaCl 1M, pH 5,2) a un caudal de 1,0 ml/min. Se aislaron estas fracciones, de las que se descubrió tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. La fraccionación por cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 se repitió 6 veces para aislar una enzima endoglucanasa purificada MCE I. Esta MCE I mostró una sola banda en la SDS-PAGE y tenía un peso molecular (MW) de aproximadamente 41 kD. La SDS-PAGE utilizó NPU-12,5L PAGEL (ATTO Japón) y se llevaron a cabo la migración y tinción de acuerdo con la especificación unida al gel. Los estándares de peso molecular utilizados fueron el rango inferior estándar de peso molecular en SDS-PAGE (BioRad Laboratories).

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Ejemplo A3 Aislamiento y purificación de la enzima endoglucanasa procedente de Phycomyces nitens

Se sometió la cepa CP99002 de Phycomyces nitens (FERM BP-6891) a cultivo en vaso fermentador en un medio (2,0% de licor de maceración de maíz, 3,0% de salvado de trigo, 2,0% de sacarosa, 1,0% de extracto de levadura, 0,05% de KH_{2}PO_{4}, 0,03% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,15% de CaCl_{2}, 0,01% de adecanol) a 28ºC, 220 rpm. Después de incubación durante 3 días, el sobrenadante de cultivo del que se retiraron las células se concentró 10 veces por ultrafiltración utilizando una membrana con un peso molecular digerido de 5.000.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,5M a partir de 120 ml del concentrado ultrafiltrado y se aplicó a un caudal de 3,0 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,5M. Después se fraccionó mediante elución a un caudal de 5,0 ml/min según un método de elución paso a paso en el que la concentración de sulfato de amonio en agua desionizada se redujo en cada paso en 0,3M desde 1,5M. Entre las fracciones, se descubrió que aquellas obtenidas a una concentración de sulfato de amonio 0,3M tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. Por tanto, se aislaron 66 ml de esta fracción. Mediante la repetición 10 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 1.200 ml del concentrado ultrafiltrado para proporcionar 660 ml de fracciones activas.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,5M a partir de 165 ml de las fracciones activas y se aplicaron a un caudal de 3,0 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una solución de sulfato de amonio 1,5M. Luego se aplicaron paso a paso soluciones de sulfato de amonio 1,5M y 0,75M a un caudal de 5,0 ml/min. Se descubrió que las fracciones entonces eluidas con aproximadamente 30 ml de agua desionizada tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel y, por ello, se agruparon. Mediante la repetición 4 veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 660 ml de las fracciones activas obtenidas en la etapa anterior para proporcionar 120 ml de fracciones activas.

Después, se diluyeron 120 ml de las fracciones activas 10 veces con el tampón de acetato 50 mM (pH 4,0) a 1.200 ml de una solución, de la cual 100 ml se aplicaron a un caudal de 1,0 ml/min a una cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia Biotech) que había sido equilibrada con el tampón de acetato 50 mM (pH 4,0). Luego, se eluyó con un gradiente lineal de Tampón A (tampón de acetato 50 mM, pH 4,0) y Tampón B (tampón de acetato 50 mM que contenía NaCl 1M, pH 5,2) a un caudal de 1,0 ml/min. Se aislaron estas fracciones, de las que se descubrió tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. La fraccionación por cromatografía de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 se repitió 12 veces para aislar una enzima endoglucanasa purificada PCE I. Esta PCE I mostró una sola banda en la SDS-PAGE y tenía un peso molecular (MW) de aproximadamente 45 kD. La SDS-PAGE utilizó NPU-1,25L PAGEL (ATTO Japón) y se llevaron a cabo la migración y tinción de acuerdo con la especificación unida al gel. Los estándares de peso molecular utilizados fueron el rango inferior estándar de peso molecular en SDS-PAGE (BioRad Laboratories).

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Ejemplo A4 Evaluación de la acción de RCE I, MCE I y PCE I sobre tejidos de celulosa regenerada por medida en lavadora

Se evaluó la actividad de eliminación de pelusa en liocel, representativa de tejidos de celulosa regenerada, de la enzima endoglucanasa purificada RCE I, MCE I y PCE I obtenida en los Ejemplos A1 a A3 de la siguiente manera.

Tejido de punto teñido de liocel (Toyoshima Japan) se metió en una gran lavadora que contenía agentes tensioactivos y bolas de goma. A continuación, el tejido de punto con pelusas de liocel (Toyoshima Japan, 9 cm x 10 cm, de aproximadamente 2 g en peso) se cosió cilíndricamente y se sometió a tratamiento de eliminación de pelusa con varias enzimas en las condiciones expuestas más abajo. Se calcularon las concentraciones de proteínas de RCE I, MCE I y PCE I exigidas para eliminar completamente la pelusa en la parte interior del tejido cilíndrico por el tratamiento.

Se calcularon las concentraciones de proteínas de varias endoglucanasas desde la zona pico a UV 280 nm de la endoglucanasa respectiva eluída con un gradiente lineal del 0% al 80% de una concentración de acetonitrilo en un 0,05% de TFA (ácido trifluoroacético) a un caudal de 1,0 ml/min en un análisis por HPLC utilizando una columna TMS-250 de gel TSK (4,6 mm I.D. x 7,5 cm, Toso Japan). El estándar utilizado fue NCE4 purificada, que fue analizada en HPLC bajo las mismas condiciones, cuya concentración de proteína había sido medida previamente por el kit de ensayo de proteínas (BioRad Laboratories). El estándar utilizado para medir la concentración de proteínas en el kit de ensayo de proteínas fue el estándar de albúmina (eroalbúmina bovina, fracción V, PIERCE). La NCE4 purificada se aisló y se purificó del caldo de cultivo de Humicola insolens de acuerdo con el método según se describe en WO 98/03640.

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG, Japón)

Temperatura de reacción: 55ºC para RCE I y 50ºC para MCE I y PCE I

Tiempo: 60 minutos

Volumen de reacción: 40 ml

pH de reacción: pH 5 (tampón de acetato 10 mM); pH 6 (tampón de acetato 10 mM)

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El líquido de tratamiento contenía 4 bolas de goma (de aproximadamente 16 g cada una) junto con la solución de endoglucanasa.

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Se muestran los resultados en la Tabla 1 siguiente.

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TABLA 1

3

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Ejemplo A5 Evaluación de la acción de RCE I, MCE I y PCE I sobre tejido de celulosa regenerada a distintos pH por medida en lavadora

Tejido teñido de liocel (Toyoshima Japan) se metió en una gran lavadora que contenía agentes tensioactivos y bolas de goma. A continuación, se llevó a cabo el tratamiento de eliminación de pelusas en liocel con RCE I, MCE I y PCE I en las condiciones que se exponen más abajo, y las concentraciones de proteínas de las distintas endoglucanasas exigidas para eliminar completamente la pelusa se calcularon a cada pH. El valor de actividad en cada pH se muestra en el gráfico adjunto por su actividad relativa en comparación con el valor de actividad (100) en la región de pH a la cual se observó la actividad más alta. Como control, se evaluó similarmente NCE4 purificada, que es el componente de la endoglucanasa procedente de Humicola insolens descrita en WO 98/03640.

Se calcularon las concentraciones de proteínas de varias endoglucanasas desde la zona pico a UV 280 nm de la endoglucanasa respectiva eluída con un gradiente lineal del 0% al 80% de una concentración de acetonitrilo en un 0,05% de TFA (ácido trifluoroacético) a un caudal de 1,0 ml/min en análisis por HPLC utilizando una columna TMS-250 de gel TSK (4,6 mm I.D. x 7,5 cm, Toso Japan). El estándar utilizado fue NCE4 purificada, que fue analizada en HPLC en las mismas condiciones, cuya concentración de proteína había sido medida previamente por el kit de ensayo de proteínas (BioRad Laboratories). El estándar utilizado para medir la concentración de proteínas en el kit de ensayo de proteínas fue el estándar de albúmina (seroalbúmina bovina, fracción V, PIERCE).

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG, Japón)

Temperatura de reacción: 55ºC para NCE4 y RCE I y 50ºC para MCE I y PCE I

Tiempo: 60 minutos

Volumen de reacción: 40 ml

pH de reacción: pH 4-6 (tampón de acetato 10 mM); pH 7-9 (tampón de Tris-HCl 10 mM); pH 9-10 (tampón de hidróxido sódico-glicina 10 mM)

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El líquido de tratamiento contenía 4 bolas de goma (de aproximadamente 16 g cada una) junto con la solución de endoglucanasa.

Se muestran los resultados en la Fig. 1. Como se puede observar a partir de la figura, el pH óptimo para RCE I, MCE I y PCE I es 5-7 y estas enzimas en el pH 5-8 poseían un 70% o más de la actividad al pH óptimo. Por otra parte, el control NCE4 tenía un pH óptimo de 5 y poseía sólo un 30% o menos de la actividad en el pH óptimo, en la región de pH de 6,2 o más. A partir de estos resultados, es evidente que RCE I, MCE I y PCE I son notablemente muy activos bajo condiciones alcalinas.

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Ejemplo A6 Evaluación de la actividad decolorante de fibra que contiene celulosa teñida de Denim por RCE I

Se sometieron unos pantalones vaqueros sin apresto (desized) de doce onzas (340 g aprox.) a un tratamiento de decoloración con la preparación de celulasa cruda y con la enzima endoglucanasa purificada RCE I obtenida en el Ejemplo A1 bajo las siguientes condiciones.

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Máquina de ensayo: Lavadora de 20 kg (Sanyo Denki Japan, lavadora totalmente automática SCW5101)

Temperatura: 55ºC

Tiempo: 60 minutos

pH: 6,2 (tampón de fosfato 6,7 mM)

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El líquido de tratamiento contenía una cantidad adecuada de bolas de goma junto con la preparación de celulasa.

La decoloración se midió mediante un espectrofotómetro (Minolta, CM-525i). En primer lugar, se establecieron las condiciones para la observación en D_{65} como fuente luminosa y 2º como campo visual, la observación y la calibración del valor L* (luminosidad) en el sistema de color L*a*b* se efectuó de acuerdo con el manual del producto. Después, se midieron en estas condiciones los valores L* en el sistema de color L*a*b* de varias muestras. Se obtuvo un aumento del valor L* (incremento del brillo) en comparación con un control (fibra no tratada), es decir, valor \DeltaL* y el grado de decoloración se evaluó mediante el valor \DeltaL*. Esto es, se midieron los valores \DeltaL* en 10 puntos en cada zona de prueba (n=10) y se calculó el promedio. Entonces, se calculó la concentración de proteína de endoglucanasa necesaria para proporcionar un valor \DeltaL* de 7.

Se cuantificó la concentración de proteína mediante seroalbúmina bovina como estándar en el kit de ensayo de proteínas (BioRad Laboratories).

Se muestran los resultados en la Tabla 2 siguiente.

TABLA 2

4

Ejemplo A7 Prueba de procesamiento de la pérdida de peso de RCE I en varios tejidos

Se sometieron a tratamiento enzimático varios tejidos que contenían celulosa (15 cm x 10 cm), cuyo peso absoluto en seco había sido medido previamente, en las siguientes condiciones:

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG. Japón)

Temperatura: 55ºC

Tiempo: 60 minutos

pH: 6 (tampón de acetato 10 mM)

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El líquido de tratamiento contenía una cantidad apropiada de microesferas de acero inoxidable (Daiei Kagaku Seiki MFG. Japón) junto con la preparación de RCE I (concentración de proteínas de 8,0 mg/l). Se cuantificó la concentración de proteínas utilizando seroalbúmina bovina como estándar en el kit de ensayo de proteínas (BioRad Laboratories).

Se midieron los pesos absolutos en seco del tejido antes y después del tratamiento con enzimas para calcular el porcentaje de pérdida de peso. Se muestran los resultados en la Tabla siguiente.

5

Ejemplo B1 Secuencias parciales de aminoácidos de RCE I, MCE I y PCE I (1) Identificación de residuos de aminoácidos N-terminales

Con el fin de determinar las secuencias de aminoácidos N-terminales de las proteínas purificadas obtenidas en los Ejemplos A1 a A3, se llevó a cabo una cromatografía en columna (columna: C8 220 x 2,1 mm, gradiente desde un 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo a un 0,085% de TFA, 70% de acetonitrilo) en el sistema HPLC preparativa Modelo 172\mu (Perkin Elmer) para purificar además la proteína diana. Se sometió al secuenciador de proteínas Modelo 492 (Perkin Elmer) para determinar la secuencia de aminoácidos N-terminales. Las secuencias resultantes son las mostradas más abajo.

Secuencia de aminoácidos N-terminal de RCE I (SEQ ID NO:14):

6

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Secuencia de aminoácidos N-terminal de MCE I (SEQ ID NO:15):

7

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Secuencia de aminoácidos N-terminal de PCE I (SEQ ID NO:16):

8

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(2) Mapeo peptídico

La proteína de RCE I purificada en (1) más arriba se liofilizó y se disolvió en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Se añadió lisil endopeptidasa (Wako Pure Chemical Japan) en una cantidad de aproximadamente 1/100 moles por mol de proteína y se sometió a reacción a 37ºC durante 48 horas. Este producto de segmentación se sometió a cromatografía en columna en el sistema de HPLC mencionado anteriormente (columna: C18 220 x 2,1 mm, gradiente desde un 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo a un 0,085% de TFA, 35% de acetonitrilo) para aislar 5 péptidos. Las secuencias de aminoácidos de los fragmentos peptídicos resultantes se determinaron mediante el secuenciador de proteínas mencionado anteriormente. Los resultados se exponen más abajo.

LE-1: Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Met-Thr-Tyr-Lys (10 residuos) (SEQ ID NO:38)

LE-2: Tyr-Ser-Ala-Val-Ser-Gly-Gly-Ala-Ser-Gly (10 residuos) (SEQ ID NO:39)

LE-3: Ser-Ala-Ser-Asp-(Cys)-Ser-Ser-Leu-Pro-Ser-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-(Cys)-Lys (17 residuos) (SEQ ID NO:40)

LE-4: Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser-Ala-Ser-Asp-(Cys)-Ser-Ser-Leu-Pro-Ser-Ala-Leu-Gln (18 residuos) (SEQ ID NO:41)

LE-5: Arg-Phe-Asn-Trp-Phe-Lys (6 residuos) (SEQ ID NO:42)

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Ejemplo B2 Aislamiento del ADN genómico

Se aislaron los ADN genómicos de la siguiente manera:

Se cultivó Rhizopus oryzae en 30 ml de medio líquido YPD (1% de extracto de levadura (Difco), 2% de polipeptona (Wako Pure Chemical), 2% de sacarosa) a 30ºC durante 40 horas, se cultivó Mucor circinelloides en 30 ml de medio líquido YPD (0,5% de extracto de levadura (Difco), 2,4% de caldo de la dextrosa de patata (Difco), 2% de sacarosa) a 30ºC durante 18 horas, y se cultivó Phycomyces nitens en 30 ml de medio líquido YPD (0,5% de extracto de levadura (Difco), 2,4% de caldo de la dextrosa de patata (Difco), 2% de sacarosa) a 30ºC durante 48 horas. Se recogieron las células procedentes de cada caldo cultivado a través de un filtro de vidrio. Las células resultantes se liofilizaron, se trituraron en una trituradora y se disolvieron en 8 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM). Se añadieron 4 ml de tampón TE que contenía un 10% de SDS y se incubaron a 60ºC durante 30 minutos. Después, se añadieron 12 ml de fenol-cloroformo-isoamil alcohol (25:24:1) y se agitaron fuertemente. Después de centrifugación, se transfirió la capa acuosa a otro recipiente, al que se añadió 1 ml de acetato de potasio 5M y se dejó reposar en hielo durante una hora o más. Después de centrifugación, se trasladó la capa acuosa a otro recipiente, al que se añadieron 2,5 volúmenes de etanol para precipitar el ADN. Se secó el precipitado y luego se disolvió en 5 ml de tampón TE. A continuación, se añadieron 5 \mul de la solución de ribonucleasa A 10 mg/ml (RNasa A) y se incubó a 37ºC durante una hora. Después, se añadieron 50 \mul de la solución de proteinasa K 20 mg/ml y se incubó a 37ºC durante una hora. A continuación, se añadieron 3 ml de la solución de polietilenglicol (20% de PEG 6000, NaCl 2,5M) para precipitar el ADN. Se disolvió el precipitado en 500 \mul de tampón TE y se extrajo dos veces con fenol-cloroformo-isoamil alcohol seguido de precipitación de etanol. Se lavó el precipitado con un 70% de etanol, se secó y se disolvió en una cantidad apropiada de tampón TE para preparar una muestra.

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Ejemplo B3 Preparación de la sonda de cadena larga mediante PCR (1) Amplificación del fragmento de ADN diana por PCR

Como sonda de ADN, se preparó una sonda larga que se amplificó a partir del ADN total de Rhizopus oryzae como patrón por el método PCR.

Como cebador de cada uno, se sintetizaron los ADN que correspondían a los aminoácidos N-terminales y los aminoácidos del péptido LE-5 marcado con *. Los oligonucleótidos sintéticos preparados tenían las siguientes secuencias.

Rh-N: AARAAYTGGAAYGGXCCNAC (20mer) (SEQ ID NO:43)

Rh-4.3a: TTRAACCARTTRAANCG (17mer) (SEQ ID NO:44)

Rh-4.3b: TTRAACCARTTRAAYCT (17mer) (SEQ ID NO:45)

donde R es A o G; Y es C o T; N es A, G, C o T; y X es una inosina.

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Se llevó a cabo la reacción PCR en las siguientes condiciones: en primer lugar, se prepararon dos conjuntos de tubos, cada uno de los cuales contenía 1 \muM de cada uno de los cebadores Rh-N y Rh-4.3a o 1 \muM de cada uno de los cebadores Rh-N y Rh-4.3b además de 1 \mug del ADN genómico de Rhizopus oryzae, y se sometieron a desnaturalización térmica a 95ºC durante 2 minutos en presencia de dNTPs. Luego, se añadió polimerasa Taq (Taq Recombinante, Takara Shuzo) y se repitieron 25 veces las condiciones de reacción de 94ºC durante 1 minuto, 45ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos, seguido de incubación a 72ºC durante 10 minutos. El producto de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y los resultados mostraron que aproximadamente 800 pb de ADN se amplificaron solamente cuando se utilizaron como cebadores Rh-N y Rh-4.3b.

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(2) Subclonación del producto de PCR

El fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb amplificado por PCR mencionado anteriormente se recuperó por medio del Kit Sephaglas Band Prep (Pharmacia Biotech) y se ligó en el vector pT7 Blue T (Novagen) por medio del kit de ligación de ADN (Takara Shuzo). Se utilizó la mezcla de ligación resultante para transformar las células competentes de E. coli JM109 (Takara Shuzo). El transformante resultante se cultivó y se recuperó el ADN plasmídico por el método descrito en J. Sambrock, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2da. Ed., editado por Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, pp. 1.25-1.32. El ADN plasmídico obtenido fue digerido por varias enzimas de restricción y se sometió a electrofóresis en gel de agarosa al 0,8% para seleccionar aquellos ADN plasmídicos en los que se había insertado el fragmento de aproximadamente 800 pb. El plásmido en el que se subclonó un producto de PCR diana se denominó pRD05.

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(3) Análisis de la secuencia de nucleótidos de pRD05

Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de nucleótidos de la siguiente manera:

El aparato utilizado para el análisis de la secuencia de nucleótidos fue un secuenciador de ADN II de A.L.F. (Pharmacia Biotech). El gel de secuenciación empleado era un soporte de acrilamida de Hydrolink Long Ranger (FMC). Varios reactivos para preparar un gel utilizaron (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, urea y persulfato de amonio) y eran reactivos de grado A.L.F. (Pharmacia Biotech). Se utilizó el Kit de Secuenciación de Autolectura (Pharmacia Biotech) en la reacción de lectura de la secuencia de nucleótidos. Las condiciones para preparar el gel, las condiciones de reacción y las condiciones electroforéticas se establecieron con referencia a los detalles de cada especificación.

El patrón de ADN, pRD05, se desnaturalizó mediante bases, se alineó con cebadores universales e inversos adjuntos al Kit de Secuenciación de Autolectura y se sometió a una reacción de elongación. Los productos de reacción fueron analizados con un secuenciador para descubrir secuencias nucleotídicas de aproximadamente 400 pb, respectivamente. En base a estos resultados, se prepararon los cebadores de secuenciación etiquetados FITC descritos más abajo y denominados RCE1-01 a 06 y se sometieron a reacción con pRD05 para continuar luego con la secuenciación. Consecuentemente, se determinó la secuencia nucleotídica total del fragmento de inserción de pRD05. La secuencia nucleotídica determinada fue traducida en una secuencia de aminoácidos y el marco de lectura coincidía con una porción de la secuencia de aminoácidos parcial de la endoglucanasa RCE I descrita en el Ejemplo B1. Así, el ADN de inserción contenido en el plásmido pRD05 se utilizó como sonda para la exploración posterior.

RCE-01: 5'-CAATGTCTTCCCTCTGGAAGCAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:46)

RCE-02: 5'-TGCCCTTAGTGACAGCAATGCCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:47)

RCE-03: 5'-CTTCCTTCCGCACTCCAAGCTGG-3' (23mer) (SEQ ID NO:48)

RCE-04: 5'-CCAGCTTGGAGTGCGGAAGGAAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:49)

RCE-05: 5'-TCACTAAGGGCAGTGACACCATC-3' (23mer) (SEQ ID NO:50)

RCE-06: 5'-CAGAGGGAAGACATTGAGAGTAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:51)

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Ejemplo B4 Preparación de la librería de ADN genómico (librería Sau3AI)

El ADN genómico de Rhizopus oryzae fue digerido con Sau3AI y sometido a electrofóresis en gel de agarosa al 0,8% utilizando Agarose LE (Nakarai Tesk Japan). Tras confirmar que el ADN genómico estaba digerido de forma restringida en el rango de 9 a 23 kpb, se extrajo este fragmento de ADN y se purificó de acuerdo con métodos convencionales. Este fragmento de ADN fue ligado en un vector de fago, el vector Lambda DASH II (Stratagene). Después de precipitación de etanol, se disolvió el vector en el tampón TE y se empacó enteramente en la cabeza lambda por medio del Kit de Empaque Giga Pack II (Stratagene). Luego, la cepa MRA de E. coli XLI-Blue fue infectada con el fago resultante. La librería de fagos (5 x 10^{4}) así obtenida se utilizó para clonar el gen diana.

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Ejemplo B5 Clonación del gen de RCE I (1) Screening por hibridación en placas

En primer lugar, el plásmido pRD05 obtenido en el Ejemplo B3 se segmentó con BamHI y luego se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para recuperar fragmentos de ADN de aproximadamente 800 pb, que a su vez fueron etiquetados mediante el sistema de detección de etiquetado de ADN/ARN ECL Direct (Amersham).

Después, la librería genómica de ADN (librería Sau3AI) obtenida de acuerdo con el Ejemplo B4 se trasladó a una membrana de nylon (Hybond N+Nylon Transfer Membrane, Amersham). El ADN se fijó con hidróxido sódico 0,4N, se lavó con 5 x SSC (1 x SSC, citrato trisódico 15 mM, cloruro de sodio 150 mM) y se secó para fijar el ADN. De acuerdo con el método del kit, después de la prehibridación (42ºC) durante 1 hora, se añadió la sonda etiquetada y se llevó a cabo la hibridación (42ºC) durante 15 horas. Se realizó el lavado de la etiqueta de acuerdo con la especificación adjunta al kit mencionada anteriormente. En primer lugar, lavado con un 0,4% de SDS, 0,5 x SSC con urea 6M añadida a 42ºC durante 20 minutos se repitió dos veces y después el lavado con 2 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos se realizó dos veces. Tras lavar la sonda, se sumergió la membrana de nylon en la solución de detección adjunta durante 1 minuto y luego se expuso a una película de rayos X Fuji Medical (Fuji Film) para obtener dos clones de fago.

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(2) Preparación de ADN del fago

La cepa MRA de E. coli XLI-Blue fue infectada con el fago y, después de 18 horas, se recogieron partículas del fago. Se trataron estas partículas con proteinasa K y fenol según el método de Grossberger (Grossberger, D., Nucleic Acids Res., 15, 6737 (1987)) y se precipitaron con etanol para aislar los ADN del fago.

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(3) Subclonación del gen diana

Dos ADN diferentes de fago fueron digeridos con varias enzimas de restricción y sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se transfirieron los ADN a una membrana de nylon por medio del método Southern (Southern, E.M., J. Mol. Biol., 98:503-517, 1975) y se efectuó la hibridación de la misma forma que en el Ejemplo B5 (1). Como consecuencia, los dos ADN de fago mostraron un modelo común de hibridación por digestión con las varias enzimas de restricción. Cuando los dos ADN de fago fueron digeridos con XbaI, se hibridizaron comúnmente con una banda de aproximadamente 3,5 kpb. Por tanto, esta banda se recuperó y subclonó en el sitio XbaI del plásmido pUC119. El plásmido resultante se denominó pRCEI-Xba.

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Ejemplo B6 Determinación de la secuencia de nucleótidos del gen RCE I

Se determinó la secuencia nucleotídica por el mismo método que en el Ejemplo B3 (3). Por tanto, la reacción para el análisis se llevó a cabo utilizando el plásmido pRCEI-Xba obtenido en el Ejemplo B5 como patrón de ADN y los cebadores de secuenciación etiquetados FITC de RCE 01 a 06 como cebadores. En base a estos resultados, se prepararon además los siguientes cebadores de secuenciación etiquetados FTTC como RCE1-07 a 09 y se sometieron a reacción cada uno de ellos con el plásmido pRCEI-Xba para analizar y determinar toda la secuencia nucleotídica del gen de la endoglucanasa RCE I.

RCE-07: 5'-ACAACATTATTICTTCAAACATG-3' (23mer) (SEQ ID NO:52)

RCE-08: 5'-AAATGCCGCATCAAGTTTTATTG-3' (23mer) (SEQ ID NO:53)

RCE-09: 5'-TTCACTTCTACCTCTGTTGCTGG-3' (23mer) (SEQ ID NO:54)

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Ejemplo B7 Expresión del gen de RCE I (1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen RCE I

El sitio BgIII se introdujo en los sitios inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación e inmediatamente aguas abajo del codón de terminación del gen de RCE I por mutagénesis sitio-dirigida de la siguiente forma:

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos pIN-Bgl y pIC-Bgl tal como se expone más abajo como cebadores para la mutagénesis y se fosforilaron en el extremo 5' utilizando la polinucleótido quinasa T4 (Wako Pure Chemical).

Luego, se llevó a cabo la mutagénesis sitio-dirigida utilizando el Kit de Mutagénesis in vitro Muta-Gene M13 (BioRad Laboratory). Así, la cepa CJ236 de E. coli se transformó con el plásmido pRCEI-Xba y se infectó con el fago ayudante M13 KO7 para obtener ADNs de una sola hebra (ssDNA). Este ssADN del pRCEI-Xba se alineó con los cebadores fosforilados pIN-Bgl y pIC-Bgl y se sometió a la reacción de la polimerasa. El ADN de doble hebra resultante se introdujo en la cepa JM109 de E. coli para producir un ADN mutante. Este plásmido mutagenizado se denominó pRCEI-Bgl.

pIN-Bgl: 51-GTAATAAACTTCATAGATCTATGTAAAAAGAATG-3' (34mer) (SEQ ID NO:55)

pIC-Bgl: 5'-GGATGAGTATAAAAGATCTTATATTTTCTTGAAC-3' (32mer) (SEQ ID NO:56).

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(2) Expresión del gen de RCE I en levadura

Para expresar el gen de RCE I en levadura, se realizaron las siguientes investigaciones utilizando el sistema vector-huésped tal como se describe en la especificación WO97/34004.

Así, el plásmido pRCEI-Bgl obtenido en el Ejemplo B7 (1) fue digerido con BgIII y se recuperó el gen de RCE I. Este gen estaba ligado de forma operable al sitio BamHI, es decir, aguas abajo del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), del vector plasmídico pY2831 para producir un plásmido pYRCEI. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa MS-161 (MATa, trp1, ura3) de la levadura (Saccharomyces cerevisiae) de acuerdo con la especificación mencionada anteriormente, para producir un transformante en el que la endoglucanasa RCE I era capaz de expresarse.

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Ejemplo B8 Evaluación del RCE I expresado en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa RCE I

La levadura transformada con el plásmido pYRCEI obtenido en el Ejemplo B7 se cultivó en un medio líquido SD (0,67% de nitrógeno base de la levadura sin aminoácidos (Difco, 2% de glucosa)), completado con 50 \mug/ml de uracil, a 30ºC durante 24 horas. El cultivo de siembra se sembró a una concentración final de un 1% en el medio líquido SD completado con 50 \mug/ml de uracil y un 1% de casaminoácido y se cultivó a 30ºC durante 36 horas. Después del cultivo, se eliminaron las células de levadura por centrifugación para producir una solución enzimática cruda, que se utilizó luego en varios análisis.

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(2) Medida del peso molecular por SDS-PAGE

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B8 (1) se sometió a SDS-PAGE para detectar un frotis con un peso molecular de aproximadamente 100 a 200 kD.

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(3) Evaluación de la levadura en la que se expresó RCE I (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B8 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE I se trató de forma similar y se empleó como control.

Se muestran los resultados en la Tabla siguiente.

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(4) Evaluación de la levadura en la que se expresó RCE I (actividad de eliminación de pelusa en liocel)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B8 (1) se dializó y se midió la actividad de eliminación de pelusas en liocel a 55ºC, pH 6, de la misma forma que en el Ejemplo A4. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN en el vector en el que no se introdujo el gen de RCE I se trató de forma similar y se empleó como control.

Como consecuencia, no apareció ninguna actividad de eliminación de pelusas en el tratamiento con 0,5 ml de caldo/ml de la cepa recombinante para el gen de RCE I. Asimismo, no se observó ninguna actividad de eliminación de pelusas en el tratamiento con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción control.

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Ejemplo B9 Expresión de la endoglucanasa RCE I mutante

En el Ejemplo B8, la endoglucanasa RCE I expresada en la levadura mostró actividad CMCasa, pero no mostró actividad de eliminación de pelusas en liocel. Además, el peso molecular medido en el Ejemplo B8 (2) era más alto de lo que se esperaba.

Van Arsdell y col. (Van Arsdell, J.N., 1987, Bio Technology, 5, 60-64) reportaron que a veces la sobreglicosilación (adición excesiva de cadenas de azúcar) tiene lugar cuando se expresa una proteína extraña en la levadura. Se pensó que un fenómeno similar había ocurrido en la expresión de la endoglucanasa RCE I en la levadura en el Ejemplo B8. En consecuencia, para expresar la endoglucanasa RCE I que muestra la actividad de eliminación de pelusas en liocel en la levadura, se creó un gen mutante de la endoglucanasa RCE I, donde se sustituyeron los aminoácidos en los sitios de glicosilación enlazados sobre asparagina (Asn).

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(1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen de RCE I

Lehle y col. (Lehle, L. and Bause E., 1984, Biochim. Biophys. Acta., 799, 246-251) reportaron que los sitios de reconocimiento de glicosilación enlazada sobre Asn, Asn-X-Ser/Thr son comunes en las levaduras y las glicoproteínas de mamífero.

Se pensó que el gen de endoglucanasa RCE I tiene tres de estas secuencias y cadenas de azúcar unidas a los residuos de asparagina en las posiciones 45, 90 y 130 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Para expresar una endoglucanasa RCE I mutante que no tiene un sitio de glicosilación enlazado sobre Asn en la levadura, se realizó una mutagénesis sitio-dirigida en el gen de RCE I.

La mutagénesis sitio-dirigida se llevó a cabo de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (1). Por tanto, se prepararon primero tres oligonucleótidos sintéticos pIRI-S47A, pIRI-S92G y pIRI-N130D tal como se establece más abajo como cebadores de mutagénesis y se fosforilaron en sus extremos 5'.

Después, la cepa CJ236 de E. coli se transformó con el plásmido pRCEI-Bgl y se utilizó un fago ayudante para obtener ssADN. Este ssADN y los cebadores se alinearon y se convirtieron en doble hebra mediante la reacción de la polimerasa con el kit mencionado anteriormente y se introdujeron en la cepa JM109 de E. coli para producir un ADN mutante que se denominó pRCEI-NLCD.

pIRIS47A: 5'-CACTTTCAGAAGCTTTATTGCCAC-3' (24mer) (SEQ ID NO:57)

pIRI-S92G: 5'-GAGCTAGAGCCAGAGTTAGAAG-3' (22mer) (SEQ ID NO:58)

pIRI-N130D: 5'-GAGAACTGACATCGGCCTTACC-3' (22mer) (SEQ ID NO:59)

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(2) Expresión de la endoglucanasa RCE I mutante en levadura

Se expresó el gen de endoglucanasa RCE I mutante en la levadura de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (2). Así, el plásmido pRCEI-NLCD1 obtenido en el Ejemplo B9 (1) fue digerido con BgIII y se recuperó un gen de celulasa RCE I mutante. Este gen estaba ligado de forma operable al sitio BamHI aguas abajo del promotor GAP del vector plasmídico pY2831 para producir un plásmido pYI-NLCD. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa de levadura MS-161. Así se obtuvo un transformante en el que la endoglucanasa RCE I mutante se expresaba.

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Ejemplo B10 Evaluación de la endoglucanasa RCE I mutante expresada en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa RCE I mutante

La levadura transformada con el plásmido pYI-NLCD obtenido en el Ejemplo B9 se cultivó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B8 (1) para producir una solución enzimática cruda como sobrenadante de cultivo.

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(2) Medida del peso molecular por SDS-PAGE

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B10 (1) se sometió a SDS-PAGE para detectar un frotis con un peso molecular de aproximadamente 40 a 45 kD.

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(3) Evaluación de la levadura en la que se expresó RCE I mutante (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B10 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN en el vector en el que no se introdujo el gen de RCE I mutante se trató de forma similar y se empleó como control.

Se muestran los resultados en la Tabla siguiente.

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(4) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusa en liocel de RCE I mutante expresada en la levadura

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B10 (1) se dializó y se midió la actividad de eliminación de pelusas en liocel a 55ºC, pH 6, de la misma forma que en el Ejemplo A4. Como control, se trató de forma similar y se evaluó un caldo de cultivo de una cepa transformada solamente con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE I mutante.

Como consecuencia, se eliminó un 80% de la pelusa cuando se trató con 0,1 ml de caldo/ml de la solución de reacción obtenida a partir de la cepa recombinante para el gen de RCE I mutante. Por otra parte, no se eliminó ninguna pelusa cuando se trató con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción control.

Estos resultados mostraron que, con el fin de expresar RCE I en levadura mientras muestra la actividad de eliminación de pelusas en liocel en levadura, es necesario sustituir los aminoácidos para que RCE I no tenga un sitio de glicosilación enlazado sobre Asn. La cantidad de proteína necesaria para eliminar completamente la pelusa se midió por medio del grado de tinción después de SDS-PAGE. Como resultado, la endoglucanasa RCE I mutante expresada en la levadura era casi idéntica a la endoglucanasa RCE I purificada por el método mostrado en el Ejemplo A1.

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(5) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusas en liocel a varios pH de RCE I mutante expresada en levadura

Se empleó la solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo B10 (1) para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel, con un pH de 4 a 9, de la misma forma que en el Ejemplo A5.

Se muestran los resultados en la Fig. 2. Como se puede observar a partir de la figura, el pH óptimo de RCE I mutante era de 7 a 8 y poseía un 80% o más de la actividad al pH óptimo en el rango de pH de 5,2 a 8,6. Está claro que la RCE I mutante expresada en la levadura muestra propiedades de pH similares en comparación con la RCE I purificada a partir de Rhizopus oryzae.

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Ejemplo C1 Búsqueda de homólogos del gen de RCE I en Rhizopus oryzae

Para buscar homólogos del gen de endoglucanasa RCE I en el ADN genómico de Rhizopus oryzae, se llevó a cabo un análisis mediante hibridación Southern.

En primer lugar, aproximadamente 10 \mug de ADN genómico de Rhizopus oryzae obtenido de acuerdo con el Ejemplo B2 fue digerido con varias enzimas de restricción (EcoRI, BamHI, HindIII, SacI, XbaI, SaII, etc.) y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se transfirieron estos materiales a una membrana de acuerdo con el Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron en las mismas condiciones que en los ejemplos mencionados anteriormente. Como consecuencia, además del gen de endoglucanasa RCE I, se encontraron al menos 2 genes homólogos presentes en el ADN genómico de Rhizopus oryzae. Estos tres genes que incluían el gen de RCE I se detectaron como banda única respectivamente, en particular en la hibridación cuando el ADN genómico fue digerido con SacI. En consecuencia, el gen detectado como banda de aproximadamente 3 kpb (gen de RCE II) y el gen detectado como banda de aproximadamente 10 kpb (gen de RCE III) se sometieron posteriormente a clonación.

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Ejemplo de referencia C2

Clonación del gen de endoglucanasa RCE II (1) Preparación de la librería de ADN genómico (para la clonación del gen de RCE II)

El ADN genómico de Rhizopus oryzae fue digerido con SacI y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% utilizando Agarose LE para extraer y purificar los fragmentos de ADN de 2 a 4 kpb de tamaño de acuerdo con métodos convencionales. Este fragmento de ADN fue ligado en un vector de fago, el vector Lambda ZAP II (Stratagene), y se empacó de la misma manera que en el Ejemplo B4. La cepa de E. coli XLI-Blue MRF' fue infectada con el fago resultante. La librería de fagos (1 x 10^{5}) obtenida por este método se utilizó para clonar el gen de RCE II.

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(2) Clonación del gen de RCE II

La exploración por hibridación en placas se llevó a cabo utilizando la librería obtenida en el Ejemplo C2 (1) y la sonda de cadena larga obtenida en el Ejemplo B3. La hibridación se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B5 para producir tres clones del fago.

La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' fue infectada con el fago resultante y se prepararon los ADN de acuerdo con el método del Ejemplo B5 (2), se digirieron con SacI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los ADN se transfirieron a una membrana de nylon según el método del Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron. Como resultado, una banda común que tenía el mismo tamaño, aproximadamente 3 kpb, que el ADN genómico se detectó en los tres ADN del fago. Esta banda se recuperó y se subclonó en el sitio SacI del plásmido pUC118. El plásmido resultante se denominó pRCEII-Sac.

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Ejemplo de referencia C3

Determinación de la secuencia nucleotídica del gen de endoglucanasa RCE II

Se determinó la secuencia nucleotídica mediante el mismo método que en el Ejemplo B3 (3). Por tanto, la reacción para el análisis se llevó a cabo utilizando el plásmido pRCEII-Sac obtenido en el Ejemplo C2 como patrón de ADN y los cebadores de secuenciación etiquetados FITC de RCE 03, 04 y 05 preparados en el Ejemplo B3 (3) como cebadores. En base a los resultados, se prepararon nuevos cebadores de secuenciación etiquetados FITC y se sometieron a reacción con el plásmido pRCEII-Sac para otra secuencia. A partir de los resultados, se prepararon además los siguientes cebadores para continuar con la secuenciación. Así, se determinó la secuencia nucleotídica de RCE II.

RCEII-01: 5'-ACAACATTATTTCTTCGAATATG-3' (23mer) (SEQ ID NO:60)

RCEII-02: 5'-TTTAGCAGCAGAGGCCATTTCAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:61)

RCEII-03: 5'-TTTTCTATCCTGATACAGAGATG-3' (23mer) (SEQ ID NO:62)

RCEII-04: 5'-GCGCTCATAAAACGACTACTACC-3' (23mer) (SEQ ID NO:63)

RCEII-05: 5'-TGCCCTTAGTGACAGCAATGTCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:64)

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Ejemplo de referencia C4

Expresión del gen de endoglucanasa RCE II (1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen de RCE II

El sitio BgIII se introdujo en los sitios inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación e inmediatamente aguas abajo del codón de terminación del gen de RCE II por mutagénesis sitio-dirigida. Se siguió el método de mutagénesis sitio-dirigida del Ejemplo B7 (1).

En primer lugar, se preparó nuevamente un oligonucleótido sintético pIIC-Bgl tal como se expone más abajo, como cebador, para la mutagénesis y se fosforiló en el extremo 5' junto con pIN-Bgl sintetizado previamente en el Ejemplo B7 (1).

Luego, el pRCEII-Sac se convirtió en una sola hebra en la cepa CJ236 de E. coli y se sometió a reacción con el cebador fosforilado para producir un ADN mutante. Este plásmido mutagenizado se denominó pRCEII-Bgl.

pIIC-Bgl: 5'-CAAGAAAATAAGATCTTTTATACTCCTACT -3' (30mer) (SEQ ID NO:65)

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(2) Expresión del gen de RCE II en la levadura

Se llevó a cabo la expresión del gen de RCE II en la levadura de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (2). Así, el plásmido pRCEII-Bgl obtenido en el Ejemplo C4 (1) fue digerido con BgIII y se recuperó el gen de endoglucanasa RCE II. Este gen estaba ligado de forma operable al sitio BamHI, es decir, aguas abajo del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), del vector plasmídico pY2831, para producir un plásmido pYRCEII. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa MS-161 (MATa, trp1, ura3) de la levadura (Saccharomyces cerevisiae) de acuerdo con la especificación WO97/34004 para producir un transformante en el que la endoglucanasa RCE II era capaz de expresarse.

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Ejemplo de referencia C5

Evaluación de endoglucanasa RCE II expresada en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa RCE II

La levadura transformada con el plásmido pYRCEII obtenido en el Ejemplo C4 se cultivó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B8 (1) para producir una solución enzimática cruda como sobrenadante de cultivo.

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(2) Medida del peso molecular por SDS-PAGE

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C4 (1) se sometió a SDS-PAGE para detectar un frotis con un peso molecular de aproximadamente 100 a 200 kD.

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(3) Evaluación de la levadura en la que se expresó RCE II (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C4 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE II se trató de forma similar y se empleó como control.

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(4) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusa en liocel por RCE II mutante expresada en la levadura

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C5 (1) se dializó y se midió la actividad de eliminación de pelusas en liocel a 55ºC, pH 6, de la misma forma que en el Ejemplo A4. Un caldo de cultivo de una cepa transformada solamente con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE II se trató de forma similar y se empleó como control.

Como consecuencia, no se mostró ninguna actividad de eliminación de pelusas en el tratamiento con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción de la cepa recombinante para el gen de RCE II. Asimismo, no se observó ninguna actividad de eliminación de pelusas en el tratamiento con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción de
control.

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Ejemplo de referencia C6

Expresión de la endoglucanasa RCE II mutante

En el Ejemplo C4, la endoglucanasa RCE II expresada en la levadura mostró actividad CMCasa, pero no mostró actividad de eliminación de pelusas en liocel. Además, el peso molecular medido en el Ejemplo C4 (2) era más alto de lo que se esperaba. Se pensó que estos resultados se debían a la adición excesiva de glicosilación enlazada sobre Asn, como era el caso de RCE I. En consecuencia, para expresar la endoglucanasa RCE II que muestra la actividad de eliminación de pelusas en liocel en levadura, se creó un gen de endoglucanasa RCE II mutante donde se sustituyeron los aminoácidos en los sitios de glicosilación enlazados sobre asparagina (de tipo Asn).

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(1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen de RCE II

Se pensó que el gen de RCE II tiene cinco sitios de reconocimiento de glicosilación enlazada sobre Asn, secuencia Asn-X-Ser/Thr, y cadenas de azúcar unidas a los residuos de asparagina en las posiciones 45, 92, 119, 122 y 158 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. Para expresar una endoglucanasa RCE II mutante que no tiene un sitio de glicosilación enlazado sobre Asn en la levadura, se realizó una mutagénesis sitio-dirigida en el gen de RCE II.

La mutagénesis sitio-dirigida se llevó a cabo de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (1). Por tanto, se prepararon primero cuatro oligonucleótidos sintéticos pIRII-S47A, pIRII-N92Q y pIRII-S121L:N122D, y pIRII-N158D tal como se establece más abajo como cebadores de mutagénesis y se fosforilaron en sus extremos 5'.

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Después, la cepa CJ236 de E. coli se transformó con el plásmido pRCEII-Bgl y se utilizó un fago ayudante para obtener ssADN. Este ssADN y los cebadores se alinearon y se convirtieron en doble hebra por reacción de la polimerasa con el kit mencionado anteriormente y se introdujeron en la cepa JM109 de E. coli para producir un ADN mutante que se denominó pRCEII-AQLDD.

pIRII-S47A: 5'-AACGGCAATAAGGCCTCTGAATGTAGC-3' (27mer) (SEQ ID NO:66)

pIRII-N92Q: 5'-GAAAGCAATGGCCAGAAAACTTCTGAAAG-3' (29mer) (SEQ ID NO:67)

pIRII.S121L:N122D: 5'-GCTTCAAACTCTCTAGACTCTAGCGGC-3' (27mer) (SEQ ID NO:68)

pIRII-N158D: 5'-CGGTAAGGCCGACGTCAGTTCTCC-3' (24mer) (SEQ ID NO:69)

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(2) Expresión de la endoglucanasa RCE II mutante en la levadura

Se expresó el gen de endoglucanasa RCE II mutante en la levadura de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (2). Así, el plásmido pRCEII-AQLDD1 obtenido en el Ejemplo C6 (1) fue digerido con BgIII y se recuperó un gen de endoglucanasa RCE II mutante. Este gen estaba ligado de forma operable al sitio BamHI aguas abajo del promotor de la GAP del vector plasmídico pY2831 para producir un plásmido pYII-AQLDD. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa de levadura MS-161. Así se obtuvo un transformante en el que la endoglucanasa RCE II mutante se expresaba.

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Ejemplo de referencia C7

Evaluación de la endoglucanasa RCE II mutante expresada en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa RCE II mutante

La levadura transformada con el plásmido pYII-AQLDD obtenido en el Ejemplo C6 se cultivó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B8 (1) para producir una solución enzimática cruda como sobrenadante de cultivo.

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(2) Medida del peso molecular por SDS-PAGE

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C7 (1) se sometió a SDS-PAGE para detectar un frotis con un peso molecular de aproximadamente 45 kD.

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(3) Evaluación de la RCE II mutante expresada en la levadura (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C7 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN del vector en el que no se introdujo el gen de RCE II mutante se trató de forma similar y se empleó como control.

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(4) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusa en liocel por RCE II mutante expresada en la levadura

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo C7 (1) se utilizó para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel a 55ºC, pH 6, de la misma forma que en el Ejemplo A4. Un caldo de cultivo de una cepa transformada solamente con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE II mutante se trató de forma similar y se utilizó como control.

Como consecuencia, se eliminó un 60% de la pelusa cuando se trató con 0,2 ml de caldo/ml de la solución de reacción de la cepa recombinante para el gen de RCE II mutante. Por otra parte, no se eliminó ninguna pelusa cuando se trató con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción de control.

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A partir de lo anterior se mostró que, con el fin de expresar RCE II que muestra la actividad de eliminación de pelusas en liocel en levadura, es necesario sustituir los aminoácidos para que RCE II no tenga un sitio de glicosilación enlazado sobre Asn, como en el caso de la RCE I. Además, la cantidad de proteína necesaria para eliminar completamente la pelusa se midió por medio del grado de tinción después de SDS-PAGE. Como resultado, la endoglucanasa RCE II mutante expresada en la levadura era casi idéntica a la endoglucanasa RCE I purificada por medio del método mostrado en el Ejemplo A1.

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Ejemplo de referencia C8

Clonación del gen de endoglucanasa RCE III (1) Preparación de la librería genómica de ADN (para clonar el gen de RCE III)

El ADN genómico de Rhizopus oryzae fue digerido con SacI y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% utilizando Agarose LE para extraer y purificar los fragmentos de ADN de aproximadamente 10 kpb de tamaño de acuerdo con métodos convencionales. Este fragmento de ADN fue ligado en un vector Lambda DASH II y se empacó de la misma manera que en el Ejemplo B4. La cepa de E. coli XLI-Blue MRA fue infectada con el fago resultante. La librería de fagos (1 x 10^{5}) obtenida por este método se utilizó para clonar el gen de RCE III.

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(2) Clonación del gen de RCE III

El screening por hibridación en placas se llevó a cabo utilizando la librería obtenida en el Ejemplo C8 (1) y la sonda de cadena larga obtenida en el Ejemplo B3. La hibridación se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B5 para producir dos clones del fago.

La cepa de E. coli XL1-Blue MRA fue infectada con el fago resultante y se prepararon los ADN de acuerdo con el método del Ejemplo B5 (2). Se digirieron con varias enzimas de restricción y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los ADN se transfirieron a una membrana de nylon según el método del Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron. Como resultado, se detectó una banda común que tenía el mismo tamaño que el ADN genómico en los dos ADN del fago. Se descubrió en particular una sola banda de aproximadamente 10 kpb o de aproximadamente 2 kpb de tamaño en la segmentación de SacI o de BamHI, respectivamente. En consecuencia, la banda de aproximadamente 2 kpb obtenida por segmentación de BamHI se recuperó y se subclonó en el sitio BamHI del plásmido p-UC118. El plásmido resultante se denominó pRCEIII-Bam.

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Ejemplo de referencia C9

Determinación de la secuencia nucleotídica del gen de endoglucanasa RCE III

Se determinó la secuencia nucleotídica mediante el mismo método que en el Ejemplo B3 (3). Por tanto, la reacción para el análisis se llevó a cabo utilizando el plásmido pRCEIII-Bam obtenido en el Ejemplo C8 como plantilla de ADN y el cebador inverso adjunto al kit, así como el cebador de secuenciación etiquetado FITC de RCE-06 como cebadores. En base a los resultados, se prepararon nuevos cebadores de secuenciación etiquetados FTTC y se sometieron a reacción con el plásmido pRCEIII-Bam para otra secuencia. Al repetir además este procedimiento, se determinó la secuencia nucleotídica de RCE III. Los cebadores de secuenciación FITC preparados fueron los siguientes:

RCEIII-01: 5'-TACAGGAGCCAACAGGGGAGGTG-3' (23mer) (SEQ ID NO:70)

RCEIII-02: 5'-TTCACAGCAGGTAGGTCCATTCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:71)

RCEIII-03: 5'-CCTACGGTTTCGCCGCTGCTTCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:72)

RCEIII-04: 5'-TAGATACCAACACCACCACCGGG-3' (23mer) (SEQ ID NO:73)

RCEIII-05: 5'-TGAAGTTCCTTACCATTGCCTCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:74)

RCEIII-06: 5'-TGGTGAAACCACTCGCTACTGGG-3' (23mer) (SEQ ID NO:75)

RCEIII-07: 5'-TTCTGCCTCTGACTGTTCTAACC-3' (23mer) (SEQ ID NO:76)

RCEIII-08: 5'-AATAGAGTTACTCTATACGATAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:77)

RCEIII-09: 5'-CACCACCAGAGACAGCGGAGTAG-3' (23mer) (SEQ II) NO:78)

RCEIII-10: 5'-TGCGTTGATTATCCTGACAATCC-3' (23mer) (SEQ ID NO:79).

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Ejemplo de referencia C10

Expresión del gen de endoglucanasa RCE III (1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen de RCE III

El sitio BamHI se introdujo en los sitios inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación e inmediatamente aguas abajo del codón de terminación del gen de RCE III por el método de PCR de la siguiente manera. En primer lugar, se prepararon nuevamente los oligonucleótidos sintéticos pIIIC-Bam1 y pIIIC-Bam2 tal como se expone más abajo como cebadores para la mutagénesis. Se llevó a cabo la PCR utilizando el plásmido pRCEIII-Bam obtenido previamente en el Ejemplo C8 como plantilla, pIIIC-Bam1 y pIIIC-Bam2 para producir un ADN mutante. Este ADN mutante fue digerido con BamHI y los fragmentos de ADN resultantes se recuperaron y subclonaron en el sitio BamHI del plásmido pUC118. El plásmido mutagenizado resultante se denominó pRCEIII-Bam2.

pIIIC-Bam1: 5'-GCGGATCCATGAAGTTCCTTACCATTGCC -3' (29mer) (SEQ ID NO:80)

pIIIC-Bam2: 5'-GCGGATCCTTATTTTCTTGAACAGCCAGA -3' (29mer) (SEQ ID NO:81).

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Se pensó que el gen de RCE III tenía cuatro sitios de reconocimiento de glicosilación enlazada sobre Asn, secuencia Asn-X-Ser/Thr, y cadenas de azúcar unidas a los residuos de asparagina en las posiciones 44, 49, 121 y 171 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En consecuencia, para expresar al mismo tiempo que se mostraba la actividad de eliminación de pelusas en liocel en levadura, se prepararon dos genes de RCE III mutante, es decir, uno en el que el aminoácido en el sitio 44 de glicosilación enlazada sobre Asn fue sustituido para que no se glicosilara el sitio, y el otro en el que ambos aminoácidos en los sitios 44 y 121 de glicosilación enlazada sobre Asn fueron sustituidos para que no se glicosilaran los sitios.

La mutagénesis sitio-dirigida se llevó a cabo de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (1). Por tanto, se prepararon primero dos oligonucleótidos sintéticos pIRIII-N44D y pIRIII-N121K tal como se establece más abajo como cebadores de mutagénesis y se fosforilaron en sus extremos 5'. Después, la cepa CJ236 de E. coli se transformó con el plásmido pRCEIII-Bam2 y se utilizó un fago ayudante para obtener ssADN. Estos ssADN y los cebadores se alinearon y se convirtieron en doble hebra por la reacción de la polimerasa con el kit mencionado anteriormente y se introdujeron en la cepa JM109 de E. coli para producir ADN mutantes. El plásmido mutagenizado en el que solamente se había sustituido el aminoácido 44 se denominó pRCEIII-D y el plásmido mutagenizado en el que se habían sustituido ambos aminoácidos 44 y 121 se denominó pRCEIII-DK.

pIRIII-N44D: 5'-GTGGAGGTGAGATCTTCATTGGGAAC-3' (26mer) (SEQ ID NO:82)

pIRIII-N121K: 5'-CAGCGGAGTACTTTGTAGAAGCAG-3' (24mer) (SEQ ID NO:83).

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(2) Expresión de la endoglucanasa RCEIII mutante en la levadura

Se expresó el gen de RCE III mutante en la levadura de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (2). Así, los dos plásmidos pRCEIII-D y pRCEIII-DK obtenidos en (1) más arriba fueron digeridos con BamHI y los genes de RCE III mutante se recuperaron. Estos genes estaban ligados de forma operable al sitio BamHI aguas abajo del promotor de la GAP del vector plasmídico pY2831 para producir dos plásmidos pYIII-D y pYIII-DK. Estos plásmidos se utilizaron para transformar la cepa MS-161 de la levadura. Así, se obtuvieron transformantes en los que se expresó la endoglucanasa RCE III mutante.

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Ejemplo de referencia C11

Evaluación de la endoglucanasa RCE III mutante expresada en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa la RCE III mutante

La levadura transformada con cada uno de los dos plásmidos pYIII-D y pYIII-DK obtenidos en el Ejemplo C10 se cultivó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B8 (1) para producir una solución enzimática cruda como sobrenadante de cultivo.

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(2) Evaluación de la RCE III mutante expresada en la levadura (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda de la levadura transformada con pYIII-DK que se obtuvo en el Ejemplo C11 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada solamente con el ADN en el vector en el que no se introdujo el gen de RCE III mutante se trató de forma similar y se empleó como control.

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(3) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusa en liocel por RCE III mutante expresada en la levadura

Las dos soluciones enzimáticas crudas de levaduras transformadas con pYIII-D y pYIII-DK obtenidos en el Ejemplo C11(1) se dializaron y después se utilizaron para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel a 55ºC, pH 6, de la misma forma que en el Ejemplo A4. Un caldo de cultivo de una cepa transformada solamente con el ADN en vector en el que no se introdujo el gen de RCE III mutante se trató de forma similar y se utilizó como control.

Como consecuencia, se eliminó un 60% de la pelusa mediante el tratamiento con 0,2 ml de caldo/ml de la solución de reacción de la cepa recombinante para el gen de RCE III mutante (transformante de pYIII-D), al mismo tiempo que se eliminó un 80% de la pelusa mediante el tratamiento con 0,2 ml de caldo/ml de la solución de reacción de la cepa recombinante para el gen de RCE III mutante (transformante de pYIII-DK). Por otra parte, no se eliminó la pelusa cuando se trató con 0,5 ml de caldo/ml de la solución de reacción de control. Estos resultados sugieren que, incluso aquellos en los que se sustituyó(sustituyeron) solamente el(los) aminoácido(s) en el(los) sitio(s) de glicosilación enlazada sobre Asn más cercano(s) del dominio de unión a celulosa, pudieron mostrar la actividad de eliminación de pelusa en liocel.

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Ejemplo D1 Expresión del gen de endoglucanasa RCE I en Humicola insolens (I) (1) Mutagénesis sitio-dirigida del gen de RCE I

La mutagénesis de la secuencia inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación del gen de RCE I se llevó a cabo por medio del método de PCR para que sea adecuada para la expresión en Humicola insolens. En primer lugar, se preparó nuevamente un oligonucleótido sintético pRIN-Bgl tal como se expone más abajo como cebador para la mutagénesis. Se realizó la PCR utilizando el plásmido pRCEI-Bgl obtenido previamente en el Ejemplo B7 (1) como patrón, pRIN-Bgl y el oligonucleótido sintético pIC-Bgl obtenido en el Ejemplo B7 (1), y el fragmento amplificado de aproximadamente 1 kb se subclonó en el vector pT7-Blue T. El plásmido mutagenizado resultante se denominó pHRCEI-Bgl-11.

La secuencia del cebador oligonucleotídico preparado con la mutagénesis se muestra a continuación.

pRIN-Bgl: 5'-GGGAGATCTTGGGACAAGATGAAGTTTATTACTATTG-3' (37mer) (SEQ ID NO:84)

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(2) Preparación del plásmido pJRID01 a) Preparación del plásmido pM21-m-A1

El vector de expresión pJRID15 del gen de RCE I en Humicola insolens se elaboró de la siguiente manera. En primer lugar, el plásmido pM21 obtenido de acuerdo con WO98/03667 se sometió a mutagénesis sitio-dirigida utilizando un oligonucleótido sintético pMN-Bam. El plásmido mutagenizado resultante se denominó pM21-m-A1.

La secuencia del cebador oligonucleotídico preparado con la mutagénesis se muestra a continuación.

pMN-Bam: 5'-GGTCAAACAAGTCTGTGCGGATCCTGGGACAAGATGGCCAAGTTCTTCCTTAC-3' (53mer) (SEQ ID NO:85)

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b) Preparación de pJD01

En primer lugar, el plásmido pM21-m-A1 fue digerido con HindIII y BamHI y se recuperó el fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb. Después, el plásmido pMKD01 obtenido de acuerdo con WO98/03667 fue digerido con HindIII y BamHI y se recuperó el fragmento de ADN de aproximadamente 7 kpb. Finalmente, estos fragmentos de ADN se ligaron y el plásmido resultante se denominó pJD01.

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c) Preparación del plásmido pJRID01

El plásmido pJD01 fue digerido con BamHI y luego se desfosforiló con fosfatasa alcalina (Takara Shuzo). Después, el plásmido pHRCEI-Bgl-11 obtenido en (1) anterior fue digerido con BamHI y se recuperó el fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb. Asimismo, estos ADN se ligaron de forma operable y el plásmido resultante se denominó pJRI1701.

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(3) Transformación de Humicola insolens con el plásmido pJRID01

De acuerdo con el método descrito en WO98/03667, Humicola insolens MN200-1 se transformó con el plásmido pJRID01 y se seleccionaron 50 cepas que mostraban resistencia a la higromicina.

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Ejemplo D2 Expresión del gen de endoglucanasa RCE I en Humicola insolens (II) (1) Cultivo del transformante con el plásmido pJRID01 y evaluación por SDS-PAGE

De acuerdo con el método descrito en WO98/03667, se cultivaron 50 transformantes con el plásmido pJRID01 en medio (N) a 37ºC durante 4 días. El sobrenadante de cultivo resultante se analizó por SDS-PAGE, pero no se detectó ninguna banda de proteína que hubiera aumentado en comparación con la cepa receptora.

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(2) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusas en liocel de los transformantes con el plásmido pJRID01

Se utilizó el sobrenadante de cultivo de 50 transformantes con el plásmido pJRID01 obtenido en (1) anterior para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel. Se siguió el método del Ejemplo A4 y se realizaron las mediciones a un pH 6, 55ºC. Como resultado, cualquiera de los transformantes mostró solamente una actividad de eliminación de pelusas en liocel sustancialmente similar a la de la cepa receptora no transformada.

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Ejemplo D3 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Humicola insolens (I)

A partir de los resultados del Ejemplo D2, el gen de endoglucanasa RCE I procedente de Rhizopus oryzae apenas se expresó en Humicola insolens. Se pensó que se debía a una gran diferencia en el uso de los codones entre los genes procedentes de Rhizopus que pertenecen a Zygomycetotina y aquellos procedentes de Humicola que pertenecen a Deuteromycotina. La Fig. 3 muestra el uso de los codones del gen de endoglucanasa RCE I. La RCE I utiliza de forma relativamente frecuente A y T como tercera letra en los codones. Por el contrario, el gen de celulasa NCE 1 (tal como se describe en la solicitud de patente japonesa abierta Nº 8-56663), NCE 2 (tal como se describe en la solicitud de patente japonesa abierta Nº 8-126492) y NCE 4 (tal como se describe en la WO98/03640) procedentes de Humicola utilizan frecuentemente G y C como tercera letra en los codones. En consecuencia, se pensó que, con el fin de expresar el gen de RCE I procedente de Rhizopus en Humicola, era necesario optimizar el uso de los codones en Humicola, en particular sustituir A y T, cuando se utilizaban como tercera letra en los codones, por G y C, sin cambiar los aminoácidos codificados por los mismos. Además, se pensó que, con el fin de mejorar la estabilidad de ARNm, producto de transcripción de un gen diana, era necesario no sólo cambiar la tercera letra en los codones por G y C, sino también seleccionar una secuencia que no contuviera la secuencia de reconocimiento de los intrones, de forma más particular, las secuencias de ADN como GTAGN, GTATN, GTAAN, GTACGN, GTGTN, GCACGN y GTTCGN. Así, cumpliendo con las condiciones mencionadas anteriormente, se diseñó el gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I y se sintetizó completamente tal como se expone a continuación.

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(1) Síntesis completa del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I a) Preparación del plásmido p12-BI

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las siguientes secuencias.

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Luego, se utilizaron estos oligonucleótidos para llevar a cabo la reacción PCR. Se utilizó el kit LA PCR (Takara Shuzo) en la reacción PCR. Se añadieron dNTP y el tampón a RCE I-01 y RCE I-02, incubándose cada 1 \muM a 94ºC durante 10 minutos, y enfriándose en hielo durante 5 minutos. A continuación, se añadió Taq polimerasa y el ciclo de reacción de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 45 segundos se repitió 20 veces, seguido de incubación a 72ºC durante 10 minutos. El ADN amplificado, de aproximadamente 200 pb, se subclonó en el vector pT7 Blue T de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo B3. El plásmido resultante se denominó p12-BI.

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b) Preparación del plásmido p123-6

En primer lugar, se preparó un oligonucleótido sintético que tenía la secuencia siguiente.

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Después, se llevó a cabo la reacción PCR de acuerdo con el método del Ejemplo D3 (1) a). El patrón de ADN utilizado fue 1 \mug del plásmido p12-Bl y los cebadores empleados fueron RCE I-01 y RCE I-P335-Xho-C, cada uno 1 \muM. Se realizó la reacción PCR en las mismas condiciones que en el Ejemplo D3 (1) a) para amplificar el ADN de aproximadamente 300 pb. El ADN de aproximadamente 300 pb se subclonó en el vector pT7 Blue-T y el plásmido resultante se denominó p123-6.

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c) Preparación del plásmido p34-6

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las secuencias siguientes.

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Después, se utilizaron estos oligonucleótidos para llevar a cabo la reacción PCR. De acuerdo con el método del Ejemplo D3 (1) a), se añadieron dNTP y el tampón a RCE I-03 y RCE I-04, cada uno 1 \muM, y se llevó a cabo la reacción en las mismas condiciones. El ADN amplificado, de aproximadamente 300 pb, se subclonó en el vector pT7 Blue-T y el plásmido resultante se denominó p34-6.

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d) Preparación del plásmido p3456-18

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las secuencias siguientes.

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Después, se llevó a cabo la reacción PCR de acuerdo con el método del Ejemplo D3 (1) a). El patrón de ADN utilizado fue 1 \mug del plásmido p34-6 y los cebadores empleados fueron RCE I-03 y RCE I-P34-6-Nco-C, cada uno 1 \muM. Se realizó la reacción PCR en las mismas condiciones que en el Ejemplo D3 (1) a) para amplificar el ADN de aproximadamente 400 pb. El ADN de aproximadamente 400 pb se recuperó utilizando el kit Sephaglas BandPrep mencionado anteriormente y la reacción PCR se llevó a cabo además utilizando este fragmento de ADN como patrón.

Así, mediante la utilización de aproximadamente 20 ng del fragmento de ADN recuperado previamente, de alrededor de 400 pb, como patrón de ADN y 1 \muM de cada uno de RCE I-03 y RCE I-P34-6-Sac-C como cebadores, se llevó a cabo la reacción PCR en las mismas condiciones que en el Ejemplo D3 (1) a) para amplificar el ADN de aproximadamente 500 pb. El ADN amplificado de aproximadamente 500 pb se subclonó en el vector pT7 Blue-T y el plásmido resultante se denominó p3456-18.

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e) Preparación del plásmido p78-2

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las secuencias siguientes.

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Después, se utilizaron estos oligonucleótidos para llevar a cabo la reacción PCR. De acuerdo con el método del Ejemplo D3 (1) a), se añadieron dNTP y el tampón a RCE I-07 y RCE I-08, cada uno 1 \muM, y se realizó la reacción en las mismas condiciones. El ADN amplificado, de aproximadamente 300 pb, se subclonó en el vector pT7 Blue-T y el plásmido resultante se denominó p78-2.

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f) Preparación del plásmido p678-8

En primer lugar, se prepararon dos oligonucleótidos sintéticos que tenían las secuencias siguientes.

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Después, se llevó a cabo la reacción PCR de acuerdo con el método del Ejemplo D3 (1) a). El patrón de ADN utilizado fue 1 \mug del plásmido p78-2 y los cebadores empleados fueron RCE I-P78-2-SacN y RCE I-H-C, cada uno 1 \muM. Se realizó la reacción PCR en las mismas condiciones que en el Ejemplo D3 (1) a) para amplificar el ADN de aproximadamente 400 pb. El ADN de aproximadamente 400 pb se subclonó en el vector pT7 Blue T y el plásmido resultante se denominó p678-8.

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g) Preparación del plásmido p18-1

En primer lugar, el plásmido p3456-18 fue digerido con XhoI y SacI para recuperar el fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb. Después, el plásmido p678-8 fue digerido con SacI y KpnI para recuperar el fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb. Estos fragmentos de ADN se ligaron por medio del kit de ligación de ADN y la mezcla de ligación se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar el fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb. Este fragmento de ADN se ligó al plásmido p123-6, el cual había sido digerido con XhoI y KpnI para producir el plásmido p18-1.

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(2) Análisis de la secuencia nucleotídica del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I

Se analizó la secuencia nucleotídica de la misma forma que en el Ejemplo B3 (3). Por tanto, la reacción para el análisis se llevó a cabo utilizando el plásmido p18-1 obtenido en el Ejemplo D3 (1) g) como patrón de ADN, así como los cebadores de secuenciación etiquetados FITC nuevamente preparados RCE-H01 a H08 que tenían como cebadores las secuencias siguientes.

En consecuencia, se pudo analizar la secuencia nucleotídica completa del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I sobre el plásmido p18-1. El gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I tenía la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:13 y la secuencia de aminoácidos deducida de esta secuencia coincidía totalmente con la secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa RCE I de SEQ ID NO:1.

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(3) Preparación del plásmido pJI4D01

El plásmido pJD01 obtenido en el Ejemplo D1 (1) fue digerido con BamHI y luego se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Después, el plásmido p18-1 obtenido en el Ejemplo D3 (1) g) fue digerido con BamHI para recuperar el fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb. Asimismo, estos ADN se ligaron de forma operable y el plásmido resultante se denominó pJI4D01.

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(4) Transformación de Humicola insolens con el plásmido pJI4D01

De acuerdo con el método descrito en WO98/03667, Humicola insolens MN200-1 se transformó con el plásmido pJI4D01 y se seleccionaron 50 cepas que mostraban resistencia a la higromicina.

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Ejemplo D4 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Humicola insolens (II)

De acuerdo con el método descrito en WO98/03667, se cultivaron 50 transformantes con el plásmido pJI4D01 en medio (N) a 37ºC durante 4 días. El sobrenadante de cultivo resultante se analizó por SDS-PAGE para detectar una banda de proteínas de aproximadamente 40 kD de peso molecular, que era presuntamente la endoglucanasa RCE I en 5 cepas de entre los transformantes con el plásmido pJI4D01.

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(2) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusas en liocel de los transformantes con el plásmido pJI4D01

De entre las 5 cepas que mostraban la expresión de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 40 kD por medio de SDS-PAGE en (1) anterior, se utilizaron los sobrenadantes de cultivo de dos cepas (1-18 y 2-15 cepas), que mostraban una expresión particularmente notable, para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel. Se utilizó como control el sobrenadante de cultivo de la cepa receptora no transformada. De acuerdo con el método del Ejemplo A4, la cantidad de sobrenadante de cultivo necesaria para eliminar completamente la pelusa se midió por medio del tratamiento de eliminación de pelusas en liocel con varios sobrenadantes de cultivo en condiciones de reacción de pH 6, 55ºC. Se muestran los resultados en la Tabla 3 siguiente.

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TABLA 3 Cantidad de sobrenadante de cultivo necesaria para la eliminación de pelusas en liocel (ml)

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Ejemplo D5 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Humicola insolens (III) (1) Evaluación por FPLC del transformante con el plásmido pJI4D01

Cada uno de los sobrenadantes de cultivo del transformante (cepas 2-15) con el plásmido pJI4D01 obtenido en el Ejemplo D4, así como la cepa receptora, se sometieron a cromatografía en columna utilizando el sistema FPLC (Pharmacia Biotech) (columna: RESOURCE^{TM} RPC 3 ml, del 5 al 60% de gradiente de acetonitrilo que contenía un 0,1% de TFA). Como resultado, se detectó un nuevo pico que no se había visto en la cepa receptora en el sobrenadante de cultivo obtenido a partir del transformante (2-15) con el plásmido pJI4D01.

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(2) Identificación de los residuos de aminoácidos N-terminales de la endoglucanasa RCE I recombinante

A partir de los Ejemplos D4 y D5 anteriores, se pensó que se expresaba una endoglucanasa recombinante RCE I en gran cantidad como consecuencia de la optimización de los codones en el gen de endoglucanasa RCE I. Por consiguiente, se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminales de esta proteína para confirmar que la proteína expresada abundantemente derivaba del gen optimizado en los codones de la endoglucanasa RCE I.

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En primer lugar, de acuerdo con el Ejemplo D5 (1), el transformante (2-15) con el plásmido pJI4D01 se sometió al sistema FPLC para aislar el nuevo pico resultante. Entonces, se centrifugó este pico y se sometió a SDS-PAGE (utilizando gel al 8%). Se transfirió eléctricamente la proteína a la membrana de PVDF (Millipore) utilizando el aparato electroforético MULTIFOR II (Pharmacia), se tiñó con Azul Brillante de Coomassie R-250, se decoloró, se lavó con agua y secó al aire. A continuación, la banda diana (40 kD) fue digerida y sometida al Modelo Secuenciador de Proteínas 492 (Perkin Elmer) para determinar 16 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal. Se muestra a continuación la secuencia resultante.

Secuencia de aminoácidos N-terminales: Ala-Glu-(Cys)-Ser-Lys-Leu-Tyr-Gly-Gln-(Cys)-Gly-Gly-Lys-Asn-Trp-Asn (16 residuos) (SEQ ID NO:105)

Esta secuencia de aminoácidos N-terminal coincidía con la secuencia de aminoácidos de la proteína de endoglucanasa RCE I deducida de la secuencia nucleotídica del plásmido pJI4D01.

Por tanto, se confirmó que la endoglucanasa RCE I recombinante se expresaba en gran cantidad en Humicola insolens como consecuencia de la optimización de los codones en el gen de endoglucanasa RCE I.

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Ejemplo D6 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Aspergillus niger (I) (1) Adquisición del mutante niaD procedente de la cepa FERM P-5886 de Aspergillus niger

Se preparó un frotis de esporas de la cepa FERM P-5886 de Aspergillus niger sobre un medio mínimo de agar (0,2% de glutamato sódico, 0,1% de hidrogenofosfato de dipotasio, 0,05% de sulfato de magnesio, 0,05% de cloruro de potasio, 0,001% de sulfato de hierro, 3% de sacarosa, 1,5% de agar, pH 5,5) que contenía clorato al 6% y se incubó a 30ºC. Después del cultivo durante aproximadamente 5 días, aquellas que formaban colonia se tomaron como cepas resistentes a clorato. Estas cepas resistentes se inocularon en el medio mínimo que contenía glutamato, nitrato o nitrito, respectivamente, como única fuente de nitrógeno para investigar las exigencias en nitrógeno. Como resultado, se encontraban presentes cepas resistentes a clorato que podrían desarrollarse en el medio mínimo que contenía glutamato de sodio o nitrito como única fuente de nitrógeno, pero que no podrían desarrollarse en nitrato. Se tomaron estas cepas como candidatos para el mutante niaD.

Con 3 cepas de entre los candidatos a mutante niaD, se midió la actividad en las células de la nitrato reductasa (enzima reductora de nitrato, que es un producto genético de niaD). Estas tres cepas se cultivaron en un agitador en un medio líquido (0,25% de glutamato de sodio, 0,1% de hidrogenofosfato de dipotasio, 0,05% de sulfato de magnesio, 0,05% de cloruro de potasio, 0,001% de sulfato de hierro, 3% de sacarosa) a 30ºC durante 60 horas. Las células húmedas resultantes (0,2 g) se suspendieron en 2 ml de un tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y se trituraron mediante un homogeneizador ultrasónico. Después de retirar por centrifugación las fracciones insolubles, se tomó como muestra el sobrenadante de cultivo. A 50 \mul de la solución de muestra se añadieron 1.000 \mul de agua destilada, 750 \mul de la solución de fosfato de sodio 0,2M (pH 7,5), 100 \mul de 0,04 mg/ml de FAD, 100 \mul de 2 mg/ml de NADPH y 1.000 \mul de 22,5 mg/ml de nitrato de sodio, seguido de la reacción a 37ºC. Después de la reacción, se añadieron a la muestra 500 \mul de sulfanilamida al 1% (disuelta en ácido clorhídrico 3N) y 500 \mul de N-1-naftil-etilendiamina al 0,02% para la formación de color y se midió A540 para detectar la actividad de nitrato reductasa. Sin embargo, no se detectó ninguna actividad nitrato reductasa en estas tres cepas. Por tanto, se concluyó que estas tres cepas eran cepas mutantes niaD y una de ellas se denominó cepa NIA5292, la cual se sometió a experimentos posteriores.

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(2) Adquisición del gen niaD procedente de la cepa FERM P-5886 de Aspergillus niger a) Preparación de la sonda

Se cultivó la cepa NRRL4337 de Aspergillus niger en medio líquido YPD (1% de extracto de levadura, 2% de polipeptona, 2% de glucosa). Se amplificó el ADN por PCR utilizando el ADN total extraído de las células resultantes mediante el método conocido (solicitud de patente japonesa abierta Nº 8-53522) como plantilla y los cebadores sintéticos de ADN de SEQ ID NO:106 y 107 preparados en base a la secuencia nucleotídica del gen niaD de Aspergillus niger descrita en Unkles, S.E., y col., Gene, 111, 149-155 (1992) como cebadores. La solución de reacción contenía 0,5 \mug de ADN cromosómico, 100 pmol de cada cebador y 2,5 U de Taq polimerasa de ADN (Nippon Gene) por cada 100 \mul. La reacción se llevó a cabo en 25 ciclos en condiciones de temperatura de 94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos, para amplificar específicamente el fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb. Se determinó la secuencia nucleotídica de este fragmento de ADN y coincidía completamente (100%) con la secuencia nucleotídica del gen niaD de Aspergillus niger ya reportada. Así, quedó claro que este fragmento de ADN derivaba del gen
niaD. En consecuencia, este fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb se tomó como sonda para su uso.

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NIA-CN: 5'- GACTGACCGGTGTTCATCC-3' (19mer) (SEQ ID NO:106)

NIA-CC: 5'- CTCGGTTGTCATAGATGTGG-3' (20mer) (SEQ ID NO:107)

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b) Análisis Southern del ADN cromosómico de Aspergillus niger

Se cultivó la cepa FERM P-5886 de Aspergillus niger en medio líquido YPD (1% de extracto de levadura, 2% de polipeptona, 2% de glucosa). El ADN total extraído de las células resultantes mediante el método conocido (solicitud de patente japonesa abierta Nº 8-53522) fue digerido completamente con las enzimas de restricción (HindIII, EcoRI, BamHI, SacI, SaII, XbaI), se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa y se utilizó para manchar una membrana de nylon (Hybond-N+, Amersham) de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning (Cold Spring Harbour, 1982). La hibridación Southern se efectuó en la membrana de nylon utilizando el fragmento de ADN de 800 pb mencionado anteriormente como sonda. Para etiquetar las sondas y detectar las señales, se utilizó el Ecl Directl DNA Labeling-Detection System (Amersham) en las condiciones establecidas en el manual adjunto. Como resultado, se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 6,5 kpb a la digestión con SaII.

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c) Aislamiento del gen niaD

El ADN total de la cepa FERM P-5886 de Aspergillus niger se segmentó parcialmente con la enzima de restricción MboI y se fraccionó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se extrajeron los fragmentos de ADN de aproximadamente 9-23 kpb y se recuperaron por métodos convencionales. El fragmento de ADN recuperado se ligó en el sitio BamHI de \lambda DASHII y se empacó mediante GIGAPACK II Gold (Stratagene). E. coli se infectó con el fago para preparar una librería.

Se llevó a cabo la hibridación en placas utilizando como sonda el fragmento de ADN de 800 pb mencionado anteriormente y el Ecl Directl DNA Labeling-Detection System (Amersham) para obtener clones positivos. Los clones positivos resultantes se sometieron a un screening secundario para purificar los clones positivos.

Se preparó ADN del fago a partir de los clones positivos para confirmar la inserción del fragmento SaII de aproximadamente 6,5 kpb. Este ADN se sometió a análisis Southern para encontrar un fragmento de ADN más pequeño del fragmento SacI de aproximadamente 4,8 kpb. Se realizó el mapa de enzimas de restricción de este fragmento. Además, este fragmento SacI fue subclonado en el plásmido pUC118. El plásmido resultante se denominó pniaD-Sac. Este fragmento SacI después fue digerido con la(s) enzima(s) de restricción y luego subclonado en pUC118. Esto se utilizó como plantilla para determinar la secuencia nucleotídica y se identificó la posición del gen niaD en el fragmento de ADN aislado.

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(3) Transformación de la cepa NIA5292 de Aspergillus niger

Se cultivó en un agitador la cepa NIA5292 de Aspergillus niger en un medio líquido (2% de almidón soluble, 1% de polipeptona, 0,2% de extracto de levadura, 0,5% de dihidrogenofosfato de sodio, 0,05% de sulfato de magnesio) a 28ºC durante 24 horas. Se recogieron las células mediante un filtro de vidrio, se suspendieron en una solución enzimática (1 mg/ml de \beta-glucuronidasa (Sigma), 5 mg/ml de Novozyme 234 (Novo Nordisk), fosfato de sodio 10 mM (pH 5,8), cloruro de potasio 0,8 M) y se calentaron suavemente a 30ºC durante 1,5 horas. Se filtraron los protoplastos con un filtro de vidrio y la fracción que pasó se centrifugó para recoger las células, las cuales se lavaron dos veces con el tampón STC (Tris 10 mM (pH 7,5), cloruro de potasio 10 mM, sorbitol 1,2M) y se suspendieron en tampón STC. Posteriormente, se mezclaron el protoplasto y el ADN plasmídico y se dejaron reposar en hielo durante 20 minutos. Después, se añadió la solución PEG (Tris 10 mM (pH 7,5), cloruro de potasio 10 mM, polietilenglicol 4000 al 60%) y se dejó reposar en hielo durante 20 minutos más para introducir el ADN en el protoplasto. Se lavó varias veces el protoplasto con tampón STC, se suspendió en medio Czapek (0,2% de nitrato de sodio, 0,1% de hidrogenofosfato de dipotasio, 0,05% de sulfato de magnesio, 0,05% de cloruro de potasio, 0,001% de sulfato férrico, 3% de sacraosa) que contenía sorbitol 1,2M y agar al 0,8%, se colocó en capas sobre el medio agar Czapek que contenía sorbitol 1,2M y agar al 1,5%, y se cultivó a 30ºC. Después del cultivo durante aproximadamente 5 días, aquellos que formaban colonias se seleccionaron como transformantes.

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Ejemplo D7 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Aspergillus niger (II) (1) Preparación del plásmido pSAEX11

Se elaboró un vector de expresión que tenía un promotor de amilasa operable en Aspergillus niger de la siguiente forma.

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a) Preparación del plásmido pAMYI

En primer lugar, el plásmido pAMY obtenido de acuerdo con WO97/00944 fue digerido con las enzimas de restricción EcoRI y SaII y el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 0,75 kb, se ligó a pUC119 también digerido con EcoRI y SaII. El plásmido resultante se denominó pAMYI.

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b) Mutagénesis sitio-dirigida del plásmido pAMYI

El sitio BamHI se introdujo en un sitio inmediatamente aguas arriba del codón de iniciación del gen de amilasa mediante mutagénesis sitio-dirigida. Se siguió el método de mutagénesis sitio-dirigida del Ejemplo B7 (1).

En primer lugar, se preparó nuevamente un oligonucleótido sintético pAMBM tal como se expone más abajo como cebador para la mutagénesis y se fosforiló en el extremo 5'. Después, el plásmido pAMYI se introdujo en una sola hebra en la cepa CJ236 de E. coli y se sometió a reacción con el cebador fosforilado para producir un ADN mutante. Este plásmido mutagenizado se denominó pAMY-Bam.

pAMBM: 5'-CCCACAGAAGGGATCCATGATGGTCGC -3' (27mer) (SEQ ID NO:108)

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c) Preparación del plásmido pSAEX 11

En primer lugar, el plásmido pAMY-Bam fue digerido con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI y se recuperó el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 0,6 kb. Después, el plásmido pDH25 obtenido de acuerdo con el informe de Cullen y col. (Cullen, D., Gene, 57, 21-26, 1987) fue digerido con EcoRI y BamHI y se recuperó el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 4,7 kb. Ambos se ligaron y el plásmido resultante se denominó pSAEX11.

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(2) Preparación de los plásmidos pANR22 y pANH42

En primer lugar, el plásmido pHRCEI-Bgl-11 fue digerido con la enzima de restricción BgIII y se recuperó el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 1 kb, como fragmento del gen de la endoglucanasa RCE I derivado de Rhizopus. Asimismo, el plásmido pJI4D01 fue digerido con BamHI y se recuperó el fragmento de ADN resultante, de aproximadamente 1 kb, como fragmento del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I.

Luego, el plásmido pSAEX11 fue digerido con BamHI y se ligó a cada uno de los fragmentos BgIII del gen de la endoglucanasa RCE I y BamHI del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I. Los plásmidos resultantes se denominaron pANR21 y pANH41, respectivamente.

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b) Preparación de los plásmidos pANR22 y pANH42

En primer lugar, los plásmidos pANR21 y pANH41 fueron digeridos con la enzima de restricción XbaI. Después, el plásmido pniaD-Sac descrito en el Ejemplo D6 fue digerido con la enzima de restricción XbaI para producir un fragmento de aproximadamente 4,8 kpb. Este fragmento contenía desde el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XbaI presente inmediatamente después del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción SacI en la región aguas arriba del gen niaD hasta el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XbaI derivado de pUC118 presente inmediatamente después del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción SacI en la región aguas abajo del gen niaD. Este fragmento de 4,8 kpb se insertó en el sitio XbaI de los plásmidos pANR21 y pAH41. Los plásmidos resultantes se denominaron pANR22 y pANH42.

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Ejemplo D8 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I en Aspergillus niger (III) (1) Transformación de la cepa NIA5292 de Aspergillus niger con los plásmidos pANR22 y pANH42

De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo D6, se transformó la cepa NIA5292 de Aspergillus niger con los plásmidos pANR22 y pANH42, así como el vector sólo como control. Aproximadamente 50 cepas cada una de los transformantes en medio agar Czapek se cultivaron en el medio líquido SMPN (3% de almidón soluble, 0,7% de extracto de malta, 1% de polipeptona, 0,3% de NaCl) a 28ºC durante 3 días. Después de haber dializado el sobrenadante de cultivo, se eliminó la pelusa en liocel en las condiciones de reacción de pH 6, 55ºC de acuerdo con el Ejemplo A4, para investigar el grado de eliminación de pelusa. Se muestran los resultados en la Tabla 4. El caldo de cultivo del transformante con el plásmido pANH42 mostró actividad en la eliminación de pelusas en liocel, mientras que el caldo de cultivo de las cepas transformadas con el vector solamente o con el plásmido pANR22 no mostró actividad de eliminación de pelusas en liocel.

TABLA 4 Grado de eliminación de pelusas en liocel

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Ejemplo D9 Expresión del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I a partir del cual se suprimió una parte de la región enlazadora en Humicola insolens

(1) Una parte de la región enlazadora en el gen de RCE I del plásmido pJI4D01 (desde la base G 331 hasta la base C 405 en la SEQ ID NO:13) se suprimió mediante PCR y este plásmido se denominó pJI4D10.

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(2) Cultivo del transformante con el plásmido pJI4D10 y evaluación por SDS-PAGE

De acuerdo con el método descrito en WO98/03667, se cultivaron 30 transformantes con el plásmido pJI4D10 en medio (N) a 37ºC durante 4 días. El sobrenadante de cultivo resultante se analizó mediante SDS-PAGE para detectar una banda de proteínas de aproximadamente 30-35 kD de peso molecular, que es presuntamente una RCE I delecionada en 5 cepas de entre los transformantes con el plásmido pJI4D10.

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(3) Evaluación de la actividad de eliminación de pelusas en liocel de los transformantes con el plásmido pJI4D10

Entre las 5 cepas que muestran la expresión de una proteína con peso molecular de aproximadamente 30-35 kD mediante SDS-PAGE en (2) más arriba, se utilizó el sobrenadante de cultivo de una cepa (cepa 3-13) que mostró una expresión particularmente significativa para medir la actividad de eliminación de pelusas en liocel. El sobrenadante de cultivo de la cepa 2-15 de la que no se suprimió una porción de la región enlazadora de RCE I se utilizó como control. De acuerdo con el método del Ejemplo A4, el grado de eliminación de pelusas se investigó por medio del tratamiento de eliminación de pelusas en liocel con varios sobrenadantes de cultivo (0,1 ml cada uno) en las condiciones de reacción de pH 6, 55ºC. Se muestran los resultados en la Tabla 5 siguiente.

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TABLA 5 Grado de eliminación de pelusas en liocel

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Ejemplo E1 Búsqueda de homólogos del gen de RCE I en Mucor circinelloides

Para buscar homólogos del gen de endoglucanasa RCE I en el ADN genómico de Mucor circinelloides, se llevó a cabo un análisis mediante hibridación Southern.

En primer lugar, aproximadamente 10 \mug de ADN genómico de Mucor circinelloides obtenido de acuerdo con el Ejemplo B2 fue digerido con varias enzimas de restricción (EcoRI, BamHI, HindIII, SacI, XbaI, SaII, etc.) y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se transfirieron estos materiales a una membrana de acuerdo con el Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron utilizando el gen de RCE I como sonda en las mismas condiciones que en los ejemplos mencionados anteriormente. Como consecuencia, se descubrió que al menos un gen homólogo estaba presente en el ADN genómico de Mucor circinelloides. Este gen se detectó como banda única, en particular en la hibridación cuando el ADN genómico fue digerido con EcoRi. En consecuencia, el gen detectado como banda de aproximadamente 4,5 kpb se denominó MCE I y se sometió posteriormente a clonación.

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Ejemplo de referencia E2

Clonación del gen de endoglucanasa MCE I (1) Preparación de la librería de ADN genómico (para la clonación del gen de MCE I)

El ADN genómico de Mucor circinelloides fue digerido con EcoRI y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% utilizando agarosa Seakem LE para extraer y purificar los fragmentos de ADN de aproximadamente 3 a 6,5 kpb de tamaño de acuerdo con métodos convencionales. Estos fragmentos de ADN se ligaron en un vector de fago, el vector Lambda gt10 (Stratagene), y se empacaron de la misma manera que en el Ejemplo B4. La cepa de E. coli NM514 fue infectada con el fago resultante. La librería de fagos (1 x 10^{4}) obtenida por este método se utilizó para clonar el gen de MCE I.

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(2) Clonación del gen de MCE I a partir de ADN genómico

La exploración por hibridación en placas se llevó a cabo utilizando la librería obtenida en el Ejemplo E2 (1) y la sonda del gen de RCE I. La hibridación se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B5 para producir 6 clones del fago.

La cepa de E. coli NM514 fue infectada con el fago resultante y se prepararon los ADN de acuerdo con el método del Ejemplo B5 (2), se digirieron con EcoRI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los ADN se transfirieron a una membrana de nylon según el método del Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron. Como resultado, se detectó una banda común que tenía el mismo tamaño de aproximadamente 4,5 kbp que el ADN genómico en los 6 ADN del fago. Esta banda se recuperó y se subclonó en el sitio EcoRI del plásmido pUC119. El plásmido resultante se denominó pMCEI-Eco. La secuencia nucleotídica de este fragmento, de aproximadamente 4,5 kpb, se determinó de la misma forma que en el Ejemplo B3 (3). La secuencia nucleotídica dilucidada se tradujo en una secuencia de aminoácidos. Un marco de lectura coincidía con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la endoglucanasa MCE I tal como se muestra en el Ejemplo B1. Sin embargo, se supuso que esta secuencia contenía intrones y, por tanto, el ADNc del gen de MCE I se aisló mediante RT-PCR.

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(3) Aislamiento del ADNc del gen de MCE I mediante RT-PCR y determinación de la secuencia nucleotídica

Se cultivó Mucor circinelloides en 30 ml de medio líquido (3,0% de licor de maceración de maíz, 0,5% de extracto de levadura (Difco), 2,4% de caldo de dextrosa de patata (Difco), 2% de sacarosa) a 30ºC durante 18 horas y se recogieron las células a través de un filtro de vidrio. Las células resultantes se liofilizaron, se trituraron finamente mediante una espátula. Se aisló el ARN total utilizando Isogen (Wako Pure Chemical Industry). En primer lugar, se añadió Isogen al polvo celular, se agitó durante 30 segundos y se incubó a 50ºC durante 10 minutos, y después se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, se añadieron 0,8 ml de cloroformo y se agitó fuertemente. Después de centrifugación, se transfirió la capa acuosa a otro recipiente, al que se añadieron 2 ml de LiCl 4 M y se mezcló, después se dejó reposar a -70ºC durante 15 minutos. A continuación, se centrifugó el material y se retiró el sobrenadante. Se disolvió el precipitado en 1,6 ml de agua y se añadieron 1,6 ml de isopropanol, se mezcló, se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos. Después de centrifugación, se retiró el sobrenadante y se lavó el precipitado con etanol al 75%. Se disolvió el precipitado en 1,6 ml de agua. Esta solución se precipitó con etanol y se lavó el precipitado con etanol al 75%, se secó y se disolvió en 0,4 ml de agua para producir ARN total.

Después, se preparó ARNm utilizando el Kit de Aislamiento de ARNm (Stratagene). En primer lugar, se añadieron 10 ml del tampón de elución a 0,2 ml de ARN total preparado anteriormente y se añadieron además 5 ml de la solución oligo dT. Tras retirar el sobrenadante, la oligo dT se lavó tres veces con High Salt Buffer y dos veces con Low Salt Buffer y luego se eluyó con el tampón de elución calentado a 68ºC. Esta solución se precipitó con etanol y se lavó el precipitado con etanol al 75%, se secó y se disolvió en 15 \mul de agua para producir la fracción de ARNm.

Después, se preparó ADNc del gen de MCE I a partir del ARNm mediante RT-PCR utilizando el Kit de PCR de ARN de Takara (AMV) Ver. 2.1. Así, como cebadores se prepararon cebadores oligonucleotídicos que tenían las siguientes secuencias para los terminales N- y C- deducidas de la secuencia genómica del gen de MCE I determinada anteriormente y sólo el ADNc del gen de MCE I fue amplificado mediante el método de PCR utilizando 1 \mul del ARNm preparado anteriormente como plantilla.

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MCEI-CN: 5'-GCGAATTCATGAAGTTCACCGTTGCTATT-3 (29mer) (SEQ ID NO:109)

MCEI-CC: 5'-GCGAATTCTTACTTTCTTTCGCAACCTG-3 (28mer) (SEQ ID NO:110)

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Se realizó la reacción RT-PCR en las siguientes condiciones. En primer lugar, se añadió el cebador C-terminal a la mezcla de reacción y se sometió a reacción con transcriptasa inversa. Luego, se añadieron polimerasa Taq (Taq Recombinante, Takara Shuzo) así como el cebador N-terminal y se repitieron 30 veces las condiciones de reacción de 94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos para la amplificación. Como resultado de la electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos amplificados fueron dos fragmentos de aproximadamente 1,1 kpb y 1,0 kpb. Estos fragmentos se subclonaron en el sitio EcoRI de pUC118 y se determinaron las secuencias nucleotídicas de los fragmentos respectivos de acuerdo con el método del Ejemplo B3 (3). Esta secuencia nucleotídica se comparó con la secuencia nucleotídica genómica para determinar los intrones. Como consecuencia de este análisis, se descubrió que en Mucor circinelloides se expresaron dos endoglucanasas en las que las secuencias del gen eran idénticas entre sí en una porción de los terminales N- y C-. En consecuencia, las endoglucanasas codificadas por las secuencias nucleotídicas más cortas (de aproximadamente 1,0 kpb) y más largas (de aproximadamente 1,1 kpb) se denominaron MCE I y MCE II, respectivamente.

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Ejemplo de referencia E3

Expresión del gen de la endoglucanasa MCE I

(1) El ADNc del gen de MCE I preparado por RT-PCR tenía una mutación. Esta mutación fue restaurada por mutagénesis sitio-dirigida. Este plásmido de MCE I subclonado en el sitio EcoRI de pUC118 se denominó pMCEI-EcoRI. Además, el gen de MCE I tenía un sitio de glicosilación enlazada sobre Asn, la secuencia Asn-X-Ser/Thr, y se pensó que una cadena de oligosacáridos se unía al residuo de asparagina en la posición 50 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. Como se pensaba que la actividad de eliminación de pelusas en liocel sería inhibida por una glicosilación excesiva en los sitios de glicosilación enlazada sobre Asn como RCE I, se creó por mutagénesis sitio-dirigida un gen mutante de la endoglucanasa MCE I en el que se sustituyó el aminoácido en el sitio de glicosilación enlazado sobre Asn.

Se llevó a cabo la mutagénesis sitio-dirigida de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (1). Así, se preparó un oligonucleótido sintético pIMI-S52G tal como se expone más abajo como cebador para la mutagénesis y se fosforiló en su extremo 5'. Luego, la cepa CJ236 de E. coli se transformó con el plásmido pMCEI-EcoRI y se utilizó un fago ayudante para obtener ssADN. Este ssADN y el cebador se alinearon y se convirtieron en doble hebra por reacción de la polimerasa utilizando el kit mencionado anteriormente y se introdujeron en la cepa JM109 de E. coli para producir un ADN mutante que se denominó pMCEI-G.

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PIMI-S52G: 5'-CTTGGTGCTGCCAGCGTTACCAG-3' (23mer) (SEQ ID NO:111)

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(2) Expresión del gen mutante de MCE I en la levadura

El gen mutante de RCE I se expresó en la levadura de acuerdo con el método del Ejemplo B7 (2). Así, el plásmido pMCEI-G obtenido en el Ejemplo E3 (1) fue digerido con EcoRI y se recuperó un gen mutante de MCE I. Este gen estaba ligado de forma operable al sitio EcoRI aguas abajo del promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), del vector plasmídico pY2831 para producir un plásmido pYMCEI. Este plásmido se utilizó para transformar la cepa MS-161 (MATa, trp1, ura3) de levadura (Saccharomyces cerevisiae) de acuerdo con la especificación WO97/34004. Así, se obtuvo un transformante en el que se pudo expresar la endoglucanasa MCE I.

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Ejemplo de referencia E4

Evaluación de la endoglucanasa MCE I mutante expresada en la levadura (1) Cultivo de la levadura que expresa la MCE I mutante

La levadura transformada con el plásmido pYMCEI obtenido en el Ejemplo E3 se cultivó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B8 (1) para producir una solución enzimática cruda como sobrenadante de cultivo.

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(2) Medida del peso molecular por SDS-PAGE

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo E4 (1) se sometió a SDS-PAGE para detectar un frotis con un peso molecular de aproximadamente 45 kD.

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(3) Evaluación de la levadura en la que se expresó MCE I mutante (actividad de CMCasa)

La solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo E4 (1) se utilizó para medir la actividad de CMCasa. Un caldo de cultivo de una cepa transformada sólo con el ADN en el vector en el que no se introdujo el gen de MCE I mutante se trató de forma similar y se empleó como control.

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(4) Purificación de la MCE I mutante expresada en la levadura

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final de 1,5M a partir de 500 ml de la solución enzimática cruda obtenida en el Ejemplo E4 (1) y se aplicó a un caudal de 3,0 ml/min a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Soporte Macro-Prep Metil (25 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una disolución de sulfato de amonio 1,5M. Después se fraccionó mediante elución a un caudal de 5,0 ml/min, según un método de elución paso a paso en el que la concentración de sulfato de amonio en agua desionizada se redujo en cada paso en 0,3M de 1,5M. Entre las fracciones, se descubrió que la fracción obtenida a una concentración de sulfato de amonio de 0,6M tenía una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel. Por tanto, se aislaron 50 ml de esta fracción. Mediante la repetición dos veces de la fraccionación por cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en soporte Macro-Prep Metil, se trataron 1.000 ml del sobrenadante de cultivo para proporcionar 100 ml de fracciones activas.

Se preparó una solución de sulfato de amonio a una concentración final 1,5M a partir de 100 ml de las fracciones activas y se aplicó a una cromatografía de interacción hidrofóbica HIC en Cartucho Econo-Pac Metil (5 ml en volumen de gel, BioRad Laboratories) que había sido equilibrada con una disolución de sulfato de amonio 1,5M. Luego, se aplicó la solución de sulfato de amonio 1,5M. Se aplicó entonces agua desionizada y 1 ml de cada una de las fracciones, se descubrió que estas fracciones tenían una actividad importante en la eliminación de pelusas en liocel, se agruparon, se fraccionaron las fracciones eluidas. Esta fracción mostró un frotis casi único en la SDS-PAGE y tenía un peso molecular (MW) de aproximadamente 45 kD. La SDS-PAGE utilizó NPU-12,5L PAGEL (ATTO Japón) y se llevaron a cabo la migración y tinción de acuerdo con la especificación adjunta al gel. Los estándares de peso molecular utilizados fueron el rango inferior estándar de peso molecular en SDS-PAGE (BioRad Laboratories).

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(5) Evaluación de la eliminación de pelusas en liocel por la MCE I mutante purificada (actividad específica en la eliminación de pelusa en liocel)

Se utilizó la solución enzimática purificada de MCE I mutante obtenida en el Ejemplo E4 (4) para evaluar la actividad de eliminación de pelusas en liocel en las condiciones que se exponen más abajo de la misma forma que en el Ejemplo A4. Así, un tejido de punto de liocel (Toyoshima Japan, 9 cm x 10 cm, aproximadamente 2 g en peso) con pelusas según el método del Ejemplo A4 se sometió a tratamiento de eliminación de pelusa en liocel en las condiciones expuestas más abajo, con lo cual se calculó la concentración de proteínas de MCE I mutante exigida para eliminar completamente la pelusa formada.

Se calcularon las concentraciones de proteínas de MCE I mutante desde la zona pico a UV 280 nm de varias endoglucanasas eluídas con un gradiente lineal del 0% al 80% de concentración de acetonitrilo en un 0,05% de TFA (ácido trifluoroacético) a un caudal de 1,0 ml/min en análisis HPLC utilizando una columna TMS-250 de gel TSK (4,6 mm I.D. x 7,5 cm, Toso Japan). El estándar utilizado fue una NCE4 purificada que fue analizada en HPLC en las mismas condiciones, cuya concentración de proteínas había sido medida previamente con el kit de ensayo de proteínas (BioRad Laboratories). El estándar utilizado para medir la concentración de proteínas del kit de ensayo de proteínas fue el estándar de albúmina (seroalbúmina bovina, fracción V, PIERCE).

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG, Japón)

Temperatura: 50ºC

Tiempo: 60 minutos

Volumen de reacción: 40 ml

pH de reacción: pH 5 (tampón de acetato 10 mM); pH 6 (tampón de acetato 10 mM)

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El líquido de tratamiento contenía 4 bolas de goma (de aproximadamente 16 g cada una) junto con la solución de endoglucanasa.

Se muestran los resultados en la Tabla 6 siguiente. La endoglucanasa MCE I mutante expresada en la levadura tenía una actividad de eliminación de pelusas en liocel por concentración enzimática casi idéntica que la endoglucanasa MCE I purificada mediante el método que se muestra en el Ejemplo A2.

TABLA 6

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(6) Evaluación de la eliminación de pelusas en liocel por MCE I mutante expresada en levadura a varios pH (perfil de pH de la actividad de eliminación de pelusas en liocel de MCE I)

Se empleó la solución enzimática cruda de MCE I obtenida en el Ejemplo E4 (1) para evaluar la actividad de eliminación de pelusas en liocel, a un pH de 4 a 10 en la condición de 50ºC de acuerdo con el método del Ejemplo A5.

Se muestran los resultados en la Fig. 2. Como se puede observar a partir de la figura, el pH óptimo de MCE I era de 5 a 6 y se mantuvo un 60% o más de la actividad al pH óptimo en el rango de pH de 5 a 8. Está claro que, como la MCE I purificada a partir de Mucor circinelloides en el Ejemplo A2, la MCE I mutante expresada en la levadura es notablemente muy activa en condiciones alcalinas en comparación con la NCE4 purificada.

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Ejemplo F1 Búsqueda de homólogos del gen de RCE I en Phycomyces nitens

Para buscar homólogos del gen de endoglucanasa RCE I en el ADN genómico de Phycomyces nitens, se llevó a cabo un análisis mediante hibridación Southern.

En primer lugar, aproximadamente 10 \mug de ADN genómico de Phycomyces nitens obtenido de acuerdo con el Ejemplo B2 fue digerido con varias enzimas de restricción (EcoRI, BamHI, HindIII, SacI, XbaI, SaII, etc.) y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se transfirieron estos materiales a una membrana de acuerdo con el Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron por medio del gen de RCE I y el gen optimizado en codones de RCE I como sondas en las mismas condiciones que en los ejemplos mencionados anteriormente. Como consecuencia, se descubrió que al menos un
gen homólogo del gen optimizado en codones de RCE I estaba presente en el ADN genómico de Phycomyces nitens.

Este gen se detectó como banda única, en particular en la hibridación cuando el ADN genómico fue digerido con BamHI. En consecuencia, el gen detectado como banda de aproximadamente 15 a 19 kpb se denominó PCE I y se sometió posteriormente a clonación.

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Ejemplo de referencia F2

Clonación del gen de endoglucanasa PCE I (1) Preparación de la librería de ADN genómico (para la clonación del gen de PCE I)

El ADN genómico de Phycomyces nitens fue digerido con BamHI y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% utilizando agarosa Seakem LE para extraer y purificar los fragmentos de ADN de aproximadamente 9 a 23 kpb de tamaño de acuerdo con métodos convencionales. Estos fragmentos de ADN se ligaron en un vector de fago, el vector Lambda DASH II (Stratagene), y se empacaron de la misma manera que en el Ejemplo B4. La cepa de E. coli XLI-Blue MRA fue infectada con el fago resultante. La librería de fagos (1,6 x 10^{4}) obtenida por este método se utilizó para clonar el gen de PCE I.

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(2) Clonación del gen de PCE I a partir del ADN genómico

El screening por hibridación en placas se llevó a cabo utilizando la librería obtenida en el Ejemplo F2 (1) y la sonda del gen optimizado en codones de RCE I. La hibridación se realizó en las mismas condiciones que en el Ejemplo B5 para producir 6 clones del fago. La cepa de E. coli XL1-Blue MRA fue infectada con el fago resultante y se prepararon los ADN de acuerdo con el método del Ejemplo B5 (2), se digirieron con XbaI y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los ADN se transfirieron a una membrana de nylon según el método del Ejemplo B5 (3) y se hibridizaron. Como resultado, se detectó una banda común de aproximadamente 2,3 kpb en los ADN de 6 fagos. Esta banda se recuperó y se subclonó en el sitio XbaI del plásmido pUC119. El plásmido resultante se denominó pPCEI-Xba. La secuencia nucleotídica de este fragmento, de aproximadamente 2,3 kpb, se determinó de la misma forma que en el Ejemplo B3 (3). La secuencia nucleotídica dilucidada se tradujo en una secuencia de aminoácidos. Un marco de lectura coincidía con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la endoglucanasa PCE I tal como se muestra en el Ejemplo B1. Sin embargo, se supuso que esta secuencia contenía intrones y, por tanto, el ADNc del gen de PCE I se aisló mediante RT-PCR.

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(3) Aislamiento del ADNc del gen de PCE I mediante RT-PCR y determinación de la secuencia nucleotídica

Se cultivó Phycomyces nitens en 30 ml de medio líquido (3,0% de licor de maceración de maíz, 0,5% de extracto de levadura (Difco), 2,4% de caldo de dextrosa de patata (Difco), 2% de sacarosa) a 30ºC durante 48 horas y se recogieron las células a través de un filtro de vidrio. Las células resultantes se liofilizaron y se trituraron finamente mediante una espátula. Se aisló el ARN total utilizando Isogen (Wako Pure Chemical Industry). En primer lugar, se añadieron 5 ml de Isogen al polvo celular, se agitó durante 30 segundos y se incubó a 50ºC durante 10 minutos, y después se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, se añadieron 0,8 ml de cloroformo y se agitó fuertemente. Después de centrifugación, se transfirió la capa acuosa a otro recipiente, al que se añadieron 2 ml de LiCl 4M y se mezcló, después se dejó reposar a -70ºC durante 15 minutos. A continuación, se centrifugó el material y se retiró el sobrenadante. Se disolvió el precipitado en 1,6 ml de agua y se añadieron 1,6 ml de isopropanol, se mezcló, se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos. Después de centrifugación, se retiró el sobrenadante y se lavó el precipitado con etanol al 75%. Se disolvió el precipitado en 1,6 ml de agua. Esta solución se precipitó con etanol y se lavó el precipitado con etanol al 75%, se secó y se disolvió en 0,4 ml de agua para producir ARN total.

Después, se preparó ARNm utilizando el Kit de Aislamiento de ARNm (Stratagene). En primer lugar, se añadieron 10 ml del tampón de elución a 0,2 ml de ARN total preparado anteriormente y se añadieron además 5 ml de la solución oligo dT. Tras retirar el sobrenadante, la oligo dT se lavó tres veces con High Salt Buffer y dos veces con Low Salt Buffer y luego se eluyó con el tampón de elución calentado a 68ºC. Esta solución se precipitó con etanol y se lavó el precipitado con etanol al 75%, se secó y se disolvió en 15 \mul de agua para producir la fracción de ARNm.

Después, se preparó ADNc del gen de PCE I a partir del ARNm mediante RT-PCR utilizando el Kit de PCR de ARN de Takara (AMV) Ver. 2.1. Así, como cebadores, se prepararon cebadores oligonucleotídicos que tenían las siguientes secuencias para los terminales N- y C- deducidas de la secuencia genómica del gen de PCE I determinada anteriormente y sólo el ADNc del gen de PCE I fue amplificado mediante el método de PCR utilizando 1 \mul del ARNm preparado anteriormente como plantilla.

PCEI-CN: 5'-GCGGATCCATGAAGTTCTCCATCATCG-3' (27mer) (SEQ ID NO:112)

PCEI-CC: 5'-GCGGATCCTTACTTGCGCTCGCAACCA-3' (27mer) (SEQ ID NO:113)

Se realizó la reacción RT-PCR en las siguientes condiciones. En primer lugar, se añadió el cebador C-terminal a la mezcla de reacción y se sometió a reacción con transcriptasa inversa. Luego, se añadieron polimerasa Taq (Taq Recombinante, Takara Shuzo) así como el cebador N-terminal y se repitieron 30 veces las condiciones de reacción de 94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos para la amplificación. Como resultado de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento amplificado fue de aproximadamente 1,0 kpb. El fragmento se subclonó en el sitio BamHI de pUC118 y se determinó la secuencia nucleotídica del fragmento de acuerdo con el método del Ejemplo B3 (3). Esta secuencia nucleotídica se comparó con la secuencia nucleotídica genómica para determinar los intrones. Como consecuencia de este análisis, se determinó la totalidad de la secuencia nucleotídica de ADNc del gen de PCE I en Phycomyces nitens.

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Ejemplo G1 Evaluación de la acción de eliminación de pelusas de la endoglucanasa RCE I expresada en Humicola insolens cuando se formula como detergente

La actividad de eliminación de pelusas en un tejido que contiene celulosa de la endoglucanasa RCE I expresada en Humicola insolens obtenida en el Ejemplo D4 se evaluó de la siguiente manera. El sobrenadante de cultivo del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I expresada en Humicola insolens preparado en el Ejemplo D4 se utilizó en el tratamiento de eliminación de pelusas de un tejido de algodón de punto (6 cm x 8 cm) con pelusas en una gran lavadora que contenía un agente tensioactivo y bolas de goma en las condiciones que se exponen a continuación. Se determinó la cantidad de sobrenadante de cultivo exigida para eliminar completamente la pelusa formada. Se utilizó como control un sobrenadante de cultivo procedente de la cepa receptora no transformada.

Máquina de ensayo: Launder Meter L-12 (Daiei Kagaku Seiki MFG, Japón)

Temperatura: 40ºC

Tiempo: 60 minutos

Volumen de reacción: 40 ml

pH de reacción: pH 8,5 (tampón Tris 10 mM)

(Agente tensioactivo no iónico): 0,15 g/l de Nonipol 100 (Sanyo Kasei Kogyo).

(Agente tensioactivo aniónico): 0,55 g/l de jabón en polvo de Shabondama Baby (Shabondama Soap Japan).

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El líquido tratante contenía una cantidad adecuada de bolas de goma junto con la solución de endoglucanasa. Se muestran los resultados en la Tabla 7 siguiente.

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TABLA 7 Cantidad de sobrenadante de cultivo necesaria para eliminar la pelusa de un tejido de algodón (ml)

26

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Ejemplo G2 Evaluación del destinte de papel usado por la endoglucanasa RCE I expresada en Humicola insolens

El sobrenadante centrifugado de un caldo de cultivo del gen optimizado en codones de la endoglucanasa RCE I expresada en Humicola insolens preparado en el Ejemplo D4 se sometió después a una filtración meticulosa (0,45 micras) y la cantidad total se liofilizó para producir un polvo de enzimas crudo. Este polvo de enzimas crudo tenía una actividad HEC de 1920 unidades/g. Para evaluar la potencia de destintado enzimático de esta enzima cruda, se llevó a cabo la siguiente prueba de destintado enzimático. Papel de periódico fue digerido en una desfibradora y se añadieron 50 mM de tampón de fosfato (pH 6,0) a 50ºC como concentración del 5% en peso. Se sumergió el papel de periódico durante 10 minutos para que aumentara de volumen. A continuación, el papel de periódico se desintegró mediante agitación 30.000 veces en un desintegrador estándar JIS calentado a 50ºC. Al material desintegrado se añadió la solución enzimática correspondiente a 3 mg (100 nkat) y 9 mg (300 nkat) de polvo de enzimas crudas por gramo de material desintegrado. Se agitó suavemente la mezcla y se incubó a 60ºC durante 120 minutos.

A continuación, el material desintegrado sometido a reacción enzimática se agitó 1000 veces en un desintegrador estándar para producir un material desintegrado homogéneamente. Un volumen del material desintegrado se diluyó con 4 volúmenes de agua de grifo. Se añadieron un agente de destinte (Raisapon 104,1 g/l) y cloruro de potasio (200 mg/l) y se sometió a la célula de flotación Voith. Se llevó la cabo la flotación a 50 grados durante 5 minutos mientras se retiraba la tinta que flotaba. Después, se preparó una hoja a mano y se secó. Se midió el brillo ISO del papel resultante mediante un medidor de blancura y la zona donde quedaba tinta se midió por medio de Quick Scan 35 (Minolta). Los resultados del análisis de las tres muestras, una zona no tratada y dos zonas experimentales tratadas enzimáticamente (100 nkat/g, 300 nkat/g) por medio del procedimiento anterior se muestran en la Tabla 8. A partir de los resultados, se confirmó la eficacia de la RCE I sobre el destinte de papel usado, ya que el brillo del papel obtenido a partir de las zonas experimentales tratadas enzimáticamente era superior al brillo del papel no tratado.

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TABLA 8

27

<110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD

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<120> Endoglucanasa y composición de celulasa que contiene la misma

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<130> 121659PX

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<140>

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<141>

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<150> JP302387/1998

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<151> 23-10-1998

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<160> 113

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente In Ver. 2.0

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

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<212> PRT

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<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

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<222> (-23)...(-1)

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<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(315)

\newpage

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<400> 1

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28

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1017

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(69)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (70)...(1017)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-23)...(-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(343)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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33

34

35

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(69)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (70)...(1101)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-23)...(-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(337)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1083

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(69)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (70)...(1083)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-22)...(-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(316)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1017

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)...(1017)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 387

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-22)...(-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(365)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)...(1164)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99002 de Phycomyces nitens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (-19)...(-1)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(327)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1041

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99002 de Phycomyces nitens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(57)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (58)...(1041)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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59

60

61

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1043

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)...(84)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)...(1043)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99002 de Phycomyces nitens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

68

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<210> 18

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<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (CBD)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (CBD)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

70

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (CBD)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (CBD)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (CBD)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99002 de Phycomyces nitens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso (enlazador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de consenso (enlazador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso (enlazador)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso (enlazador)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99001 de Mucor circinelloides

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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\hskip1cm

86

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP99002 de Phycomyces nitens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\hskip1cm

87

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaraaytgga ayggnccnac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttraaccart traancg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttraaccart traayct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatgtcttc cctctggaag cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcccttagt gacagcaatg ccc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttccttccg cactccaagc tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagcttgga gtgcggaagg aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcactaaggg cagtgacacc atc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagagggaag acattgagag tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaacattat ttcttcaaac atg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatgccgca tcaagtttta ttg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcacttcta cctctgttgc tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaataaact tcatagatct atgtaaaaag aatg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatgagtat aaaagatctt attttcttga ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactttcaga agctttattg ccac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctagagc cagagttaga ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagaactgac atcggcctta cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaacattat ttcttcgaat atg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttagcagca gaggccattt cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttctatcc tgatacagag atg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctcataa aacgactact acc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcccttagt gacagcaatg tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagaaaata agatctttta tactcctact

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacggcaata aggcctctga atgtagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagcaatg gccagaaaac ttctgaaag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttcaaact ctctagactc tagcggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtaaggcc gacgtcagtt ctcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaggagcc aacaggggag gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcacagcag gtaggtccat tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctacggttt cgccgctgct tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagataccaa caccaccacc ggg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaagttcct taccattgcc tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgaaacc actcgctact ggg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctgcctct gactgttcta acc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatagagtta ctctatacga tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccaccaga gacagcggag tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgttgatt atcctgacaa tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatccat gaagttcctt accattgcc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatcctt attttcttga acagccaga

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggaggtga gatcttcatt gggaac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcggagta ctttgtagaa gcag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagatctt gggacaagat gaagtttatt actattg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcaaacaa gtctgtgcgg atcctgggac aagatggcca agttcttcct tac

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggggatcc tgcgtttact tgcgcgagca tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcggtgg cgctagcggc aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaatggcag cggcagcgaa acc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtgccca cttcgatctc cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttccgcc gcactgtccg tag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgacaacca gccatggct gtc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctcgaatga ctactacagc cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccqctggga cgagcatccg ttg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagctgctc gagttggacg gag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> CP96001 de Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactgaccgg tgttcatcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcggttgtc atagatgtgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacagaag ggatccatga tggtcgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcat gaagttcacc gttgctatt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattctt actttctttc gcaacctg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttggtgctg ccagcgttac cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatccat gaagttctcc atcatcg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatcctt acttgcgctc gcaacca

\hfill

27

Claims (26)

1. Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: que tiene actividad endoglucanasa.

2. Polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho polinucleótido comprende la secuencia de ADN tal como se muestra en la SEQ ID NO:2.

4. Polinucleótido según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque dicho polinucleótido comprende una secuencia nucleotídica en la que los codones han sido optimizados para un huésped mediante la selección de aquellos codones utilizados frecuentemente por el huésped.

5. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Célula huésped transformada con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o con el vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Célula huésped según la reivindicación 6, caracterizada porque dicha célula huésped es una levadura o un hongo filamentoso.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque la levadura pertenece al género Saccharomyces, al género Hansenula o al género Pichia.

9. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque el hongo filamentoso pertenece al género Humicola, al género Aspergillus, al género Trichoderma, al género Acremonium o al género Fusarium.

11. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque el hongo filamentoso es Humicola insolens, Aspergillus niger o Trichoderma viride.

12. Método para producir la proteína según la reivindicación 1, que comprende el cultivo de la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 así como la recuperación de la proteína de dicha célula huésped y/o del caldo de cultivo resultante.

13. Endoglucanasa producida por medio del método según la reivindicación 12.

14. Preparación de celulasa que comprende la proteína según la reivindicación 1 y uno o más componentes seleccionados de entre excipientes, agentes tensioactivos y conservantes.

15. Método para tratar tejidos que contienen celulosa, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

16. Método para reducir la velocidad a la que el tejido que contiene celulosa adquiere pelusas o para reducir las pelusas en tejidos que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

17. Método para tratar la pérdida de peso de tejidos que contienen celulosa para mejorar su tacto y su aspecto, el cual comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

18. Método para proporcionar la clarificación del color de tejidos coloreados que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

19. Método para proporcionar una variación localizada en el color de tejidos coloreados que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

20. Método para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa se vuelven rígidos o para reducir la rigidez en tejidos que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

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21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque el tratamiento de los tejidos se realiza por medio de remojo, lavado o enjuague de los tejidos.

22. Aditivo para detergente que comprende la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14 en una forma granular no dispersante o en una forma líquida estabilizada.

23. Composición detergente que comprende la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

24. Método para mejorar el refinado de una pulpa de papel, que comprende una etapa que consiste en tratar la pulpa de papel con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

25. Método para el destintado de papel usado que comprende una etapa que consiste en el tratamiento del papel usado con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14 en presencia de un agente de destinte.

26. Método para mejorar la digestibilidad de un alimento para animales, que comprende una etapa que consiste en el tratamiento de un alimento que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.